JP3723533B2 - ビス−スタウロスポリンおよびＫ−２５２ａ誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【従来の技術】
発明の背景
プロテインキナーゼは、アミノ酸をリン酸化することにより数多くの細胞性タンパク質を化学的に修飾するよう作用する広範なクラスの酵素である。
プロテインキナーゼの阻害剤は構造的に変化に富み、神経系および他の組織に対して種々の（時として、相反する）作用を有する。所与のプロテインキナーゼ阻害剤は、２以上のプロテインキナーゼに対して影響を及ぼし得る。例えば、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)属の種およびアクチノマデュラ(Actinomadula)属の種の培養ブロスから単離されたアルカロイド様物質であるＫ２５２−ａは、元来、プロテインキナーゼＣ阻害剤であると報告されたが、続いてプロテインキナーゼＡおよびＧ、ミオシン軽鎖キナーゼ、およびｔｒｋ（神経成長因子［ＮＧＦ］により活性化されるチロシンキナーゼであり、後者は末梢、知覚および交感神経の生存性を促進する向神経性タンパク質である）も阻害することが見い出された。この後者の作用と一致して、Ｋ−２５２ａは、ＮＧＦのＰＣ−１２細胞（ラット副腎髄質腫瘍由来のクロム親和性細胞である褐色細胞腫）に対する向神経性の作用を阻害し、かつ後根神経節ニューロンおよび海馬ニューロンの生存性を促進する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、それは広範囲な濃度にて細胞毒性であることが見い出され、幾人かの研究者をして、これがイン・ビボ(in vivo)で限定された有用性しか有しないと結論付けさせることとなった。
Ｋ−２５２ａに関連する微生物アルカロイドであるスタウロスポリン(staurosporine)もまた、異なったプロテインキナーゼおよび細胞型に対して種々の作用を有する。スタウロスポリンは、ＰＣ−１２細胞に対してＮＧＦ様の作用を有すること、ならびに虚血後の損傷からアレネズミの海馬を保護することが見い出された。それは、ラットの前脳基底野においてコリン作動性ニューロンへの傷害を逆行させることができる。
Ｋ−２５２ａおよびスタウロスポリンは、腫瘍阻害剤として提唱されてきた。スタウロスポリンは、殺虫剤として提供されてきた。メチルアミンの窒素原子が置換されてヒドロカルビル基またはアシル基を有するスタウロスポリンの誘導体が製造され、以下の：腫瘍阻害、炎症阻害、免疫調節、および心血管および中枢神経系の疾患治療の用途が提唱されている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、一の態様において、式：
【０００４】
【化７】
［式中、［Stau］は、式：
【０００５】
【化８】
【０００６】
の残基を表し、Ｗはビス(カルバミル)またはビス(チオカルバミル)基：
【０００７】
【化９】
【０００８】
を表し、ここに、Ｗ'は２〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であって、ＹはＯまたはＳを意味する］
によって表される新規なスタウロスポリンのビス−Ｎ−置換誘導体をその要旨とする。
また、本発明は、式（ＩＩ−４）：
【０００９】
【化１０】
【００１０】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々独立してＨ、Ｘはヒドロキシメチル（ＣＨ２ＯＨ）であって、ＲはＯＣＨ３を意味する］
によって表されるＫ−２５２ａの新規な誘導体をその要旨とする。
また、本発明は、式：
【００１１】
【化１１】
【００１２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々独立してＨ、ＸはＣＨ２−ＮＨ−Ｓerであって、ＲはＯＨを意味する］
によって表されるＫ−２５２ａの新規な誘導体をその要旨とする。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−４９）：
【００１３】
【化１２】
【００１４】
［式中、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々Ｈ、ＲはＯＨ、Ｒ１はＣＨ２ＳＯ２Ｃ２Ｈ５であって、ＸはＣＯ２ＣＨ３を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−３８）：
【００１５】
【化１３】
【００１６】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々Ｈ、ＲはＯＨであって、ＸはＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ６Ｈ５を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−４５）：
【００１７】
【化１４】
【００１８】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、各々Ｂｒ、ＲはＯＨ、Ｚ１およびＺ２は各々Ｈであって、ＸはＣＯＮＨＣ６Ｈ５を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−５７）：
【００１９】
【化１５】
【００２０】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々Ｈ、ＲはＯＨであって、ＸはＣＨ２ＮＨＣＯ２ＣＨ３を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（Ｖ）：
【００２１】
【化１６】
【００２２】
［式中、ＸはＣＯ２Ｒ５（ここで、Ｒ５は低級アルキルを表す）またはＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｒ６（ここで、Ｒ６は低級アルキルまたはアリールを表す）を表し；Ｒ１は水素またはＣＨ２ＳＯ２Ｒ７（ここで、Ｒ７は低級アルキルを表す）を表すが、但し、Ｘ＝ＣＯ２Ｒ５であって、Ｒ１＝水素の組合せは除外される］
で示される化合物も包含される。
式（Ｖ）における基の定義において、低級アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ネオペンチルおよびヘキシルのごとき、１ないし６個、好ましくは、１ないし３個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。アリールは、フェニルおよびナフチルのごとき、６ないし１０個の炭素原子を有するアリール基を意味する。
式Ｖの化合物は、医薬上許容される塩の形態とすることができる。化合物（Ｖ）の医薬上許容される塩は、医薬上許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、およびアミノ酸付加塩を包含する。
医薬上許容される酸付加塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩およびリン酸塩のごとき無機酸付加塩、ならびに、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩およびクエン酸塩のごとき有機酸付加塩がある。医薬上許容される金属塩の例としては、ナトリウム塩およびカリウム塩のごときアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩のごときアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩および亜鉛塩がある。医薬上許容されるアンモニウム塩の例としては、アンモニウム塩およびテトラエチルアンモニウム塩がある。医薬上許容される有機アミン付加塩の例としては、モルホリンおよびピペリジンとの塩がある。医薬上許容されるアミノ酸付加塩の例としては、リジン、グリシンおよびフェニルアラニンとの塩がある。
【００２３】
もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒトにスタウロスポリンの新規なビス−置換誘導体のうち１種の治療量を投与することにより、コリン作動性ニューロン、線条体ニューロン、および感覚ニューロン、例えば、後根神経節ニューロンの機能を高める方法をその要旨とする。該治療は、栄養因子、好ましくはニューロトロフィックファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなしうる。ニューロトロフィックファミリーは、ＮＧＦに対し高い相同性を有するタンパク質群であって、ＮＧＦに加えて、脳由来栄養因子（ＢＤＮＦ;レイブロック(Leibrock)ら、ネイチャー(Nature)第３４１巻:１４９〜１５２頁、１９８９年）;ニュートロフィル−３(neutrophil-３)（ＮＴ−３;ホーン(Hohn)ら、ネイチャー(Nature)第３４４巻:３３９〜３４１頁、１９９０年）;およびニューロトロフィック−５(neurotrophic-５)（ＮＴ−５;バークマイヤー(Berkemeier)ら、ニューロン(Neuron)第７巻:８５７〜８６６頁、１９９１年）も包含する。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、スタウロスポリンの新規なビス−置換誘導体のうちの１種の治療量を、例えば、ヒトのごとき哺乳動物に投与することにより、興奮性アミノ酸により誘導される変性から該哺乳動物の神経細胞を保護する方法をその要旨とする。かかる変性が起こり得る病患は、アルツハイマー病;運動ニューロンの疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症;パーキンソン病;脳血管疾患、例えば、虚血状態;ＡＩＤＳ痴呆;癲癇;ハンチントン舞踏病;ならびに、脳または脊髄への振盪または穿通損傷を包含する。該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなしうる。
【００２５】
もう１つの態様において、本発明は、テーブル１に示すいずれかの置換基を有する式:
【００２６】
【化１７】
【００２７】
によって表されるＫ−２５２ａの機能性誘導体の治療量を、哺乳動物、例えば、ヒトに、投与することにより、該哺乳動物において、コリン作動性ニューロン、線条体ニューロン、および感覚ニューロン、例えば、後根神経節ニューロンの機能を高める方法をその要旨とする。：
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなし得る。該方法は、ハンチントン舞踏病を治療するのに用いることができる。
【００３１】
好ましい態様において、本発明は、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【００３２】
【化１８】
【００３３】
によって表されるＫ−２５２ａの機能性誘導体の治療量を哺乳動物、例えば、ヒトに投与することによって、後根神経節神経細胞の機能を高める方法をその要旨とし、該式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の誘導体は以下の置換基を有する。
【００３４】
【表３】
【００３５】
該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなし得る。
好ましい態様において、本発明は、式（ＩＩ）：
【００３６】
【化１９】
【００３７】
［式中、Ｒ１およびＲ２は各々Ｈ、ＸはＣＯ２ＣＨ３、ＲはＯＨであって、Ｚ１およびＺ２は各々Ｈを意味する］
によって表されるＫ−２５２ａの治療量を哺乳動物、例えば、ヒトに投与することにより、該哺乳動物のコリン作動性ニューロンの機能を高める方法をその要旨とする。該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなすことができ、また、ハンチントン舞踏病を治療するのに用いることができる。
好ましい態様において、本発明は、
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
【００３８】
【化２０】
【００３９】
によって表されるＫ−２５２ａまたはＫ−２５２ａの機能性誘導体の治療量を哺乳動物、例えば、ヒトに投与することによって、線条体神経細胞の生存性および／または機能を高める方法をその要旨とするが、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の化合物は以下の置換基を有する。
［式中、以下の置換基がある：
【００４０】
【表４】
【００４１】
該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子と組み合わせてなすことができ、また、ハンチントン舞踏病を治療するのに用いることができる。
本発明の他の要旨および利点は、以下のその好ましい具体例の記載および請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００４２】
【発明の実施の形態】
スタウロスポリン誘導体
本発明は、スタウロスポリンの新規なビス−Ｎ−置換誘導体、ならびに、神経病、特に、障害され、損傷し、軸索変性が進行しているか、死滅する危険性が上昇しているかのいずれかの神経細胞、あるいは損われたコリン作動活性により特徴付けられる疾患についての治療剤としてのその使用に関する。これらの疾患は、興奮性アミノ酸により誘導されるものを包含する。これらの新規な誘導体の治療剤としての使用は、誘導体単独の使用、および、栄養因子（好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子、ＮＧＦ）の外因的投与と組み合わせた該誘導体の使用を包含する。本発明の範囲内の化合物は、式：
【００４３】
【化２１】
【００４４】
［式中、［Stau］は、式：
【化２２】
【００４５】
の残基を表し、Ｗはビス(カルバミル)またはビス(チオカルバミル)基：
【００４６】
【化２３】
【００４７】
を表し、ここで、Ｗ'は２〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であって、ＹはＯまたはＳを意味する］
によって表すことができる。Ｗ'は、好ましくは、非置換の、または１〜３個の炭素原子の１〜３個のアルキル基で置換された２〜１０個の炭素原子のアルキレン基;非置換の、または１〜３個の炭素原子のアルキル基、塩素原子もしくは臭素原子の１〜３個で置換された６〜１２個の炭素原子のアリーレン基である。Ｗ'は、特に好ましくは、ヘキサメチレンおよび１,４−フェニレンである。Ｙは、好ましくはＯである。
【００４８】
式（Ｉ）の化合物は、カルバメートおよびチオカルバメートの製造に関する当該分野において公知の方法により製造できる。好ましくは、該化合物は、ビス−ジイソシアネートまたはビス−ジイソチオシアネートとスタウロスポリンとを反応させて、式（Ｉ）（式中、各々、Ｙ＝ＯまたはＹ＝Ｓ）の化合物を得ることによって製造できる。
【００４９】
用いるのに適する中間体ビス−ジイソシアネートおよびビス−ジイソチオシアネートは：
１,６−ジイソシアネートヘキサン
トルエン−２,６−ジイソシアネート
ベンゼン−１,２−ジイソシアネート
２−メチル−１,５−ジイソシアネートペンタン
ナフタレン−２,６ ジイソシアネート
１,６−ジイソチオシアネートヘキサン
１,４−ジイソチオシアネートブタン
トルエン−２,４−ジイソシアネート
ベンゼン−１,４−ジイソシアネート
１,２−ジイソシアネートエタン
ナフタレン−１,５−ジイソシアネート
１,５−ジイソシアネートペンタン
ベンゼン−１,４−ジイソチオシアネート
２−メチル−１,５−ジイソチオシアネートペンタン
を包含する。
【００５０】
イソシアネートおよびイソチオシアネートの製造のレビューについては、リヒターおよびウルリッヒによる刊行物を参照されたい（リヒター(Richter)およびウルリッヒ(Ulrich)「ザ・ケミストリー・オブ・サイネーテス・アンド・ゼア・チオ・デリバティブズ(The Chemistry of Cyanates and Their Thio Derivatives)」、第２版、ウイリー(Wiley)、ニュー・ヨーク(New York)、１９７７年）。該化合物は、好ましくは、ホスゲン（Ｙ＝Ｏ）またはチオホスゲン（Ｙ＝Ｓ）と対応するジアミンとの反応により製造する。別製法を用いることもできる。例えば、エチレン尿素とホスゲンとを反応させ、続いて加熱することにより１,２−ジイソシアネートエタンを製造することができる。
【００５１】
Ｋ−２５２ａ誘導体
また、本発明は、障害され、損傷し、軸索変性が進行しているか、死滅の危険にあるニューロンにより特徴付けられる、ある種の神経病または障害における治療剤としての、Ｋ−２５２ａの特定の機能性誘導体の使用にも振向される。該機能性誘導体は、単独で、または栄養因子（好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子、ＮＧＦ）と組み合わせて投与することができる。Ｋ−２５２ａの「機能性誘導体」とは、例えば、神経細胞生存性を促進する能力、または神経繊維（例えば、軸索）成長を促進する能力、またはコリン作動性神経細胞機能を高める能力、または感覚細胞（例えば、後根神経節神経細胞）の機能を高める能力、または線条体ニューロンの機能および／または生存性を高める能力のごとき、本明細書中で神経保護活性(neuroprotective activity)と定義する所望の生物学的活性を有する、該分子の修飾形態を定義する。かかる分子修飾は、分子の溶解性、吸着性、（例えば、血液脳関門および細胞膜を通っての）輸送性、生物学的半減期等を改善することができる。別法として、あるいはさらに、ある種の基は、当該分子の毒性を減じることができ、あるいは、当該分子の望ましくないいずれの副作用も除去または緩和することができる。
【００５２】
本発明の範囲内の化合物は、本発明の範囲内の化合物を示す後記のテーブル４中の置換基を有する、以下の式（ＩＩ）［以下、化合物（ＩＩ）という］、式（ＩＩＩ）［以下、化合物（ＩＩＩ）という］、および式（ＩＶ）［以下、化合物（ＩＶ）という］：
【００５３】
【化２４】
【００５４】
によって表すことができる。本発明のＫ−２５２ａの機能性誘導体は、当業者に公知の方法を用いる化学合成によってデ・ノボ(de novo)で製造し得る。例えば、化合物ＩＩの製造に用いる方法は、ムラカタ(Murakata)ら（出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第４,９２３,９８６号）により記載されている。化合物ＩＩＩの製造に用いる方法は、ムーディー(Moody)ら（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(J.Org.Chem.)第５７巻:２１０５〜２１１４頁（１９９２年））;ステグリッヒ(Steglich)ら（アンギュ・ケム・イント・エド・イングル(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)第１９巻:４５９〜４６０頁（１９８０年））;ナカニシ(Nakanishi)ら（ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス(J.Antibiotics)第３９巻:１０６６〜１０７１頁（１９８６年））;ならびに、特願昭６０−２９５１７２号（１９８５年）により記載されている。さらに、特願昭６０−２９５１７３号（１９８５年）中に化合物ＩＩ−１、９、１２および１５;特願昭６２−３２７８５８号（１９８７年）中に化合物ＩＩ−２、３、４、２４、２５および２６;特願昭６２−３２７８５９号（１９８７年）中に化合物ＩＩ−２０;および、明治製菓（株）(Meiji Seika Kaisha Ltd.)によって、特願昭６０−２５７６５２号（１９８５年）中に化合物ＩＩ−１０の製造方法が記載されている。
【００５５】
【表５】
【００５６】
【表６】
【００５７】
また、本発明は、前記に示した化合物（ＩＩ）およびテーブル４（脚注１０）に示した置換基によって表されるＫ−２５２ａの治療量を投与することにより、コリン作動性ニューロンの機能を高める方法も包含する。この化合物は、当該分野にて記載されている方法によって製造する（マツダ(Matsuda)ら、米国特許第４,５５４,４０２号;カセ(Kase)ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス(J.Antibiotics)第３７巻:１０５９〜１０６５頁（１９８６年）参照）。「コリン作動性ニューロンの機能を高める」とは、コリン作動性神経細胞の生存性、および／または神経繊維（例えば、軸索）の成長を促進すること、および／または神経細胞のコリン作動活性を高めることを意味する。Ｋ−２５２ａは、栄養因子、好ましくはニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と共に、あるいはそれ無しで投与することができる。
【００５８】
化合物の用途
