JPH06509333A - ニューロトロフィン活性に対する方法およびアッセイ系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ９４、前記神経栄養因子がＢＤＮＦ、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、ニュ ーロトロフィン−３およびニューロトロフィン−４より成る群から選ばれる、請 求項９３記載の細胞系。

９５、前記神経栄養因子がＢＤＮＦである、請求項９３記載の細胞系。

９６、前記レセプターがｔｒｋＢである、請求項９５記載の細胞系。

９７、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号−として寄託 された細胞系Ｍ　Ｂ　ｘ　。

９８、前記第１細胞の型がＭＢｘである、請求項８４記載の方法。

明細書 ニューロトロフィン活性に対する方法およびアッセイ系技術分野 本発明は、神経栄養因子を発現し、かつその生存にオートクリンループメカニズ ムを利用する腫瘍細胞をもつ哺乳動物を治療する医薬組成物および方法に関する 。さらに特定すると、本発明は、脳誘導神経栄養因子（”　ＢＤＮＦ”　）のシ グナル変換経路を阻害し、かつＢＤＮＦ発現細胞の細胞死を引き起こす方法に関 する。

背景技術 Ａ、神経冠由来の腫瘍 神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）の語は、胚性交感神経芽細胞、神 経冠細胞および神経管のマントル層から由来する神経原性新生物の範囲を指すの に使用する。１歳以下の幼児において最も頻繁に診断される新生物である神経芽 細胞腫腫瘍は新生児１０，０００人に１人の頻度で起こる。神経芽細胞腫は子供 では３番目に多い悪性腫瘍と考えられており、すべての小児科新生物の約ｌθ％ 、そして子供におけるすべての癌関連死の少なくとも１５％にのぼる。

生化学的には、神経芽細胞腫はしばしばアドレナリン作動性とコリン作動性神経 伝達経路の両方の要素を含む。これらは、ニューロン特異的エノラーゼおよび神 経フィラメントタンパク質を発現し、培養下で神経突起形成を伴う基質付着細胞 成長を示す。ヒト神経芽細胞腫のおそらく最も顕著な特徴はＮ−ｍｙｃ癌遺伝子 の増幅であり、これは神経芽細胞腫のセルライン２２のうちの１９に同定され、 またステージ■およびステージ■の神経芽細胞腫の患者からの腫瘍組織の約３１ ％に同定された［にｏｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６：１３３ ３　（１９８４）］　。ヒト神経芽細胞腫セルライン５Ｋ−Ｎ−３Ｈおよびその 誘導体５Ｈ−３Ｙ５Ｙは神経上というよりはむしろ胸由来であり、増幅されたＮ −ｍｙｃを発現しないが、Ｎ−ｒａｓを発現する。

別のクラスの腫瘍である小細胞肺癌（ｓａｍａｌｌ　ｃｅｌｌｌｕｎｇ　ｃａｒ ｃｉｎｏｍａ：５ＣＬＣ）は、神経芽細胞腫と共通の発生系をもち、これらはい ずれも明らかに神経上由来の神経前駆細胞から由来する［Ｃａｒｎｅｙ、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４５：２９１３　（１９８５）；　Ｇａｚｄａｒ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４５：２９２４　（１９８５）　］。

小細胞肺癌はすべての肺癌の約３分の１を表す。いくつかの神経芽細胞腫は増幅 されたレベルのＮ−ｍｙｃを発現することが知られているが、５ＣＬＣは一般に Ｎ−ｍｙｃまたはＬ−ｍｙｃのいずれかの活性化されたレベルを特徴とする。小 細胞癌はすべての肺癌の約２０−２５％を表し、米国では毎年約２５，０００〜 ３０．０００件発生し、肺癌の中では群を抜いて最も攻撃的である。５ＣＬＣは しばしば（７０−９０％）転移を呈する。小細胞癌は元来神経細胞胚である。こ れらの腫瘍はアミン前駆体取り込みおよび脱炭酸反応（ＡＰＵＤ）　、ならびに 神経活性ペプチドの産生などのその他の神経の特徴を有している。亜急性知覚神 経病などの刷新生物症候群が、小細胞の患者ではその他の肺癌患者よりも頻繁に 起こる。

Ｂ２ニューロトロフィンおよびそのレセプター神経系の発達および機能は、元来 神経細胞の生存を支持する能力によって同定された神経栄養因子と呼ばれるタン パク質に依存する。ニューロンの生存増強に加えて、これらの因子は神経系内の 増殖および分化過程に影響することができ、また神経系の外でも作用をもつ。ニ ューロン生存分子である神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに最近になってその構 造関連体である脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびニューロトロフィン−３ （ＮＴ−３）について多くのことが明らかとなった。これら３つのタンパク質な らびに最近同定されたニューロトロフィン−４［Ｈａｌｌｂｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｎｅｕｒｏｎ、　６：８４５−５８　（１９９１）］は、”＝ニーｏトロ フィン”と呼ばれる族を構成し、各メンバーはお互いに約５５−６０％のアミノ 酸配列の同一性をもつ。これらの神経栄養因子の生物学的役割を理解するには、 これらがその影響を与えるために用いるレセプターとシグナル変換経路の性質を 明らかにすることが必要である。

タンパク質チロシンキナーゼレセプターのｔｒｋ族はニューロトロフィンの生物 学的に機能的なレセプターであると同定された。

ＢＤＮＦはｔｒｋＢとして知られるｔｒｋ細胞表面レセプターと結合できる神経 生存分子であって、該ｔｒｋＢは固有のプロティンキナーゼ活性を有しており、 主として神経系で発現する［Ｋａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　 ３５０：１５Ｂ　（１９９１）；　Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ。Ｃｅ１１．６５： １８９　（１９９１）；　Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 、　３５０：６７８　（１９９１）］　、　ｔｒｋＢ遺伝子は、ＢＤＮＦおよび ＮＴ−３の両方に結合し、かつ機能的応答を媒介するタンパク質をコードする［ ＰＣＴ国際出願ＷＯ９Ｉｌｏ　３５６８　；　５ｏｐｐｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｃｅ１１．６５：８９５　（１９９１）］。

最近になってｔｒｋレセプターを繊維芽細胞に導入することにより、伝統的な成 長因子の作用を模倣する神経栄養因子への生物学的応答を示す細胞の創成が可能 となった。増殖および生存のためにある種の成長因子（ＦＧＦまたはＰＤＧＦ） を必要とするＮＩＨ３Ｔ３細胞にｔｒｋＢレセプターを導入することにより、外 因性で生理学的に適当なレベルのＢＤＮＦまたはＮＴ−３で生存できる細胞が得 られた。このようなモデルは、ニューロトロフィン活性の検出および／または測 定、ニューロトロフィン様活性を示す薬剤の同定、ならびにニューロトロフィン レセプターへのリガンドの結合をブロックするアンタゴニストの同定に使用でき る強力なアッセイ系を提供する［Ｇｌａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、前出］。

ＮＧＦ−関連神経栄養因子の族によるレセプターチロシンキナーゼの利用は、ニ ューロンによって利用されるシグナル形質導入メカニズムが、マイトジェン因子 に応答して他の細胞型によって利用されるものと基本的に似ていることを示唆す る。この知見は、神経栄養因子が一定の場合にはマイトジェンとして作用できる という最近のデータと一致する［Ｃａｔｔａｎｅｒ　ａｎｄ　ＭｃＫａｙ、　Ｎ ａｔｕｒｅ。

３４７：７６２　（１９９１）；　Ｇｌａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、前出］　、ＢＤＮ ＦおよびＮＴ−３は分裂終了表現型をまだ達成していないニューロン前駆体のた めの生存および／またはマイトジェン因子として作用するの）＞も知れない。

ニューロトロフィンのための生物学的に機能的なレセプターとして同定されたタ ンパク質チロシンキナーゼのｔｒｋ族とともに、ＥＲＫキナーゼが最近、細胞外 シグナル−制御タンパク質キナーゼの族として同定され、かつ分子的にクローン 化された［ｌ１ｏｕｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　６５：６６３−７ ５　（１９９１９］　。ＥＲＫ活性は、細胞の成長因子（すなわち、インシュリ ンおよびＮＧＦ）刺激に応答して急速に活性化され、チロシン上でそれ自体がリ ン酸化される細胞内Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼのクラスを表す［Ｂｏｕｌｔｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、。

前出］。ＥＲＫのチロシンリン酸化はｉｎ　ｖｉｔｒｏでそのキナーゼ活性を非 常に増強することが示された。

細胞の増殖、分化および生存の制御を導く出来事を分子的に理解すると究極的に は、腫瘍、免疫不全や神経変性を含む各種の病気の治療を特異的にねらう医薬を 合理的にデザインできるようになる。最近になって、真核細胞の増殖、分化およ び生存の制御に関与することが知られている重要な遺伝子産物の発現を阻害する 選択的かつ効率的な手段となりうる強力な実験法が現れた。この技術は、これら の重要な細胞性制御タンパク質の翻訳阻止を提供するようにデザインされたアン チセンスのＤＮＡまたはＲＮＡ分子の使用を含む。特定の遺伝子産物のヌル突然 変異体を作製することにより、この技術を用いて、重要な細胞性翻訳時期におけ る単一の遺伝子産物の特定の機能を直接評価できる。

現在、タンパク質合成のアンチセンス−指示による翻訳阻止を達成するためには ２つの主なアプローチがある。第１の方法は、相補的アンチセンスｍＲＮＡ配列 を構成的に合成するようにデザインされた安定にトランスフェクションされたプ ロモーター指示の遺伝子構築物を使用する。この手法は、ある遺伝子産物のタン パク質翻訳をハイブリダイゼーション阻止することになる。このメカニズムでは 、アンチセンスｍＲＮＡとＤＮＡとの間に形成されたＲＮＡ／ＤＮＡ二重体を開 裂することによってＲＮａｓｅが一定の役割を果たしていることが最近示唆され た。別の可能なメカニズムでは、核プロセシングの損傷またはＲＮＡ／ＤＮＡ二 重体が効率よく翻訳できないことを含む。ベクター指示のアンチセンス翻訳阻止 に対する別のアプローチは、短い５′または３゛の合成アンチセンスオリゴデオ キシリボヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ）の合成を含む。アンチセンスＤＮ Ａをｉｎ　ｖｉｔｒＯで真核細胞に加えたときに、これが選択されたＲＮＡの翻 訳を阻止する能力を示すことが最近いくつか報告されている［Ｖａｎ　ｄｅｒ　 Ｋｒｏｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　６：９５８−９７ ３　（１９８８）にまとめられているコ。

目的とする核酸配列の発現を調節するために、選択された細胞性またはウィルス 性の目的とする核酸配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを使用するいくつか のアプローチがなされてきた。

ウィルス複製を阻害するために特定の核酸配列を使用することがいくつか報告さ れている［例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：５５０７−５５１１　（１９８ ８）；　Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ、　８５：１０２８ −１０３２　（１９８８）；　Ｋａｗａｓａｋｉ。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３：４９９１　（１９８５）］。

いくつかの実験室では、比較的膜透過性でかつヌクレアーゼ耐性である修飾オリ ゴヌクレオチドを開発する試みをしてきた。１つのアプローチではノニオン性の オリゴヌクレオチド類似体の開発を含む。このような類似体の例としては、メチ ルホスホネート［Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：２７８７−２７９１　（１９８６）；　Ａ ｇｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５：６２６８−６ ２７５　（１９８６）；　Ｊａｙａｒａｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８：１５３７−１５４１　（ １９８１）］　、ホスホロチオニー　ト［Ａｇａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８３：４１４３−４１４ ６　（１９８８）；　Ｍａｔｓｕｋｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４ニア７０６−７７１０　（１９８７）；　Ｍａ ｒｃｕｓ−３ｅｋｕｒａ　ｅｔａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、 　１５：５７４９−５７６３　（１９８７）コ　；およびホスホラミデート［Ａ ｇａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ。

８３：４１４３−４１４６　（１９８８）　］を含む。

ホスホロチオエートが相補的な目的とする核酸配列に結合することに加えて、Ｈ ＩＶ逆転写酵素へのプライマー結合の阻害を指示すると推測されてきた［Ｍａｔ ｓｕｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ｊｌｓＡ、　８４ニア７０６−７７１０　（２９８７）コ。部分的にチオール 化されたポリシチジル酸を含むポリヌクレオチドを用いる抗鋳型（ａｎｔｉｔｅ ｍｐｌａｔｅ）阻害も報告されている［５ｔｅｊｎ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４８：２６５９−２６６８　（１９８８）にまとめら れているコ。

別のアプローチでは、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み効率を増加する であろう分子とオリゴヌクレオチドとの結合を含む。このような結合体の例とし ては、コレステリル結合オリゴヌクレオチド［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、　ＩＪｓＡ、　８６：６ ５５３−６５５６　（１９８９）　］および］ポリーＬ−リシン結合体Ｌｅｍａ ｉｔｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ、　８４：６４８−６５２　（１９８７）］を含む。別の例では、膜輸送 の効率を増加するために、最終産物に画集性を与える基を結合手を介してオリゴ ヌクレオチドと結合させることを含む［ＰＣＴ出願公開ＷＯ３８１０９８１０， １９８８年１２月１５日公開］。

またさらに別のアプローチでは、反応性オリゴヌクレオチド、すなわち目的核酸 を修飾することのできる反応性薬剤と結合したアンチセンスオリゴヌクレオチド の使用を含む。反応性薬剤のこのような基の１つは、隣接する塩基対の間に挿入 することによって二重らせんと結合するか、または外部ヌクレオチドおよびリン 酸要素とそれぞれ結合することのできる挿入剤である。オリゴヌクレオチドおよ びオリゴヌクレオチド類似体と付着されたインターカレーターの例としては、ア クリジン、アンスリジウムおよび光活性プソラレン［Ｚｏｎ、　Ｐｈａｒｍ、　 Ｒｅｓ、、　５：５３９−５４９　（１９８８）にまとめられているコを含む。

オリゴマーとカップリングした反応性基のうちの別の基には、ＥＤＴＡ−Ｆｅ　 （ｎ）　、ｏ−フェナントロリン−Ｃｕ　（Ｉ）またはポルフィリン−Ｆｅ　（ Ｉｆ）などの金属複合体を含む［Ｋｒｏｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＴｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ、　６：９５８−９７６　（１９８８）にまとめられている］。これ らの化合物は、分子状酸素と還元剤の存在下にヒドロキシルラジカルを生じうる 。生じたラジカルは目的とする核酸骨格を攻撃して、次いで相補鎖を開裂するこ とができる。

最近になってアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害に関する多くの文献が 提出された。例えば、ヒト悪性黒色腫の増殖が、塩基性繊維芽細胞増殖因子に対 するアンチセンスオリゴヌクレオチドによってｉｎ　ｖｊｔｒｏで阻害された［ Ｂｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

ＥＭＢＯＪ、　８：３６８５　（１９８９）コ。エビソーム的に複製する発現ベ クターを介するヒトＮ−ｍｙｃ遺伝子の一部に対してアンチセンスなＲＮＡの創 製は神経外胚葉腫瘍セルラインの分化転換をブロックすることが観察された［Ｗ ｈｉｔｅｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｊｏｌ、、　１１ （３）：１３６０−１３７１　（１９９１）コ。神経細胞の微小管関連タンパク 質タウの遺伝子にアンチセンスなオリゴヌクレオチドを培地に加えると、初期小 脳ニューロンにおける神経突起の極性を阻害した［Ｃａｃｅｒｅｓ　ａｎｄ　Ｋ ｏｓｉｋ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４３：４６１　（１９９０）　］　、）ランス フォーミング増殖因子ベータ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、組 織片培養における胚性心臓内皮細胞の上皮−間葉トランスホーメーションを阻害 した［Ｐｏｔｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、　８８：１５１６−１５２０　（１９９１）　］。

Ｄ、オートクリンルーブ 新生形成におけるオートクリン増殖メカニズムの関与は１９８０年に初めて同定 された［Ｓｐｏｒｍ　ａｎｄ　Ｔｏｄａｒｏ、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　１．　Ｍｅ ｄ。

、　３０８：８７８−８０　（１９８０）　］。各種増殖因子分子や腫瘍セルラ インに対してオートクリンループが観察されている。ある種の腫瘍細胞は、正常 な細胞の増殖と分裂に必要な増殖因子を合成し、これに応答することが知られて いる。オートクリンシグナリングを介して、細胞はそれ自身が産生ずる物質に応 答する。オートクリンルーブは腫瘍細胞においては細胞性応答を加速し、または 増幅する作用をもっているのかも知れない。なぜなら、このような細胞はそれが 存在するための環境依存度がより少ないがらである。

