ES2271247T3 - Aril-n-cianoguanidinas y metodo relacionados con ellas. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene la estructura: o un esteroisómero, derivado acetato, formato o benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que R3 es morfolinilo; y R1, R2, R4 y R5 son lo mismo o diferente, e individualmente hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido. o R4 tomado junto con R5, y además tomado junto con el respectivo átomo de carbono al cual estos grupos están ligados, forman un arilo fusionado o un heterociclo no sustituído o sustituído.
Description
Aril-N-cianoguanidinas
y métodos relacionados con ellas.
La presente invención se refiere generalmente a
compuestos y métodos para tratar artritis y enfermedades
relacionadas, y para tratar enfermedades asociadas con una función
mitocondrial alterada y, más particularmente a compuestos de
aril-N-cianoguanidina y sus
derivados.
Numerosas enfermedades crónicas debilitantes del
sistema esquelético en los vertebrados, incluyendo la artritis y
las enfermedades artríticas relacionadas, se caracterizan por
degradación de un tejido cartilaginoso avascular especializado,
conocido como cartílago articular, que contiene células dedicadas a
producir cartílago, los condrocitos articulares. Al contrario que
otros condrocitos, tales como los condrocitos de la placa de
crecimiento epifisaria, presentes en los extremos de los huesos
largos en desarrollo (por ejemplo, los condrocitos endocondrales o
costocondrales), los condrocitos articulares residen y mantienen el
cartílago articular que no tiene vasculatura. De esta forma,
careciendo de aporte de sangre como fuente de oxígeno, se cree que
los condrocitos articulares generan energía metabólica, por ejemplo
producción de ATP bioenergético, predominantemente mediante
respiración anaerobia (por ejemplo, glicosilación), y no mediante
fosforilación oxidativa mitocondrial aeróbica
(Stefanovich-Racic et al., J Cell
Physiol. 159:274-80, 1994). Debido a que,
incluso bajo condiciones aeróbicas, los condrocitos articulares
pueden consumir poco oxígeno, y por ello parecen diferir de una
amplia variedad de tipos celulares de vertebrados
(Stefanovich-Racic et al, 1994), el papel de
las mitocondrias en las enfermedades artríticas han sido ignoradas
durante largo tiempo.
El sistema músculo-esquelético
libera eficazmente energía mecánica útil y apoyo de carga en
vertebrados tales como mamíferos, reptiles, pájaros y peces, pero
es también capaz de sintetizar, procesar y organizar macromoléculas
complejas para formar tejidos y órganos especializados en la
realización de funciones mecánicas específicas. Las articulaciones
son un importante subgrupo de estructuras especializadas del sistema
músculo-esquelético, y existen muchos tipos
diferentes de articulaciones en el organismo. Las articulaciones de
movilidad libre (por ejemplo el tobillo, el codo, la cadera, la
rodilla, el hombro, y las articulaciones de los dedos de manos,
pies y muñecas), se conocen como articulaciones sinoviales
diartrodiales. Por el contrario, las articulaciones
intervertebrales de la columna no son articulaciones diartrodiales,
ya que éstas son fibrosas y no se mueven libremente, aunque
proporcionan la flexibilidad requerida por la columna. Los extremos
óseos que se articulan en la articulación diartrodial están
recubiertos de una capa fina de tejido blando hidratado, conocido
como cartílago articular. Cuarto, la articulación es estabilizada
por, y su rango de movimiento se controla por, los ligamentos y
tendones que pueden estar dentro y fuera de la cápsula
articular.
articular.
Las capas limitantes de superficie de las
articulaciones diartrodiales, es decir, la capa sinovial y la de
cartílago articular, forman la cavidad articular que contiene el
líquido sinovial. Así, en las articulaciones del esqueleto de los
vertebrados, el líquido sinovial, el cartílago articular y el hueso
en que se apoyan, forman un sistema de soporte suave, casi sin
fricción. Mientras que las articulaciones diartrodiales están
sometidas a un enorme y variado intervalo de condiciones de carga,
las superficies del cartílago sufren poco roce y desgarro (por
ejemplo, degradación estructural) bajo circunstancias normales. Es
más, la mayoría de las articulaciones de los seres humanos son
capaces de funcionar eficazmente bajo altas cargas y situaciones de
estrés, y a velocidades de operación muy bajas. Estas
características de actuación demandan unos procesos de lubricación
eficientes, para minimizar la fricción y el roce del cartílago en la
articulación. Las roturas importantes del cartílago articular por
procesos bioquímicos o biomecánicos dan lugar a la artritis, que es
por lo tanto definida generalmente como un fallo en el sistema de
carga de peso de los vertebrados.
Los condrocitos articulares sintetizan y
depositan los componentes de, y residen en, una matriz extracelular
cartilaginosa tridimensional, que está compuesta mayoritariamente
por dos clases principales de macromoléculas, el colágeno y los
proteoglicanos. Los condrocitos articulares, de esta forma median la
síntesis, ensamblaje, degradación y recambio de las macromoléculas
que están contenidas en la matriz extracelular del cartílago (ECM o
simplemente "matriz"). Las propiedades
mecano-químicas de esta matriz contribuyen
significativamente a la función biomecánica del cartílago in
vivo.
La integridad estructural del cartílago
articular es la base del funcionamiento óptimo de las articulaciones
esqueléticas, tales como las encontradas en caderas, hombros,
codos, tarsos y rodillas de los vertebrados. La alteración de la
función de la articulación esquelética reduce dramáticamente la
movilidad de un sujeto individual, tal como la implicada en la
elevación desde una posición sentada, o al subir y bajar escaleras.
Como se ha destacado anteriormente, para mantener la integridad
estructural y funcional del cartílago articular, los condrocitos
articulares sintetizan constantemente colágeno y proteoglicanos, los
principales componentes del cartílago articular; los condrocitos
también secretan el líquido sinovial que reduce la fricción. Esta
elaboración constante por los condrocitos articulares de las
macromoléculas de la ECM del cartílago y del líquido sinovial,
provee al cartílago articular de un mecanismo de reparación para la
mayoría del roce mecánico que puede ser causado por la fricción
entre los extremos del hueso. Sin embargo, dicha biosíntesis
mantenida de los componentes del cartílago genera una demanda
constante de sus precursores, o bloques de construcción, de estas
macromoléculas y de los componentes del líquido sinovial. La falta
de estos precursores dará lugar a defectos en la estructura y la
función de las articulaciones esqueléticas. Esta deficiencia ocurre
frecuentemente cuando los niveles de actividad son muy elevados, o
cuando el tejido cartilaginoso se traumatiza.
Los meniscos de la rodilla, y otras estructuras
similares tales como los discos de la articulación témporomandibular
y el labrum del hombro, son estructuras fibrocartilaginosas
especializadas que son vitales para la función articular normal.
Ellos ayudan al cartílago articular a distribuir la carga a lo largo
de la articulación, ayudan a los ligamentos y los tendones a
estabilizar las articulaciones y juegan un papel principal en la
absorción del choque, y pueden además ayudar a lubricar la
articulación. La lesión de estas estructuras puede dar lugar a una
función articular alterada, y a una degeneración del cartílago
articular. La eliminación quirúrgica de estas estructuras
fibrocartilaginosas, por ejemplo, después de desgarros en el
cartílago aparentemente irreparables, puede dar como resultado el
inicio precoz de artrosis. Los meniscos, discos y labrum son
estructuras de fibrocartílago hidratadas compuestas primariamente
por colágeno tipo III, con pequeñas cantidades de otros colágenos y
también están presentes los proteoglicanos (incluyendo agrecán y
proteoglicanos más pequeños, no agregantes). Estas estructuras
fibrocartilginosas contienen una población escasa de células
residentes que, al igual que los condrocitos en el cartílago
articular, son responsables de la síntesis y el mantenimiento de
esta matriz extracelular.
Las articulaciones diartrodiales permiten
movimientos del cuerpo comunes, incluyendo movimientos de los
miembros asociadas con funciones motoras (por ejemplo,
ambulatorias) y otras actividades de la vida diaria. El fracaso de
las superficies articulares (es decir, del cartílago articular)
significa un fracaso en estas características biomecánicas para
proporcionar sus funciones centrales, tales como el movimiento
ambulatorio y otros movimientos del cuerpo, la liberación de
energía mecánica y el soporte de la carga.
En términos biomédicos, el fracaso de las
articulaciones diartrodiales lleva a alteraciones artríticas, la
más frecuente de las cuales es la artrosis, o enfermedad articular
degenerativa, o la condrocalcinosis. Otras formas de artritis
incluyen la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, la
espondilitis anquilosante, el síndrome de Reiter, la artritis
psoriásica, el lupus eritematoso, la gota, las artritis infecciosas
y la condrocalcinosis (véase, por ejemplo, Guillnad et al.,
"Disorders of the joints and connective tissue", Section 14,
Harrison's Principles of Internal Medicine, Octava Ed., Thorn
et al., eds, McGraw-Hill, New Cork, NY,
1977, pags. 2048-80) y, en un contexto veterinario,
displasias tales como la displasia de cadera canina. Las
enfermedades artríticas pueden también incluir, o pueden ser el
resultado de, traumatismos físicos (por ejemplo, daño físico agudo
que lesiona los tejidos articulares, o el síndrome de movimiento
repetitivo), o enfermedades de la dieta (por ejemplo raquitismo u
otras enfermedades de deficiencias dietéticas), que dan como
resultado un daño articular.
Con mucho, las enfermedades artríticas mas
prevalentes son la artritis reumatoide (RA) y la artrosis (OA). La
RA, que se cree que es una enfermedad autoinmune, es el resultado en
parte de una inflamación de la membrana sinovial. En humanos, el
pico de inicio de esta enfermedad ocurre en adultos de más de 30
años de edad (típicamente en sus treinta o cuarenta), y afecta a las
mujeres tres veces más frecuentemente que a los hombres. En casos
extremos, la inflamación crónica erosiona y distorsiona las
superficies articulares y el tejido conectivo, lo que da como
resultado una deformidad articular importante y dolor constante.
Además la RA frecuentemente lleva a OA, que colabora todavía más en
la destrucción de la articulación. La enfermedad artrítica más
frecuente, la OA, se caracteriza por cambios degenerativos en la
superficie del cartílago articular. Las alteraciones en la
estructura fisicoquímica del cartílago lo hacen menos resistente a
las fuerzas compresivas y tensiles. Finalmente, ocurre la erosión
completa, dejando al hueso subcondral expuesto y susceptible al
desgarro. Las articulaciones de las rodillas y las manos son las
más frecuentemente afectadas, y también pueden afectarse una o más
de las articulaciones vertebrales, las caderas, los tobillos y los
hombros. En ambas, la RA y la OA, la degeneración de las
articulaciones que soportan carga tales como las caderas y las
rodillas puede ser especialmente debilitante y frecuentemente
requiere cirugía para aliviar el dolor y para aumentar la
movilidad.
No existen medios actualmente para parar o
revertir los cambios degenerativos que ocurren en la RA, la OA y
las enfermedades artríticas relacionadas. Al mismo tiempo,
aproximadamente 37 millones de americanos buscan alivio sintomático
en forma de fármacos de prescripción. En tales casos, los fármacos
anti-inflamatorios no esteroideos (NSAIDS) son los
que más frecuentemente se prescriben. Aunque estos compuestos
frecuentemente alivian o palian los síntomas artríticos,
frecuentemente tienen efectos secundarios no deseados, por ejemplo,
náuseas y úlceras gastrointestinales. Otros compuestos comúnmente
prescritos para el tratamiento de las enfermedades artríticas son
los corticosteroides, tales como la triamcinolona, la prednisolona y
la hidrocortisona. Estos fármacos también tienen efectos
secundarios indeseables, particularmente cuando se requiere su
utilización a largo plazo, y además pueden estar contraindicados en
muchos pacientes. Además de las dificultades para determinar las
dosis efectivas, se han descrito un número de reacciones adversas
durante el tratamiento intra-articular con éstos y
otros esteroides. Como resultado, el uso de tratamiento con
corticosteroides en el manejo de las enfermedades artríticas está
actualmente siendo reevaluado.
Como una alternativa a las medidas sintomáticas
y paliativas para tratar la OA y la RA descritas anteriormente, la
reparación mecánica de las articulaciones artríticas, cuando es
posible, incluye la cirugía ortopédica para reemplazar las
articulaciones con una prótesis artificial, o con un injerto
biológico. Con más de treinta millones de americanos padeciendo de
estas enfermedades invalidantes, dicha cirugía supone un reto médico
y económico enorme, y no sin sus propios riesgos y
contraindicaciones.
Como se ha remarcado anteriormente, la artrosis,
también conocida como enfermedad articular degenerativa, es uno de
los tipos más comunes de artritis. Se caracteriza por la rotura del
cartílago dentro de la articulación, ocasionado roce doloroso de un
hueso de la articulación contra otro hueso, y llevando a una pérdida
de movilidad de la articulación afectada. La artrosis puede ser
desde muy leve a muy grave, y más frecuentemente afecta a personas
de mediana edad y mayores. En particular, la OA afecta
frecuentemente las articulaciones de las manos y las de carga,
tales como las rodillas, caderas, pies y espalda. Aunque la edad es
un factor de riesgo principal, en el momento actual la etiología y
la patogénesis de esta enfermedad permanecen ampliamente
desconocidas. Muchos factores ambientales y otras condiciones
independientes se han asociado con un riesgo aumentado de
desarrollar artrosis, incluyendo obesidad, lesión previa y/o
meniscectomía (por ejemplo, lesiones relacionadas con el deporte u
otras lesiones accidentales), actividades relacionadas con la
ocupación, que incluyen lesiones repetitivas en la rodilla, el
tabaquismo, las hormonas sexuales, las enfermedades ginecológicas y
otros factores metabólicos. La condrocalcinosis es otra forma de
enfermedad articular degenerativa relacionada con la artrosis, en
la que ocurre una calcificación anormal en el cartílago
articular.
Para el porvenir, está claro que ninguna de las
terapias farmacológicas actuales corrige el defecto bioquímico
subyacente en las enfermedades artríticas tales como la RA y la
OA. Tampoco ninguno de estos tratamientos actualmente disponibles
mejora todas las anormalidades fisiológicas en las enfermedades
artríticas tales como la actividad anormal de los condrocitos
articulares, la degradación del cartílago, la erosión articular y
la deformidad articular grave. Además, los fracasos del tratamiento
son comunes con estos agentes, de tal forma que frecuentemente es
necesaria la terapia con múltiples fármacos.
Claramente existe una necesidad de mejorar la
terapéutica dirigida a corregir los defectos bioquímicos y/o
metabólicos responsables de la artritis. La presente invención
proporciona composiciones y métodos que son útiles para tratar una
enfermedad artrítica asociada con una función mitocondrial alterada,
y ofrece otras ventajas relacionadas.
Según una teoría no limitante, y como se
describe en la solicitud co-pendiente, que tiene el
Nº de Serie de EE. UU. 09/661.848, algunas o todas las enfermedades
artríticas como aquí se proporcionan, pueden representar ejemplos de
enfermedad asociada con una función mitocondrial alterada.
Como antecendentes, las mitocondrias son la
principal fuente de energía en las células de organismos superiores,
y estas organelas proporcionan regulación bioquímica directa e
indirecta de un amplio marco de procesos celulares respiratorios,
oxidativos y metabólicos (como revisión, véase Emster y Schatz, J
Cell Biol 91:227s-255s, 1981). Éstos incluyen la
actividad de cadena de transporte de electrones (ETC), que dirige la
fosforilación oxidativa para producir energía metabólica en forma de
trifosfato de adenosina (ATP), y que también remarca un papel
central de las mitocondrias en la homeostasis del calcio
intracelular. Además de su papel en los procesos metabólicos, las
mitocondrias también están implicadas en la secuencia de suicidio
celular programado conocido como "apoptosis" (Green y Reed,
Science 281:1309-12, 1998; Susin et
al., Biochim et Biophys Acta 1366:151-65,
1998).
La actividad mitocondrial defectuosa, incluyendo
pero no limitándose, al fracaso de cualquier etapa del elaborado y
multicomplejo ensamblaje mitocondrial, conocido como cadena de
transporte de electrones (ETC), puede dar como resultado: (i)
disminución de la producción de ATP, (ii) aumento en la generación
de radicales libres altamente reactivos (por ejemplo, superóxido,
radicales peroxinitrito e hidroxilo, y peróxido de hidrógeno),
(iii) alteraciones en la homeostasis del calcio intracelular, y (iv)
la liberación de factores (tales como el citocromo c, y el
"factor inductor de apoptosis"), que inicia o estimula la
cascada de la apoptosis. Debido a estos cambios bioquímicos, la
disfunción mitocondrial tiene el potencial de ocasionar daño
diseminado a células y tejidos.
Un número de enfermedades y alteraciones, se
piensa que son causadas por, o que están asociadas con, alteraciones
en el metabolismo de las mitocondrias, y/o con la inducción o
supresión inapropiadas de funciones relacionadas con las
mitocondrias, tales como las que llevan a la apoptosis. Estas
incluyen, como ejemplo, enfermedades neurodegenerativas crónicas
tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad de
Parkinson (PD); enfermedades autoinmunes; diabetes mellitas,
incluyendo el Tipo I y el Tipo II; enfermedades asociadas con las
mitocondrias, incluyendo, pero no limitándose a distrofia muscular
congénita con anormalidades estructurales en las mitocondrias,
miopatía infantil fatal con depleción grave de mtDNA y la miopatía
benigna de "comienzo tardío", con reducción moderada en el
mtDNA, el síndrome MELAS (encefalopatía mitocondrial, acidosis
láctica y accidente cerebro-vascular) y el síndrome
MIDD (diabetes mitocondrial y sordera); el síndrome MERFF (síndrome
de epilepsia mioclónica con fibras rojo-rasgadas);
la artritis; el síndrome NARP (Neuropatía; Ataxia; Retinitis
Pigmentaria); el síndrome MNGIE (Miopatía y oftalmoplegia externa;
Neuropatía, Gastro-intestinal; Encefalopatía); el
síndrome LHON (Leber's; Hereditaria; Óptica; Neropatía); la
enfermedad de Kearns-Sayre; el síndrome de Pearson;
la PEO (Oftalmoplegia Externa Progresiva); el síndrome de Wolfram
DIDMOAD (Diabetes Insípida, Diabetes Mellitas, Atrofia Óptica,
Sordera); el síndrome de Leigh; la distonía, la esquizofrenia; y las
enfermedades hiperproliferativas, tales como el cáncer, los tumores
y la psoriasis.