以下にさらに詳細に記載するように、本発明は、単独で、またはＮＧＦのごとき栄養因子と組み合わせてのＫ−２５２ａの機能性誘導体または式Ｉの化合物の、特に、障害され、損傷し、軸索変性が進行しているか死滅の危険性が上昇している神経細胞により特徴付けられるか、損われたコリン作動活性により特徴付けられる神経病の治療剤としての、新規な用途を提供する。これらの疾病としては、興奮性アミノ酸により誘導されるものを包含する。栄養因子との組合せも含む本発明の化合物の生物活性は、（全て以下に詳記する）培養ＰＣ−１２細胞・オルニチンデカルボキシラーゼ・アッセイ、培養脊髄・コリンアセチルトランスフェラーゼ・アッセイ、培養後根神経節ニューロン・生存アッセイ、培養線条体ニューロン・生存アッセイ、またはイン・ビボ・興奮性毒素神経保護・アッセイにより簡便に検定し得る。かくして、本発明の化合物は、前記した、神経病あるいは神経細胞の死滅または不全の危険性が高まることにより特徴付けられる障害に苦しむヒトまたは他の哺乳動物への投与に有用である。これらの神経病および障害としては:アルツハイマー病;筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患;パーキンソン病;脳卒中または他の虚血性障害;ハンチントン舞踏病;ＡＩＤＳ痴呆;癲癇;脳または脊髄の振盪または穿通損傷;および末梢神経障害を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本明細書中にて提供する化合物は、医薬上許容される非毒性の賦形剤および担体と混合することにより医薬組成物に製剤化することができる。前記したごとく、かかる組成物は、非経口投与で用いるために、特に液状の溶液または懸濁液の形態に;経口投与には、特に錠剤またはカプセル剤の形態に;または鼻腔内投与には、特に粉末剤、点鼻液またはエアロゾールの形態に製造することができる。
該組成物は、都合よくは、単位用量形態にて投与でき、例えば、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)（マック・パブ社(Mack Pub.Co.)、ペンシルバニア州、イーストン(Easton,PA)（１９８０年））に記載されているごとく医薬分野でよく知られた方法のいずれによっても製造できる。非経口投与用の製剤には、通常の賦形剤である滅菌水またはセーライン、ポリエチレングリコールのごときポリアルキレングリコール、野菜起源の油、水素化ナフタレン等を含有させることができる。特に、生適合性、生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコール酸共重合体、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体は、有効成分化合物の放出を制御する有用な賦形剤となり得る。これらの有効成分化合物のための他の潜在的に有用な非経口デリバリーシステムとしては、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システムおよびリポソームを包含する。吸入投与用の製剤は、例えば、ラクトースを賦形剤として含有させるか、または、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含有する水溶液、または点鼻液形態にて投与する油性溶液とするか、または鼻腔内に適用するゲルとすることができる。非経口投与用の製剤には、バッカル投与用のグリココレート、直腸投与用にメトキシサリチレート、または膣投与用にはクエン酸を含有させることもできる。
本発明の該物質は、薬剤中にて単独の有効剤として用いることができるか、または、例えば、末梢神経障害のごとき神経の疾病または不全におけるニューロン生存性または軸索の成長を容易ならしめる他の成長因子のような、他の有効成分と組み合わせて用いることもできる。
【００６０】
治療組成物における本明細書中に記載した該化合物の濃度は、投与すべき該薬剤の用量、用いる該化合物の化学的な特性（例えば、疎水性）、および投与経路を含めた多くの要因に応じて変動するであろう。一般的に、本発明の化合物は、約０.１ないし１０％ｗ／ｖの非経口投与用の化合物を含有する水溶性生理緩衝液中にて提供できる。典型的な用量範囲は、約１μｇ／ｋｇ体重／日ないし約１ｇ／ｋｇ体重／日;好ましい用量範囲は約０.０１ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし１００ｍｇ／ｋｇ／体重／日である。投与すべき薬剤の好ましい用量は、該神経病の型および進行の程度、個々の患者の総じての健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的効率、該化合物賦形剤の製剤、およびその投与経路のごとき変数に依存するようである。
【００６１】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、添付した請求の範囲のみによって決定される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【００６２】
実施例１
１,６−ヘキサメチレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)（ＨＢＣＳ）（硫酸マグネシウム無水和物上で乾燥させた）酢酸エチル１.００ｍl中のスタウロスポリン（カミヤ・バイオメディカル社(Kamiya Biomedical Company)、カリフォルニア州、サウザンド・オークス(Thousand Oaks,CA)）１.０ｍｇの溶液（２.１５マイクロモル）を、乾燥した酢酸エチル１.０ｍl中のヘキサメチレン−ビス−イソシアネート１０.７５ｍｇの溶液１７μl（１.０８マイクロモル）で処理した。コハク色ガラス製反応バイアル中の該反応混合物を、室温にて２日間放置した。６００μｇ重量の結晶性沈殿物を分離した。その組成を高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ-ＭＳ）より確認した。
この生成物および続いて記載する全てのスタウロスポリン誘導体は、遮光性のガラス製バイアル中で保存した。
【００６３】
実施例２
ｐ−フェニレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)（ＰＢＣＳ）
乾燥した酢酸エチル１.００ｍl中のスタウロスポリン１.０ｍｇの溶液（２.１５マイクロモル）を、乾燥した酢酸エチル１.００ｍl中のｐ−フェニレンジイソシアネート（トランス・ワールド・ケミカルズ (Trans World Chemicals)社 Ｐ１５８６−１）３.８３ｍｇから調製した溶液４５μl（１.０８マイクロモル）で処理した。該反応混合物を一晩放置した。白色沈殿物が生じた。次いで、石油エーテル０.５ｍlを添加した。該混合物を、真空乾燥した焼結−ガラス漏斗で濾過した。合計０.９０ｍｇの結晶性生成物を収集し、高速原子衝撃質量分析によりｐ−フェニレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)であると同定された。
【００６４】
調製例Ａ
Ｎ−フェニルカルバミルスタウロスポリン（ＰＣＳ）
文献：米国特許第５,０９３,３３０号
乾燥した酢酸エチル１.５０ｍl中のスタウロスポリン２.０ｍｇ（４.３０マイクロモル）の溶液を、乾燥した酢酸エチル０.９９０ｍl中のフェニルイソシアネート１０μlの溶液４６８μl（４.３０マイクロモル）で処理した。該溶液を一晩放置し、ヘキサデ３ｍlを少量ずつ添加した。２.３９ｍｇ重量の無色の結晶を得た。酢酸エチル１ｍlおよび石油エーテル２ｍlからこの生成物を再結晶した後に、結晶性生成物１.７５ｍｇを単離した。同様な調製から、Ｎ−フェニルカルバミルスタウロスポリンとしての生成物の組成がＦＡＳ−ＭＳによって確認された。
【００６５】
調製例Ｂ
Ｎ−フェニルチオカルバミルスタウロスポリン（ＰＴＣＳ）
酢酸エチル１.００ｍl中のスタウロスポリン１.０ｍｇ（２.１５マイクロモル）の溶液を、酢酸エチル１.００ｍl中のフェニルイソチオシアネート１０μlのストック溶液２６μlで処理した。このアリコートは、フェニルイソチオシアネート２９０μｇ（２.１５マイクロモル）を含有していた。該反応混合物を２５℃に一晩維持し、次いでヘキサデ２.０ｍlを添加した。得られた結晶性生成物を濾別し、ヘキサデで洗浄し、アルゴンガス気流で乾燥した。
【００６６】
調製例Ｃ
Ｎ−エチルカルバミルスタウロスポリン（ＥＣＳ）
酢酸エチル９００μl中のスタウロスポリン０.９ｍｇ（１.９３マイクロモル）の溶液を、１.９３マイクロモルのエチルイソシアネート（乾燥した酢酸エチル２.００ｍl中のエチルイソシアネート９.０５ｍｇのストック溶液３０.２μl）で処理した。該反応混合物を２５℃に一晩維持し、ヘキサデ２.０ｍlを添加した。結晶性生成物を分離し、乾燥した。
【００６７】
実施例３
化合物ＩＩ−４
化合物Ａ（９６２ｍｇ,２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン３０ｍlおよびメタノール１０ｍlの混合液に溶解し、次いで、氷冷下に、ホウ水素化ナトリウム７６０ｍｇ（２０ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて同温度にて４時間、さらに室温にて１２時間撹拌した。それに３Ｎ塩酸を添加した後に、該溶液を塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、続いて該溶媒を蒸発させた。該残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２）によって精製して８８２ｍｇの化合物ＩＩ−４を得た（収率９７％）。
融点：１３０〜１４０℃
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)：δ(ｐｐｍ):２.０３２(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１３.９Ｈz),２.２３１(３Ｈ,ｓ),２.９６７(３Ｈ,ｓ)，３.６０９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.６,１３.４Ｈz),３.９５９(２Ｈ,ｍ),５.０００(２Ｈ,ｓ),５.２６８(１Ｈ,ｔ,Ｊ=５.３Ｈz),７.０６５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.３Ｈz),７.２５４-８.０３８(７Ｈ,ｍ),８.５６５(１Ｈ,ｓ),９.２０６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=７.８Ｈz)
【００６８】
【化２５】
【００６９】
実施例４
化合物ＩＩ−１４
化合物Ｂ（３９３ｍｇ、０.９ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン２５ｍlに溶解し、次いで、氷冷下にて、カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン３０９ｍｇ（１.３５ｍｍｏｌ）、Ｎ−オキシスクシンイミド１５６ｍｇ（１.３５ｍｍｏｌ）、４−メチルモルホリン０.１ｍl（０.９ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド２７９ｍｇ（１.３５ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン３ｍlを添加し、続いて１２時間撹拌した。該反応混合物を濾過し、該溶媒を蒸発させた。その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９９／１）によって精製して４２９ｍｇの化合物Ｃを得た（収率７２％）。
融点：１８８〜１９３℃
ＳＩＭＳ(ｍ/ｚ)：６６０(Ｍ＋１)＋
【００７０】
化合物Ｃ（３９９ｍｇ）を、ジメチルホルムアミド１０ｍlに溶解し、次いで、炭素上の１０％パラジウム３００ｍｇを添加し、続いて水素気流下５０℃にて７時間撹拌した。該反応混合物をセライトを通して濾過し、該溶媒を蒸発させた。その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／２８％水酸化アンモニウム＝９０／１０／１）によって精製し、得られた生成物をテトラヒドロフラン５ｍlに溶解し、続いて１.７Ｎ塩酸／酢酸エチル５ｍlおよびジエチルエーテル１０ｍlを添加した。濾過によって該溶液から沈殿物を分離して、２３４ｍｇの化合物ＩＩ−１４を得た（収率６９％）。
融点：＞３００℃
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６＋Ｄ２Ｏ)δ(ｐｐｍ):１.９２-２.２８(１Ｈ,ｍ),２.２０(３Ｈ,ｓ),２.８４-３.１２(７Ｈ,ｍ),３.４０-４.２０(５Ｈ,ｍ),５.０４(２Ｈ,ｓ),６.９８(１Ｈ,ｍ),７.２４-８.２０(７Ｈ,ｍ),８.７６(１Ｈ,ｂｒｓ),９.２２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=８Ｈz)
ＳＩＭＳ(ｍ/ｚ):５２７(Ｍ＋２)＋
【００７１】
【化２６】
【００７２】
実施例５
ＰＣ−１２細胞は、ラット副腎髄質の腫瘍より生じたクローン化集団であって、ＮＧＦの作用を研究するための極めて有用で広範に研究されたモデルであることが判明している（グロフ(Guroff)、セル・カルチャー・イン・ザ・ニューロサイエンシーズ(Cell Culture in the Neurosciences)、プレナム・パブリッシング・コーポレーション(Plenum Publishing Corporation)、１９８５年、第８章、２４５〜２７２頁）。これらの細胞に対するＮＧＦの特に強い１つの作用は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）活性の急激な刺激、すなわち２００ｎＭのＫ−２５２ａによって遮断されると報告された効果（コイズミ(Koizumi)ら、１９８８年）である。本実施例の実験においては、（ジイ・グロフ博士(Dr.G.Guroff)から入手した）ＰＣ−１２細胞を６×１０４細胞／ｃｍ２の密度にて４８−ウェルプレート中で培養し、薬物ビヒクル（０.５％ＤＭＳＯ）、スタウロスポリン、またはＨＢＣＳと共にインキュベートした。Ｋ−２５２ａおよびスタウロスポリンは、カミヤ・バイオメディカル(Kamiya Biomedical)社から商業的に入手可能である。薬物添加４時間後に、ヒュッフ(Huff)らにより記載されているごとくに（ヒュッフ(Huff)ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)第８８巻：１８９〜１９８頁、１９８１年）、ＯＤＣアッセイのために該細胞を収穫した。
これら３つの全ての化合物では、ＯＤＣ活性が誘導された（すなわち、上昇した）が、活性および効率において顕著な相違があった（図１）。Ｋ−２５２ａは用量依存的にＯＤＣ活性を誘導し、効果は２ｎＭで認められ、２００ｎＭで最大まで上昇した（３６.３倍誘導）。スタウロスポリンの効果は、同様に２ｎＭで認められたが、２０ｎＭでピークに達し（３４.７倍誘導）、２００ｎＭでは顕著に下降した。ＨＢＣＳも同様に２ｎＭで誘導したが、より高濃度においては効果が上昇しなかった。従って、その最大効率は他の２つの化合物のそれよりもはるかに低かった（６.５倍誘導）。もう１つの実験において、ＰＴＣＳ、ＰＣＳおよびＥＣＳのＰＣ−１２細胞ＯＤＣ活性に対する効果をＫ−２５２ａのそれと比較した。２００ｎＭ濃度において、Ｋ−２５２ａの活性を１００％と表すと、ＰＴＣＳはＫ−２５２ａ活性の７１.４％を示し、一方ＰＣＳおよびＥＣＳは、各々、Ｋ−２５２ａ活性の８８.９％および６１.９％を示した。しかしながら、プロテインキナーゼＣ阻害剤Ｈ−７は、プロテインキナーゼＣ活性を阻害することが知られている濃度（ナカダテ(Nakadate)ら、バイオケミカル・ファーマコロジー(Biochem.Pharmacol.)第３７巻：１５４１〜１５４５頁、１９８８年）である３０μＭではＯＤＣ活性を誘導しなかった。
【００７３】
前記した濃度の該化合物の存在または不存在下に、１０ｎｇ／ｍl細胞培地のＮＧＦを添加し、続いて前記したごとく該細胞のＯＤＣアッセイを行うことにより、Ｋ−２５２ａ、スタウロスポリンおよびＨＢＣＳのＮＧＦ生物活性を強化および／または阻害する能力を評価した（図２）。ＮＧＦのこの濃度は、当該化合物の強化または阻害効果が検出できるように中程度の誘導を供するために選択した。２００ｎＭにおいてＫ−２５２ａは、コイズミ(Koizumi)らにより１９８８年に報告されているごとく、ＯＤＣのＮＧＦ誘導を阻害したが、驚くべきことには、さらに低濃度（２ｎＭおよび２０ｎＭ）においては該誘導を強化した。２ｎＭにおいてのスタウロスポリンもまた、ＮＧＦによる該誘導を強化したが、この効果はさらに高濃度（２０ｎＭおよび２００ｎＭ）においては失われた。対照的に、ＨＢＣＳは、試験した全ての濃度でＮＧＦの該効果を強化した。この顕著な効果を、ＨＢＣＳ単独の適度なＯＤＣ−誘導効果に比して、図３に示す。
【００７４】
実施例６
（以下に記載するごとき）標準的な方法によりラット胎児から調製した解離脊髄培養にて、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣhＡＴ）活性に対するＫ−２５２ａの効果を検定した。ＣhＡＴは、神経伝達物質であるアセチルコリンの合成を触媒する酵素であって、コリン作動性ニューロンに特異的な生化学マーカーでもある。脊髄においては、大部分のコリン作動性ニューロンは運動ニューロンである。かくして、この酵素のアッセイを、コリン作動性ニューロンの生存性および／またはこの酵素の調節に対する因子（または因子群）の効果の指標として用いることができる。
細胞が基体に付着し得るよう平板培養してから２〜３時間インキュベートした後に、示した濃度にてＫ−２５２ａを培養に添加した。ＣhＡＴ活性は培養中で４８時間後に測定した。その結果脊髄培養中のＫ−２５２ａは、用量依存的にＣhＡＴ活性を上昇させ、２００〜３００ｎＭにて最大効率に達した（２−ないし３−倍上昇）（図４）。さらに高濃度では、ＣhＡＴ活性が低下する結果となった（図４）。７日間までにわたるさらに長期の培養インキュベート期間では、ＣhＡＴ活性の基底野レベルが下降するため、ＣhＡＴ活性は４−ないし５−倍上昇した（図５）。この培養系においては、基本（対照）条件では経時的に変性および死滅する運動ニューロン数が増加した（マクマナマン(McManaman)ら、デベロップメンタル・バイオロジー(Developmental Biol.)第１２５巻:３１１〜３２０頁、１９８８年）。図４および図５双方に示す結果は、培養開始日にＫ−２５２ａを単独で適用した結果であり、脊髄コリン作動性ニューロンの生存性および／または該酵素自体の調節に対する効果が持続したことを示している。
【００７５】
方法:ラット胎児脊髄細胞の解離培養での実験は、記載されているごとく一般的に行った（スミス(Smith)ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)第１０１巻:１６０８〜１６２１頁、１９８５年）。組織のトリプシン解離を用いた当業者に公知の標準的技術により、１４日胚齢のラットから摘出した脊髄から解離細胞を調製した（スミス(Smith)ら、１９８５年）。細胞を、無血清Ｎ２培地中のポリ−１−オルニチンで被覆したプラスチック組織培養ウェルに６×１０５細胞／ｃｍ２にて撒き（平板培養し）、５％ＣＯ２／９５％空気の湿度調整下３７℃にて（ボッテンシュタイン(Bottenstein)およびサト(Sato)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユー・エス・エイ(PNAS USA)第７６巻：５１４〜５１７頁、１９７９年）、４８時間インキュベートした。イシダ(Ishida)およびデグチ(Deguchi)（ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(J.Neurosci.)第３巻：１８１８〜１８２３頁、１９８３年）、ならびにマクマナマン(McManaman)ら（前掲、（１９８８年））に準じて、フォナム(Fonnum)の方法（ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー(J.Neurochem.)第２４巻:４０７〜４０９頁、１９７５年）の変法を用いてＣhＡＴ活性を測定した。活性は、ビシンコニン酸(bicinchonicic acid)／Ｃｕ＋＋反応（ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬(BCA protein assay reagent)、イリノイ州、ロックランド、ピース(Pierce,Rockland,Il)）により測定した全タンパク質に対して補正した。
【００７６】
実施例７
Ｋ−２５２ａの１００種を超える機能性誘導体を脊髄ＣhＡＴアッセイで試験しそれらの相対効率を測定した。図８に示すデータは、３００および３０ｎＭで試験したオリジナルの機能性誘導体のうち２８種が３００ｎＭにてＣhＡＴ活性を有意に上昇させたことを示している。１つの機能性誘導体、化合物ＩＩ−２１も３０ｎＭにて活性を有していた（基底野レベルに対して３０％のＣhＡＴ活性の上昇）。この化合物は、３０ｎＭにてＣhＡＴ活性をかなり上昇させるものがＫ−２５２ａまたは残りのアナログのうちにないため、これらよりさらに強力であった。
図１３は、ラット脊髄培養において、有意にＣhＡＴ活性を上昇させるオリジナルの２８種のＫ−２５２ａ誘導体、ならびに３０種のさらなる誘導体（化合物ＩＩ−２９ないしＩＩ−３４、ＩＩ−３６ないしＩＩ−５６、およびＩＶ−１ないしＩＶ−３の全て）の効果を示す。
【００７７】
実施例８
Ｋ−２５２ａならびに５０種の機能性誘導体を後根神経節細胞の生存性を促進するそれらの能力につき評価した。細胞生存性は、生育可能な染料のアナログであってフルオレセイン二酢酸であるカルセインＡＭ(calcein AM)の取込みにより測定した。カルセインは、生存細胞により取り込まれ、細胞内で、生存細胞の無傷の膜により保持される蛍光性の塩に分解される。生存ニューロンの顕微鏡計数は、フルオロメーター生存率アッセイで得た相対的蛍光値に直接相関する。かくして、この方法は、所与の培養の全細胞集団中の生存細胞の、信頼性がありかつ定量的な測定を提供した。