いくつかの場合には、オートクリンルーブを破壊するためにアンチセンスのアプ ローチを使用することによってオートクリンループが実験的に定義されてきた。

言い換えると、細胞増殖に逆効果を与える特定因子に対してアンチセンスである オリゴヌクレオチドの能力は、その細胞が該因子を合成しており、がっ該因子が その細胞の増殖または生存に必要であることを示唆する。このような状況では、 該因子に対する細胞レセプターの存在、または周囲への増殖因子の放出さえもが 検出できない。

トランスシオーミング増殖因子−ベータが、上皮細胞の間葉細胞へのトランスフ ォーメーションを担うオートタリン細胞分化因子として作用することを示すため に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられて来た［Ｐｏｔｔｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８：１ ５１６　（１９９１）コ。ヒト黒色腫［Ｂｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢ ＯＪ、　８：３６８５　（１９８９）］　とトランスフオームされたヒト星細胞 ［ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６ ６：７２Ｂ　（１９９１）　］の両方のオートタリン刺激された分化には塩基性 繊維芽細胞増殖因子が必要であることを示すためにアンチセンスアプローチが使 用されてきた。成長ホルモンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはリンパ 球の増殖を阻害する［Ｗｅｉｇｅｎｔ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ｏｇｙ、　１２８：２０５３　（１９９１）］。

Ｅ、プロティンキナーゼ阻害剤 特定のタンパク質リン酸化阻害剤が、標的細胞上での神経増殖因子の生物学的活 性にとって重要な細胞性タンパク質のリン酸化における多数のキナーゼの効果と その作用を研究するために使用されてきた。

ノカルデイオシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｓｉｓ　ｓｐ、）およびその誘導体の培地 から単離されたキナーゼ阻害剤に２５２ａが米国特許第４．５５５，４０２号、 ４，８７７．７７６号および４．９２３，９８６号に記載されており、これらの 特許は参照として本明細書に包含される。Ｋ２５２ａおよびスタウロスポリンは 最初強力なプロティンキナーゼＣ（ＰＫＣ）として性状決定されていた［Ｋａｓ ｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ ｍ、、　１４２：４３６−４４０　（１９８７）　］が、今ではチロシン−特異 的プロティンキナーゼの阻害を含むもっと広い作用を有することが知られている ［Ｆｕｊｉ＋ａ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　ａｎｄ　Ｋａｔｈｕｒｉａ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、　１５７：９５５−９６ ２　（１９８８）；　Ｏ’Ｂｒ１ａｎ　ａｎｄ　Ｗａｒｄ、１．　Ｎａｔｌ、　 Ｃａｎｃ、Ｉｎ５ｔｉｔ、　８２：１７３４−１７３４　（１９９０）　］　。

ナノモル濃度のに２５２ａおよびその誘導体がｉｎ　ｖｉｔｒｏでプロティンキ ナーゼＣ１サイクリックＡＭＰ−およびサイクリックＧＭＰ−依存性プロチイン キナーゼ、ミオシンＬ鎖キナーゼ、ならびにカルモデユリン−依存性ホスホジェ ステラーゼをやや選択的に阻害することが見いだされた［Ｋａｓｅ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１ ４２：４３６４０（１９８７）；　Ｎａｋａｎｉｓｈｉ、［、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、　２６３：６２１５−１９　（１９８８）；　Ｋａｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ、　３９：１０５９−６０　（１９８６）］　。選択的 キナーゼ阻害のメカニズムは酵素上のアデノシン５°−三リン酸（ＡＴＰ）結合 部位に関する競合に関係すると思われる。

Ｋ２５２ａおよびスタウロスポリンはＰＣＩ２細胞におけるＦＧＦまたはＥＧＦ 応答を減少しないように思われるが、これらはＮＧＦ誘導チロシンリン酸化を含 むＮＧＦによって誘導される検出しうる最も初期のシダナリングプロセスを阻害 することができる。Ｋ２５２ａはまた、胚性後根神経節組織片の一次培養からの ＮＧＦ誘導による神経突起伸長を阻害し、また胚性ヒナ交感神経の一次培養での ＮＧＦの生存活性を完全にブロックすることが示された［Ｍａｔｓｕｄａ　ａｎ ｄ　Ｆｕｋｕｄａ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、、　８７：１１−１７　 （１９８８）；　Ｂｏｒａｓｉｏ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、、　１０ ８：２０７−１２　（１９９０）　］。

チロシンプロティンキナーゼ阻害剤の別のクラスであるチアゾリジンジオンクラ スの阻害剤は、特定の上皮増殖因子（ＥＧＦ）誘導のレセプター自己リン酸化を 示し、またＥＧＦ−依存性細胞を阻害することが示された［Ｇｅ１ｓｓｌｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、、”Ｔｈ１ａｚｏｌｉｄｉｎｅ−Ｄｉｏｎｅｓ″、　１．　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６５：２２２５５−２２２６１　（１９９０）］　、こ れらの阻害剤は増殖因子媒介性の細胞変化を妨害する特定のメカニズムという点 てに２５２ａと類似する。

神経芽細胞腫なとのＢＤＮＦ−発現性腫瘍細胞の増殖を１ｎｖｔｖｏで抑制して 腫瘍の進展を阻害できる方法ならびに医薬組成物に対する需要が当業界に存在す る。特に、ＢＤＮＦ−発現性腫瘍細胞のＢＤＮＦオートタリン生存ループを妨害 する手段がめられている。

発明の概要 本発明は、ＢＤＮＦの発現によって特徴づｊすられるタイプの腫瘍細胞をもつ哺 乳動物の治療方法に関する。特に、本発明はＢＤＮＦ−発現腫瘍細胞におけるオ ートクリン生存ループの同定ならびに細胞死を引き起こすためにオートクリンル ープを妨害する手段に関する。

本発明はまた、生存のためにはオートクリンルーブに依存する腫瘍細胞を含む細 胞のモデル系として使用する組換え細胞に関する。このような組換え細胞は、オ ートクリン生存ループを利用する腫瘍の治療における化合物の治療有効性をスク リーニングする手段を提供する。

本発明の一面においては、ＢＤＮＦおよびｔｒｋＢレセプターの両方を発現し、 したがって生存のためにＢＤＮＦオートクリンループに依存する組換え細胞を用 いて、ＢＤＮＦオートクリンループを妨害し、かつ生存および／または増殖のた めにこのようなオートクリンループに同様に依存する腫瘍細胞を治療するのに使 用できる薬剤を同定する。

一面においては、本発明はＢＤＮＦまたはその一部をコードする遺伝子またはｃ ＤＮＡにアンチセンスな少なくとも６個のヌクレオチドの核酸に関する。ここで 用いる”アンチセンス”とは、一定の配列相補性のためにＢＤＮＦ　ＲＮＡ　（ 好ましくはｍＲＮＡ）の一部とハイブリダイズすることのできる核酸を言う。

ＢＤＮＦオートクリン生存ループを妨害するのに用いる本発明のアンチセンス核 酸は、二本鎖または一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ、若しくはその修飾体または誘 導体であるオリゴヌクレオトチドであることができ、これらは細胞に直接投与す るか、または外因性の導入された配列の転写によって細胞内で産生ずることがで きる。

別の面では、本発明はＢＤＮＦオートクリン生存ループを妨害するためにスタウ ロスポリン、Ｋ２５２ａまたはその誘導体、若しくはその他のプロティンキナー ゼ阻害剤を使用することに関する。

本発明によって提供されるＢＤＮＦアンチセンス核酸およびに２５２ａまたはそ の誘導体は、その腫瘍のタイプがＢＤＮＦを発現していることが示された細胞で ある腫瘍の治療に使用できる。

ある態様においては、本発明は、本発明のアンチセンスＢＤＮＦを含む有効量の 組成物を細胞に与えることからなる、真核細胞におけるＢＤＮＦ核酸配列の発現 を阻害する方法に関する。

本発明の別の態様においては、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａまたはその誘導体 、若しくはその他のプロティンキナーゼ阻害剤を用いて、ＢＤＮＦレセプターの リン酸化を阻害することによって細胞表面レセプターのレベルでＢＤＮＦオート クリンループを妨害する。

別の態様においては、ＢＤＮＦアンチセンス核酸の細胞毒性効果から機能性ＢＤ ＮＦまたはその他のニューロトロフィンレセプターを発現する細胞をニューロト ロフィンが”救う”能力を観察することによって、このような細胞の同定を行う ことができる。

本発明の別の面では、患者から得た細胞中におけるＢＤＮＦ発現を検出すること によるヒト神経芽細胞腫または小細胞肺癌の診断を提供する。

本発明はさらに、医薬的に受容できる担体中に有効量の本発明のＢＤＮＦアンチ センス核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物を投与することか らなる各種疾患および不調の治療方法も提供する。

別の面では、医薬的に受容しうる担体中に活性成分としてに２５２ａ、スタウロ スポリンまたは関連化合物を含む医薬組成物を提供する。この組成物はＢＤＮＦ 発現腫瘍細胞に関連する各種疾患および不調の治療に使用できる。

本発明のさらに別の面は、第１の活性成分としてに２５２ａ、スタウロスポリン または関連化合物を、第２の活性成分として本発明のＢＤＮＦアンチセンス核酸 を含む医薬組成物である。あるいは、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａまたはその 他のプロティンキナーゼ阻害剤を、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞と関連する疾患の治療 または予防に有用ないかなる他の慣用的薬剤とも組み合わせることができる。

本発明のさらに別の面は、上記した物質および組成物の有効量を投与することに よる神経芽細胞腫または小細胞肺癌をもつ患者の治療方法である。

本発明のさらに別の面は、特に低用量のに２５２ａなどのプロティンキナーゼ阻 害剤を投与することによる神経突起伸長の刺激方法である。

本発明のその他の面ならびに利点は以下に記載する本発明の好ましい態様の詳細 な説明によってさらに説明する。

図面の説明 図１は、コムギ胚溶解物のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系におけるアンチセンスオリゴ ヌクレオチドによるＢＤＮＦ合成の阻害を示す。

Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによる有効なｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳のためのＴ７バク テリアプロモーターを含むプラスミド発現構築物ｐＣ８ｈＢ　［ＰＣＴ出願公開 Ｗ０９１１０３５６８．１９９１年３月２１日公開を参照］を用いて、製造者の 指示通りに（Ｐｒ。

ｍｅｇａＳＭａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを１ｎｖｉｔｒｏで合成 した。ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを精製して、次いでＢＤＮＦオリゴヌクレオチドの存 在下または不在下に、コムギ胚溶解物ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ ）中に入れた。

ＢＤＮＦタンパク質の合成に次いで反応に３５８−メチオニンを用いた。対照の オリゴヌクレオチドはヒトＢＤＮＦの配列とは無関係なランダム１Ｂ−ｍａｒを 使用した。

図２は、培養における細胞生存性に及ぼす３’　−ＡＳ−ＢＤＮＦの効果を示す 。培養した神経芽細胞腫細胞に加えた各種濃度の３°−Ａｓ−ＢＤＮＦ　（ｘ軸 、マイクロモル）に対する細胞生存率（ｘ軸）を示す。Ａ　：　ＬＡ−Ｎ−５細 胞、Ｂ　：　ＬＡ−１１−１細胞；　Ｃ：　５Ｋ−ＥＳ細胞；　Ｄ　：　５Ｈ− ８Ｙ５Ｙ細胞。

図３は、神経芽細胞腫セルラインに各種ニューロトロフィンと３°　−Ａｓ−Ｂ ＤＮＦを同時に添加した効果を示す。図に示す神経芽細胞腫セルラインを５０μ Ｍ３°−ＡＳ−ＢＤＮＦと、ニューロトロフィン無添加（中心に点のある白四角 ）　、ＢＤＮＦ　（黒ダイヤ型）、ＮＴ−３（白四角）、またはＮＧＦ　（白ダ イヤ型）とともに同時インキュベーションした。ｘ軸：細胞生存率；ｘ軸：培養 時間。図３Ａ：　５Ｈ−３Ｙ５Ｙ細胞；図３８　：　ＬＡ−Ｎ−１細胞：図３Ｃ ：　ＬＡ−Ｎ−５細胞；図３Ｄ：ＣＨＰ−１３４細胞；図３Ｅ　：　ＣＨＰ−４ ０４細胞。

図４は、小細胞肺癌セルラインまたは成人ラット脳（レーン１）から由来する全 細胞性ＲＮＡ　（レーン当たりｌＯμｇ）のノーザンプロット分析を示す。ノー ザンプロットをヒトＢＤＮＦプローブとハイブリダイズした。小細胞肺癌セルラ インは以下の通りである：Ｈ８２（レーン２）、Ｈ２Ｏ９（レーン３）、Ｈ３４ ５（レーン４）、８３７８（レーン５）、Ｈ５１０（レーン６）およびＮ４１７ （レーン７）。

図５は、ヒトおよび薩歯類腫瘍セルラインにおけるＢＤＮＦ発現のノーザン（Ｒ ＮＡ）プロットの比較を示す。各セルラインからの全ＲＮＡ　（１０μｇ）を分 画し、膜に移し取り、上記したように”Ｐ−ＢＤＮＦとハイブリダイズした［Ｍ ａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：１４４ ６　（１９９９）　］　ＯパネルＢおよびＣに示す神経芽細胞腫セルラインはＬ ＡＮ５．５Ｙ５ＹおよびＮ、１８ＴＧ２を表す。

図６は、ＬＡ−Ｎ−５神経芽細胞腫に及ぼすアンチセンスおよびセンスＢＤＮＦ オリゴマーの形態的効果を示す。未処理（パネルＡ）、１０μＭ３°　−ＡＳ− ＢＤＮＦオリゴマー処理（パネルＢ）、ｌＯμＭ　３’　−３−ＢＤＮＦオリゴ マー処理（パネルＣ）またはｌｏμＭ　３°−ＡＳ−ＢＤＮＦと１１００ｎ／ｍ ｌのヒト組換えＢＤＮＦの両方で処理（パネルＤ）したＬＡ−Ｎ−５神経芽細胞 腫細胞の光学顕微鏡写真であり、パネルＢで示したのと同様の結果が他のアンチ センスＢＤＮＦオリゴマーであるＰＳ−ＡＳ−ＢＤＮＦでも得られた。ＬＡ−Ｎ −５神経芽細胞腫細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン、１ ％ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）および２ｍＭグルタミンを補充したＲＰＭＩ１ ６４０　（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｆｉｃ）中、ｌウェル当たり３Ｘ１０’ 細胞の密度で６ウエルのコスタ−プレートに播種した。播種後１８時間で細胞を 血清不含規定培地［Ｚｈａｎｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 　６：３５４１　（１９８６）］に移し、上記した試薬で７２時間処理した。Ｃ ＨＯ細胞中で遺伝子操作されたＢＤＮＦが産生され、ＣＨＯ細胞ならし培地から 上記した方法で精製した［５ｑｕｉｎｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６５： ８８５　（１９９１）］。

図７は、ＬＡ−Ｎ−５神経芽細胞腫細胞のＤＮＡおよびタンパク質含量の両方を 定量するための二重染色フローサイトメーターアッセイを示す。ＬＡ−Ｎ−５神 経芽細胞腫細胞をプレート当たりｌＸｌ０’細胞の密度でｌｏｃｍのプレートに 播種し、図６で記載したように培養した。細胞を未処理（パネルＡ）または１０ μＭ　３’　−Ａｓ−ＢＤＮＦ単独（パネルＢ）　、３’　−ＡＳ−ＢＤＮＦと ｌｏｏｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ　（パネルＣ）、または高濃度（１００μＭ）の対 照３“−３−ＢＤＮＦ　（パネルＤ）で４８時間処理じた。これらの処理の後、 細胞を回収して、ＰＢＳ−ｖｅｒｓｅｎｅ　（グルコースおよびＥＤＴＡを含む ＰＢＳ）中に再懸濁して単細胞懸濁液を得た。細胞を１Ｈｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（ ＤＮＡ含量用：パネルの左側）と１０μｇ／ｍｌのスルフォルホダミン１０１　 （タンパク質含量用：バネルの右側）の両方で染色し、文献記載の方法［Ｄｅｌ 　Ｂｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１９３：２７（ １９９１）；　Ｔａｋｏｂｉｓｉａｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：３６２８　（１９９１）］でフローサ イトメーターによって分析した。各分析で少なくとも５ＸＩＯ３個の細胞を計数 した。タンパク質側に引かれた線は、パネルＡ−Ｃ（右側）と比較してパネルＤ （右側）で観察された蛍光の減少を示す。Ｂ中の矢印は細胞のアポブトティック （ａｐｏｐ　ｔｏ　ｔ　ｉ　ｃ）集団を示す。細胞周期を示す。８期における細 胞のパーセントは以下の通りである：パネルＡ−２５，５％；パネルＢ−１６． ２％：バネルＣ−３０，１％；パネルＤ−２４，９％。