Según las teorías generalmente aceptadas de la
función mitocondrial, la actividad respiratoria ETC apropiada
requiere el mantenimiento de un potencial electroquímico
(\Delta\Psim), en la membrana mitocondrial interna, por un
mecanismo quimio-osmótico acoplado. Las condiciones
que disipan o colapsan este potencial de membrana, incluyendo pero
no limitándose, a fracasos en cualquier etapa de la ETC, pueden de
esta forma prevenir la biosíntesis de ATP y activar o frenar la
producción de una fuente de energía bioquímica vital. La actividad
mitocondrial alterada o defectuosa puede también dar como resultado
un colapso mitocondrial catastrófico que ha sido denominado
"transición de permeabilidad mitocondrial" (MPT). Además, las
proteínas mitocondriales tales como el citocromo c y el "factor
inductor de apoptosis", pueden disociarse o ser liberados de las
mitocondrias debido a la MPT (o a la acción de proteínas
mitocondriales tales como Bax), y puede inducir proteasas conocidas
como caspasas y/o estimular otros eventos en la apoptosis (Murphy,
Drug Dev Res 46:18-25, 1999).
La actividad mitocondrial defectuosa puede
alternativamente o adicionalmente dar como resultado la generación
de radicales libres altamente reactivos, que tienen la capacidad
potencial de lesionar células y tejidos. Estos radicales libres
pueden incluir especies de oxígeno reactivas (ROS), tales como el
superóxido, los radicales peroxinitrito e hidroxilo, y
potencialmente otras especies reactivas que pueden ser tóxicas para
las células. Por ejemplo, la inducción de la peroxidación lípida
por los radicales libres de oxígeno es un mecanismo patogénico bien
establecido en la lesión del sistema nervioso central (CNS), tal
como la que se encuentra en un número de enfermedades
degenerativas, y en la isquemia (es decir, accidente
cerebro-vascular). (La participación mitocondrial
en la cascada de la apoptosis se cree también que es un evento clave
en la patogénesis de la muerte neuronal).
Hay, además, al menos dos consecuencias
deletéreas de la exposición a radicales libres de oxígeno que se
originan de la disfunción mitocondrial, que impactan adversamente a
las propias mitocondrias. En primer lugar, la lesión mediada por
los radicales libres puede inactivar una o más de la miríada de
proteínas de la ETC. En segundo lugar, la lesión mediada por los
radicales libres puede dar como resultado un colapso mitocondrial
catastrófico que se ha denominado "permeabilidad de
transición". Según las teorías generalmente aceptadas de la
función mitocondrial, la actividad respiratoria apropiada de la
ETC, requiere el mantenimiento de un potencial electroquímico en la
membrana mitocondrial interna por un mecanismo
quimio-osmótico acoplado. La actividad oxidativa de
los radicales libres puede disipar este potencial de membrana,
previniendo de esta forma la biosíntesis de ATP y/o poniendo en
marcha eventos mitocondriales en la cascada apoptótica. De esta
forma, mediante la modulación de éstos y otros efectos de la
oxidación de los radicales libres sobre la estructura y función
mitocondriales, la presente invención proporciona composiciones y
métodos para proteger las mitocondrias, que no se proporcionan por
la mera determinación de la peroxidación lípida inducida por los
radicales libres.
Por ejemplo, la transición de la permeabilidad
mitocondrial rápida, probablemente incluye cambios en la proteína
transmembrana mitocondrial interna adenilato traslocasa, que da como
resultado la formación de un "poro". Si este poro es un
conducto distinto o simplemente una fuga diseminada en la membrana,
está sin resolver. De cualquier modo, debido a que la transición de
la permeabilidad está potenciada por la exposición de radicales
libres, sería más posible que ocurriera en las mitocondrias de
células de pacientes que tienen enfermedades asociadas a
mitocondrias, que están crónicamente expuestos a dichos radicales
libres reactivos.
La función mitocondrial alterada (por ejemplo,
aumento o disminución de una forma estadísticamente significativa
relativa a un control apropiado, tal como un individuo libre de
enfermedad), característica de las enfermedades asociadas a
mitocondria, puede también estar relacionada a una pérdida del
potencial electroquímico de la membrana mitocondrial, por
mecanismos diferentes de la oxidación por radicales libres, y dicha
permeabilidad de transición puede resultar del efecto directo o
indirecto de los genes mitocondriales, sus productos génicos o
moléculas mediadoras aguas abajo relacionadas y/o genes
extramitocondriales, sus productos génicos o mediadores
relacionados aguas abajo, o de otras causas conocidas o
desconocidas. La pérdida del potencial mitocondrial de esta forma,
puede ser un evento crítico en la progresión de las enfermedades
degenerativas o asociadas a mitocondrias.
La diabetes mellitus es una enfermedad común,
degenerativa, que afecta al 5-10% de la población en
países desarrollados. La propensión para desarrollar diabetes
mellitus se ha referido como de herencia materna, lo que sugiere una
implicación genética mitocondrial (Alcolado, JC y Alcolado R, Br
Med J 302:1178-80, 1991; Reny, SL,
Internacional J Epidem 23:886-90, 1994). La
diabetes es una enfermedad heterogénea con un fuerte componente
genético; los gemelos monozigotos son altamente concordantes y hay
una elevada incidencia de la enfermedad entre los familiares de
primer grado de los individuos afectados.
A nivel celular, el fenotipo degenerativo que
puede ser característico de la diabetes mellitus de comienzo
tardío, incluye indicadores de función respiratoria mitocondrial
alterada, por ejemplo secreción de insulina alterada, disminución
de la síntesis de ATP y aumento de los niveles de especies de
oxígeno reactivas. Algunos estudios han mostrado que la diabetes
mellitus puede ser precedida por, o asociada con, ciertas
enfermedades relacionadas. Por ejemplo, se estima que cuarenta
millones de individuos en los EE. UU. padece una alteración de la
tolerancia a la glucosa (IGT) de comienzo tardío. Los pacientes con
IGT fracasan en la respuesta a la glucosa con un aumento de la
secreción de insulina. Un pequeño porcentaje de individuos con IGT
(5-10%) progresan a diabetes deficiente en insulina
no dependiente de insulina (NIDDM) cada año. Algunos de estos
individuos progresan además a diabetes mellitus dependiente de
insulina (IDDM). Estas formas de diabetes mellitus, NIDDM e IDDM,
se asocian con una disminución de la liberación de insulina por las
células pancreáticas beta y/o una disminución en la respuesta final
del órgano a la insulina. Otros síntomas de la diabetes mellitus y
condiciones que preceden o se asocian con la diabetes mellitus
incluyen la obesidad, las patologías vasculares, las neuropatías
periféricas y sensoriales, la ceguera y la sordera.
Debido al fuerte componente genético de la
diabetes mellitus, el genoma nuclear ha sido el principal foco de
investigación para mutaciones genéticas causales. Sin embargo, a
pesar de intensos esfuerzos, los genes nucleares que se segregan
con la diabetes mellitus son conocidos solo por mutaciones raras en
el gen de la insulina, el gen del receptor de la insulina, el gen
de la deaminasa de adenosina y el gen de la glucoquinasa. Según
esto, los defectos mitocondriales, que pueden incluir pero no
necesitan limitarse a defectos relacionados con el genoma
mitocondrial no nuclear, que reside en el DNA mitocondrial, podrían
contribuir significativamente a la patogénesis de la diabetes
mellitus (Anderson, Drug Dev Res 46:67-79,
1999).
La enfermedad de Parkinson (PD) es una
enfermedad neurodegenerativa, progresiva, crónica, asociada a
mitocondrias, caracterizada por la pérdida y/o la atrofia de
neuronas que contienen dopamina, en la pars compacta de la
substantia nigra del cerebro. Al igual que la enfermedad de
Alzheimer (AD), la PD también afecta a los ancianos. Se caracteriza
por bradiquinesia (movimiento lento), rigidez y temblor de reposo.
Aunque el tratamiento con L-Dopa reduce los
temblores en la mayoría de los pacientes temporalmente, finalmente
los temblores se vuelven más y más incontrolables, haciendo difícil
o imposible para los pacientes incluso alimentarse por sí mismos o
cumplir con sus propias necesidades de higiene básica.
Se ha demostrado que la neurotoxina
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
(MPTP) induce parkinsonismo en animales y en seres humanos, en
parte a través de sus efectos sobre las mitocondrias. La MPTP se
convierte a su metabolito activo, MPP+, en las neuronas con
dopamina; después se concentra en las mitocondrias. El MPP+ después
inhibe selectivamente la enzima mitocondrial NADH:ubiquinona
oxido-reductasa ("Complejo I"), llevando a un
aumento en la producción de radicales libres, a una reducción en la
producción de trifosfato de adenosina, y finalmente, a la muerte de
las neuronas con dopamina.
El Complejo I mitocondrial está compuesto por
40-50 subunidades; la mayoría están codificadas por
el genoma nuclear y siete por el genoma mitocondrial. Como el
parkinsonismo puede inducirse por la exposición a toxinas
mitocondriales que afectan a la actividad del Complejo I, parecería
posible que los defectos en las proteínas del Complejo I pudieran
contribuir a la patogénesis de la PD, ocasionando una deficiencia
bioquímica similar en la actividad del Complejo I. Es más, se han
descrito defectos en la actividad del Complejo I mitocondrial en la
sangre y el cerebro de pacientes con PD (Parker et al., Am
J Neurol 26:719-23, 1989; Swerdlow y Parker,
Drug Dev Res 46:44-50, 1999).
Teorías similares se han avanzado para
relaciones análogas entre defectos mitocondriales y otras
enfermedades neurológicas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer,
la neuropatía óptica hereditaria de Leber, la esquizofrenia, el
síndrome de "encefalopatía mitocondrial, acidosis láctica y
accidente cerebro-vascular" (MELAS), y el
"síndrome de epilepsia mioclónica con fibras rojo rasgadas"
(MERRF).
Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (AD), es
una enfermedad neurodegenerativa crónica, progresiva, que se
caracteriza por pérdida y/o atrofia de neuronas en determinadas
regiones del cerebro, y que se acompaña por depósitos
extracelulares de \beta-amiloide y por la
acumulación intracelular de ovillos neurofibrilares. Es únicamente
una enfermedad humana, y afecta a más de 13 millones de personas en
todo el mundo. También es una enfermedad especialmente trágica.
Muchos individuos que han vivido vidas normales, productivas, son
afectados lentamente por la AD según se hacen mayores, y la
enfermedad gradualmente les quita la memoria y otras facultades
mentales. Eventualmente, cesan de reconocer a la familia y a sus
seres queridos, y frecuentemente requieren cuidado continuado hasta
su eventual muerte.
Existe evidencia de que algunos defectos en la
fosforilación oxidativa dentro de las mitocondrias, son al menos
causas parciales de los casos esporádicos de AD. La enzima citocromo
c oxidasa (COX), que forma parte de la cadena de transporte de
electrones (ETC) mitocondrial, está presente en cantidades normales
en los pacientes con AD; sin embargo, la actividad catalítica de
esta enzima en los pacientes con AD y en los cerebros de pacientes
con AD en la autopsia, se ha encontrado anormalmente baja. Esto
sugiere que la COX en los pacientes con AD es defectuosa, llevando
a una disminución en la actividad catalítica, que de alguna forma
causa o contribuye a los síntomas que son característicos de la
AD.
Una característica patológica de la AD es la
muerte de poblaciones neuronales seleccionadas en determinadas
regiones del cerebro. Se presume que la muerte celular en la AD es
apoptótica, ya que se han visto signos de muerte celular programada
(PCD), y no se han encontrado indicadores de gliosis y necrosis
activas (Smale et al., Exp Neurolog
133:225-30, 1995; Cotman et al., Molec
Neurobiol 10:19-45, 1995). Las consecuencias de
la muerte celular en la AD, la pérdida neuronal y sináptica, están
cercanamente asociadas con el diagnóstico clínico de AD, y se
correlacionan de forma elevada con el grado de demencia en la AD
(DeKosky et al., Ann Neurol
27(5):467-64, 1990).
Se piensa que la disfunción mitocondrial es
crítica en la cascada de eventos que lleva a la apoptosis en
diversos tipos celulares (Kroemer et al., FASEB J
9:1277-87, 1995), y puede ser una causa de
muerte celular apoptótica en neuronas del cerebro de AD. La
alteración de la fisiología mitocondrial puede estar entre los
eventos más precoces en la PCD (Zamzami et al., J Exp Med
182:367-77, 1995; Zamzami et al., J
Exp Med 181:1661-72, 1995), y los elevados
niveles de especies de oxígeno reactivas (ROS) que resultan de dicha
función mitocondrial alterada pueden iniciar la cascada apoptótica
(Ausserer et al., Mol Cell Biol
14:5032-42, 1994). En diversos tipos celulares,
incluyendo las neuronas, la reducción en el potencial de la membrana
mitocondrial (\Delta\Psim), precede a la degradación del DNA
nuclear que acompaña a la apoptosis. En sistemas libres de células,
las fracciones enriquecidas mitocondriales, pero no nucleares, son
capaces de inducir apoptosis nuclear (Newmeyer et al.,
Cell 70:353-64, 1994). La perturbación de la
actividad respiratoria mitocondrial que lleva a estados metabólicos
celulares alterados, tales como la elevación intracelular de ROS,
puede ocurrir en enfermedades asociadas a mitocondrias, y puede
además inducir eventos patogénicos a través de mecanismos de
apoptosis.
Las mitocondrias oxidativamente estresadas
pueden liberar un factor soluble preformado que puede inducir
condensación cromosómica, un evento que precede a la apoptosis
(Marchetti et al., Cancer Res
56:2033-38, 1996). Además, los miembros de la
familia Bcl-2 de productos génicos
anti-apoptosis están localizados dentro de la
membrana externa mitocondrial (Monaghan et al., J
Histochem Cytochem 40:1819-25, 1992), y estas
proteínas parecen proteger las membranas del estrés oxidativo
(Korsmayer et al., Biochim Biophys Act 1271:63, 1995).
La localización de Bcl-2 en esta membrana parece
ser indispensable para la modulación de la apoptosis (Nguyen et
al., J Biol Chem 269:16521-24, 1994).
Así, los cambios en la fisiología mitocondrial pueden ser mediadores
importantes de la apoptosis. Hasta el grado en que la muerte
celular apoptótica sea un hecho prominente en la pérdida neuronal en
la AD, la disfunción mitocondrial puede ser crítica para la
progresión de la enfermedad y puede también ser un factor que
contribuya en otras enfermedades asociadas a mitocondrias.
Defectos focales en el metabolismo de la energía
en las mitocondrias, con aumentos acompañantes en el estrés
oxidativo, pueden asociarse con AD. Se ha establecido que el
metabolismo de la energía está alterado en el cerebro de la AD
(Palmer et al., Brain Res 645:338-42,
1994; Pappolla et al., Am J Pathol
140:621-28, 1992; Jeandel et al.,
Gerontol 35:275, 1989; Balazs et al., Neurochem Res
19:1131-37, 1994; Mecocci et al., Ann
Neurol 36:747-51, 1994; Gsell et al.,
J Neurochem 64:1216-23, 1995). Por ejemplo,
se han descrito deficiencias regionales específicas en el
metabolismo de la energía en los cerebros de pacientes con AD en un
número de estudios de tomografía de emisión de positrones (Kuhl
et al., J Cereb Blood Flow Metab 7:S406, 1987; Grady
et al., J Clin Exp Neuropsychol
10:576-96, 1988; Haxby et al., Arch
Neurol 47:753-60, 1990; Azari et al.,
J Cereb Blood Flow Metab 13:438-47, 1993).
Los defectos metabólicos en el neocortex
témporo-parietal de los pacientes con AD,
aparentemente preceden a una disminución cognitiva durante varios
años. Los fibroblastos de la piel de los pacientes con AD presentan
una disminución en la utilización de glucosa, que lleva a la
formación de productos finales de la glicosilación (Yan et
al., Proc Natl Acad Sci USA 91:7787-91,
1994). El tejido cerebral de cerebros con AD postmortem muestra una
actividad disminuida de las enzimas mitocondriales piruvato
deshidorgenasa (Sheu et al., Ann Neurol
17:444-49, 1985) y
\alpha-cetoglutarato deshidrogenada
(Mastrogiacomo et al., J Neurochem
6:2007-14, 1994), que son ambas enzimas clave en
el metabolismo de la energía. Estudios de resonancia magnética
funcional de espectroscopia han demostrado un aumento de los niveles
de fosfato inorgánico, en relación con la fosfocreatina, en el
cerebro de AD, lo que sugiere una acumulación de precursores
producida a partir de una disminución de la producción de ATP por
las mitocondrias (Pettegrew et al., Neurobiol of Aging
15:117-32, 1994; Pettegrew et al.,
Neurobiol of Aging 16:973-75, 1995). Además,
se ha descrito un aumento de los niveles de piruvato, pero no los
de glucosa o lactato, en el líquido cefalorraquídeo de pacientes
con AD, consistente con los defectos en la actividad de la cadena de
transporte de electrones (ETC) mitocondrial del cerebro (Pametti
et al., Neurosci Lett 199:231-33,
1995).
Los signos de lesión oxidativa son hechos
prominentes en la patología de la AD y, como se ha remarcado
previamente, las especies reactivas de oxígeno (ROS) son mediadores
críticos de la degeneración neuronal. Es más, los estudios de
autopsias muestran que los marcadores de proteína, DNA y
peroxidación lípida están aumentados en el cerebro de pacientes con
AD (Palmer et al., Brain Res
645:338-42, 1994; Pappolla et al., Am
J Pathol 140:621-28, 1992; Jeandel et
al., Gerontol 35:275-82; Balazs et
al., Arch Neurol 4:864, 1994; Mecocci et al.,
Ann Neurol 36:747-51, 1994; Smith et
al., Proc Natl Acad Sci USA 88:10540-43,
1991). En el tejido del hipocampo de pacientes con AD, pero no de
testigos, está aumentada la formación de carbonilo indicativa de que
la oxidación de proteínas está aumentada en el citoplasma neuronal,
y en el núcleo de las neuronas y de la glía (Smith et al.,
Nature 382:120-21, 1996). Los ovillos
neurofibrilares también parecen ser lugares prominentes de oxidación
de proteínas (Scheweers et al., Proc Natl Acad Sci USA
92:8463, 1995; Blass et al., Arch Neurol 4:864,
1990). Bajo condiciones estresadas y no estresadas, la incubación
del tejido cortical de cerebros con AD tomados de autopsia,
demuestra un aumento de la producción de radicales libres en
relación con testigos que no tienen AD. Además, la actividad de las
enzimas antioxidantes críticas, particularmente las catalasas, están
reducidas en la AD (Gsell et al., J Neurochem
64:1216-23, 1995), lo que sugiere que el cerebro
de AD es vulnerable a un aumento de la producción de ROS. Así, el
estrés oxidativo puede contribuir significativamente a la patología
de las enfermedades asociadas a mitocondrias tales como la AD, en
las que pueden estar presentes la disfunción mitocondrial y/o la
elevación de ROS.