後根神経節ニューロン生存性は、濃度依存的にＫ−２５２ａにより促進された;約１００ｎＭで最大活性が観察された（図６）。試験した５０種のアナログのうち２４種は、ＤＲＧニューロン生存性を促進するのに活性であり、そのうち２２種について図７に示す。これら全てのアナログは、脊髄ＣhＡＴ活性を上昇させるのにおいても活性であった（実施例５、図８参照）。オリジナルの２２種ならびに２種のさらなる活性なアナログ（ＩＩ−３０、ＩＩ−３２）を図１４に示す。２４種の活性な機能性誘導体で刺激された後根神経節ニューロンの顕微鏡観察は、神経繊維の成長も同様に促進されることを示した。
【００７８】
方法：後根神経節を８日胚齢のニワトリの胚から摘出し、続いてのディスパーゼ(Dispase)（中性プロテアーゼ、コラボレイティブ・リサーチ(Collaborative Research)社）解離により解離細胞を調製した。ニューロンを、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで被覆した９６ウェルプレートに低密度（１.８×１０４細胞／ｃｍ２）にて撒いた。細胞は、５％ＣＯ２／９５％空気、湿度調整下３７℃にて、無血清Ｎ２培地中で４８時間培養した（ボッテンシュタイン(Bottenstein)およびサト(Sato)、１９７９年）。細胞生存性は、前記した生存フルオロメーターアッセイを用いて、４８時間にて計測した。
【００７９】
実施例９
興奮性アミノ酸であるカイニン酸（カイニン酸塩）の齧歯動物の脳の空洞への直接的な浸出は、海馬の錐体細胞のニューロン変性を起こす。このニューロンの死滅は、細胞骨格タンパク質であるスペクトリンのタンパク質加水分解の著しい上昇により特徴付けられる。スペクトリン分解生成物は、カイニン酸塩投与後２４時間以内に海馬ホモジネート中で測定できる。スペクトリンのタンパク質加水分解の程度は、海馬の錐体細胞のニューロンの死滅の程度と高い相関があり（シーマン(Siman)ら、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(J.Neurosci.)第９巻：１５７９〜１５９０頁、１９８９年）、従って、スペクトリンのタンパク質加水分解は、興奮性アミノ酸−誘導性のニューロン変性の優れた生化学マーカーである。内因性興奮性アミノ酸の過剰な放出は、脳卒中および他の虚血性障害;アルツハイマー病;筋萎縮性硬化症を含む運動神経疾患；パーキンソン病；ハンチントン舞踏病；ＡＩＤＳ痴呆；癲癇；ならびに脳または脊髄の振盪および穿通損傷を含めた多くの神経疾患および不全の病因と関連があるとされてきた。
【００８０】
図９は、海馬におけるカイニン酸塩−誘導性ニューロン変性に対するＫ−２５２ａの効果を示している。カニューレ処理を施したオスおよびメスのスプラーグ−ドーリーラット(Sprague-Dawley rat)に、脳の大脳外側空洞（icv）に直接カイニン酸塩（０.６μｇ）を注射する３０分前ならびに約３および２４時間後に、０.４μｇのＫ−２５２ａまたはビヒクルを摂取させた。以下に記載するごとき組織学的分析のため、２週間後に該脳を摘出し、凍結し、切断して染色した。示したデータは各群につき損傷された海馬の亜領域の平均数±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である。Ｋ−２５２ａは、海馬内の損傷領域数を３.８６±０.７８（Ｋ−２５２ａ不存在）から１.１８±０.４（Ｋ−２５２ａ存在）に顕著に減じた。
【００８１】
図１０は、海馬における、カイニン酸塩−誘導性のスペクトリン分解に対するＫ−２５２ａの効果を示す。メスのスプラーグ−ドーリーラットに、icv注入によって、神経毒性用量のカイニン酸塩（０.６μｇ）と共に、０.４μｇのＫ−２５２ａまたはビヒクルを摂取させた。偽対照動物には、ビヒクルの注入を摂取させたがカイニン酸塩またはＫ−２５２ａを摂取させなかった。２４時間後に、後根海馬ホモジネートを、以下に記載するごとくにスペクトリン分解生成物につき分析した。スペクトリンのタンパク質分解の程度は、偽対照値に対する各群のスペクトリン分解生成物の％増加として表す。データは、各群のスペクトリン分解生成物の平均％増加（偽対照＝１００％）±Ｓ.Ｅ.Ｍ.値を示す。Ｋ−２５２ａのｉｃｖ注入は、スペクトリンタンパク質分解の程度を、偽対照値の約１４０±１５％（Ｋ−２５２ａ不存在）から約１０２±１０％（Ｋ−２５２ａ存在）に顕著に減じた。
【００８２】
実施例１０
図１１は、海馬における、カイニン酸塩−誘導性ニューロン変性に対するＨＢＣＳの効果を示す。カニューレ処理を施したメスのスプラーグ−ドーリーラットに、icv注入によって、カイニン酸塩（０.６μｇ）を摂取させる４０分前および約４時間後に、０.８μｇのＨＢＣＳまたはビヒクルを摂取させた。後記するごとく、組織学的な分析のため、２週間後に該脳を摘出し、凍結し、解離させて染色した。示したデータは各群につき損傷された海馬の亜領域の平均数±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である。ＨＢＣＳは、海馬内の損傷領域数を２.５±０.６（ＨＢＣＳ処理せず）から１.３±０.５（ＨＢＣＳ処理した）に顕著に減じた。
【００８３】
実施例１１
図１２は、海馬における、３種のＫ−２５２ａ機能性誘導体のカイニン酸塩−誘導性スペクトリン分解に対する効果を比較する。メスのスプラーグ−ドーリーラットに、icv注入によって、神経毒性用量のカイニン酸塩（０.６μｇ）と共に、０.４μｇのＫ−２５２ａまたは化合物ＩＩＩ−１もしくはＩＩ−２１またはビヒクルを摂取させた。偽対照動物には、ビヒクルの注入を摂取させたがカイニン酸塩またはＫ−２５２ａ誘導体は摂取させなかった。２４時間後に、後根海馬ホモジネートを、後記するごとく、スペクトリン分解生成物につき分析した。スペクトリンのタンパク質分解の程度は、偽対照値に対する各群についてのスペクトリン分解生成物の％増加として表す。示したデータは、各群につきスペクトリン分解生成物の平均％増加（偽対照＝１００％）±Ｓ.Ｅ.Ｍ.を示す。Ｋ−２５２ａのｉｃｖ注入は、スペクトリンのタンパク質分解の程度を、偽対照値の約１２８±９％（ビヒクル処理）から約１０４±４％（Ｋ−２５２ａ存在）に減じた。Ｋ−２５２ａ誘導体、ＩＩＩ−１およびＩＩ−２１は、カイニン酸塩−誘導性スペクトリンタンパク質分解を阻害できなかった。
【００８４】
図９〜１２の方法
カイニン酸塩注入様式：
Ｋ−２５２ａまたはその誘導体のカイニン酸塩−誘導性ニューロン損傷に対する効果を以下のごとくに評価した：成体のオスまたはメスのスプラーグ−ドーリーラット（１７５〜２５０ｇ）をネンブタール(Nembutal)（５０ｍｇ／ｋｇ,ｉｐ）で麻酔し、個々の場合について、示した用量および注入スケジュールを用いたicv注入によって、カイニン酸塩処理（５μl）の前または後に、合計５μlにて、薬剤を投与するか、あるいはビヒクルで処理した。対照動物には、カイニン酸塩および薬剤注入の代わりに担体を投与した。解剖学的な研究のため、icv注入は、薬剤注入の約１週間前に埋め込み、定位置：ブレグマの前−後で、ブレグマの１.５ｍｍ外側であって頭骸頂点から４.４ｍｍ腹側、に設置したカニューレ（プラスチック・ワン(Plastic One)、バージニア州、ローンオーク(Roanoke，VA)）を介してデリバリーした。この処理様式の結果は、以下に記載する解剖学的分析を用いて２週間後に評価した。
【００８５】
Ｋ−２５２ａまたはその誘導体のカイニン酸塩−誘導性スペクトリンタンパク質加水分解への効果を評価する実験において、麻酔したラットには、前記した定位置に設置した１０μlハミルトン(Hamilton)シリンジを介して、カイニン酸塩と同時に５μlの薬物またはビヒクルのicv注入を摂取させた。２４時間後にこれらのラットを殺し、以下に記載するごとく生化学的分析に付した。
【００８６】
解剖学的および生化学的分析
解剖学的分析は、以下のごとくに行った。処理２週間後に断頭によりラットを殺し、脳を迅速に摘出し、ドライアイスで凍結した。各脳からの一連のスライドに載せた冠状切片をチオニンで染色し、顕微鏡観察した。海馬への損傷は、錐体細胞の喪失を被っている該脳の左および右側の双方につき、海馬の４種の解剖学的定義領域（出典明示して本明細書の一部とみなす、シェパード(Shepard)、１９７９年、「ザ・シナプチック・オーガニゼーション・オブ・ザ・ブレイン(The Synaptic Organization of the Brain)」オックスフォード(Oxford)、３１０頁に記載されているロレンテ番号(Lorente de No)の分類に従ったＣＡ１−４）の全数を合計することにより定量化した。
生化学的分析は、以下のごとくに行った。脳スペクトリン（フォドリン）のカルペイン(Calpain)Ｉ−感受性のタンパク質加水分解は、シーマンらにより記載されているイムノブロット分析（１９８８年、ニューロン(Neuron)、第１巻:２７９〜２８７、出典明示して本明細書の一部とみなす）を用いて海馬のホモジネートにて評価した。簡単に述べると、処理２４時間後に断頭によりラットを殺し、後根海馬を迅速に脳から摘出し、０.１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する２０ｍＭＴris−ＨＣl（ｐＨ７.４）中でホモジナイズした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって各ホモジネートのアリコートからタンパク質を分離し、イムノブロット分析を用いて各試料中のカイニン酸塩−誘導性スペクトリン分解の量を定量した。
【００８７】
実施例１２
Ｋ−２５２ａを、線条体培養中における生存性を促進するその能力につき評価した。線条体は１７日胚齢のラット胚から切除し、細胞はディスパーゼ（中性プロテアーゼ、コラボラティブ・リサーチ(Collaborative Research)社）によって解離させた。ニューロンを、ウェルを予めポリ−１−オルニチンおよびラミリンで被覆した９６ウェルプレートに５×１０４／ウェル（１.５×１０５／ｃｍ２）にて撒いた。細胞は、５％ＣＯ２／９５％空気、湿度調整下３７℃にて、０.０５％ウシ血清アルブミンを含有する無血清Ｎ２培地中で培養した（ボッテンシュタイン(Bottenstein)およびサト(Sato)、１９７９年）。細胞生存性は、それを撒いて５日後に、実施例８に記載したカルセイン生存フルオロメトリーアッセイを用いて評価した。
線条体ニューロンの生存性は、Ｋ−２５２ａによって濃度依存的に上昇した。最大活性は７５ｎＭのＫ−２５２ａで認められ、対照に対して３〜４倍の効率が得られた（図１５）。対照培養においては、０日目にプレートしたニューロンの９０％が５日以内に死滅したが、一方、Ｋ−２５２ａで処理した培養においては該ニューロンの５０％が生存していた（図１６）。線条体ニューロンにおける生存性効果は培養３日後に起こり、少なくとも培養７日間維持された。培養開始日のＫ−２５２ａの単独適用から、これらの結果は、ある種のニューロン集団に対して生存性効果が維持されることを示す。
図１７は、対照培養または７５ｎＭのＫ−２５２ａで処理した培養から撮影した一対の光学顕微鏡写真である。７５ｎＭのＫ−２５２ａが存在するこれらの培養において、細胞生存性およびニューロン成長が高められていた。
【００８８】
実施例１３
実施例１０の線条体細胞生存アッセイにおけるＫ−２５２ａの３１種の機能性誘導体の強化性および効率を測定するため、該誘導体を試験した。図１８は、線条体ニューロンの生存性を促進する１８種のＫ−２５２ａ誘導体のデータを示している。
【００８９】
化合物（Ｖ）の製造プロセス
化合物（Ｖ）の製造プロセスを以下に記載する。
プロセス１
化合物（Ｖ−１）［Ｒ１がＣＨ２ＳＯ２Ｒ７であって、ＸがＣＯ２Ｒ５である化合物（Ｖ）］は以下の反応工程：
【００９０】
【化２７】
【００９１】
（Ｒ５は低級アルキルまたはＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｒ６を表し、ここにＲ６は低級アルキルまたはアリールを表し；Ｒ７は低級アルキルを表す）
により製造できる。
該出発化合物（Ａ）は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）特開昭６３−２９５５８８号に開示されている。
化合物（Ｖ−１）は、化合物（Ａ）を１〜１.５当量の酸化剤で処理することによって得ることができる。該酸化剤の例は、ｍ−クロロ過安息香酸である。反応溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルムまたは二塩化エチレン等のごときハロゲン化炭化水素を用いる。該反応は−２０〜３０℃にて０.５〜１時間で完了する。プロセス２
化合物（Ｖ−２）［Ｒ１が水素であって、ＸがＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｒ６である化合物（Ｖ）］は、以下の反応工程：
【００９２】
【化２８】
【００９３】
［Ｒ６は低級アルキルまたはアリールを表す］
によって製造できる。
出発化合物（Ｂ）は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）特開昭６２−１５５２８５号に開示されている。
化合物（Ｖ−２）は、１〜３当量の塩基の存在下で化合物（Ｂ）と１〜３当量のＣｌＣＯ２Ｒ６とを反応させることにより得ることができる。該塩基の例はトリエチルアミンである。反応溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルムまたは二塩化エチレンのごときハロゲン化炭化水素等を用いる。該反応は−１０〜３０℃にて０.５〜３時間で完了する。
【００９４】
実施例１４
化合物ＩＩ−４９
化合物（Ａ−１；Ｒ５＝ＣＨ３であってＲ７＝Ｃ２Ｈ５）（２７ｍｇ、０.０５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム１ｍlに溶解し、次いで、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸１０ｍｇ（０.０６ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて同温度にて４５分間撹拌した。クロロホルムで希釈した後に、該混合物を、８％チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水、および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９５／５）に付して１７.７ｍｇの化合物ＩＩ−４９を得た（収率６２％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.２９８(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.５Ｈｚ),２.０３７(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１４.１Ｈｚ),２.１５３(３Ｈ,ｓ),３.０９６(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.５Ｈｚ),３.２６６(２Ｈ,ｓ),３.９２９(３Ｈ,ｓ),４.９８５(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.０Ｈｚ),５.０４３(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.０Ｈｚ),６.３４８(１Ｈ,ｓ),７.１４７(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.１Ｈz),７.３４５-８.０７０(６Ｈ,ｍ),８.６１２(１Ｈ,ｓ),９.２３２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.５Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):５７４(Ｍ＋１)＋
【００９５】
実施例１５
化合物ＩＩ−５７
化合物（Ｂ）（４３.８ｍｇ、０.１ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン１ｍlに溶解し、次いで、クロロギ酸メチル９.３μl（０.１２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μl（０.２ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、氷冷下、５０分間撹拌した。テトラヒドロフランで希釈した後、混合物を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９９／１）に付して３２.６ｍｇの化合物ＩＩ−５７を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):２.０９９(３Ｈ,ｓ),２.６７９(１Ｈ,ｍ),３.２０４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=６.７,１３.８Ｈz),３.８３７(３Ｈ,ｓ),４.４４６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.３Ｈz),４.６３４(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.６Ｈz),５.４９７(１Ｈ,ｂｒｓ),６.５９１(１Ｈ,ｂｒｓ),７.０１０-８.０３７(７Ｈ,ｍ),８.５９２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=６.６Ｈｚ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):４９７(Ｍ＋１)＋
【００９６】
実施例１６
化合物ＩＩ−３８
化合物（Ｂ）４３.８ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸フェニル１５μlを用いて実施例１５と実質的に同じ方法を繰り返して、２７.８ｍｇの化合物ＩＩ−３８を得た（収率５０％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):２.１１１(３Ｈ,ｓ),２.８９０(１Ｈ,ｂｒｄ,Ｊ=１３.７Ｈz),３.２６２(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１３.９Ｈz),３.７４２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１３.４Ｈz),３.９６７(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１２.９Ｈz),４.５８２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.３Ｈz),５.３４２(１Ｈ,ｂｒｓ),５.９０６(１Ｈ,ｂｒｓ),６.５５０(１Ｈ,ｂｒｓ),７.００５-８.０４２(１２Ｈ,ｍ),８.５９６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=７.６Ｈｚ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):５５９(Ｍ＋１)＋
【００９７】
実施例１７
（化合物Ｃからの化合物Ｈの合成を図１９に示す）
化合物ＩＩ−３９
化合物（Ｃ）（特開昭６３−２９５５８８号公報;出典明示して本明細書の一部とみなす）（２０ｍｇ、０.０３５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム１ｍlに溶解し、次いで、トリエチルアミン１４.６μl（０.１０５ｍｍｏｌ）およびエチルイソシアネート１３.９μl（０.１７５ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、室温にて２時間撹拌した。該溶液にメタノール１ｍlを添加し、続いて、クロロホルムで希釈した。混合物を、水および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２）に付して２１ｍｇの化合物（Ｄ）を得た（収率８４％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.１９５(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.２Ｈz),１.２２２(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.２Ｈz),１.６６４(３Ｈ,ｓ),２.１９４(３Ｈ,ｓ),２.５５５(３Ｈ,ｓ),３.３４６(４Ｈ,ｑ,Ｊ=７.２Ｈz),３.８２０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.６Ｈz),３.９３８(３Ｈ,ｓ),５.０３６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.７Ｈz),５.１２５(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.２Ｈz),６.７４５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,７.４Ｈz),７.２６０-７.８９８(５Ｈ,ｍ),８.６９０(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.９Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):７２４(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｄ）（９ｍｇ、０.０１２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン０.２ｍlおよびメタノール０.２ｍlの混合液に溶解し、次いで、２８％ナトリウムメトキシド／メタノール２μlをそれに添加し、続いて、室温にて１０分間撹拌した。溶液に５％クエン酸水溶液０.１ｍlを添加し、続いて、クロロホルムで希釈した。混合物を水および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９／１）に付して、８ｍｇの化合物ＩＩ−３９を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.０８６(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.１Ｈz),１.０９９(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.１Ｈz),１.９４８(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,１４.１Ｈz),２.１０７(３Ｈ,ｓ),３.１５８(４Ｈ,ｍ),３.９１０(３Ｈ,ｓ),４.８８０(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.７Ｈz),４.９３１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.９Ｈz),７.０２８(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,７.１Ｈz),７.３３２-８.２８７(５Ｈ,ｍ),８.８３８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.１Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６４０(Ｍ＋１)＋
