ES2326919T3 - Derivados de pirazolo(4,3-d)pirimidin-5-ilo usados como inhibidores de pdes. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene la estructura ** ver fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Description
Derivados de
pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-ilo
usados como inhibidores de PDE5.
La presente invención se refiere generalmente al
ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidin-4-carboxílico
y las sales del mismo. La presente invención además se refiere a
las composiciones farmacéuticas que comprenden este compuesto o sus
sales, los procedimientos de tratamiento que emplean este compuesto
o sus sales, y los procedimientos de preparación de este compuesto
o sus sales. En general, el compuesto y sus sales inhiben la enzima
fosfodiesterasa de tipo 5 ("PDE5") específica de monofosfato de
guanilato cíclico.
La hipertensión es una afección asociada a,
entre otros problemas fisiológicos, un riesgo incrementado de
accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, fibrilación atrial,
insuficiencia cardíaca, enfermedad vascular periférica y disfunción
renal. A pesar de los numerosos fármacos disponibles en diversas
categorías farmacológicas para tratar hipertensión y problemas
fisiológicos relacionados, no todos los pacientes responden a tales
fármacos con la eficacia o con la seguridad que desea. Todavía son
necesarios agentes terapéuticos adicionales para el tratamiento de
hipertensión y/o afecciones relacionadas.
Una clase de agentes terapéuticos reseñados en
la bibliografía como útiles para el tratamiento de hipertensión son
inhibidores de la enzima PDE5 ("inhibidores de la PDE5"). En
general, las células endoteliales vasculares secretan óxido nítrico
que actúa sobre las células del músculo liso vascular y conduce a la
activación de la guanilato ciclasa y la acumulación del monofosfato
de guanosina cíclico ("cGMP"). La acumulación de cGMP provoca
que los músculos se relajen y los vasos sanguíneos se dilaten,
conduciendo a una reducción en la presión sanguínea. El cGMP se
inactiva por la hidrólisis a 5'-monofosfato de
guanosina ("GMP") mediante fosfodiesterasas específicas de
cGMP. Una cGMP-fosfodiesterasa implicada en la
inactivación de cGMP es la enzima PDE5. Los inhibidores de la
enzima PDE5 disminuyen la velocidad de la hidrólisis de cGMP. Esta
reducción en la hidrólisis de cGMP potencia las acciones de óxido
nítrico que conduce a la reducción de la presión sanguínea.
Los compuestos que son inhibidores de la PDE5 se
han reseñado en la bibliografía. Por ejemplo, el documento WO
2005049616 reseña una clase de compuestos de
pirazolo[4,3-d]pirimidinilo. El
documento WO 2005049617 reseña otra clase de compuestos de
pirazolo[4,3-d]pirimidinilo. El
documento WO 2004096810 reseña otra clase de compuestos de
pirazolo[4,3-d]pirimidinilo. El
documento EP 1348707 reseña otra clase de compuestos de
pirazolo[4,3-d]pirimidinilo.
Es deseable la identificación de compuestos
adicionales que son inhibidores de la PDE5. Tales compuestos se
pueden usar para tratar sujetos que padecen o son susceptibles de
hipertensión y/o problemas fisiológicos relacionados y además
amplían el intervalo de opciones de tratamiento disponibles para
tales sujetos.
En una realización, la invención comprende el
ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidin-4-carboxílico
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
En otra realización, la invención comprende una
composición farmacéutica que comprende el ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidina-4-carboxílico
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la invención comprende una
composición farmacéutica que comprende el ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidina-4-carboxílico
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, uno o más agentes
terapéuticos adicionales, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
En otra realización, la invención comprende
ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidin-4-carboxílico
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en el
tratamiento de una afección en un sujeto. Las afecciones que se
pueden tratar de acuerdo con la presente invención incluyen
afecciones cardiovasculares, afecciones metabólicas, afecciones del
sistema nervioso central, afecciones pulmonares, disfunción sexual,
dolor, y disfunción renal.
En otra realización, la invención comprende
ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidin-4-carboxílico
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, uno o más agentes
terapéuticos adicionales, y un vehículo farmacéuticamente aceptable
para usar en el tratamiento de una afección en un sujeto. Las
afecciones que se pueden tratar de acuerdo con la presente
invención incluyen afecciones cardiovasculares, afecciones
metabólicas, afecciones del sistema nervioso central, afecciones
pulmonares, disfunción sexual, dolor, y disfunción renal.
En otra realización, la invención comprende el
uso del ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidina-4-carboxílico
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de una afección en un sujeto.
Tales afecciones incluyen afecciones cardiovasculares, afecciones
metabólicas, afecciones del sistema nervioso central, afecciones
pulmonares, disfunción sexual, dolor, y disfunción renal.
En otra realización, la invención comprende
procedimientos para fabricar el ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidina-4-carboxílico
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La figura 1 muestra un gráfico que ilustra el
efecto sobre la presión sanguínea de la administración oral
repetida del ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidin-4-carboxílico
(1 mg/kg de dosis oral al día), solo y en combinación con
enalapril, en un modelo de rata hipertensa consciente
espontánea.
La figura 2 muestra un gráfico que ilustra el
efecto sobre el cGMP urinario de 24 horas de la administración oral
repetida del ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidin-4-carboxílico
(1 mg/kg de dosis oral al día), solo y en combinación con
enalapril, en un modelo de rata hipertensa consciente
espontánea.
Como se usa en referencia a ^{1}H RMN, el
símbolo "\delta" se refiere al desplazamiento químico de
^{1}H RMN.
Como se usa en referencia a ^{1}H RMN, la
abreviatura "br" se refiere a una señal de ^{1}H RMN
ancha.
Como se usa en referencia a ^{1}H RMN, la
abreviatura "d" se refiere a un pico de ^{1}H RMN
doblete.
Como se usa en referencia a ^{1}H RMN, la
abreviatura "m" se refiere a un pico de ^{1}H RMN
multiplete.
Como se usa en referencia a ^{1}H RMN, la
abreviatura "c" se refiere a un pico de ^{1}H RMN
cuartete.
Como se usa en referencia a ^{1}H RMN, la
abreviatura "s" se refiere a un pico de ^{1}H RMN
singlete.
Como se usa en referencia a ^{1}H RMN, la
abreviatura "t" se refiere a un pico de ^{1}H RMN
triplete.
La abreviatura "BSA" se refiere a albúmina
sérica bovina.
La abreviatura "CDI" se refiere a
carbodiimida.
La abreviatura "DMSO" se refiere a
dimetilsulfóxido.
La abreviatura "DBAD" se refiere a
dibencilazodicarboxilato.
La abreviatura "EDTA" se refiere a ácido
etilendiaminatetraacético.
La abreviatura "HEPES" se refiere a ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico.
La abreviatura "EMAR" se refiere a
espectroscopía de masas de alta resolución (barrido positivo de
ionización por electropulverización).
La abreviatura "iPrOAc" se refiere a
acetato de isopropilo.
La abreviatura "CLEM" se refiere a
espectroscopía de masas acoplado a cromatografía líquida.
La abreviatura "m/z" se refiere a pico de
espectro de masas.
La abreviatura
"NaN(TMS)_{2}" se refiere a hexametildisilazida
de sodio.
La abreviatura "ufp" se refiere a unidades
formadoras de placas.
La abreviatura "Pt/C" se refiere a platino
sobre carbono.
La abreviatura "PMSF" se refiere a fluoruro
de fenilmetilsulfonilo.
La abreviatura "SPA" se refiere a ensayo de
proximidad de centelleo.
La abreviatura "THF" se refiere a
tetrahidrofurano.
La abreviatura "Tris-HCl"
se refiere a clorhidrato de
Tris(hidroximetil)aminometano.
El término "afección mediada por
c-GMP" se refiere a cualquier afección mediada
por cGMP, o bien a través de regulación directa por cGMP, o a
través de la regulación indirecta por cGMP como un componente de una
ruta de señalización.
El término "afección mediada por la
PDE-5" se refiere a cualquier afección mediada
por la enzima PDE5.
El término "sujeto hipertenso" se refiere a
un sujeto que tiene hipertensión, que padece los efectos de
hipertensión o es susceptible a una afección hipertensa si no se
trata para prevenir o controlar tal hipertensión.