Cada vez mayor evidencia apunta al papel
fundamental de la disfunción mitocondrial en las enfermedades
neurodegenerativas crónicas (Beal, Biochim Biophys Acta
1366:211-23, 1998), y estudios recientes
implican a la mitocondria en la regulación de eventos que llevan a
la muerte celular necrótica y apoptótica (Susin et al.,
Biochim Biophys Acta 1366:151-68, 1998). Las
mitocondrias estresadas (por ejemplo, mediante radicales libres,
elevado calcio intracelular, pérdida de ATP, entre otros), pueden
liberar factores solubles preformados que pueden iniciar la
apoptosis a través de una interacción con los apoptosomas (Marchetti
et al., Cancer Res 56:2033-38, 1996;
Li et al., Cell 91:479-89, 1997). La
liberación de factores solubles preformados por las mitocondrias
estresadas, como el citocromo c, puede ocurrir como consecuencia de
un número de eventos. En cualquier evento, se piensa que la magnitud
del estrés (ROS, niveles de calcio intracelular, etc) influencia los
cambios en la fisiología mitocondrial que finalmente determina si la
muerte celular ocurre a través de la vía de la necrosis o de la
apoptosis. Hasta el grado en que la muerte celular por apoptosis sea
un hecho prominente en las enfermedades degenerativas, la disfunción
mitocondrial puede ser un factor crítico en la progresión de la
enfermedad.
En contraste con las enfermedades
neurodegenerativas crónicas, la muerte celular que sigue al
accidente cerebro-vascular ocurre de una forma
aguda. Una gran cantidad de literatura actual documenta la
importancia de la función mitocondrial en la muerte celular que
sigue a la lesión de isquemia/repercusión que acompaña al accidente
cerebro-vascular, el fallo cardiaco y la lesión
traumática en el cerebro. El apoyo experimental continúa
acumulándose para un papel central de un metabolismo de la energía
defectuoso, una alteración en la función mitocondrial que lleva a
un aumento de la producción de radicales de oxígeno y a una
homeostasis del calcio intracelular alterada, y a una participación
mitocondrial activa en la cascada apoptótica en la patogénesis de la
neurodegeneración aguda.
Un accidente cerebro-vascular
ocurre cuando una región del cerebro pierde la perfusión, y las
neuronas mueren agudamente o de una forma retrasada como resultado
de este evento isquémico agudo. Después del cese de flujo sanguíneo
en el cerebro, la concentración tisular de ATP cae a niveles
indetectables en minutos. En el núcleo del infarto, la ausencia de
producción de ATP mitocondrial produce una pérdida de la homeostasis
iónica, llevando a una lisis celular osmótica y a la muerte
necrótica. Un número de cambios secundarios pueden también
contribuir a la muerte celular que sigue a la caída del ATP
mitocondrial. La muerte celular en la lesión neuronal aguda se
irradia desde el centro de un infarto donde las neuronas mueren
primariamente por necrosis, a la penumbra, donde las neuronas
sufren apoptosis, hasta la periferia, donde el tejido todavía no
está dañado (Martin et al., Brain Res Bull
46:281-309, 1998).
Mucha de la lesión a las neuronas en la penumbra
está producida por la citotoxicidad inducida por el glutamato
liberado durante la lisis celular del foco del infarto,
especialmente cuando se exacerba por un fallo bioenergético de las
mitocondrias por la deprivación de oxígeno (MacManus y Linnik, J
Cerebral Flow Metab 17:815-32, 1997). El
activador inicial en la citotoxicidad es el masivo influjo de
Ca^{2+}, primariamente a través de los receptores NMDA, que da
como resultado una ingestión aumentada del Ca^{2+} al interior de
las mitocondrias (revisado por Dykens, "Free radicals and
mitochondrial dysfunction in excitotoxicity and neurodegenerative
diseases" en "Cell Death and Diseases of the Nervous
System", VE Koliatos y RR Rafan, eds., Humana Press, New
Jersey, pags. 45-68, 1999). La sobrecarga de
Ca^{2+} colapsa el potencial de la membrana mitocondrial
(\Delta\Psi_{m}), e induce un aumento de la producción de
especies de oxígeno reactivas (Dykens, J Neurochem
63:584-91, 1994; Dykens, "Mitochondrial
radical production and mechanisms of oxidative cytotoxicity" en
The Oxygen Paradox, KJA Davies y F Ursini, eds., Cleup Press,
U of Padova, pags. 453-67, 1995). Si son
suficientemente importantes, el colapso de la \Delta\Psi_{m} y
el secuestro intracelular de Ca^{2+}, pueden inducir la abertura
de un poro en la membrana mitocondrial interna a través de un
proceso llamado transición de permeabilidad mitocondrial (MPT),
liberando indirectamente citocromo c y otras proteínas que inician
la apoptosis (Bernardi et al., J Biol Chem
267:2934-39, 1994; Zoratti y Szabo, Biochim
Biophys Acta 1241:139-76, 1995; Ellerby et
al., J Neurosci 17:6165-78, 1997). Consistente
con estas observaciones, la citotoxicidad inducida por glutamato
puede inhibirse previniendo la ingestión mitocondrial de Ca^{2+} o
bloqueando la MPT (Budd y Nichols, J Neurochem
66:403-11, 1996; White y Raynolds, J
Neurosci 16:5688-97, 1996; Li et al.,
Brain Res 753:133-40, 1997).
Mientras que la apoptosis mediada por
mitocondrias puede ser crítica en las enfermedades degenerativas, se
piensa que enfermedades tales como el cáncer implican un
crecimiento no regulado y no deseado (hiperproliferación) de
células que de alguna forma han escapado al mecanismo que
normalmente pone en marcha la apoptosis de tales células no
deseables. La expresión aumentada de la proteína
anti-apoptótica, Bcl-2 y de sus
homólogas, está implicada en la patogénesis de numerosos cánceres
humanos. La Bcl-2 actúa inhibiendo la muerte celular
programada, y la sobreexpresión de Bcl-2, y de la
proteína relacionada Bcl-xL, bloquean la liberación
mitocondrial de citocromo c de las mitocondrias, y la activación de
la caspasa 3 (Yang et al., Science
275:1129-32, 1997; Kluck et al.,
Science 275:1132-36, 1997; Kharbanda et
al., Proc Natl Acad Sci USA 94:6939-42,
1997). En contraste, la sobreexpresión de Bcl-2 y
Bcl-xL protege contra la disfunción mitocondrial que
precede a la apoptosis nuclear que se induce por agentes
quimioterapéuticos. Además, la resistencia adquirida contra
múltiples drogas, se asocia con la inhibición de la liberación del
citocromo c, que es dependiente de la sobreexpresión de
Bcl-xL (Kojima et al., J Biol Chem
273:16647-50, 1998). Como las mitocondrias se
han implicado en la apoptosis, es de esperar que los agentes que
interactúan con los componentes mitocondriales, afecten a la
capacidad celular de desarrollar apoptosis. Así, los agentes que
inducen o promueven apoptosis en las células hiperproliferativas, es
de esperar que sean útiles para tratar enfermedades
hiperproliferativas y enfermedades tales como el cáncer.
Así, la alteración de la función mitocondrial
tiene un gran potencial para un amplio espectro de estrategias
terapéuticas, para diseñar fármacos para tratar enfermedades
asociadas con una función mitocondrial alterada, incluyendo (por
medio de una teoría no limitante), ciertas enfermedades artríticas,
enfermedades degenerativas y enfermedades hiperproliferativas.
También según una teoría no limitante, dependiendo de la enfermedad
o alteración para el cual se busca el tratamiento, tales fármacos
pueden ser, por ejemplo, agentes protectores de las mitocondrias,
agentes anti-apoptóticos o agentes
pro-apoptóticos.
Claramente existe una necesidad de compuestos
que limiten o prevengan el daño a las organelas, células o tejidos
que resulta directa o indirectamente de una disfunción mitocondrial,
por ejemplo, el daño por radicales libres generados
intracelularmente. En particular, como las mitocondrias son
organelas esenciales para producir energía metabólica, los agentes
que protegen las mitocondrias contra dicho daño (por ejemplo, lesión
oxidativa por radicales libres), serán especialmente útiles. Tales
agentes pueden ser adecuados para el tratamiento de enfermedades
degenerativas incluyendo las enfermedades asociadas a las
mitocondrias. Las aproximaciones existentes para identificar
agentes que limiten el daño oxidativo, pueden no incluir la
determinación de si dichos agentes pueden ayudar a proteger la
estructura de la mitocondria y/o su función.
También existe una necesidad para compuestos y
métodos que limiten o prevengan el daño a las células que ocurre
directa o indirectamente como resultado de la necrosis y/o la
apoptosis inadecuada. En particular, como las mitocondrias son
mediadores de los eventos apoptóticos, los agentes que modulen los
eventos proapoptóticos mediados por mitocondrias, serán
especialmente útiles. Dichos agentes pueden ser adecuados para el
tratamiento de eventos degenerativos agudos, tales como los
accidentes cerebro-vasculares. Dada la limitada
ventana terapéutica para bloquear la muerte necrótica en el núcleo
de un infarto, puede ser particularmente deseable desarrollar
estrategias terapéuticas para limitar la muerte neuronal,
previniendo la disfunción mitocondrial en las regiones no
necróticas de un infarto. Los agentes y métodos que mantienen la
integridad mitocondrial durante la isquemia transitoria y la
posterior onda de excitotoxicidad, es de esperar que sean nuevos
agentes neuroprotectores, con utilidad para limitar la lesión
neuronal relacionada con el accidente
cerebro-vascular.
También hay una necesidad de compuestos y
métodos que inhiban el crecimiento o aumenten la muerte de células
y tejidos que han escapado de las apropiadas señales de apoptosis,
así como de agentes citotóxicos que produzcan la muerte de células
no deseables (por ejemplo, de cáncer), iniciando la cascada de la
apoptosis. En particular, como las mitocondrias son mediadores de
eventos apotóticos, los agentes que estimulen los eventos
pro-apoptóticos mediados por las mitocondrias,
serán especialmente útiles. Tales agentes pueden ser adecuados para
el tratamiento de las enfermedades hiperproliferativas, tales como
el cáncer o la psoriasis.
La presente invención cumple con estas
necesidades y proporciona otras ventajas relacionadas. Los expertos
en la técnica reconocerán otras ventajas y beneficios de la
invención, después de leer la descripción.
Dicho brevemente, la presente invención se
dirige al tratamiento de una enfermedad artrítica y/o al tratamiento
de una enfermedad asociada con una alteración de la función
mitocondrial, mediante la administración a un animal de sangre
caliente con esa necesidad, una cantidad efectiva de un compuesto
que tiene la siguiente estructura general
(I):
(I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
incluyendo los esteroisómeros,
profármacos y sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que,
desde R_{1} hasta R_{5} se definen más
adelante.
En ciertas realizaciones, la invención
proporciona una composición farmacéutica que contiene un compuesto
aril N-cianoguanidina de la estructura (I), y un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Según otras realizaciones, la
invención proporciona un método para tratar una enfermedad
artrítica, mediante la administración de una cantidad efectiva de
dicha composición farmacéutica a un animal con esa necesidad. Según
todavía otras realizaciones, se proporciona un método para tratar
una enfermedad asociada con una función mitocondrial alterada, que
comprende la administración e una cantidad efectiva de dicha
composición farmacéutica a un animal con esa necesidad.
Estos y otros aspectos de la presente invención
serán evidentes en referencia a la siguiente descripción detallada.
Además, se incluyen varias referencias aquí, que describen en mayor
detalle ciertos aspectos de esta invención. Se proporciona un
compuesto que tiene una estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un esteroisómero, o derivados de
grupos funcionales de alcohol y amina acetato, formato o benzoato, o
sus sales farmacéuticamente aceptables, en los que R_{3} es
morfolinilo; y R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son lo mismo o
diferente, e individualmente hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo,
alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo,
arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido,
heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; o R_{4}
tomado junto con R_{5}, y además tomado junto con los respectivos
átomos de carbono a los que estos grupos están ligados, forman un
arilo fusionado o un heterociclo sustituido o no
sustituido.
\newpage
La presente invención también proporciona un
compuesto que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un esteroisómero, o derivados de
grupos funcionales de alcohol y amina acetato, formato o benzoato, o
sus sales farmacéuticamente aceptables, en los que R_{1}, R_{2}
y R_{3} son lo mismo o diferente, e individualmente hidrógeno,
halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo
sustituido; y R_{4} tomado junto con R_{5}, y además tomado
junto con los respectivos átomos de carbono a los que estos grupos
están ligados, forman un arilo fusionado o un heterociclo sustituido
o no
sustituido.
La Figura 1 ilustra la capacidad de un compuesto
representativo para bloquear la inhibición mediada por
SIN-1 de la respiración mitocondrial en células
TC28.
También se describen compuestos, composiciones y
métodos que son útiles en el tratamiento de enfermedades artríticas
y/o enfermedades asociadas con una función mitocondrial alterada.
Más específicamente, los compuestos que tienen la siguiente
estructura (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un esteroisómero, profármaco o
sus sales farmacéuticamente
aceptables,
en el que
R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son lo mismo
o diferente, e individualmente hidrógeno, halógeno, hidroxi,
alquilo, alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo
sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido; o
R_{3} tomado junto con R_{4}, o R_{4} tomado junto con
R_{5}, y además tomado junto con los respectivos átomos de carbono
a los que estos grupos están ligados, forman un arilo fusionado o un
heterociclo sustituido o no sustituido.
Los términos anteriores tienen los siguientes
significados:
"Alquilo" significa una cadena lineal o
ramificada, cíclica o no cíclica, saturada o no saturada, alifática,
de hidrocarbonos, que contiene entre 1 y 10 átomos de carbono,
mientras que el término "alquilo inferior" tiene el mismo
significado que el alquilo, pero contiene entre 1 y 6 átomos de
carbono. Cadenas de alquilo lineales saturadas representativas
incluyen metilo, etilo, n-propilo,
n-butilo, n-pentilo o
n-hexilo; mientras que alquilos ramificados
saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo,
tert-butilo o isopentilo. Alquilos cíclicos saturados
representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo,
ciclohexilo, -CH_{2}ciclopropilo, -CH_{2}ciclobutilo,
-CH_{2}ciclopentilo o -CH_{2}ciclohexilo; mientras que alquilos
cíclicos no saturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo. Los
alquilos cíclicos, también denominados "anillos homocíclicos",
incluyen anillos di- y poli-homocíclicos tales como
decalino y adamantilo, Los alquilos no saturados contienen al menos
un puente doble o triple entre átomos de carbono adyacentes
(denominados como un "alquenilo" o "alquinilo",
respectivamente). Alquenilos de cadena lineal y ramificada
representativos incluyen etilenilo, propilenilo,
1-butenilo, 2-butenilo,
isobutilenilo, 1-pentenilo,
2-pentenilo,
3-metil-1-butenilo,
2-metil-2-butenilo ó
2,3-dimetil-2-butenilo;
mientras que alquinilos de cadena recta o ramificada representativos
incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo,
2-butinilo, 1-pentinilo,
2-pentinilo ó
3-metil-1-butinilo.
"Arilo" significa un resto carbocíclico
aromático tal como el fenilo o naftilo.
"Arilalquilo" significa un alquilo que
tiene al menos un átomo de hidrógeno alquilo reemplazado con un
resto arilo, tal como bencilo, -CH_{2}(1 ó
2-naftilo), -(CH_{2})_{2}fenilo,
-(CH_{2})_{3}fenilo ó -CH(fenil)_{2}.
"Heteroarilo" significa un anillo
heterocíclico aromático de 5 a 10 miembros, y que tiene al menos un
heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno o azufre, y que
contiene al menos 1 átomo de carbono, incluyendo sistemas de anillos
tanto mono- como bicíclicos. Heteroarilos representativos incluyen
furilo, benzofuranilo, tiofenilo, benzotiofenilo, pirrolilo,
indolilo, isoindolilo, azaindolilo, piridilo, quinolinilo,
isoquinolinilo, oxazolilo, isooxazolilo, benzoxazolilo, pirazolilo,
imidazolilo, bencimidazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo,
isotiazolilo, piridacinilo, pirimidinilo, piracinilo, triacinilo,
cinnolinilo, ptalacinilo o quinazolinilo.
"Heteroarilalquilo" significa un alquilo
que tiene al menos un átomo de alquilo hidrógeno reemplazado por un
resto heteroarilo, tal como -CH_{2}piridinilo o
-CH_{2}pirimidinilo.
"Heterociclo" (también denominado aquí como
"anillo heterociclo") significa un anillo heterociclo de 5 a 7
miembros monocíclico, o de 7 a 14 miembros policíclico, que está o
bien saturado, o bien insaturado, o bien es aromático, y que
contiene de 1 a 4 heteroátomos independientemente seleccionados de
nitrógeno, oxígeno y azufre, y en el que los heteroátomos de
nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el
heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado,
incluyendo anillos bicíclicos en los que cualquiera de los
heterociclos anteriores están fusionados a un anillo de benceno, así
como anillos heterocíclicos tricíclicos (y superiores). El
heterociclo puede estar ligado a través de cualquier heteroátomo o
átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se
definieron anteriormente. Así, además de los heteroarilos aromáticos
listados previamente, los heterociclos también incluyen
morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo,
hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo,
tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo,
tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo,
tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo o
tetrahidrotiopiranilo.
"Heterocicloalquilo" significa un alquilo
que tiene al menos un átomo de alquilo hidrógeno reemplazado con un
heterociclo, tal como -CH_{2}morfolinilo.