【００９８】
実施例１８
化合物ＩＩ−５１およびＩＩ−５６
化合物（Ｅ）（特開昭６３−２９５５８８号;前掲）（６０.７ｍｇ、０.１ｍｍｏｌ）を、クロロホルム５ｍlおよびメタノール１ｍlの混合液に溶解し、次いで、氷冷下、ホウ水素化ナトリウム１１ｍｇ（０.３ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、同温度にて１５分間撹拌した。クロロホルムで希釈した後に、混合物を水および食塩水で順次洗浄し、炭酸カリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン=９８／２／０.５）に付して、３６ｍｇの化合物（Ｆ）を得た（収率５９％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.６５０(３Ｈ,ｓ),２.０２７(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１４.５Ｈｚ),２.１２６(３Ｈ,ｓ),３.８４３(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.４,１４.５Ｈz),３.８９１(３Ｈ,ｓ),４.６０７(２Ｈ,ｓ),４.６７３(２Ｈ,ｓ),５.１２５(２Ｈ,ｓ),７.０９９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,７.３Ｈz),７.４３７-７.９０７(５Ｈ,ｍ),８.８１２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=０.８Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６１２(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｆ）（１５９ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ）をクロロホルム１５ｍlに溶解し、次いで、エタンチオール０.８ｍl（１０.４ｍｍｏｌ）およびショウノウスルホン酸２４ｍｇ（０.１０４ｍｇ）をそれに添加し、続いて、室温にて１２時間撹拌した。溶液を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水、および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／トルエン＝１／９−クロロホルム／メタノール＝９９／１）に付して４３ｍｇの化合物（Ｇ）および７５ｍｇの化合物（Ｈ）を得た。
化合物（Ｇ）
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.２９２(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.２９７(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.７９９(３Ｈ,ｓ),２.１４１(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１４.５Ｈz),２.２５６(３Ｈ,ｓ),２.５３２(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.５５３(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.８６９(３Ｈ,ｓ),３.９７１(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.５Ｈz),３.９９２(２Ｈ,ｓ),４.００５(３Ｈ,ｓ),４.０２１(２Ｈ,ｓ),５.４１６(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=１７.５Ｈz),５.４５９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.４Ｈz),６.９８９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.１,７.４Ｈz),７.５０９-７.９６３(５Ｈ,ｍ),９.１３４(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.２Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):７００(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｈ）
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.２９４(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.７９９(３Ｈ,ｓ),２.１４９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１４.６Ｈz),２.２７３(３Ｈ,ｓ),２.５３３(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.８１３(３Ｈ,ｓ),３.９７２(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.４,１４.６Ｈz),４.００８(３Ｈ,ｓ),４.０１５(２Ｈ,ｓ),４.９５１(２Ｈ,ｓ),５.３７７(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.４Ｈz),５.４１８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.４Ｈz),６.９７３(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,７.５Ｈz),７.４８１-８.０３７(５Ｈ,ｍ),９.０９３(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.２Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６５６(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｇ）３４ｍｇを用いて、実施例１７と実質的に同じ方法を繰り返して、１８.７ｍｇの化合物ＩＩ−５１を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.３００(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.３２５(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),２.１８５(３Ｈ,ｓ),２.５１４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,１４.５Ｈz),２.５４０(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.５５５(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),３.３８４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.５Ｈz),３.９４１(２Ｈ,ｓ),３.９７６(２Ｈ,ｓ),４.０９４(３Ｈ,ｓ),４.８３６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.４Ｈz),４.９１０(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.３Ｈz),５.７８１(１Ｈ,ｓ),６.８４５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,７.５Ｈz),７.３７１-７.８４３(５Ｈ,ｍ),８.９９８(１Ｈ,ｓ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６１６(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｈ）３０ｍｇを用い、実施例１７と実質的に同じ方法を繰り返して、２０.４ｍｇの化合物ＩＩ−５６を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.２８０(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),２.１４４(３Ｈ,ｓ),２.３９１(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１４.５Ｈz),２.５１７(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),３.３２０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.４,１４.５Ｈz),３.８８５(２Ｈ,ｓ),４.０６９(３Ｈ,ｓ),４.５２１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.３Ｈz),４.６３１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.７Ｈz),４.８０４(２Ｈ,ｓ),５.７６９(１Ｈ,ｓ),６.８３０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,７.４Ｈz),７.３７５-７.７７１(５Ｈ,ｍ),８.９３４(１Ｈ,ｓ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):５７２(Ｍ＋１)＋
【００９９】
実施例１９
化合物ＩＶ−２
化合物（Ｊ）（特開昭６２−１２０３８８号;出典明示して本明細書の一部とみなす）（５０ｍｇ、０.０９ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸０.５ｍlおよび３Ｎ ＨＣl５０μlの混合液に溶解し、溶液を室温にて２日間撹拌した。濾過により沈殿物を回収し、高速液体クロマトグラフィー（ユニシル(Unisil)５Ｃ１８；メタノール／水＝８／２）に付して８.４ｍｇの化合物（ＩＶ−２）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):４.９４７(２Ｈ,ｓ),７.３００-８.０１０(６Ｈ,ｍ),８.２４９(１Ｈ,ｓ),９.２６６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.０Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):３９０(Ｍ＋１)＋
【０１００】
実施例２０
化合物ＩＩ−４５は、図２０に示した反応段階により製造できる。出発化合物（Ｊ）は、特開昭６２−１２０３８８号（出典明示して本明細書の一部とみなす）に開示されている。
化合物ＩＩ−４５
化合物（Ｊ）（２００ｍｇ）を、ジメチルホルムアミド１ｍlに溶解し、次いで、水酸化ナトリウム２３.５ｍｇの水溶液０.２５ｍlをそれに添加し、続いて、室温にて４時間撹拌した。１Ｎ塩酸を添加して、溶液のｐＨを１〜２に調整し、濾過により沈殿物を収集して１７８ｍｇの化合物（Ｋ）を得た（収率９１％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.９６５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,１４.０Ｈz),２.１８４(３Ｈ,ｓ),３.３６４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.０Ｈz),５.０２９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.１Ｈz),５.０７１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.０Ｈz),７.１３３(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.５Ｈz),７.５９５-８.１８９(５Ｈ,ｍ),８.７３３(１Ｈ,ｓ),９.３９８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.１Ｈz)
化合物（Ｋ）（１６８ｍｇ）を、ピリジン３ｍlに溶解し、次いで、無水酢酸０.４４ｍl（４.７ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、室温にて４時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、１Ｎ塩酸４ｍlを残渣に添加し、濾過により沈殿物を収集して１８２ｍｇの化合物（Ｌ）を得た（定量的収率）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.６８４(３Ｈ,ｓ),２.１３５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１４.４Ｈz),２.２５２(３Ｈ,ｓ),３.８６５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.６,１４.５Ｈz),５.０６３(２Ｈ,ｓ),７.２５５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.５Ｈz),７.６１２-８.５８２(５Ｈ,ｍ),８.７６０(１Ｈ,ｓ),９.３８９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.１Ｈz)
化合物（Ｌ）（１７２ｍｇ）を、塩化チオニルに懸濁し、続いて、９０℃にて４.５時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、ジエチルエーテルを残渣に添加し、濾過により沈殿物を収集して１８０ｍｇの化合物（Ｍ）を得た。
化合物（Ｍ）（６７ｍｇ、０.１ｍｍｏｌ）を二塩化エチレン２ｍlに溶解し、次いで、氷冷下、テトラヒドロフラン中のアニリン１８０μlをそれに添加し、続いて、同温度にて１時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をテトラヒドロフラン２ｍlおよびメタノール０.５ｍlの混合液に溶解し、次いで、１ＮのＮａＯＨ１ｍlをそれに添加し、続いて室温にて３時間撹拌した。溶液に１Ｎ塩酸（１.２ｍl）を添加して中和し、続いてテトラヒドロフランで希釈した。該混合物を食塩水で洗浄し硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２）に付して化合物ＩＩ−４５（単離された化合物Ｎ５６ｍｇから１３ｍｇ）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):２.１１０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１３.９Ｈz),２.１７５(３Ｈ,ｓ),５.０１９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.１Ｈz),５.０８８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.０Ｈz),６.８８７(１Ｈ,ｓ),７.１１９-８.２０１(１１Ｈ,ｍ),８.７１１(１Ｈ,ｓ),９.３９１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.２Ｈz),１０.０７１(１Ｈ,ｓ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６８７(Ｍ＋１)＋
他の具体例も、以下の請求の範囲内に包含される。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明により提供されたスタウロスポリンの新規なビス−置換誘導体のうち１種の治療量を投与することにより、コリン作動性ニューロン、線条体ニューロン、および感覚ニューロン、例えば、後根神経節ニューロンの機能を高めることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＣ−１２細胞における基底オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）活性に対するＫ−２５２ａ、１,６−ヘキサメチレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)（ＨＢＣＳ）およびスタウロスポリンの効果を示すグラフ。
【図２】 ＰＣ−１２細胞におけるＮＧＦ−刺激性ＯＤＣ活性に対するスタウロスポリン、ＨＢＣＳおよびＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図３】 ＰＣ−１２細胞におけるＯＤＣ活性に対するＨＢＣＳのＮＧＦ−強化効果を示すグラフ。
【図４】 ラット胚脊髄培養におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣhＡＴ）比活性に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図５】 ラット胚脊髄培養におけるＣhＡＴ活性に対するＫ−２５２ａの経時的な効果を示すグラフ。
【図６】 ニワトリ胚後根神経節ニューロンの生存性に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図７】 ニワトリ胚後根神経節ニューロンの生存性に対するＫ−２５２ａ機能性誘導体の効果を示すグラフ。
【図８】 ラット胚脊髄培養におけるＣhＡＴ活性に対するＫ−２５２ａ機能性誘導体の効果を示すグラフ。
【図９】 ラット海馬へのカイニン酸塩(kainate)誘導性の障害に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図１０】 ラット海馬におけるカイニン酸塩誘導性のスペクトリンのタンパク質加水分解に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図１１】 該海馬へのカイニン酸塩誘導性の障害に対するＨＢＣＳの効果を示すグラフ。
【図１２】 ラット海馬におけるカイニン酸塩誘導性のスペクトリンのタンパク質加水分解に対するＫ−２５２ａアナログの効果を示すグラフ。
【図１３】 ラット脊髄培養におけるＣhＡＴ活性に対するＫ−２５２ａ誘導体の相対活性を示す表。
【図１４】 ニワトリ後根神経節培養におけるニューロンの生存性に対するＫ−２５２ａ誘導体の相対活性を示す表。
【図１５】 Ｋ−２５２ａの存在下の線条体ニューロンの生存性を示すグラフ。
【図１６】 Ｋ−２５２ａの存在下の線条細胞の生存性を示すグラフ。
【図１７】 Ｋ−２５２ａの存在または不存在下にて培養した線条体ニューロンの光学顕微鏡写真。
【図１８】 ラット線条体培養におけるニューロン生存性に対するＫ−２５２ａ誘導体の相対活性を示す表。
【図１９】 出発化合物Ｃからの化合物Ｈの合成を示す概略図。
【図２０】 出発化合物Ｊからの化合物ＩＩ−４５の合成を示す概略図。
【従来の技術】
発明の背景
プロテインキナーゼは、アミノ酸をリン酸化することにより数多くの細胞性タンパク質を化学的に修飾するよう作用する広範なクラスの酵素である。
