BRPI0618284A2 - derivado de pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il usado como inibidores de pde5 - Google Patents

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Abstract

DERIVADO DE PIRAZOLO-[4,3-D]-PIRIMIDIN-5-IL USADO COMO INIBIDORES DE PDE5 A presente invenção compreende (1) ácido 1-(l-(2- etóxi-etil) -3-etil-7- (4-metil-piridin-2-il-amino) -1H-pirazolo- 14, 3-d] -pirimidin-5-il) -piperidino-4-carboxílico e seus sais. A invenção compreende ainda composições farmacêuticas, métodos de tratamento e métodos de síntese referentes à Fórmula (1).Fórmula (1) é usado para inibir a enzima PDE5.

Description

"DERIVADO DE PIRAZOLO-[4,3-D]-PIRIMIDIN-5-IL USADOCOMO INIBIDORES DE PDE5"
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se genericamente aoácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-lH-pirazolo-[4,3-d]^pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxilico e seus sais. A presente invenção refere-se aindaa composições farmacêuticas que compreendem este composto ouseus sais, métodos de tratamento que empregam este compostoou seus sais, e métodos para preparar este composto ou seussais. Genericamente, o composto e seus sais inibem a enzimafosfodiesterase tipo 5 ("PDE5") especifica de guanilatomonofosfato cíclico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A hipertensão é uma condição associada com, dentreoutros problemas fisiológicos, maior risco de acidentevascular cerebral, infarto do miocárdio, fibrilação atrial,insuficiência cardíaca, doença vascular periférica, einsuficiência renal. Apesar dos inúmeros fármacosdisponíveis em várias categorias farmacológicas para tratarhipertensão e problemas fisiológicos relacionados, nem todosos pacientes respondem a esses fármacos tão eficazmente outão seguramente conforme desejado. Agentes terapêuticosadicionais para o tratamento de hipertensão e/ou condiçõesrelacionadas ainda são necessários.
Uma classe de agentes terapêuticos relatada naliteratura como útil para o tratamento de hipertensão sãoinibidores da enzima PDE5 ("inibidores de PDE5").Genericamente, as células endoteliais vasculares secretamóxido nitrico que atua sobre as células do músculo lisovascular e leva à ativação de guanilato ciclase e ao acúmulode monofosfato de guanosina cíclico ("cGMP"). A acumulaçãode cGMP faz com que os músculos relaxem e os vasossangüíneos dilatem, levando a uma redução na pressãosangüínea. 0 cGMP é inativado por hidrólise para 5'-monofosfato de guanosina ("GMP") por fosfodiesterasesespecíficas de cGMP. Uma cGMP-fosfodiesterase envolvida nainativação de cGMP é a enzima PDE5. Os inibidores da enzimaPDE5 diminuem a taxa da hidrólise de cGMP. Esta redução nahidrólise de cGMP potencializa as ações do óxido nitrico,levando a um abaixamento da pressão sangüínea.
Os compostos que são inibidores de PDE5 foramrelatados na literatura. Por exemplo, o documento n° WQ2005/049616 relata uma classe de compostos de pirazolo[4,3-d]-pirimidinila. O documento n2 WO 2005/049617 relata outraclasse de compostos de pirazolo[4,3-d]-pirimidinila. 0documento n° WO 2004/096810 relata outra classe de compostosde pirazolo[4,3-d]-pirimidinila. O documento n° EP 1348707relata outra classe de compostos de pirazolo[4,3-d]-pirimidinila.
A identificação de compostos adicionais que sãoinibidores de PDE5 é desejável. Tais compostos podem serusados para tratar indivíduos que sofrem ou são suscetíveisà hipertensão e/ou problemas fisiológicos relacionados, eexpandem ainda mais a faixa de opções de tratamentodisponíveis para tais indivíduos.SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em uma modalidade, a invenção compreende o ácido1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7- (4-metil-piridin-2-il-amino)-lH-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxíIicoe seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Em outra modalidade, a invenção compreende umacomposição farmacêutica que compreende o ácido 1— (1—(2 —etóxi-etil)-3-etil-7- ( 4-metil-piridin-2-il-amino)-IH-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxílico,ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, e um carreadorfarmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, a invenção compreende umacomposição farmacêutica que compreende o ácido 1— (1—(2 —etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-IH-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxílico,ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, um ou maisagentes terapêuticos adicionais, e um carreadorfarmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, a invenção compreende métodospara tratar uma condição em um indivíduo, administrando aoindivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7- ( 4-metil-piridin-2-il-amino)-IH-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxílico,ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. As condições quepodem ser tratadas de acordo com a presente invenção incluemcondições cardiovasculares, condições metabólicas, condiçõesdo sistema nervoso central, condições pulmonares, disfunçãosexual, dor e disfunção renal.Em outra modalidade, a invenção compreende métodospara tratar uma condição em um indivíduo, administrando aoindivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7- (4-metil-piridin-2-il-amino)-IH-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxílico,ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, um ou maisagentes terapêuticos adicionais, e um carreadorfarmaceuticamente aceitável. As condições que podem sertratadas de acordo com a presente invenção incluem condiçõescardiovasculares, condições metabólicas, condições dosistema nervoso central, condições pulmonares, disfunçãosexual, dor e disfunção renal.
Em outra modalidade, a invenção compreende o usodo ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino) - IH-pirazolo- [4, 3—d] -pirimidin-5-il) -piperidino-4-carboxílico, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, paraa fabricação de um medicamento para o tratamento de umacondição em um indivíduo. Tais condições incluem condiçõescardiovasculares, condições metabólicas, condições dosistema nervoso central, condições pulmonares, disfunçãosexual, dor e disfunção renal.
Em outra modalidade, a invenção compreende métodospara fabricar o ácido 1- (1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-IH-pirazolo-[4,3—d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxílico, ou um seu sal farmaceuticamenteaceitável.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 apresenta um gráfico que ilustra oefeito sobre a pressão sangüínea da administração oralrepetida do ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-1Η-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxílico (dose oral diária de 1 mg/kg),isoladamente e em combinação com enalapril, em um modelo derato hipertensivo espontâneo consciente.
A Figura 2 apresenta um gráfico que ilustra oefeito sobre cGMP urinário em 24 horas da administração oralrepetida do ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-1H-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-
piperidino-4-carboxíIico (dose oral diária de 1 mg/kg) ,isoladamente e em combinação com enalapril, em um modelo derato hipertensivo espontâneo consciente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Esta descrição detalhada de modalidades pretendeapenas inteirar terceiros versados nessas técnicas dainvenção da requerente, seus princípios, e sua aplicaçãoprática, de tal modo que terceiros versados nessas técnicaspossam adaptar e aplicar a invenção em suas inúmeras formas,conforme ela possa ser mais bem apropriada para osrequisitos de um uso específico. A invenção, portanto, nãoestá limitada às modalidades descritas neste relatóriodescritivo, e pode ser variadamente modificada.
A. Abreviaturas e Definições
Como utilizado em referências a 1H NMR, o símbolo"δ" refere-se a um deslocamento químico da 1H NMR.
Como utilizada em referências a 1H NMR, aabreviatura "br" refere-se a um sinal ampliado da 1H NMR.Como utilizada em referências a 1H NMR, aabreviatura "d" refere-se a um pico de dublete da 1H NMR.
Como utilizada em referências a 1H NMR, aabreviatura "m" refere-se a um pico de multiplete da 1H NMR.
Como utilizada em referências a 1H NMR, aabreviatura "q" refere-se a um pico de quarteto da 1H NMR.
Como utilizada em referências a 1H NMR, aabreviatura "s" refere-se a um pico de singlete da 1H NMR.
Como utilizada em referências a 1H NMR, aabreviatura "t" refere-se a um pico de triplete da 1H NMR.
A abreviatura "BSA" refere-se a albumina do sorobovino.
A abreviatura "CDI" refere-se a carbodiimida.
A abreviatura "DMSO" refere-se a sulfóxido dedimetíla.
A abreviatura "DBAD" refere-se a azodicarboxilatode dibenzila (DBAD).
A abreviatura "EDTA" refere-se ao ácidoetilenodiaminotetracético.
A abreviatura "HEPES" refere-se ao ácido 4-(2-hidróxi-etil)-1-piperazino-etanossulfônico.
A abreviatura "HRMS" refere-se à Espectroscopia deMassas de Alta Resolução (varredura positiva de ionizaçãopor eletrospray.
A abreviatura "iPrOAc" refere-se a acetato deisopropila.
A abreviatura "LCMS" refere-se Espectroscopia deMassas com Cromatografia Liquida.A abreviatura "m/z" refere-se a pico do espectrode massas.
A abreviatura "NaN(TMS)2" refere-se a hexametil-dissilazida de sódio.
A abreviatura "pfu" refere-se a unidadesformadoras de placas.
A abreviatura "Pt/C" refere-se a platina sobrecarvão.
A abreviatura "PMSF" refere-se a fluoreto defenil-metil-sulfonila.
A abreviatura "SPA" refere-se a ensaio deproximidade de cintilação.
A abreviatura "THF" refere-se a tetraidrofurano.
A abreviatura "Tris-HCl" refere-se a cloridrato detris —(hidróxi—metil)—amino—metano.
O termo "condição mediada por cGMP" refere-se aqualquer condição mediada por cGMP, seja através daregulação direta por cGMP ou através da regulação indiretapor cGMP como um componente de uma via de sinalização.
O termo "condição mediada por PDE5" refere-se aqualquer condição mediada pela enzima PDE5.
O termo "indivíduo hipertensivo" refere-se a umindivíduo que tem hipertensão, sofre dos efeitos dehipertensão ou é suscetível a uma condição hipertensiva casonão tratado para prevenir ou controlar tal hipertensão.
0 termo "carreador farmaceuticamente aceitável"refere-se a um carreador que é compatível com os outrosingredientes da composição e não é prejudicial para oindivíduo. Tais carreadores podem ser um material,composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal comouma carga líquida ou sólida, diluente, excipiente, solventeou material de encapsulação, envolvido em carregar ou transportar um agente químico. A composição preferidadepende do método de administração.
O termo "quantidade terapeuticamente eficaz"refere-se à quantidade de fármaco ou agente farmacêutico,que eliciará a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema ou animal, que está sendo buscada por um pesquisadorou médico.
O termo "tratamento" (e os termos correspondentes"tratar" e tratando") inclui tratamento paliativo,restaurador e preventivo de um indivíduo. O termo "tratamento paliativo" refere-se ao tratamento que alivia oureduz o efeito ou intensidade de uma condição em umindivíduo, sem curar a condição. O termo "tratamentopreventivo" (e o termo correspondente "tratamentoprofilático") refere-se a prevenir o início de uma condição pré-clinicamente evidente completamente ou prevenir o iníciode um estágio pré-clínico evidente de uma condição em umindivíduo. O termo "tratamento restaurador" refere-se aotratamento que detém a progressão, reduz as manifestaçõespatológicas ou elimina inteiramente uma condição em um indivíduo.
B. Composto de Carbóxi-piperidina
Em uma modalidade, a presente invenção compreendeo composto que tem a estrutura:<formula>formula see original document page 10</formula>
e os sais (particularmente os sais farmaceuticamenteaceitáveis) do composto. O nome correspondente destecomposto é ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-1H-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxilico. A menos que diferentementeassinalado, este composto, todas formas tautoméricas docomposto, e os sais farmaceuticamente aceitável do compostoe suas formas tautoméricas são referidas coletivamente nestepedido de patente como "Composto de Carbóxi-piperidina"). OComposto de Carbóxi-piperidina é útil, por exemplo, como uminibidor da enzima PDE5.
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se àforma de ácido livre do Composto de Carbóxi-piperidina.
0 documento n° WO 2004/096810 relata um gênero decompostos que engloba genericamente o Composto de Carbóxi-piperidina. Embora o documento n2 WO 2004/096810 forneçaexemplos de compostos específicos do gênero, ele nãodescreve o composto de Carbóxi-piperidina em si. 0 Compostode Carbóxi-piperidina, entretanto, possui pelo menos um oumais propriedades diferentes em relação aos compostosespecíficos descritos no documento n° WO 2004/096810. Estaspropriedades incluem, por exemplo, eficácia (por exemplo,maior potência in vitro, ex vivo, e/ou in vivo), segurança(por exemplo, maior seletividade e/ou toxicidade maisbaixa) , propriedades farmacocinéticas (por exemplo, Cmax,meia-vida mais longa e/ou depuração mais baixa), epropriedades na fabricação (por exemplo, facilidade desíntese e/ou disponibilidade de matérias-primas).
C. Sais
Como assinalado acima, o Composto de Carbóxi-piperidina pode estar na forma de ácido livre ou na forma deum sal. Diferentes formas de sais do composto de Carbóxi-piperidina podem ter propriedades físicas diferentes entresi. Conseqüentemente, a seleção da forma de sal específicado Composto de Carbóxi-piperidina potencialmente podeinfluenciar, por exemplo, a estabilidade do composto (talcomo em uma faixa de temperaturas e/ou umidades),solubilidade do composto, e outras propriedades físicas docomposto, que podem afetar um produto farmacológico. Alémdisso, os sais do Composto de Carbóxi-piperidina devem tergenericamente maior solubilidade aquosa do que a forma deácido livre correspondente.
Quando o sal do Composto de Carbóxi-piperidina éadministrado a um indivíduo humano ou animal (contrastando,por exemplo, com o uso para testes in vitro) , o sal é, depreferência, um sal farmaceuticamente aceitável. O termo"sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que égenericamente considerado apropriado para consumo humano(particularmente um sal atóxico). Os sais farmaceuticamenteaceitáveis incluem sais de adição de bases e sais de adiçãode ácidos do ácido livre correspondente. Estes sais podemser preparados tipicamente por meios convencionais a partirdo ácido livre do Composto de Carbóxi-piperidina.
Os sais de adição de bases ilustrativos doComposto de Carbóxi-piperidina incluem sais metálicos e saisorgânicos. Os sais metálicos incluem sais de metaisalcalinos (Grupo Ia) (tais como sais de litio, sódio epotássio), sais de metais alcalinoterrosos (Grupo lia) (taiscomo os sais de cálcio e magnésio) , e outros sais de metaisfisiologicamente aceitáveis (tais como os sais de alumínio ezinco). Os sais orgânicos incluem sais fabricados a partirde aminas secundárias, terciárias e quaternárias (tais comoos sais de trometamina, dietil-amina, trietil-amina, etanol-amina, dietanol-amina, trietanol-amina, etilenodiamina,N, N'-dibenzil-etilenodiamina, meglumina (N-metil-glicamina) ,procaína, cloro-procaina, e colina), e sias fabricados apartir de aminoácidos catiônicos (tais como arginina, lisinae histidina).
Os exemplos de sais de adição de ácidos incluemcloridrato, bromidrato, fluoridrato, iodidrato, borato,flúor-borato, fosfato, fosfato ácido, fosfato diácido,glicerofosfato, hexaflúor-fosfato, metafosfato, nitrato,bicarbonato, carbonato, bissulfato, sulfato, dodecil-sulfato, sulfonato, metanossulfonato, etanossulfonato,benzenossulfonato, toluenossulfonato, triflúor-
metanossulfonato, toluenossulfonato, 2-hidróxi-
etanossulfonato, ciclo-hexil-amino-sulfonato, 2-
naftalenossulfonato, canfor-sulfonato, acetato, adipato,atranilato, aspartato, ascorbato, alginato, triflúor-acetato, fenil-acetato, benzoato, p-hidróxi-benzoato,besilato, butirato, β-hidróxi-butirato, canforato,
cansilato, citrato, embonato, edisilato, esilato, formiato,fumarato, gliconato, digliconato, glicolato, glucamato,glicuronato, gliceptato, heptanoato, glico-heptanoato,hexanoato, hibenzato, isetionato, isotianato, lactato,lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato,nicotinato, orotato, oxalato, palmitato, pamoato,pantotenato, pectinato, picrato, pivalato, propionato,ciclo-pentano-propionato, 3-fenil-propionato, piruvato,sacarato, salicilato, estearato, succinato, sulfanilato,tartarato, galactarato, tosilato, uronato, galacturonato,tiocianato e undecanoato.