El término "sustituido" significa
cualquiera de los grupos anteriores (por ejemplo alquilo, arilo,
arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo,
heterocicloalquilo, etc.), en el que al menos un átomo de hidrógeno
está reemplazado con un sustituto. En el caso de un sustituto ceto
("=O"), se reemplazan dos átomos de hidrógeno. Cuando
sustituyen, los "sustitutos" incluyen halógeno, hidroxi, ciano,
nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo, alcoxi,
alquiltío, haloalquilo, arilo, arilo sustituido, arilalquilo,
arilalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido,
heteroarilalquilo, heteroarilalquilo sustituido, heterociclo,
heterociclo sustituido, heterocicloalquilo, heterocicloalquilo
sustituido, -NR_{a}R_{b}, -NR_{a}C(=O)R_{b},
-NR_{a}C(=O)NR_{a}NR_{b},
-NR_{a}C(=O)OR_{b}, -NR_{a}SO_{2}R_{b}, -OR_{a},
-C(=O)R_{a}, -C(=O)OR_{a},
-C(=O)NR_{a}R_{b}, -OC(=O)NR_{a}R_{b}, -SH,
-SR_{a}, -SOR_{a}, -S(=O)_{2}R_{a},
-OS(=O)_{2}R_{a}, -S(=O)_{2}OR_{a}, donde
R_{a} y R_{b} son lo mismo o diferente, e independientemente
hidrógeno, alquilo, haloalquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo
sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heteroarilo,
heteroarilo sustituido, heteroarilalquilo, heteroarilalquilo
sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo
o heterocicloalquilo sustituido. Por ejemplo, el alquilo sustituido
incluye trifluorometilo.
"Halógeno" significa flúor, cloro, bromo y
yodo.
"Haloalquilo" significa un alquilo que
tiene al menos un átomo de hidrógeno reemplazado con un halógeno,
tal como trifluorometilo.
"Alcoxi" significa un resto alquilo ligado
a través de un puente de oxígeno (es decir,
-O-alquilo), tal como metoxi, etoxi.
En una descripción más específica, al menos dos
de R_{1} a R_{5} son hidrógeno, y en otra descripción, al menos
tres de R_{1} a R_{5} son hidrógeno, y todavía en otra
descripción al menos cuatro de R_{1} a R_{5} son hidrógeno.
En otra descripción más, al menos uno de R_{1}
a R_{5} es un heterociclo, tal como morfolinilo.
En todavía otra descripción, R_{3} tomado
junto con R_{4}, o R_{4} tomado junto con R_{5}, y además
tomados juntos con el respectivo átomo de carbono a los que estos
grupos están ligados, forman un arilo fusionado o un heterociclo
sustituido o no sustituido. Por ejemplo, en el caso de un arilo
sustituido o no sustituido, los compuestos representativos tienen
la siguiente estructura (II), cuando R_{4} y R_{5} tomados
juntos forman un arilo fusionado, y la estructura (III), cuando
R_{3} y R_{4} tomados juntos forman un arilo fusionado:
donde la parte de arilo fusionado
de la estructura (II) o (III) puede estar opcionalmente sustituida
por uno o más sustitutos como se definieron
anteriormente.
Los compuestos de la presente invención pueden
prepararse por técnicas conocidas de síntesis orgánica, incluyendo
los métodos descritos en más detalle en los Ejemplos. En general,
los compuestos de esta invención pueden prepararse mediante el
siguiente Esquema de Reacción:
Esquema de
Reacción
En el Esquema de Reacción anterior, la
N-ciano-S-metilisotiourea
1 se disuelve en i-PrOH, seguido de la adición de
NaOH. La solución resultante se calienta y después se enfría para
generar la sal intermedia, la dicianamida de sodio 2. Esta sal
intermedia se añade después a la analina 3 apropiadamente
sustituida, en HCl. La mezcla de reacción se calienta, se enfría y
después se evapora para proporcionar un compuesto de la estructura
(I) como un producto crudo, que después puede purificarse para
proporcionar un compuesto de la estructura (I) que tiene la pureza
deseada.
Como se ha destacado anteriormente, los
parámetros clínicos y los criterios para determinar la presencia o
el riesgo de una enfermedad artrítica están bien establecidos (por
ejemplo, Gilliand et al., "Disorders of the joints and
connective tissue", Section 14, Harrison's Principles of
Internal Medicine, Octava Ed., Thorn et al., eds,
McGraw-Hill, New Cork, NY, 1977, pags.
2048-2080), como lo están los criterios para
determinar la presencia o el riesgo de un número de otras
enfermedades asociadas con una función mitocondrial alterada, como
también se proporcionan aquí (por ejemplo, para AD, McKhann et
al., Neurology 34:939, 1984; DeKosky et al., Ann
Neurology 27(5):467-64, 1990; para la diabetes,
Gavin et al., Diabetes Care 22(suppl.
1):S5-S19, 1999; -otros criterios diagnósticos para
enfermedades asociadas con una función mitocondrial alterada serán
familiares para los generalmente expertos en la técnica, y basados
en la descripción actual). Una "función mitocondrial alterada"
puede referirse a cualquier condición o estado, incluyendo aquellos
que pueden, según una teoría no limitante, acompañar a una
enfermedad artrítica, donde cualquier estructura o actividad que
está directa o indirectamente relacionada con una función
mitocondrial se ha cambiado de una forma estadísticamente
significativa, en relación a un testigo o estándar. La función
mitocondrial alterada puede tener su origen en estructuras o
eventos extramitocondriales, así como en estructuras o eventos
mitocondriales, en interacciones directas entre genes
mitocondriales y extramitocondriales y/o sus productos génicos, o en
cambios estructurales o funcionales que ocurren como resultado de
las interacciones entre productos intermedios que pueden formarse
como resultado de dichas interacciones, incluyendo metabolitos,
catabolitos, sustratos, precursores o cofactores.
Adicionalmente, una función mitocondrial
alterada puede incluir una alteración de la actividad respiratoria,
metabólica o cualquier otra actividad bioquímica o biofísica, en
algunas o todas las células de una fuente biológica. Como ejemplos,
la actividad ETC marcadamente alterada puede estar relacionada con
una función mitocondrial alterada, como puede ser la generación de
especies de oxígeno reactivas (ROS), o la deficiente fosforilación
oxidativa. Como otros ejemplos, la alteración del potencial de
membrana mitocondrial (por ejemplo, Documento PCT/US99/22261;
Documento PCT/US00/17380), la alteración de la regulación
mitocondrial de la homeostasis del calcio intracelular (por
ejemplo, la Patente de EE UU Nº 6.140.067), la inducción de vías de
apoptosis y la formación de especies entrecruzadas químicas y
bioquímicas atípicas dentro de una célula, por mecanismos
enzimáticos o no enzimáticos, también pueden verse como indicativos
de una función mitocondrial alterada. Estos y otros ejemplos de
función mitocondrial alterada se describen en mayor detalle más
adelante.
Sin desear estar ligado a una teoría, una
función mitocondrial alterada que puede ser característica de una
enfermedad artrítica o de otra enfermedad asociada con función
mitocondrial alterada, como aquí se proporciona, puede también
estar relacionada con la pérdida del potencial electromecánico de la
membrana mitocondrial por mecanismos distintos de la oxidación de
radicales libres, por ejemplo por defectos en las vías y
transportadores de la membrana transmitocondrial, tales como el
transportador mitocondrial nucleótido adenina, o el transportador
malato-aspartato, por flujo intracelular de calcio,
por defectos en la biosíntesis de ATP, por alteración de la
asociación con la porina mitocondrial (también conocida como, por
ejemplo, canal de aniones dependiente de voltaje, VDAC) de las
hexoquinasas u otras enzimas, o por otros eventos. Tal colapso del
potencial de la membrana interna mitocondrial puede ser el
resultado de efectos directos o indirectos de genes, productos de
genes o de moléculas mediadoras relacionadas aguas abajo
mitocondriales, y/o de genes, productos de genes o mediadores
relacionados aguas abajo extramitocondriales, o por otras causas
conocidas o no conocidas.
Como antecedentes, las mitocondrias funcionales
contienen productos de genes codificados por genes mitocondriales
situados en el DNA mitocondrial (mtDNA), y por genes
extramitocondriales (por ejemplo, genes nucleares), no situados en
el genoma circular mitocondrial. El mtDNA de 16,5 kb codifica 22
tRNA, dos RNA ribosomales (rRNA) y 13 enzimas de la cadena de
transporte de electrones (ETC), el elaborado sistema de ensamblaje
multi-complejo mitocondrial en el que, por ejemplo,
tiene lugar la fosforilación oxidativa respiratoria. La inmensa
mayoría de las proteínas estructurales y funcionales mitocondriales
están codificadas por genes extramitocondriales y en la mayoría de
los casos, presumiblemente nucleares. Según esto, los genes
mitocondriales y extramitocondriales pueden interactuar
directamente, o indirectamente a través de productos de genes y sus
intermediarios aguas abajo, incluyendo metabolitos, catabolitos,
sustratos, precursores o cofactores. Las alteraciones en la función
mitocondrial, por ejemplo la alteración en la actividad de
transporte de electrones, la fosforilación oxidativa defectuosa o
el aumento de la producción de radicales libres, pueden por lo tanto
emerger como resultado de un mtDNA defectuoso, un DNA
extramitocondrial defectuoso, productos de genes mitocondriales o
extramitocondriales defectuosos, intermediarios aguas abajo
defectuosos, o una combinación de éstos y otros factores.
Según ciertas realizaciones de la presente
invención, cuando se relacionan con una enfermedad artrítica y/o
una enfermedad asociada con una función mitocondrial alterada, la
determinación de la función mitocondrial alterada (por ejemplo,
aumento o disminución de una forma estadísticamente significativa en
relación a un testigo), puede implicar la monitorización de la
homeostasis intracelular de calcio y/o las respuestas celulares a
las perturbaciones de esta homeostasis, incluyendo la regulación
fisiológica y patofisiológica del calcio. En particular, según
estas realizaciones, una respuesta celular a un calcio intracelular
elevado en una muestra biológica de un sujeto conocido o sospechoso
de padecer una enfermedad asociada con una función mitocondrial
alterada, se compara con la respuesta en una muestra biológica de un
sujeto de control. El intervalo de respuestas celulares a la
elevación del calcio intracelular es muy amplio, como lo es el
intervalo de métodos y reacciones para la detección de dichas
respuestas. Muchas respuestas celulares específicas son conocidas
para los habitualmente expertos en la técnica; estas respuestas
dependerán de los tipos particulares de células presentes en una
muestra biológica seleccionada. Como ejemplos no limitantes, las
respuestas celulares a una elevación del calcio intracelular
incluyen la secreción de productos secretorios específicos,
exocitosis de componentes preformados particulares, aumento en el
metabolismo del glucógeno y proliferación de células (véase, por
ejemplo, Clapham, Cell 80:259, 1995; Cooper, The Cell - A
Molecular Approach, 1997 ASM Press, Washington, DC; Alberts B,
Bray D, et al., Molecular Biology of the Cell, 1995
Garland Publishing, NY).
Como un breve recordatorio, las alteraciones
normales del Ca^{2+} mitocondrial se asocian con una regulación
metabólica normal (Dykens, 1998 en Mitochondria & Free
Radicals in Neurodegenerative Diseases, Beal, Howell y
Bodis-Wolner, Eds., Wiley-Liss, New
Cork, pags. 29-55; Radi et al., 1998 en
Mitochondria & Free Radicals in Neurodegenerative
Diseases, Beal, Howell y Bodis-Wolner, Eds.,
Wiley-Liss, New Cork, pags. 57-89;
Gunter y Pfeiffer, Am J Physiol 27:C755, 1991; Gunter et
al., Am J Physiol 267:313, 1994). Por ejemplo, los
niveles fluctuantes de Ca^{2+} libre mitocondrial pueden ser los
responsables de la regulación del metabolismo oxidativo en
respuesta a una utilización aumentada de ATP, a través de la
regulación alostérica de enzimas (revisado por Crompton et
al., Basic Res Cardiol 88:513-23, 1993)
y el vehículo glicerofosfato (Gunter et al., J Bioenerg
Biomembr 26:471, 1994).
La función mitocondrial normal incluye la
regulación de los niveles de calcio libre citosólico, mediante el
secuestro del exceso de Ca^{2+} dentro de la matriz mitocondrial.
Dependiendo del tipo celular, la concentración citosólica de
Ca^{2+} es típicamente 50-100 nM: En células que
funcionan normalmente, cuando los niveles de Ca^{2+} alcanzan
200-300 nM, las mitocondrias comienzan a acumular
Ca^{2+} como una función de equilibrio entre el influjo a través
de un uniportador de Ca^{2+} en la membrana mitocondrial interna y
el reflujo de Ca^{2+} a través de transportadores tanto
dependientes de Na^{+} como independientes de Na^{+}. En
ciertas instancias, tal perturbación de la homeostasis del calcio
intracelular es un hecho de las enfermedades asociadas con una
función mitocondrial alterada, sin tener en cuenta si la disfunción
regulatoria del calcio es causa de, o consecuencia de, una función
mitocondrial alterada.
Los niveles elevados de calcio mitocondrial
pueden acumularse como respuesta a una elevación inicial en el
calcio libre citosólico, como se describió previamente. Dichas
concentraciones elevadas de calcio mitocondrial, en combinación con
un ATP reducido u otras condiciones asociadas con la patología
mitocondrial, puede llevar al colapso del potencial de la membrana
interna mitocondrial (véase Gunter et al., Biochim Biophys
Acta 1366:5, 1998; Rottenberg y Marbach, Biochim Biophys Acta
1016:87, 1990). Generalmente, el nivel extramitocondrial
(citosólico) de Ca^{2+} en una muestra biológica es mayor que el
presente dentro de la mitocondria. En el caso de una enfermedad
asociada con una función mitocondrial alterada, los niveles de
calcio mitocondrial o citosólico pueden variar desde los intervalos
anteriores, y puede estar en el intervalo, por ejemplo, de desde
alrededor de 1 nM hasta alrededor de 500 mM, más típicamente desde
alrededor de 10 nM hasta alrededor de 100 \muM, y generalmente de
desde alrededor de 20 nM hasta alrededor de 1 \muM, donde
"alrededor" indica \pm 10%. Se conocen una variedad de
indicadores de calcio en la técnica, incluyendo pero sin limitarse
a, por ejemplo, fura-2 (McCormack et al.,
Biochim Biophys Acta 973:420, 1989);
mag-fura-2; BTC (Patente de EE UU
Nº 5.501.980); fluo-3, fluo-4 y
fluo-5N (Patente de EE UU Nº 5.049.673);
rhod-2; benzotiaza-2 (todos los
cuales están disponibles de Molecular Probes, Eugene, OR). Estos y
otros medios para monitorizar el calcio intracelular están
contemplados para determinar la presencia de una función
mitocondrial alterada (véase, por ejemplo, PCT/US01/01500).
Así, para determinar una función mitocondrial
alterada que se manifiesta como una respuesta celular a una
elevación del calcio intracelular, los compuestos que inducen el
aumento de las concentraciones citoplasmáticas y mitocondriales de
Ca^{2+}, incluyendo los ionóforos de calcio, son bien conocidos
para los expertos en la técnica, así como lo son los métodos para
medir el calcio intracelular (véase, por ejemplo, Gunter y Gunter,
J Bioenerg Biomembr 26:471, 1994; Gunter et al.,
Biochim Biophys Acta 1366:5, 1998; McCormack et al.,
Biochim Biophys Acta 973:420, 1989; Orrenius y Nicotera,
J Neural Transm Suppl 43:1, 1994; Leist y Nicotera, Rev
Physiol Biochem Pharmacol 132:79, 1998; y Haugland, 1996,
Handbook of Fluorescents Probes and research Chemicals- Sexta
Ed., Molecular Probes, Eugene, OR). Según esto, una persona
experta en la técnica puede fácilmente seleccionar un ionóforo
adecuado (u otro compuesto que de como resultado un aumento en las
concentraciones de Ca^{2+} citoplasmático y/o mitocondrial), y
unos medios apropiados para detectar el calcio intracelular, que
puedan utilizarse para identificar una función mitocondrial
alterada, de acuerdo con la descripción actual y con métodos bien
conocidos.
El influjo de Ca^{2+} al interior de la
mitocondria parece ser mayoritariamente dependiente, y puede ser
completamente dependiente, del potencial electroquímico
transmembrana negativo (\Delta\Psi), establecido en la membrana
interna mitocondrial por transferencia de electrones, y dicho
influjo deja de ocurrir en ausencia de \Delta\Psi incluso
cuando se impone un gradiente de concentración de Ca^{2+} ocho
veces mayor (Kapus et al., 1991 FEBS Let 282:61).
Según esto, las mitocondrias pueden liberar Ca^{2+} cuando el
potencial de membrana se disipa, como ocurre con desligadores como
2,4-dinitrofenol y
carbonil-cianuro-p-trifluoro-metoxifenilhidrazona
(FCCP). Así, según ciertas realizaciones de la presente invención,
el colapso de \Delta\Psi puede potencialmente producirse por
influjos de calcio libre citosólico al interior de la mitocondria,
así como puede ocurrir bajo ciertas condiciones fisiológicas,
incluyendo las encontradas por células de un sujeto que tiene una
enfermedad artrítica. La detección de dicho colapso puede
conseguirse por una variedad de métodos como se proporcionan
aquí.
En ciertas realizaciones relacionadas de la
invención, el potencial de la membrana mitocondrial alterado (por
ejemplo, aumentado o disminuido de una forma estadísticamente
significativa en relación a un testigo), puede ser un indicador de
una función mitocondrial alterada. Típicamente, el potencial de la
membrana mitocondrial puede determinarse según métodos que son
familiares para los expertos en la técnica, incluyendo la detección
y/o la medida de compuestos detectables tales como indicadores
fluorescentes, sondas ópticas y/o electrodos PH sensibles e
ión-selectivos (véase, por ejemplo, Emster et
al., J Cell Biol 91:227s, 1981; y las referencias allí
citadas; véase también Haugland, 1996 Handbook of Fluorescent
Probes and Research Chemical- Sexta Ed. Molecular Probes,
Eugene, OR, pags. 266-274 y
589-594). Por ejemplo, como medio de ilustración,
las sondas fluorescentes
2-,4-dimetilaminostiril-N-metil
piridino (DASPM) y los ésteres de tetrametilrodamina (tales como,
por ejemplo metil éster de tetrametilrodamina, TMRM; etil éster de
tetrametilrodamina, TMRE), o los compuestos relacionados (véase,
por ejemplo, Haugland, 1996, arriba), pueden cuantificarse
después de su acumulación en la mitocondria, un proceso que es
dependiente de, y proporcional a, el potencial de membrana
mitocondrial (véase, por ejemplo, Murphy et al., 1998, en
Mitochondria & Free Radicals in Neurodegenerative
Diseases, Beal, Howell y Bodis-Wollner, Eds.,
Wiley-Liss, New Cork, pags. 159-186,
y las referencias allí citadas; y Molecular Probes
On-line Handbook of Fluorescent Probes and Research
Chemicals, en http://www.probes.com/handbook/toc/htlm).