図８は、ヒト神経芽細胞腫および組換えオートラリン３Ｔ３繊維芽細胞腫に対す るアンチセンス（ＡＳ）およびセンス（Ｓ）　ＢＤＮＦオリゴマーの用量応答致 死曲線を示す。ヒト神経芽細胞腫細胞（ＬＡ−Ｎ−５、パネルＡ　；　５Ｈ−８ Ｙ５Ｙ、パネルＢ）を図６の説明で記載した方法で培養し、一方ＢＤＮＦオート クリン３Ｔ３細胞（パネルＣ）を文献記載の方法［Ｇｌａｓｓ　ｅｔ　ａｔ、、 　Ｃｅ１１６６：４０５　（１９９１）；　Ｚｈａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１ ．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、前出］で増殖因子不足培地中で培養した。すべての 細胞は２４ウエルのコースタ−プレート中にｌウェル当たり２Ｘ１０’細胞の密 度で播いた。各種濃度（０，１，５、ｌ０１５０．１００および２５０ａＭ）の ３’　−ＡＳ−ＢＤＮＦまたは対照３’　−３−ＢＤＮＦオリゴマーを、ヒト組 換えＢＤＮＦ　（１００ｎ　ｇ／ｍ　１）の存在下または不在下に、血清不含Ｅ ＭＥＭ　（パネルＡおよびＢ）または増殖因子不足培地（パネルＣ）を用いて、 ４時間培養物に加えてオリゴヌクレオチドを細胞中に取り込ませた。次いでイン シュリン、トランスフェリンおよびセレン（ＩＴＳ）を即座に培養物に加えて、 ７２時間後に培地中に残っているグルコースの濃度を測定することによって細胞 生存性をアッセイした。黒四角−３’ＡＳ。

白四角−３°ＡＳとＢＤＮＦ　；黒丸−３“　Ｓ；白丸−３’　ＳとＢＤＮＦ。

図９は、神経芽細胞腫セルラインにおける構成的に自己リン酸化されたｔｒｋレ セプターの同定を示す。パネルＡ、ｔｒｋＢを発現する約３Ｘ１０’個のＮＩＨ ３Ｔ３細胞［３Ｔ３　（ｔｒｋＢ）］から調製してＢＤＮＦで処理したか、ある いは２−５Ｘ１０６個の未処理神経芽細胞腫細胞から調製した全タンパク質溶解 物から特異的に免疫沈降した自己リン酸化ｔｒｋＢレセプターの抗−ホスホチロ シンイムノプロット。パネルＢ、細胞溶解物の調製およびｔｒｋ特異的免疫沈降 の前にＮ１８７Ｇ２神経芽細胞腫細胞を未処理、または２００ｎＭ　Ｋ２５２ａ で前処理した。パネルＣ，ＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３）　、ＢＤＮＦで処理した ３Ｔ３（ｔｒｋＢ）細胞、または未処理３Ｔ３（オートクリン）細胞から調製し た全タンパク質溶解物の抗−ホスホチロシンイムノプロット。ｔｒｋＢの位置を 矢印で示し、一方分子量基準（ｋＤ）を図の左側に示す。黒四角−３’ＡＳ、白 四角−３’　ＡＳとＢＤＮＦ；黒丸−３゛Ｓ；白丸−３°　ＳとＢＤＮＦ。

図１０は、神経芽細胞腫セルラインにおける構成的に自己リン酸化されたｔｒｋ レセプターの同定を示す。パネルＡ、ｔｒｋＢを発現する約３ＸＩＯ’個のＮＩ Ｈ３Ｔ３細胞から調製してＢＤＮＦで処理したか、あるいは２−５Ｘｌ　Ｏ’個 の未処理神経芽細胞腫細胞から調製した全タンパク質溶解物から特異的に免疫沈 降した自己リン酸化ｔｒｋＢレセプターの抗−ホスホチロシンイムノプロット。

パネルＢ、細胞溶解物の調製およびｔｒｋ特異的免疫沈降の前にＮ１８ＴＧ２神 経芽細胞腫細胞を未処理、または２００ｎＭ　Ｋ２５２ａで前処理した。パネル Ｃ，ＮＩＨ３Ｔ３細胞（３Ｔ３）　、ＢＤＮＦで処理した３Ｔ３　（ｔｒｋＢ） 細胞、または未処理３Ｔ３−オートクリン細胞から調製した全タンパク質溶解物 の抗−ホスホチロシンイムノプロット。ｔｒｋＢの位置を矢印で示し、一方分子 量基準（ｋＤ）を図の左側に示す。

図１１は、その生存がＢＤＮＦオートクリン生存ループに依存するかあるいは無 関係である、神経芽細胞腫（パネルＡ）および３Ｔ３セルライン（パネルＢ）に 対するに２５２ａの分化効果を示す。神経芽細胞腫細胞（パネルＡ）および３Ｔ ３細胞（パネルＢ）を図７で説明した方法により２４ウエルのプレート中に播い た。播種後、すべての細胞を増殖因子不足培地に移した。３Ｔ３親細胞は５０ｐ Ｍ　ＦＧＦ中に維持した。細胞を各種濃度のに２５２ａ（０から２５０ｎＭ）で ４８時間処理した。すべてのセルラインの細胞生存性をグルコース利用アッセイ で■試料につき２回ずつ測定した。パネルＡ：白四角−８Ｈ−３Ｙ５Ｙ　（ＢＤ ＮＦ無添加）；黒四角−Ｌ、ｌＮ−５（ＢＤＮＦ添加）；黒丸−Ｎ】８ＴＧ２　 （ＢＤＮＦ添加）。パネルＢ：白四角−３７３（ＦＧＦ添加）；黒四角−３Ｔ３ −オートクリン（ＢＤＮＦ添加）。

図１２は、小細胞肺癌（ＮＣＩ−Ｈ６９）　、肺腺癌（Ｃａｌｕ−３）、３Ｔ３ 　（オートクリン）および神経芽細胞腫（Ｎ１８ＴＧ２）細胞に対するに２５２ ａの分化効果を示す。細胞を図７で説明した方法で２４ウエルのプレートに播い た。０．５０および１１００ｎ　Ｋ２５２ａで細胞を４８時間処理した。すべて のセルラインの細胞生存性をグルコース利用アッセイで１試料につき２回ずつ測 定した。ヒストグラム（左から右）は以下の通りである：黒のヒストグラム：Ｎ Ｃｌ−Ｈ６９；肉太の平行斜線を引いたヒストグラム：Ｎ１８ＴＧ２：点々をつ けたヒストグラム＝３Ｔ３（オートクリン）；細い平行斜線をり匹またヒストグ ラム＝Ｃ本発明は、腫瘍細胞およびその子孫の増殖を阻害し、または妨害するた めに、二二一口トロフィンを発現する腫瘍細胞をもつ哺乳動物を治療する方法お よび医薬組成物を提供する。本発明の組成物および方法は、腫瘍細胞のオートク リン生存ループを妨害する有効量の物質を冒された哺乳動物に投与することを含 む。

さらに特定すると、ＢＤＮＦ−オートクリン生存ループの妨害に使用でき、した がってＢＤＮＦ−発現腫瘍細胞における細胞死を引き起こすことのできる２つの メカニズムの例を提供する。

本発明を実施するための１つのメカニズムは、ＢＤＮＦまたはその一部をコード する遺伝子またはｃＤＮＡとアンチセンスな少なくとも６個のヌクレオチドの核 酸の使用を含む。ここで用いる”アンチセンス”とは、一定の配列相補性のため にＢＤＮＦ　ＲＮＡ（好゛ましくはｍＲＮＡ）の一部とハイブリダイズすること のできる核酸をいう。

もう１つのメカニズムは、スタウロスポリン、Ｍｕｒａｋａｔａらの米国特許第 ４，９２３．９８６号および１９８９年２月２２日公開の欧州特許出願第３０３ ，６９７号、１９８９年７月５日公開の第３２３，１７１号に記載されたに２５ ２ａまたはその誘導体、若しくはその他のプロティンキナーゼ阻害剤の使用を含 む。

さらに、本発明は、オートクリン生存ループを利用する腫瘍細胞（神経芽細胞腫 および５ＣＬＣなど）の多くの特徴を具現する組換えオートクリンループ細胞モ デルを提供する。ここで用いるオートクリン生存ループを利用する細胞とは、そ れ自身の生存のために必要な分子を発現する細胞をいう。

本発明のアンチセンス核酸は、生存のためにＢＤＮＦ発現に依存する細胞による ＢＤＮＦの合成を阻止することによって、細胞間レベルでＢＤＮＦ−オートクリ ンルーブを妨害する。Ｋ２５２ａおよび関連化合物がＢＤＮＦ−オートクリンル ーブを妨害するメカニズムは、ｔ　ｒｋＢレセプターの活性化およびリン酸化を 阻止することによって、ＢＤＮＦレセプターのレベルで起きる。別のチロシンプ ロティンキナーゼ阻害剤のクラスであるチアゾリジンジオンクラスの阻害剤［Ｇ ｅ１ｓｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６５： ２２２５５−２２２６１　（１９９９）コはに２５２ａにたいして同様に作用す ることができる。カルフォスチンＣ、スタウロスポリン、Ｋ２５２ｂ、ＫＴ５７ ２０、ＫＴ５８２３およびＫＴ５９２６　（Ｋａｍｉｙａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ） などのその他のプロティンキナーゼ阻害剤も使用できる。ＢＤＮＦオートクリン ルーブを妨害するその他のメカニズムもまた本発明に包含される。

本発明のアンチセンス核酸は二本鎖または一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ、若しく はその修飾体または誘導体であるオリゴヌクレオチドであることができ、これら は細胞に直接投与するか、あるいは外因性の導入された配列の翻訳によって細胞 内的に生産することができる。

本発明によって提供されるＢＤＮＦアンチセンス核酸は、その腫瘍タイプがＢＤ ＮＦ遺伝子を発現することが証明された（ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ で）細胞である腫瘍の治療に使用できる。このような証明はＢＤＮＦ　ＲＮＡま たはＢＤＮＦタンパク質の検出によって行うことができる。本発明によると、Ｂ ＤＮＦアンチセンスオリゴマーはこのような腫瘍の増殖を阻止するだけでなく、 細胞性タンパク質の喪失前にＤＮＡが喪失することを特徴とするプログラムされ た、または”アポプロティック”な死を含む普通でないメカニズムによる腫瘍細 胞を死に至らしめることがてきる［Ａｒｅｎｄｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｍ、１． 　Ｐａｔｈｏｌ、　１３６＋５９３　（１９９０）］。

本発明はさらに、医薬的に受容できる担体中に有効量の本発明のＢＤＮＦアンチ センス核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物を投与することか らなる各種疾患および不調の治療方法も提供する。

別の態様においては、本発明は、本発明のアンチセンスＢＤＮＦ核酸を含む有効 量の組成物を細胞に与えることからなる、真核細胞におけるＢＤＮＦ核酸配列の 発現を阻害する方法に関する。

別の態様においては、ＢＤＮＦアンチセンス核酸の細胞毒性効果から機能性ＢＤ ＮＦまたはその他のニューロトロフィンレセプターを発現する細胞をニューロト ロフィンが”救う”能力を観察することによって、このような細胞の同定を行う ことができる。

本発明の別の面では、患者から得た細胞中におけるＢＤＮＦ発現を検出すること によるヒト神経芽細胞腫または小細胞肺癌の診断を提供する。このような診断は ＢＤＮＦ　ＲＮＡまたはタンパク質発現を検出することによって実施することが できる。

本発明のアンチセンス核酸は少なくとも６個のヌクレオチドであり、好ましくは オリゴヌクレオチド（６から約５０ヌクレオチド）である。オリゴヌクレオチド はＤＮＡまたはＲＮＡ、若しくはそのキメラ混合物または誘導体または修飾体、 −水路または二本鎖でありうる。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、また はリン酸骨格で修飾してもよい。オリゴヌクレオチドはペプチドなどの他の付属 基、若しくは細胞膜を透過して輸送することを可能にする薬剤［例えば、Ｌｅｔ Ｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：６４８−６５２　（１９８７）；ＰＣＴ出願公開Ｗ ０８　Ｂ１０９８１０２１９９８８年１２月１５日公開を参照］または血液−脳 関門を透過して輸送することを可能にする薬剤［例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ３ ９／１０１３４．１９９８８年４月２５日公開を参照］、ハイブリダイゼーショ ン−誘発化開裂剤［例えば、Ｋｒｏｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ、　６：９５Ｂ−９７６（１９８８）を参照コまたは挿入剤［例えば、Ｚ ｏｎ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｒｅｓ、、　５：５３９−５４９　（１９８８）を参照 ］を含むことができる。

本発明の好ましい面においては、好ましくは一本鎖ＤＮＡのＢＤＮＦアンチセン スオリゴヌクレオチドが提供される。最も好ましい面においては、このようなオ リゴヌクレオチドはヒトＢＤＮＦの最後の６コドンにアンチセンスな配列からな る。このオリゴヌクレオチドは当業界で公知の置換基によってその構造のいずれ の位置において修飾されていてもよい。

ＢＤＮＦアンチセンスオリゴヌクレオチドは以下の群から選択される少なくとも １つの塩基部分を含んでいてもよいが、これに限定されない＝５−フルオロウラ シル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキ サンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメ チル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５− カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベーターＤ−ガラ クトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イツペンテニルアデニン、■−メチルグア ニン、ｌ−メチルイノンン、２．２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、 ２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニ ン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミ ノメチル−２−チオウラシル、ベーターＤ−マンノシルケオンン、５−メトキシ カルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イ ツペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、 プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−゛２−チオウラ シル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル− ５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル −２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウ ラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２．６−ジアミツプリン。

別の態様においては、オリゴヌクレオチドは以下の群から選択される少なくとも １つの修飾糖部分を含んでいてもよいが、これに限定されない：アラビノース、 ２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。

さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート、ホスホ ロジチオエート、ホスホラミドチオエート、１５ホスホラミデート、ホスホロチ オエ−ト、メチルホスホネート、アルキルホスホルトリエステル、およびホルム アセクールまたはその類似体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾リ ン酸骨格を含む。

さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオ チドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは相補的ＲＮＡと特定の二本鎖ハ イブリッドを形成し、これはウラシルβ−ユニットとは異なり、鎖がお互いに平 行に伸びる［Ｇａｕｔｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、、　１５：６６２５−６６４１　（１９８７）　］。

オリゴヌクレオチドは、例えばペプチド／１イブリダイゼーシヨンー誘発化架橋 剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発化開裂剤などの他の分子と結合しても よい。

本発明のオリゴヌクレオチドは当業界で公知の標準法、例えば、自動ＤＮＡ合成 機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販 されているものなど）を用いて合成することができる。例えば、ホスホロチオエ ートオリゴは５ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、 　１６：３２０９　（１９８８）の方法によって合成でき、メチルホスホネート オリゴは制御された多孔性ガラスポリマー支持体を用いて調製できる［５ａｒｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５ニア４４８−７４５１　（１９８８）　 ］。

特定の態様においては、ＢＤＮＦアンチセンスオリゴヌクレオチドは触媒性ＲＮ Ａ、またはりポザイム［例えば、ＰＣＴ国際出願公開Ｗ０９０／１１３６４．１ ９９０年ｌθ月４日公開；５ａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４７：１２２２−１２２５　（１９９０）　］からなる。別の態様では、オリゴ ヌクレオチドは２°−Ｏ−メチルリボヌクレオチド［Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１５：６１３１−６１４８　（１９ Ｂ？）　］、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ同族体［１ｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、 　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