Para obter uma revisão sobre sais apropriados,vide "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties,Selection and Use" por Stahl e Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim,Alemanha, 2002) .
D. Tautômeros
Como utilizado neste relatório descritivo, o termo
Composto de Carbóxi-piridina (bem como a estruturacorrespondente) pretende englobar todos os isômerostautoméricos do ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-lH-pirazolo-[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-4-carboxilico. Os isômeros tautoméricosrepresentativos do Composto de Carbóxi-piperidina estãoilustrados abaixo:<formula>formula see original document page 14</formula>
E. Métodos de Tratamento
A presente invenção compreende ainda métodos paratratar uma condição em um indivíduo que tem ou é suscetívela ter tal condição, administrando ao indivíduo umaquantidade terapeuticamente eficaz do Composto de Carbóxi-piperidina. Em uma modalidade, o tratamento é um tratamentopreventivo. Em outra modalidade, o tratamento é umtratamento paliativo. Em ainda outra modalidade, otratamento é um tratamento restaurador.
Em outra modalidade, a condições é uma condiçãomediada por PDE5.
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãomediada por cGMP. Uma condição na qual, por exemplo, cGMPinsuficiente é um componente importante, e cuja produção ouação é modulada em resposta à enzima PDE5, seriaconsiderada, portanto, um distúrbio mediado por cGMP.
Em outra modalidade, a condição é selecionada nogrupo que consiste em condições cardiovasculares, condiçõesmetabólicas, condições do sistema nervoso central, condiçõespulmonares, disfunção sexual, dor e disfunção renal.
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãocardiovascular selecionada no grupo que consiste emhipertensão (incluindo hipertensão essencial, hipertensãopulmonar, hipertensão arterial pulmonar, hipertensãosecundária, hipertensão sistólica isolada, hipertensão associada com diabetes, hipertensão associada comaterosclerose, e hipertensão renovascular); complicaçõesassociadas à hipertensão (incluindo lesão de órgãosvasculares, insuficiência cardíaca congestiva, angina,acidente vascular cerebral, glaucoma, e função renal enfraquecida); insuficiência valvular; angina estável,instável e variante (Prinzmetal); doença vascularperiférica; infarto do miocárdio; acidente vascular cerebral(inclusive recuperação de acidente vascular cerebral);doença tromboembólica; restenose; arteriosclerose ; aterosclerose; angioestenose após bypass; angioplastia(inclusive angioplastia transluminal percutânea eangioplastia coronária transluminal percutânea);hiperlipidemia; vasoconstrição hipóxica; vasculite(incluindo síndrome de Kawasaki); insuficiência cardíaca (incluindo insuficiência cardíaca congestiva, insuficiênciacardíaca descompensada, insuficiência cardíaca sistólica,insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíacaventricular esquerda, insuficiência cardíaca ventriculardireita, e hipertrofia ventricular esquerda); fenômeno de Raynaud; pré-eclampsia; pressão sangüínea alta induzida porgravidez; cardiomiopatia; e distúrbios arteriais oclusivos.
Em outra modalidade, a condição é hipertensão.Em outra modalidade, a condição é hipertensãopulmonar.
Em outra modalidade, a condição é hipertensãoarterial pulmonar.
Em outra modalidade, a condição é insuficiênciacardíaca.
Em outra modalidade, a condição é insuficiênciacardíaca diastólica.
Em outra modalidade, a condição é insuficiênciacardíaca sistólica.
Em outra modalidade, a condição é angina.
Em outra modalidade, a condição é trombose.
Em outra modalidade, a condição é acidentevascular cerebral (incluindo recuperação de acidentevascular cerebral).
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãoassociada à disfunção endotelial (incluindo condiçõesselecionadas no grupo que consiste em lesõesateroscleróticas, isquemia do miocárdio, isquemiaperiférica, insuficiência valvular, hipertensão arterialpulmonar, angina, coágulos, complicações vasculares apósbypass vascular, dilatação vascular, repermeabilizaçãovascular, e transplante cardíaco).
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãometabólica selecionada no grupo que consiste em Síndrome X;diabetes (incluindo tipo I e tipo II); resistência àinsulina; síndromes de resistência à insulina (incluindodistúrbios de receptores de insulina, síndrome de Rabson-Mendenhall, síndrome de Cushing, acromegalia, feocomocitoma,glicagonoma, aldosteronismo primário, somatostatinoma,diabetes lipoatrófica, diabetes induzido por toxinas decélulas β, doença de Grave, tireoidite de Hashimoto, edoença de Addison idiopática); tolerância à glicoseenfraquecida; complicações diabéticas (incluindo gangrenadiabética, artropatia diabética, nefropatia diabética,glomerulosclerose diabética, dermatopatia diabética,neuropatia diabética, neuropatia diabética periférica,catarata diabética, e retinopatia diabética); hiperglicemia;e obesidade.
Em outra modalidade, a condição é resistência àinsulina.
Em outra modalidade, a condição é nefropatia.
Em outra modalidade, a condição é uma condição dosistema nervoso central selecionada no grupo que consiste erndemência vascular; traumatismo craniocerebral; infartocerebral; acidente vascular cerebral; demência; distúrbio deconcentração; doença de Alzheimer; doença de Parkinson;esclerose lateral amiotrófica; doença de Huntington;esclerose múltipla; doença de Creutzfeldt-Jakob; ansiedade;depressão; distúrbios do sono; e enxaqueca.
Em outra modalidade, a condição é doença deAlzheimer.
Em outra modalidade, a condição é doença deParkinson.
Em outra modalidade, a condição é escleroselateral amiotrófica.
Em outra modalidade, a condição é um distúrbio deconcentração.
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãopulmonar selecionada no grupo que consiste em asma; angústiarespiratória aguda; fibrose cística; doença pulmonarobstrutiva crônica; bronquite; e obstrução pulmonarreversível crônica.
Em outra modalidade, a condição é dor. Em outramodalidade, a condição é dor aguda. Os exemplos de dor agudaincluem dor aguda associada a lesão ou cirurgia. Em outramodalidade, a condição é dor crônica. Os exemplos de dorcrônica incluem dor neuropática (incluindo dor pós-herpéticae dor associada a câncer ou neuropatia diabéticaperiférica), sindrome do túnel do carpo, dor dorsal(incluindo dor associada a discos intervertebrais herniadosou rompidos ou anormalidades das articulações de facetaslombares, articulações sacroiliacas, músculos paraespinhais,ou do ligamento longitudinal posterior), cefaléia, dor decâncer (incluindo dor relacionada a tumores, tais como doróssea, cefaléia, dor facial ou dor visceral) ou dorassociada à terapia de câncer (incluindo sindrome pós-quimioterapia, sindrome de dor pós-cirúrgica crônica,sindrome pós-radiação, dor associada à imunoterapia, ou dorassociada à terapia hormonal), dor artrítica (incluindo dorde osteoartrite e artrite reumatóide), dor pós-cirúrgicacrônica, neuralgia pós-herpética, neuralgia trigeminal,neuropatia de HIV, dor do membro-fantasma, dor pós-acidentevascular cerebral central e dor associada a alcoolismocrônico, hipotireoidismo, uremia, esclerose múltipla, lesãodo cordão espinhal, doença de Parkinson, epilepsia edeficiência de vitaminas. Em outra modalidade, a condição édor nociceptiva (incluindo dor de traumatismo do sistemanervoso central, lesões por esforço repetitivo/entorses,queimaduras, infarto do miocárdio, e pancreatite aguda, dorpós-operatória (dor após qualquer tipo de procedimentocirúrgico), dor pós-traumática, cólica renal, dor de câncere dor dorsal). Em outra modalidade, a condição é dorassociada a inflamação (incluindo dor artritica (tal comodor de osteoartrite e doença reumatóide), espondiliteancilosante, dor visceral (incluindo doença inflamatória dointestino, distúrbio funcional do intestino, refluxogastroesofágico, dispepsia, sindrome do intestino irritável,sindrome de dor abdominal funcional, doença de Crohn,ileite, colite ulcerativa, dismenorréia, cistite,pancreatite e dor pélvica). Em outra modalidade, a condiçãoé dor resultante de distúrbios musculoesqueléticos(incluindo mialgia, fibromialgia, espondilite, artropatiassoronegativas (não-reumatóides), reumatismo não-articular,distrofinopatia, glicogenólise, polimiosite e piomiosite).Em outra modalidade, a condição é selecionada no grupo queconsiste em dor cardíaca e vascular (incluindo dor causadapor angina, infarto do miocárdio, estenose mitral,pericardite, fenômeno de Raynaud, esclerodoma, e isquemia demúsculo esquelético). Em outra modalidade, a condição éselecionada no grupo que consiste em dor de cabeça(incluindo enxaqueca, tal como enxaqueca com aura eenxaqueca sem aura), cefaléia em cacho, cefaléia do tipotensão, cefaléia mista e cefaléia associada a distúrbiosvasculares, dor orofacial, incluindo dor dental, dor ótica,sindrome da boca ardente e dor miofacial temporomandibular.
Em outra modalidade, a condição é disfunção sexual(incluindo disfunção sexual selecionada no grupo queconsiste em impotência (orgânica ou psíquica); disfunçãoerétil masculina; disfunção clitoridiana; disfunção sexualdepois de lesão do cordão espinhal; distúrbio de estímulosexual feminino; disfunção orgástica sexual feminina;distúrbio de dor sexual feminina; e distúrbio de desejosexual hipoativo feminino).
Em outra modalidade, a condição é disfunção erétilmasculina.
Em outra modalidade, a condição é disfunção renal(incluindo disfunção renal selecionada no grupo que consisteem insuficiência renal aguda, insuficiência renal crônica,nefropatia (tal como nefropatia diabética); distúrbiostubulointersticiais; glomerulopatia; e nefrite. Em outramodalidade, a condição é uma condição de câncer selecionadano grupo que consiste em caquexia cancerosa; metástase detumores e neoplasia.
Em outra modalidade, a condição é osteoporose.
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãogastrointestinal selecionada no grupo que consiste emesôfago em quebra-nozes (nutcracker); fissura anal;distúrbios de motilidade intestinal; sindrome do intestinoirritável e hemorróida. Em outra modalidade, a condição éuma condição urológica selecionada no grupo que consiste emobstrução da saida da bexiga; incontinência e hiperplasiaprostática benigna.
Em outra modalidade, a condição é uma condição dapele selecionada entre psoríase; urticária e necrose dapele.
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãooftálmica selecionada entre doença retiniana; degeneraçãomacular e glaucoma.
Em outra modalidade, a condição é intolerância anitratos.
Em outra modalidade, a condição é calvicie.
Em outra modalidade, a condição é uma condiçãoginecológica selecionada no grupo que consiste emdismenorréia (primária e secundária); infertilidade e partoprematuro. Em outra modalidade, a condição é dismenorréiasecundária.
Em outra modalidade, a presente invençãocompreende ainda métodos para induzir perda de peso oumanutenção da perda de peso em um indivíduo, administrandoao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz doComposto de Carbóxi-piperidina.
F. Indivíduos
O Composto de Carbóxi-piperidina (incluindo osmétodos de tratamento e composições farmacêuticascorrespondentes) é apropriado para uso com, por exemplo,indivíduos mamíferos, tais como humanos, outros primatas(por exemplo, macacos, chimpanzés), animais de estimação(por exemplo, cães, gatos, cavalos), animais de criação(cabritos, carneiros, porcos, gado bovino), cobaias (porexemplo, camundongos, ratos), e animais selvagens e cativos(por exemplo, lobos, ursos, cervos). Em uma modalidade, oindivíduo é um indivíduo mamífero. Em outra modalidade, oindivíduo é um ser humano.
G. Mecanismo Hipotético
Sem se ater a uma teoria específica, levanta-se ahipótese de que o Composto de Carbóxi-piperidina inibe aação da enzima PDE5. Levanta-se ainda a hipótese de que oComposto de Carbóxi-piperidina inibe a ação da enzima PDE5,levando a um aumento nos níveis intracelulares de cGMP. Esteaumento nos níveis intracelulares de cGMP reduz asinalização de cálcio intracelular, o que por sua vez,resulta em relaxamento do músculo liso vascular e umaredução na pressão sangüínea.
H. Administração e Dosagem
O Composto de Carbóxi-piperidina é administradogenericamente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Emuma modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina éadministrado em uma quantidade inibidora da enzima PDE5. OComposto de Carbóxi-piperidina pode ser administrado porqualquer via apropriada na forma de uma composiçãofarmacêutica adaptada para essa via, e em uma dose eficazpara o tratamento pretendido. As doses terapeuticamenteeficazes do Composto de Carbóxi-piperidina, necessárias paraprevenir ou deter a progressão ou para tratar a condiçãomédica, são determinadas facilmente pelos versados nessas'técnicas, usando abordagens pré-clínicas e clínicasconhecidas nas técnicas medicinais.
0 esquema de dosagem para os compostos e/oucomposições que contêm os compostos baseia-se em uma sériede fatores, incluindo o tipo, idade, peso, sexo e condiçãomédica do paciente; a gravidade da condição; a via deadministração; e a atividade do composto especificoempregado. Assim sendo, o esquema de dosagem pode variardependendo da situação especifica. Os níveis de dosagementre cerca de 0,001 mg e cerca de 100 mg do Composto deCarbóxi-piperidina por quilograma de peso corporal por diasão úteis no tratamento das condições indicadas acima. Emuma modalidade, a dose diária total do Composto de Carbóxi-piperidina (administrado em dose única ou doses divididas) étipicamente entre cerca de 0,001 mg/kg e cerca de 20 mg/kg(isto é, mg do composto/kg de peso corporal) . Em outramodalidade, a dose diária total do Composto de Carbóxi-piperidina é entre cerca de 0,005 mg/kg e cerca de 10 mg/kg.Em outra modalidade, a dose diária total do Composto deCarbóxi-piperidina é entre cerca de 0,005 mg/kg e cerca de 5mg/kg. Em outra modalidade, a dose diária total do Compostode Carbóxi-piperidina é entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de1 mg/kg. Estas dosagens baseiam-se em um indivíduo humanomédio que tem um peso de cerca de 65 kg a cerca de 75 kg. Ummédico deve ser capaz de determinar as doses para osindivíduos cujo peso cai fora desta faixa, tais comolactentes. A administração do Composto de Carbóxi-piperidinapode ser repetida uma pluralidade de vezes em um dia(tipicamente não mais do que 4 vezes), para atingir a dosediária desejada.