プロテインキナーゼの阻害剤は構造的に変化に富み、神経系および他の組織に対して種々の（時として、相反する）作用を有する。所与のプロテインキナーゼ阻害剤は、２以上のプロテインキナーゼに対して影響を及ぼし得る。例えば、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)属の種およびアクチノマデュラ(Actinomadula)属の種の培養ブロスから単離されたアルカロイド様物質であるＫ２５２−ａは、元来、プロテインキナーゼＣ阻害剤であると報告されたが、続いてプロテインキナーゼＡおよびＧ、ミオシン軽鎖キナーゼ、およびｔｒｋ（神経成長因子［ＮＧＦ］により活性化されるチロシンキナーゼであり、後者は末梢、知覚および交感神経の生存性を促進する向神経性タンパク質である）も阻害することが見い出された。この後者の作用と一致して、Ｋ−２５２ａは、ＮＧＦのＰＣ−１２細胞（ラット副腎髄質腫瘍由来のクロム親和性細胞である褐色細胞腫）に対する向神経性の作用を阻害し、かつ後根神経節ニューロンおよび海馬ニューロンの生存性を促進する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、それは広範囲な濃度にて細胞毒性であることが見い出され、幾人かの研究者をして、これがイン・ビボ(in vivo)で限定された有用性しか有しないと結論付けさせることとなった。
Ｋ−２５２ａに関連する微生物アルカロイドであるスタウロスポリン(staurosporine)もまた、異なったプロテインキナーゼおよび細胞型に対して種々の作用を有する。スタウロスポリンは、ＰＣ−１２細胞に対してＮＧＦ様の作用を有すること、ならびに虚血後の損傷からアレネズミの海馬を保護することが見い出された。それは、ラットの前脳基底野においてコリン作動性ニューロンへの傷害を逆行させることができる。
Ｋ−２５２ａおよびスタウロスポリンは、腫瘍阻害剤として提唱されてきた。スタウロスポリンは、殺虫剤として提供されてきた。メチルアミンの窒素原子が置換されてヒドロカルビル基またはアシル基を有するスタウロスポリンの誘導体が製造され、以下の：腫瘍阻害、炎症阻害、免疫調節、および心血管および中枢神経系の疾患治療の用途が提唱されている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、一の態様において、式：
【０００４】
【化７】
【０００５】
【化８】
の残基を表し、Ｗはビス(カルバミル)またはビス(チオカルバミル)基：
【０００７】
【化９】
を表し、ここに、Ｗ'は２〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であって、ＹはＯまたはＳを意味する］
によって表される新規なスタウロスポリンのビス−Ｎ−置換誘導体をその要旨とする。
また、本発明は、式（ＩＩ−４）：
【０００９】
【化１０】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々独立してＨ、Ｘはヒドロキシメチル（ＣＨ２ＯＨ）であって、ＲはＯＣＨ３を意味する］
によって表されるＫ−２５２ａの新規な誘導体をその要旨とする。
また、本発明は、式：
【００１１】
【化１１】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々独立してＨ、ＸはＣＨ２−ＮＨ−Ｓerであって、ＲはＯＨを意味する］
によって表されるＫ−２５２ａの新規な誘導体をその要旨とする。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−４９）：
【００１３】
【化１２】
［式中、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々Ｈ、ＲはＯＨ、Ｒ１はＣＨ２ＳＯ２Ｃ２Ｈ５であって、ＸはＣＯ２ＣＨ３を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−３８）：
【００１５】
【化１３】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々Ｈ、ＲはＯＨであって、ＸはＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ６Ｈ５を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−４５）：
【００１７】
【化１４】
［式中、Ｒ１およびＲ２は、各々Ｂｒ、ＲはＯＨ、Ｚ１およびＺ２は各々Ｈであって、ＸはＣＯＮＨＣ６Ｈ５を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（ＩＩ−５７）：
【００１９】
【化１５】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｚ１およびＺ２は、各々Ｈ、ＲはＯＨであって、ＸはＣＨ２ＮＨＣＯ２ＣＨ３を意味する］
によって表される化合物も包含される。
また、本発明には、以下の式（Ｖ）：
【００２１】
【化１６】
［式中、ＸはＣＯ２Ｒ５（ここで、Ｒ５は低級アルキルを表す）またはＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｒ６（ここで、Ｒ６は低級アルキルまたはアリールを表す）を表し；Ｒ１は水素またはＣＨ２ＳＯ２Ｒ７（ここで、Ｒ７は低級アルキルを表す）を表すが、但し、Ｘ＝ＣＯ２Ｒ５であって、Ｒ１＝水素の組合せは除外される］
で示される化合物も包含される。
式（Ｖ）における基の定義において、低級アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ネオペンチルおよびヘキシルのごとき、１ないし６個、好ましくは、１ないし３個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味する。アリールは、フェニルおよびナフチルのごとき、６ないし１０個の炭素原子を有するアリール基を意味する。
式Ｖの化合物は、医薬上許容される塩の形態とすることができる。化合物（Ｖ）の医薬上許容される塩は、医薬上許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、およびアミノ酸付加塩を包含する。
医薬上許容される酸付加塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩およびリン酸塩のごとき無機酸付加塩、ならびに、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩およびクエン酸塩のごとき有機酸付加塩がある。医薬上許容される金属塩の例としては、ナトリウム塩およびカリウム塩のごときアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩のごときアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩および亜鉛塩がある。医薬上許容されるアンモニウム塩の例としては、アンモニウム塩およびテトラエチルアンモニウム塩がある。医薬上許容される有機アミン付加塩の例としては、モルホリンおよびピペリジンとの塩がある。医薬上許容されるアミノ酸付加塩の例としては、リジン、グリシンおよびフェニルアラニンとの塩がある。
【００２３】
もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物、例えば、ヒトにスタウロスポリンの新規なビス−置換誘導体のうち１種の治療量を投与することにより、コリン作動性ニューロン、線条体ニューロン、および感覚ニューロン、例えば、後根神経節ニューロンの機能を高める方法をその要旨とする。該治療は、栄養因子、好ましくはニューロトロフィックファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなしうる。ニューロトロフィックファミリーは、ＮＧＦに対し高い相同性を有するタンパク質群であって、ＮＧＦに加えて、脳由来栄養因子（ＢＤＮＦ;レイブロック(Leibrock)ら、ネイチャー(Nature)第３４１巻:１４９〜１５２頁、１９８９年）;ニュートロフィル−３(neutrophil-３)（ＮＴ−３;ホーン(Hohn)ら、ネイチャー(Nature)第３４４巻:３３９〜３４１頁、１９９０年）;およびニューロトロフィック−５(neurotrophic-５)（ＮＴ−５;バークマイヤー(Berkemeier)ら、ニューロン(Neuron)第７巻:８５７〜８６６頁、１９９１年）も包含する。
【００２４】
もう１つの態様において、本発明は、スタウロスポリンの新規なビス−置換誘導体のうちの１種の治療量を、例えば、ヒトのごとき哺乳動物に投与することにより、興奮性アミノ酸により誘導される変性から該哺乳動物の神経細胞を保護する方法をその要旨とする。かかる変性が起こり得る病患は、アルツハイマー病;運動ニューロンの疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症;パーキンソン病;脳血管疾患、例えば、虚血状態;ＡＩＤＳ痴呆;癲癇;ハンチントン舞踏病;ならびに、脳または脊髄への振盪または穿通損傷を包含する。該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなしうる。
【００２５】
もう１つの態様において、本発明は、テーブル１に示すいずれかの置換基を有する式:
【００２６】
【化１７】
によって表されるＫ−２５２ａの機能性誘導体の治療量を、哺乳動物、例えば、ヒトに、投与することにより、該哺乳動物において、コリン作動性ニューロン、線条体ニューロン、および感覚ニューロン、例えば、後根神経節ニューロンの機能を高める方法をその要旨とする。：
【００２８】
【表１】
【表２】
該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなし得る。該方法は、ハンチントン舞踏病を治療するのに用いることができる。
【００３１】
好ましい態様において、本発明は、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【００３２】
【化１８】
によって表されるＫ−２５２ａの機能性誘導体の治療量を哺乳動物、例えば、ヒトに投与することによって、後根神経節神経細胞の機能を高める方法をその要旨とし、該式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の誘導体は以下の置換基を有する。
【００３４】
【表３】
該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなし得る。
好ましい態様において、本発明は、式（ＩＩ）：
【００３６】
【化１９】
［式中、Ｒ１およびＲ２は各々Ｈ、ＸはＣＯ２ＣＨ３、ＲはＯＨであって、Ｚ１およびＺ２は各々Ｈを意味する］
によって表されるＫ−２５２ａの治療量を哺乳動物、例えば、ヒトに投与することにより、該哺乳動物のコリン作動性ニューロンの機能を高める方法をその要旨とする。該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と組み合わせてなすことができ、また、ハンチントン舞踏病を治療するのに用いることができる。
好ましい態様において、本発明は、
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
【００３８】
【化２０】
によって表されるＫ−２５２ａまたはＫ−２５２ａの機能性誘導体の治療量を哺乳動物、例えば、ヒトに投与することによって、線条体神経細胞の生存性および／または機能を高める方法をその要旨とするが、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）の化合物は以下の置換基を有する。
［式中、以下の置換基がある：
【００４０】
【表４】
該治療は、栄養因子、好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子と組み合わせてなすことができ、また、ハンチントン舞踏病を治療するのに用いることができる。
本発明の他の要旨および利点は、以下のその好ましい具体例の記載および請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００４２】
【発明の実施の形態】
スタウロスポリン誘導体
本発明は、スタウロスポリンの新規なビス−Ｎ−置換誘導体、ならびに、神経病、特に、障害され、損傷し、軸索変性が進行しているか、死滅する危険性が上昇しているかのいずれかの神経細胞、あるいは損われたコリン作動活性により特徴付けられる疾患についての治療剤としてのその使用に関する。これらの疾患は、興奮性アミノ酸により誘導されるものを包含する。これらの新規な誘導体の治療剤としての使用は、誘導体単独の使用、および、栄養因子（好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子、ＮＧＦ）の外因的投与と組み合わせた該誘導体の使用を包含する。本発明の範囲内の化合物は、式：
【００４３】
【化２１】
［式中、［Stau］は、式：
【化２２】
の残基を表し、Ｗはビス(カルバミル)またはビス(チオカルバミル)基：
【００４６】
【化２３】
を表し、ここで、Ｗ'は２〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であって、ＹはＯまたはＳを意味する］
によって表すことができる。Ｗ'は、好ましくは、非置換の、または１〜３個の炭素原子の１〜３個のアルキル基で置換された２〜１０個の炭素原子のアルキレン基;非置換の、または１〜３個の炭素原子のアルキル基、塩素原子もしくは臭素原子の１〜３個で置換された６〜１２個の炭素原子のアリーレン基である。Ｗ'は、特に好ましくは、ヘキサメチレンおよび１,４−フェニレンである。Ｙは、好ましくはＯである。
【００４８】
式（Ｉ）の化合物は、カルバメートおよびチオカルバメートの製造に関する当該分野において公知の方法により製造できる。好ましくは、該化合物は、ビス−ジイソシアネートまたはビス−ジイソチオシアネートとスタウロスポリンとを反応させて、式（Ｉ）（式中、各々、Ｙ＝ＯまたはＹ＝Ｓ）の化合物を得ることによって製造できる。
【００４９】
用いるのに適する中間体ビス−ジイソシアネートおよびビス−ジイソチオシアネートは：
１,６−ジイソシアネートヘキサン
トルエン−２,６−ジイソシアネート
ベンゼン−１,２−ジイソシアネート
２−メチル−１,５−ジイソシアネートペンタン
ナフタレン−２,６ ジイソシアネート
１,６−ジイソチオシアネートヘキサン
１,４−ジイソチオシアネートブタン
トルエン−２,４−ジイソシアネート
ベンゼン−１,４−ジイソシアネート
１,２−ジイソシアネートエタン
ナフタレン−１,５−ジイソシアネート
１,５−ジイソシアネートペンタン
ベンゼン−１,４−ジイソチオシアネート
２−メチル−１,５−ジイソチオシアネートペンタン
を包含する。
【００５０】
イソシアネートおよびイソチオシアネートの製造のレビューについては、リヒターおよびウルリッヒによる刊行物を参照されたい（リヒター(Richter)およびウルリッヒ(Ulrich)「ザ・ケミストリー・オブ・サイネーテス・アンド・ゼア・チオ・デリバティブズ(The Chemistry of Cyanates and Their Thio Derivatives)」、第２版、ウイリー(Wiley)、ニュー・ヨーク(New York)、１９７７年）。該化合物は、好ましくは、ホスゲン（Ｙ＝Ｏ）またはチオホスゲン（Ｙ＝Ｓ）と対応するジアミンとの反応により製造する。別製法を用いることもできる。例えば、エチレン尿素とホスゲンとを反応させ、続いて加熱することにより１,２−ジイソシアネートエタンを製造することができる。
【００５１】
Ｋ−２５２ａ誘導体
また、本発明は、障害され、損傷し、軸索変性が進行しているか、死滅の危険にあるニューロンにより特徴付けられる、ある種の神経病または障害における治療剤としての、Ｋ−２５２ａの特定の機能性誘導体の使用にも振向される。該機能性誘導体は、単独で、または栄養因子（好ましくは、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子、ＮＧＦ）と組み合わせて投与することができる。Ｋ−２５２ａの「機能性誘導体」とは、例えば、神経細胞生存性を促進する能力、または神経繊維（例えば、軸索）成長を促進する能力、またはコリン作動性神経細胞機能を高める能力、または感覚細胞（例えば、後根神経節神経細胞）の機能を高める能力、または線条体ニューロンの機能および／または生存性を高める能力のごとき、本明細書中で神経保護活性(neuroprotective activity)と定義する所望の生物学的活性を有する、該分子の修飾形態を定義する。かかる分子修飾は、分子の溶解性、吸着性、（例えば、血液脳関門および細胞膜を通っての）輸送性、生物学的半減期等を改善することができる。別法として、あるいはさらに、ある種の基は、当該分子の毒性を減じることができ、あるいは、当該分子の望ましくないいずれの副作用も除去または緩和することができる。
【００５２】
本発明の範囲内の化合物は、本発明の範囲内の化合物を示す後記のテーブル４中の置換基を有する、以下の式（ＩＩ）［以下、化合物（ＩＩ）という］、式（ＩＩＩ）［以下、化合物（ＩＩＩ）という］、および式（ＩＶ）［以下、化合物（ＩＶ）という］：
【００５３】
【化２４】
によって表すことができる。本発明のＫ−２５２ａの機能性誘導体は、当業者に公知の方法を用いる化学合成によってデ・ノボ(de novo)で製造し得る。例えば、化合物ＩＩの製造に用いる方法は、ムラカタ(Murakata)ら（出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第４,９２３,９８６号）により記載されている。化合物ＩＩＩの製造に用いる方法は、ムーディー(Moody)ら（ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(J.Org.Chem.)第５７巻:２１０５〜２１１４頁（１９９２年））;ステグリッヒ(Steglich)ら（アンギュ・ケム・イント・エド・イングル(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)第１９巻:４５９〜４６０頁（１９８０年））;ナカニシ(Nakanishi)ら（ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス(J.Antibiotics)第３９巻:１０６６〜１０７１頁（１９８６年））;ならびに、特願昭６０−２９５１７２号（１９８５年）により記載されている。さらに、特願昭６０−２９５１７３号（１９８５年）中に化合物ＩＩ−１、９、１２および１５;特願昭６２−３２７８５８号（１９８７年）中に化合物ＩＩ−２、３、４、２４、２５および２６;特願昭６２−３２７８５９号（１９８７年）中に化合物ＩＩ−２０;および、明治製菓（株）(Meiji Seika Kaisha Ltd.)によって、特願昭６０−２５７６５２号（１９８５年）中に化合物ＩＩ−１０の製造方法が記載されている。
【００５５】
【表５】
【表６】
また、本発明は、前記に示した化合物（ＩＩ）およびテーブル４（脚注１０）に示した置換基によって表されるＫ−２５２ａの治療量を投与することにより、コリン作動性ニューロンの機能を高める方法も包含する。この化合物は、当該分野にて記載されている方法によって製造する（マツダ(Matsuda)ら、米国特許第４,５５４,４０２号;カセ(Kase)ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス(J.Antibiotics)第３７巻:１０５９〜１０６５頁（１９８６年）参照）。「コリン作動性ニューロンの機能を高める」とは、コリン作動性神経細胞の生存性、および／または神経繊維（例えば、軸索）の成長を促進すること、および／または神経細胞のコリン作動活性を高めることを意味する。Ｋ−２５２ａは、栄養因子、好ましくはニューロトロフィンファミリーのメンバー、最も好ましくは神経成長因子（ＮＧＦ）と共に、あるいはそれ無しで投与することができる。
【００５８】
化合物の用途
以下にさらに詳細に記載するように、本発明は、単独で、またはＮＧＦのごとき栄養因子と組み合わせてのＫ−２５２ａの機能性誘導体または式Ｉの化合物の、特に、障害され、損傷し、軸索変性が進行しているか死滅の危険性が上昇している神経細胞により特徴付けられるか、損われたコリン作動活性により特徴付けられる神経病の治療剤としての、新規な用途を提供する。これらの疾病としては、興奮性アミノ酸により誘導されるものを包含する。栄養因子との組合せも含む本発明の化合物の生物活性は、（全て以下に詳記する）培養ＰＣ−１２細胞・オルニチンデカルボキシラーゼ・アッセイ、培養脊髄・コリンアセチルトランスフェラーゼ・アッセイ、培養後根神経節ニューロン・生存アッセイ、培養線条体ニューロン・生存アッセイ、またはイン・ビボ・興奮性毒素神経保護・アッセイにより簡便に検定し得る。かくして、本発明の化合物は、前記した、神経病あるいは神経細胞の死滅または不全の危険性が高まることにより特徴付けられる障害に苦しむヒトまたは他の哺乳動物への投与に有用である。これらの神経病および障害としては:アルツハイマー病;筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患;パーキンソン病;脳卒中または他の虚血性障害;ハンチントン舞踏病;ＡＩＤＳ痴呆;癲癇;脳または脊髄の振盪または穿通損傷;および末梢神経障害を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本明細書中にて提供する化合物は、医薬上許容される非毒性の賦形剤および担体と混合することにより医薬組成物に製剤化することができる。前記したごとく、かかる組成物は、非経口投与で用いるために、特に液状の溶液または懸濁液の形態に;経口投与には、特に錠剤またはカプセル剤の形態に;または鼻腔内投与には、特に粉末剤、点鼻液またはエアロゾールの形態に製造することができる。