、２１５：３２７−３３０　（１９８７）コである。

あるいは別の態様においては、本発明のＢＤＮＦアンチセンス核酸は外因性配列 からの翻訳によって細胞内で生産される。例えば、ベクターが細胞によって取り 込まれるようにベクターを１ｎｖｊｖｏで導入し、該細胞内でベクターまたはそ の一部が翻訳されて、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生産する。このよ うなベクターはＢＤＮＦアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このような ベクターは所望のアンチセンスＲＮＡを生産するように翻訳される限り、エピソ ーム性であり続けるか、あるいは染色体に取り込まれることができる。このよう なベクターは当業界において標準的な組換えＤＮＡ手法によって構築できる。ベ クターは哺乳動物細胞における複製と発現に用いられるプラスミド、ウィルスま たは当業界で公知の他のものである。ＢＤＮＦアンチセンスＲＮＡをコードする 配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞において当業界で公知のいかなる プロモーターによってもよい。このようなプロモーターは誘導可能であり、かつ 構築可能である。このようなプロモーターは以下のものを含むが、これに限定さ れない：ＳＶ４０初期プロモーター領域［Ｂｅｒｎｏｉｓｔａｎｄ　Ｃｈａｍｂ ｏｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９０：３０４−３１０　（１９８１）］　、ラウス 肉腫ウィルスの３゛末端復中に含まれるプロモーター［Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　２２ニア８７−７９７　（１９８０）］　、ヘルペス チミジンキナーゼプロモーター［Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８：１４４１−１４４５　（１ ９８１）］　、メタロチオネイン遺伝子の制御配列［Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ　ｅｔ　 ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９６：３９−４２　（１９８２）コなど。

本発明のアンチセンス核酸は、ＢＤＮＦ遺伝子、好ましくはヒトＢＤＮＦ遺伝子 のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的である。しかしながら、絶対的な相補 性は、これが好まい）けれども、必要ではない。ここでいう”ＲＮＡの少なくと も一部と相補的な”配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二本鎖（二本 鎖のＢＤＮＦアンチセンス核酸の場合には二本鎖）を形成することができるため に十分な相補性を有することを意味する。ハイブリダイズする能力は相補性の程 度およびアンチセンス核酸の長さに依存する。一般に、ノ）イブリダイズする核 酸が長ければ長し）程、それが含むＢＤＮＦ　ＲＮＡと塩基がミスマツチするが 、それても安定な二本鎖（場合により二本鎖）を形成する。当業者はハイブリダ イズした複合体の融点を測定するための標準法を用し）で、使用に耐え得るミス マツチの程度を確認することができる。

Ｂ、レセプターリン酸化の妨害 に２５２　ａとして知られる化合物はカリフォルニア州、サウザンドオークスの Ｋａｍｉｙａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから市販されており、あ るいは上記した文献に記載されている。

生理的に活性な物質であるに２５２ａはノカルデイオシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｓ ｉｓ）属の微生物を培養することにより生産される物質に２５２の誘導体である ［Ｍａｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｔ、、米国特許第４．５５５，４０２号］、に２５ ２はＭｕｒａｋａｔａらの米国特許第４，８７７．７７６号に以下の式で表され る化合物として記載されている： ［式中、Ｒ１およびＲ２はＨまたはＯＨ；ＸはＣ０ＯＨ，Ｃｏ。

ＲまたはＣＨ２０Ｈ；ＹはＨ，ＲまたはＣＯＲ；そしてＺは０Ｈ１ＯＲまたはＳ Ｒであり、ここてＲは低級アルキルである］。Ｋ２５２はヒト子宮癌ＨｅＬａ細 胞、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７、ヒト大腸腺癌細胞Ｃ０ＬＯ３２０ＤＭ、ヒト肺癌腫 細胞ＰＣＩＯの増殖をプロティンキナーゼ阻害活性によって阻害することが示さ れた。

Ｋ２５２の誘導体はＭｕｒａｋａｔａらの米国特許第４．９２３．９８６号に以 下の式の化合物として記載されているニ［式中、Ｗ、　、Ｗ、　、Ｒ’　、Ｒ” 　、Ｒ”　、Ｒ’　、ＸおよびＹは各種置換基である］。

理論やメカニズムに拘泥されることなく、われわれのデータはスタウロスポリン およびその誘導体ならびにに２５２ａおよびそノ誘導体はニューロトロフィンレ セプターのリン酸化を妨害することによって作用することを示唆する。さらに特 定すれば、細胞表面レセプターのレベルでＢＤＮＦオートクリンルーブを妨害す ることにより、ｔｒｋ　Ｂチロシンキナーゼレベルが不活性化される。細胞性タ ンパク質のリン酸化の抑制は、Ｋ２５２ａまたはスタウロスポリンまたはこれら の誘導体がＢＤＮＦ媒介性の細胞応答を特異的に妨害する直接的効果によるもの と信じられる。ＥＧＦ−誘導化レセプターリン酸化を阻害するチアゾリジンジオ ンなどのその他のプロティンキナーゼ阻害剤も、同様のＢＤＮＦ−媒介性の細胞 応答を妨害する作用をすることができる。

治療有用性 本発明の物質は、ＢＤＮＦを発現することが示されている型の腫瘍の治療に使用 できる。このような腫瘍は、制限するものではないが、神経芽細胞腫、小細胞肺 癌およびある種の神経上皮腫を含む。

１つの実施態様では、１重鎖ＤＮＡアンチセンスＢＤＮＦオリゴヌクレオチドを 神経芽細胞腫の治療に使用する。もう１つの実施態様では、スタウロスポリン（ ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎ）またはに２５２ａを神経芽細胞腫の治療に使用する 。

ＢＤＮＦ　ＲＮＡを発現する他の腫瘍型を、当分野で既知の種々の方法により同 定できる。このような方法は、制限するものではないが、例えば、ＲＮＡがｉｎ 　ｖｉｔｒｏでＢＤＮＦに翻訳される能力を観察することによる、ノーザンハイ ブリッド形成、ドツトプロットハイブリッド形成などの、ＢＤＮＦ−特異的核酸 とのハイブリッド形成を含む。

好ましい態様では、患者からの初期腫瘍組織を、治療前にＢＤＮＦ発現について 分析できる。

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容できる担体中のＢＤＮＦオートクリン生存 ループを阻害する、有効量の物質を含むが、ＢＤＮＦ　ＲＮＡを発現する型の腫 瘍を有する患者に投与できる。

ＢＤＮＦ−発現腫瘍細胞の増殖を阻害する、本発明の治療および医薬組成物は、 それ故、医薬的に許容できる担体との混合物中の、ＢＤＮＦ−オートクリンルー プを阻害することができる、治療に有効な量の物質を含む。殺腫瘍活性を有する 医薬組成物は、例えば、溶液、シロップ、エマルジョン、注射可能薬剤、錠剤、 カプセルまたは座薬のような従来の形態の処方で利用できる。

適切な担体は、薬理学の分野で習熟した者にはよく知られている［例えば、Ｒｅ ｍｉｎｇｔｏｎｓ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ、　９ｔｈ、　 １０ｔｈ　ａｎｄｌｌｔｈ　Ｅｄ、を参照されたい］。例示する担体は、滅菌生 理食塩水、ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、 寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、スクアレンおよび水を含む。

さらに、担体または希釈剤は、単一でまたは蝋と共に用いるグリセリンモノステ アレートまたはグリセリンジステアレートのような時間遅滞物質を含んでもよい 。場合により、適切な化学安定化剤を医薬製剤の安定性を改善するために使用し てよい。適切な化学安定化剤は、当分野で習熟した者には周知であり、例えば、 クエン酸および他のｐＨ調節剤、キレートまたは金属イオン封鎖剤および抗酸化 剤を含む。

Ｋ２５２ａ　、スタウロスポリンまたはその誘導体または他のプロティンキナー ゼ阻害剤のいずれかを含む医薬組成物の処方は、部会長くは、単位剤形にでき、 そして従来の方法のいずれによっても調製できる。これとは別に、組成物は、当 分野で知られている切ｖｉｖｏ徐放出に適する形態にできる。すべての方法は、 活性成分を、１種以上の補助成分を構成しうる担体と会合させる工程を含む。

特定の疾患または状態の治療に有効な物質の量は、疾患または状態の性質に依存 し、そして標準臨床技術により決定できる。本発明の１つの実施態様では、ヒト で試験し使用する前に、治療する腫瘍型のアンチセンス細胞毒性を、例えば、以 下の実施態様に記載する分析系において、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、その後、動物モ デル系で測定することが望ましい。

導入法は、制限するものではないが、皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経 口および鼻内を含む。さらに、本発明の医薬組成物を、脳室内および髄腔内注射 を含むいずれかの適切な経路により中枢神経系に導入することが望ましい；脳室 内注射は、例えば、オマヤレザバーのようなレザバーに取り付けた脳室内カテー テルにより容易にできる。

さらに、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部位に局部的に投与すること が望ましいかもしれず；これは例えば、制限するものではないが、手術中の局部 注入、注射、カテーテルにより、または移植、シアラスティック（ｓｉａｌａｓ ｔｉｃ）膜またはファイバーのような膜を含む、多孔性、非−多孔性またはゼラ チン状の物質の前記移植により達成できる。

本発明は、リポソーム、微粒子またはマイクロカプセルを介して投与する、ＢＤ ＮＦ−オートクリンルーブを阻害する物質を含む医薬組成物も提供する。本発明 の種々の実施態様では、物質の持続放出を達成する組成物を使用することが有効 であり得る。特定の実施態様では、特定の同定可能な腫瘍抗原（例えば、神経芽 細胞腫または５ＣＬＣに選択的な細胞表面抗原）に対する抗体を介して、標的と されるリポソームを利用することが望ましいかもしれない［Ｌｅｏｎｅｔｔｉ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８ ７：２４４８−２４５１（１９９０）；　Ｒｅｎｎｅ４ｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　夏、Ｂ４ｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０ ）］。

Ｋ２５２ａまたはスタウロスポリンまたはその誘導体および他のプロティンキナ ーゼ阻害剤も、単独で、または、ある癌の直接または補助治療に有用な他の治療 または診断剤と組み合わせて、本発明の方法および組成物に従って使用できる。

Ｋ２５２ａまたはその誘導体を、本′発明のＢＤＮＦアンチセンス核酸と組み合 わせて使用できることを意図する。他の薬剤、例えば、代謝拮抗物質、アルキル 化剤、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、プラチナ誘導体、置換尿素、副 腎皮質ステロイド、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロンまたは 抗体も、ＢＤＮＦ−発現細胞により特徴付けられる種々の癌また関連疾患を治療 するために、このようなキナーゼ阻害剤と連係して使用することもできる。

以下に記載する状態の治療法において、有効量の、例えば、Ｋ２５２ａの投与に 含まれる投与計画は、例えば、患者の状態、体重、性別および食生活、腫瘍の程 度、投与時間および他の臨床因子のような、薬物の作用を変化させる種々の因子 を考慮して主治医により決定されるであろう。本文中に記載する特定の疾病状態 を治療するのに使用する本発明の組成物の用量は、特定の疾病および疾病の段階 により変化できる。

さらに、Ｋ２５２ａまたはその誘導体、スタウロスポリンまたは他のキナーゼ阻 害剤を含む医薬組成物も、上述のシクロホスファミド、サイトカイン、インター ロイキン、インターフェロンまたは抗体のような別の従来の治療剤を含むことを 意図する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、プロティンキナーゼ阻 害剤を含む医薬組成物と組み合わせることができることを特に意図する。これら の薬物を医薬組成物において組み合わせる場合は、各活性成分が、この薬物を単 独で投与する場合と同じ濃度か、または僅かに低濃度で、組み合わせる組成物中 に存在することが予測される。

本発明の組成物および方法の治療機構は、現在使用されているＢＤＮＦ−発現に 関連する腫瘍の治療に使用する大多数の薬物の機構と原則として異なっている。

単独でまたは他の既知の殺腫瘍薬剤と組み合わせて、ＢＤＮＦ−オートロリン生 存ループを阻害する物質本方法および組成物による治療に感受性のＢＤＮＦ−発 現腫瘍は、制限するものではないが、神経芽細胞腫、小細胞肺癌およびいくつか の神経上皮腫を含む。ＢＤＮＦを発現する他の腫瘍型を、当分野で既知の種々の 方法により同定できる。本発明法に従って、所望により、患者からの初期腫瘍組 織を、治療前にＢＤＮＦ発現について分析できる。

上述の哺乳類疾病の治療に加えて、本発明の方法と組成物は、例えば、ウマ、ブ タ、ウシおよび家禽を苦しめるＢＤＮＦ−発現腫瘍の治療における獣医学的目的 のために利用できる。これらの疾病は、上述の哺乳類疾病の治療に使用できる量 の化合物を使用して治療できる。

診断上の有用性 はとんどのヒト神経芽細胞腫細胞系は、ある値のヒトＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを発現 する。ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡ発現は、（小細胞肺癌およびいくつかの神経上皮腫の ような）少しの例外があるのみで、神経芽細胞腫に特有であるようである。これ らの結果より、８ＤＮＦ　ｍＲＮＡ発現はヒト神経芽細胞腫および５ＣＬＣとい くつかの神経上皮腫のための有用なマーカーとして臨床的に使用できる。現在ま での神経芽細胞腫の最適の臨床マーカーはＮ−ｍｙｃ増幅であり、Ｎ−ｍｙｃは 、全ての後期神経芽細胞腫（ＩＩ＋および１■期）の約３０％を増幅するのみで あるとすると、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡ発現は、神経芽細胞腫の前期および後期の両 方のさらに有用な広範囲の臨床マーカーであり得る。

機能的ＢＤＮＦまたは他のニューロトロフィン受容体を発現する細胞の同定 いくつかの神経芽細胞腫細胞系は、ＢＤＮＦＳＮＧＦおよびＮＴ−３のいずれか の添加によりアンチセンスＢＤＮＦオリゴヌクレオチドの毒性作用から効果的に 守られることができる（以下の第６節を参照されたい）。それ故、いくつかの神 経芽細胞腫は、［１ＤＮＦ、　ＮＧＦまたはＮＴ−３の機能的受容体を発現する ことが、このような細胞型を５アンチセンス細胞毒性から守るこれらの個々のリ ガンドの能力に基ついて予言できる。例えば、われわれのデータ（実施例１、■ 。

１節）により、ＬＡ−Ｎ−５神経芽細胞腫細胞は、ＮＧＦ　、　ＢＤＮＦおよび ＮＴ−３の機能的受容体を発現するが、ＬＡ−Ｎ−１細胞は、機能的ＢＤＮＦ受 容体のみを発現し、そしてＣＨＰ−１３４とＣＨＰ−４０４神経芽細胞腫細胞は 、ＮＴ−３受容体は欠くがＮＧＦ　（！：［１ＤＮＦ受容体の両方を発現するこ とが示唆される。

オートラリン−ループ依存性腫瘍細胞を模倣する細胞系モデルの遺伝子工学 神経芽細胞腫のＢＤＮＦ依存性依存性オーシタリン生存ループにもかかわらず、 検出可能な値のｔｒｋＢのｍＲＮＡまたは検出可能な値の構造的にリン酸化され たｔｒｋ受容体のような、生存ループを反映するような細胞の特性は容易に検出 されなかった。従来のマイトジェン因子を含むオートクリンルーブの以前の研究 により、これらのループは、検出可能な分泌因子の非存在化で、細胞内で時々生 しる受容体活性化を伴って機能し得ることが立証されている［Ｚｈａｎ　ａｎｄ 　Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、　６：３５４１（１ ９８６）］。さらに、慢性オートクリン刺激により、受容体自己リン酸化の実質 的ダウンレギュレーションおよび関与している受容体の急速な代謝回転が起こり 、その両者は構造的にリン酸化された受容体の検出を困難または不可能にし得る 。同様に、神経細胞を持続的にＮＧＦに晒すと、生存には必要であるが、ついに は、活性化ｔｒｋＡ受容体の実質的ダウンレギュレーションが起こる［Ｋａｐｌ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５２：５５４（１９９１）］。

これらの問題を克服し、ループの遮断がｉｎ　ｖｉｔｒｏで容易に検出できる、 ＢＤＮＦオートクリンルーブを利用するモデル細胞を提供し、それ故このような オートクリンルーブを遮断する能力を持つ化合物をスクリーニングする有用な系 を提供するために、組換え細胞系を作製した。この系はＢＤＮＦ／１ｒｋＢ媒介 オートクリン媒介オート用リンループ系は、所定の培地中での増殖と生存が正常 では繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のい ずれかを必要とする変異Ｎｌ＋（３Ｔ３繊維芽細胞系に基づいており［Ｌｅｅ。

ａｎｄ　Ｄｏｎｏｇｈｕｅ、ｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１１３：３６１　（１ ９９１）コ；因子欠乏によるこれらの繊維芽細胞の死滅もアポブトティック（ａ ｐｏｐｔｏｔ　ｉｃ）である。［Ｅｒｎｆｏｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｕｒｏ ｎ　５：５１１　（１９９０）コ。これらの細胞がｔｒｋＢ受容体で安定してト ランスフェクトされている場合は、ＢＤＮＦはＦＧＦまたはＰＤＧＦと置換でき る［Ｇｌａｓｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６６：４０５　（１９９１）］。