El término "vehículo farmacéuticamente
aceptable" se refiere a un vehículo que es compatible con los
otros ingredientes de la composición y no es perjudicial al sujeto.
Tales vehículos pueden ser un material, composición o vehículo
farmacéuticamente aceptable, tal como una carga, diluyente,
excipiente, disolvente o material encapsulador líquido o sólido,
implicado en el porte o transporte de un agente químico. La
composición preferida depende del procedimiento de
administración.
El término "cantidad terapéuticamente
eficaz" se refiere a una cantidad de fármaco o agente
farmacéutico que provocará la respuesta biológica o médica de un
tejido, sistema o animal que se está buscando por un investigador o
clínico.
El término "tratamiento" (y los términos
correspondientes "tratar" y "tratando") incluye
tratamiento paliativo, restaurador, y preventivo de un sujeto. El
término "tratamiento paliativo" se refiere al tratamiento que
calma o reduce el efecto o intensidad de una afección en un sujeto
sin curar la afección. El término "tratamiento preventivo" (y
el término correspondiente "tratamiento profiláctico" se
refiere a o bien prevenir la aparición de una afección
preclínicamente evidente en conjunto o prevenir la aparición de una
fase preclínicamente evidente de una afección en un sujeto. El
término "tratamiento restaurador" se refiere al tratamiento que
detiene la progresión de, reduce las manifestaciones patológicas
de, o elimina completamente una afección en un sujeto.
En una realización, la presente invención
comprende el compuesto que tiene la estructura:
y las sales (particularmente las
sales farmacéuticamente aceptables) del compuesto. El nombre
correspondiente de este compuesto es el ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidina-4-carboxílico.
Salvo que se establezca otra cosa, este compuesto, todas las formas
tautómeras del compuesto, y las sales farmacéuticamente aceptables
del compuesto y sus formas tautómeras se refieren de forma
colectiva en esta solicitud como el "compuesto de
carboxipiperidina". El compuesto de carboxipiperidina es útil,
por ejemplo, como un inhibidor de la enzima
PDE5.
En una realización, la presente invención se
refiere a la forma de ácido libre del compuesto de
carboxipiperidina.
En otra realización, la presente invención se
refiere a las sales farmacéuticamente aceptables del compuesto de
carboxipiperidina.
El documento WO 2004096810 reseña un género de
compuestos que abarca genéricamente el compuesto de
carboxipiperidina. Aunque el documento WO 2004096810 proporciona
ejemplos de compuestos específicos dentro del género, no describe
el propio compuesto de carboxipiperidina. Sin embargo, el compuesto
de carboxipiperidina, posee al menos una o más propiedades
diferentes con relación a los compuestos específicos descritos en el
documento WO 2004096810. Estas propiedades incluyen, por ejemplo,
las propiedades de eficacia (por ejemplo, mayor potencia in
vitro, ex vivo, y/o in vivo), de seguridad (por ejemplo,
mayor selectividad y/o menor toxicidad), farmacocinética (por
ejemplo., C_{máx}, semivida más larga y/o menor eliminación), y
propiedades de fabricación (por ejemplo, facilidad de síntesis y/o
disponibilidad de materiales de partida).
Como se ha indicado anteriormente, el compuesto
de carboxipiperidina puede estar o bien en la forma de ácido libre
o en forma de una sal. Las formas de sales diferentes del compuesto
de carboxipiperidina pueden tener diferentes propiedades físicas
relativas entre sí. De acuerdo con lo anterior, la selección de la
forma de sal específica del compuesto de carboxipiperidina
potencialmente puede tener impacto sobre, por ejemplo, la
estabilidad del compuesto (tal como sobre un intervalo de
temperaturas y/o humedades), la solubilidad del compuesto, y otras
propiedades físicas del compuesto que pueden afectar al producto
fármaco. Además, las sales del compuesto de carboxipiperidina en
general tendrán mayor solubilidad acuosa que la forma de ácido libre
correspondiente.
Cuando la sal del compuesto de carboxipiperidina
se administra a un ser humano o sujeto animal (en oposición a, por
ejemplo, uso para ensayo in vitro), la sal preferiblemente es
una sal farmacéuticamente aceptable. El término "sal
farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que
generalmente se considera adecuada para consumo humano
(particularmente una sal no tóxica). Las sales farmacéuticamente
aceptables incluyen sales de adición de base y sales de adición de
ácido del ácido libre correspondiente. Estas sales típicamente se
pueden preparar mediante medios convencionales a partir del ácido
libre del compuesto de carboxipiperidina.
Las sales de adición de base ilustrativas del
compuesto de carboxipiperidina incluyen las sales metálicas y las
sales orgánicas. Las sales metálicas incluyen sales de metal
alcalino (grupo Ia) (tales como sales de litio, sodio y potasio),
sales de metal alcalino térreo (grupo IIa) (tales como sales de
calcio y magnesio), y otras sales de metales fisiológicamente
aceptables (tales como sales de aluminio y de cinc). Las sales
orgánicas incluyen las sales hechas a partir de aminas secundarias,
terciarias y cuaternarias (tales como trometamina, dietilamina,
trietilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina,
etilendiamina, N,N'-dibenciletilendiamina,
meglumina (N-metilglucamina), procaína,
cloroprocaína, y colina) y las sales preparadas a partir de
aminoácidos catiónicos (tales como arginina, lisina e
histidina).
Los ejemplos de las sales de adición de ácido
adecuadas incluyen, clorhidrato, bromhidrato, fluorhidrato,
yodhidrato, borato, fluoroborato, fosfato, fosfato ácido, fosfato
diácido, glicerofosfato, hexafluorofosfato, metafosfato, nitrato,
bicarbonato, carbonato, bisulfato, sulfato, dodecilsulfato,
sulfonato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato,
toluenosulfonato, trifluorometanosulfonato, toluenosulfonato,
2-hidroxietanosulfonato, ciclohexilaminosulfonato,
2-naftalenosulfonato, alcanforsulfonato, acetato,
adipato, antranilato, aspartato, ascorbato, algenato,
trifluoroacetato, fenilacetato, benzoato,
p-hidoxibenzoato, besilato, butirato,
\beta-hidroxibutirato, alcanforato, camsilato,
citrato, embonato, edisilato, esilato, formiato, fumarato,
gluconato, digluconato, glicolato, glucamato, glucuronato,
gluceptato, heptanoato, glicoheptanoato, hexanoato, hibenzato,
isetionato, isotionato, lactato, lactobionato, malato, maleato,
mandelato, mesilato, nicotinato, orotato, oxalato, palmitato,
pamoato, pantotenato, pectinato, picrato, pivalato, propionato,
ciclopentanopropionato, 3-fenilpropionato,
piruvato, sacarato, salicilato, estearato, succinato, sulfanilato,
tartrato, galactarato, tosilato, uronato, galacturonato,
tiocianato, y undecanoato.
Para una revisión sobre sales adecuadas, véase
"Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and
Use" por Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim,
Alemania, 2002).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se usa en esta solicitud, el término
compuesto de carboxipiperidina (así como la estructura
correspondiente) pretende abarcar todos los isómeros tautómeros del
ácido
1-(1-(2-etoxietil)-3-etil-7-(4-metilpiridin-2-ilamino)-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5-il)piperidina-4-carboxílico.
Los isómeros tautómeros representativos del compuesto de
carboxipiperidina se muestran más adelante:
La presente invención comprende además el
compuesto de carboxipiperidina para usar en el tratamiento de una
afección en un sujeto que tiene o es susceptible de tener tal
afección mediante la administración al sujeto de una cantidad
terapéuticamente eficaz del compuesto de carboxipiperidina. En una
realización, el tratamiento es tratamiento preventivo. En otra
realización, el tratamiento es tratamiento paliativo. En todavía
otra realización, el tratamiento es tratamiento restaurador.
En otra realización, la afección es una afección
mediada por la PDE5.
En otra realización, la afección es una afección
mediada por cGMP. Una afección en la que, por ejemplo, el cGMP
insuficiente es un componente principal, y cuya producción o acción
se modula en respuesta a la enzima PDE5, por lo tanto se
consideraría un trastorno mediado por el cGMP.