該組成物は、都合よくは、単位用量形態にて投与でき、例えば、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)（マック・パブ社(Mack Pub.Co.)、ペンシルバニア州、イーストン(Easton,PA)（１９８０年））に記載されているごとく医薬分野でよく知られた方法のいずれによっても製造できる。非経口投与用の製剤には、通常の賦形剤である滅菌水またはセーライン、ポリエチレングリコールのごときポリアルキレングリコール、野菜起源の油、水素化ナフタレン等を含有させることができる。特に、生適合性、生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコール酸共重合体、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体は、有効成分化合物の放出を制御する有用な賦形剤となり得る。これらの有効成分化合物のための他の潜在的に有用な非経口デリバリーシステムとしては、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システムおよびリポソームを包含する。吸入投与用の製剤は、例えば、ラクトースを賦形剤として含有させるか、または、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含有する水溶液、または点鼻液形態にて投与する油性溶液とするか、または鼻腔内に適用するゲルとすることができる。非経口投与用の製剤には、バッカル投与用のグリココレート、直腸投与用にメトキシサリチレート、または膣投与用にはクエン酸を含有させることもできる。
本発明の該物質は、薬剤中にて単独の有効剤として用いることができるか、または、例えば、末梢神経障害のごとき神経の疾病または不全におけるニューロン生存性または軸索の成長を容易ならしめる他の成長因子のような、他の有効成分と組み合わせて用いることもできる。
【００６０】
治療組成物における本明細書中に記載した該化合物の濃度は、投与すべき該薬剤の用量、用いる該化合物の化学的な特性（例えば、疎水性）、および投与経路を含めた多くの要因に応じて変動するであろう。一般的に、本発明の化合物は、約０.１ないし１０％ｗ／ｖの非経口投与用の化合物を含有する水溶性生理緩衝液中にて提供できる。典型的な用量範囲は、約１μｇ／ｋｇ体重／日ないし約１ｇ／ｋｇ体重／日;好ましい用量範囲は約０.０１ｍｇ／ｋｇ体重／日ないし１００ｍｇ／ｋｇ／体重／日である。投与すべき薬剤の好ましい用量は、該神経病の型および進行の程度、個々の患者の総じての健康状態、選択した化合物の相対的な生物学的効率、該化合物賦形剤の製剤、およびその投与経路のごとき変数に依存するようである。
【００６１】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実施例は、添付した請求の範囲のみによって決定される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【００６２】
実施例１
１,６−ヘキサメチレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)（ＨＢＣＳ）（硫酸マグネシウム無水和物上で乾燥させた）酢酸エチル１.００ｍl中のスタウロスポリン（カミヤ・バイオメディカル社(Kamiya Biomedical Company)、カリフォルニア州、サウザンド・オークス(Thousand Oaks,CA)）１.０ｍｇの溶液（２.１５マイクロモル）を、乾燥した酢酸エチル１.０ｍl中のヘキサメチレン−ビス−イソシアネート１０.７５ｍｇの溶液１７μl（１.０８マイクロモル）で処理した。コハク色ガラス製反応バイアル中の該反応混合物を、室温にて２日間放置した。６００μｇ重量の結晶性沈殿物を分離した。その組成を高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ-ＭＳ）より確認した。
【００６３】
実施例２
ｐ−フェニレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)（ＰＢＣＳ）
乾燥した酢酸エチル１.００ｍl中のスタウロスポリン１.０ｍｇの溶液（２.１５マイクロモル）を、乾燥した酢酸エチル１.００ｍl中のｐ−フェニレンジイソシアネート（トランス・ワールド・ケミカルズ (Trans World Chemicals)社 Ｐ１５８６−１）３.８３ｍｇから調製した溶液４５μl（１.０８マイクロモル）で処理した。該反応混合物を一晩放置した。白色沈殿物が生じた。次いで、石油エーテル０.５ｍlを添加した。該混合物を、真空乾燥した焼結−ガラス漏斗で濾過した。合計０.９０ｍｇの結晶性生成物を収集し、高速原子衝撃質量分析によりｐ−フェニレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)であると同定された。
調製例Ａ
Ｎ−フェニルカルバミルスタウロスポリン（ＰＣＳ）
文献：米国特許第５,０９３,３３０号
乾燥した酢酸エチル１.５０ｍl中のスタウロスポリン２.０ｍｇ（４.３０マイクロモル）の溶液を、乾燥した酢酸エチル０.９９０ｍl中のフェニルイソシアネート１０μlの溶液４６８μl（４.３０マイクロモル）で処理した。該溶液を一晩放置し、ヘキサデ３ｍlを少量ずつ添加した。２.３９ｍｇ重量の無色の結晶を得た。酢酸エチル１ｍlおよび石油エーテル２ｍlからこの生成物を再結晶した後に、結晶性生成物１.７５ｍｇを単離した。同様な調製から、Ｎ−フェニルカルバミルスタウロスポリンとしての生成物の組成がＦＡＳ−ＭＳによって確認された。
調製例Ｂ
Ｎ−フェニルチオカルバミルスタウロスポリン（ＰＴＣＳ）
酢酸エチル１.００ｍl中のスタウロスポリン１.０ｍｇ（２.１５マイクロモル）の溶液を、酢酸エチル１.００ｍl中のフェニルイソチオシアネート１０μlのストック溶液２６μlで処理した。このアリコートは、フェニルイソチオシアネート２９０μｇ（２.１５マイクロモル）を含有していた。該反応混合物を２５℃に一晩維持し、次いでヘキサデ２.０ｍlを添加した。得られた結晶性生成物を濾別し、ヘキサデで洗浄し、アルゴンガス気流で乾燥した。
調製例Ｃ
Ｎ−エチルカルバミルスタウロスポリン（ＥＣＳ）
酢酸エチル９００μl中のスタウロスポリン０.９ｍｇ（１.９３マイクロモル）の溶液を、１.９３マイクロモルのエチルイソシアネート（乾燥した酢酸エチル２.００ｍl中のエチルイソシアネート９.０５ｍｇのストック溶液３０.２μl）で処理した。該反応混合物を２５℃に一晩維持し、ヘキサデ２.０ｍlを添加した。結晶性生成物を分離し、乾燥した。
実施例３
化合物ＩＩ−４
化合物Ａ（９６２ｍｇ,２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン３０ｍlおよびメタノール１０ｍlの混合液に溶解し、次いで、氷冷下に、ホウ水素化ナトリウム７６０ｍｇ（２０ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて同温度にて４時間、さらに室温にて１２時間撹拌した。それに３Ｎ塩酸を添加した後に、該溶液を塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、続いて該溶媒を蒸発させた。該残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２）によって精製して８８２ｍｇの化合物ＩＩ−４を得た（収率９７％）。
融点：１３０〜１４０℃
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)：δ(ｐｐｍ):２.０３２(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１３.９Ｈz),２.２３１(３Ｈ,ｓ),２.９６７(３Ｈ,ｓ)，３.６０９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.６,１３.４Ｈz),３.９５９(２Ｈ,ｍ),５.０００(２Ｈ,ｓ),５.２６８(１Ｈ,ｔ,Ｊ=５.３Ｈz),７.０６５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.３Ｈz),７.２５４-８.０３８(７Ｈ,ｍ),８.５６５(１Ｈ,ｓ),９.２０６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=７.８Ｈz)
【００６８】
【化２５】
実施例４
化合物ＩＩ−１４
化合物Ｂ（３９３ｍｇ、０.９ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン２５ｍlに溶解し、次いで、氷冷下にて、カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン３０９ｍｇ（１.３５ｍｍｏｌ）、Ｎ−オキシスクシンイミド１５６ｍｇ（１.３５ｍｍｏｌ）、４−メチルモルホリン０.１ｍl（０.９ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド２７９ｍｇ（１.３５ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン３ｍlを添加し、続いて１２時間撹拌した。該反応混合物を濾過し、該溶媒を蒸発させた。その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９９／１）によって精製して４２９ｍｇの化合物Ｃを得た（収率７２％）。
融点：１８８〜１９３℃
ＳＩＭＳ(ｍ/ｚ)：６６０(Ｍ＋１)＋
【００７０】
化合物Ｃ（３９９ｍｇ）を、ジメチルホルムアミド１０ｍlに溶解し、次いで、炭素上の１０％パラジウム３００ｍｇを添加し、続いて水素気流下５０℃にて７時間撹拌した。該反応混合物をセライトを通して濾過し、該溶媒を蒸発させた。その残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／２８％水酸化アンモニウム＝９０／１０／１）によって精製し、得られた生成物をテトラヒドロフラン５ｍlに溶解し、続いて１.７Ｎ塩酸／酢酸エチル５ｍlおよびジエチルエーテル１０ｍlを添加した。濾過によって該溶液から沈殿物を分離して、２３４ｍｇの化合物ＩＩ−１４を得た（収率６９％）。
融点：＞３００℃
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６＋Ｄ２Ｏ)δ(ｐｐｍ):１.９２-２.２８(１Ｈ,ｍ),２.２０(３Ｈ,ｓ),２.８４-３.１２(７Ｈ,ｍ),３.４０-４.２０(５Ｈ,ｍ),５.０４(２Ｈ,ｓ),６.９８(１Ｈ,ｍ),７.２４-８.２０(７Ｈ,ｍ),８.７６(１Ｈ,ｂｒｓ),９.２２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=８Ｈz)
ＳＩＭＳ(ｍ/ｚ):５２７(Ｍ＋２)＋
【００７１】
【化２６】
実施例５
ＰＣ−１２細胞は、ラット副腎髄質の腫瘍より生じたクローン化集団であって、ＮＧＦの作用を研究するための極めて有用で広範に研究されたモデルであることが判明している（グロフ(Guroff)、セル・カルチャー・イン・ザ・ニューロサイエンシーズ(Cell Culture in the Neurosciences)、プレナム・パブリッシング・コーポレーション(Plenum Publishing Corporation)、１９８５年、第８章、２４５〜２７２頁）。これらの細胞に対するＮＧＦの特に強い１つの作用は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）活性の急激な刺激、すなわち２００ｎＭのＫ−２５２ａによって遮断されると報告された効果（コイズミ(Koizumi)ら、１９８８年）である。本実施例の実験においては、（ジイ・グロフ博士(Dr.G.Guroff)から入手した）ＰＣ−１２細胞を６×１０４細胞／ｃｍ２の密度にて４８−ウェルプレート中で培養し、薬物ビヒクル（０.５％ＤＭＳＯ）、スタウロスポリン、またはＨＢＣＳと共にインキュベートした。Ｋ−２５２ａおよびスタウロスポリンは、カミヤ・バイオメディカル(Kamiya Biomedical)社から商業的に入手可能である。薬物添加４時間後に、ヒュッフ(Huff)らにより記載されているごとくに（ヒュッフ(Huff)ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)第８８巻：１８９〜１９８頁、１９８１年）、ＯＤＣアッセイのために該細胞を収穫した。
これら３つの全ての化合物では、ＯＤＣ活性が誘導された（すなわち、上昇した）が、活性および効率において顕著な相違があった（図１）。Ｋ−２５２ａは用量依存的にＯＤＣ活性を誘導し、効果は２ｎＭで認められ、２００ｎＭで最大まで上昇した（３６.３倍誘導）。スタウロスポリンの効果は、同様に２ｎＭで認められたが、２０ｎＭでピークに達し（３４.７倍誘導）、２００ｎＭでは顕著に下降した。ＨＢＣＳも同様に２ｎＭで誘導したが、より高濃度においては効果が上昇しなかった。従って、その最大効率は他の２つの化合物のそれよりもはるかに低かった（６.５倍誘導）。もう１つの実験において、ＰＴＣＳ、ＰＣＳおよびＥＣＳのＰＣ−１２細胞ＯＤＣ活性に対する効果をＫ−２５２ａのそれと比較した。２００ｎＭ濃度において、Ｋ−２５２ａの活性を１００％と表すと、ＰＴＣＳはＫ−２５２ａ活性の７１.４％を示し、一方ＰＣＳおよびＥＣＳは、各々、Ｋ−２５２ａ活性の８８.９％および６１.９％を示した。しかしながら、プロテインキナーゼＣ阻害剤Ｈ−７は、プロテインキナーゼＣ活性を阻害することが知られている濃度（ナカダテ(Nakadate)ら、バイオケミカル・ファーマコロジー(Biochem.Pharmacol.)第３７巻：１５４１〜１５４５頁、１９８８年）である３０μＭではＯＤＣ活性を誘導しなかった。
【００７３】
前記した濃度の該化合物の存在または不存在下に、１０ｎｇ／ｍl細胞培地のＮＧＦを添加し、続いて前記したごとく該細胞のＯＤＣアッセイを行うことにより、Ｋ−２５２ａ、スタウロスポリンおよびＨＢＣＳのＮＧＦ生物活性を強化および／または阻害する能力を評価した（図２）。ＮＧＦのこの濃度は、当該化合物の強化または阻害効果が検出できるように中程度の誘導を供するために選択した。２００ｎＭにおいてＫ−２５２ａは、コイズミ(Koizumi)らにより１９８８年に報告されているごとく、ＯＤＣのＮＧＦ誘導を阻害したが、驚くべきことには、さらに低濃度（２ｎＭおよび２０ｎＭ）においては該誘導を強化した。２ｎＭにおいてのスタウロスポリンもまた、ＮＧＦによる該誘導を強化したが、この効果はさらに高濃度（２０ｎＭおよび２００ｎＭ）においては失われた。対照的に、ＨＢＣＳは、試験した全ての濃度でＮＧＦの該効果を強化した。この顕著な効果を、ＨＢＣＳ単独の適度なＯＤＣ−誘導効果に比して、図３に示す。
【００７４】
実施例６
（以下に記載するごとき）標準的な方法によりラット胎児から調製した解離脊髄培養にて、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣhＡＴ）活性に対するＫ−２５２ａの効果を検定した。ＣhＡＴは、神経伝達物質であるアセチルコリンの合成を触媒する酵素であって、コリン作動性ニューロンに特異的な生化学マーカーでもある。脊髄においては、大部分のコリン作動性ニューロンは運動ニューロンである。かくして、この酵素のアッセイを、コリン作動性ニューロンの生存性および／またはこの酵素の調節に対する因子（または因子群）の効果の指標として用いることができる。
細胞が基体に付着し得るよう平板培養してから２〜３時間インキュベートした後に、示した濃度にてＫ−２５２ａを培養に添加した。ＣhＡＴ活性は培養中で４８時間後に測定した。その結果脊髄培養中のＫ−２５２ａは、用量依存的にＣhＡＴ活性を上昇させ、２００〜３００ｎＭにて最大効率に達した（２−ないし３−倍上昇）（図４）。さらに高濃度では、ＣhＡＴ活性が低下する結果となった（図４）。７日間までにわたるさらに長期の培養インキュベート期間では、ＣhＡＴ活性の基底野レベルが下降するため、ＣhＡＴ活性は４−ないし５−倍上昇した（図５）。この培養系においては、基本（対照）条件では経時的に変性および死滅する運動ニューロン数が増加した（マクマナマン(McManaman)ら、デベロップメンタル・バイオロジー(Developmental Biol.)第１２５巻:３１１〜３２０頁、１９８８年）。図４および図５双方に示す結果は、培養開始日にＫ−２５２ａを単独で適用した結果であり、脊髄コリン作動性ニューロンの生存性および／または該酵素自体の調節に対する効果が持続したことを示している。
【００７５】
方法:ラット胎児脊髄細胞の解離培養での実験は、記載されているごとく一般的に行った（スミス(Smith)ら、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J.Cell Biol.)第１０１巻:１６０８〜１６２１頁、１９８５年）。組織のトリプシン解離を用いた当業者に公知の標準的技術により、１４日胚齢のラットから摘出した脊髄から解離細胞を調製した（スミス(Smith)ら、１９８５年）。細胞を、無血清Ｎ２培地中のポリ−１−オルニチンで被覆したプラスチック組織培養ウェルに６×１０５細胞／ｃｍ２にて撒き（平板培養し）、５％ＣＯ２／９５％空気の湿度調整下３７℃にて（ボッテンシュタイン(Bottenstein)およびサト(Sato)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・イン・ユー・エス・エイ(PNAS USA)第７６巻：５１４〜５１７頁、１９７９年）、４８時間インキュベートした。イシダ(Ishida)およびデグチ(Deguchi)（ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(J.Neurosci.)第３巻：１８１８〜１８２３頁、１９８３年）、ならびにマクマナマン(McManaman)ら（前掲、（１９８８年））に準じて、フォナム(Fonnum)の方法（ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー(J.Neurochem.)第２４巻:４０７〜４０９頁、１９７５年）の変法を用いてＣhＡＴ活性を測定した。活性は、ビシンコニン酸(bicinchonicic acid)／Ｃｕ＋＋反応（ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬(BCA protein assay reagent)、イリノイ州、ロックランド、ピース(Pierce,Rockland,Il)）により測定した全タンパク質に対して補正した。
【００７６】
実施例７
Ｋ−２５２ａの１００種を超える機能性誘導体を脊髄ＣhＡＴアッセイで試験しそれらの相対効率を測定した。図８に示すデータは、３００および３０ｎＭで試験したオリジナルの機能性誘導体のうち２８種が３００ｎＭにてＣhＡＴ活性を有意に上昇させたことを示している。１つの機能性誘導体、化合物ＩＩ−２１も３０ｎＭにて活性を有していた（基底野レベルに対して３０％のＣhＡＴ活性の上昇）。この化合物は、３０ｎＭにてＣhＡＴ活性をかなり上昇させるものがＫ−２５２ａまたは残りのアナログのうちにないため、これらよりさらに強力であった。
図１３は、ラット脊髄培養において、有意にＣhＡＴ活性を上昇させるオリジナルの２８種のＫ−２５２ａ誘導体、ならびに３０種のさらなる誘導体（化合物ＩＩ−２９ないしＩＩ−３４、ＩＩ−３６ないしＩＩ−５６、およびＩＶ−１ないしＩＶ−３の全て）の効果を示す。
【００７７】
実施例８
Ｋ−２５２ａならびに５０種の機能性誘導体を後根神経節細胞の生存性を促進するそれらの能力につき評価した。細胞生存性は、生育可能な染料のアナログであってフルオレセイン二酢酸であるカルセインＡＭ(calcein AM)の取込みにより測定した。カルセインは、生存細胞により取り込まれ、細胞内で、生存細胞の無傷の膜により保持される蛍光性の塩に分解される。生存ニューロンの顕微鏡計数は、フルオロメーター生存率アッセイで得た相対的蛍光値に直接相関する。かくして、この方法は、所与の培養の全細胞集団中の生存細胞の、信頼性がありかつ定量的な測定を提供した。
後根神経節ニューロン生存性は、濃度依存的にＫ−２５２ａにより促進された;約１００ｎＭで最大活性が観察された（図６）。試験した５０種のアナログのうち２４種は、ＤＲＧニューロン生存性を促進するのに活性であり、そのうち２２種について図７に示す。これら全てのアナログは、脊髄ＣhＡＴ活性を上昇させるのにおいても活性であった（実施例５、図８参照）。オリジナルの２２種ならびに２種のさらなる活性なアナログ（ＩＩ−３０、ＩＩ−３２）を図１４に示す。２４種の活性な機能性誘導体で刺激された後根神経節ニューロンの顕微鏡観察は、神経繊維の成長も同様に促進されることを示した。
【００７８】
方法：後根神経節を８日胚齢のニワトリの胚から摘出し、続いてのディスパーゼ(Dispase)（中性プロテアーゼ、コラボレイティブ・リサーチ(Collaborative Research)社）解離により解離細胞を調製した。ニューロンを、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで被覆した９６ウェルプレートに低密度（１.８×１０４細胞／ｃｍ２）にて撒いた。細胞は、５％ＣＯ２／９５％空気、湿度調整下３７℃にて、無血清Ｎ２培地中で４８時間培養した（ボッテンシュタイン(Bottenstein)およびサト(Sato)、１９７９年）。細胞生存性は、前記した生存フルオロメーターアッセイを用いて、４８時間にて計測した。