ｔｒｋＢおよびＢＤＮＦの両方とこれらの細胞の同時トランスフェクションによ りＮＩＨ３Ｔ３細胞［３Ｔ３　（オートロリン）またはＭＢｘと称す］が導かれ 、この細胞は外来性の増殖因子を添加せずに所定の培地中で生存できる（すなわ ち、ＢＤＮＦについてオートロリンとなる）。注目すべきは、これらのオートク リンＮＩＨ３Ｔ３細胞は多くの点でＢＤＮＦオートクリン生存ループに依存する 神経芽細胞腫に類似している。例えば、それらはＢＤＮＦアンチセンスオリゴマ ーへの同様の配列特異的感受性を示し、外来性ＢＤＮＦにより克服される。さら に、これらの細胞は培地中に検出可能な値のＢＤＮＦを分泌せず、検出可能な値 の構造的にリン酸化されたｔｒｋＢ受容体を現さない。

さらに、Ｋ２５２ａとスタウロスポリンは、神経芽細胞腫に作用するのと非常に 類似した様式で、所定の培地中で増殖しているＢＤＮＦ／１ｒｋＢ−トランスフ ェクトＮｌ１１３Ｔ３細胞に作用し、それ故、このような細胞は、オートクリン ルーブの崩壊を介してオートラリンループ依存性腫瘍細胞を破壊するのに使用で きる薬物を同定する有用な分析系を提供することを確証する。特定の因子および 因子のための受容体をコードし発現するように設計されている、他のオートクリ ンループモデル系も、ここに意図されているように、このようなオートクリンル ープを遮断する薬剤を同定するために作製し使用することもできる。このような 因子は、制限するものではないが、神経増殖因子、ニューロトロフィン−３、二 二一口トロフィン−４および毛様体ニューロトロフィック（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐ ｈｉｃ）因子を含む。

ここに記載する発明がさらに十分理解できるように、以下の実施例を説明する。

これらの実施例は、説明を目的とするものであり、本発明の制限としていかよう にも解釈されるべきではないことが理解されるべきである。

実験結果：神経芽細胞腫 ここに記載するように、本発明者らは、ＢＤＮＦに対して向けられたアンチセン スオリゴヌクレオチドは神経芽細胞腫細胞系に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞毒 性マあることを示し、それ故、ヒト神経芽細胞腫細胞はオートクリン生存分子と してＢＤＮＦを必要とし、そしてこれらの神経芽細胞腫細胞は外来性ＢＤＮＦを 投与することによりアンチセンスＢＤＮＦの細胞毒性作用から守られることを実 証する。これらの神経芽細胞腫細胞のほとんどは、検出可能な値のｔｒｋＢ　ｍ ＲＮＡを発現しないので、われわれのデータによりＢＤＮＦの別の受容体が存在 するかもしれないことが暗示される。

ノーサンプロット法によりＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現について、一群のヒトおよ び薩歯類腫瘍細胞系をスクリーニングした［Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　 ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７：１４４６−１４５１（１９９０）］　、 表１および図５はこれらの結果を要約し、そしてほとんどの神経芽細胞腫細胞系 （試験した１７と１８）はＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを発現し、そしてＢＤＮＦ　ｍＲ ＮＡの発現は、ある程度、神経芽細胞腫に特有であるようであることを示す。例 えば、１２種の神経上皮腫またはユーイング肉腫のうち３種のみがＢＤＮＦ　ｍ ＲＮＡを発現する。試験した非−神経性腫瘍はいずれもＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを発 現しないことが見いだされた。試験した非−神経性腫瘍細胞系は、網膜芽細胞腫 、悪性黒色腫、癌（頚部および胸部）および白血病を含んでいた。ＢＤＮＦ　ｍ ＲＮＡを発現しなかった唯一の神経芽細胞腫細胞系は、神経堤由来起源と対照的 に、胸部由来である点でユニークである５Ｈ−５Ｙ５Ｙであった。Ｍａｒｋ　ｌ ５ｒａｅ■博士（ＵＣ３Ｄ）がこれらの神経芽細胞腫細胞系のいくつかのＲＮＡ プロットを提供した。

表■ ヒト細胞系におけるＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現※細胞系　ＢＤＮＦ発現 神経芽細胞腫 ＮＢ−６９＋ ＮＭＢ　十 ＭＲ−３２ ＳＨ−５Ｙ５Ｙ 表Ｉ（続き） 神経上皮腫／ユーイング肉腫 ５に−Ｎ−ＭＣ ＣＨＰ−１００ Ａ４５７３　＋ ＳＫ−Ｎ−ＬＯ＋ ｕ十 非−神経性細胞系 Ｌ−６０ ＣＯＬＪＤ−３２０ ＥＬＡ に５６２ ＣＦ７ ※データは、ヒトＢＤＮＦで釣り上げたヒト細胞系ＲＮＡプローブのノーザンブ ロッティング結果のまとめである。（＋）はｈＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの陽性発現を 示し、そして、（−）はＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの欠如を示す。

（＋／−）は非常に低い値の発現を示す。（実際のノーザンブロッティングデー タはＢＤＮＦ特許に示されている）１．２．７ンチセン７、オリゴヌクレオチド はＢＤＮＦ　ｍＲＮＡのｉｎ　Ｖｉｔｒ。

下記の表Ｈに示したように、ヒトの５８ＤＮＦ遺伝子［ＰＣＴ、国際公開番号Ｗ Ｏ９１／Ｐ３５６８．１９’ｌ１年３月２１日発行を参照のこと］の様々な領域 に相補的になるように３種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。オ リゴヌクレオチド（以下「オリゴ」と略す）はいずれも１８−ｍｅｒとして作製 し、すべての実験においてこれらと相補的なセンスオリゴを対照として使用した 。５゛末端をもつアンチセンスオリゴ（５′−ＡＳ−ＢＤＮＦ　、配列番号＝１ ）は、開始コドンと考えられるＡＴＧ塩基配列の３ヌクレオチド上流から始まり 、この開始メチオニンの４コドン下流に至るヒトのＢＤＮＦ　ＤＮＡ配列から成 っていた。第二のアンチセンスオリゴは二塩基性残基プロセシング部位周辺のＢ ＤＮＦ　ＤＮＡ配列に対応させ（ＰＳ−ＡＳ−ＢＤＮＦ　、配列番号＝３）、第 三のアンチセンスオリゴ（３’　−Ａｓ−ＢＤＮＦ　、配列番号：５）はヒトＢ ＤＮＦの最後の６ゴトンに対応させた。

５°−ＡＳ−ＢＤＮＦ　５°−ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＣＡ Ｃ−３’　ｌ　−１２９から　−１２４まで５°−３−ＢＤＮＦ　５°−ＧＴＧ 　ＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＣＣＴＴ　ＴＴＣ−３’　２　−１２９から　−１２４ま でＰＳ−ＡＳ−ＢＤＮＦ　５’　−ＧＧＣＡＧＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＴＧ　ＧＣ Ｇ−３°　３　−１から　＋５まで３’−５−ＢＤＮＦ　５′−ＴＴＧ　ＡＣＣ ＡＴＴ　八ＡＡ　ＡＧＧ　ＧＧＡ−３’　６　４１１３から　＋１１９までＡＳ −アンチセンス配列を指す、Ｓ−センス配列を指す、ＰＳ−二塩基性アミノ酸プ ロセシング部位を指す。推定上のＡＴＧ開始コドンは５’−３−ＢＤＮＦ配列中 に認められる。Ａｒｇ−Ｌｙｓ二塩基性残基コドンはＰＳ−３−ＢＤＮＦ配列に 表れている。これらのオリゴヌクレオチドは、すべてＡｐｐＨｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ社の核酸合成機で合成されている。

最初に、コムギ胚芽等解液によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を用いて、それぞれの アンチセンスＢＤＮＦオリゴヌクレオチドがＢＤＮＦの合成を抑制する能力を試 験した（図１）。この検定系では、ＢＤＮＦ　（＋／−のアンチセンスもしくは センスオリゴヌクレオチド）の合成後に、３５Ｓ−メチオニンによる代謝標識、 ポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびに蛍光光度法を行なった（図１）。無作 為の１８−ｍｅｒ　（対照オリゴ）は、１８Ｍ、６μＭのいずれの濃度において もｉｎ　ｖｉＬｒｏてＢＤＮＦの合成に対して抑制作用を持たないことが観察さ れた。

５’−Ａｓ−ＢＤＮＦオリゴ（配列番号；ｌ）は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて濃 度ｌμＭでＢＤＮＦの合成をわずかに抑制し、６μＭの濃度では顕著な抑制作用 を示した。３’　−ＡＳ−ＢＤＮＦ　（配列番号＝５）とＰＳ−Ａｓ−ＢＤＮＦ 　（配列番号＝３）は、いずれも濃度１μＭおよび６μＭの濃度てＢＤＮＦの合 成を効果的に抑制した。相補的なセンスオリゴは、濃度１μＭではＢＤＮＦのｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ合成にほとんど影響を及ぼさなかったが、きわめて高い濃度（６ μＭ）では若干の抑制作用を示した（５゛−５−ＢＤＮＦオリゴ（配列番号：２ ）の代表的なデータを図１に示した）。

我々は、アンチセンスロＤＮＦオリゴヌクレオチド（５’　−ＡＳ−ＢＤＮＦ。

ＰＳ−ＡＳ−ＢＤＮＦ、３°−ＡＳ−ＢＤＮＦ）をｉｎ　ＶｉｔｒＯでヒト神経 芽細胞腫細胞の培養液に直接添加した場合に、細胞の生存力が受ける影響を試ヒ トの神経芽細胞腫細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、 １％ペニシリン及び１％ストレプトマイシンを含有するイーグルの改変必須培地 （ＥＭＥＭ）　（完全培地）で培養した。アンチセンスなオリゴを検定するため 、２４のウェルからなるコスタ−プレートにウェル当たり２ＸｌＯ’の細胞密度 で細胞を播いた。血清ヲ含まないＥＭＥＭ培地中の細胞にアンチセンスオリゴを 直接添加して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを行なった。

細胞の培地に添加したアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドの濃度は ０．１ＨＭ−５０μＭであった（図２）。それぞれのオリゴヌクレオチドと共に ４時間培養した後、細胞培養ウェルにＩＴｓ補足液（インシュリン、トランスフ ェリン及びセレン）を加え、オリゴを添加した９６時間後に細胞の生存力を検定 した。ウェルを二重に検定して平均値をとった。細胞の生存力はトリノくンブル ー染色により検定した（図２）。センスならびにアンチセンスＢＤＮＦオリゴマ ーがＬＡＮ−５神経芽細胞腫細胞に及ぼす形態学的な影響を図６に光学顕微鏡写 真として示した。図２でも明らかなように、ＬＡ−Ｎ−５神経芽細胞腫細胞系が ３°−Ａｓ−ＢＤＮＦオリゴヌクレオチド（配列番号、５）の細胞毒性作用に最 も敏感であった。これらの細胞の８０％以上が１８Ｍの３°−Ａｓ−ＢＤＮＦて ９６時間以内に死滅した。

ＬＡ−Ｎ−１神経芽細胞腫細胞は、１８Ｍの３’−ＡＳ−ＢＤＮＦで、そのうち の４０％しか９６時間以内に死滅せず、ＬＡＮ−５細胞よりもやや感受性が低か った。興味深いことは、ＬＡ−Ｎ−１細胞がＬＡ−Ｎ−５細胞よりもＢＤＮＦｍ ＲＮＡの発現率が低いということである。（ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを発現しない） 　５Ｋ−ＥＳ細胞と５）ｌ−３Ｙ５Ｙ細胞は、５０ＭＭの濃度でも３’　−Ａｓ −ＢＤＮＦの細胞毒性作用に抵抗性であった。これらの抵抗性細胞系は、３°− ＡＳ−ＢＤＮＦの濃度を５０ＭＭとすると細胞の生存力が多少失われたが、対照 の３°−センス−ＢＤＮＦ　（３°−３−ＢＤＮＦ）オリゴヌクレオチド５０μ Ｍで処理した場合にも細胞の生存力が同様に失われた。しかし実際には、５０Ｍ Ｍの３°−３−ＢＤＮＦを加えた無血清培地で９６時間処理したときに、３０％ 以上の細胞が失われることは４種類のどの細胞系においても認められなかった。

最後に、５°−ＡＳ−ＢＤＮＦオリゴ（配列番号：ｌ）で処理したときには、ど の神経芽細胞腫細胞系においても細胞生存力の喪失は観察されなかったが、ＰＳ −ＡＳ−ＢＤＮＦ（配列番号＝３）で処理した場合には３°−Ａｓ−ＢＤＮＦ　 （配列番号＝５）の場合とほぼ同一の結果が認められた。

ＢＤＮＦアンチセンスオリゴマーは、神経芽細胞腫の培地に低い濃度で添加して も細胞の形態に著しい影響を及ぼしたが、対照のオリゴマーにはそのような作用 は見られなかった（図６Ａ−Ｃ）。

予想されるように、ＢＤＮＦのオートロリンループが破壊されためにこうした作 用が生しるとすれば、アンチセンスが媒介する細胞形態の変化は外部からＢＤＮ Ｆを添加することで防止できるだろう。

図３　（Ａ−Ｅ）は、各種の神経芽細胞腫細胞（即ち、５Ｈ−５Ｙ５Ｙ（Ａ）、 ＬＡ−Ｎ−１（Ｂ）、ＬＡ−Ｎ−５（Ｃ）、ＣＨＰ−１３４（Ｄ）、Ｃ）ＩＰ− ４０４（Ｅ））に、ＢＤＮＦ、ＮＧＦもしくはニューロトロフィン３　（ＮＴ− ３）　（精製した組換え因子１１００ｎ／ｍｌ、それぞれのニューロトロフィン 遺伝子を移入したＣＨＤ細胞から得たもの）［ＰＣＴ、国際公開番号ＷＯ９１１ ０３５６８参照］のいずれかと、３°−ＡＳ−ＢＤＮＦ　（配列番号＝５）オリ ゴヌクレオチド（５０μＭ）とを同時に添加した同時添加実験の結果を示してい る。

３’−ＡＳ−ＢＤＮＦ＋／−神経栄養因子を添加後２４時間置きに、トリバンブ ルー染色により、２４ウエルからなるプレートのウェルで細胞の生存力を二重に 測定した。また、血球針を用いて細胞数も記録した。

先に記述したように、血清を含まない条件下で、４時間、細胞培養系にオリゴを 直接添加して、オリゴヌクレオチドの取り込みを行なった。図３Ａのデータは、 ３°−Ａｓ−ＢＤＮＦが、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡ陰性の５Ｈ−３Ｙ５Ｙ細胞に対し て細胞毒性作用を持たないことを実証している。ＣＩＩＰ−１３４細胞、ＣＨＰ −４０４細胞（それぞれ図３Ｄ及び３Ｅ）のいずれも、３’−Ａｓ−ＢＤＮＦの 細胞毒性作用に感受性を示す。これらの細胞系は、ＢＤＮＦ、　ＮＧＦのいずれ かを同時に添加することで（その７０％〜９０％を）救出することができるが、 ＮＴ−３を添加してもそのような働きはない。ＬＡ−Ｎ−］細胞はＢＤＮＦによ って３’　−Ａｓ−ＢＤＮＦの細胞毒性作用から救出されるにすぎない（図３Ｂ ）が、ＬＡ−Ｎ−５細胞は３種類のどの二二一口トロフィンによっても救出され る（図３Ｃ）、図３には示していないが、我々は、３’−Ａｓ−ＢＤＮＦオリゴ ヌクレオチドがＬＡ−Ｎ−１，ＬＡ−Ｎ−５、ＣＩＩＰ−１３４及びＣＩＩＰ− ４０４細胞に対して細胞毒性作用だけでなく細胞増殖抑制作用があること、５Ｈ −３Ｙ５Ｙ細胞に対してはそのような作用がないことを観察した。