Por conveniência, o Composto de Carbóxi-piperidinapode ser administrado em uma forma de dosagem unitária. Casodesejado, múltiplas doses por dia da forma de dosagem unitária podem ser usadas para aumentar a dose diária total.A forma de dosagem unitária pode ser, por exemplo, umcomprimido ou cápsula que contém cerca de 0,01, 0,05, 0,1,0, 5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250 ou 500 mg do Composto de Carbóxi-piperidina. Em uma modalidade, Aforma de dosagem unitária contém entre cerca de 0,01 mg ecerca de 500 mg do Composto de Carbóxi-piperidina. Em outramodalidade, a forma de dosagem unitária contém entre cercade 0,05 e cerca de 250 mg do Composto de Carbóxi-piperidina. Em outra modalidade, a forma de dosagem unitária contémentre cerca de 0,1 e cerca de 100 mg do Composto de Carbóxi-piperidina. Em outra modalidade, a forma de dosagem unitáriacontém entre cerca de 0,5 e cerca de 50 mg do Composto deCarbóxi-piperidina.
I. Uso na Preparação de um MedicamentoEm outra modalidade, a presente invençãocompreende o Composto de Carbóxi-piperidina para uso como ummedicamento (tal como um comprimido de dosagem unitária oucápsula de dosagem unitária).
A presente invenção compreende ainda o suo doComposto de Carbóxi-piperidina para a fabricação de ummedicamento (tal como um comprimido de dosagem unitária oucápsula de dosagem unitária) , para tratar uma ou mais dascondições identificadas anteriormente nas seções acima quediscutem métodos de tratamento. Em uma modalidade, acondição é hipertensão.
J. Composições Farmacêuticas
Para o tratamento das condições referidas acima, oComposto de Carbóxi-piperidina pode ser administrado como ocomposto de ácido livre de per si. Em outra modalidade, oComposto de Carbóxi-piperidina pode ser administrado como umou mais sais farmaceuticamente aceitáveis do composto ácidolivre de per si. Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser administrado como um mistura do compostoácido livre de per si e um ou mais sais farmaceuticamenteaceitáveis do composto ácido livre de per si.
A presente invenção compreende ainda composiçõesfarmacêuticas que compreendem o Composto de Carbóxi-piperidina. Em uma modalidade, a composição farmacêuticacompreende o Composto de Carbóxi-piperidina na forma deácido livre. Em outra modalidade, a composição farmacêuticacompreende um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis doComposto de Carbóxi-piperidina. Em outra modalidade, acomposição farmacêutica compreende uma mistura do Compostode Carbóxi-piperidina na forma de ácido livre e um ou maissais farmaceuticamente aceitáveis do Composto de Carbóxi-piperidina. Em uma modalidade, a composição farmacêuticacompreende o Composto de Carbóxi-piperidina e pelo menos umcarreador farmaceuticamente aceitável. O carreador pode serum sólido, um liquido, ou ambos, ou pode ser formulado com oComposto de Carbóxi-piperidina como uma forma de dosagemunitária, por exemplo, um comprimido, que pode conter entre0,05% e 95% em peso do Composto de Carbóxi-piperidina.Outras substâncias farmacológicas ativas também podem estarpresentes.
O Composto de Carbóxi-piperidina pode seradministrado por qualquer via apropriada, de preferência naforma de uma composição farmacêutica adaptada para essa via,e em uma dose eficaz para o tratamento pretendido. 0Composto de Carbóxi-piperidina e as composiçõescorrespondentes, por exemplo, podem ser administrados porvia oral, retal, parenteral ou tópica.
A administração oral de uma forma de dosagemsólida pode ser apresentada, por exemplo, em unidadesdistintas, tais como cápsulas duras ou moles, pílulas,lâminas, pastilhas ou comprimidos, cada um contendo umaquantidade predeterminada de pelo menos um composto dapresente invenção. Em outra modalidade, a administração oralpode ser em uma forma de pó ou grânulo. Em outra modalidade,a forma de dosagem oral é sublingual, tal como, por exemplo,uma pastilha. Nessas formas de dosagem, o Composto deCarbóxi-piperidina é normalmente combinado com um ou maisadjuvantes. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, asformas de dosagem podem compreender também tampões, ou podemser preparadas com revestimentos entéricos.
Em outra modalidade, a administração oral pode serem uma forma de dosagem líquida. As formas de dosagemlíquidas para administração oral incluem, por exemplo,emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixiresfarmaceuticamente aceitáveis, contendo diluentes inertesusados comumente nessas técnicas (por exemplo, água). Taiscomposições podem compreender também adjuvantes, tais comoagentes umectantes, emulsificantes, auxiliares de suspensão,sabores e/ou perfumes.
Em outra modalidade a presente invenção compreendeuma forma de dosagem parenteral. 0 termo "administraçãoparenteral" inclui, por exemplo, injeções subcutâneas,injeções intravenosas, injeções intraperitoneais, injeçõesintramusculares, injeções intra-esternais, e infusão. Aspreparações injetáveis (por exemplo, suspensões aquosas ouoleaginosas estéreis injetáveis) podem ser formuladas deacordo com técnicas conhecidas, usando agentes dispersantes,umectantes apropriados e/ou agentes auxiliares de suspensão.
Em outra modalidade, a presente invençãocompreende uma forma de dosagem tópica. A "administraçãotópica" inclui, por exemplo, administração transdérmica,tais como, por exemplo, emplastros transdérmicos oudispositivos de iontoforese, administração intra-ocular, ouadministração intranasal ou por inalação. As composiçõespara administração tópica podem incluir, por exemplo, géis,sprays, pomadas, e cremes tópicos. Uma formulação tópicapode incluir um composto que intensifica a absorção oupenetração do ingrediente ativo através da pelo ou outrasáreas afetadas. Quando os compostos desta invenção sãoadministrados por um dispositivo transdérmico, aadministração deve ser realizada usando um emplastro do tiporeservatório ou membrana porosa, ou de uma variedade dematriz sólida. As formulações apropriadas para administraçãotópica ao olho incluem, por exemplo, gotas oftálmicas, ondeo composto desta invenção é dissolvido ou colocado emsuspensão em um carreador apropriado. Para administração intranasal ou administração por inalação, os compostosativos da invenção são distribuídos convenientemente naforma de uma solução ou suspensão a partir de um recipientede spray com bomba que é comprimido ou bombeado pelopaciente ou como uma apresentação de spray de aerossol a partir de um recipiente pressurizado ou um nebulizador, como uso de um propelente apropriado.
Em outra modalidade, a presente invençãocompreende uma forma de dosagem retal. Tal forma de dosagemretal pode estar na forma de, por exemplo, um supositório.
Outros materiais carreadores e modos deadministração conhecidos nas técnicas farmacêuticas tambémpodem ser usados. As composições farmacêuticas da invençãopodem ser preparadas por qualquer uma das técnicas defarmácia bem conhecidas, tais como procedimentos de formulação e administração eficazes. As considerações acimareferentes a procedimentos de formulação e administraçãoeficazes são bem conhecidas nessas técnicas e estãodescritas em livros-textos padronizados. A formulação defármacos está discutida, por exemplo, em Hoover, John E., "Remingtons's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co.,Easton, PA, 1975; Liberman et al., editores, "PharmaceuticalDosage Forms", Mareei Decker, New York, NY, 1980; Kibbe etal., editores, "Handbook of Pharmaceutical Excipients" (3-edição), American Pharmaceutical Association, Washington,1999.
K. Combinações e Terapia Combinada
O Composto de Carbóxi-piperidina pode seradministrado também em combinação com outros agentesterapêuticos para tratar as várias condições discutidasanteriormente acima. O composto de Carbóxi-piperidina e o(s)outro(s) agente(s) terapêutico(s) podem ser administradossimultaneamente (seja na mesma forma de dosagem ou em formasde dosagem separadas) ou seqüencialmente. Conseqüentemente,em uma modalidade, a presente invenção compreende métodospara tratar uma condição em um indivíduo que tem ou ésuscetível a ter tal condição, administrando ao indivíduouma quantidade terapeuticamente eficaz do Composto deCarbóxi-piperidina e um ou mais agentes terapêuticosadicionais. Em outra modalidade, a presente invençãocompreende uma composição farmacêutica que compreende oComposto de Carbóxi-piperidina, um ou mais agentesterapêuticos adicionais, e um carreador farmaceuticamenteaceitável.
Em uma modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser administrado com aspirina.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisdiuréticos. Os exemplos de diuréticos apropriados incluemhidroclorotiazida (tais como MICROZIDE™ e ORETIC™) ,hidroflumetiazida (tal como SALURON™) , bemetanida (tal comoBUMEX™) , torsemida (tal como DEMADEX™) , metolazona (talcomo ZAROXOLYN™) , clorotiazida (tais como DIURIL™,ESIDRIX™ e HYDRODIURIL™, triamtereno (tal como DYRENIUM™) ,ácido etacrinico (tal como EDECRIN™) , clortalidona (talcomo HYGROTON™) , furosemida (tal como LASIX™) , indapamida(tal como LOZOL™) , e amilorida (tais como MIDAMOR™ eMODURETIC™) .
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisinibidores da enzima conversora de angiotensina. Os exemplosde inibidores da enzima' conversora de angiotensinaapropriados incluem quinapril (tal como ACCUPRIL™) ,perindopril (tal como ACEON™) , captopril (tal comoCAPOTEN™) , enalapril (tal como VASOTEC™) , ENALAPRILAT™,RAMIPRIL (tal como ALTACE™) , cilazapril, delapril,fosenopril (tal como MONOPRIL™) , zofenopril, indolapril,benazepril (tal como LOTENSIN™) , lisinopril (tais comoPRINIVIL™ e ZESTRIL™) , spirapril, trandolapril (tal comoMAVIK™) , perindep, pentopril, moexipril (tal comoUNIVASC™) , fasidotril, S-alilmercaptocaptopril, e pivopril.Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-
piperidina pode ser co-administrado com um ou maisbloqueadores de receptores de angiotensina II. Os exemplosde bloqueadores de receptores de angiotensina II apropriadosincluem candesartan (tal como ATACAND™) , aprosartan (talcomo TEVETEN™) , irbesartan (tal como AVEPRO™) , losartan(tal como COZAAR™) , olmesartan, olmesartan medoxomil (talcomo BENICAR™) , tasosartan, telmisartan (tal comoMICARDIS™) , valsartan (tal como DIOVAN™) , zolasartan, FI-6828Κ, RNH-6270, UR-7198, Way-126227, KRH-594, TAK-536, BRA-657 e TA-606.
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisbloqueadores de canais de cálcio. Os exemplos debloqueadores de canais de cálcio apropriados incluemnifedipina (tais como ADALAT™, ADALAT CC™ e PROCARDIA™),verapamil (tais como CALAN™, COVERA-HS™, ISOPTIN SR™, eVERELAN™), diltiazem (tais como CARDIZEM™, CARDIZEM CD™,CARDIZEM LA™, CARDlZEM SR™, DILACOR™, TIAMATE™ eTIAZAC™), isradipina (tal como DYNAC IRC™ e DYNACIRC CR™),amiodipina (tal como NORVASC™), felodipina (tal comoPLENDIL™), nisoldipina (tal como SULAR™), bepridil (talcomo VASCOR™), vatanidipina, clevidipina, lercanidipina,dilitiazem, e NNC-55-0396.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisbetabloqueadores. Os exemplos de betabloqueadoresapropriados incluem timolol (tal como BLOCARDEN™),carteolol (tal como CARTROL™), carvedilol (tal comoCOREG™), nadolol (tal como CORGARD™), propanolol (tal comoINNOPRAN XL™), betaxolol (tal como KERLONE™), penbutolol(tal como LEVATOL™), metoprolol (tal como LOPRESSOR™ eTOPROL-XL™), atenolol (tal como TENORMIN™), pindolol (talcomo VISKEN™), e bisoprolol.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com alfabloqueadores. Osexemplos de alfabloqueadores apropriados incluem prazosin,doxazosin (tal como CARDURA™), fenoxibenzamina (tal comoDIBENZYLINE™), TERAZOSIN™ (tal como HYTRIN™), CDRI-93/478e CR-2991.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser administrado com um ou mais alfa-betabloqueadores. Um exemplo de alfa-betabloqueador élabetalol (tais como NORMODYNE™ e TRANDATE™).
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisantagonistas de receptores de aldosterona. Os exemplos deantagonistas de receptores de aldosterona incluem eplerenona(tal como INSPRA™) e espironolactona (tal como ALDACTONE™).
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisinibidores de renina. Os exemplos de inibidores de reninaapropriados incluem alisquireno (SPP 100), SPP-500/600 e YS-004-39.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisantiadrenérgicos centrais. Os exemplos de antiadrenérgicoscentrais apropriados incluem metildopa (tal como ALDOMET™),clonidina (tais como CATAPRES™ ou CATAPRES-TSS™),guanfacina (tal como TENEX™), e guanabenz (tal comoWYTENSIN™).
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisglicosideos/agentes inotrópicos. Um exemplos de umglicosideo/agente inotrópico apropriado é digoxina (tal comoLANOXIΝ™) .
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou mais peptideosnatriuréticos do tipo B humanos. Um exemplo de um peptideonatriurético do tipo B humano apropriado é nesiritida (talcomo NATRECOR™) .
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou mais nitratosorgânicos ou doadores de óxido nítrico. 0 termo "doador deóxido nítrico" refere-se a um composto que doa, libera e/outransfere direta ou indiretamente uma espécie de monóxido denitrogênio e/ou estimula a produção endógena de óxidonítrico ou do fator relaxante derivado do endotélio (EDRF)in vivo e/ou eleva os níveis endógenos de óxido nítrico ouEDRF in vivo. Ele inclui também compostos que são substratospara óxido nítrico sintase. Os exemplos de doadores de óxidonítrico apropriados incluem S-nitrosotióis, nitritos,nitratos, N-oxo-N-nitrosaminas, SPM 3672, SPM 5185, SPM 5186e análogos deles, nitroprussida de sódio, nitroglicerina,dinitrato de isossorbida, molsidomina, SIN-I e substratosdas várias isozimas de óxido nítrico sintase.
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou mais agonistasde bradicinina.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisativadores de guanilato. ciclase. Um exemplo de um ativadorde guanilato ciclase solúvel apropriado é BAY-41-8543.Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser administrado com um ou mais inibidoresde endopeptidase. Os exemplos de inibidores deendopeptidases neutros apropriados incluem omapatrilat,falsidotril, mixanpril, sampatrilat, Z13752A,
<formula>formula see original document page 34</formula>
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisantagonistas de endoteliano. Os exemplos de antagonistas deendoteliano apropriados incluem ambrisentano, darusentano,J-104132, SPP-301, TBC-3711, YM-62899, YM-91746 e BMS-193884.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um mais inibidoresde 3-hidróxi-3-metil-glutaril coenzima A redutase. Osexemplos de inibidores de 3-hidróxi-3-metil-glutarilcoenzima A redutase apropriados incluem fluvastatina (talcomo LESCOL™), atorvastatina (tal como LIPITOR™),lovastatina (tais como ALTOCOR™ ou MEVACOR™), pravastatina(tal como PRAVACHOL™) , rosuvastatina (tal como CRESTOR™), esinvastatina (tal como ZOCOR™).
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou mais derivadosdo ácido nicotínico. Os exemplos de derivados do ácidonicotinico ou niacina apropriados incluem NIACOR™,NIASPAN™, NICOLAR™, e SLO-NIACIN™.
Em outra modalidade, o Composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou mais derivadosde ácido fibrico. Os exemplos de derivados do ácido fibricoincluem clofibrato (tal como ATROMID-S™) , genfibrozil (talcomo LOPID™) , e fenofibrato (tal como TRICOR™) .