Otros compuestos fluorescentes detectables que pueden utilizarse en
la invención incluyen rodamina 123, hexil éster de rodamina B,
DiOC_{6}(3), JC-1[Yoduro de
5,5',6,6'-Tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbencimidazol-carbocianina]
(véase Patente de EE UU Nº 5.049.673; todos los compuestos
precedentes están disponibles de Molecular Probes, Eugene, Oregón)
y la rodamina 800 (Lambda Physik, GMBH, Göttingen, Alemania; véase
Sakanoue et al., J Biochem 121:29, 1997). Los métodos
para monitorizar el potencial de la membrana mitocondrial también se
describen en la Solicitud de EE UU Nº 09/161.172.
El potencial de membrana mitocondrial puede
también medirse por métodos no fluorescentes, por ejemplo,
utilizando TTP (ión de tetrafenilfosfonio), y un electrodo sensible
a TTP (Kamo et al., Membrana Biol 49:105, 1979; Porter
y Brand, Am J Physiol 269:R1213, 1995). Los expertos en la
técnica serán capaces de seleccionar compuestos detectables
apropiados u otros medios apropiados para medir el \Delta\Psim.
Como ejemplo, pero no como limitación, la TMRM es de alguna forma
preferible a la TMRE porque, después del flujo desde las
mitocondrias, la TMRE proporciona una señal residual levemente
mayor en el retículo endoplásmico y en el citoplasma que la
TMRM.
Como otro ejemplo, el potencial de membrana
puede ser adicionalmente o alternativamente calculado a partir de
medidas indirectas de la permeabilidad mitocondrial a solutos
cargados detectables, utilizando volumen de matriz y/o
determinación de redox del nucleótido piridina, combinadas con
cuantificación espectrofotométrica o fluorimétrica. La medida del
potencial de membrana dependiente del
intercambio-difusión de un sustrato a través de la
membrana mitocondrial interna puede también proporcionar una medida
indirecta del potencial de membrana (Véase, por ejemplo, Quinn,
1976, The Molecular Biology of Cell Membranas, University
Park Press, Baltimore, Maryland, pags. 200-217, y
las referencias allí citadas).
La exquisita sensibilidad a las extraordinarias
acumulaciones de Ca^{2+} que resultan de la elevación del calcio
intracelular, como se describió anteriormente, puede también
caracterizar una enfermedad asociada con una función mitocondrial
alterada. Adicionalmente, una variedad de agentes pertinentes
fisiológicamente, incluyendo el hidroperóxido y los radicales
libres, pueden actuar sinérgicamente con el Ca^{2+} para inducir
el colapso de \Delta\Psi (Novgorodov et al., Biochem
Biophys Acta 1058:242, 1991; Takeyama et al., Biochem
J 294:719, 1993; Guidox et al., Arch Biochem Biophys
306:139, 1993). Según esto, los ejemplos de métodos para
determinar una función mitocondrial alterada que se manifiesta en
las respuestas celulares a una elevación del calcio intracelular, o
como un potencial de membrana mitocondrial alterado, incluyen los
ensayos de potencial de membrana mitocondrial (\Delta\Psim)
(descritos en la Solicitud de Patente de EE UU copendiente, con Nº
de Serie 60/140.433), y los ensayos de transición de permeabilidad
mitocondrial (MPT) (descritos en la Solicitud de Patente de EE UU
copendiente, con Nº de Serie 09/161.172).
Una función mitocondrial alterada también puede
determinarse comparando una respuesta celular a un estímulo de
inducción de apoptosis ("apoptogénico") en una muestra
biológica de (i) un sujeto que se cree que tiene riesgo para una
enfermedad asociada a una función mitocondrial alterada, y (ii) un
sujeto de control. El intervalo de las respuestas celulares a
varios estímulos apoptogénicos conocidos es amplia, como lo es el
intervalo de métodos y reactivos para la detección de dichas
respuestas. Está por lo tanto dentro de la contemplación de la
presente invención, determinar una enfermedad asociada con una
función mitocondrial alterada, comparando una respuesta celular a
un estímulo apoptogénico, donde dicha respuesta es un indicador de
una función mitocondrial alterada como aquí se proporciona.
Como se ha destacado anteriormente, la
disfunción mitocondrial y/o los elevados niveles de ROS
relacionados, pueden iniciar precozmente eventos que llevan a la
apoptosis en varios tipos celulares (Kroemer et al., FASEB
J 9:1277-87, 1995; Zamzami et al., J
Exp Med 182:367-77, 1995; Zamzani et al.,
J Exp Med 181:1661-72, 1995; Ausserer et
al., Mol Cell Biol 14:5032-42, 1994). En
varios tipos celulares, la reducción en el potencial de membrana
mitocondrial (\Delta\Psim) precede a la degradación de DNA
nuclear que acompaña a la apoptosis. En sistemas libres de células,
las fracciones enriquecidas en mitocondrias, pero no las nucleares,
son capaces de inducir apoptosis nuclear (Newmeyer et al.,
Cell 70:353-64, 1994). La perturbación de la
actividad respiratoria mitocondrial que lleva a estados metabólicos
celulares alterados, tales como una elevación de ROS intracelular,
puede ocurrir en una enfermedad asociada con una función
mitocondrial alterada y puede posteriormente inducir eventos
patogénicos a través de mecanismos apoptóticos.
Las mitocondrias estresadas oxidativamente
pueden liberar un factor soluble preformado, que puede inducir
condensación cromosómica, un evento que precede a la apoptosis
(Marchetti et al., Cancer Res
56:2033-38, 1996). Además, miembros de la
familia Bcl-2 de productos génicos
anti-apoptóticos están localizados dentro de la
membrana mitocondrial externa (Monaghan et al., J
Histochem Cytochem 40:1819-25, 1992), y estas
proteínas parecen proteger las membranas del estrés oxidativo
(Korsmayer et al., Biochim Biophys Act 1271:63, 1995).
La localización de Bcl-2 en esta membrana parece
ser indispensable para la modulación de la apoptosis (Niguyen et
al., J Biol Chem 269:16521-24, 1994).
Así, los cambios en la fisiología de la mitocondria pueden ser
importantes mediadores de la apoptosis.
Una función mitocondrial alterada, como puede
utilizarse para identificar un riesgo para una enfermedad asociada
con una función mitocondrial alterada en un sujeto, según la
presente invención, puede de esta forma disminuir el dintel para la
inducción de apoptosis por un apoptógeno. Una variedad de
apoptógenos son conocidos para los expertos en la técnica (véase,
por ejemplo Green et al., Science 281:1309, 1998; y
las referencias allí citadas), y puede incluir, como ejemplos y no
como limitación, apoptógenos que, cuando se añaden a las células
bajo condiciones apropiadas, con las que los expertos en la técnica
serán familiares, requieren receptores específicos tales como el
factor de necrosis tumoral, FasL, glutamato, NMDA,
IL-1, IL-3, corticosterona, o
receptores de mineralocorticoides o glucocorticoides, Los
apoptógenos también pueden incluir herbimicina A (Manzini et
al., J Cell Biol 138:449-69, 1997);
paracuat (Constantini et al., Toxicology
99:1-2, 1995); etilén glicoles; inhibidores de
proteín quinasas tales como, por ejemplo estaurosporina, calfostina
C, fenetil éster de ácido cafeico, cloruro de queleritrina,
genisteína;
1-(5-isoquinolinesulfonil)-2-metilpiperacina;
N-[2-((p-bromocinamil)amino)etilo]-5-5-isoquinolinesulfonamida;
KN-93; quercitina; derivados de
d-eritro-esfingosina, radiación UV; ionóforos tales como, por
ejemplo ionomicina, valinomicina y otros ionóforos conocidos en la
técnica; inductores de MAP quinasas tales como, por ejemplo,
anisomicina y anandamina; bloqueantes del ciclo celular tales como,
por ejemplo afidicolina, colcemid, 5-fluoracilo y
homoharringtonina; inhibidores de la acetil colinesterasa tales
como, por ejemplo, berberina; anti-estrógenos tales
como, por ejemplo tamoxifeno; pro-oxidantes, tales
como, por ejemplo hidroperóxido de tert-butilo,
peroxinitrilo, peróxido de hidrógeno y donantes de óxido nítrico,
incluyendo pero no limitándose a L-arginina,
5,5'-dinitrosoditiol,
N-hidroxi-L-arginina,
S-nitroso-N-acetilpenicilamina,
S-nitrosoglutation, NOR-1,
NOR-3, NOR-4,
4-fenil-3-furoxancarbonitrilo,
3-morfolinosidnonimina, nitroprusiato sódico y
estreptozotocina; agentes depleccionadores de glutatión tales como,
por ejemplo ácido etacrínico (Meister, Biochim Biophis Acta
1271:35, 1995); radicales libres tales como por ejemplo, óxido
nítrico, iones metálicos inorgánicos, tales como, por ejemplo
cadmio; inhibidores de la síntesis de DNA tales como, por ejemplo,
actinomicina D; intercaladores de DNA tales como, por ejemplo
doxorubicina, sulfato de bleomicina, hidroxiurea, metotrexate,
mitomicina C, camptotecina, y daunorubicina; inhibidores de la
síntesis proteica tales como, por ejemplo cicloheximida, puromicina,
y rapamicina; agentes que afectan a la formación o la estabilidad
de los microtúbulos, tales como, por ejemplo: vinblastina,
vincristina, colchicina, 4-hidroxifenilretinamida,
y paclitaxel; y otros inductores de MPT tales como, por ejemplo,
proteína Bax (Jurgenmeier et al., PNAS
95:4997-5002, 1998); calcio y fosfato inorgánico
(Kroemer et al., Ann Rev Physiol 60:619, 1998).
Las células en una muestra biológica que son
sospechosas de estar desarrollando apoptosis pueden examinarse para
cambios morfológicos, de permeabilidad, u otros cambios que son
indicadores de un estado apoptótico. Por ejemplo, como ilustración,
la apoptosis en muchos tipos celulares pueden producir una
apariencia morfológica alterada, tal como la formación de burbujas
en la membrana plasmática, cambios de la forma celular, pérdida de
las propiedades de adhesión al sustrato, u otros cambios
morfológicos que pueden ser fácilmente detectables por una persona
experta en la técnica, por ejemplo utilizando un microscopio de luz.
Como otro ejemplo, las células que están desarrollando apoptosis
pueden exhibir fragmentación y desintegración de cromosomas, que
pueden ser aparentes por microscopía y/o a través del uso de
tinciones específicas de DNA o específicas de cromatina, que son
conocidos en la técnica, incluyendo tinciones fluorescentes. Dichas
células pueden también exhibir unas propiedades de permeabilidad de
membrana plasmática alterada, como puede ser fácilmente detectada a
través del uso de tinciones vitales (por ejemplo yoduro de propidio,
azul tripán), o mediante la detección de la salida de lactato
deshidrogenada al espacio extracelular. Estos y otros medios para
detectar células apoptóticas mediante criterios morfológicos,
permeabilidad de la membrana plasmática alterada, y otros cambios
relacionados serán aparentes para los expertos en la técnica.
Alternativamente, donde el indicador de una
función mitocondrial alterada es una respuesta celular a un
apoptógeno, las células en una muestra biológica pueden analizarse
para la translocación de la fosfatidilserina (PS) de la membrana
celular, desde la capa interna a la externa de la membrana
plamática, que puede detectarse, por ejemplo, midiendo la unión de
la capa externa por la proteína específica de PS, anexina (Martin
et al., J Exp Med 182:1545, 1996; Fadck et al.,
J Immunol 148:2207, 1992). En todavía otro método para
determinar una función mitocondrial alterada, monitorizando una
respuesta celular a un apoptógeno, la respuesta celular al
apoptógeno se determina mediante un ensayo para inducción de
actividad proteasa específica en cualquier miembro de una familia
de proteasas activadas por apoptosis, conocidas como caspasas
(véase, por ejemplo, Green et al., Science 281:1309, 1998).
Los expertos en la técnica serán fácilmente familiares con los
métodos para determinar la actividad caspasa, por ejemplo mediante
determinación de la escisión mediada por caspasa de sustratos
proteicos específicamente reconocidos. Estos sustratos pueden
incluir, por ejemplo,
poli-(ADP-ribosa)polimerasa (PARP), u otros
péptidos o proteínas naturales o sintéticos escindidos por las
caspasas que se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Ellerby
et al., J Neurosci 17:6165, 1997). El péptido
sintético
Z-Tir-Val-Ala-Asp-AFC
(SEQ ID NO:_:), en el que Z indica un resto
benzoil-carbonilo, y AFC indica
7-amino-4-trifluorometilcoumarina
(Kluck et al., Science 275:1132, 1997; Nicholson
et al., Nature 376:37, 1995), es uno de tales
sustratos. Otro ejemplo de sustratos incluye proteínas nucleares
tales como U1-70kDa y DNA-PKcs
(Rosen y Casciola-Rosen, J Cell Biochem
64:50, 1997; Cohen, Biochem J 326:1, 1997).
Como se ha descrito previamente, la membrana
interna mitocondrial puede exhibir una permeabilidad altamente
selectiva y regulada para muchos pequeños solutos, pero es
impermeable a moléculas grandes (>-10 kDa) (Véase, por ejemplo,
Quinn, 1976, The Molecular Biology of Cell Membranas,
University Park Press, Baltimore, Maryland). En las células que
están desarrollando apoptosis, sin embargo, el colapso del potencial
de la membrana mitocondrial puede estar acompañado por un aumento
en la permeabilidad que permite la difusión de macromoléculas a
través de la membrana mitocondrial. Así, en otro método para
analizar una respuesta celular a un apoptógeno, la detección de una
proteína mitocondrial, por ejemplo el citocromo c o una proteína del
espacio intermembrana, que ha escapado de las mitocondrias en las
células apoptóticas, puede proporcionar evidencia de una respuesta a
un apoptógeno que puede determinarse fácilmente (Liu et al.,
Cell 86:147, 1996). Dicha detección del citocromo c puede
realizarse espectrofotométricamente, inmunoquímicamente, o mediante
otros métodos bien establecidos para determinar la presencia de una
proteína específica.
Por ejemplo, la liberación de citocromo c de
células estimuladas con estímulos apoptóticos (por ejemplo,
ionomicina, un ionóforo de calcio bien conocido), puede
monitorizarse mediante una variedad de métodos inmunológicos. La
espectrometría de masas asistida por matriz de ionización deserción
de láser tiempo-de-vuelo
(Matriz-assisted laser desorption ionization
time-of-flight)
(MALDI-TOF), asociada con captura de afinidad, es
particularmente adecuada para tales análisis, ya que el
apo-citocromo c y el holo-citocromo
c pueden distinguirse sobre la base de sus pesos moleculares
únicos. Por ejemplo, el sistema Surface-Enhanced
Laser Desorption/Ionization (SELDI™) (Ciphergen, Palo Alto,
California), puede utilizarse para detectar el citocromo c liberado
de las mitocondrias en células tratadas con apoptógeno. En esta
aproximación, un anticuerpo específico contra citocromo c
inmovilizado en un sustrato sólido, se utiliza para capturar el
citocromo c presente en un extracto celular soluble. La proteína
capturada es después recogida en una matriz de una molécula de
absorción de energía (EAM) y se desabsorbe de la superficie del
soporte sólido utilizando excitación de láser pulsado. La masa
molecular de la proteína se determina por su tiempo de vuelo al
detector del espectrómetro de masas SELDI™.
\newpage
Una persona experta en la técnica apreciará
fácilmente que puede haber otras técnicas adecuadas para cuantificar
la apoptosis, y dichas técnicas, utilizadas con el propósito de
determinar una función mitocondrial alterada, como se manifiesta en
una respuesta celular a un estímulo apoptogénico, están dentro del
alcance de los métodos proporcionados por la presente invención.
La detección de la producción de radicales
libres en una muestra biológica puede también emplearse para
determinar la presencia de una función mitocondrial alterada, en
una muestra biológica de un sujeto. Aunque las mitocondrias son una
fuente primaria de radicales libres en sistemas biológicos (véase,
por ejemplo, Murphy et al., 1998 en Mitochondria and Free
Radicals in Neurodegenerative Diseases, Beal, Howell y
Bodis-Wollner, Eds., Wiley-Liss,
New Cork, pags 159-186, y las referencias allí
citadas), la invención no debería así limitarse, y la producción de
radicales libres puede ser un indicador de una función mitocondrial
alterada, sin tener en cuenta el lugar de la fuente subcelular
particular. Por ejemplo, numerosas vías intracelulares bioquímicas
que llevan a la formación de radicales, a través de la producción de
metabolitos tales como peróxido de hidrógeno, óxido nítrico o
radical superóxido, por medio de reacciones catalizadas por enzimas
tales como las oxidasas ligadas a flavina, la superóxido dismutasa
o la sintetasa de óxido nítrico, son bien conocidas en la técnica,
como lo son los métodos utilizados para detectar tales radicales
(véase, por ejemplo, Kelver, Crit Rev Toxicol 23:21, 1993;
Haliwell B et al., Free Radicals in Biology and
Medicine, 1989, Clarandon Press, Oxford, Reino Unido; Davies,
KJA et al., The Oxigen Paradox, Cleup Univ Press,
Padua, Italia). Una función mitocondrial alterada, tal como el
fracaso en cualquier etapa de la ETC, puede también llevar a la
generación de radicales libres altamente reactivos. Como se ha
resaltado anteriormente, los radicales resultantes de una función
mitocondrial alterada incluyen especies reactivas de oxígeno (ROS),
por ejemplo, radicales superóxido, peroxinitrilo e hidroxilo, y
potencialmente otras especies reactivas que pueden ser tóxicas para
las células. Según esto, en ciertas realizaciones preferidas de la
invención, un indicador de una función mitocondrial alterada puede
ser una especie de radical libre detectable, presente en una muestra
biológica. En ciertas realizaciones particularmente preferidas, el
radical libre detectable será un ROS.
Los métodos para detectar un radical libre que
puede ser útil como indicador de una función mitocondrial alterada
son conocidos en la técnica, y dependerán del radical particular.