En otra realización, la afección se selecciona
del grupo constituido por afecciones cardiovasculares, afecciones
metabólicas, afecciones del sistema nervioso central, afecciones
pulmonares, disfunción sexual, dolor, y disfunción renal.
En otra realización, la afección es una afección
cardiovascular seleccionada entre el grupo constituido por
hipertensión (incluyendo hipertensión esencial, hipertensión
pulmonar, hipertensión arterial pulmonar, hipertensión secundaria,
hipertensión sistólica aislada, hipertensión asociada a diabetes,
hipertensión asociada a aterosclerosis, e hipertensión
renovascular); complicaciones asociadas a hipertensión (incluyendo
daño de los órganos vasculares, insuficiencia cardíaca congestiva,
angina, accidente cerebrovascular, glaucoma y alteración de la
función renal); insuficiencia valvular; angina estable, inestable y
variante (Prinzmetal); enfermedad vascular periférica; infarto de
miocardio; accidente cerebrovascular (incluyendo recuperación de
accidente cerebrovascular); enfermedad tromboembólica; reestenosis;
arterioesclerosis; aterosclerosis; angioestenosis después de
derivación; angioplastia (incluyendo angioplastia transluminal
percutánea y angioplastia coronaria transluminal percutánea);
hiperlipidemia; vasoconstricción hipóxica,; vasculitis (incluyendo
síndrome de Kawasaki); insuficiencia cardíaca (incluyendo
insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia cardíaca
descompensada, insuficiencia cardíaca sistólica, insuficiencia
cardíaca diastólica, insuficiencia cardíaca del ventrículo
izquierdo, insuficiencia cardíaca del ventrículo derecho, e
hipertrofia del ventrículo izquierdo); fenómeno de Raynaud;
preeclamsia; presión sanguínea alta inducida por el embarazo;
cardiomiopatía; y trastornos oclusivos arteriales.
En otra realización, la afección es
hipertensión.
En otra realización, la afección es hipertensión
pulmonar.
En otra realización, la afección es hipertensión
arterial pulmonar.
En otra realización, la afección es
insuficiencia cardíaca.
En otra realización, la afección es
insuficiencia cardíaca diastólica.
En otra realización, la afección es
insuficiencia cardíaca sistólica.
En otra realización, la afección es angina.
En otra realización, la afección es
trombosis.
En otra realización, la afección es accidente
cerebrovascular (incluyendo recuperación de accidente
cerebrovascular).
En otra realización, la afección es una afección
asociada a disfunción endotelial (incluyendo afecciones
seleccionadas entre el grupo constituido por lesiones
ateroscleróticas, isquemia miocardial, isquemia periférica,
insuficiencia valvular, hipertensión arterial pulmonar, angina,
coágulos, complicaciones vasculares después de derivación vascular,
dilatación vascular, repermeabilización vascular, y transplante
cardíaco).
En otra realización, la afección es una afección
metabólica seleccionada entre el grupo constituido por Síndrome X;
diabetes (incluyendo diabetes de tipo I y tipo II); resistencia a la
insulina; síndromes de resistencia a insulina (incluyendo
trastornos de receptor de insulina, síndrome de
Rabson-Mendenhall, leprechaunismo, síndrome de
Kobberling-Dunnigan, síndrome de Seip, síndrome de
Lawrence, síndrome de Cushing, acromegalia, feocromocitoma,
glucagonoma, aldosteronismo primario, somatostatinoma, diabetes
lipoatrófica, diabetes inducida por toxinas de células \beta,
enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto y enfermedad de Addison
idiopática); alteración de la tolerancia a glucosa; complicaciones
diabéticas (incluyendo gangrena diabética, artropatía diabética,
nefropatía diabética, glomeruloesclerosis diabética, deramatopatía
diabética, neuropatía diabética, neuropatía diabética periférica,
catarata diabética, y retinopatía diabética); hiperglucemia y
obesidad.
En otra realización, la afección es resistencia
a insulina.
En otra realización, la afección es
nefropatía.
En otra realización, la afección es una afección
del sistema nervioso central seleccionada entre el grupo
constituido por demencia vascular; trauma craneoencefálico; infarto
cerebral; accidente cerebrovascular, demencia; trastornos de
concentración; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Parkinson;
esclerosis amiolateral; enfermedad de Huntington; esclerosis
múltiple; enfermedad de Creutzfeld-Jacob; ansiedad;
depresión; trastorno del sueño; y migraña.
En otra realización, la afección es enfermedad
de Alzheimer.
En otra realización, la afección es enfermedad
de Parkinson.
En otra realización, la afección es esclerosis
amiolateral.
En otra realización, la afección es un trastorno
de concentración.
En otra realización, la afección es una afección
pulmonar seleccionada entre el grupo constituido por asma;
insuficiencia respiratoria aguda; fibrosis cística; enfermedad
pulmonar obstructiva crónica; bronquitis; y obstrucción pulmonar
reversible crónica.
En otra realización, la afección es dolor. En
otra realización, la afección es dolor agudo. Los ejemplos de dolor
agudo incluyen dolor agudo asociado a lesión o cirugía. En otra
realización, la afección es dolor crónico. Los ejemplos de dolor
crónico incluyen dolor neuropático (incluyendo neuralgia
postherpética y dolor asociado a neuropatía periférica, de cáncer o
diabética), síndrome de túnel carpiano, dolor de espalda (incluyendo
dolor asociado a discos invertebrales herniados o rotos o
anormalidades de las articulaciones de las facetas lumbares,
articulaciones sacroilíacas, músculos paraespinales o el ligamento
longitudinal posterior), cefalea, dolor de cáncer (incluyendo dolor
relacionado con tumor tal como dolor óseo, cefalea, dolor facial o
dolor visceral) o dolor asociado a terapia de cáncer (incluyendo
síndrome después de la quimioterapia, síndrome de dolor
postquirúrgico crónico, síndrome después de radiación, dolor
asociado a inmunoterapia, o dolor asociado a terapia hormonal),
dolor artrítico (incluyendo dolor de osteoartritis y dolor de
artritis reumatoide), dolor postquirúrgico crónico, neuralgia
postherpética, neuralgia trigeminal, neuropatía de VIH, dolor del
miembro fantasma, dolor después de de accidente cerebrovascular
central y dolor asociado a alcoholismo crónico, hipotiroidismo,
uremia, esclerosis múltiple, dolor de la médula espinal, enfermedad
de Parkinson, epilepsia y deficiencia de vitaminas. En otra
realización, la afección es dolor nociceptivo (incluyendo dolor de
trauma del sistema nervioso central, distensiones/esguinces,
quemaduras, infarto de miocardio y pancreatitis aguda, dolor
post-operativo (dolor después de cualquier tipo de
procedimiento quirúrgico), dolor post-traumático,
cólico renal, dolor de cáncer y dolor de espalda). En otra
realización, la afección es dolor asociado a inflamación (incluyendo
dolor artrítico (tal como dolor por osteoartritis y dolor de
enfermedad reumática), espondilitis anquilosante, dolor visceral
(incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino, trastorno del
intestino funcional, reflujo dastroesofágico, dispepsia, síndrome
del intestino irritable, síndrome de dolor abdominal funcional,
enfermedad de Crohn, ileitis, colitis ulcerosa, dismenorrea,
cistitis, pancreatitis y dolor pélvico). En otra realización, la
afección es dolor que se produce por trastornos
músculo-esqueléticos (incluyendo mialgia,
fibromialgia, espondilitis, artropatías
sero-negativas (no reumatoides), reumatismo no
articular, distrofinopatía, glicogenolisis, polimiositis y
piomiositis). En otra realización, la afección se selecciona entre
el grupo constituido por dolor cardíaco y vascular (incluyendo
dolor provocado por angina, infarto de miocardio, estenosis mitral,
pericarditis, fenómeno de Raynaud, escleredoma e isquemia del
músculo esquelético). En otra realización, la afección se
selecciona entre el grupo constituido por dolor de cabeza
(incluyendo migraña tal como migraña con aura y migraña sin aura),
migraña en racimo, migraña de tipo tensión mezclada con migraña y
migraña asociada a trastornos vasculares; dolor orofacial,
incluyendo dolor dental, dolor ótico, síndrome de la boca ardiente
y dolor miofacial temporomandibular).