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisseqüestrantes de ácidos biliares. Os exemplos deseqüestrantes de ácidos biliares apropriados incluemcolestipol (tal como C0LESTID™) , colestiramina (tais comoLOCHOLEST™, PREVALITE™, QUESTRAN™, e QuESTRAN LIGHT™) ,colesevelam (tal como WELCHOL™) .
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisinibidores da absorção de colesterol. Um exemplo de inibidorda absorção de colesterol apropriado é ezetimiba (tal comoZETIA™) .
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisinibidores protéicos de transporte de colesteril-éster. Umexemplo de inibidor protéico do transporte de colesteril-éster apropriado é torcetrapib.
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisinibidores de co-transportadores de ácidos biliaresdependentes de sódio. Os exemplos de inibidores de co-transportadores de ácidos biliares dependentes de sódioapropriados incluem SD-5613, AZD7806 e 264W94.
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisinibidores de alfa-glicosidase. Os exemplos de inibidores dealfa-glicosidase apropriados incluem miglitol (tal comoGLYSET™) e acarbose (tal como PRECOSE™) .
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com uma ou maisbiguanidas. Os exemplos de biguanidas apropriadas incluemrosiglitazona (tal como AVANDAMET™) , metmorfina (tais comoGLUCOPHAGE™ e GLUCOPHAGE XR™) . Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou maisinsulinas. Os exemplos de insulinas apropriadas incluemHUMAL0G™, HUMAL0G 50/50™, HUMALOG 75/25™, HUMULIN 50/50™,HUMALIN 7 5/25™, HUMALIN L™, HUMALIN N™, HUNALIN R™, HUMALIN R-U500, HUMALIN U™, ILETIN II LENTE™, ILETIN NPH™,ILETIN II REGULAR™, LANTUS™, NOVOLIN 70/30™, NOVOLIN N™,NOVOLIN R™, NOVOLOG™, VELOSULIN BR™, e EXUBERA™.
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com uma ou mais meglitnidas. Os exemplos de meglitnidas apropriadas incluemrepaglinida (tal como PRANDIN™) e nateglinida (tal comoSTARLIX™) .
Em outra modalidade, o\ composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com uma ou maissulfoniluréias. Os exemplos de sulfoniluréias apropriadasincluem glimepirida (tal como AMARYL™) , gliburida (taiscomo DIABETA™, GLYNASE PRESTAB™ ou MICRONASE™) , eglipizida (tais como GLUCOTROL™ e GLUCOTROL XL™) .
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi^piperidina pode ser co-administrado com uma ou maistiazolidinodionas. Os exemplos de tiazolidinodionasapropriadas incluem pioglitazona (tal como ACTOS™) erosiglitazona (tal como AVANDIA™) .
Em outra modalidade, o composto de Carbóxi-piperidina pode ser co-administrado com um ou mais ligantesalfa-2-delta. Os exemplos de ligantes alfa-2-deltaapropriados incluem gabapentina (tal como LYRICA™) , ácido[(1R, 5R,6S)-6-(amino-metil)-biciclo[3.2.0]-hept-6-il] -acético, 3-(1-amino-metil-ciclo-hexil-metil)— 4H—[1,2,4] —oxadiazol-5-ona, C-[1-(1H-tetrazol-5-il-metil)-ciclo-heptil]-metil-amina, ácido (3S,4S)-(1-amino-metil-3,4-dimetil-ciclo-pentil)-acético, ácido (1α,3a,5a)-(3-amino-metil-biciclo[3.2.0]-hept-3-il)-acético, ácido (3S,5R)-3-amino-metil-5-metil-octanóico, ácido (3S,5R)-3-amino-5-metil-heptanóico, ácido (3S,5R)-3-amino-5-metil-nonanóico, eácido (3S,5R)-3-amino-5-metil-octanóico, (2S,4S)-4-(3-cloro-fenóxi)-pralina, e (2S,4S)-4-(3-flúor-benzil)-pralina.L. Kits
A presente invenção compreende ainda kits que sãoapropriados para uso na realização dos métodos de tratamentodescritos acima. Em uma modalidade, o kit compreende umaprimeira forma de dosagem que compreende o Composto deCarbóxi-piperidina e um recipiente para a primeira forma dedosagem. Em outra modalidade, o kit compreende uma primeiraforma de dosagem que compreende o Composto de Carbóxi-piperidina e uma segunda forma de dosagem que compreende umsegundo agente terapêutico.
Em outra modalidade, o kit compreende uma primeiraforma de dosagem que compreende o Composto de Carbóxi-piperidina e uma segunda forma de dosagem que compreende uminibidor da enzima conversora de angiotensina.
Em outra modalidade, o kit compreende uma primeiraforma de dosagem que compreende o Composto de Carbóxi-piperidina e uma segunda forma de dosagem que compreende umantagonista de receptores de angiotensina II.
Em outra modalidade, o kit compreende uma primeiraforma de dosagem que compreende o Composto de Carbóxi-piperidina e uma segunda forma de dosagem que compreende umantagonista de receptor de aldosterona.
Em outra modalidade, o kit compreende uma primeiraforma de dosagem que compreende o Composto de Carbóxi-piperidina e uma segunda forma de dosagem que compreende umdoador de óxido nitrico.
M. Síntese do Composto
O Composto de Carbóxi-piperidina pode serpreparado usando os métodos ilustrados nos esquemas desíntese e nos procedimentos experimentais descritos abaixo.
Os esquemas genéricos de síntese são apresentados compropósitos ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Osmateriais de partida usados para preparar o Composto deCarbóxi-piperidina estão disponíveis comercialmente ou podemser preparados por métodos rotineiros bem conhecidos pelosversados nessas técnicas (tais como os métodos descritos naliteratura de referência, tal como o "Compendium of OrganicSynthetic Methods", volumes I-VI (publicado por Wiley-Interscience)).
Esquema 1
0 Esquema 1 delineia um procedimento genérico paraa preparação do ácido livre do Composto de Carbóxi-piperidina
<formula>formula see original document page 39</formula>
Esquema 2
0 Esquema 2 delineia um procedimento genéricoalternativo para a preparação do ácido livre do Composto deCarbóxi-piperidina.
<formula>formula see original document page 40</formula>
Os exemplos que se seguem ilustram a síntese doácido livre do Composto de Carbóxi-piperidina:
EXEMPLO 1
<formula>formula see original document page 40</formula>
Ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-IH-pirazolo[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-carboxilico
Etapa 1: Preparação de 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-4-nitro-lH-pirazol-5-carboxamidaUm frasco de 1 L foi carregado com 3-etil-4-nitro-pirazol-5-carboxamida (preparada como descrito no documenton5 EP 1176142 na página 18) (15,0 g, 81 mmol), trifenil-fosfina (25,6 g, 97,8 mmol), e tetraidrofurano (120 mL) . Amistura resultante foi resfriada colocando o frasco em umabanho a 0°C, e adicionou-se 2-etóxi-etanol (9,5 mL, 98mmol) ao frasco. Uma solução de azodicarboxilato de di-t-butila (22,5 g, 97,8 mmol) em tetraidrofurano (90 mL) foientão adicionada ao frasco durante um período de 2,5 h. Amistura foi agitada sob resfriamento por mais uma hora edepois aquecida até a temperatura ambiente e agitada pormais uma hora. A mistura foi resfriada novamente até 0°C,tratada com ácido clorídrico 6 M (40 mL) e aquecida até 40°C por uma hora. A mistura foi concentrada parcialmente eextraída entre acetato de etila e água. A camada aquosa foiextraída novamente com acetato de etila. As camadasorgânicas combinadas foram lavadas com água e com salmoura,secadas com sulfato de magnésio, filtradas e depoisconcentradas. O óleo viscoso resultante foi tratado com 2-propanol e esta mistura foi então concentrada. O materialresultante foi tratado com 2-propanol e aquecido. Depois deresfriar, os cristais resultantes foram filtrados,enxaguados com 2-propanol gelado, e secados, para produzir16,5 g do composto do título.
Etapa 2: Preparação de 4-amino-1-(2-etóxi-etil)-3-etil-1H-pirazol-5-carboxaraida
<formula>formula see original document page 42</formula>
A 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-4-nitro-1H-pirazol-5-carboxamida da Etapa 1 (15,0 g, 58 ramol) , 5% de platinasobre carvão (0,75 g) , e acetato de isopropila (150 mL)foram combinados e a mistura foi agitada sob 0,55 MPa dehidrogênio por cerca de 50 horas. A mistura foi entãofiltrada através de Celite, a Celite foi enxaguada comacetonitrila, e o filtrado foi concentrado. O materialeventualmente cristalizou, para dar 13,7 g como um hidratodo composto do título.
Etapa 3: 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-1H-pirazol[4,3-d]-pirimidino-5,7(4H,6H)-diona
<formula>formula see original document page 42</formula>
Uma mistura de carbonildiimidazol (12,3 g, 76,1mmol) em acetonitrila (123 rtiL) foi aquecida até 50 °C. A 4-amino-1-(2-etóxi-etil)-3-etil-1H-pirazol-5-carboxamidapreparada na Etapa 2 (13,2 g, 58 mmol) foi adicionada àmistura durante um período de uma hora e a temperatura damistura foi elevada para 75 0C durante a adição. A misturafoi então resfriada e agitada de um dia para o outro. Amistura foi resfriada em um banho de gelo e filtrada. Atorta do filtro foi enxaguada com água e secada, paraproduzir 12,8 g do composto do título.
Etapa 4: Preparação de 5,7-dicloro-l-(2-etóxi-etil )-3-etil-1H-pirazol[4,3-d]-pirimidinapirazol[4,3-d]-pirimidino-5,7(4H,6H)-diona da Etapa 3 (25,2g, 100 mmol) foi tratada com PhPOCl2 (195 g, 1.000 mmol) eaquecida, sob N2 e agitação a 135 0C por 20 h. A mistura foiresfriada e depois aquecida a 140 0C por mais 20 h. Amistura foi resfriada e adicionada lentamente a uma misturade gelo (600 g) e água (200 Ml) . Este material foi agitadopor 3 h e o sólido resultant foi coletado por filtração eenexaguado com água (2 χ 100 mL) . O sólido foi colocado emsuspensão em acetato de etila (300 mL). Adicionou-se água
Uma mistura de 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-1H-(200 mL) e o pH foi ajustado para 1-2. Depois, adicionou-seNaHCO3 a 10% (resultando em um pH de 7) , e as camadas foramseparadas. A camada orgânica foi lavada sucessivamente comágua (400 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (150mL) . A solução resultante foi então secada e concentrada,para produzir 2 3 g do composto do titulo.
Etapa 5: Preparação de N-[5-cloro-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-lH-pirazol[4,3-d]-pirimidin-7-il]-4-metil-piridin-2-il-amina
<formula>formula see original document page 44</formula>
Uma mistura de 2-amino-4-picolina (4,32 g, 40mmol) e 5,7-dicloro-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-lH-pirazol[4,3-d]-pirimidina da Etapa 4 (5,78 g, 20 mmol) foi tratada comTHF (25 mL) e resfriada até 0 °C. A mistura foi agitada etratada com LiN(TMS)2 1 M em THF (40 mL, 40 mmol) em umavelocidade tal que a temperatura se mantivesse abaixo de 5°C. A mistura foi agitada por 30 min e depois tratada comsolução de ácido citrico a 10% até atingir um pH de 6-7. Amistura foi concentrada parcialmente sob pressão reduzida. Amistura foi então agitada a 5 °C por 1 h. O sólidoresultante foi coletado por filtração sob sucção e lavadocom água (40 mL). O sólido foi secado em uma estufa a vácuoem uma temperatura menor do que 60 °C, para produzir 7,0 gdo composto do título.
metil-piridin-2-il-amino)-lH-pirazolo[4,3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-carboxíIico
Uma mistura de N-[5-cloro-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-lH-pirazol[4,3-d]-pirimidin-7-il]-4-metil-piridin-2-il-aminada Etapa 5 (5,42 g, 166 mmol), ácido isonipecótico (85,9 g,665 mmol) , carbonato de césio (162 g, 498 mmol) e DMSO (55mL) foi aquecida sob agitação a 125 0C. Depois de 20 h, amistura foi resfriada até 20 0C e adicionou-se água (165mL) . A mistura foi agitada por 15 min e depois tratada comacetato de etila (55 mL). As camadas foram separadas e aaquosa foi tratada com outra parcela de acetato de etila (55mL) . As camadas foram separadas novamente e a camada aquosafoi levada até pH 5, usando HCl 6 M. Depois de agitar poruma hora, o sólido resultante foi filtrado, lavado com água(20 mL) e secado sob vácuo, para dar 5,5 g do composto, dotítulo. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ 1,10 (t, 3H) , 1,30 (t,3H) , 1, 49-1, 60 (m, 2H) , 1, 84-1, 95 (m, 2H) , 2, 32-2, 36 (m,
Etapa 6: Ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-
<formula>formula see original document page 45</formula>3Η) , 2, 52-2, 57 (m, 1Η) , 2,78 (q, 2Η) , 2, 99-3, 08 (m, 2Η) ,3,52 (q, 2Η), 3,78 (t, 2Η), 4,45-4,53 (m, 2Η), 4,56-4,64 (m,2Η) , 6,91 (d, 1Η) , 8,05 (s, 1Η) , 8,18 (d, 1H), 9,63 (s, 1H) ,12,18 (s, 1H). LCMS m/z 454.
Alternativamente, uma mistura de N-[5-cloro-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-lH-pirazol[4,3-d]-pirimidin-7-il]-4-metil-piridin-2-il-amina da Etapa 5 pode ser combinada comácido isonipecótico (entre 1 e 10 equivalentes) e um base, eaquecida entre 100-125 0C em um solvente até que a reaçãoesteja completa. As bases apropriadas incluem carbonato decésio, carbonato de sódio e carbonato de potássio. Ossolventes apropriados incluem DMSO e N,N-dimetil-formamida.Depois de resfriar, água pode ser adicionada e soluçãobásica extraída (entre 1 e 3 vezes) com um solventeorgânico, tal como acet ato de etila. A camada básicaremanescente é acidificada até pH 5 com HCl. A mistura éagitada por aproximadamente 1 hora. 0 sólido é removido porfiltração, lavado com água e secado sob vácuo, para produziro composto do título. EXEMPLO 2
Ácido 1- (1- (2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-ΙΗ-pirazolo[4,3-d]-pirimidin-5-il) -piperidino-carboxíIico<formula>formula see original document page 47</formula>
Etapa 1: Preparação de 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-4-nitro-lH-pirazol-5-carboxamida
<formula>formula see original document page 47</formula>
A 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-4-nitro-lH-pirazol-5-carboxamida foi preparada de acordo com a Etapa 1 do Exemplo1.
Etapa 2: Preparação de 4-amino-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-lH-pirazol-5-carboxamida
<formula>formula see original document page 47</formula>
Uma mistura de 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-4-nitro-1H-pirazol-5-carboxamida da Etapa 1 (5,70 g, 22 mmol) ehidróxido de paládio (1,0 g) em etanol (110 mL) foi tratadacom formiato de amônio (7,01 g, 111 mmol) em quatro parcelasdesiguais em intervalos de cerca de 10 minutos. A misturaresultante foi aquecida sob refluxo por duas horas e depoisresfriada. A mistura foi filtrada através de Celite econcentrada. O resíduo resultante foi purificada porcromatografia de coluna em sílica-gel, usando uma mistura deacetato de etila e hexano como eluente, para produzir 2,45 gdo composto do título. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,17 (t,3H), 1,21-1,32 (m, 3H), 2,60 (q, 2H) , 3,53 (q, 2H), 3,79-3,95 (m, 2H), 4,38-4,52 (m, 2H). MS (ESI) m/z 227.