１．５．　ＢＤＮＦアンチセンスオリゴマーによる神経芽細胞腫の処理はアポブ トティックな死を引き起こす 神経芽細胞腫に影響を及ぼすことは知られていたが、以前に記述された成長因子 オートクリンループ［Ｂｅｃｋｅｒら、ｆ！ＭＩＩＯＪ、ら、８：３６８５（１ ９８９）＋　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　！、旦ｏ１．　Ｃｈｏｍ、　２６６：７２８ （１９９１）；　Ｅｌ−Ｂａｄｒｙら１．！、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８７： ６４８（１９９１）；　５ｅｌｉｎｆｒｅｕｎｄ　ら、Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　ｍ　：２０２１（！９９０）］の破壊から生じる影響 とは対照的に、ＢＤＮＦアンチセンスオリゴマーは、神経芽細胞腫の増殖を防止 しただけでなく、神経芽細胞腫細胞の死をもたらした（図６Ｂ）。

ＢＤＮＦが実際にこれらの細胞系においてニューロンの生存分子として作用する とすれば、ＢＤＮＦのオートクリンルーブが破壊されることから生じる死は、神 経栄養因子が失われた後の神経細胞の死について以前に記述されたもの［Ｍａｒ ｔｉｎら、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０６：８２９（１９８８）；　５ ｃｏｔｔら、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、　２１：６３０（１９９０）；　Ｂａｔ ｌｓｔａｔｏｎ予想される。自然な形での細胞死を迎えるときに神経細胞が示す 形態学的パターンは異なるらしい［５ｅｒｖｅｒら、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、　Ｔ ｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌ１ｌａｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｅａｔｈ　ｐｐ 、２６３−２７９（１９９１）　］が、神経細胞の死の一般的な特色は、胸腺や 前立腺といった他の器官のプログラムされた細胞死に特有の幾つかの生化学的変 化のようである［Ｂａｔｉｓｔａｔｏｕ、上記参照；　Ｒｕｋｅｎｓｔｅｉｎ、 上記参照、Ｗｙｌｉｅら、思１強、諭力壮、　６８：２５１（１９８０）］。特 に、細胞蛋白の減少の前にＤＮＡの減少をもたらす内因性のカルシウム依存エン ドヌクレアーゼの活性化は、プログラムされた、すなわちＥアポブトティツタな （細胞消滅的）Ｊ死の一般的な特色のようである［Ａｒｅｎｄｓら、Ａｍ、　Ｊ 、　Ｐａｔｈｏｌ、　１３６：５９３（１９９０）　］　、我々は、アポブトシ スと壊死とを区別するため、二重染色（ＤＮＡと蛋白質への染色）フローサイト メトリー検定法を利用した［ＤｅｌＢｉｎｏら、Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ。

１９３：２７（１９９１）　；　Ｊａｋｏｂｉｓｉａｋら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｆ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

６８：３６２８（１９９１）］。］ＬＡ−Ｎ−５ヒト神経芽細胞腫神経芽細胞腫 口フィールは、正常に循環する多くの細胞系に特有であり、細胞集団の多くがＧ １期の細胞周期にあり、残りの細胞集団は８期もしくはＧ２＋Ｍ期のいずれかで あった（図７Ａ）。アンチセンスなりＤＮＦオリゴマーによる処理は、蛋白質減 少の非存在下でのＤＮＡ含有量の有意な低減を特色とするＬＡ−Ｎ−５細胞のア ポブトティックな集団を出現させた（図７Ｂ）が、こうした変化は、アポブトテ ィックな集団において通常具られるように（Ｄｅｌ　Ｂｉｎｏ、上記参照）、８ 期における細胞の比率の低減を伴っていた。アンチセンスで処理したオートクリ ン細胞のＢＤＮＦによる救助は、図６Ｄで前に観察したように、アポブトティッ クな集団の出現を防止した（図７Ｃ）。

神経芽細胞腫細胞は低濃度のＢＤＮＦセンスもしくはランダム配列オリゴマーに 敏感ではなかったが、これらのオリゴマーは、高濃度で存在した場合に、ＢＤＮ Ｆのオートクリンループに依存しない細胞の死だけてなく神経芽細胞腫細胞の死 をもたらした（下記参照）。

低濃度のＢＤＮＦアンチセンスオリゴマーで処理した神経芽細胞腫細胞のアポブ トティツタなプロフィールとは対照的に、高濃度のセンスオリゴマーでは、壊死 の場合と一致するＤＮＡと蛋白質のプロフィール、すなわち、ＤＮＡの含有量や 、８期における細胞の比率に影響を及はすことなく細胞の蛋白が失われるプロフ ィールが見られた（図７Ｄ）。

ＢＤＮＦアンチセンスオリゴマーが配列依存的に作用して、ＢＤＮＦのオートク リンループを要求する神経芽細胞腫を特異的に殺すことを立証するため、我々は 、様々な濃度のセンスもしくはアンチセンスオリゴマーにさらしたときの神経芽 細胞腫細胞の生存力を比較した。用量と反応の関係を検討した結果、アンチセン スＢＤＮＦオリゴマーは、ＢＤＮＦを発現する神経芽細胞腫ＬＡ−Ｎ−５を殺す 能力が対照のオリゴマーに比べて著しく強いことが明らかになった（図８Ａ）。

逆に、アンチセンス及び対照のオリゴマーはいずれも、唯一のＢＤＮＦ陰性神経 芽細胞腫５Ｙ５Ｙを殺す上で同様に効果がなかった（図８Ｂ）。外部からＢＤＮ Ｆを添加しても、センスもしくはアンチセンスオリゴマーが５Ｙ５Ｙ細胞に及ぼ す影響は変わらなかった（図８Ｂ）が、ＬＡ−Ｎ−５細胞の場合は、外部からＢ ＤＮＦを添加すると、アンチセンスオリゴマーの死滅曲線は大きく移行し、対照 であるセンスオリゴマーの曲線に一致した（図８Ａ）。ＢＤＮＦ陰性のユーイン グ肉腫細胞系Ｓに−ＥＳは、５Ｙ５Ｙと同様、アンチセンスＢＤＮＦオリゴマー に感受性がなかったが、ＢＤＮＦ陽性の４種類の細胞系（ＣＨＰ−１３４、’Ｎ ｌ８ＴＧ２、ＣＨＰ、４０４及びＬＡ−Ｎ−１）をさらに実験したところ、ＢＤ ＮＦによって救出される能力だけでなく、ＬＡ−Ｎ−５細胞のそれと本質的に区 別できないアンチセンスＢＤＮＦオリゴマーへの鋭敏な感受性が明らかになった （データ省略）。

従って、アンチセンスなりＤＮＦオリゴマーは、配列特異的に、ＢＤＮＦを発現 する神経芽細胞腫のみに対して作用する。さらに、アンチセンスオリゴマーの毒 性は、外部からＢＤＮＦを添加することによって対照オリゴマーの値域まで低減 する。これらのデータと、アンチセンスなりＤＮＦオリゴマーによる神経芽細胞 腫の死がアポブトシスであり、高濃度の対照オリゴマーによる死が壊死であると いう我々の観察とは、共に、ＢＤＮＦアンチセンスオリゴマーが、ＢＤＮＦの継 続した合成に依存するオートリリン生存ループを破壊し、それによって神経芽細 胞腫におけるアポブトティックな細胞死を選択的に活性化することを明確に実証 している。

１．６．結論 殆どのヒト神経芽細胞腫細胞系はある値域のヒトＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを発現する が、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現は、ごく僅かな例外（小細胞肺癌や数種類の神経 上皮腫なと）を除いて神経芽細胞腫に特有のよってある。こうした結果は、ＩＩ ＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現がヒトの神経芽細胞腫に対して臨床的に有用なマーカー となり得ることを示唆している。現在までの神経芽細胞腫に対する臨床上の最良 のマーカーはＮ−ｍｙｃの増幅であり、Ｎ−ｍｙｃが後期の全神経芽細胞腫（第 ■期及び第■期）の約３０％で増幅されるにすぎないとすると、ＢＤＮＦ　ｍＲ ＮＡの発現は前期及び後期いずれの神経芽細胞腫に対してもより有用で広範囲に わたる臨床マーカーとなり得る。

３°−ＡＳ−ＢＤＮＦ　（配列番号：５）及びＰＳ−ＡＳ−ＢＤＮＦ　（配列番 号＝３）・　のオリゴヌクレオチドは、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡを発現するヒトの神 経芽細胞腫細胞に対してのみ、細胞増殖抑制作用と細胞毒性作用がある。

この結果は、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡに陽性の神経芽細胞腫が自己の増殖と生存のた めにＢＤＮＦのオートリリンループを要求することを暗示している。我々の結果 は、アンチセンスＢＤＮＦオリゴヌクレオチドによる処理で、少なくとも一部の 神経芽細胞腫を効果的かつ特異的に死滅させ得ることを示唆している。

一部の神経芽細胞腫細胞系は、［１ＤＮＦ、　ＮＧＦ　、　ＮＴ−３のいずれか の添加によって、アンチセンスＢＤＮＦオリゴヌクレオチドの細胞毒性作用から 効果的に救出することができる。

実施例２ 小細胞肺癌腫瘍に対するオートリリン生存因子としてのＢＤＮＦの潜在的役割を 考察するため、我々はノーサンブロッティング法を利用して何種類かの小細胞肺 癌細胞系におけるＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現を調べた。

６種類の異なる小細胞肺癌細胞系から調製した全ＲＮＡ試料は、いずれも国立衛 生研究所（Ｎｌｌ（）のＪｉｍ　ｌ１ａｔｔｅｙ博士の研究室から供与された。

図４に示した細胞系は、Ｈ８２（第２レーン）　、＋４２０９（第３レーン）　 、Ｈ３４５（第４レーン）　、１１３７８　（第５レーン）、Ｈ５１０（第６レ ーン）　、　Ｈ４１７（第７レーン）であった。これらの細胞系のＲＮＡ各ｌＯ μｇを用いてノーザンブロッティングを行ない、［１ＯＮＦ　ｍＲＮＡのレベル を成熟したラットの脳（第ル−ン）と直接比較した。我々は、６種類の小細胞肺 癌がいずれも何らかのＢＤＮＦｍＲＮＡを発現することを認めた。以前に組織と 神経芽細胞腫細胞系で実証されたように［Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１　（１９９０）］　、２つの転写物が検 出された。小細胞肺癌細胞系Ｈ３７８（第５レーン）は特別に高いレベルのＢＤ ＮＦ　ｍＲＮＡを発現し、そのレベルは成熟したラットの脳（第ル−ン）に発現 した値のほぼ２−３倍であった。

実施例１．２．て述べたように調製したアンチセンスＢＤＮＦヌクレオチドを、 ｉｎ　ｖｉｔｒｏで５ＣＬＣ細胞（Ｈ３４５及び＋１３７８）の培養物に直接地 に添加したアンチセンスもしくはセンスオリゴヌクレオチドの濃度は０．１−５ ０μＭであった（図８）。それぞれのオリゴヌクレオチドと共に４時間培養した のち、ＩＴｓ補足液（インシュリン、トランスフェリン、セレン）を細胞培地の ウェルに添加し、オリゴヌクレオチド添加９６時間後に細胞の生存力を評価した 。トリパンブルー染色によりウェルを二重に検定した。図９に示したように、Ｈ ３４５（８Ａ）と１１３７８　（８Ｂ）は、いずれも３°アンチセンスＢＤＮＦ （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５　）オリゴヌクレオチドの細胞毒性作用にきわめて敏 感であったが、５゛アンチセンスないしセンスオリゴヌクレオチドにはそのよう な感受性を示さなかった。

２．３．　ＢＤＮＦを発現する５ＣＬＳ細胞は細胞培養系への［１ＤＮＦの同時 添加により３’−ＡＳ−ＢＤＮＦオリゴヌクレオチドの細胞毒性作用から選択的 に救出される 図９　（ＡとＢ）は、＋１３４５及びＩＩ　３７８の５ＣＬＣ細胞培養液にＢＤ ＮＦ　（１００ｎｇ／ｍｌ、それぞれのニューロトロフィン遺伝子を移入したＣ １（０細胞から得たもの）と３’　−ＡＳ−ＢＤＮＦ　（配列番号＝５）のオリ ゴヌクレオチドを同時に添加した場合の同時添加実験の結果を示している。

図９で明らかなように、ＢＤＮＦの同時添加によっていずれの細胞系も救出され ている。

２．１．結論 ヒトの神経芽細胞腫に加えて、５ＣＬＣ細胞系も何らかのレベルのヒトＢＤＮＦ 　ｍＲＮＡを発現する。こうした結果は、ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡの発現が臨床的に ５ＣＬＣの有用なマーカーとなり得ることを示唆している。

３°−Ａｓ−ＢＤＮＦ　（配列番号：５）とＰＳ−ＡＳ−ＢＤＮＦ　（配列番号 ＝３）のオリゴヌクレオチドは、試験を行なったいずれの５ＣＬＣ細胞系に対し ても細胞増殖抑制作用及び細胞毒性作用を有していた。この結果は、ＢＤＮＦ　 ｍＲＮＡ陽性の５ＣＬＣ細胞系が自己の増殖と生存のためにＢＤＮＦのオートリ リンループを要求すること、そのような細胞はアンチセンスなｆｌＩ）ＮＦオリ ゴヌクレオチドによる処置で効果的に死滅させ得ることを示唆している。

Ｋ２５２ａに神経栄養素が媒介する細胞反応を特異的に遮断する働きがあること を確認するため、我々は、構造的に関連性のある３種類のプロティンキナーゼ阻 害剤に２５２ａ　（ミクロバクテリウム属のノカルジオブシス種から分離）、ス タウロスポリン（ストレプトミセス種から分離）もしくはＨ−７（１−（５−イ ソキノリンスルフォニル）−２−メチルビペリジンニ塩酸塩）の非存在下又は存 在下でＰＣ−１２細胞を神経成長因子（ＮＧＦ）もしくは線維芽細胞成長因子（ ＦＧＦ）で刺激しておき、刺激を受けたＰＣ−１２細胞から調製した総蛋白溶解 液のチロシンリン酸化プロフィールを調べた。

我々は、キナーゼ阻害剤のに２５２ａ、スタウロスポリンもしくはＨ−７で予め １５分間処理し、その後ＮＧＦもしくはＦＧＦを５分間投与したＰＣ−１２細胞 から調製した総溶解液中におけるチロシンのリン酸化を比較した。ＰＣ−１２細 胞は、血清含有培地（６％ウマ血清、６％ウシ血清、１％グルタミン、１％ペニ シリン、１％ストレプトマイシンを補足したＤＭＥ）の入っている１００ｍｍの 組織培養皿で約７０％の集密度に生育させた。同様の培地に成長因子と阻害剤を 入れて希釈し、２００マイクロリツトルに等分して細胞に投与した。

培養後、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝溶液を用いて ４℃で２回細胞を洗浄した。洗浄に用いた緩衝液を完全に吸引したのち、補足し たＲＩＰＡ緩衝液（カルシウムとマグネシウムは含まないが、１％ＮＰ４０　、 ０．５％Ｉ）ＱＣ，０，１％ＳＤＳ。

ＩｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、ｌ　ｍＭ　ＰＭＳＦ　、アプロチニン０゜ １４　ＴＩＵ／ｍｇを含有するリン酸緩衝溶液）５００マイクロリツトルを用い て細胞を溶解させた。細胞を溶解させるため、Ｖａｒｉミキサーを用い４℃で１ ５分間プレートを混合した。細胞の溶解液は２．２ｍｌのエッペンドルフ管に移 し、４℃で１５分間微量遠心した。滅菌したつま楊子を用い氷上でペレットを取 り除き捨てた。総溶解液に相当する上清を５×蛋白負荷染料によりｌ×とした。

溶解液を９５℃で３−５分間煮沸し、１０％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｔｏｎ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移してから、ｌ：１ ０００の抗ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ）を加えた。　１２５Ｉで標識したヤギ 抗マウスＩｇＧ　１マイクロリットル／ｍｌを用いてオートラジオグラフィーに よる検出を行なった（ＳＡ＝］３μＣ／ｍｌ）。

ゲル電気泳動後に得たオートラジオグラフを分析したところでは、未処理のＰＣ −１２細胞と比較したときに、０．０１％もしくは０．０２％のＤＭＳＯは細胞 に対する毒性作用がなく、またリン酸化のパターンも変えなかった。さらに、阻 害剤のみ［１１００ｎ及び２００ａＭのに２５２ａ　、　１１００ｎスタウロス ポリンならびに２５μＭ　ｌｌ−７］で処理した細胞、成長因子のみ［１１００ ｎ／ｍｌ　ＮＧＦ　；　１０．５０．１００及び２００ａｇ／ｍｌ　ＦＧＦ］で 処理した細胞、阻害剤［１１００ｎ及び２００ａＭ　Ｋ２５２ａ　、　１１００ ｎスタウロスポリン、２５マイクロモルＨ−７］で予め処理した後にＮＧＦ　１ １００ｎ／ｍｌを投与した細胞と、阻害剤［１１００ｎ及び２００ａＭ　Ｋ２５ ２ａ　、１１００ｎスタウロスポリン、２５マイクロモルＨ−７］で予め処理し 、その後にＦＧＦ　５０％ｇ／　ｍｌを投与した細胞のそれぞれの試料について 電気泳動を行なった。阻害剤は、製造業者からＤＭＳＯ中に再懸濁しておき、０ ．０２％を超えない最終濃度で細胞に加えた。