En otra realización, la afección es disfunción
sexual (incluyendo disfunción sexual seleccionada entre el grupo
constituido por impotencia (orgánica o psíquica); disfunción eréctil
masculina; disfunción del clítoris; disfunción sexual después de
lesión de la médula espinal; trastorno de excitación sexual
femenina; disfunción orgásmica sexual femenina; trastorno de dolor
sexual femenino; y trastorno del deseo sexual hipoactivo
femenino).
En otra realización, la afección es disfunción
eréctil masculina.
En otra realización, la afección es disfunción
renal (incluyendo disfunción renal seleccionada entre el grupo
constituido por insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal
crónica; nefropatía (tal como nefropatía diabética); trastornos
túbulo intersticial; glomerulopatía; y nefritis. En otra
realización, la afección es una afección de cáncer seleccionada
entre el grupo constituido por caquexia cancerosa; metástasis de
tumores y neoplasia.
En otra realización, la afección es
osteoporosis.
En otra realización, la afección es una afección
gastrointestinal seleccionada entre el grupo constituido por
esófago en cascanueces; fisura anal; trastornos de la motilidad del
intestino; síndrome del intestino irritable y hemorroides. En otra
realización, la afección es una afección urológica seleccionada
entre el grupo constituido por obstrucción de la salida de la
vejiga; incontinencia e hiperplasia prostática benigna.
En otra realización, la afección es una afección
de piel, seleccionada entre psoriasis, urticaria y necrosis de la
piel.
En otra realización, la afección es una afección
oftálmica seleccionada entre enfermedad retinal; degeneración
macular y glaucoma.
En otra realización, la afección es intolerancia
a nitratos.
En otra realización, la afección es
calvicie.
En otra realización, la afección es una afección
ginecológica seleccionada entre el grupo constituido por
dismenorrea (primaria y secundaria); infertilidad y parto prematuro.
En otra realización, la afección es dismenorrea secundaria.
En otra realización, la presente invención
comprende además procedimientos para inducir pérdida de peso o
mantenimiento de pérdida de peso en un sujeto mediante la
administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz
del compuesto de carboxipiperidina.
El compuesto de carboxipiperidina (incluyendo
los procedimientos de tratamiento correspondientes y las
composiciones farmacéuticas) es adecuado para uso con, por ejemplo,
sujetos mamíferos tales como seres humanos, otros primates (por
ejemplo, monos, chimpancés), animales de compañía (por ejemplo,
perros, gatos, caballos), animales de granja (por ejemplo cabras,
ovejas, cerdos, ganado vacuno), animales de laboratorio (por
ejemplo, ratones, ratas), y animales salvajes y de zoológico (por
ejemplo, lobos, osos, ciervo). En una realización, el sujeto es un
sujeto mamífero. En otra realización, el sujeto es un ser
humano.
Sin mantener ninguna teoría particular, se
formula la hipótesis de que el compuesto de carboxipiperidina es un
inhibidor de la enzima PDE5. Además se formula la hipótesis de que
el compuesto de carboxipiperidina inhibe la acción de la enzima
PDE5 que conduce a un incremento en los niveles de cGMP
intracelular. Este incremento en los niveles de cGMP intracelular
reduce la señalización de calcio intracelular, que a su vez da como
resultado el relajamiento del músculo liso vascular y una reducción
de la presión sanguínea.
El compuesto de carboxipiperidina se administra
en general en una cantidad terapéuticamente eficaz. En una
realización, el compuesto de carboxipiperidina se administra en una
cantidad inhibidora de la enzima PDE5. El compuesto de
carboxipiperidina se puede administrar mediante cualquier vía
adecuada en la forma de una composición farmacéutica adaptada a
dicha vía, y en una dosis eficaz para el tratamiento propuesto. Las
dosis terapéuticamente eficaces del compuesto de carboxipiperidina
requeridas para prevenir o detener el progreso de, o para tratar la
afección médica, las determinan fácilmente los expertos en la
técnica usando planteamientos preclínicos y clínicos familiares en
las técnicas medicinales.
El régimen de dosificación para los compuestos
y/o composiciones que contienen los compuestos se basa en una
diversidad de factores, incluyendo el tipo, edad, peso, sexo y
afección médica del paciente; la gravedad de la afección; la vía de
administración; y la actividad del compuesto particular empleado. De
este modo el régimen de dosificación puede variar basándose en la
situación específica. Los niveles de dosificación entre
aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 100 mg del compuesto de
carboxipiperidina por kg de peso corporal al día son útiles en el
tratamiento de las afecciones indicadas anteriormente. En una
realización, la dosis diaria total del compuesto de
carboxipiperidina (administrado en dosis individuales o divididas)
está típicamente entre aproximadamente 0,001 mg/kg y
aproximadamente 20 mg/kg (es decir, mg de compuesto/kg de peso
corporal). En otra realización, la dosis diaria total del compuesto
de carboxipiperidina está entre aproximadamente 0,005 mg/kg y
aproximadamente 10 mg/kg. En otra realización, la dosis diaria
total está entre aproximadamente 0,005 mg/kg y aproximadamente 5
mg/kg. En otra realización, la dosis diaria total está entre
aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. Estas
dosificaciones se basan en un sujeto humano medio que tiene un peso
de aproximadamente 65 kg a aproximadamente 75 kg. Un médico será
fácilmente capaz de determinar las dosis para sujetos cuyo peso cae
fuera de este intervalo, tales como niños. La administración del
compuesto de carboxipiperidina se puede repetir una pluralidad de
veces en un día (típicamente no mayor que 4 veces) para lograr la
dosis diaria deseada.
Por conveniencia el compuesto de
carboxipiperidina se puede administrar en una forma de dosificación
unitaria. Si se desea, se pueden usar múltiples dosis al día de la
forma de dosificación unitaria para incrementar la dosis diaria
total. La forma de dosificación unitaria, por ejemplo, puede ser un
comprimido o cápsula que contiene aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1,
0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,
80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250 ó 500 mg del compuesto
de carboxipiperidina. En una realización, la forma de dosificación
unitaria contiene entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente
500 mg del compuesto de carboxipiperidina. En otra realización, la
forma de dosificación unitaria contiene entre aproximadamente 0,05
mg y aproximadamente 250 mg del compuesto de carboxipiperidina. En
otra realización, la forma de dosificación unitaria contiene entre
aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 100 mg del compuesto de
carboxipiperidina. En otra realización, la forma de dosificación
unitaria contiene entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 50
mg del compuesto de carboxipiperidina.
En otra realización, la presente invención
comprende el compuesto de carboxipiperidina para uso como un
medicamento (tal como un comprimido de dosificación unitaria o
cápsula de dosificación unitaria).
La presente invención además comprende el uso
del compuesto de carboxipiperidina para la fabricación de un
medicamento (tal como un comprimido de dosificación unitaria o
cápsula de dosificación unitaria) para tratar una o más de las
afecciones identificadas previamente en las secciones anteriores que
describen los procedimientos de tratamiento. En una realización, la
afección es hipertensión.
Para el tratamiento de las afecciones
mencionadas anteriormente, el compuesto de carboxipiperidina se
puede administrar en forma del compuesto de ácido libre per
se. En otra realización, el compuesto de carboxipiperidina se
puede administrar en forma de una o más sales farmacéuticamente
aceptables del compuesto de ácido libre per se. En otra
realización, el compuesto de carboxipiperidina se puede administrar
en forma de una mezcla del compuesto de ácido libre per se y
una o más sales farmacéuticamente aceptables del compuesto de ácido
libre per se.
La presente invención además comprende
composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto de
carboxipiperidina. En una realización, la composición farmacéutica
comprende el compuesto de carboxipiperidina en la forma de ácido
libre. En otra realización, la composición farmacéutica comprende
una o más sales farmacéuticamente aceptables del compuesto de
carboxipiperidina. En otra realización, la composición farmacéutica
comprende una mezcla del compuesto de carboxipiperidina en la forma
de ácido libre y una o más sales farmacéuticamente aceptables del
compuesto de carboxipiperidina. En una realización, la composición
farmacéutica comprende el compuesto de carboxipiperidina y al menos
un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede ser un
sólido, un líquido, o ambos, y se puede formular con el compuesto de
carboxipiperidina en forma de una forma de dosificación unitaria,
por ejemplo, un comprimido que puede contener entre 0,05% y 95% en
peso del compuesto de carboxipiperidina. Otras sustancias
farmacológicamente activas también pueden estar presentes.