Típicamente, un nivel de producción de radical libre en una muestra
biológica puede determinarse según los métodos con los que los
expertos en la técnica sean fácilmente familiares, incluyendo la
detección y/o medida de: productos de glicosilación incluyendo
pentosidina, carboximetilisina y pirrolina; productos de
lipoxidación incluyendo glioxal, malondialdehido y
4-hidroxinonenal; sustancias reactivas con ácido
tiobarbitúrico (TBARS; véase, por ejemplo, Steinbrecher et
al., Proc Nat Acad Sci USA 81:3883, 1984; Wolf, Br Med
Bull 49:642, 1993) y/o otros medios de detección química tales
como el atrapamiento de radicales hidroxilo por salicilato (por
ejemplo, Guiselli et al., Meths Mol Biol 108:89, 1998;
Halliwell et al., Free Radic Res 27:239, 1997) o
formación de aductos específicos (véase, por ejemplo, Macocci et
al., Ann Neurol 34:609, 1993; Giulivi et al.,
Meths Enzymol 233:363, 1994), incluyendo la formación de
malondialdehido, la nitrosilación de proteínas, la oxidación de DNA,
incluyendo la oxidación de DNA mitocondrial, los aductos
8'-OH-guanosina (por ejemplo,
Beckman et al., Mutant Res 424:51, 1999, la oxidación
de proteínas, la modificación carbonilo de proteínas (por ejemplo,
Baynes et al., Diabetes 40:405, 1991; Baynes et
al., Diabetes 48:1, 1999), las sondas de resonancia de spin
electrones (ESR), la voltametría cíclica, los indicadores
fluorescentes y/o quimioluminiscentes (véase también por ejemplo,
Greenwald, RA (ed), Handbook of Methods for Oxygen Radical
Research, 1985, CRC Press, Boca Raton, FL; Acworth y Balley,
(eds.), Handbook of Oxidative Metabolism, 1995, ESA, Inc.,
Chelmsford, MA; Yla-Herttuala et al., J
Clin Invest 84:1086, 1989; Velazques et al., Diabetes
Medicine 8:752, 1991; Belch et al., Int Arcgiol
14:385, 1995; Sato et al., Biochem Med 21:104,
1979; Traversa et al., Diabetología 41:265, 1998;
Haugland, 1996 Handbook of Fluorescent Probes and Research
Chemicals-Sexta Ed., Molecular Probes, Eugene,
OR, pags. 483-502, y las referencias allí citadas).
Por ejemplo, como ilustración, la oxidación de las sondas
fluorescentes diclorodihidrofluoresceína diacetato y su derivado
carboxilado carboxidiclorodihidrofluoresceína diacetato (véase, por
ejemplo, Haugland, 1996, arriba), pueden cuantificarse después de
la acumulación en células, un proceso que es dependiente de, y
proporcional a, la presencia de especies de oxígeno reactivas (véase
también, por ejemplo, Molecular Probes On-line
Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, en
http://www.probes.com/hadbook/toc.html). Otros compuestos
fluorescentes detectables que pueden utilizarse en la invención,
para la detección de producción de radicales libres incluyen los
derivados dihidrorrodamina y dihidrorrosamina, el ácido
cis-perinárico, los derivados resorufino, la
lucigenina y cualquier otro compuesto adecuado que puede ser
conocido para los expertos en la técnica.
Así, como también se ha descrito anteriormente,
el daño mediado por radicales libres puede inactivar una o más de
la miriada de proteínas de la ETC, y haciendo eso, puede desacoplar
el mecanismo quimiosmótico mitocondrial responsable de la
fosforilación oxidativa y de la producción de ATP. Los indicadores
de una función mitocondrial alterada que son factores de
biosíntesis de ATP, incluyendo la determinación de la producción de
ATP, se describen en mayor detalle, por ejemplo, en el Documento
PCT/US00/25317 y en la Patente de EE UU Nº 6.140.067. El daño
mediado por radicales libres a la integridad funcional mitocondrial
es solo un ejemplo de los múltiples mecanismos asociados con una
función mitocondrial alterada que pueden dar como resultado un
colapso del potencial electroquímico mantenido en la membrana
mitocondrial interna. Los métodos para detectar cambios en el
potencial de la membrana mitocondrial interna están descritos
anteriormente, y en la solicitud de patente de EE UU
co-pendiente número 09/161.172.
Las muestras biológicas pueden comprender
cualquier tejido o preparación celular en la que al menos puede
detectarse un indicador candidato de una función mitocondrial
alterada, y puede variar de naturaleza de acuerdo a esto,
dependiendo del indicador(es) particular que se va a
comparar. Así, como será aparente para los expertos en la técnica
con la descripción aquí incluida, en ciertas realizaciones altamente
preferidas, las muestras biológicas comprenden células o
preparaciones celulares que contienen mitocondrias, y en ciertas
otras realizaciones preferidas, las muestras biológicas pueden
comprender partículas submitocondriales. Las muestras biológicas
pueden proporcionarse mediante la obtención de una muestra de
sangre, un espécimen de biopsia, un explante de tejido, un cultivo
orgánico y cualquier otro tejido o preparación celular de un sujeto
o una fuente biológica. El sujeto o fuente biológica puede ser un
animal humano o no humano, un cultivo celular primario o un cultivo
de una línea celular adaptada, incluyendo líneas celulares
modificadas genéticamente que pueden contener secuencias de ácidos
nucleicos recombinantes integradas o episomales, líneas celulares
inmortalizadas o inmortalizables, líneas celulares de células
somáticas híbridas o de citoplasma híbrido ("cíbridas"), líneas
celulares diferenciadas o diferenciables, o líneas celulares
transformadas. En realizaciones particularmente preferidas, el
sujeto o fuente biológica es un vertebrado humano o no humano, y en
otras realizaciones particularmente preferidas el sujeto o fuente
biológica es un cultivo celular primario derivado de un vertebrado o
una línea celular adaptada a cultivo, como aquí se proporciona.
Como un ejemplo y medio de ilustración, en ciertas realizaciones la
invención se contempla una muestra biológica que puede ser un tejido
o preparación celular de un no vertebrado, que ha sido manipulado
artificialmente, por ejemplo a través de ingeniería genética
recombinante, para contener uno o más genes, productos de genes o
similares, derivados de vertebrados, tales como componentes
moleculares mitocondriales y/o factores de biosíntesis de ATP, como
se proporcionan, por ejemplo en el Documento PCT/US00/25317 y en la
Patente de EE UU Nº 6.140.067. Por ejemplo, un número de líneas
celulares de levaduras e insectos pueden reconstituirse fácilmente
con componentes derivados de vertebrados heterólogos, según los
métodos establecidos con los que los expertos en la técnica serán
familiares, para generar un modelo de sistema para una enfermedad
asociada con una función mitocondrial alterada como aquí se
proporciona.
En ciertas otras realizaciones particularmente
preferidas de la invención, el sujeto o fuente biológica puede ser
un sujeto sospechoso de tener o de estar en riesgo para tener una
enfermedad artrítica y/o una enfermedad asociada con una función
mitocondrial alterada, y en ciertas realizaciones preferidas de la
invención, el sujeto o fuente biológica puede ser conocida por
estar libre de el riesgo o la presencia de tal enfermedad. En
ciertas otras realizaciones preferidas, en las que es deseable
determinar si o no un sujeto o fuente biológica cae dentro de los
parámetros indicativos de una enfermedad artrítica, pueden
utilizarse los signos y síntomas de una enfermedad artrítica que
son aceptados por los expertos en la técnica, para designar a un
sujeto o fuente biológica, por ejemplo los signos clínicos
referidos en Primer on the Rheumatic Diseases (7ª Edición,
JH Klippel (ed), 1997, The Arthritis Foundation, Atlanta, GA), y las
referencias allí citadas, u otros métodos conocidos en la técnica
del diagnóstico de una enfermedad artrítica. De forma similar, los
parámetros clínicos indicativos de ciertas otras enfermedades
asociadas con una función mitocondrial alterada como aquí se
proporciona, son conocidos en la técnica y se han discutido
anteriormente.
En ciertas realizaciones de la invención, las
muestras biológicas de un sujeto o una fuente biológica en la que
se ha detectado al menos una función mitocondrial alterada, pueden
compararse antes y después de hacer contactar al sujeto o la fuente
biológica con una composición de la estructura (I), tal como un
agente aril N-cianoguanidino como aquí se
proporciona, por ejemplo, para identificar una función mitocondrial
candidata en la que el agente es capaz de efectuar un cambio,
relativo al nivel de la función mitocondrial antes de la exposición
del sujeto o fuente biológica al agente.
En una realización más preferida de la
invención, el contenido de la muestra biológica en la que se
determina una función mitocondrial alterada, comprende un
condrocito, y todavía más preferiblemente, un condrocito articular.
Los condrocitos pueden obtenerse, por ejemplo, de tejido
cartilaginoso maduro normal. Por ejemplo, las Patentes de EE UU Nº
4.846.835 y Nº 5.041.138, describen el aislamiento de condrocitos
mediante digestión del cartílago articular en una solución de
colagenasa, seguido de la expansión mitótica de los condrocitos
in vitro. En otra realización preferida de la invención, la
muestra biológica que contiene al menos un indicador candidato de
una función mitocondrial alterada, puede comprender una vesícula de
matriz (MV) derivada de un condrocito (por ejemplo, Anderson,
Rheum Dis Clin North AMER 14:303, 1988; Doyle, J Pathol
136:199, 1982; Doherty, Hosp. Pract Off Ed 29:93, 1994),
por ejemplo, una MV preparada según uno cualquiera de una serie de
procedimientos establecidos (por ejemplo, Jonson et al.,
J Bone Miner Res 14:883, 1999), o mediante otras técnicas con
las que serán familiares los expertos en la
técnica.
técnica.
El inicio de la calcificación de la matriz por
los condrocitos, así como por los osteoblastos, parece estar
mediada por la liberación de fragmentos celulares limitados a
membrana, conocidos como vesículas de matriz (MVs). Los componentes
de la MV, incluyendo una variedad de enzimas, modifican la matriz
extracelular, y los interiores de la MV sirven como un ambiente de
refugio para la formación de cristales de hidroxiapatita (Anderson,
Clin Orthopaed Rel Res 314:266-80, 1995;
Boskey et al., Calcio Tissue Int
60:309-15, 1997; Boskey, Connect Tissue Res
35:357-63, 1996; y Goldberg, Prog Histochem
Cytochem 31:1-187, 1996). Los métodos para
preparar MVs están descritos aquí, y otros métodos son conocidos en
la técnica (véase, por ejemplo, Jonson et al., J Bone
Miner Res 14:883-92, 1999, y la Patente de EE UU
Nº 5.656.450).
Las mitocondrias y las SMPs pueden prepararse
por una variedad de métodos (véase, por ejemplo, Fleischer et
al., Methods Enzymol 31:292-99, 1974; Pedersen
et al., Methods Cell Biol 20:411-81,
1978; Della-Cioppa et al., Mol Cell Endocrinol
48:111-20, 1986; y Lauquin et al.,
Biochim Biophys Acta 460:331-45, 1977). Por
ejemplo, para preparar mitocondrias y/o SMPs, puede utilizarse el
siguiente procedimiento. Se centrifugan lisados celulares a 600 x g
durante 10 minutos a 4ºC, y este primer sobrenadante se retira y se
deja a un lado. El centrifugado (pellet), que contiene material de
membrana plasmática, se lava con 100 \mul de MBS (manitol 210 mM,
sacarosa 70 mM, Tris-HCl, pH 7,4 50 mM, y EDTA 10
mM) y se centrifuga a 600 x g durante 10 minutos a 4ºC, para
producir un segundo sobrenadante. El primer y segundo sobrenadantes
se combinaron y se centrifugan a 14000 x g durante 15 minutos a
4ºC; el centrifugado (pellet) resultante representa una fracción
mitocondrial que se resuspende en MBS para preparar las
mitocondrias. Dichas mitocondrias pueden incubarse con 0,25 mg/ml de
digitonina (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN) durante
2 minutos, y sonicarse durante 3 minutos al 50% del ciclo de
trabajo, en un sonicador cup-hom, para producir
partículas submitocondriales (SMPs).
Según esto, una muestra biológica tal como se
proporciona aquí puede, en ciertas realizaciones preferidas,
comprender un condrocito, MVs derivadas de condrocitos, y/o
partículas submitocondriales (SMP) derivadas de condrocitos, en los
que se pueden comparar los niveles de uno o más indicadores de una
función mitocondrial alterada.
En otra realización preferida de la invención,
la muestra biológica, que contiene al menos un indicador candidato
de una función mitocondrial alterada, puede comprender sangre
completa, y puede, en otra realización preferida, comprender una
fracción cruda de la capa espumosa de sangre completa, que es
conocida en la técnica por contener además una fracción particulada
de sangre completa enriquecida en plaquetas y en células sanguíneas
nucleadas (por ejemplo, células sanguíneas blancas tales como
linfocitos, monocitos y granulocitos incluyendo neutrófilos,
eosinófilos y basófilos), y sustancialmente depleccionada de
eritrocitos. Los expertos en la técnica sabrán como preparar tal
fracción de capa espumosa, que puede prepararse, por ejemplo,
mediante sedimentación de densidad diferencial de los componentes
de la sangre bajo condiciones definidas, incluyendo el uso de un
medio de separación dependiente de densidad, o mediante otros
métodos. En otras realizaciones preferidas, la muestra biológica
que contiene al menos un indicador de una función mitocondrial
alterada, puede comprender una fracción de subpoblaciones de
células sanguíneas, enriquecida purificada o aislada, tal como, por
ejemplo, linfocitos, leucocitos polimorfonucleares, granulocitos y
similares. Los métodos para la preparación selectiva de
subpoblaciones de células hematopoyéticas particulares son bien
conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols
in Immunology, JE Coligan et al., (Eds.), 1988, John
Wiley & Sons, NY).
Según ciertas realizaciones de la invención, el
tipo celular particular o el tipo de tejido del que se obtiene la
muestra biológica, puede influenciar aspectos cualitativos o
cuantitativos de al menos un indicador candidato de una función
mitocondrial alterada contenido en ella, en relación al
correspondiente indicador candidato de una función mitocondrial
alterada obtenido de un tipo de célula o tejido diferente de una
fuente biológica común. Está por lo tanto dentro de la
contemplación de la invención cuantificar al menos un indicador
candidato de función mitocondrial alterada en muestras biológicas
de diferentes tipos de células o tejidos, ya que puede hacer que
las ventajas de la invención sean más útiles para una indicación
particular, por ejemplo, una enfermedad artrítica o una enfermedad
asociada con una función mitocondrial alterada como aquí se
proporciona, y además para un particular grado de progresión de una
enfermedad artrítica conocida o sospechada (o una enfermedad
asociada con una función mitocondrial alterada), en un sujeto
vertebrado. Los tipos de células o tejidos relevantes serán
conocidos para los expertos en dichas enfermedades.
Por ejemplo, como aquí se proporciona, los
condrocitos del cartílago articular pueden representar un tipo de
célula particularmente preferido en el contexto de una enfermedad
artrítica, y también lo pueden ser otros tipos celulares presentes
en los procesos de desarrollo, estabilización, mantenimiento y
reparación de la articulación, tales como la homeostasis del
cartílago, la cicatrización de un injerto de hueso o ligamento, la
resorción del tejido cicatricial, o el remodelado del tejido
conectivo, por ejemplo, las células óseas, los osteoblastos,
osteoclastos, células del estroma de la médula ósea, miocitos,
células de los nervios motores/placa terminal, células inflamatorias
y/o sinoviocitos.
Para determinar si una alteración mitocondrial
puede contribuir a un estado particular de enfermedad, puede ser
útil construir un modelo de sistema para análisis diagnóstico y para
escrutinio de agentes terapéuticos candidatos, en los que la carga
genética mitocondrial puede mantenerse constante, mientras que el
genoma mitocondrial se modifica. Se conoce en la técnica como
depleccionar el DNA mitocondrial de las células en cultivo para
producir células p^{0}, previniendo de esta forma la expresión y
la replicación de genes mitocondriales e inactivando la función
mitocondrial. Es además conocido en la técnica como repoblar dichas
células p^{0} con mitocondrias derivadas de células extrañas,
para estudiar la contribución del genotipo mitocondrial del donante
al fenotipo respiratorio de las células recipientes. Tales células
híbridas citoplásmicas, que contienen DNA genómico y mitocondrial
de diferentes orígenes biológicos, son conocidas como cíbridas.
Vease, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 95/26973
y la Patente de EE UU Nº 5.888.498 y las referencias allí
citadas.
En ciertas otras realizaciones, la invención
proporciona un método para tratar a un paciente que tiene una
enfermedad artrítica, administrando al paciente una composición que
comprende un agente que tiene la estructura (I), que mejora
sustancialmente (por ejemplo, altera para acercarlo al estado del
testigo o al estado asintomático de una forma estadísticamente
significativa), al menos un criterio clínico para tener o estar en
riesgo de tener una enfermedad artrítica (véase, por ejemplo,
Primer on the Rheumatic Diseases, 7ª Edición, JH Klippel
(ed.), 1997 The Arthritis Foundation, Atlanta, GA). La invención
también proporciona un método de tratar a un paciente que tiene una
enfermedad asociada con una función mitocondrial alterada,
administrando al paciente una composición que contiene un agente
que tiene la estructura química (I) que mejora sustancialmente (por
ejemplo, altera para acercarlo al estado del testigo o al estado
asintomático de una forma estadísticamente significativa), al menos
un criterio clínico para tener o estar en riesgo de tener dicha
enfermedad, como se conoce en la técnica y se proporciona aquí.
Aquellos expertos en la técnica podrán determinar fácilmente si un
cambio en dicho criterio clínico trae ese nivel más cerca de un
valor normal y/o beneficia clínicamente al sujeto. Así, un agente
preferido proporcionado por la presente invención puede incluir un
agente capaz de restaurar completa o parcialmente dicho nivel.