Etapa 3: 1-(2-etóxi-etil)-3-etil-1H-pirazol [4,3-d]-pirimidino-5,7(4H,6H)-diona
Uma mistura de 4-amino-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-1H-pirazol-5-carboxamida da Etapa 2 (2,44 g, 10,8 mmol) em N,N-dimetil-formamida (40 mL) foi tratada com carbonildiimidazol(1,92 g, 11,9 mmol) e aquecida a 80 0C durante a noiteinteira. A mistura foi concentrada sob vácuo e o resíduo foipurificado por cromatografia de coluna em sílica-gel, usandouma mistura de acetato de etila e hexano como eluente, paraproduzir 1.04 g do composto do título. MS (ESI) m/z 253.Etapa 4: Preparação de 5,7-dicloro-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-1H-pirazol[4,3-d]-pirimidina
<formula>formula see original document page 49</formula>
Uma mistura de 1- (2-etóxi-etil)-3-etil-1H-pirazol[4,3-d]-pirimidino-5,7(4H,6H)-diona preparada naEtapa 3 (7,2 g) e oxicloreto de fósforo (200 mL) com umagota de N,N-dimetil-formamida foi aquecida sob refluxodurante a noite inteira. A mistura foi resfriada e ooxicloreto de fósforo foi evaporado sob pressão reduzida.Adicionou-se gelo ao resíduo resultante e depois a misturafoi extraída com clorofórmio. As camadas orgânicas foramsecadas com sulfato de magnésio, filtradas e evaporadas,para produzir 2,09 g de 5,7-dicloro-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-1Η-pirazol[4,3-d]-pirimidina como um óeo que solidificouapós descansar. LCMS m/z 289.
Etapa 5: Preparação de ácido 1-(1-(2-etóxi-etil)-3-etil-7-(4-metil-piridin-2-il-amino)-1Η-pirazolo[4 , 3-d]-pirimidin-5-il)-piperidino-carboxílico<formula>formula see original document page 50</formula>
A 5,7-dicloro-l-(2-etóxi-etil)-3-etil-lH-pirazol[4, 3-d]-pirimidina preparada na Etapa 4 (1 mmol), 2-amino-4-picolina (2 mmol), N,N-diisopropil-etil-amina (3mmol) e N-metil-pirrolidona (1 mL) foram adicionados a cadavaso entre dois vasos de reação. Cada vaso foi irradiado emum microondas CEM Discover por 15 min a 150 °C. Adicionou-seácido isonipecótico (3 mmol) a cada vaso de reação e amistura resultante foi irradiada por 15 min a 180 0C. Osconteúdos dos dois vasos de reação foram combinados.
Adicionou-se água e acetato de etila à mistura e a misturafoi vascolejada. Adicionou-se ácido clorídrico (1 M) àmistura e a mistura foi vascolejada novamente. As camadasforam separadas. A camada orgânica foi secada com sulfato demagnésio, filtrada e evaporada. 0 pH da camada aquosa foielevado para cerca de 6, adicionando solução saturada decarbonato de sódio, e a camada aquosa foi então extraída comacetato de etila. A camada orgânica foi secada com sulfatode magnésio, filtrada, adicionada ao resíduo orgânico acimae evaporada. A solução foi purificada por RP-HPLC em umacoluna Varian Dynamax C-18 (250 χ 41,4 mm) com um gradientede 10-95% de acetonitrila/água (ácido clorídrico) durante 15min em duas bateladas. As frações foram combinadas eevaporadas, pra produzir 0,26 g do composto do título. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ 1,10 (t, 3H), 1,30 (t, 3H), 1,49-1,60 (m, 2H), 1,84-1,95 (m, 2H), 2,32-2,36 (m, 3H), 2,52-2,57 (m, 1H), 2,78 (q, 2H), 2, 99-3, 08 (m, 2H), 3,52 (q, 2H),3,78 (t, 2H), 4, 45-4, 53 (m, 2H), 4, 56-4, 64 (m, 2H), 6,91 (d,1H), 8,05 (s, 1H), 8,18 (d, 1H), 9,63 (s, 1H), 12,18 (s,1H). LCMS m/z 454.
Protocolos
N. Ensaios de Potência e Seletividade
Método 1: Ensaio de Proximidade de Cintilação com
Inibição da Enzima PDE5 de Plaquetas Humanas
Um ensaio in vitro pode ser usado para avaliar ainibição da atividade da enzima PDE5 por um composto emteste. Como descrito mais especificamente abaixo, esteensaio mede o valor da CI50 de PDE5 para o composto em teste(isto é, a concentração do composto em teste, necessáriapara inibir 50% da hidrólise de cGMP catalisada pela enzimaPDE5 para dar GMP em relação à atividade de controles não-inibidos.
A enzima PDE5 para uso no ensaio pode ser obtida apartir de plaquetas humanas por modificação apropriada dométodo de Thompson, W.J., Biochemistry 18(23):5228-5237(1979), como descrito por Ballard, S.A. et al., J. Urology159(6) :2164-2171 (1998). A enzima PDE5 isolada a partir deplaquetas humanas pode ser usada para catalisar a hidrólisede [3H]cGMP (Amersham Biosciences) para 5' nucleotídeo[3HJGMP. [3HJGMP se liga a pérolas SPA de silicato de ítrio(Amersham Biosciences) e é detectado por contagem decintilação. Mais especificamente, o efeito do composto emteste em diferentes concentrações pode ser avaliado noensaio colocando o composto em contato com uma quantidadefixa da enzima PDE5 na presença de substrato (cGMP ou cAMPem uma razão 3:1 de não marcado para marcado com [3H]) . Acontagem da cintilação pode ser usada como descrito acimapara determinar a atividade relativa da enzima PDE5. Ainibição da atividade da enzima PDE5 é então calculada emrelação à atividade total da enzima PDE5 de controles não-inibidos.
Ensaio de CI5o de PDE5: formato em placas demicrotitulação de 96 poços
Reagentes
Tampão A: Tris-HCl 20 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,4
Tampão B: 2 mg/mL de BSA em Tampão A (tampão deenzima)
Substrato cGMP: Concentração final 500 nM emensaio
A quantidade de substrato marcado com [3H]adicionada depende da atividade especifica de [3H]cGMP, e osubstrato cGMP é diluído com um insumo 10 mM de cGMP geladoem Tampão A para uma concentração final do substrato 500 Nmno ensaio.
Enzima PDE: Preparada em Tampão Β. O fator dediluição é determinado pela atividade da enzima.
Pérolas SPA: Suspensão a 20 mg/mL preparada emdH20.<table>table see original document page 53</column></row><table>
Os estoques de padrão e compostos em teste sãopreparados a 5 mM em 100% de DMSO. 0 composto é diluídoserialmente em uma placa de diluição usando um formato dediluição 10 pontos H Iog. 2 μL da diluição dos compostos sãoadicionados em duplicata aos poços da placa do ensaio. 2 uLde DMSO a 100% são adicionados aos poços de controledesignados. 25 μΙ* de Tampão A são adicionados aos poços. 25μL do Tampão B são adicionados aos poços de controlenegativo. 25 pL de enzima são adicionados aos poçosremanescentes. 50 μΐϋ de substrato são adicionados a cadapoço. As placas são vedadas e incubadas por 60 min sobre umabatedeira de placas a 30 °C. 50 μL de pérolas SPA sãoadicionados para interromper a reação. As placas são vedadasnovamente e vascolejadas por 15 min, para permitir que aspérolas se liguem ao produto GMP. As pérolas são deixadasdecantando por 30 min e depois lidas em um contador decintilação NXT TopCount. Os dados são analisados com aaplicação de uma curva de adaptação para triagem baseada emplacas. A inibição percentual neste ensaio é calculada daseguinte maneira:
Inibição (5) = [(máximo da média - valor docomposto/(máxima média - mínimo médio)] χ 100.
0 valor de CI50 é determinado a partir de curvassigmóides de resposta à dose da atividade da enzima versusconcentração do composto.
O Composto de Carbóxi-piperidina foi testado de
acordo com o Método 1. Os valores correspondentes da CI50 dePDE5 estão indicados na Tabela A.
Tabela A
<table>table see original document page 54</column></row><table>
Os compostos descritos nos Exemplos do documenton° WO 2004/096810 foram testados de acordo com o Método 1.Os valores correspondentes da CI50 de PDE5 medidos estãoindicados na Tabela B.
Tabela B
<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table><table>table see original document page 94</column></row><table>
Metodo 1A: Ensaio Alternativo de Proximidade deCintilação com Inibição da Enzima PDE5 de Plaquetas Humanas
A CI50 de P DE 5 de um composto em teste pode sermedida também em um ensaio in vitro alternativo que varia doMétodo 1 como descrito abaixo.
Ensaio da CI50 de PDE5: formato de placas demicrotitulação com 96 poços
Reagentes
Tampão A: Tris-HCl 20 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,4
Tampão B: 2 mg/mL de BSA em Tampão A (tampão deenzima)
Substrato cGMP: Concentração final 50 nM em ensaio
A quantidade de substrato marcado com [3H]adicionada depende da atividade especifica de [3H]cGMP, eele é diluído em Tampão A.
Enzima PDE: Preparada em Tampão Β. 0 fator dediluição é determinado pela atividade da enzima.
Pérolas SPA: Suspensão a 4 mg/mL preparada emdH20.
<table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table>
Os estoques de padrão e compostos em teste sãopreparados a 2 mM em 100% de DMSO. O composto em teste édiluído serialmente em uma placa de diluição usando umformato de diluição 10 pontos 1/5 log, de tal modo que aconcentração inicial no ensaio seja 2 μΜ para uma triageminicial da CI50; as CI50 são feitas usando uma diluição 10pontos 1/3 log. 27 μL, de Tampão A são adicionados aos poçosdas placas do ensaio. A partir da placa de diluição, 3 μL docomposto diluído são distribuídos em duplicata ou 3 μL deDMSO a 100% (para os controles positivo e negativo) sãoadicionados. 30 μL de enzima são adicionados. Para os poçosde controle negativo, a enzima é substituída por Tampão B.30 μL, de substrato marcado são adicionados a todos os poços.
Depois de incubar por 60 min à temperaturaambiente, a reação é interrompida com a adição de 30 μL, depérolas de silicato de ítrio. Estas pérolas são densas erequerem agitação constante enquanto estão sendo adicionadasàs placas. As placas são vedadas e vascolejadas sobre umabatedeira de placas por 15 min, para permitir que as pérolasse liguem ao produto GMP.
Depois de deixar as pérolas decantarem por 30 min,as placas são lidas em um contador de ,cintilação NXTTopCount e os dados são analisados da maneira que se segue.Os valores da inibição percentual são calculados usando asmédias dos controles de 0% e 100% em cada placa. Asestimativas dos 4 parâmetros do modelo logístico de respostaà dose sigmóide são então calculadas usando o valor deinibição percentual do nível dos poços para o composto. Afórmula para o modelo logístico de 4 parâmetros pode serexpressa como Y = ((a-d)/(l+ (X/c)^b)) + d, onde Y é aresposta, X é a concentração, "a" é a assíntota inferior(resposta mínima), d é a assíntota superior (respostamáxima), c é a CI50 do modelo (nas mesmas unidades que X), eb é a inclinação (como descrito em D. Lean, Q., P.J. Munsone D. Rodbard, "Simultaneous Analysis of Families ofSigmoidal Curves: Application to Bioassay, RadioligandAssay, and Physiological Dose-Response Curves", Am J.Physiol. 235 (2) :E97-E102, 1978). Estas estimativas sãousadas para calcular a concentração que corresponde a 50% deinibição.
O Composto de Carbóxi-piperidina foi testado deacordo com o Método la. Os valores correspondentes da CI50de PDE5 estão indicados na Tabela C.
Tabela C
<table>table see original document page 96</column></row><table>Os compostos descritos anteriormente nos Exemplosdo documento no WO 2004/096810 foram testados de acordo como Método la. Os valores correspondentes da CI50 de PDE5medidos estão indicados na Tabela D.
Tabela D
<table>table see original document page 97</column></row><table>
Método 2: Ensaio de Proximidade de Cintilaçâo comInibição da Enzima PDE6 da Retina Humana
A inibição da atividade da enzima PDE6 por umcomposto pode ser medida de acordo com o ensaio in vitro doMétodo 1, mas usando a enzima PDE6 semipurifiçada isolada apartir da retina humana, bovina ou canina em vez da enzimaPDE5. Este ensaio mede o valor de CI50 de PDE6 para ocomposto em teste (isto é, a concentração do composto emteste, necessária para inibir 50% da hidrólise de [3H]cGMPcatalisada pela enzima PDE6 para dar 5' nucleotideo [3HJGMPem relação à atividade de controles não-inibidos). [3HJGMPse liga a pérolas SPA de silicato de itrio e é detectado porcontagem de cintilaçâo.
Purificação de PDE6: PDE6 pode ser isolada epurificada a partir do seguinte: PDE6 de Bastão solúvel/PDE6de segmento externo de olhos bovinos (Charles River Ltd.,França) . PDE6 do cone de olhos caninos (LAS) ; ou PDE6 deBastão solúvel e Cone de olhos humanos (I.I.A.M.).Tampão de Homogeneização
Hepes 20 mM (Sigma) 2,383 g
EDTA 1 mM (Sigma) 0,186 g
Dissolver em 300 mL de HPLC (Acros) ou águaduplamente desmineralizada.
PMSF 100 mM (Sigma) 0,174 g/10 mL de etanol
Adicionar 5 mL da solução de PMSF ao tampãolentamente para evitar a precipitação.
Adicioar sacarose 250 mM (Fisher) 42,78 g
Ajustar o volume até 500 mL, agita até dissolver.
Ajustar o pH para 7,2 usando NaOH 1 M.
Estocar a 4 °C.
Preparação da Retina: Deixar os olhosdescongelarem até ficarem macios e até que a córnea e alente estejam límpidas. Segurando o olho com a córnea paracima, fazer uma pequena incisão através da conjuntiva abaixodo nível da íris. A incisão deve ser suficiente parapermitir que o humor escape através do corte. Usandotesouras finas, cortar ao redor da córnea para permitir queela seja levantada como uma aba. Usando um gancho pequeno,engatar a lente e puxá-la suavemente para fora da órbita,tomando cuidado para não puxar a retina para fora na mesmahora. Deixar que a retina caia livremente até a base daórbita.
Levantar a retina com cuidado e localizar o nervoóptico. Cortar através do ervo.óptico e transferir a retinapara uma placa pequena contendo alguns mililitros de tampãode homogeneização. Suavemente, fazer a retina flutuar sobrea superfície do tampão e remover qualquer materialpigmentado manifesto da íris. Colocar a retina e uma segundaplaca com tampão limpo para remover os últimos traços depigmento e depois transferir para um tubo de centrifugaçãoCorning Star (Sigma) de 50 mL e manter sobre gelo.
Isolamento e Purificação de PDE6 da Retina: Deixar2 mL do tampão de homogeneização por retina bovina e 1 mLpor retina canina e humana. Homogeneizar usando umhomogeneizador portátil 3 χ choques de 5 segundos,resfriando sobre gelo entre cada choque. Filtrar ohomogeneizado através de duas camadas de gaze cirúrgica.Centrifugar a 100.000 χ g por 60 min a 4 °C. Filtrar ocitosol através de um leito de Steril-D de 0,22 μΜ, casohaja volume suficiente, ou através de um filtro deextremidade de seringa de 0,22 μΜ (por exemplo, Millex®-GV) . Operar através de FPLC (Pharmacia FPLC LKB/FRAC - 100,Pharmacia) ou fracionar e estocar em nitrogênio líquido,caso necessário.