El compuesto de carboxipiperidina se puede
administrar mediante cualquier vía adecuada, preferiblemente en la
forma de una composición farmacéutica adaptada a tal vía, y en una
dosis eficaz para el tratamiento pretendido. El compuesto de
carboxipiperidina y las composiciones correspondientes, por ejemplo,
se pueden administrar por vía oral, rectal, parenteral, o
tópica.
La administración oral de una forma de
dosificación sólida se puede, por ejemplo, presentar en unidades
discretas, tales como cápsulas duras o blandas, píldoras, sellos,
pastillas, o comprimidos, conteniendo cada una cantidad
predeterminada de al menos un compuesto de la presente invención. En
otra realización, la administración oral, puede estar en una forma
de polvo o gránulo. En otra realización, la forma de dosificación
oral es sublingual, tal como, por ejemplo, una pastilla. En tales
formas de dosificación sólidas, el compuesto de carboxipiperidina
se combina ordinariamente con uno o más adyuvantes. En el caso de
las cápsulas, comprimidos, y píldoras, las formas de dosificación
también pueden comprender agentes de tamponación o se pueden
preparar con revestimientos entéricos.
En otra realización, la administración oral
puede estar en una forma de dosis líquida. Las formas de
dosificación líquidas para la administración oral incluyen, por
ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elixires
farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes usados
comúnmente en la técnica (por ejemplo, agua). Tales composiciones
también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes
humectantes, emulsionantes, de suspensión, aromatizantes (por
ejemplo, edulcorantes), y/o agentes perfumantes.
En otra realización, la presente invención
comprende una forma de dosificación parenteral. La "administración
parenteral" incluye, por ejemplo, inyecciones subcutáneas,
inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares,
intraperitonealmente, inyecciones intrasternales e infusión. Las
preparaciones inyectables (por ejemplo, suspensiones acuosas u
oleaginosas inyectables estériles) se pueden formular de acuerdo con
la técnica conocida usando agentes de dispersión, humectantes, y/o
de suspensión adecuados.
En otra realización, la presente invención
comprende una forma de dosificación tópica. La "administración
tópica" incluye, por ejemplo, la administración transdérmica, tal
como mediante parches transdérmicos o dispositivos de iontoforesis,
administración intraocular, o administración intranasal o
inhalación. Las composiciones para la administración tópica también
incluyen, por ejemplo, geles tópicos, pulverizaciones, pomadas, y
cremas. Una formulación tópica puede incluir un compuesto que
potencia la absorción o penetración del ingrediente activo a través
de la piel u otras áreas afectadas. Cuando los compuestos de esta
invención se administran mediante un dispositivo transdérmico, la
administración se llevará a cabo usando un parche o bien del tipo
depósito y membrana porosa o de una variedad de matriz sólida. Las
formulaciones adecuadas para la administración tópica al ojo
incluyen, por ejemplo, gotas de ojos en las que el compuesto de esta
invención está disuelto o suspendido en un vehículo adecuado. Para
la administración intranasal o la administración por inhalación,
los compuestos activos de la invención se liberan convenientemente
en forma de una solución o suspensión desde un recipiente con bomba
de pulverización que se aprieta o bombea por el paciente, o como una
presentación de pulverización de aerosol desde un recipiente
presurizado o nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado.
En otra realización, la presente invención
comprende una forma de dosificación rectal. Tal forma de
dosificación rectal puede estar en la forma de, por ejemplo, un
supositorio.
También se pueden usar otros materiales vehículo
y modos de administración conocidos en la técnica farmacéutica. Las
composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar
mediante cualquiera de las técnicas de farmacia bien conocidas, tal
como la formulación eficaz y procedimientos de administración. Las
consideraciones anteriores con relación a las formulaciones
eficaces y procedimientos de administración se conocen bien en la
técnica y se describen en los libros de texto convencionales. La
formulación de fármacos se describe en, por ejemplo, Hoover, John
E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,
Easton Pennsylvania, 1975; Liberman, y col., Eds.,
Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekaer, Nueva York, N Y.,
1980; y Kibbe, y col., Eds, Handbook of Pharmaceutical Excipients
(3ª edición), American Pharmaceutical Association, Washington,
1999.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto de carboxipiperidina también se
puede administrar en combinación con otros agentes terapéuticos
para tratar las diversas afecciones descritas previamente antes. El
compuesto de carboxipiperidina y el (los) otro(s)
agente(s) terapéutico(s) se pueden administrar de
manera simultánea (o bien en la misma forma de dosificación o en
formas de dosificación separadas) o secuencialmente. De acuerdo con
lo anterior, en una realización, la presente invención comprende
procedimientos para tratar una afección en un sujeto que tiene o es
susceptible de tener tal afección mediante la administración al
sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de
carboxipiperidina y uno o más agentes terapéuticos adicionales. En
otra realización, la presente invención comprende una composición
farmacéutica que comprende el compuesto de carboxipiperidina, uno o
más agentes terapéuticos adicionales, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En una realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede administrar con aspirina.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más diuréticos.
Los ejemplos de diuréticos adecuados incluyen hidroclorotiazida
(tales como MICROZIDE ^{TM} y ORETIC ^{TM}), hidroflumetiazida
(tal como SALURON ^{TM}), bemetanide (tal como BUMEX ^{TM}),
torsemide (tal como DEMADEX ^{TM}), metolazona (tal como ZAROXOLYN
^{TM}), clorotiazida (tal como DIURIL ^{TM}, ESIDRIX ^{TM} e
HYDRODIURIL ^{TM}), triamtereno (tal como DYRENIUM ^{TM}), ácido
etacrínico (tal como EDECRIN ^{TM}), clortalidona (tal como
HYGROTON ^{TM}), furosemida (tal como LASIX ^{TM}), indapamida
(tal como LOZOL ^{TM}), y amilorida (tal como MIDAMOR ^{TM}
y
MODURETIC ^{TM}).
MODURETIC ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de la enzima convertidora de la angiotensina. Los ejemplos de
inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina incluyen
quinapril (tal como ACCUPRIL ^{TM}), perindopril (tal como ACEON
^{TM}), captopril (tal como CAPOTEN ^{TM}),
enalapril (tal como VASOTEC ^{TM}), ENALAPRILAT ^{TM}, ramipril (tal como ALTACE ^{TM}), cilazapril, delapril, fosenopril (tal como MONOPRIL ^{TM}), zofenopril, indolapril, benazepril (tal como LOTENSIN ^{TM}), lisinopril (tal como PRINIVIL ^{TM} y ZESTRIL ^{TM}), espirapril, trandolapril (tal como MAVIK ^{TM}), perindep, pentopril, moexipril (tal como UNIVASC ^{TM}, fasidotril, S-alilmercaptocaptopril, y pivopril.
enalapril (tal como VASOTEC ^{TM}), ENALAPRILAT ^{TM}, ramipril (tal como ALTACE ^{TM}), cilazapril, delapril, fosenopril (tal como MONOPRIL ^{TM}), zofenopril, indolapril, benazepril (tal como LOTENSIN ^{TM}), lisinopril (tal como PRINIVIL ^{TM} y ZESTRIL ^{TM}), espirapril, trandolapril (tal como MAVIK ^{TM}), perindep, pentopril, moexipril (tal como UNIVASC ^{TM}, fasidotril, S-alilmercaptocaptopril, y pivopril.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más bloqueadores
del receptor de angiotensina II. Los ejemplos de bloqueadores del
receptor de angiotensina II incluyen candesartan (tal como ATACAND
^{TM}), eprosartan (tal como TEVETEN ^{TM}), ibesartan (tal como
AVEPRO ^{TM}), iosartan (tal como
COZAAR ^{TM}), olmesartan, olmesartan medoxomil (tal como BENICAR ^{TM}), tasosartan, telmisartan (tal como MICARDIS ^{TM}), valsartan (tal como DIOVAN ^{TM}), zolasartan, FI-6828K, RNH-6270, UR-7198, Way-126227, KRH-594, TAK-536, BRA-657, y TA-606.