未処理の対照と比較すると、ＰＣ１２細胞にＮＧＦ（ｌｏＯｎｇ／ｍｌ）を５分 間投与した場合には、ＥＲＫＩ　Ｃ４３ｋｄ）及びＥＲＫ２　（４１ｋｄ）の速 やかなチロシンリン酸化が生じ、ＴｒｋＡレセプターと考えられる高分子量の蛋 白（１４０ｋｄ）が認められた。

１１０−１Ｏ０ｎ／ｍｌ　ＦＧＦでＰＣ１２細胞を刺激した場合には、ＥＲＫ２ のチロシンリン酸化が検出されたが、２００ａｇ／ｍｌ　ＦＧＦで刺激するとこ の作用は抑制された。阻害剤のみもしくはＤＭＳＯ（ビヒクル対照）で処理した 場合には、リン酸化のプロフィールは影響を受けなかった。Ｈ−７はＮＧＦもし くはＦＧＦのいずれの信号変換経路も遮断しなかった。重要なことは、スタウロ スポリンとに２５２ａが、ＴｒｋＡ、ＥＲＫＩ及びＥＲに２のチロシンリン酸化 の低減において示されたように、ＮＧＦの経路は遮断したが、ＦＧＦ経路は、Ｅ ＲＫ２のリン酸化が対照レベルに留まっていたところからみて遮断されなかった ということである。

結論として、我々は、ＮＧＦとＦＧＦが、スタウロスポリンおよびに２５２ａの ＮＧＦ媒介反応の特異性によって識別される、独立した信号変換経路を通して、 ＰＣｌ３における早期の細胞反応を刺激することを観察した。

実施例４ に２５２ａの作用がＢＤＮＦの信号変換経路も遮断し得るかどうかを決定するた め、我々は機能的なｔｒｋＢレセプターを発現する３Ｔ３細胞を遺伝子操作によ り作製した。我々は以前に、ｔｒｋＢを発現するこれらの３７３細胞の規定培地 における生存と増殖とが、ＢＤＮＦに依存することを実証している［Ｄ、　Ｊ、 　Ｇｌａｓｓら、Ｃｅ１１．６６：４０５−４１３（１９９１）］。ｔｒｋＢを 発現する３Ｔ３細胞には、ＰＣＩ２細胞の検定に用いたものと同様の阻害剤を投 与した。

我々は、実施例３て使用した阻害剤で１５分間事前に処理してからＢＤＮＦ　１ １００ｎ／ｍｌを５分間投与した神経芽細胞腫（Ｎ１８７Ｇ２）細胞及びｔｒｋ Ｂ発現３Ｔ３細胞の、総溶解液におけるチロシンリン酸化を比較した。我々は、 実施例３て記述したように、抗ホスホチロシン抗体を用いて溶解液を処理し、免 疫プロッティングを行なった。

未処理の細胞とＢＤＮＦで処理した細胞からの溶解液を、阻害剤［２５ｍｉｃｒ ｏＭ　Ｉｔ−７、＋００ｎＭ　Ｋ２５２ａ及びｌｏＯｎＭスタウロスポリン］の みて予め処理しておいた細胞と、阻害剤［２５ｍｉｃｒｏＭ　Ｉｆ−７、ｔｏｏ ｎＭ　Ｋ２５２ａ及び１１００ｎスタウロスポリン］で事前に処理した後にＢＤ ＮＦ　１１００ｎ／ｍ＋を投与した細胞とて比較した。

ＢＤＮＦて処理した３Ｔ３（オートクリン）細胞と処理及び未処理の神経芽細胞 腫細胞（Ｎ１８７Ｇ２）の総蛋白溶解液から免疫沈降させた、自己リン酸化した ｔｒｋ［］レセプターの免疫プロットを図１Ｏに示した。

この結果は、これらの細胞へのＢＤＮＦの投与が、未処理の対照と比較して、ｔ ｒｋＢ及びＥＲＫ２の速やかなリン酸化をもたらしたことを示している。またチ ロシンのリン酸化パターンは、実施例３に掲げたＰＣ−１２細胞に関するデータ と同様、Ｋ２５２ａおよびスタウロスポリンによる細胞の事前の処理が、ＢＤＮ Ｆの刺激によるｔｒｋＢのチロシンリン酸化を阻止するが、ドアにはそのような 働きがないことを示している。チロシンリン酸化のプロフィールは阻害剤のみて は変わらないようであった。スタウロスポリンはＥＲＫ２のリン酸化を完全に阻 止したが、ｌｏＯｎＭのに２５２ａでは、ＥＲＫ２のチロシンリン酸化が依然と して容易に検出できた。１１００ｎのに２５２ａは２０のＰＣ−１２細胞てＥＲ ＫＩ及びＥＲＫ２のリン酸化の約５０％を阻止したことからすると、ＢＤＮＦに よるｔ　ｒｋＢレセプターのわずかな刺激（本検定では検出できなかった）でも 細胞内反応を十分伝達できるかもしれない。

ｔｒｋＢを発現する３Ｔ３細胞について我々の知見は、Ｋ２５２ａが、ＢＤＮＦ に反応してｔｒｋＢレセプターのリン酸化と活性化を抑制することにより、ＢＤ ＮＦのオートクリン生存ループを破壊し得ることを示している。我々は、４種類 のヒト神経芽細胞腫細胞系と、３７３線維芽細胞のモデル細胞系、小細胞肺癌細 胞系（ＮＣＩ−Ｈ６９−１−１）、肺の腺癌細胞系（Ｃａｌｕ−３）を用いて、 この仮説を検証した。

この研究のために選択した３Ｔ３細胞系は、血清を含まない規定培地での生存を ＦＧＦに依存している。我々は以前に、ｔ　ｒｋＡを発現する３Ｔ３細胞がＮＧ Ｆを補足した規定培地で生存し、ｔｒｋＢを発現する３Ｔ３細胞がＢＤＮＦを補 足した規定培地で生存することを実証している　［ＧＩａ’ｓｓ　ら、Ｃｅ１ｌ 　６６：４０５−４１３（１９９１）コ。ｔｒｋＢとＢＤＮＦの双方を発現する ３Ｔ３細胞は、規定培地のみで生存し、オートクリン生存のための有用なモデル 細胞系となり、ヒトの神経芽細胞腫細胞系とよく似ている。神経芽細胞腫細胞系 のうち、ＬＡ−Ｎ−５細胞と５Ｋ−Ｎ−ＬＯ細胞はいずれもＢＤＮＦ　ｍＲＮＡ を発現するが、５Ｈ−３Ｙ５Ｙ細胞と５Ｋ−ＥＳ細胞は、　ＢＤＮＦ　ｍＲＮＡ を発現しない。しかし、ｍＲＮＡレベルにおけるｒｔｋＢの発現はＬＡ−Ｎ−５ 細胞系で検出できたにすぎない。

プロティンキナーゼ阻害剤に２５２ａがヒトの神経芽細胞腫細胞、小細胞肺癌細 胞及びｔｒｋＢ発現３Ｔ３細胞の生存に及ぼす影響を調べるため、我々はグルコ ースの消費を基調とした細胞の生存力についての検定法を開発した。この検定法 の基礎的な原理は、生存力がある細胞はその増殖培地に与えたグルコースを代謝 するが、死んでいる細胞はグルコースを代謝しないという事実に由来している。

従って、増殖培地におけるグルコースの濃度は培地内の生存力がある細胞の数と 逆の関係にある。

ウェル当たり約２ＸｌＯ’の細胞密度て、２４ウエルからなるプレートに細胞を 播いた。ヒト神経芽細胞腫細胞、５ＣＬＣ細胞ならびに肺の腺癌細胞は、ウソ胎 児血清を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地て培養したが、３Ｔ３細胞は、適当な ニューロトロフィン（すなわち、５００ｐＭのＦＧＦ　、　ＢＤＮＦもしくはＮ ＧＦ）を含み血清を含まない規定培地で培養した［Ｇｌａｓｓら、収旦、上記参 照］　、　ｔｒｋＢ／ＢＤＮＦオートクリーン３Ｔ３細胞（ＭＢｘ）は規定培地 のみで培養した。すべての細胞培地は細胞を播いた時点て４５０ｍｇ／ｄｌのグ ルコースを含有していた。

細胞を播いた３６時間後にに２５２ａを０．１０．５０．１００．２５０．５０ ０．１０００、　２０００ｎＭの濃度で添加した（　ＤＭＳＯ中に可溶化した、 実施例１参照）。検定はすべて３回行なった。細胞の形態を視覚的に監視し、細 胞の生存力を培養６日後にグルコース消費についての検定により評価した。増殖 培地の５０μＩアリコートを血糖試験紙に移し、２分後にこれらの試験紙を血糖 監視装置で読み取ってグルコースの濃度（ｍｇ／ｄ　ｌ　）を測定した。

各細胞系で、各薬剤に対するＬＤ５゜を推定するため、読み取った血糖値を平均 してから、に２５２ａの濃度に対してプロットした。

表３は各細胞系のに２５２ａに対するＬＤ、。値を示したものである。

我々のデータ（図１１）は、Ｋ２５２ａがヒトの神経芽細胞腫細胞に対して細胞 破壊作用があり、このチロシンキナーゼレセプター阻害剤が、培養中自己の生存 のためにＢＤＮＦのオートクリンループを要求する神経芽細胞腫細胞（すなわち ５Ｋ−Ｎ−ＬＯ及びＬＡ−Ｎ−５細胞）に効果があることを実証している。例え ば、ＬＡ−Ｎ−５細胞は、Ｋ２５２ａの細胞破壊作用に対する感受性が５Ｋ−Ｂ Ｓや５Ｈ−３Ｙ５Ｙ細胞よりもそれぞれ約２０倍から１５０倍も強力である。５ Ｋ−Ｎ−ＬＯ細胞も、Ｋ２５２ａに対する感受性が５Ｋ−ＥＳや５Ｈ−３Ｙ５Ｙ に比べて（２，５倍から１９倍）強力である。５Ｋ−Ｎ−ＬＯ細胞も５Ｋ−ＥＳ や５Ｈ−３Ｙ５Ｙ細胞よりもに２５２ａに対して感受性である（２．５〜１９倍 ）。５Ｋ−Ｎ−ＬＯ細胞は明らかにｔｒｋＢを発現しないので、我々のデータは 、これらの細胞が独特のに２５２ａ感受性ｔｒｋ様ＢＤＮＦレセプターを発現し 得るか、その代わりに、これらの細胞で発現されるｔｒｋＢのレベルが検出限界 以下であることをも示唆している。さらに我々のデータは、Ｋ２５２ａのような プロティンキナーゼ阻害剤が小細胞肺癌細胞に対しては細胞破壊作用があるが、 肺の腺癌細胞に対しては細胞破壊作用がないことを実証している。Ｋ２５２ａが ３７３−オートクリン、神経芽細胞腫細胞（Ｎ１８ＴＧ２）　、小細胞肺癌（Ｎ ＣＴ−８６９）及び肺の腺癌細胞（Ｃａｌｕ−３）に及はす影響を比較したもの を図１２に示しである。

５Ｋ−ＥＳ　２００　ｎｍ　ＮＥ ３１１−３Ｙ５Ｙ　１５００　ｎｍ　ＮＥＬＳ−Ｎ−５１０ｎｍ　＜２５　ｎｍ ５Ｋ−Ｎ−ＬＯ８０ｎｍ　ＮＥ 線維芽細胞 ＭＢＸ　２５　ｎｍ ＭＧ８７　（＋ＦＧＦ）　１７５　ｎｍＭＧ８７　ｔｒｋＡ　（±ＮＧＦ）　３ ０　ｎｍＭＧ８７　ｔｒｋＢ　（＋ＢＤＮＦ）　３０　ｎｍ小細胞肺癌細胞 ＮＣｌ−Ｈ６９１００ｎｍ 肺腺癌細胞 ＣａＬｕ−３７５０ｎｍ ＭＧ８７細胞は生存のため規定培地てＦＧＦを要求する３Ｔ３細胞である。

ＭＧ８７　ｔｒｋＡ細胞はＮＧＦを要求する。

＼！Ｇ８７　ｔｒｋＢ細胞はＢＤＮＦを要求する。

ＮＥ−影響なし 我々は、規定培地での生存のためにニューロトロフィンを要求するｔｒｋレセプ ターキナーゼ発現３Ｔ３線維芽細胞（ＭＢｘ　、　ＭＧ８７　ｔｒｋＡ及びＭＧ ８７　ｔｒｋＢ）に対するに２５２ａとスタウトスポリンの効果が、ＦＧＦを補 足した規定培地で生存する親３Ｔ３細胞（ＭＧ８７）に対する効果より（約６倍 ）強力であることも明らかにしている。トランスフェクションを行なった３Ｔ３ 細胞についてのこうしたデータは、Ｋ２５２ａとスタウロスポリンの細胞破壊作 用がＦＧＦレセプターチロシンキナーゼと比べてｔｒｋレセプターファミリーに 対して顕著であるという確信を抱かせる。さらに、我々のデータは、Ｋ２５２ａ が神経栄養素／ｌｒｋ受容体の信号変換経路を選択的に破壊するという仮説と、 Ｋ２５２ａとスタウロスポリンとがｔｒｋＢ／ＢＤＮＦのオートクリン生存ルー プを効果的に阻害するという仮説を裏付けるものとなる。

最後に我々は、Ｋ２５２ａの濃度を約２５ｎＭ以下にすると、培養４−５日頃に ＬＡ−Ｎ−５神経芽細胞腫細胞において顕著な抗増殖作用と神経突起の有意な伸 長とが検出できることを観察した。こうした形態の変化は、ＬＡ−Ｎ−５細胞の 分化をＮＧＦが誘導することを思い起こさせる。低濃度のに２５２ａについての こうした観察は、この薬剤がｔｒｋレセプターの信号変換経路の部分的な作動薬 として機能し得ることを示唆している。

ここに記述したように、我々は、Ｋ２５２ａが神経栄養素／【「にレセプター信 号変換経路の重要な選択的拮抗剤となり得ること、そしてそれゆえに、ＢＤＮＦ のオートクリン生存ループに依存する神経由来の腫瘍細胞を死滅させる上で、潜 在的な治療上の有用性があり得ることを明らかにした。我々は、ＢＤＮＦを発現 する他の癌細胞系かに２５２ａから同様の影響を受けるだろうと予想している。

例えば、神経上皮腫の中にはに２５２ａや他のプロティンキナーゼ阻害剤によっ て有害な作用を受けるものがあると予想される。

本発明の特定の実施例を特に記述したが、多くの修正と変更が可能なことは当業 者に明らかであろう。従って、本発明は、ここに示した特性の実施例によって限 定されると解釈してはならず、その範囲は以下の請求の範囲によってのみ定義さ れるものとする。

寄託 以下に記載した細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｅｉｔｏｎ、　１２３０ １　Ｐａｒｋｌａｗ。

Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２）に寄託 されている。

寄託物　受託番号 Ｂｘ 配列表 （１）一般情報： （ｉ）　出願人：　５ｑｕｉｎｔｏ、　５ｔｅｐｈｅｎ　Ｐ。

ＹａｎＣＯｐＯｕｌＯ８，Ｇｅｏｒｇｅ　Ｄ。

Ｎｙｅ、　５ｔｅｖｅｎ　Ｈ。

（ｉｉ）　発明の名称二ニューロトロフィン活性の抑制方法（ｉｉｉ）配列の数 ：６ （ｉｖ）　通信宛先 （Ａ）住所：　Ｈｏｗｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈｏｗｓｏｎ（Ｂ）通り：　３２１　Ｎ ｏｒｒｊｓｔｏｗｎ　Ｒｏａｄ、Ｂｏｘ　４５７（Ｃ）都市：　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈｏｕｓｅ（Ｄ）州：ＰＡ （Ｅ）国：Ｕ、Ｓ、Ａ。