Método 2A: Ensaio Alternativo de Proximidade deCintilação com Inibição da Enzima PDE6 da Retina Humana
A inibição da atividade da enzima PDE6 por umcomposto em teste pode ser medida também de acordo com oensaio in vitro do Método IA, mas usando a enzima PDE6semipurifiçada isolada a partir da retina humana, bovina oucanina no lugar da enzima PDE5. Este ensaio mede o valor daCI50 de PDE6 para o composto em teste (isto é, aconcentração do composto em teste, necessária para inibir50% da hidrólise de [3H]cGMP catalisada pela enzima PDE6para dar 5' nucleotídeo [3H] GMP em relação à atividade decontroles não-inibidos). [3H] GMP se liga a pérolas SPA desilicato de itrio e é detectado por contagem de cintilação.
Método 3: Ensaio de Proximidade de Cintilação(SPA) com Inibição da Enzima PDEll Recombinante Humana
A inibição da atividade da enzima PDEll por umcomposto em teste pode ser medida também de acordo com oensaio in vitro do Método IA, mas usando a enzima PDE11expressada em células de inseto Sf9 no lugar da enzima PDE5. Este ensaio mede o valor da CI50 de PDEll para o composto emteste (isto é, a concentração do composto em teste,necessária para inibir 50% da hidrólise de [3H]cGMPcatalisada pela enzima PDEll para dar 5' nucleotídeo [3H]GMPem relação à atividade de controles não-inibidos). [3H]GMP se liga a pérolas SPA de silicato de itrio e é detectado porcontagem de cintilação.
Expressão e Purificação de PDEll:
Expressão: Infectar 200 mL de células de insetoSf9 (Invitrogen, Carlsbad, CA) (1 χ 105/mL) com uma multiplicidade de infecção de 2, usando um vetor deexpressão de baculovírus, contendo PDE-11A1 (SEQ ID NO: 1)transposta (sistema pFastBac, Invitrogen) (4 χ 107 pfu/mL).Incubar a 27 ºC sob vascole j amento de 220 rpm por 48 h.Colher as células infectadas pelotizando a 2.000 rpm por 10 min a 4 ºC. Estocar o pélete de células infectadas a -80 ºCaté que esteja pronto para purificação. Recolocar emsuspensão os péletes celulares descongelados até 1 χ 107células/mL (= 20 mL de tampão que consiste em HEPES 20 mM(pH 7,2), EDTA 1 mM, sacarose 20 mM, NaCl 150 mM ecomprimidos de inibidor de protease). Misturar intensamentee deixar descansando sobre gelo por 10 min. Passar porultra-som por 5x5 segundos sobre gelo. Centrifugar a12.000 rpm por 10 min a 4 0C em SS34. Estocar o péleteinsolúvel a -80 °C, e prosseguir para a purificação domaterial solúvel.
Purificação: Preparar a coluna (1,0 cm dediâmetro, Kontes) enxaguando a coluna vazia duas vezes comTBS. Depois, misturar as pérolas (Anti-FLAG Agarose, Sigma)com TBS (não operar a seco) . Aplicar o extrato à coluna edeixar o extrato entrar por escoamento por gravidade.Reaplicar o escoamento. Lavar a coluna com 15 volumes decoluna de TBS. Eluir a proteína com 5 alíquotas de 1 mL depeptídeo FLAG (Sigma) (isto é, 100 ug/mL em TBS) . Eluir aproteína remanescente com 1 mL de glicina 0,1 M, e adicionarimediatamente 25 uL de Tris 1 M pH 8 para neutralizar.
Método 3A: Ensaio Alternativo de Proximidade deCintilação (SPA) com Inibiçâo da Enzima PDEll RecombinanteHumana
A inibição da atividade da enzima PDEll por umcomposto em teste pode ser medida também de acordo com oensaio in vitro do Método 1A, mas usando a enzima PDEllexpressada em células de inseto Sf9 no lugar da enzima PDE5.Este ensaio mede o valor da CI50 de PDEll para o composto emteste (isto é, a concentração do composto em teste,necessária para inibir 50% da hidrólise de [3H]cGMPcatalisada pela enzima PDEll para dar 5' nucleotídeo [3H]GMPem relação à atividade de controles não-inibidos). [3H]GMPse liga a pérolas SPA de silicato de itrio e é detectado porcontagem de cintilação.
O Composto de Carbóxi-piperidina foi testado deacordo com o Método 2, Método 2A , Método 3 e Método 3A. Osvalores de CI50 de PDE6 e PDEll correspondentes medidosestão indicados na Tabela E.
Tabela E
<table>table see original document page 102</column></row><table>
Os compostos descritos anteriormente no documenton° WO 2004/096810 foram testados de acordo com o Método 2,Método 2A , Método 3 e Método 3A. Os valores de CI50 de PDE6e PDE11 correspondentes medidos estão indicados na Tabela F.
Tabela F
<table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table>
Ensaios adicionais que podem ser usados para
avaliar a eficácia de um composto em teste incluem oMétodo4, Método 4A, Método 5 e Método 6 descritos abaixo.
Um ensaio ex vivo pode ser usado para medir orelaxamento direto de um anel aórtico do rato exposto a umcomposto em teste. Como descrito mais especificamenteabaixo, um composto em teste que inibe a atividade de PDE5elicia um relaxamento do anel aórtico por intensificar osinal de cGMP (isto é, inibindo a hidrólise de cGMPcatalisada pela enzima PDE5 para dar GMP) evocado quando oanel aórtico é exposto a um doador de óxido nitrico exógenoestável, tal como NONOato de dietil-triamina (diazên-l-io,2-diolato, conhecido também como "DETA-N0"). 0 ensaio mede ovalor de CE50 para o composto em teste (isto é, aconcentração do composto em teste, que produz 50% daresposta eficaz máxima possível para o composto em teste).
Ratos Sprague-Dawley machos (250-350 g) sãoasfixiados usando gás CO2 e suas aortas torácicas sãoexcisadas cuidadosamente e colocadas em tampão Krebs. Asaortas são então dissecadas cuidadosamente para remover otecido conjuntivo e divididas em 8 seções, cada uma com umcomprimento de 3-4 mm.
Os anéis aórticos são suspensos entre fios de açoinoxidável paralelos em um banho de tecido de 15 mL (37 °C)com camisa de água sob uma tensão de repouso de 1 grama. Atensão é medida usando transdutores isométricos de tensão eregistrada usando um sistema de plataforma de tecidoPonemah. Cada preparação é deixada equilibrar por pelo menos60 min antes de testar o composto. Durante este tempo, ostecidos são também incubados com NG-monometil L-arginina 200uM ("L-NMMA") , e o meio de incubação foi trocado a cada 15-20 min (L-NMMA é adicionada depois de cada lavagem paramanter a concentração final em 200 uM em cada banho detecido).
Depois do período de equilibração, as tensõesbasais são registradas para cada tecido. A respostavasoconstritora à fenilefrina (1 uM) é avaliada e quando aresposta à fenilefrina atinge um máximo, a reatividadevascular é avaliada subseqüentemente por um inoculação deacetilcolina (1 uM) . Depois de outro período de depuração,um segundo valor basal é registrado depois de adicionar ovasoconstritor noradrenalina (25 nM) a cada banho eincubando os tecidos por um período de tempo (cerca de 15min) suficiente para que os tecidos atinjam uma firmezaestável. Um impulso de óxido nítrico exógeno é suprido usando o doador de óxido nítrico estável, DETA-NO. Aconcentração de DETA-NO é titulada (cumulativamente emincrementos de meio-log), para atingir aproximadamente 5 a15% de relaxamento da pré-constrição evocada pelanoradrenalina. As curvas cumulativas deconcentração/resposta são construídas em um único anel,usando tipicamente 5 doses/anel e espaçando 15 min entrecada adição.
Método 4A: Ensaio Alternativo de Anel AórticoO Método 4 pode ser modificado para proporcionar um protocolo alternativo para medir o relaxamento direto deanéis aórticos do rato expostos a um composto em teste. Estemétodo alternativo difere do Método 4 da seguinte maneira:
Para o método alternativo, o endotélio éprimeiramente removido esfregando suavemente a luz do vaso entre os dedos antes de preparar os anéis (anéis desnudos) .A tensão de repouso é ajustada em 2 gramas e a respostavasoconstritora até uma concentração máxima de fenilefrina(1 μΜ) é avaliada, e em seguida (depois de um período dedepuração), faz-se mais duas outras exposições a 300 nM defenilefrina. A relação da resposta/concentração paranoradrenalina é construída em cada tecido em uma faixa .deconcentrações entre 0,1 e 300 nM. Depois de outro período dedepuração, os tecidos são contraídos com uma concentraçãoCEgo de noradrenalina para testar o composto.
Método 5; Ensaio Culex™
O efeito de um composto em teste sobre a pressãosangüínea arterial pode ser avaliado em um modelo de ratohipertensivo espontaneamente pré-canulado consciente("SHR") . Este ensaio é conduzido usando um sistemaautomatizado amostrador de sangue ("ABS"). 0 sistema Culex™ABS (Bioanalytical System, Inc., West Lafayette, IN)compreende um computador laptop, quatro unidades de controlee gaiolas metabólicas. Este sistema ABS permite a coleta demúltiplas amostras de sangue de um único rato, sem causartensão indevida ao animal. Além disso, o sistema ABS permitea coleta de amostras de urina que podem ser potencialmenteusadas para identificações de biomarcadores. Através destaabordagem, a eficácia e os estudos farmacocinéticospadronizados são conduzidos nos ratos SHR livres conscientessimultaneamente para definir a relação entre concentração defármaco isento de plasma ou biomarcadores potenciais eefeito farmacológico (redução da pressão sangüínea arterialmédia).
Ratos SHR com 12 a 16 semanas de idade, pesandocerca de 300 g, sofreram canulação cirúrgica de ambas veiasjugulares e da artéria carótida direita. Depois darecuperação da cirurgia, os animais são colocados na gaiolasCulex™ e amarrados a um braço responsivo a movimentos comum sensor que controla a a gaiola: movimento quando o animalse move para impedir que os cateteres fiquem enroscados. Sãofeitas conexões entre o cateter jugular direito e o conjuntode tubos estéreis Culex™ para amostragem de sangue, e ocateter jugular esquerdo para administração do composto, e ocateter na artéria carótida direita é conectado a umtransdutor de pressão para monitorar a pressão sangüínea.
Para manter a desobstrução dos cateteres, a cânula jugulardireita é mantida pela função "inclinar" do Culex™ que lavao cateter com 20 μL; de solução salina com heparina (10unidades/mL) a cada 12 min ou entre episódios de amostragem,e a cânula jugular esquerda é preenchida com solução salinacom heparina (20 unidade/mL). A desobstrução da cânulajugular direita é mantida por infusão lenta de soluçãosalina com heparina diretamente para dentro da tubulação deprolongamento quando a pressão sangüínea não é registrada ouatravés do transdutor de pressão durante o monitoramento dapressão sangüínea. Os animais são deixados aclimatar porpelo menos duas horas antes da avaliação do composto. Ocomposto em teste pode ser administrado por via intravenosaou por gavagem oral. Os protocolos de amostragem de sangue(tempo e volume da amostragem) são programados usando osoftware Culex™. A quantidade total de sangue retirada decada animal não deve exceder 750 μL;/24 h e 10 mL/kg dentrode duas semanas. A freqüência cardíaca, a pressão sangüíneae a concentração de fármaco são monitoradas. A pressãosangüínea arterial sistêmica e a freqüência cardíaca sãoregistradas por PONEMA (Gould Instrument System, Valleyview, OH), um transdutor de pressão através de um sistema deobtenção de dados para registrar a pressão sangüínea e afreqüência cardíaca, por 6 a 24 horas, baseado no protocoloexperimental. A pressão sangüínea arterial média (pontofinal primário) é analisada para avaliar a eficácia docomposto.
As amostras de sangue são analisadas para medir aconcentração plasmática do fármaco, usando o método LC/MS/MSdescrito abaixo, e para avaliar biomarcadores potenciais.
Método LC/MS/MS
Preparação das Amostras: Amostras de plasma (50μL, desconhecido, controle ou sem nada) são misturadas com10 μL. de acetonitrila: água ou uma solução-padrão do compostoem teste e 150 μL de solução de padrão interno (100 ng/mL docomposto em teste em acetonitrila). A mistura é centrifugadaa 3.000 rpm por 5 min, e 125 μL do sobrenadante sãotransferidos para uma placa de 96 poços. O solvente éevaporado sob uma corrente de nitrogênio e o resíduo éreconstituído com 80 μL de acetonitrila/solução aquosa deácido fórmico a 0,1% (20:80 v/v).
Um volume de 20 μL de cada amostra preparada éinjetado em uma coluna Phenomenex Synergi 4 μm MAX-RP 2,0 75mm e eluído a 0,4 ml/min usando um gradiente de eluição desolução aquosa de ácido fórmico a 0,1% (fase móvel A) paraacetonitrila (fase móvel B) . 0 programa do gradienteconsiste em uma aplicação inicial de 90% da fase móvel A, eem seguida, um gradiente linear até 75% da fase móvel B de0, 2 a 1,15 min depois da injeção e mantido em 75% da fasemóvel B até 2,0 min. A fase móvel foi mudada linearmente devolta para 90% da fase móvel A entre 2,00 e 2,10 min, e apróxima injeção ocorreu em 3,00 min. A detecção foirealizada por espectrometria de massas usando eletrosprayiônico positivo (ESI) com monitoramento de múltiplas reaçõesdas transições m/z 454, 00 (ΜΗ+ o composto em teste) —» m/z408,00, m/z 466,24 (ΜΗ+ o composto em teste) 409,33. Avoltagem do spray iônico é ajustada em 5.000. Uma curva decalibração é construída usando razões da área do pico doanalisado em relação ao padrão interno. As concentrações emquestão são determinadas por previsão inversa a partir dassuas razões da área de pico contra a curva de calibração.
Método 6: Implantação de Radiotransmissores eSubseqüente triagem da Pressão Sangüínea por Telemetria emRatos Espontaneamente Hipertensivos
O efeito de um composto em teste sobre a pressãosangüínea arterial sistêmica pode ser avaliado em um modelode rato espontaneamente hipertensivo ("SHR") usandotelemetria. Os ratos SHR são anestesiados com gás isofluranopor intermédio de uma máquina de anestesia com isofluranoque é calibrada para distribuir isoflurano em uma faixa deporcentagens à medida que o oxigênio atravessa as câmarasinternas da máquina. Os animais são colocados em uma câmarade indução e recebem uma administração de isoflurano a 4-5%para atingir um plano cirúrgico de anestesia. Eles são entãomantidos a 1-2% durante o procedimento cirúrgico porintermédio de um cone nasal, sendo o isoflurano distribuídopor intermédio de um dispositivo de anestesia de isofluranomenor sobre a mesa cirúrgica.