COZAAR ^{TM}), olmesartan, olmesartan medoxomil (tal como BENICAR ^{TM}), tasosartan, telmisartan (tal como MICARDIS ^{TM}), valsartan (tal como DIOVAN ^{TM}), zolasartan, FI-6828K, RNH-6270, UR-7198, Way-126227, KRH-594, TAK-536, BRA-657, y TA-606.
En otra realización el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más bloqueadores
de los canales de calcio. Los ejemplos de los bloqueadores de los
canales de calcio adecuados incluyen nifedipina (tal como ADALAT
^{TM}, ADALAT CC ^{TM} y PROCARDIA ^{TM}, verapamil (tal como
CALAN ^{TM}, COVERA-HS ^{TM}, ISOPTIN
SR ^{TM} y VERELAN ^{TM}) diltiazem (tal como CARDIZEM ^{TM}, CARDIZEM CD ^{TM}, CARDIZEM LA ^{TM}, CARDIZEM SR ^{TM}, DILACOR ^{TM}, TIAMATE ^{TM} Y TIAZAC ^{TM}), isradipina (tal como DYNACIRC ^{TM} y DYNACIRC CR ^{TM}), amlodipina (tal como NORVASC ^{TM}, felodipina (tal como PLENDIL ^{TM}), nisoldipina (tal como SULAR ^{TM}), bepridil (tal como VASCOR ^{TM}), vatanidipina, clevidipina, lercanidipina, dilitiazem, y NNC-55-0396.
SR ^{TM} y VERELAN ^{TM}) diltiazem (tal como CARDIZEM ^{TM}, CARDIZEM CD ^{TM}, CARDIZEM LA ^{TM}, CARDIZEM SR ^{TM}, DILACOR ^{TM}, TIAMATE ^{TM} Y TIAZAC ^{TM}), isradipina (tal como DYNACIRC ^{TM} y DYNACIRC CR ^{TM}), amlodipina (tal como NORVASC ^{TM}, felodipina (tal como PLENDIL ^{TM}), nisoldipina (tal como SULAR ^{TM}), bepridil (tal como VASCOR ^{TM}), vatanidipina, clevidipina, lercanidipina, dilitiazem, y NNC-55-0396.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más bloqueadores
beta. Los ejemplos de bloqueadores beta adecuados incluyen timolol
(tal como BLOCARDEN ^{TM}), carteolol (tal como CARTROL ^{TM}),
carvedilol (tal como COREG ^{TM}), nadolol (tal como CORGARD
^{TM}), propranolol (tal como INNOPRAN XL ^{TM}), betaxolol
(tal como KERLONE ^{TM}), penbutolol (tal como LEVATOL ^{TM}),
metoprolol (tal como LOPRESSOR ^{TM} y TOPROL-XL
^{TM}), atenolol (tal como TENORMIN ^{TM}), pindolol (tal como
VISKEN ^{TM}), y bisoprolol.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede co-administrar con uno o
más bloqueadores alfa. Los ejemplos de bloqueadores alfa adecuados
incluyen prazosina, doxazosina (tal como CARDURA ^{TM}),
fenoxibenzamina (tal como DIBENZYLINE ^{TM}), terazosin (tal como
HYTRIN ^{TM}), CDRI-93/478 y
CR-2991.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede co-administrar con uno o
más bloqueadores alfa -
beta. Un ejemplo de un bloqueador alfa - beta adecuado es labetalol (tales como NORMODYNE ^{TM} o TRAN-
DATE ^{TM}).
beta. Un ejemplo de un bloqueador alfa - beta adecuado es labetalol (tales como NORMODYNE ^{TM} o TRAN-
DATE ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más antagonistas
de los receptores de aldosterona. Los ejemplos de antagonistas de
receptores de aldosterona adecuados incluyen eplerenona (tal como
INSPRA ^{TM}) y espironolactona (tal como ALDACTONE ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de renina. Los ejemplos de inhibidores de renina adecuados incluyen
aliskiren (SPP 100), SPP-500/600 e
YS-004-39.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más
antiadrenérgicos centrales. Los ejemplos de antiadrenérgicos
centrales adecuados incluyen metildopa (tal como ALDOMET ^{TM}),
clonidina (tal como CATAPRES ^{TM} o CATAPRES-TTS
^{TM}), guanfacina (tal como TENEX ^{TM}), y guanabenz (tal
como WYTENSIN ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más
glicósidos/agentes inotrópicos. Un ejemplo de un glicósido/agente
inotrópico adecuado es digoxin (tal como LANOXIN ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más péptidos
natriuréticos de tipo B humanos. Un ejemplo de un péptido
natriurético de tipo B humano es nesiritida (tal como NATRECOR
^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más nitratos
orgánicos o donantes de óxido nítrico. "Donante de óxido
nítrico" se refiere a un compuesto que dona, libera y/o directa
o indirectamente transfiere una especie de monóxido de nitrógeno,
y/o estimulan la producción endógena de óxido nítrico o del factor
relajante derivado de endotelio (EDRF) in vivo y/o elevan los
niveles endógenos de óxido nítrico o EDRF in vivo. También
incluye los compuestos que son sustratos para la óxido nítrico
sintasa. Los ejemplos de donantes de óxido nítrico adecuados
incluyen S-nitrosotioles, nitritos, nitratos,
N-oxo-N-nitrosaminas,
SPM 3672, SPM 5185, SPM 5186 y análogos de los mismos, nitroprúsido
de sodio, nitroglicerina, dinitrato de isosórbido, mononitrato de
isosórbido, molsidomina, SIN-1 y sustratos de las
diversas isoenzimas de la óxido nítrico sintasa.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más agonistas de
bradiquinina.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más activadores
de la guanilato ciclasa solubles. Un ejemplo de un activador de la
guanilato ciclasa soluble adecuado es
BAY-41-8543.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de la endopeptidasa neutra. Los ejemplos de inhibidores de la
endopeptidasa neutra adecuados incluyen omapatrilat, fasidotril,
mixanpril, sampatrilat, Z13752A,
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más antagonistas
endoteliales. Los ejemplos de antagonistas endoteliales adecuados
incluyen ambrisentan, darusentan, J-104132,
SPP-301, TBC-3711,
YM-62899, YM-91746 y
BMS-193884.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de la
3-hidroxi-3-metilglutaril
coenzima A reductasa. Los ejemplos de inhibidores de la
3-hidroxi-3-metilglutaril
coenzima A reductasa adecuados incluyen fluvastatina (tales como
LESCOL ^{TM}), atorvastatina (tal como LIPITOR ^{TM}),
lovastatina (tal como ALTOCOR ^{TM}, o MEVACOR ^{TM}),
pravastatina (tal como PRAVACHOL ^{TM}), rosuvastatina (tal como
CRESTOR ^{TM}), y simvastatina (tal como ZOCOR ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con niacina o uno o más
derivados de ácido nicotínico. Los ejemplos de niacina o derivados
del ácido nicotínico adecuados incluyen NIACOR ^{TM}, NIASPAN
^{TM}, NICOLAR ^{TM}, y SLO-NIACIN ^{TM}.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más derivados de
ácido fíbrico. Los ejemplos de derivados de ácido fíbrico adecuados
incluyen clofibrato (tal como ATROMID-S ^{TM}),
gemfibrozil (tal como LOPID ^{TM}), y fenofibrato (tal como TRICOR
^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más secuestrantes
de ácidos biliares. Los ejemplos de secuestrantes de ácidos
biliares adecuados incluyen colestipol (tal como COLESTID ^{TM}),
colestiramina (tal como LOCHOLEST ^{TM}, PREVALITE ^{TM},
QUESTRAN ^{TM}, y QUESTRAN LIGHT ^{TM}), colesevelam (tal como
WELCHOL ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de absorción de colesterol. Un ejemplo de un inhibidor de la
absorción de colesterol adecuado es ezetimibe (tal como ZETIA
^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de la proteína de transporte del colesteril éster. Un ejemplo de un
inhibidor de la proteína de transporte del colesteril éster
adecuado es torcetrapib.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de cotransportador de ácido biliar dependiente de sodio apical. Los
ejemplos de inhibidores de cotransportador de ácido biliar
dependiente de sodio apical incluyen SD-5613,
AZD7806 y 264W94.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más inhibidores
de la alfa glucosidasa. Los ejemplos de inhibidores de la alfa
glucosidasa adecuados incluyen miglitol (tal como GLYSET ^{TM}) y
acarbosa (tal como PRECOSE ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con una o más biguanidas.