【００７９】
実施例９
興奮性アミノ酸であるカイニン酸（カイニン酸塩）の齧歯動物の脳の空洞への直接的な浸出は、海馬の錐体細胞のニューロン変性を起こす。このニューロンの死滅は、細胞骨格タンパク質であるスペクトリンのタンパク質加水分解の著しい上昇により特徴付けられる。スペクトリン分解生成物は、カイニン酸塩投与後２４時間以内に海馬ホモジネート中で測定できる。スペクトリンのタンパク質加水分解の程度は、海馬の錐体細胞のニューロンの死滅の程度と高い相関があり（シーマン(Siman)ら、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス(J.Neurosci.)第９巻：１５７９〜１５９０頁、１９８９年）、従って、スペクトリンのタンパク質加水分解は、興奮性アミノ酸−誘導性のニューロン変性の優れた生化学マーカーである。内因性興奮性アミノ酸の過剰な放出は、脳卒中および他の虚血性障害;アルツハイマー病;筋萎縮性硬化症を含む運動神経疾患；パーキンソン病；ハンチントン舞踏病；ＡＩＤＳ痴呆；癲癇；ならびに脳または脊髄の振盪および穿通損傷を含めた多くの神経疾患および不全の病因と関連があるとされてきた。
【００８０】
図９は、海馬におけるカイニン酸塩−誘導性ニューロン変性に対するＫ−２５２ａの効果を示している。カニューレ処理を施したオスおよびメスのスプラーグ−ドーリーラット(Sprague-Dawley rat)に、脳の大脳外側空洞（icv）に直接カイニン酸塩（０.６μｇ）を注射する３０分前ならびに約３および２４時間後に、０.４μｇのＫ−２５２ａまたはビヒクルを摂取させた。以下に記載するごとき組織学的分析のため、２週間後に該脳を摘出し、凍結し、切断して染色した。示したデータは各群につき損傷された海馬の亜領域の平均数±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である。Ｋ−２５２ａは、海馬内の損傷領域数を３.８６±０.７８（Ｋ−２５２ａ不存在）から１.１８±０.４（Ｋ−２５２ａ存在）に顕著に減じた。
【００８１】
図１０は、海馬における、カイニン酸塩−誘導性のスペクトリン分解に対するＫ−２５２ａの効果を示す。メスのスプラーグ−ドーリーラットに、icv注入によって、神経毒性用量のカイニン酸塩（０.６μｇ）と共に、０.４μｇのＫ−２５２ａまたはビヒクルを摂取させた。偽対照動物には、ビヒクルの注入を摂取させたがカイニン酸塩またはＫ−２５２ａを摂取させなかった。２４時間後に、後根海馬ホモジネートを、以下に記載するごとくにスペクトリン分解生成物につき分析した。スペクトリンのタンパク質分解の程度は、偽対照値に対する各群のスペクトリン分解生成物の％増加として表す。データは、各群のスペクトリン分解生成物の平均％増加（偽対照＝１００％）±Ｓ.Ｅ.Ｍ.値を示す。Ｋ−２５２ａのｉｃｖ注入は、スペクトリンタンパク質分解の程度を、偽対照値の約１４０±１５％（Ｋ−２５２ａ不存在）から約１０２±１０％（Ｋ−２５２ａ存在）に顕著に減じた。
【００８２】
実施例１０
図１１は、海馬における、カイニン酸塩−誘導性ニューロン変性に対するＨＢＣＳの効果を示す。カニューレ処理を施したメスのスプラーグ−ドーリーラットに、icv注入によって、カイニン酸塩（０.６μｇ）を摂取させる４０分前および約４時間後に、０.８μｇのＨＢＣＳまたはビヒクルを摂取させた。後記するごとく、組織学的な分析のため、２週間後に該脳を摘出し、凍結し、解離させて染色した。示したデータは各群につき損傷された海馬の亜領域の平均数±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である。ＨＢＣＳは、海馬内の損傷領域数を２.５±０.６（ＨＢＣＳ処理せず）から１.３±０.５（ＨＢＣＳ処理した）に顕著に減じた。
【００８３】
実施例１１
図１２は、海馬における、３種のＫ−２５２ａ機能性誘導体のカイニン酸塩−誘導性スペクトリン分解に対する効果を比較する。メスのスプラーグ−ドーリーラットに、icv注入によって、神経毒性用量のカイニン酸塩（０.６μｇ）と共に、０.４μｇのＫ−２５２ａまたは化合物ＩＩＩ−１もしくはＩＩ−２１またはビヒクルを摂取させた。偽対照動物には、ビヒクルの注入を摂取させたがカイニン酸塩またはＫ−２５２ａ誘導体は摂取させなかった。２４時間後に、後根海馬ホモジネートを、後記するごとく、スペクトリン分解生成物につき分析した。スペクトリンのタンパク質分解の程度は、偽対照値に対する各群についてのスペクトリン分解生成物の％増加として表す。示したデータは、各群につきスペクトリン分解生成物の平均％増加（偽対照＝１００％）±Ｓ.Ｅ.Ｍ.を示す。Ｋ−２５２ａのｉｃｖ注入は、スペクトリンのタンパク質分解の程度を、偽対照値の約１２８±９％（ビヒクル処理）から約１０４±４％（Ｋ−２５２ａ存在）に減じた。Ｋ−２５２ａ誘導体、ＩＩＩ−１およびＩＩ−２１は、カイニン酸塩−誘導性スペクトリンタンパク質分解を阻害できなかった。
【００８４】
図９〜１２の方法
カイニン酸塩注入様式：
Ｋ−２５２ａまたはその誘導体のカイニン酸塩−誘導性ニューロン損傷に対する効果を以下のごとくに評価した：成体のオスまたはメスのスプラーグ−ドーリーラット（１７５〜２５０ｇ）をネンブタール(Nembutal)（５０ｍｇ／ｋｇ,ｉｐ）で麻酔し、個々の場合について、示した用量および注入スケジュールを用いたicv注入によって、カイニン酸塩処理（５μl）の前または後に、合計５μlにて、薬剤を投与するか、あるいはビヒクルで処理した。対照動物には、カイニン酸塩および薬剤注入の代わりに担体を投与した。解剖学的な研究のため、icv注入は、薬剤注入の約１週間前に埋め込み、定位置：ブレグマの前−後で、ブレグマの１.５ｍｍ外側であって頭骸頂点から４.４ｍｍ腹側、に設置したカニューレ（プラスチック・ワン(Plastic One)、バージニア州、ローンオーク(Roanoke，VA)）を介してデリバリーした。この処理様式の結果は、以下に記載する解剖学的分析を用いて２週間後に評価した。
【００８５】
Ｋ−２５２ａまたはその誘導体のカイニン酸塩−誘導性スペクトリンタンパク質加水分解への効果を評価する実験において、麻酔したラットには、前記した定位置に設置した１０μlハミルトン(Hamilton)シリンジを介して、カイニン酸塩と同時に５μlの薬物またはビヒクルのicv注入を摂取させた。２４時間後にこれらのラットを殺し、以下に記載するごとく生化学的分析に付した。
【００８６】
解剖学的および生化学的分析
解剖学的分析は、以下のごとくに行った。処理２週間後に断頭によりラットを殺し、脳を迅速に摘出し、ドライアイスで凍結した。各脳からの一連のスライドに載せた冠状切片をチオニンで染色し、顕微鏡観察した。海馬への損傷は、錐体細胞の喪失を被っている該脳の左および右側の双方につき、海馬の４種の解剖学的定義領域（出典明示して本明細書の一部とみなす、シェパード(Shepard)、１９７９年、「ザ・シナプチック・オーガニゼーション・オブ・ザ・ブレイン(The Synaptic Organization of the Brain)」オックスフォード(Oxford)、３１０頁に記載されているロレンテ番号(Lorente de No)の分類に従ったＣＡ１−４）の全数を合計することにより定量化した。
生化学的分析は、以下のごとくに行った。脳スペクトリン（フォドリン）のカルペイン(Calpain)Ｉ−感受性のタンパク質加水分解は、シーマンらにより記載されているイムノブロット分析（１９８８年、ニューロン(Neuron)、第１巻:２７９〜２８７、出典明示して本明細書の一部とみなす）を用いて海馬のホモジネートにて評価した。簡単に述べると、処理２４時間後に断頭によりラットを殺し、後根海馬を迅速に脳から摘出し、０.１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する２０ｍＭＴris−ＨＣl（ｐＨ７.４）中でホモジナイズした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって各ホモジネートのアリコートからタンパク質を分離し、イムノブロット分析を用いて各試料中のカイニン酸塩−誘導性スペクトリン分解の量を定量した。
【００８７】
実施例１２
Ｋ−２５２ａを、線条体培養中における生存性を促進するその能力につき評価した。線条体は１７日胚齢のラット胚から切除し、細胞はディスパーゼ（中性プロテアーゼ、コラボラティブ・リサーチ(Collaborative Research)社）によって解離させた。ニューロンを、ウェルを予めポリ−１−オルニチンおよびラミリンで被覆した９６ウェルプレートに５×１０４／ウェル（１.５×１０５／ｃｍ２）にて撒いた。細胞は、５％ＣＯ２／９５％空気、湿度調整下３７℃にて、０.０５％ウシ血清アルブミンを含有する無血清Ｎ２培地中で培養した（ボッテンシュタイン(Bottenstein)およびサト(Sato)、１９７９年）。細胞生存性は、それを撒いて５日後に、実施例８に記載したカルセイン生存フルオロメトリーアッセイを用いて評価した。
線条体ニューロンの生存性は、Ｋ−２５２ａによって濃度依存的に上昇した。最大活性は７５ｎＭのＫ−２５２ａで認められ、対照に対して３〜４倍の効率が得られた（図１５）。対照培養においては、０日目にプレートしたニューロンの９０％が５日以内に死滅したが、一方、Ｋ−２５２ａで処理した培養においては該ニューロンの５０％が生存していた（図１６）。線条体ニューロンにおける生存性効果は培養３日後に起こり、少なくとも培養７日間維持された。培養開始日のＫ−２５２ａの単独適用から、これらの結果は、ある種のニューロン集団に対して生存性効果が維持されることを示す。
図１７は、対照培養または７５ｎＭのＫ−２５２ａで処理した培養から撮影した一対の光学顕微鏡写真である。７５ｎＭのＫ−２５２ａが存在するこれらの培養において、細胞生存性およびニューロン成長が高められていた。
【００８８】
実施例１３
実施例１０の線条体細胞生存アッセイにおけるＫ−２５２ａの３１種の機能性誘導体の強化性および効率を測定するため、該誘導体を試験した。図１８は、線条体ニューロンの生存性を促進する１８種のＫ−２５２ａ誘導体のデータを示している。
【００８９】
化合物（Ｖ）の製造プロセス
化合物（Ｖ）の製造プロセスを以下に記載する。
プロセス１
化合物（Ｖ−１）［Ｒ１がＣＨ２ＳＯ２Ｒ７であって、ＸがＣＯ２Ｒ５である化合物（Ｖ）］は以下の反応工程：
【００９０】
【化２７】
（Ｒ５は低級アルキルまたはＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｒ６を表し、ここにＲ６は低級アルキルまたはアリールを表し；Ｒ７は低級アルキルを表す）
により製造できる。
該出発化合物（Ａ）は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）特開昭６３−２９５５８８号に開示されている。
化合物（Ｖ−１）は、化合物（Ａ）を１〜１.５当量の酸化剤で処理することによって得ることができる。該酸化剤の例は、ｍ−クロロ過安息香酸である。反応溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルムまたは二塩化エチレン等のごときハロゲン化炭化水素を用いる。該反応は−２０〜３０℃にて０.５〜１時間で完了する。プロセス２
化合物（Ｖ−２）［Ｒ１が水素であって、ＸがＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｒ６である化合物（Ｖ）］は、以下の反応工程：
【００９２】
【化２８】
［Ｒ６は低級アルキルまたはアリールを表す］
によって製造できる。
出発化合物（Ｂ）は、（出典明示して本明細書の一部とみなす）特開昭６２−１５５２８５号に開示されている。
化合物（Ｖ−２）は、１〜３当量の塩基の存在下で化合物（Ｂ）と１〜３当量のＣｌＣＯ２Ｒ６とを反応させることにより得ることができる。該塩基の例はトリエチルアミンである。反応溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルムまたは二塩化エチレンのごときハロゲン化炭化水素等を用いる。該反応は−１０〜３０℃にて０.５〜３時間で完了する。
【００９４】
実施例１４
化合物ＩＩ−４９
化合物（Ａ−１；Ｒ５＝ＣＨ３であってＲ７＝Ｃ２Ｈ５）（２７ｍｇ、０.０５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム１ｍlに溶解し、次いで、氷冷下、ｍ−クロロ過安息香酸１０ｍｇ（０.０６ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて同温度にて４５分間撹拌した。クロロホルムで希釈した後に、該混合物を、８％チオ硫酸ナトリウム水溶液、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水、および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９５／５）に付して１７.７ｍｇの化合物ＩＩ−４９を得た（収率６２％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.２９８(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.５Ｈｚ),２.０３７(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１４.１Ｈｚ),２.１５３(３Ｈ,ｓ),３.０９６(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.５Ｈｚ),３.２６６(２Ｈ,ｓ),３.９２９(３Ｈ,ｓ),４.９８５(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.０Ｈｚ),５.０４３(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.０Ｈｚ),６.３４８(１Ｈ,ｓ),７.１４７(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.１Ｈz),７.３４５-８.０７０(６Ｈ,ｍ),８.６１２(１Ｈ,ｓ),９.２３２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.５Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):５７４(Ｍ＋１)＋
【００９５】
実施例１５
化合物ＩＩ−５７
化合物（Ｂ）（４３.８ｍｇ、０.１ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン１ｍlに溶解し、次いで、クロロギ酸メチル９.３μl（０.１２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン２８μl（０.２ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、氷冷下、５０分間撹拌した。テトラヒドロフランで希釈した後、混合物を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９９／１）に付して３２.６ｍｇの化合物ＩＩ−５７を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):２.０９９(３Ｈ,ｓ),２.６７９(１Ｈ,ｍ),３.２０４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=６.７,１３.８Ｈz),３.８３７(３Ｈ,ｓ),４.４４６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.３Ｈz),４.６３４(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.６Ｈz),５.４９７(１Ｈ,ｂｒｓ),６.５９１(１Ｈ,ｂｒｓ),７.０１０-８.０３７(７Ｈ,ｍ),８.５９２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=６.６Ｈｚ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):４９７(Ｍ＋１)＋
【００９６】
実施例１６
化合物ＩＩ−３８
化合物（Ｂ）４３.８ｍｇ（０.１ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸フェニル１５μlを用いて実施例１５と実質的に同じ方法を繰り返して、２７.８ｍｇの化合物ＩＩ−３８を得た（収率５０％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):２.１１１(３Ｈ,ｓ),２.８９０(１Ｈ,ｂｒｄ,Ｊ=１３.７Ｈz),３.２６２(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１３.９Ｈz),３.７４２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１３.４Ｈz),３.９６７(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１２.９Ｈz),４.５８２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.３Ｈz),５.３４２(１Ｈ,ｂｒｓ),５.９０６(１Ｈ,ｂｒｓ),６.５５０(１Ｈ,ｂｒｓ),７.００５-８.０４２(１２Ｈ,ｍ),８.５９６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=７.６Ｈｚ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):５５９(Ｍ＋１)＋
【００９７】
実施例１７
（化合物Ｃからの化合物Ｈの合成を図１９に示す）
化合物ＩＩ−３９
化合物（Ｃ）（特開昭６３−２９５５８８号公報;出典明示して本明細書の一部とみなす）（２０ｍｇ、０.０３５ｍｍｏｌ）を、クロロホルム１ｍlに溶解し、次いで、トリエチルアミン１４.６μl（０.１０５ｍｍｏｌ）およびエチルイソシアネート１３.９μl（０.１７５ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、室温にて２時間撹拌した。該溶液にメタノール１ｍlを添加し、続いて、クロロホルムで希釈した。混合物を、水および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２）に付して２１ｍｇの化合物（Ｄ）を得た（収率８４％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.１９５(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.２Ｈz),１.２２２(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.２Ｈz),１.６６４(３Ｈ,ｓ),２.１９４(３Ｈ,ｓ),２.５５５(３Ｈ,ｓ),３.３４６(４Ｈ,ｑ,Ｊ=７.２Ｈz),３.８２０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.６Ｈz),３.９３８(３Ｈ,ｓ),５.０３６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.７Ｈz),５.１２５(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.２Ｈz),６.７４５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,７.４Ｈz),７.２６０-７.８９８(５Ｈ,ｍ),８.６９０(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.９Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):７２４(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｄ）（９ｍｇ、０.０１２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン０.２ｍlおよびメタノール０.２ｍlの混合液に溶解し、次いで、２８％ナトリウムメトキシド／メタノール２μlをそれに添加し、続いて、室温にて１０分間撹拌した。溶液に５％クエン酸水溶液０.１ｍlを添加し、続いて、クロロホルムで希釈した。混合物を水および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９／１）に付して、８ｍｇの化合物ＩＩ−３９を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.０８６(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.１Ｈz),１.０９９(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.１Ｈz),１.９４８(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,１４.１Ｈz),２.１０７(３Ｈ,ｓ),３.１５８(４Ｈ,ｍ),３.９１０(３Ｈ,ｓ),４.８８０(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.７Ｈz),４.９３１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.９Ｈz),７.０２８(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,７.１Ｈz),７.３３２-８.２８７(５Ｈ,ｍ),８.８３８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.１Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６４０(Ｍ＋１)＋