Depois da administração da anestesia, os ratosrecebem um implante de transmissores, usando procedimentosassépticos com unidades de radiotelemetria estéreisdisponíveis comercialmente (Data Sciences, International,Roseville, MN 55113-1136). Antes da cirurgia, o campocirúrgico é despelado, esfregado com solução antimicrobianada marca Dial™ (contendo 4% de gliconato de clorexidina e4% de álcool isopropílico), e em seguida uma aplicação desolução de spray de iodo (10%). Uma laparotomia de 2,5 a 3,0cm é realizada e as unidades de radiotelemetria sãoimplantadas dentro do abdome, com a ponta do cateterinserida dentro da aorta abdominal. Retratores BabyWeitianer são usados para reter o tecido mole. Uma seção de1 cm da aorta abdominal é dissecada e essa seção é grampeadade forma cruzada brevemente, puncionada com uma agulhacalibre 21 e a ponte do cateter transmissor é introduzidadentro do vaso e afixada por uma única sutura de seda 4.0ancorada ao músculo psoas adjacente. O corpo do transmissoré então inserido dentro da cavidade abdominal e afixadosimultaneamente à parede do músculo abdominal enquanto emfechamento com uma sutura de seda 4.0 supurante. A camada depele é fechada com sutura absorvivel 4.0 continuasubdérmica. Uma administração subcutânea de marcaina e emseguida uma aplicação tópica de iodo são administradasdentro e ao redor da linha de sutura, respectivamente,depois de fechar. Todos ratos recebem uma injeção pós-operatória de buprenorfina a 0,05 mg/kg por via subcutâneaantes de recuperar a consciência. Um volume de dose típicopara um rato de 0, 300 kg deve ser de 0,050 mL. Os ratosdevem estar completamente recuperados da sua anestesiaoperatória antes da administração da buprenorfina. Elesrecebem então a mesma dose uma vez ao dia por 2 diasconsecutivos, a menos que o animal demonstre que está comdor pós-operatória comprometedora.
Depois da cirurgia, os ratos são devolvidos parasuas gaiolas e alojados individualmente na gaiola com fundomaciço com forro de papel. Um período de pelo menos 7 dias épermitido para recuperação antes de iniciar os procedimentosexperimentais. Observou-se que os ratos são tipicamentehipertensivos por vários dias depois da cirurgia e retornampara níveis "normotensivos" aproximadamente no 1- dia após acirurgia. Eles são alimentados com ração de rato usual eágua à vontade durante a duração inteira do experimento.
Os compostos em teste são administrados por viaintragástrica por intermédio de gavagem, usando uma agulhade gavagem de aço inoxidável de 2,5 in calibre 18 com umaextremidade arredondada. Para uma única dosagem diária, ovolume-alvo é de 3,3 mL/kg, por via intragástrica. 0 volumeda dose para o composto em teste é de aproximadamente 1mL/rato. O veículo no qual o composto em teste éadministrado é metil-celulose (0,5%) + Tween 80 (0,1%) emtampão de citrato 50 mM, pH = 5,0.
Os dados da pressão sangüínea devem ser obtidosusando o programa de obtenção de dados da Data SciencesInternational (Versão 3.0). As amostras da pressão sangüíneasão registradas em intervalos de 1,5-3 minutos por umaduração de 5 segundos, 24 horas por dia durante o estudointeiro. Estes dados são processados pelo software deanálise de dados da Data Science em médias de intervalos detempo desejados. Toda redução de outros dados é realizada emfolhas de desenvolvimento Microsoft Excel™.
O. Ensaios de Toxicidade
Método 7: Ensaio de Micronúcleo
Um ensaio de micronúcleo in vitro pode ser usadopara determinar o potencial mutagênico de um composto emteste. Este ensaio detecta anormalidades cromossômicasresultantes da exposição a um composto em teste, medindo aformação de pequenos fragmentos de DNA ligados à membrana,tais como micronúcleos no citoplasma de células interfase.
O ensaio é conduzido usando células do ovário dohamster chinês (CHO) sob diferentes condições do teste, naausência e na presença de ativação metabólica. Aconcordância em resultados entre este ensaio de triagem e acitogenética in vitro é ao redor de 85%. 0 teste direto (-S9) é conduzido usando tratamentos contínuos de 24 horas ou3 horas, enquanto que o teste com ativação metabólica (+S9)envolve um tratamento de 3 horas. A clastogenicidade éindicada por um aumento no número de células micronucleadasna primeira interfase depois da exposição (em célulasbinucleadas bloqueadas por citocinese). Os resultados sãocomparados com o nível de toxicidade (medido pela proporçãode células binucleadas) que um composto em teste produz.Para demonstrar a validade do teste, controles negativos(tratados com veículo) e positivos (um respondedorconhecido) são necessários para responder dentro de faixashistóricas estabelecidas.Negativo - Um resultado negativo identifica nenhumdano genotóxico definido pelo resultado final especifico doensaio (por exemplo, negativo em micronúcleo in vitro) . Umcomposto em teste que apresenta uma resposta negativa não preencheu os critérios específicos da avaliação para oensaio, que podem incluir um ou ambos entre os seguintes:(1) um aumento reprodutível dependente da concentração noresultado específico do ensaio em comparação com um controlenegativo (veículo) e/ou (2) uma ou mais concentrações doteste que atingem um amento mínimo em vezes no resultadofinal específico sobre os controles.
Equívoco - Um resultado equivocado é reservadopara situações nas quais o composto em teste foi avaliado emum teste ou testes válidos (isto é, critérios de aceitabilidade do ensaio satisfatórios), mas deixa deapresentar um resultado negativo ou positivo como definidopor critérios de avaliação estabelecidos. Isto pode levar àpresença de uma resposta positiva fraca que requer arepetição de um teste adicional ou um teste confirmativo eventual cãs a caso.
Inconclusivo - Um resultado inconclusivo éreservado para situações nas quais o composto em teste foiavaliado em um teste de ensaio inválido (isto é, critériosde aceitabilidade do ensaio insatisfatórios por razões técnicas, por exemplo, controles negativos ou positivosdeixam de responder adequadamente). Recomenda-se repetir ostestes para estabelecer um resultado válido do teste deensaio.O Composto de Carbóxi-piperidina foi testado deacordo com o Método 7 e produziu um resultado equivocado.
Os compostos descritos anteriormente nos exemplosdo documento n° WO 2004/096810 foram testados de acordo como Método 7. Os resultados do ensaio de micronúcleocorrespondentes estão indicados na Tabela G.
Tabela G
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Os ensaios adicionais que podem ser usados paraavaliar a toxicidade de um composto em teste (por exemplo,quando o ensaio de micronúcleo produz um resultadoequivocado) incluem o Método 8, Método 9 e o Método 10descritos abaixo.
Método 8: Aberração Cromossômica Estrutural InVitro em Linfócitos Periféricos Humanos
Um ensaio de aberração cromossômica estrutural invitro pode ser usado para avaliar um composto em testequanto à sua capacidade de induzir aberrações cromossômicasestruturais e numéricas na presença ou ausência de ativaçãometabólica de mamíferos em linfócitos periféricos humanos.
Os cálculos das concentrações baseiam-se no fatorgrupamento correspondente de 1.000. O composto em teste édissolvido e diluído em DMSO, que também servirá comocontrole com veículo em um volume equivalente àquele usadopara distribuir o composto em teste (concentração final de1%) .
0 sangue venoso periférico humano heparinizado deum voluntário masculino sadio é adicionado ao meio decultura, e em seguida, adiciona-se fitoemaglutinina M (SigmaChemical Co., St. Louis, Missouri), para estimular a divisãocelular de linfócitos. As culturas primárias são incubadaspor pelo menos 4 6 horas antes do tratamento com o compostoem teste.
0 seguinte controle positivo é utilizado:
Tabela 1. Controles Positivos
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Monoculturas de células para cada concentração eum controle com veículo são dosadas. As culturas de célulassão expostas a 0,1 μg/mL de Colcemid (Ciba, Suíça) por 2 hantes de colher. As células são colhidas por centrifugação,intumescidas em uma solução hipotônica e depois fixadas emuma solução fixadora de metano:ácido acético glacial. Asolução de células fixada é jogada sobre lâminas demicroscópio, secada e corada com Glemsa. Para cadaconcentração do fármac testado, pelo menos 2 lâminas porcultura são preparadas.
A citotoxicidade é medida por uma avaliação damorfologia cromossômica e a inibição de mitose (índicemitótico). Um índice mitótico é determinado para todas ascondições de tratamento pontuando 1.000 células por condiçãopara a proporção de células em metáfase.
A concentração máxima correspondente, selecionadapara pontuar as aberrações cromossômicas, é a dose mais altana qual um número suficiente de células em metáfaseanalisáveis é esperado. Caso possível, a dose mais altaselecionada suprimiria o índice mitótico em aproximadamente50%, mas não mais do que 70% de redução.
Pelo menos uma concentração sob cada condição doteste é selecionada para análise junto com o veiculoconcomitante e o controle positivo. As lâminas não sãoanalisadas de uma maneira cega. A critério do diretor doestudo, concentrações adicionais do teste podem seravaliadas depois que a avaliação inicial tenha sidocompletada, para proporcionar maior esclarecimento de umefeito (isto é, um aumento ou ausência de aberrações).
A concentração mais alta do teste selecionada paraanálise deve atender a um dos seguintes critérios: (1)produz aproximadamente 50% de redução do índice mitótico emcomparação com o controles com veículo, (2) apresentaevidência de solubilidade incompleta, ou (3) é equivalente àconcentração máxima de 5.000 μg/mL ou 10 mM (a que for maisbaixa). Quando possível, 100 células em metáfase diplóidesaceitáveis de cada cultura são avaliadas quando ao danocromossômico. Uma exceção a isto é um aumento aparente nafreqüência de células anormais durante a coleta de dados(isto é, > 10 células aberrantes são contadas nas 50primeiras células aceitáveis), em cujo caso uma análiseadicional é descontinuada. As células em metáfase paraanálise devem estar intactas (isto é, terem 4 6 ± 2cromossomas), e devem ter um mínimo de cromossomassobrepostos. Além disso, os cromossomas devem pareceralongados, de tal modo que braços individuais e regiõescentroméricas possam ser identificadas facilmente. Cadacélula em metáfase é classificada como normal ou anormal como tipo(s) e número de anormalidades presentes por célularegistrados. No caso de células anormais, as coordenadas dalâmina no estágio X e vernier Y são registradas. Asaberrações cromossômicas estruturais são classificadas comobreak de cromatideos (Ct brk), fragmentos de cromatideos (CtFrg), dano de cromatideos, incluindo trocas, anéis,dicêntricos, e translocações (R), breaks de cromossomas (CsBrk) , fragmentos de cromossomas (Cs Frg), e múltiplos breaks(M) . Além disso, as células com cromossomas pulverizados(PV) são coletadas na contagem total de aberrações. Ascélulas que continham lacunas são registradas, mas nãoincluídas na contagem de aberrações totais. As aberraçõescromossômicas numéricas são determinadas para cada condiçãode tratamento e os controles com veículo concomitantes,avaliando o número de células poliplóides eendoreduplicadas. Os índices de diploidia são obtidospontuando quando possível 1.000 células em metáfase/culturae ao mesmo tempo tabulando o número de células em metáfaseque são poliplóides ou endoreduplicadas.
Um teste Exato de Fisher com cauda 1 sobre onúmero total de células aberrantes de cada grupo detratamento em comparação com as células aberrantes totaisdos controles negativos é usado como análise estatística5.Um valor de p < 0,05 é considerado como sendoestatisticamente significante.
Um ensaio é considerado válido caso os seguintescritérios sejam atendidos:
1. O controle positivo induz um aumentoestatisticamente significante na porcentagem de células comaberrações cromossômicas em comparação com o controle comveiculo concomitante e as freqüências induzidas sãocomparáveis a dados publicados ou históricos.
2. As culturas de controle com veiculo têm < 3%
de células com aberrações ou uma porcentagem consideradacomparável a dados pubicados ou históricos.
3. Aproximadamente 50% de inibição do índicemitótico são observados no nível de dose mais alto. Esterequisito não é aplicável para testar compostos para osquais nenhuma toxicidade aparente pôde ser atingida naconcentração solúvel máxima ou na dose mais altapermissível.
Método 9: Estudo de toxicidade por Gavagem Oral deSete Dias no Rato SD/IGS Macho
A toxicidade de um composto em teste pode seravaliada em um modelo de rato. Este estudo determina atoxicidade potencial da exposição sistêmica a compostos emteste, quando administrados por gavagem oral, uma vez aodia, por 7 dias consecutivos, a ratos SD/IGS Charles Rivermachos com 6 a 8 semanas de idade, pesando entre 175 g e 200g. Este estudo é conduzido usando o Sistema Xybion Path/Tox(Xybion Medicai Systems Corporation, Cedar Knolls, NJ).
O composto em teste é administrado por via oraluma vez por 7 dias por gavagem em um volume de 10 mL/kg depeso corporal. 0 composto em teste é administrado a 3 gruposde ratos (n = 5), que recém doses de 30 mg/kg/dia, 10mg/kg/dia, e 500 mg/kg/dia, respectivamente. Um grupo decontrole (n = 5) recebe veiculo (metil-celulose a 0,5% (p/v)e Polissorbato 80 a 0,1% (v/v) em tampão de fosfato 50 mM) .A via oral é usada porque ela é a via intencionada deexposição em humanos. A quantidade apropriada do composto emteste é colocada em suspensão em metil-celulose a 0,5% (p/v)e Polissorbato 80 a 0,1% (v/v) em tampão de citrato 50 mM. 0pH da suspensão de dosagem é mantido entre 3 e 9.
Cada animal é sangrado serialmente em 1, 3, 8 e 24horas após a dose no Dia 1. A urina é coletadaaproximadamente 2 4 horas para análise metabólica. Asobservações de sobrevivência e morbidez são conduzidas umavez ao dia durante o período de tratamento. Os sinaisclínicos são observados diariamente, 1-3 horas após a dose.Os animais são sacrificados por meio de exsangüinação depoisde 7 dias. Os animais encontrados mortos são refrigerados enecropsiados no tempo mais cedo possível (dentro do horáriode trabalho). Os pesos corporais finais, amostras de sanguee pesos dos órgãos não foram registrados dos animais mortos.Os animais moribundos/não-programados/programados e todasamostras da patologia clínica exceto amostras de urina foramregistrados.
Vários tecidos (adrenal, osso femoral, cérebro,ceco, cólon, epidídimo, coração, íleo, jejuno, rim, fígado,pâncreas, músculo esquelético do bíceps femoral, baço,estômago, testículos, timo, tireóide, cordão espinhallombar, e nodo linfático mesentérico) devem ser pesados,congelados instantaneamente corados e fixados. Depois doexame macroscópico, os tecidos coletados com grandesanormalidades são retidos em formalina. Todos tecidoscoletados com grandes anormalidades são processados eexaminados microscopicamente pelo patologista. Os tecidossão aparados, embutidos, seccionados, e corados comhematoxilina e eosina e examinados microscopicamente pelopatologista a critério do patologista. Esfregaços da medulaóssea são preparados e corados com o corante de Wright. Paraelucidar a natureza de uma mudança do tecido do animalindividual, mais coleta, secionamento, coloração, e examemicroscópico dos tecidos são conduzidos conforme solicitadopelo patologista.
As observações clinicas, pesos corporais,observações de necropsia bruta, e descobertashistopatológicas são alimentadas diretamente no sistemaXybion Path/Tox.