Los ejemplos de biguanidas adecuados incluyen rosiglitazona (tal
como AVANDAMET ^{TM}) y metformin (tal como GLUCOPHAGE ^{TM} y
GLUCOPHAGE XR ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con una o más insulinas.
Los ejemplos de insulinas adecuadas incluyen HUMALOG ^{TM},
HUMALOG 50/50 ^{TM}, HUMALOG 75/25 ^{TM}, HUMULIN
50/50 ^{TM}, HUMALIN 75/25 ^{TM}, HUMALIN L ^{TM}, HUMALIN N ^{TM}, HUMALIN R ^{TM}, HUMALIN R U-500 ^{TM}, HUMALIN U ^{TM}, ILETIN II LENTE ^{TM}, ILETIN II NPH ^{TM}, ILETIN II REGULAR ^{TM}, LANTUS ^{TM}, NOVOLIN
70/30 ^{TM}, NOVILIN N ^{TM}, NOVILIN R ^{TM}, NOVOLOG ^{TM}, VELOSULIN BR ^{TM}, y EXUBERA ^{TM}.
50/50 ^{TM}, HUMALIN 75/25 ^{TM}, HUMALIN L ^{TM}, HUMALIN N ^{TM}, HUMALIN R ^{TM}, HUMALIN R U-500 ^{TM}, HUMALIN U ^{TM}, ILETIN II LENTE ^{TM}, ILETIN II NPH ^{TM}, ILETIN II REGULAR ^{TM}, LANTUS ^{TM}, NOVOLIN
70/30 ^{TM}, NOVILIN N ^{TM}, NOVILIN R ^{TM}, NOVOLOG ^{TM}, VELOSULIN BR ^{TM}, y EXUBERA ^{TM}.
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con una o más meglitinidas.
Los ejemplos de meglitinidas adecuados incluyen repaglinida (tal
como PRANDIN ^{TM}) y nateglinida (tal como
STARLIX ^{TM}).
STARLIX ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con una o más
sulfonilureas. Los ejemplos de sulfonilureas adecuados incluyen
glimepirida (tal como AMARYL ^{TM}), gliburida (tal como
DIABETA ^{TM}, GLYNASE PRESTAB ^{TM} o MICRONASE ^{TM}), y glipizida (tal como GLUCOTROL ^{TM} y GLUCOTROL XL ^{TM}).
DIABETA ^{TM}, GLYNASE PRESTAB ^{TM} o MICRONASE ^{TM}), y glipizida (tal como GLUCOTROL ^{TM} y GLUCOTROL XL ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con una o más
tiazolidindionas. Los ejemplos de tiazolidindionas adecuadas
incluyen pioglitazona (tal como ACTOS ^{TM}) y rosiglitazona (tal
como AVANDIA ^{TM}).
En otra realización, el compuesto de
carboxipiperidina se puede coadministrar con uno o más ligandos
alfa-2-delta. Los ejemplos de
ligandos alfa-2-delta adecuados
incluyen gabapentina, pregabalina (tal como LYRICA ^{TM}), ácido
[(1R,5R,6S)-6-(aminometil)biciclo[3.2.0]hept-6-il]acético,
3-(1-aminometil-ciclohexilmetil)-4H-[1,2,4]oxadiazol-5-ona,
C-[1-(1H-tetrazol-5-ilmetil)-cicloheptil]metilamina,
ácido
(3S,4S)-(1-aminometil-3,4-dimetilciclopentil)-acético,
ácido (1\alpha,
3\alpha,5\alpha)-(3-aminometil-biciclo[3.2.0]hept-3-il)-acético,
ácido
(3S,5R)-3-aminometil-5-metil-octanoico,
ácido
(3S,5R)-3-amino-5-metil-heptanoico,
ácido
(3S,5R)-3-amino-5-metil-nonanoico
y ácido
(3S,5R)-3-amino-5-metil-octanoico,
(2S,4S)-4-(3-clorofenoxi)pralina,
y
(2S,4S)-4-(3-fluorobencil)pralina.
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La presente invención comprende además kits que
son adecuados para uso en la realización de los procedimientos de
tratamiento descritos anteriormente. En una realización, el kit
comprende una primera forma de dosificación que comprende el
compuesto de carboxipiperidina y un recipiente para la primera forma
de dosificación. En otra realización, el kit comprende una primera
forma de dosificación que comprende el compuesto de
carboxipiperidina y una segunda forma de dosificación que comprende
un segundo agente terapéutico.
En otra realización, el kit comprende una
primera forma de dosificación que comprende el compuesto de
carboxipiperidina y una segunda forma de dosificación que comprende
un inhibidor de la enzima conversora de angiotensina.
En otra realización, el kit comprende una
primera forma de dosificación que comprende el compuesto de
carboxipiperidina y una segunda forma de dosificación que comprende
un antagonista del receptor de angiotensina II.
En otra realización, el kit comprende una
primera forma de dosificación que comprende el compuesto de
carboxipiperidina y una segunda forma de dosificación que comprende
un antagonista de receptor de aldosterona.
En otra realización, el kit comprende una
primera forma de dosificación que comprende el compuesto de
carboxipiperidina y una segunda forma de dosificación que comprende
un donante de óxido nítrico.
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El compuesto de carboxipiperidina se puede
preparar usando los procedimientos ilustrados en los esquemas de
síntesis y los procedimientos experimentales descritos a
continuación. Los esquemas de síntesis generales se presentan para
propósitos de ilustración y no se pretende que sean limitantes. Los
materiales de partida usados para preparar el compuesto de
carboxipiperidina están comercialmente disponibles o se pueden
preparar mediante procedimientos de rutina bien conocidos por los
expertos en la técnica (tales como los procedimientos descritos en
libros de referencia convencionales tales como COMPENDIUM OF ORGANIC
SYNTHETIC METHODS, Vol. I - VI (publicado por Wiley -
Interscience)).
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Esquema
1
El esquema 1 esboza un procedimiento general
para la preparación del ácido libre del compuesto de
carboxipiperidina.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esquema
2
El esquema 2 esboza un procedimiento general
alternativo para la preparación del ácido libre del compuesto de
carboxipiperidina.
Los siguientes ejemplos ilustran la síntesis del
ácido libre del compuesto de carboxipiperidina:
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Etapa
1
Se cargó un matraz de 1 l con
3-etil-4-nitropirazol-5-carboxamida
(preparado como se describe en el documento EP 1176142 en la página
18) (15,0 g, 81 mmoles), trifenilfosfina (25,6 g, 97,8 mmoles), y
tetrahidrofurano (120 ml). La mezcla resultante se enfrió colocando
el matraz en un baño a 0ºC y se añadió 2-etoxietanol
(9,5 ml, 98 mmoles) al matraz. Una solución de azodicarboxilato de
di-terc-butilo (22,5 g, 97,8 mmoles)
en tetrahidrofurano (90 ml) se añadió después al matraz durante un
período de 2,5 horas. La mezcla se agitó con enfriamiento durante
una hora adicional y después se calentó hasta temperatura ambiente y
se agitó durante una hora adicional. La mezcla se enfrió de nuevo
hasta 0ºC, se trató con ácido clorhídrico 6 M (40 ml), y se calentó
hasta 40ºC durante una hora. La mezcla se concentró parcialmente y
se extrajo entre acetato de etilo y agua. La fase acuosa se volvió
a extraer con acetato de etilo. Las fases orgánicas combinadas se
lavaron con agua, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato
de magnesio, se filtraron y se concentraron después. El aceite
viscoso resultante se trató con 2-propanol y esta
mezcla se concentró después. El material resultante se trató con
2-propanol y se calentó. Tras el enfriamiento, los
cristales resultantes se filtraron, se enjuagaron con
2-propanol frío, y se secaron produciendo 16,5 g del
compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Se combinaron
1-(2-etoxietil)-3-etil-4-nitro-1H-pirazol-5-carboxamida
de la etapa 1 (15,0 g, 58 mmoles), platino al 5% sobre carbono
(0,75 g), y acetato de isopropilo (150 ml) y la mezcla se agitó bajo
80 psi (551,58 kPa) de hidrógeno durante aproximadamente 50 horas.