（Ｆ）郵便番号：　１９４７７ （Ｖ）　コンピュータ読み取り形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣ互換機（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−００ ５／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔ　Ｉｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ 　＃１．０Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５ （ｖｉ）　現在の出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先行出願データ： （２）配列番号＝５の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）　配列の種類：ｃＤＮＡ （ｘｉ）　配列の記載：配列番号：５：ＣｒＡＴＣＣＣ：ＣｒＴ　ＴｒＡＡＴＧ ＧＴ（２）配列番号＝６の情報： （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー水路 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）　配列の種類：ｃＤＮＡ （ｘｉ）　配列の記載：配列番号：６：ＴｒＧＡＣＣＡＴｒＡ　ＡＡＡＧＧＧＧ Ａオリゴ　対照　５°−８５°−３ＰＳ−ＡＳ　３″−ＡＳ［オリゴ］（μＭ） ０　１　６１　６１　６１　６１６０．１　０．５　１　５　１０　５０ ［オリゴ］（μＭ） 培養時間　ＦＩＧ、３Ｃ 培養時間 ＦＩＧ、　５Ａ ヒト神経芽細胞腫 Ａ、未処理 ＦＩＧ、　６Ａ Ｃ，センス Ｄ、アンチセンス　＋ＢＤＮＦ ■（／：◇ｑ ゛　發馴 發−４／：◇ｑ 凋剛餠 ■−１ｆ、、１ ■Ｉｉｉ＆哨 ロ （％＊〃玉） 車桝￥カ手’ｒ　−ｃ　４ｔ、４ （％＊ガニ） ぷ＠ｑｋ羊Ｍ−ｃ４ｔ（。

０　１００　２００　：１ＯＯ ＦＩＧ、９Ａ　［オリゴコ　μＭ ＦＩＧ、９Ｂ　［オリゴ］μＭ ［０１ｉｇｏｌ　ｕＭ ＦＩＧ、９Ｃ に−２５２ａ　［ｎＭ］ ■　ＮＣｌ−Ｈ６９ ［コ　３Ｔ３（オートクリン） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７１０２　 ８３１４−４Ｃ４８１００８３１４−４Ｃ Ｃ１２Ｎ　５／１０ １５／１１　ＺＮＡ ／／　Ａ６１　Ｋ　３７／２４　８３１４−４Ｃ（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、 ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、Ｃ３，ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎｏ、ＲＵ （７２）発明者　ニー、ステイーブン　エイチ。

アメリカ合衆国　１０１２８　ニューヨーク州ニューヨーク、アパートメント　 ３イ ー、イースト　９０テイーエイチ　ストリート　４２３ （７２）発明者　ヤンコパウロス、ジョージ　ディー。

アメリカ合衆国　１０５１０　ニューヨーク州プライアークリフ　メイナー、ス リーピー　ホロー　ロード　４２８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脳誘導神経栄養因子遺伝子の発現により特徴づけられる腫瘍型の腫瘍を有す る患者を治療する方法であって、該患者に有効量のオリゴヌクレオチドを投与す ることから成り、該オリゴヌクレオチドが（ａ）少なくとも６個のヌクレオチド から成り、（ｂ）脳誘導神経栄養因子遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に 相補的な配列を含み、そして（ｃ）該ＲＮＡ転写物にハイブリダイズすることが できるものである、上記方法。 ２．前記患者がヒトであり、脳誘導神経栄養因子遺伝子がヒト遺伝子である、請 求項１記載の方法。 ３．前記腫瘍が神経芽細胞腫である、請求項１記載の方法。 ４．前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項１記載の方法。 ５．前記腫瘍が神経芽細胞腫である、請求項２記載の方法。 ６．前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項２記載の方法。 ７．オリゴヌクレオチドが少なくとも１８個のヌクレオチドから成る、請求項２ 記載の方法。 ８．オリゴヌクレオチドが少なくとも１８個のヌクレオチドから成る、請求項５ 記載の方法。 ９．オリゴヌクレオチドが少なくとも１９個のヌクレオチドから成る、請求項６ 記載の方法。 １０．オリゴヌクレオチドが配列番号：３および配列番号：５より成る群から選 ばれる、請求項８記載の方法。 １１．オリゴヌクレオチドがＡｒｇ−Ｌｙｓプロセシング部位をコードするコド ンを含む脳誘導神経栄養因子ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、請求項２記載 の方法。 １２．オリゴヌクレオチドがＡｒｇ−Ｌｙｓプロセシング部位をコードするコド ンを含む脳誘導神経栄養因子ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、請求項５記載 の方法。 １３．オリゴヌクレオチドがＡｒｇ−Ｌｙｓプロセシング部位をコードするコド ンを含む脳誘導神経栄養因子ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、請求項６記載 の方法。 １４．オリゴヌクレオチドが脳誘導神経栄養因子ＲＮＡの最後の６コドン内にあ る該ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、請求項２記載の方法。 １５．オリゴヌクレオチドが脳誘導神経栄養因子ＲＮＡの最後の６コドン内にあ る該ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、請求項５記載の方法。 １６．オリゴヌクレオチドが脳誘導神経栄養因子ＲＮＡの最後の６コドン内にあ る該ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、請求項６記載の方法。 １７．オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項 ２記載の方法。 １８．オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項 ５記載の方法。 １９．オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項 ６記載の方法。 ２０．オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾塩基成分を有する、請求項１ ７記載の方法。 ２１．オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾糖成分を有する、請求項１７ 記載の方法。 ２２．オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の修飾ホスフェート主鎖を有する、 請求項１７記載の方法。 ２３．少なくとも６個のヌクレオチドから成り、そして脳誘導神経栄養因子遺伝 子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、該ＲＮＡ転写物にハ イプリダイズすることができる、単離されたオリゴヌクレオチド。 ２４．脳誘導神経栄養因子遺伝子がヒト遺伝子である、請求項２３記載のオリゴ ヌクレオチド。 ２５．少なくとも１８個のヌクレオチドから成る、請求項２４記載のオリゴヌク レオチド。 ２６．配列番号：３および配列番号：５より成る群から選ばれる、請求項２５記 載のオリゴヌクレオチド。 ２７．Ａｒｇ−Ｌｙｓプロセシング部位をコードするコドンを含む脳誘導神経栄 養因子ＲＮＡの一部に相補的な配列を含む、請求項２４記載のオリゴヌクレオチ ド。 ２８．脳誘導神経栄養因子ＲＮＡの最後の６コドン内にある該ＲＮＡの一部に相 補的な配列を含む、請求項２４記載のオリゴヌクレオチド。 ２９．少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２４記載のオリゴヌク レオチド。 ３０．少なくとも１個の修飾塩基成分を有する、請求項２９記載のオリゴヌクレ オチド。 ３１．少なくとも１個の修飾糖成分を有する、請求項２９記載のオリゴヌクレオ チド。 ３２．少なくとも１個の修飾ホスフェート主鎖を有する、請求項２９記載のオリ ゴヌクレオチド。 ３３．請求項２３のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ３４．請求項２４のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ３５．請求項２５のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ３６．請求項２６のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ３７．請求項２７のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ３８．請求項２８のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ３９．請求項２９のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ４０．請求項３０のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ４１．請求項３１のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ４２．請求項３２のオリゴヌクレオチド、および製剤上許容される担体を含有す る医薬組成物。 ４３．脳誘導神経栄養因子をコードする核酸配列またはその一部の細胞における 発現を阻止する方法であって、該細胞に有効量の請求項２３のオリゴヌクレオチ ドを与えることから成る、上記方法。 ４４．脳誘導神経栄養因子をコードする核酸配列またはその一部の細胞における 発現を阻止する方法であって、該細胞に有効量の請求項２４のオリゴヌクレオチ ドを与えることから成る、上記方法。 ４５．脳誘導神経栄養因子遺伝子の発現により特徴づけられる腫瘍型の腫瘍の患 者における存在を診断する方法であって、腫瘍細胞である疑いのある患者細胞に おいて脳誘導神経栄養因子遺伝子の発現を検出することから成り、該発現が脳誘 導神経栄養因子ＲＮＡまたはタンパク質の産生を検出することにより検出される 、上記方法。 ４６．前記腫瘍が神経芽細胞腫である、請求項４５記載の方法。 ４７．前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項４５記載の方法。 ４８．脳誘導神経栄養因子レセプターを発現する細胞の同定方法であって、 （８）該細胞をｉｎｖｉｔｒｏで（ｉ）細胞毒性量の請求項２３のオリゴヌクレ オチド、および（ｉｉ）適量の脳誘導神経栄養因子にさらし；そして （ｂ）該細胞の生存を検出する； ことから成り、その際、該オリゴヌクレオチドと該脳誘導神経栄養因子の両方の 存在下での細胞の生存が該細胞による脳誘導神経栄養因子レセプターの発現を示 すものである、上記方法。 ４９．ニューロトロフィン−３レセプターを発現する細胞の同定方法であって、 （ａ）該細胞をｉｎｖｉｔｒｏで（ｉ）細胞毒性量の請求項２３のオリゴヌクレ オチド、および（ｉｉ）適量のニューロトロフィン−３にさらし；そして （ｂ）該細胞の生存を検出する； ことから成り、その際、該オリゴヌクレオチドとニューロトロフィン−３の両方 の存在下での細胞の生存が該細胞によるニューロトロフィン−３レセプターの発 現を示すものである、上記方法。 ５０．神経成長因子レセプターを発現する細胞の同定方法であって、（３）該細 胞をｉｎｖｉｔｒｏで（ｉ）細胞毒性量の請求項２３のオリゴヌクレオチド、お よび（ｉｉ）適量の神経成長因子にさらし；そして（ｂ）該細胞の生存を検出す る； ことから成り、その際、該オリゴヌクレオチドと神経成長因子の両方の存在下で の細胞の生存が該細胞による神経成長因子レセプターの発現を示すものである、 上記方法。 ５１．有効量の、ＢＤＮＦオートクリン生存ループを妨げることができる物質を 投与することから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法 。 ５２．ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞に有効量の請求項２３のオリゴヌクレオチドを投与 することから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞においてＢＤＮＦオートクリンループ を妨げる方法。 ５３．ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞に有効量のＫ２５２ａまたはその誘導体を投与する ことから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞においてＢＤＮＦオートクリンループを妨 げる方法。 ５４．ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞に有効量のチアゾリジン−ジオンまたはそれらの誘 導体を投与することから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞においてＢＤＮＦオートク リンループを妨げる方法。 ５５．腫瘍上のＢＤＮＦレセプターのリン酸化および活性化を阻止する医薬組成 物を投与することから成る、ＢＤＮＦで刺激される腫瘍の増殖を抑制する方法。 ５６．医薬組成物がＫ２５２ａまたはその誘導体を含有する、請求項５５記載の 方法。 ５７．医薬組成物がチアゾリジンジオンまたはそれらの誘導体を含有する、請求 項５５記載の方法。 ５８．脳誘導神経栄養因子の発現により特徴づけられる型の腫瘍を有する哺乳動 物を治療する方法であって、該哺乳動物に薬学的に有効な量のＫ２５２ａまたは その誘導体を含有する薬学的に許容される組成物を投与することから成る、上記 方法。 ５９．哺乳動物がヒトである、請求項５８記載の方法。 ６０．前記腫瘍が神経芽細胞腫である、請求項５８記載の方法。 ６１．前記腫瘍が神経上皮腫である、請求項５８記載の方法。 ６２．前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項５８記載の方法。 ６３．Ｋ２５２ａを少なくとも１種の他の化学療法剤と共に投与する、請求項５ ８記載の方法。 ６４．化学療法剤が請求項２３のオリゴヌクレオチドである、請求項６３記載の 方法。 ６５．化学療法剤が代謝拮抗薬、アルキル化剤、ツルニチニチソウ（ｖｉｎｃａ ）アルカロイド、抗腫瘍性の抗生物質、白金誘導体、置換尿素、アドレノコルチ コステロイド、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロンおよび抗体 より成る群から選ばれる、請求項６３記載の方法。 ６６．活性成分として、薬学的に有効な量のＫ２５２ａを、製剤上の担体、希釈 剤、賦形剤およびアジュバントより成る群から選ばれる少なくとも１種の物質と 共に含有する、ＢＤＮＦ発現腫瘍を治療するための薬学的に許容される組成物。 ６７．経口、非経口、直腸または局所投与に適した、請求項６６記載の組成物。 ６８．代謝拮抗薬、アルキル化剤、ツルニチニチソウアルカロイド、抗腫瘍性の 抗生物質、白金誘導体、置換尿素、アドレノコルチコステロイド、サイトカイン 、インターロイキン、インターフェロンおよび抗体より成る群から選ばれる少な くとも１種の他の化学療法剤をさらに含む、請求項６６記載の組成物。 ６９．Ｋ２５２ａまたはその誘導体を２５ｎＭ未満の用量範囲で投与することか ら成る、ｔｒｋＢレセプターを発現する腫瘍細胞において神経突起の成長を刺激 する方法。 ７０．有効量の請求項２３のオリゴヌクレオチドを投与することから成る、ＢＤ ＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法。 ７１．有効量の請求項２４のオリゴヌクレオチドを投与することから成る、ＢＤ ＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法。 ７２．有効量の請求項２５のオリゴヌクレオチドを投与することから成る、ＢＤ ＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法。 ７３．有効量の請求項２６、２７または２８のオリゴヌクレオチドを投与するこ とから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法。 ７４．有効量の請求項２９、３０または３１のオリゴヌクレオチドを投与するこ とから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法。 ７５．有効量の請求項３２のオリゴヌクレオチドを投与することから成る、ＢＤ ＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法。 ７６．ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞に有効量のＫ２５２ａまたはその誘導体を投与ずる ことから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方法。 ７７．ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞に有効量のチアゾリジン−ジオンまたはその誘導体 を投与することから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞において細胞死を引き起こす方 法。 ７８．前記腫瘍が神経芽細胞腫である、請求項５１記載の方法。 ７９．前記腫瘍が神経芽細胞腫である、請求項７０記載の方法。 ８０．前記腫瘍が神経芽細胞腫である、請求項７３記載の方法。 ８１．前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項５１記載の方法。 ８２．前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項７０記載の方法。 ８３．前記腫瘍が小細胞肺癌である、請求項７３記載の方法。 ８４．細胞増殖を抑制することができるか、または細胞死を引き起こすことがで きる物質の同定方法であって、（ａ）第１および第２細胞を物質にさらし、ここ で該第１細胞は神経栄養因子の組換えレセプターを発現し、かつ第１細胞の生存 が神経栄養因子の存在に依存し、そして第２細胞は第１細胞と同じ細胞型である が、該第２細胞は組換えレセプターを発現せず、かつ生存に関して神経栄養因子 の存在に依存せず；そして （ｂ）該物質の存在下での第２細胞の増殖または生存と比較して、該物質および 神経栄養因子の存在下での第１細胞の増殖または生存の低減を検出する； ことから成り、その際、前記低減が細胞増殖を抑制するかまたは細胞死を引き起 こす該物質の能力を示すものである、上記方法。 ８５．神経栄養因子がＢＤＮＦである、請求項８４記載の方法。 ８６．前記第１および第２細胞の型が線維芽細胞である、請求項８４記載の方法 。 ８７．前記線維芽細胞がＮＩＨ３Ｔ３細胞である、請求項８５記載の方法。 ８８．前記神経栄養因子が外因的添加により存在する、請求項８４記載の方法。 ８９．前記神経栄養因子が細胞による内因的生産により存在する、請求項８４記 載の方法。 ９０．ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞を薬学的に有効な量の請求項８４の方法により同定 された物質で処理することから成る、ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞の増殖を抑制するか またはその細胞死を引き起こす方法。 ９１．ＢＤＮＦ発現腫瘍細胞の増殖を抑制するかまたはその細胞死を引き起こす 方法に使用するための、請求項２３のオリゴヌクレオチドを含有する組成物。 ９２．ＢＤＮＦレセプターを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制するかまたはその細 胞死を引き起こす医薬を調製するための、Ｋ２５２ａまたはその誘導体、スタウ ロスポリンまたはその誘導体、もしくはチアゾリジンジオンまたはその誘導体を 含有する組成物の使用。 ９３．神経栄養因子をコードする組換え核酸および該因子のレセプターをコード する組換え核酸を含み、無血清培地で生存することができる細胞系。 ９４．前記神経栄養因子がＢＤＮＦ、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、ニュ ーロトロフィン−３およびニューロトロフィン−４より成る群から選ばれる、請 求項９３記載の細胞系。 ９５．前記神経栄養因子がＢＤＮＦである、請求項９３記載の細胞系。 ９６．前記レセプターがｔｒｋＢである、請求項９５記載の細胞系。 ９７．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号＿として寄託 された細胞系ＭＢｘ。 ９８．前記第１細胞の型がＭＢｘである、請求項８４記載の方法。