Según esto, en ciertas realizaciones preferidas
como aquí se proporcionan, una composición farmacéutica adecuada
para tratar una enfermedad artrítica y/o para tratar una enfermedad
asociada con una función mitocondrial alterada, comprende un agente
de la estructura (I), por ejemplo, un agente aril
N-cianoguanidino. En el caso de las enfermedades
artríticas, dichos agentes pueden utilizarse para prevenir o tratar
enfermedades artríticas, tales como la artrosis o las enfermedades
articulares degenerativas, y para promover la curación del cartílago
lesionado, por ejemplo, el cartílago dañado por traumatismo o por
una alteración de movimiento repetitivo. Sin querer ligarse a
ninguna teoría particular, algunos de dichos agentes pueden tener
actividad como antioxidantes, y presumiblemente actúan previniendo
o disminuyendo los efectos del daño a la mitocondria producido por
el estrés oxidativo (para una revisión, véase, por ejemplo,
Kowaltowski et al., Free Radical Biol Med
26:463-471, 1999). Estos y/o otros agentes
pueden actuar para prevenir la muerte celular programada
(apoptosis), que puede contribuir al desarrollo de la artrosis
(Blanco et al., Arthritis & Rheumatism
41:284-289, 1998), y/o de otras enfermedades
asociadas con una función mitocondrial alterada como aquí se
proporciona, o puede ejercer efectos clínicamente beneficiosos a
través de otros mecanismos.
Así, dentro de esas y otras realizaciones
relacionadas, una composición que contiene la estructura (I) (por
ejemplo, un agente aril N-cianoguanidino), tal como
los que se proporcionan aquí, se administra a un paciente en una
cantidad terapéuticamente efectiva. Una cantidad terapéuticamente
efectiva es una cantidad calculada para conseguir el efecto
deseado. Será aparente para los expertos en la técnica que la vía de
administración puede variar con el tratamiento particular. Las
rutas de administración pueden ser invasivas o no invasivas. Las
rutas de administración no invasivas incluyen la oral,
bucal/sublingual, rectal, nasal, tópica (incluyendo la transdérmica
y la oftálmica), vaginal, intravesical y pulmonar. Las rutas de
administración invasivas incluyen la intrarterial, intravenosa,
intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intratecal
e intraocular.
La dosis requerida puede variar con el
tratamiento particular y la vía de administración. En general, las
dosis para los compuestos de esta invención tales como los agentes
aril N-cianoguanidino de la estructura (I) como se
describen aquí, estarán entre alrededor de 1 y alrededor de 5
miligramos del compuesto por kilogramo de peso corporal del animal
hospedante por día; frecuentemente estarán entre alrededor de 100
\mug y alrededor de 5 mg, pero pueden variar hasta alrededor de
50 mg del compuesto por kg de peso corporal por día. La
administración terapéutica se realiza generalmente bajo la guía de
un médico, y las composiciones farmacéuticas contienen el agente en
un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estos vehículos son bien
conocidos en la técnica, y típicamente contienen sales no tóxicas y
soluciones de tampón. Tales vehículos pueden comprender soluciones
de tampón como solución salina tamponada fisiológicamente, solución
salina tamponada con fosfato, carbohidratos tales como glucosa,
manosa, sacarosa, manitol o dextranos, aminoácidos tales como
glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o
glutatión, adyuvantes y conservantes. Las sales no tóxicas
aceptables incluyen sales de adición de ácido o complejos de metal,
por ejemplo con zinc, hierro, calcio, bario, magnesio, aluminio o
similares (que se consideran como sales de adición para el propósito
de esta solicitud). Ejemplos ilustrativos de tales sales de adición
de ácido son cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, sulfato,
fosfato, tannato, oxalato, fumarato, gluconato, alginato, maleato,
acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato o
tartrato. Si el ingrediente activo se va a administrar en forma de
tableta, la tableta puede contener un ligador, tal como tragacanto,
almidón de maíz o gelatina; un agente desintegrante, tal como el
ácido algínico; y un lubricante, tal como el estearato de magnesio.
Si se desea la administración en forma líquida, pueden utilizarse
edulcorantes o saborizantes, y se puede efectuar la administración
intravenosa en solución salina isotónica o tamponada con
fosfato.
En una realización de la invención, las
composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos de
esta invención están contenidas dentro de liposomas. Los liposomas
son esferas microscópicas que tienen un núcleo acuoso rodeado por
una o más capas externas, hechas de lípidos colocados en una
configuración de bicapa (véase, por ejemplo, Chonn et al.,
Current Op Biotech 6:698, 1995). El potencial terapéutico de
los lisosomas como agentes de liberación de fármacos fue reconocida
hace casi treinta años (Sessa et al., J Lipid Res
9:310, 1968). Los liposomas incluyen "liposomas estabilizados
estéricamente", una expresión que, como aquí se utiliza, se
refiere a un liposoma que contiene uno o más lípidos especializados
que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado una
vida media en la circulación aumentada, en relación a los liposomas
que carecen de tales lípidos especializados. Ejemplos de lipososmas
estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la
porción lípida que forma la vesícula del liposoma (A) comprende uno
o más glicolípidos, tal como el monosialogangliósido G_{M1}, o
(B) es derivado con uno o más polímeros hidrófilos, tal como el
resto polietilén-glicol (PEG). Sin querer atarse a
una teoría particular, se piensa en la técnica que, la menos para
los lisosomas estabilizados estéricamente que contienen
gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivados de PEG, la vida
media circulatoria aumentada de estos liposomas estabilizados
estéricamente se deriva de una disminución en la ingestión por las
células del sistema retículoendotelial (RES) (Allen et al.,
FEBS Letters 223:42, 1987; Wu et al., Cancer
Research 53:3765, 1993).
Son conocidos en la técnica varios liposomas que
comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al.,
(Ann NY Acad Sci 507:64, 1987), refirieron la capacidad del
monosialogangliosido G_{M1}, el galactocerebrósido sulfato y el
fosfatidilinositol para mejorar la vida media de los liposomas.
Estos hallazgos fueron ampliados por Gabizon et al.,
(Proc Natl Acad Sci USA 85:6949, 1988). Las Patentes de EE UU
Nº 4.837.028 y de WO 88/04924, ambas de Allen et al.,
describen liposomas que contienen (1) esfingomielina y (2)
gangliósido G_{M1}o un éster de galactocerebrósido sulfato. La
Patente de EE UU Nº 5.543.152 (Webb et al.,) describe
liposomas que contienen esfingomielina. Los liposomas que contienen
1,2-sn-dimiristolfosfatidilcolina se describen en el
Documento WO 97/13499 (Lim et al.).
Varios liposomas que contienen lípidos derivados
de uno o más polímeros hidrófilos, y los métodos para su
preparación, son conocidos en la técnica. Sunamoto et al.,
(Bull Chem Soc Jpn 53:2778, 1980), describieron liposomas
que contienen un detergente no iónico, 2C_{12}15G, que contiene un
resto PEG. Illum et al., (FEBS Letters 167:79, 1984),
resaltaron que las partículas de poliestireno con cubierta hidrófila
de glicoles poliméricos, da como resultado una vida media sanguínea
significativamente aumentada. Los fosfolípidos sintéticos
modificados por la unión de grupos carboxílicos de polialquilén
glicoles (por ejemplo PEG), están descritos por Sears (Patentes de
EE UU Nº 4.426.330 y Nº 4.534.899). Klibanov et al., (FEBS
Letts 268:235, 1990), describieron experimentos que demuestran
que los liposomas que contienen fosfatidiletanolamina (PE) derivada
con PEG o estearato de PEG, tienen un aumento significativo en la
vida media de la circulación sanguínea. Blume et al.,
(Biochimica et Biophysica Acta 1029:91, 1990), ampliaron
dichas observaciones a otros fosfolípidos derivados de PEG, por
ejemplo DSPE-PEG, formado por la combinación de
distearoil-fosfatisdil-etanolamina
(DSPE) y PEG. Los liposomas que tienen restos PEG unidos
covalentemente en sus superficies externas, se describen en la
Patente Europea Nº 0 445 131 B1 y en el Documento WO 90/04384 de
Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen
1-20 moles por cien de PE derivada con PEG, y los
métodos para su utilización, han sido descritos por Woodle et
al., (Patentes de EE UU Nº 5.013.556 y Nº 5.356.633) y Martin
et al., (Patente de EE UU Nº 5.213.804 y la Patente Europea
Nº EP 0 496 813 B1). Los liposomas que contienen un número de otros
conjugados lípido-polímero se describen en el
Documento WO 91/05545 y en la Patente de EE UU Nº 5.225.212 (ambos
de Martin et al.) y en el Documento WO 94/20073 (Zalipsky
et al.). Los liposomas que contienen lípidos ceramida
modificados por PEG se describen en el Documento WO 96/10391 (Choi
et al.). Las Patentes de EE UU Nº 5.540.935 (Miyazaki et
al.) y Nº 5.556.948 (Tagawa et al.) describen liposomas
que contienen PEG que pueden ser modificados además con restos
funcionales en sus superficies.
Los compuestos de la presente invención (por
ejemplo, composiciones de la estructura (I) tales como los agentes
aril N-cianoguanidino), como se proporcionan en la
presente invención también incluyen sus profármacos. Como aquí se
utilizan, un "profármaco", es cualquier vehículo unido
covalentemente que libera in vivo el fármaco activo
parental, cuando dicho profármaco se administra a un sujeto
vertebrado Los profármacos de un compuesto dado se preparan
modificando los grupos funcionales presentes en el compuesto, de tal
forma que las modificaciones son escindidas, en manipulación de
rutina o in vivo, para producir el compuesto parental. Los
profármacos incluyen compuestos en los que grupos hidroxilo o amino
se unen a cualquier grupo del compuesto parental a través de un
puente que, cuando el profármaco se administra a un sujeto, se
escinde para formar un hidroxilo o amino libre, respectivamente.
Ejemplos representativos de profármacos incluyen derivados de grupos
funcionales alcohol y amina de acetato, formato y benzoato.
Los "vehículos farmacéuticamente
aceptables" para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica
farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remingtons
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (AR Gennaro, ed,
1985). Por ejemplo, pueden utilizarse solución salina estéril y
solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico. En la
composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes,
estabilizadores, tinciones e incluso agentes saborizantes. Por
ejemplo, pueden añadirse como conservantes benzoato sódico, ácido
sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Además pueden
utilizarse agentes anti-oxidantes y suspensores.
Opcionalmente, para ciertas rutas de administración, puede incluirse
en la formulación un anestésico.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los
compuestos de esta invención pueden prepararse mediante métodos bien
conocidos en la técnica, tal como haciendo reaccionar las formas
base o ácido libres de estos compuestos con una cantidad
estoiquiométrica de la base o el ácido apropiados en agua o en un
disolvente orgánico. Las sales adecuadas en este contexto pueden
encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences 17ª Ed.,
Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985.
Como ejemplo, las sales adecuadas
farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención,
incluyen sales de adición de ácido que pueden, por ejemplo,
formarse mezclando una solución del compuesto según la invención
con una solución de un ácido aceptable, tal como ácido bromhídrico,
ácido clorhídrico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido
p-toluensulfónico, ácido málico, ácido maleico,
ácido metanosulfónico, ácido succínico, ácido acético, ácido
cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico, ácido fosfórico o ácido
sulfúrico. Las sales puede formarse por métodos convencionales,
tales como haciendo reaccionar la forma base libre del producto con
uno o más equivalentes del ácido apropiado en un disolvente o medio
en el que la sal es insoluble, o en un disolvente tal como agua,
que es eliminada in vacuo o mediante congelación en seco o
mediante intercambio de aniones de una sal existente por otro
anión, sobre una resina de intercambio iónico adecuada. Como
ejemplo, las sales adecuadas farmacéuticamente aceptables del
compuesto de esta invención incluyen sales de adición de ácido que
pueden, por ejemplo, formarse mezclando una solución del compuesto
según la invención, con una solución de un ácido aceptable tal como
ácido bromhídrico, ácido clorhídrico, ácido fumárico, ácido oxálico,
ácido p-toluensulfónico, ácido málico, ácido
maleico, ácido metanosulfónico, ácido succínico, ácido acético,
ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico, ácido fosfórico o
ácido sulfúrico. Las sales pueden formarse por métodos
convencionales, tales como haciendo reaccionar la forma base libre
del producto con uno o más equivalentes del ácido apropiado en un
disolvente o medio en el que la sal es insoluble, o en un disolvente
tal como agua, que es eliminada in vacuo o mediante
congelación en seco o mediante intercambio de aniones de una sal
existente por otro anión, sobre una resina de intercambio
iónico
adecuada.
adecuada.
Las composiciones farmacéuticas que contienen
uno o más compuestos de la invención como aquí se describe, pueden
estar de cualquier forma que permita que la composición sea
administrada a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar
en forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). Las típicas rutas de
administración incluyen, sin limitación, oral, tópica, parenteral
(por ejemplo sublingualmente o bucalmente), sublingual, rectal,
vaginal e intranasal. El término parenteral como aquí se utiliza
incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa,
intramuscular, intraesternal, intratecal, intracavernosa,
intrameatal, intraureteral o técnicas de infusión. La composición
farmacéutica se formula de tal forma que permite a los ingredientes
activos allí contenidos, que estén biodisponibles después de la
administración de la composición a un paciente. Las composiciones
que se administrarán a un paciente toman la forma de una o más
unidades de dosis, donde, por ejemplo, una tableta puede ser una
unidad de dosis única, y un contenedor de uno o más compuestos de la
invención en forma de aerosol puede contener una pluralidad de
unidades de
dosis.
dosis.
Para la administración oral, puede estar
presente un excipiente y/o un ligador. Ejemplos de los mismos son
la sacarosa, caolín, glicerina, dextrinas de almidón, alginato
sódico, carboximetilcelulosa y etilcelulosa. Agentes colorantes y
saborizantes. Puede utilizarse una cubierta dura. La composición
puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, sirope,
solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para
administración oral o para liberación mediante inyección, como dos
ejemplos. Cuando el propósito es la administración oral, las
composiciones preferidas contienen, además de uno o más compuestos
de la estructura (I), uno o más de un agente edulcorante,
conservantes, tientes/colorantes y aumentadores del sabor. En una
composición con el propósito de administración mediante inyección,
pueden incluirse uno o más de un surfactante, conservante, agente
humidificante, agente dispersante, agente de suspensión, solución de
tampón, estabilizador y agente isotónico.
Una composición farmacéutica líquida como aquí
se utiliza, tanto en la forma de una solución como de una
suspensión, puede incluir uno o más de los siguientes adyuvantes:
diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución
salina, preferiblemente solución salina fisiológica, solución de
Ringer, cloruro sódico isotónico, aceites fijos tales como mono o
diglicéridos sintéticos, que pueden servir como disolvente o medio
de suspensión, polietilén glicoles, glicerina, propilén glicol u
otros disolventes; agentes antibacterianos tales como bencil
alcohol o metil parabén; antioxidantes tales como ácido ascórbico o
bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido
etilendiaminotetraacético; soluciones de tampón como acetatos,
citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad, tal como
cloruro sódico o dextrosa. La preparación parenteral puede incluirse
en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis
hechos de cristal o plástico. La solución salina fisiológica es un
adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es
preferiblemente estéril.
Una composición líquida con el propósito de
administración parenteral u oral debería contener una cantidad de
un compuesto de la estructura (I), de tal forma que se obtenga una
dosis adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos 0,01% del
peso de un compuesto de la invención en la composición. Cuando el
propósito es la administración oral, esta cantidad puede variar
para estar entre 0,1 y alrededor de 70% del peso de la composición.
Las composiciones orales preferidas contienen entre alrededor del
4% y alrededor del 50% del compuesto de la invención. Las
composiciones y preparaciones preferidas se preparan de tal forma
que una unidad de dosis parenteral contiene entre 0,01 y 1% por peso
del compuesto activo.
La composición farmacéutica puede tener el
propósito de administración tópica, en cuyo caso, el vehículo puede
comprender adecuadamente una base de solución, emulsión, ungüento o
gel. La base, por ejemplo, puede contener uno o mas de los
siguientes: petrolatum, lanolina, polietilén glicoles, cera de
abeja, aceite mineral, diluyentes como agua y alcohol, y
emulsionantes y estabilizantes. Los agentes engrosantes pueden estar
presentes en una composición farmacéutica para administración
tópica. Si el propósito es la administración transdérmica, la
composición puede incluir un parche transdérmico o un aparato de
iontofosresis. Las formulaciones tópicas pueden contener una
concentración del compuesto de la invención de desde alrededor de
0,1 hasta alrededor de 10% (peso/volumen) (peso por unidad de
volumen).
La composición farmacéutica puede tener el
propósito de administración rectal, en forma, por ejemplo, de un
supositorio que se disolverá en el recto y liberará el fármaco. La
composición para administración rectal puede contener una base
oleaginosa como excipiente adecuado no irritante. Dichas bases
incluyen lanolina, manteca de cacao y polietilén glicol.
En ciertos métodos preferidos de la invención,
el (los) compuesto(s) de la invención pueden administrarse a
través de inserto(s), bola(s), formulación(es)
de liberación temporal, parche(s), o formulación(es)
de liberación rápida. Será evidente para los habitualmente expertos
en la técnica, que la dosis óptima de el (los) agente(s)
puede depender del peso y las condiciones físicas del paciente; de
la gravedad y duración de la condición física que se va a tratar; de
la forma particular del ingrediente activo, la manera de
administración y de la composición empleada. Deberá entenderse que
el uso de compuestos de la presente invención en quimioterapia
puede incluir dicho agente unido a otro compuesto, por ejemplo, un
anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o un liposoma, que
ayude a la liberación de dicho compuesto.
Estas y otras ventajas relacionadas serán
apreciadas por los expertos en la técnica. Los siguientes ejemplos
se ofrecen como vía de ilustración.
N-Ciano-S-metilisotiourea
(1,38 g, 12,0 mmol), se disolvió en i-PrOH (18,0
ml). A esta solución en agitación, se añadió NaOH acuoso (2,0 M, 6,0
ml), y la mezcla de reacción resultante se calentó a 100ºC durante
30 minutos. La solución se dejó enfriar hasta temperatura ambiente,
y se añadieron partes de 2,0 ml (cada una conteniendo ca 1,0 mmol de
la sal intermedia putativa, dicianamida sódica), a una solución de
anilina (1,0 mmol) apropiada, en HCl_{(aq)} (1,0 M, 1,0 ml). La
mezcla de reacción se calentó a 100ºC durante 60 minutos con
agitación.