Método 10: Ensaio de Mutação do Gene BioLum Ames
Um teste de mutagenicidade de Salmonella (videtambém o teste Ames) pode ser usado para determinar opotencial mutagênico de um composto em teste. Este ensaiomede a taxa de mutação de bactérias que são expostas a umcomposto em teste. Vide, por exemplo, Ames, B.N., Durston,W.E., Yamasaki, E., e Lee, F.D., "Carcinogens and mutagens:a simple test system combining liver homogenates foractivation and bactéria for detection", Proc. Natl. Acad.Sei. USA 70:2281-2285 (1973). Alguns carcinógenos tornam-seativados quando eles são transformados enzimaticamente emuma espécie eletrofilica capaz de se ligar de formacovalente ao DNA. No ensaio de Ames, a frações de S9 (9.000g de sobrenadante) são preparadas a partir dos fígados deratos pré-tratados com fenobarbital (PB)/5,6-benzoflavona ouAroclor 1254 para induzir essa atividade de enzimamatabolizadora de fármacos.
O ensaio de BioLum Ames é uma versão de triagem
com produção mais alta do ensaio de mutação gênicabacteriana (Ames). Para demonstrar a validade do teste, oscontroles negativos (tratados com veículo) e positivos (umrespondedor conhecido) são necessários para responder dentrode faixas históricas estabelecidas.
Negativo - Um resultado negativo identifica nenhumdano genotóxico definido pelo resultado final do ensaio (porexemplo, micronúcleo in vitro). Um composto em teste queapresenta uma resposta negativa não preencheu os critériosespecíficos de valiação para o ensaio, que podem incluir umou ambos entre os seguintes: (1) um aumento reprodutíveldependente da concentração no resultado final específico doensaio em comparação com um controle negativo (veículo) e/ou(2) uma ou mais concentrações do teste que atingem um mínimoaumento em vezes no resultado final específico sobre oscontroles.
Positivo - Um resultado positivo identifica umdano genotóxico definido pelo resultado final específico doensaio (por exemplo, micronúcleo in vitro positivo). Umcomposto em teste que apresenta uma resposta positivapreencheu os critérios específicos de avaliação para oensaio, que podem incluir um ou ambos entre os seguintes:(1) um aumento reprodutível dependente da concentração noresultado final específico do ensaio em comparação com umcontrole negativo (veículo) e/ou (2) uma ou maisconcentrações do teste, que atingem um aumento mínimo devezes no resultado final específico sobre os controles.
Equívoco - Um resultado equivocado é reservadopara situações nas quais o composto em teste foi avaliado emum teste ou testes válidos (isto é, critérios deaceitabilidade do ensaio satisfatórios), mas deixa deapresentar um resultado negativo ou positivo como definido por critérios de avaliação estabelecidos. Isto pode levar àpresença de uma resposta positiva fraca que requer arepetição de um teste adicional ou um teste confirmativoeventual cãs a caso.
Inconclusivo - Um resultado inconclusivo é reservado para situações nas quais o composto em teste foiavaliado em um teste de ensaio inválido (isto é, critériosde aceitabilidade do ensaio insatisfatórios por razõestécnicas, por exemplo, controles negativos ou positivosdeixam de responder adequadamente). Recomenda-se repetir os testes para estabelecer um resultado válido do teste deensaio.
P. Estudo Farmacocinético/FarmacodinâmicoMétodo 11: Farmacocinética de Dose Única eBiodisponibilidade Oral no Rato Sprague-Dawley Macho Após Administração Intravenosa e Oral
Um modelo in vivo pode ser usado para avaliar aspropriedades farmacocinéticas de dose única ebiodisponibilidade oral absoluta de um composto em teste.Como descrito mais especificamente abaixo, um composto emteste é administrado a ratos Sprague-Dawley (SD) por viaintravenosa ou oral em um estudo cruzado, e as propriedadesfarmacocinéticas resultantes e a biodisponibilidade oral sãomedidas.
Ratos Sprague-Dawley machos recebem umaadministração de 2,0 mg/kg por via oral (n = 2), porgavagem, como uma suspensão (0,5% de metil-celulose/0,1% deTween 80 em água destilada). Depois de um período dedepuração de 72 horas, os mesmos ratos recebem administraçãode 2,0 mg/kg de dose intravenosa maciça (n = 2) (70% de PEG400/20% de tampão de citrato 0,05 M, pH 3/10% de etanol) .Amostras seriais de sangue (para plasma) são coletadas decada rato durante 24 horas após a dose para cada via. Asconcentrações plasmáticas do composto em teste sãodeterminadas usando um método LC/MS/MS com um limiteinferior de quantificação (LLOQ) de 1,2 (para -534) ng/mL.Os parâmetros farmacocinéticos de um composto em teste sãodeterminados a partir dos dados de concentraçãoplasmática/tempo usando métodos não-compartimentados.
LC/MS/MS: (1) Coluna: Hyperso; AQUASIL C-18 2,1 χ20 mm, 3,0 μπι; (2) Fase móvel: aquosa: água com 0,1% deácido fórmico, orgânica: acetonitrila; Ionização: +ESI (API4000). MRM: m/z 494, 4 -> m/z 394,0 (Exemplo 261 no documenton2 WO 2004/096810), m/z 509,44 m/z 409,80 (Exemplo 262 nodocumento n- WO 2004/096810). Os limites de detecção são0,12 ng/mL (Exemplo 261 no documento n- WO 2004/096810), 1,3ng/m (Exemplo 263 no documento n2 WO 2004/096810), e 0,11ng/mL (Exemplo 262 no documento n° WO 2004/096810).
Watson (Versão 6.4.0.04) é usado para calcular asconcentrações médias do composto em teste, os desvios-padrãocorrespondentes e o coeficiente percentual de variação (% deCV), e para estimar os parâmetros farmacocinéticos(derivados por métodos não-compartimentados) e a estatísticaassociada (média, desvio-padrão e % de CV), caso aplicável.Como n = 2, nenhum SD ou CV calculado?). As concentraçõesabaixo de do limite de quantificação (BLQ) são relatadoscomo zero (0) e são usados na Cmax, e o tempo para atingir aconcentração de pico (t"max) são registrados diretamente apartir dos perfis individuais de concentraçãoplasmática/tempo. A fase log-linear terminal da curva deconcentração plasmática/tempo é identificada por regressãolinear dos pontos de dados. A meia-vida terminal (t1/2 écalculada como em (2) dividido pelo valor absoluto dainclinação da fase log-linear terminal. A área sob a curvade concentração plasmática/tempo a partir do tempo zero atéo tempo da última concentração quantificável (t) [AUC(0-t)] édeterminada usando o método trapezoidal linear. A área sob acurva de concentração plasmática/tempo a partir do tempozero até o infinito [AUC(o-∞)] é determinada como [AUC(0-t)]mais a área extrapolada. A área extrapolada é determinadadividindo a última concentração plasmática observada pelainclinação da fase log-linear terminal. A depuraçãoplasmática sistêmica (CL) é calculada como dose/[AUC(0-∞) ] ,enquanto que o volume de distribuição no estado de equilírio(V"dss) é calculado como CL x MRT, onde MRT (tempo deresidência médio) é definido como AUMC(0-«>)/AUC(0-oo) . Abiodisponibilidade PO absoluta (F) é calculada como umarazão da AUC(o-oo> normalizada para a dose do animalindividual depois da administração IV dado o desenho doestudo cruzado. A concentração plasmática de pico (Cmax), otempo para atingir a concentração de pico (tmax) , a meia-vidaterminal (ti/2) , a área sob a curva de concentraçãoplasmática/tempo a partir do tempo zero até o infinito[AUC(o-od)], o volume de distribuição no estado de equilíbrio(Vdss) , a depuração plasmática sistêmica (CL) , e abiodisponibilidade PO absoluta (F) estão indicadas na TabelaC.
O Composto de Carbóxi-piperidina foi testado deacordo com o Método 11 e os resultados estão indicados naTabela H. Os compostos descritos anteriormente nos exemplosdo documento n- WO 2004/096810 foram testados de acordo como Método 11. Os resultados para estes compostos também estãoindicados na Tabela H.Tabela H Sumario de Parametro PK Medias
<table>table see original document page 127</column></row><table>Q. Protocolos Biológicos - Co-administração comInibidor da Enzima Conversora de Angiotensina
Método 12: Terapia Combinada no Rato SHRUm estudo foi conduzido para avaliar o efeito dadosagem oral repetida do Composto de Carbóxi-piperidinasobre o abaixamento da pressão sangüínea e se a co-administração do Composto de Carbóxi-piperidina com a enzimaconversora de angiotensina enalapril poderia resultar emabaixamento adicional da pressão sangüínea. O estudoconsistiu em tratar ratos espontaneamente hipertensivos(SHR) teledosados como descrito no Método F com o Compostode Carbóxi-piperidina (1 mg/kg uma vez ao dia por via oral)e enalapril (0,007% na água de beber) isoladamente e emcombinação por 7 dias (Figura 1) (n = 12/grupo) . 0 Compostode Carbóxi-piperidina reduziu a pressão sangüínea de umvalor basal pré-dose em comparação com um grupo tratado comveículo em 11 ± 1 mm de Hg no Dia 1. A redução na pressãosangüínea foi mantida durante o período de 7 dias,permanecendo 9 ± 1 mm de Hg abaixo do valor basal pré-doseno Dia 7.
Enalapril também reduziu a pressão sangüínea de umvalor basal pré-dose em comparação com um grupo tratado comveículo com uma redução máxima de 22 ± 2 mm de Hg no dia 7.A combinação do Composto de Carbóxi-piperidina maisenalapril reduziu a pressão sangüínea mais do que a pressãosangüínea foi reduzida por cada agente isoladamente em todosos dias.
As mudanças no biomarcador mecanístico cGMPurinário foram avaliadas durante o período de 24 horas nodia 9. cGMP foi elevado em uma coleta de urina de 0-24 horasnos grupos de Composto de Carbóxi-piperidina e também no dacombinação Composto de Carbóxi-piperidina + enalapril emcompração com o grupo tratado com veículo (Figura 2 (n =12/grupo).
Todos documentos mencionados neste pedido dapatente são expressamente incorporados como referência comose estivessem inteiramente enunciados. Quando elementosintrodutórios da presente invenção ou suas modalidadespreferidas são enunciados, os artigos "um", "uma", "o", "a"e "dito" ou "dita" significam que há um ou mais doselementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo"pretendem ser inclusivos e significam que podem existirelementos adicionais que não os elementos listados.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Pfizer Inc
<120> AciDO 1-(1-(2-ETÓXI-ETIL)-3-ETIL-7-(4-METIL-PIRIDIN-2-IL-.AMINO)-1H-PIRAZ0L0-[4,3-D]-PIRIMIDIN-5-IL)-PIPERIDINO-4-CARBOXÍLICOE SEUS SAIS
<130> PC03B153A
<150> 60/735320<151> 2005-11-10
<160> 1
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggáctaca aggacgacga cgacaaiggga tcccggtccg agatgtcccc aaagtgcagt 60gctgatgctg agaacagttt caaagajaagc atggagaaat catcatactc cgactggcta 120
ataaataaca gcattgctga gctggtitgct tcaacaggce ttccâgtgaa catcagtgat 180
gcctaccagg atccgcgctt tgatgqagag gcagaccaga tatctggttt tcacataaga 240
tctgttcttt gtgtccctat ttggaaltagc aaccaccaaa taattggagt ggctcaagtg 300
ttaaacagac ttgatgggaa acctttjtgat gatgcagatc aacgactttt tgaggctttt 360
gtcatctttt gtggacttgg catcaacaac acaattatgt atgatcaagt gaagaagtcc 420
tgggccaagc agtctgtggc tcttgajtgtg ctatcatacc atgcaacatg ttcaaaagct 480gaagttgaca agtttaaggc agccaaicatc cctctggtgt cagaacttgc catcgatgac 540attcattttg atgacttttc tctcga;cgtt gatgccatga tcacagctgc tctccggatg 600ttcatggagc tggggatggt acagaajattt aaaattgact atgagacact gtgtaggtgg 660cttttgacag tgaggaaaáa ctatcggatg gttctatacc acaactggag acatgccttc 720aacgtgtgtc agctgatgtt cgcgatgtta accactgctg ggtttcaaga cattctgacc 780gaggtggaaa ttttagcggt gattgtggga tgcctgtgtc atgacctcga ccacagggga 840accaacaatg ccttccaagc taagagtggc tctgccctgg cccaactcta tggaacctct 900gctaccttgg agcatcacca tttcaafccac gccgtgatga tccttcaaag tgagggtcac 960
aatatctttg ctaacctgtc ctccaaggaa tatagtgacc ttatgcagct tttgaagcag 1020
tcaatattgg caacagacct cacgctiptac tttgagagga gaaçtgaatt ctttgaactt 10.80
gtcagtaaag gagaatacga ttggaaçatc aaaaaccatc gtgatatatt tcgatcaatg 1140
ttaatgacag cctgtgacct tggagobgtg accaaaccgt gggagatctc cagacaggtg 1200gcagaacttg taaccagtga gttcttcgaa caaggagatcctcactcctt cagcaatttt tgatcggaac cggaaggatggagtggattg atagcatctg catgçctttg tatcaggcacctgaagccga tgctagattc agtagctaca aacagaagtaaaacgactgc tggcctcaac tgcctcatcc tcctcccctggaagacagga actaataa 1518
gggagagatt agagctcaaa 1260aactgcctcg gttgcaactg 1320tggtgaaggt caacgtgaaa 1380agtgggaaga gctacaccaa 1440ccagtgttat ggtagccaag 1500

Claims (21)

1. Composto, e sais farmaceuticamente aceitáveisdo composto, CARACTERIZADO pelo fato de que tem a estrutura:<formula>formula see original document page 132</formula>
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que é um ácido livre.
3. Sais farmaceuticamente aceitáveis,CARACTERIZADO pelo fato de serem do composto conformedescrito na reivindicação 1.
4. Composição farmacêutica, CARACTERIZADO pelofato de que compreende um composto, ou um salfarmaceuticamente aceitável do composto, tendo a estrutura:<formula>formula see original document page 132</formula>
5. Composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeum ácido livre do composto.
6. Composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeum sal farmaceuticamente aceitável do composto.
7. Composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeainda um inibidor da enzima conversora de angiotensina.
8. Composição farmacêutica, de acordo com areivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeainda um antagonista de receptor de angiotensina II.
9. Método para tratar uma condição em umindivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que o métodocompreende administrar ao indivíduo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um composto, ou de um seu salfarmaceuticamente aceitável, tendo a estrutura:<formula>formula see original document page 133</formula>onde a condição é selecionada no grupo que consiste em umacondição cardiovascular, uma condição metabólica, umacondição do sistema nervoso central, uma condição pulmonar,uma disfunção sexual, dor e disfunção renal.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma condiçãocardiovascular.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição cardiovascular éhipertensão.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição cardiovascular é insuficiência cardíaca.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição cardiovascular éangina.
14. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor daenzima conversora de angiotensina ao indivíduo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista dereceptor de angiotensina II ao indivíduo.
16. Uso de um composto, ou de um seu salfarmaceuticamente aceitável, tendo a estrutura:<formula>formula see original document page 135</formula>CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricaçãode um medicamento para o tratamento de uma condiçãoselecionada no grupo que consiste em condiçõescardiovasculares, condições metabólicas, condições dosistema nervoso central, condições pulmonares, disfunçãosexual, dor e disfunção renal.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição é uma condiçãocardiovascular.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição cardiovascular éhipertensão.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição cardiovascular éinsuficiência cardíaca.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 18,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição cardiovascular éangina.
21. Método para preparar um primeiro composto quetem a estrutura:<formula>formula see original document page 136</formula>CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreendecolocar um segundo composto que tem a estrutura:<formula>formula see original document page 136</formula>em contato com ácido isonipecótico, para produziro primeiro composto.
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