【００９８】
実施例１８
化合物ＩＩ−５１およびＩＩ−５６
化合物（Ｅ）（特開昭６３−２９５５８８号;前掲）（６０.７ｍｇ、０.１ｍｍｏｌ）を、クロロホルム５ｍlおよびメタノール１ｍlの混合液に溶解し、次いで、氷冷下、ホウ水素化ナトリウム１１ｍｇ（０.３ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、同温度にて１５分間撹拌した。クロロホルムで希釈した後に、混合物を水および食塩水で順次洗浄し、炭酸カリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／トリエチルアミン=９８／２／０.５）に付して、３６ｍｇの化合物（Ｆ）を得た（収率５９％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.６５０(３Ｈ,ｓ),２.０２７(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１４.５Ｈｚ),２.１２６(３Ｈ,ｓ),３.８４３(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.４,１４.５Ｈz),３.８９１(３Ｈ,ｓ),４.６０７(２Ｈ,ｓ),４.６７３(２Ｈ,ｓ),５.１２５(２Ｈ,ｓ),７.０９９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,７.３Ｈz),７.４３７-７.９０７(５Ｈ,ｍ),８.８１２(１Ｈ,ｄ,Ｊ=０.８Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６１２(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｆ）（１５９ｍｇ、０.２６ｍｍｏｌ）をクロロホルム１５ｍlに溶解し、次いで、エタンチオール０.８ｍl（１０.４ｍｍｏｌ）およびショウノウスルホン酸２４ｍｇ（０.１０４ｍｇ）をそれに添加し、続いて、室温にて１２時間撹拌した。溶液を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、水、および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／トルエン＝１／９−クロロホルム／メタノール＝９９／１）に付して４３ｍｇの化合物（Ｇ）および７５ｍｇの化合物（Ｈ）を得た。
化合物（Ｇ）
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.２９２(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.２９７(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.７９９(３Ｈ,ｓ),２.１４１(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１４.５Ｈz),２.２５６(３Ｈ,ｓ),２.５３２(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.５５３(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.８６９(３Ｈ,ｓ),３.９７１(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.５Ｈz),３.９９２(２Ｈ,ｓ),４.００５(３Ｈ,ｓ),４.０２１(２Ｈ,ｓ),５.４１６(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=１７.５Ｈz),５.４５９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.４Ｈz),６.９８９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.１,７.４Ｈz),７.５０９-７.９６３(５Ｈ,ｍ),９.１３４(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.２Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):７００(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｈ）
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.２９４(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.７９９(３Ｈ,ｓ),２.１４９(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,１４.６Ｈz),２.２７３(３Ｈ,ｓ),２.５３３(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.８１３(３Ｈ,ｓ),３.９７２(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.４,１４.６Ｈz),４.００８(３Ｈ,ｓ),４.０１５(２Ｈ,ｓ),４.９５１(２Ｈ,ｓ),５.３７７(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.４Ｈz),５.４１８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１７.４Ｈz),６.９７３(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=５.０,７.５Ｈz),７.４８１-８.０３７(５Ｈ,ｍ),９.０９３(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１.２Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６５６(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｇ）３４ｍｇを用いて、実施例１７と実質的に同じ方法を繰り返して、１８.７ｍｇの化合物ＩＩ−５１を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.３００(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),１.３２５(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),２.１８５(３Ｈ,ｓ),２.５１４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,１４.５Ｈz),２.５４０(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),２.５５５(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),３.３８４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.５Ｈz),３.９４１(２Ｈ,ｓ),３.９７６(２Ｈ,ｓ),４.０９４(３Ｈ,ｓ),４.８３６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.４Ｈz),４.９１０(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.３Ｈz),５.７８１(１Ｈ,ｓ),６.８４５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,７.５Ｈz),７.３７１-７.８４３(５Ｈ,ｍ),８.９９８(１Ｈ,ｓ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６１６(Ｍ＋１)＋
化合物（Ｈ）３０ｍｇを用い、実施例１７と実質的に同じ方法を繰り返して、２０.４ｍｇの化合物ＩＩ−５６を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ(ｐｐｍ):１.２８０(３Ｈ,ｔ,Ｊ=７.４Ｈz),２.１４４(３Ｈ,ｓ),２.３９１(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１４.５Ｈz),２.５１７(２Ｈ,ｑ,Ｊ=７.４Ｈz),３.３２０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.４,１４.５Ｈz),３.８８５(２Ｈ,ｓ),４.０６９(３Ｈ,ｓ),４.５２１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.３Ｈz),４.６３１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１６.７Ｈz),４.８０４(２Ｈ,ｓ),５.７６９(１Ｈ,ｓ),６.８３０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,７.４Ｈz),７.３７５-７.７７１(５Ｈ,ｍ),８.９３４(１Ｈ,ｓ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):５７２(Ｍ＋１)＋
【００９９】
実施例１９
化合物ＩＶ−２
化合物（Ｊ）（特開昭６２−１２０３８８号;出典明示して本明細書の一部とみなす）（５０ｍｇ、０.０９ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸０.５ｍlおよび３Ｎ ＨＣl５０μlの混合液に溶解し、溶液を室温にて２日間撹拌した。濾過により沈殿物を回収し、高速液体クロマトグラフィー（ユニシル(Unisil)５Ｃ１８；メタノール／水＝８／２）に付して８.４ｍｇの化合物（ＩＶ−２）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):４.９４７(２Ｈ,ｓ),７.３００-８.０１０(６Ｈ,ｍ),８.２４９(１Ｈ,ｓ),９.２６６(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.０Ｈz)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):３９０(Ｍ＋１)＋
【０１００】
実施例２０
化合物ＩＩ−４５は、図２０に示した反応段階により製造できる。出発化合物（Ｊ）は、特開昭６２−１２０３８８号（出典明示して本明細書の一部とみなす）に開示されている。
化合物ＩＩ−４５
化合物（Ｊ）（２００ｍｇ）を、ジメチルホルムアミド１ｍlに溶解し、次いで、水酸化ナトリウム２３.５ｍｇの水溶液０.２５ｍlをそれに添加し、続いて、室温にて４時間撹拌した。１Ｎ塩酸を添加して、溶液のｐＨを１〜２に調整し、濾過により沈殿物を収集して１７８ｍｇの化合物（Ｋ）を得た（収率９１％）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.９６５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.８,１４.０Ｈz),２.１８４(３Ｈ,ｓ),３.３６４(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.５,１４.０Ｈz),５.０２９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.１Ｈz),５.０７１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.０Ｈz),７.１３３(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.５Ｈz),７.５９５-８.１８９(５Ｈ,ｍ),８.７３３(１Ｈ,ｓ),９.３９８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.１Ｈz)
化合物（Ｋ）（１６８ｍｇ）を、ピリジン３ｍlに溶解し、次いで、無水酢酸０.４４ｍl（４.７ｍｍｏｌ）をそれに添加し、続いて、室温にて４時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、１Ｎ塩酸４ｍlを残渣に添加し、濾過により沈殿物を収集して１８２ｍｇの化合物（Ｌ）を得た（定量的収率）。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):１.６８４(３Ｈ,ｓ),２.１３５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１４.４Ｈz),２.２５２(３Ｈ,ｓ),３.８６５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=７.６,１４.５Ｈz),５.０６３(２Ｈ,ｓ),７.２５５(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,７.５Ｈz),７.６１２-８.５８２(５Ｈ,ｍ),８.７６０(１Ｈ,ｓ),９.３８９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.１Ｈz)
化合物（Ｌ）（１７２ｍｇ）を、塩化チオニルに懸濁し、続いて、９０℃にて４.５時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、ジエチルエーテルを残渣に添加し、濾過により沈殿物を収集して１８０ｍｇの化合物（Ｍ）を得た。
化合物（Ｍ）（６７ｍｇ、０.１ｍｍｏｌ）を二塩化エチレン２ｍlに溶解し、次いで、氷冷下、テトラヒドロフラン中のアニリン１８０μlをそれに添加し、続いて、同温度にて１時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をテトラヒドロフラン２ｍlおよびメタノール０.５ｍlの混合液に溶解し、次いで、１ＮのＮａＯＨ１ｍlをそれに添加し、続いて室温にて３時間撹拌した。溶液に１Ｎ塩酸（１.２ｍl）を添加して中和し、続いてテトラヒドロフランで希釈した。該混合物を食塩水で洗浄し硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発させた後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２）に付して化合物ＩＩ−４５（単離された化合物Ｎ５６ｍｇから１３ｍｇ）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ(ｐｐｍ):２.１１０(１Ｈ,ｄｄ,Ｊ=４.９,１３.９Ｈz),２.１７５(３Ｈ,ｓ),５.０１９(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.１Ｈz),５.０８８(１Ｈ,ｄ,Ｊ=１８.０Ｈz),６.８８７(１Ｈ,ｓ),７.１１９-８.２０１(１１Ｈ,ｍ),８.７１１(１Ｈ,ｓ),９.３９１(１Ｈ,ｄ,Ｊ=２.２Ｈz),１０.０７１(１Ｈ,ｓ)
ＦＡＢ-ＭＳ(ｍ/ｚ):６８７(Ｍ＋１)＋
他の具体例も、以下の請求の範囲内に包含される。
【０１０１】
【発明の効果】
本発明により提供されたスタウロスポリンの新規なビス−置換誘導体のうち１種の治療量を投与することにより、コリン作動性ニューロン、線条体ニューロン、および感覚ニューロン、例えば、後根神経節ニューロンの機能を高めることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＰＣ−１２細胞における基底オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）活性に対するＫ−２５２ａ、１,６−ヘキサメチレン−ビス−(カルバミルスタウロスポリン)（ＨＢＣＳ）およびスタウロスポリンの効果を示すグラフ。
【図２】 ＰＣ−１２細胞におけるＮＧＦ−刺激性ＯＤＣ活性に対するスタウロスポリン、ＨＢＣＳおよびＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図３】 ＰＣ−１２細胞におけるＯＤＣ活性に対するＨＢＣＳのＮＧＦ−強化効果を示すグラフ。
【図４】 ラット胚脊髄培養におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣhＡＴ）比活性に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図５】 ラット胚脊髄培養におけるＣhＡＴ活性に対するＫ−２５２ａの経時的な効果を示すグラフ。
【図６】 ニワトリ胚後根神経節ニューロンの生存性に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図７】 ニワトリ胚後根神経節ニューロンの生存性に対するＫ−２５２ａ機能性誘導体の効果を示すグラフ。
【図８】 ラット胚脊髄培養におけるＣhＡＴ活性に対するＫ−２５２ａ機能性誘導体の効果を示すグラフ。
【図９】 ラット海馬へのカイニン酸塩(kainate)誘導性の障害に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図１０】 ラット海馬におけるカイニン酸塩誘導性のスペクトリンのタンパク質加水分解に対するＫ−２５２ａの効果を示すグラフ。
【図１１】 該海馬へのカイニン酸塩誘導性の障害に対するＨＢＣＳの効果を示すグラフ。
【図１２】 ラット海馬におけるカイニン酸塩誘導性のスペクトリンのタンパク質加水分解に対するＫ−２５２ａアナログの効果を示すグラフ。
【図１３】 ラット脊髄培養におけるＣhＡＴ活性に対するＫ−２５２ａ誘導体の相対活性を示す表。
【図１４】 ニワトリ後根神経節培養におけるニューロンの生存性に対するＫ−２５２ａ誘導体の相対活性を示す表。
【図１５】 Ｋ−２５２ａの存在下の線条体ニューロンの生存性を示すグラフ。
【図１６】 Ｋ−２５２ａの存在下の線条細胞の生存性を示すグラフ。
【図１７】 Ｋ−２５２ａの存在または不存在下にて培養した線条体ニューロンの光学顕微鏡写真。
【図１８】 ラット線条体培養におけるニューロン生存性に対するＫ−２５２ａ誘導体の相対活性を示す表。
【図１９】 出発化合物Ｃからの化合物Ｈの合成を示す概略図。
【図２０】 出発化合物Ｊからの化合物ＩＩ−４５の合成を示す概略図。
Claims (26)
- 式：
で示される化合物。 - 式：
- 該感覚ニューロンがコリン作動性ニューロン、線条体ニューロン、または後根神経節ニューロンである請求項２記載の機能向上剤。
- 式：
- 該神経細胞変性がアルツハイマー病と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性が運動ニューロン病と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該運動ニューロン病が筋萎縮硬化症である請求項６記載の治療剤。
- 該神経細胞変性がパーキンソン病と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性が脳血管疾患と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該脳血管疾患が虚血症である請求項９記載の治療剤。
- 該神経細胞変性がＡＩＤＳ痴呆と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性が癲癇と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性が脳への振盪損傷と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性が脊髄への振盪損傷と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性が脳への穿通損傷と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性が脊髄への穿通損傷と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該神経細胞変性がハンチントン舞踏病と関連している請求項４記載の治療剤。
- 該化合物と神経栄養因子とを含有する請求項２記載の機能向上剤。
- 該化合物と神経栄養因子とを含有する請求項４記載の治療剤。
- 該神経栄養因子がニューロトロフィンファミリーのメンバーである請求項１８記載の機能向上剤。
- 該ニューロトロフィンファミリーのメンバーが神経成長因子（ＮＧＦ）である請求項２０記載の機能向上剤。
- 式（ＩＩ−４）：
- 式（ＩＩ−１４）：
で示される化合物。 - 式（ＩＩ−４５）：
で示される化合物。 - 該神経栄養因子がニューロトロフィンファミリーのメンバーである請求項１９記載の治療剤。
- 該ニューロトロフィンファミリーのメンバーが神経成長因子（ＮＧＦ）である請求項２５記載の治療剤。
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