Después de enfriarse hasta temperatura ambiente,
la mezcla de reacción se evaporó bajo presión reducida,
proporcionando el producto crudo de la estructura (I). Antes de la
purificación, cada mezcla cruda se disolvió en MeOH (10 ml), se
sonicó para romper los sólidos, y se filtró a través de filtros de
membrana PTFE de 0,20 micras. Se llevó a cabo
RP-HPLC preparativa en un sistema de HPLC
automatizado Gilson 215, siendo cada derivado purificado en tres
lotes (3,3 ml de volumen de inyección) sobre una columna Betasil™
C18 (150 x 20 mm, 5 \mu partículas, 100 \tilde{\tilde{A}} poros,
Keystone Scientific, Inc., Bellefonte, PA). El producto se eluyó
utilizando un gradiente de MeCN:TFA (10000:5) en H_{2}O:TFA
(10000:5) a una tasa de flujo de 15 ml/min. Las fracciones
apropiadas se analizaron para la presencia del producto deseado
mediante LC/MS. Las fracciones combinadas se concentraron y se
co-evaporaron repetidamente con MeOH (3 x 5,0 ml).
Los análisis LC/MS y NMR se utilizaron para confirmación de la
estructura. Los rendimientos estaban en el intervalo de
10-65%.
Los compuestos representativos fabricados con
este procedimiento, junto con los correspondientes datos analíticos,
se resumen en la siguiente Tabla 1:
N-ciano-S-metilisotiourea (576 mg,
5,00 mmol) se disolvió en i-PrOH (7,5 ml). A esta
solución en agitación se añadió NaOH acuoso (2,0 M, 2,5 ml), y la
mezcla de reacción resultante se calentó a 100ºC durante 30 minutos.
La solución se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. A esta
solución dicianamida se añadió una solución de
4-hidroxi-2-metilalanina
(616 mg, 5,00 mmol) en HCl_{(aq)} (1,0 M, 5,0 ml). La mezcla de
reacción se calentó a 100ºC durante 60 minutos, y después de
enfriarla hasta temperatura ambiente, se evaporó hasta secarse. Al
producto crudo, se le añadió un peso equivalente de gel de sílice y
MeOH (10 ml/g de producto crudo). Después de agitarlo durante varios
minutos, el MeOH se eliminó mediante evaporación rotatoria, y el
sílice/producto crudo se libró todavía más del MeOH mediante
evaporación del diclorometano añadido (DCM, 10 ml/g de producto
crudo). Esta etapa de co-evaporación se repitió
tres veces. La mezcla de sílice/producto crudo se colocó en el
extremo superior de una flash-SGC equilibrada con
DCM/MeOH (95:5). La elución con un gradiente paso a paso de MeOH en
DCM (5-10%), proporcionó el Compuesto (1) como un
sólido marrón claro después de secarse bajo vacío elevado.
Rendimiento:
482 mg (50,7%).
482 mg (50,7%).
Los condrocitos de costilla juvenil
inmortalizados TC28 (a.k.a. "T/C-28") fueron
proporcionados por la Dra. Mary Goldring (Harvard Medical School,
Boston MA). Las células TC28 se mantuvieron en un cultivo monocapa
en medio DMEM/Ham's F12 (1:1) suplementado con FCS al 10%,
L-glutamina al 1%, 100 unidades/ml de Penicilina y
50 mg/ml de Estreptomicina (Omega Scientific, Tarzana, CA) y se
cultivaron a 37ºC con CO_{2} al 5%. Adicionalmente, para estudiar
mejor los condrocitos en un estado más fisiológico no adherente, en
algunos experimentos las células TC28 se transfierieron a placas de
6 pocillos que habían sido recubiertas previamente durante 18 horas
a 22ºC con una solución del inhibidor de la adhesión celular
poli-2-hidroxietil metacrilato
(poliHEME) al 10% en etanol al 95%, seguido de dos lavados en PBS.
Después se añadió a los pocillos medio completo DMEM/Ham's F12, y
las células se estudiaron durante 72 horas en cultivo (Folkman J y
Moscona A: Role of cell shape in growth control, Nature
273:345-349, 1978; Reginato A, Iozzo R, Jiménez S:
Formation of Nodular Structures Resembling Mature Articular
Cartilage in Long-Term Primary Cultures of Human
Fetal Epiphyseal Chondrocytes on a Hydrogel Substrate, Arthritis
Rheum 37:1338-1349, 1994). La expresión de
colágeno tipo II y agrecano se confirmaron utilizando
RT-PCR, que verificaba el mantenimiento del fenotipo
de los condrocitos.
Los efectos protectores de los condrocitos de
los compuestos representativos se analizaron in vitro. Los
agonistas incluían un donante de óxido nítrico
(NOC-12), un donante de peroxinitrilo
(SIN-1) e IL-1 beta recombinante
humana. El SIN-1 100 \muM y el
NOC-12 250 \muM se utilizaron como estímulo tóxico
para las células adherentes. En los experimentos en que se
utilizaban células TC28 cultivadas en placas de poliHEME, el
SIN-1 10 \muM, el NOC 12 25 \muM y la
IL-1 a 10 ng/ml, se utilizaron como iniciadores de
artrosis, en ausencia o presencia de 1 \muM del compuesto
representativo del Ejemplo 1. La citotoxicidad se estudió utilizando
un ensayo de liberación de LDH estándar, y el ATP intracelular de
los condrocitos se midió por un ensayo de luciferasa estándar.
El aumento de liberación de glicosaminoglicanos
(GAG) por los condrocitos, es un hecho central de los condrocitos
artrósicos, y se sabe que es potentemente estimulada por
IL-1 que, como el NO y el peroxinitrilo es un factor
patogénico principal en la artrosis. Así, la liberación de GAG
también se estudió, en la que, para optimizar el ensayo de
escrutinio, se llevó a cabo una digestión de los "nódulos" de
cartílago formados en el sistema poliHEME, utilizando 300 \mug/ml
de papaína en fosfato sódico 20 mM, EDTA 1 mM y DTT (pH 6,8) 2 mM.
La digestión de las proteínas interferentes conseguida de esta
forma, permitía que la liberación de GAG fuera más fácilmente
detectable, y la liberación de GAG se cuantificó mediante el ensayo
colorimétrico estándar de unión a tinción, azul de dimetileno
(DMB). Brevemente, el extracto de células digerido previamente se
combinó con DMB 46 \muM, glicina 40 mM, y NaCl (pH 3,0) 40 mM, e
inmediatamente se leyó a 525 nm, y se comparó con una curva estándar
generada con muestras de condroitin sulfato 1-50
\mug/ml (Farndale R, Buttle D, Barrett A: Improved quantitation
and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of
dimethylmethylene blue, Biochimica et Biophysica Acta 883:
173-177, 1986; Sztrolovics R, White R, Poole R, Mort
J, Roughley P: Resistance of small leucine-rich
repeat proteoglycans to proteolytic degradation during
interleukin-1 stimulated cartilage catabolism.
Biochem J 339: 571-577, 1999). Los
resultados de este experimento se presentan en la Tabla 2:
| % de disminución en la liberación de GAG | |||
| Compuesto | NOC-12 | IL-1b | SIN-1 |
| (1) | 27,4 | 36,8 | 47,7 |
| (2) | 50,1 | 40,9 | 23,6 |
| (3) | 28,0 | 29,1 | 21,9 |
| (4) | 17,2 | 1,5 | 11,3 |
| (5) | 14,2 | 30,7 | 35,0 |
| (6) | 11,0 | 2,4 | 1,6 |
| (7) | 46,2 | 56,6 | 42,3 |
| (8) | 32,3 | 43,8 | 55,2 |
1 x 10^{5} células TC28 (medio DMEM/F12 con
FCS al 10%, glutamina al 1%, P/S al 1%), se plantaron en cada
pocillo de una placa de 96 pocillos para que se adhirieran durante
la noche. Las células se lavaron una vez con PBS y el medio se
cambió por otro que contenía solo FCS al 1%. Se añadió el Compuesto
(1) a varias concentraciones a las células, como
pre-tratamiento durante 1 hora. El medio se eliminó
y se añadió compuesto fresco +/- el estímulo tóxico. Las células se
incubaron entonces durante 24 horas a 37ºC. después de la
incubación, se recolectó el medio y se utilizó para análisis en el
CytTox 96 Nonradioactive Cytotoxic Assay (Promega, Madison, WI).
Brevemente, la liberación de LDH por las células muertas se
cuantificó en una reacción enzimática durante 30 minutos, que daba
como resultado la conversión de un tetrazolio saletin en un producto
formazan rojo. Los resultados se expresaron como el porcentaje de
células muertas en relación con la liberación de LDH por las células
de control.
5 x 10^{5} células TC28 se plantaron en platos
de 60 mm para que se adhirieran durante la noche. Las células
después se lavaron con PBS y el medio se cambió a un medio que
contenía FCS al 1%. El Compuesto (1) se añadió como
pre-tratamiento de las células durante 1 hora a
37ºC. El medio se eliminó y se añadió compuesto nuevo +/- el
estímulo tóxico, y las células se incubaron durante 24 horas a 37ºC.
Las células se rascaron suavemente en PBS y se lavaron, y después
los pellets se congelaron rápidamente en hielo seco. Las células se
extrajeron después en ácido perclórico 0,4 N y se incubaron en hielo
durante 15 minutos. Las células se centrifugaron a 14.000 rpm
durante 15 minutos y el sobrenadante se eliminó. Se añadió
KHCO_{3} 2,2 M al 24% (por volumen), para neutralizar la solución,
y el precipitado se depositó mediante centrifugación. Este
sobrenadante se mezcló con mezcla de ensayo de ATP del kit Sigma
ATP Luciferase, y la reacción se contó durante 15 segundos (con un
retraso inicial de 5 segundos), en triplicado. Los conteos se
corrigieron para DNA total en el pellet celular (véase Tabla
3).
Los resultados de los Ensayos de Viabilidad
Celular y de ATP descritos previamente, se presentan en la Tabla 3,
que proporciona los valores de EC_{50} (\muM) aproximados, para
la prevención de la muerte celular mediada por
SIN-1 y NOC-12, y la depleción de
ATP por el Compuesto (1). En estos ensayos, las células TC28 fueron
pre-tratadas durante 1 hora, seguido de una
exposición durante 24 horas al activador, en presencia del Compuesto
(1).
\vskip1.000000\baselineskip
| Preservación de Viabilidad Celular y Niveles de ATP en Presencia de Activadores de Artrosis | ||||
| Viabilidad Celular | Depleción de ATP | |||
| Activador | Noc12^{a} | Sin-1^{b} | Noc-12^{a} | Sin-1^{b} |
| EC_{50} (\muM) | 0,01 | 0,01 | 0,1 | 0,1 |
| ^{a} exposición a NOC-12: 250 \muM. \; ^{b} exposición a SIN-1: 100 \muM |
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de colágeno se midió mediante la
siguiente incorporación de ^{3}H prolina, como describieron
Johnson et al., Arthritis Rheum
43:11560-70, 2000. Los resultados se presentan en la
Tabla 4, que proporciona los valores EC_{50} (\muM) aproximados,
para la prevención de la liberación de GAG (vía el Ejemplo 3), y la
inhibición de la síntesis de colágeno (vía Jonson et al.)
mediada por SIN-1, NOC-12 e
IL-1, en condrocitos, por el Compuesto (1). En estos
experimentos, las células TC28 en placas recubiertas de poliHEME
fueron pre-tratadas durante 1 hora, seguido de la
exposición al activador durante 72 horas en presencia del Compuesto
(1).
Además, también se evaluaron las tasas de
consumo de oxígeno por las células TC28 en cultivo monocapa,
mediante los procedimientos de Jonson et al., los resultados
de los cuales se presentan en la Figura 1, que muestra que el
Compuesto (1) bloqueó la ihibición de la respiración mitocondrial
mediada por SIN-1 en células TC28. En este
experimento, las células TC28 se trataron con SIN-1
500 \muM durante 4 horas, +/- Compuesto (1) 10 \muM:
Estado
3/4 - tasa de respiración basal sin adición de sustrato; Estado 4 - tasa de respiración en presencia de oligomicina, 5 \muM/ml; Estado 3U - tasa de respiración máxima no ligada al estado 3, debida a la adición del desligador CCCP.
3/4 - tasa de respiración basal sin adición de sustrato; Estado 4 - tasa de respiración en presencia de oligomicina, 5 \muM/ml; Estado 3U - tasa de respiración máxima no ligada al estado 3, debida a la adición del desligador CCCP.
| Conservación de la Matriz en Condrocitos en Presencia de Activadores Pro-Artrósicos | ||||||
| Colágeno | Liberación de GAG | |||||
| Activador | Noc-12^{a} | Sin-1^{b} | IL-1^{c} | Noc-12^{a} | Sin-1^{b} | IL-1^{c} |
| EC_{50} (\muM) | 1 | 1 | 1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| ^{a} Exposición a NOC-12: 25 \muM. \; ^{b} Exposición a SIN-1: 10 \muM. \; ^{c} Exposición a IL-1: 10 ng/ml |
Se obtuvieron rodillas de bovino maduro y se
removieron el cartílago de los cóndilos femorales y la cueva patelar
en rodajas de grosor completo (1-3 mm). Se
extrajeron núcleos circulares (6-7 mm de diámetro)
del tejido. Los núcleos se lavaron dos veces con medio (FCS al 1%,
P/S al 1%, glutamina al 1%, que contenía DMEM con elevada glucosa),
y se colocaron en placas de 96 pocillos. Las rodajas se incubaron en
medio (como anteriormente) a 37ºC durante 48 horas para permitir la
recuperación del proceso de aislamiento. Después del periodo de
recuperación, el medio se eliminó y se añadió medio fresco con el
Compuesto (1) a las rodajas durante un periodo de tratamiento de 6
horas. Después el medio se eliminó y se añadió Compuesto (1) fresco
+/- IL-1 (a 10 ng/ml) y se incubó a 37ºC durante 24
horas. El medio condicionado se recolectó y se analizó la liberación
de GAG y NO. Finalmente, las rodajas se pesaron para corregir las
pequeñas variaciones en el tamaño y en el grosor. Los resultados de
este experimento se presentan en la Tabla 5, que proporciona los
valores de EC_{50} (\muM) aproximados, para la prevención de la
liberación de GAG y NO mediada por IL-1, en rodajas
de cartílago bovino por el Compuesto (1).
| Prevención de la Degradación de la Matriz e Inhibición de la Liberación de NO en Rodajas de Cartílago | ||
| Bovino en Respuesta a Estímulo con IL-1 | ||
| Activación con IL-1 | ||
| Liberación de GAG | Liberación de NO | |
| EC_{50} (\muM) | 10 | 10 |
Claims (28)
1. Un compuesto que tiene la estructura:
o un esteroisómero, derivado
acetato, formato o benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de
sus sales farmacéuticamente aceptables, en el
que
- R_{3} es morfolinilo; y
- R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son lo mismo o diferente, e individualmente hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido.
- o R_{4} tomado junto con R_{5}, y además tomado junto con el respectivo átomo de carbono al cual estos grupos están ligados, forman un arilo fusionado o un heterociclo no sustituído o sustituído.
2. Un compuesto que tiene la estructura:
o un esteroisómero, derivado
acetato, formato o benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de
sus sales farmacéuticamente aceptables, en el
que
- R_{1}, R_{2} y R_{3} son lo mismo o diferente, e individualmente hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido.
- R_{4} tomado junto con R_{5}, y además tomado junto con el respectivo átomo de carbono al cual estos grupos están ligados, forman un arilo fusionado o un heterociclo no sustituido o sustituido.
3. El compuesto de las reivindicaciones 1 ó 2,
en el que R_{1} es hidrógeno o alquilo.
4. El compuesto de la reivindicación 3, en el
que R_{1} es es metilo.
5. El compuesto de las reivindicaciones 1 ó 2,
en el que R_{2} es hidrógeno, halógeno, alcoxi o alquilo
sustituido.
6. El compuesto de las reivindicaciones 1 ó 2,
en el que R_{2} es hidrógeno.
7. El compuesto de la reivindicación 2, en el
que R_{3} es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alcoxi o alquilo.
8. El compuesto de la reivindicación 2 en el que
R_{3} es heterociclo.
9. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R_{4} es hidrógeno o alcoxi.
10. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R_{5} es hidrógeno.
11. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R_{4} tomado en conjunto con R_{5}, y además tomado en
conjunto con el respectivo átomo de carbono a los que estos grupos
están ligados, forma un grupo fenilo fusionado no sustituido.
12. El compuesto de la reivindicación 1, en el
que R_{2}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno.
13. Un compuesto que tiene la estructura:
o un esteroisómero, derivado
acetato, formato o benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de
sus sales farmacéuticamente aceptables, en el
que
- R_{1} es metilo;
- R_{2}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno; y
- R_{3} es hidroxi.
14. Una composición farmacéutica que comprende
un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Un compuesto que tiene la estructura:
o un esteroisómero, derivado
acetato, formato o benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de
sus sales farmacéuticamente aceptables, en el
que
- R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son lo mismo o diferente, e individualmente hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido.
- o R_{3} tomado junto con R_{4}, o R_{4} tomado junto con R_{5}, y además tomado junto con el respectivo átomo de carbono al cual estos grupos están ligados, forman un arilo fusionado o un heterociclo no sustituido o sustituido, para utilizar en un método para tratar una enfermedad artrítica.
16. Un compuesto que tiene la estructura:
o un esteroisómero, derivado
acetato, formato o benzoato de grupos funcionales alcohol y amina de
sus sales farmacéuticamente aceptables, en el
que
- R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4} y R_{5} son lo mismo o diferente, e individualmente hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, heterocicloalquilo o heterocicloalquilo sustituido.
- o R_{3} tomado junto con R_{4}, o R_{4} tomado junto con R_{5}, y además tomado junto con el respectivo átomo de carbono al cual estos grupos están ligados, forman un arilo fusionado o un heterociclo no sustituido o sustituido, para utilizar en un método para tratar una enfermedad asociada con una función mitocondrial alterada.
17. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{1} es hidrógeno o
alquilo.
18. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{1} es metilo.
19. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{2} es hidrógeno, halógeno,
alcoxi, alquilo o alquilo sustituido.
20. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{2} es hidrógeno.
21. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{3} es hidrógeno, halógeno,
hidroxi, alcoxi o alquilo.
22. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{3} es heterociclo.
23. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{3} es morfolinilo.
24. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{4} es hidrógeno o
alcoxi.
25. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{5} es hidrógeno.
26. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{4} tomado junto con
R_{5}, y además tomado junto con el respectivo átomo de carbono
al que estos grupos están ligados, forman un grupo fenilo fusionado
no sustituido o sustituido.
27. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{2}, R_{4} y R_{5} son
hidrógeno.
28. El compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que R_{1} es metilo y R_{3} es
hidroxi.
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