Después la mezcla se filtró a través de celita, se enjuagó la
celita con acetonitrilo, y el filtrado se concentró. El material
finalmente cristalizó proporcionando 13,7 g en forma de un hidrato
del compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó una mezcla de carbonildiimidazol
(12,3 g, 76,1 mmoles) en acetonitrilo (123 ml) hasta 50ºC. La
4-amino-1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo-5-carboxamida
preparada en la etapa 3 (13,2 g, 58 mmoles) se añadió a la mezcla
durante un período de una hora y la temperatura de la mezcla se
incrementó hasta 75ºC durante la adición. Después la mezcla se
enfrió y se agitó durante toda una noche. La mezcla se enfrió en un
baño de hielo y se filtró. La torta del filtro se enjuagó con agua
y se secó proporcionando 12,8 g del compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
\newpage
Se trató una mezcla de
1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona
de la etapa 3 (25,2 g, 100 mmoles) con PhPOCl_{2} (195 g, 1000
mmoles) y se calentó, en N_{2}, con agitación a 135ºC durante 20
horas. La mezcla se enfrió y después se calentó a 140ºC durante 20
horas adicionales. La mezcla se enfrió y se añadió lentamente a una
mezcla de hielo (600 g)/agua (200 ml). Ésta se agitó durante 3 horas
y el sólido resultante se recogió mediante filtración y se enjuagó
con agua (2 x 100 ml). El sólido se suspendió con acetato de etilo
(300 ml). Se añadió agua (200 ml) y se ajustó el pH a 1 - 2. Después
se añadió NaHCO_{3} al 10% (125 ml) (dando como resultado un pH
de ~ 7) y se separaron las fases. La fase orgánica se lavó
sucesivamente con agua (400 ml) y solución saturada de cloruro
sódico (150 ml). Después se secó la solución orgánica, y se
concentró proporcionando 23 g del compuesto del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató una mezcla de
2-amino-4-picolina
(4,32 g, 40 mmoles) y
5,7-dicloro-1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidina
de la etapa 4 (5,78 g, 20 mmoles) con THF (25 ml) y se enfrió hasta
0ºC. La mezcla se agitó y se trató con LiN(TMS)_{2}
1 M en THF (40 ml, 40 mmoles) a una velocidad tal que la temperatura
se mantuvo por debajo de 5ºC. La mezcla se agitó durante 30 minutos
y después se trató con solución de ácido cítrico al 10% hasta que
se logró un pH de 6 - 7. La mezcla se concentró parcialmente a
presión reducida. Después la mezcla se agitó a 5ºC durante 1 hora.
El sólido resultante se recogió mediante filtración por succión y
se lavó con agua (40 ml). Se secó el sólido en una estufa de vacío a
una temperatura menor que 60ºC produciendo 7,0 gramos del compuesto
del título.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó una mezcla de
N-[5-cloro-1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo[4,3-
d]pirimidin-7-il]-4-metilpiridin-2-ilamina
de la etapa 5 (5,42 g, 166 mmoles), ácido isonipecótico (85,9 g,
665 mmoles), carbonato de cesio (162 g, 498 mmoles), y DMSO (55 ml)
con agitación a 125ºC. Después de 20 horas, la mezcla se enfrió
hasta 20ºC y se añadió agua (165 ml). Esta mezcla se agitó durante
15 minutos y después se trató con acetato de etilo (55 ml). Se
separaron las fases y la acuosa se trató con otra parte de acetato
de etilo (55 ml). Se separaron las fases otra vez y la fase acuosa
se llevó hasta pH ~ 5 usando HCl 6 M. Después de agitar durante 1
hora, se filtró el sólido resultante, se lavó con agua (20 ml) y se
secó a vacío, proporcionando 5,5 g del compuesto del título.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 400 MHz): \delta 1,10
(t, 3 H), 1,30 (t, 3 H), 1,49 - 1,60 (m, 2 H), 1,84 - 1,95 (m, 2
H), 2,32 - 2,36 (m, 3 H), 2,52 - 2,57 (m, 1 H), 2,78 (c, 2 H), 2,99
- 3,08 (m, 2H), 3,52 (c, 2 H), 3,78 (t, 2 H), 4,45 - 4,53 (m, 2 H),
4,56 - 4,64 (m, 2 H), 6,91 (d, 1 H), 8,05 (s, 1 H), 8,18 (d, 1 H),
9,63 (s, 1 H), 12,18 (s, 1 H). CLEM m/z 454.
\newpage
Como alternativa, una mezcla de
N-[5-cloro-1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-il]-4-metilpiridin-2-ilamina
de la etapa 5 (se puede combinar con ácido isonipecótico (entre 1 y
10 equivalentes) y una base y se calentó entre 100 - 125ºC en un
disolvente hasta que se completa la reacción. Las bases adecuadas
incluyen carbonato de cesio, carbonato de sodio y carbonato de
potasio. Los disolventes adecuados incluyen DMSO y
N,N-dimetilformamida. Tras enfriamiento, se puede
añadir agua y la solución básica extraerse (entre 1 y 3 veces) con
un disolvente orgánico tal como acetato de etilo. La fase básica
restante se acidifica hasta pH 5 con HCl. La mezcla se agita
durante aproximadamente 1 hora. El sólido se retira por filtración,
se lava con agua, y se seca a vacío proporcionando el compuesto del
título.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
1-(2-etoxietil)-3-etil-4-nitro-1H-pirazolo-5-carboxamida
se preparó de acuerdo con la etapa 1, del Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Se trató una mezcla de
1-(2-etoxietil)-3-etil-4-nitro-1H-pirazol-5-carboxamida
de la etapa 1 (5,70 g, 22 mmoles) e hidróxido de paladio (1,0 g) en
etanol (110 ml) con formiato de amonio (7,01 g, 111 mmoles) en
cuatro partes desiguales a aproximadamente intervalos de 10
minutos. La mezcla resultante se calentó a reflujo durante dos
horas y después se enfrió. La mezcla se filtró a través de celita y
se concentró. El residuo resultante se purificó mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice usando una mezcla de
acetato de etilo y hexano como el eluyente proporcionando 2,45 g
del compuesto del título. ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 400 MHz):
\delta 1,17 (t, 3 H), 1,21 - 1,32 (m, 3 H), 2,60 (c, 2 H), 3,53
(c, 2 H), 3,79 - 3,95 (m, 2 H), 4,38 - 4,52 (m, 2 H). EM (IEP) m/z
227.
\newpage
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se trató una mezcla de
4-amino-1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo-5-carboxamida
de la etapa 2 (2,44 g, 10,8 mmoles) en
N,N-dimetilformamida (40 ml) con carbonildiimidazol
(1,92 g, 11,9 mmoles) y se calentó a 80ºC durante toda una noche.
La mezcla se concentró a vacío y el residuo se purificó mediante
cromatografía en columna sobre gel de sílice usando una mezcla de
acetato de etilo y hexano como el eluyente proporcionando 1,04 g
del compuesto del título. EM (IEP) m/z 253.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentó una mezcla de
1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona
preparada en la etapa 3 (7,2 g) y oxicloruro de fósforo (200 ml)
con una gota de N,N-dimetilformamida a reflujo
durante toda una noche. La mezcla se enfrió y el oxicloruro de
fósforo se evaporó a presión reducida. Se añadió hielo al residuo
resultante y después la mezcla se extrajo con cloroformo. Se secaron
las fases orgánicas sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se
evaporaron proporcionando 2,09 g de
5,7-dicloro-1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidina
en forma de un aceite que solidificó tras reposo CLEM m/z 289.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
5
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se añadieron la
5,7-dicloro-1-(2-etoxietil)-3-etil-1H-pirazolo[4,3-d]pirimidina
preparada en la etapa 4 (1 mmol),
2-amino-4-picolina
(2 mmoles), N,N-diisopropiletilamina (3 mmoles), y
N-metilpirrolidona (1 ml) a cada uno de dos
recipientes de reacción. Cada recipiente se irradió en un microondas
CEM Discover durante 15 minutos a 150ºC. Se añadió ácido
isonipecótico (3 mmoles) a cada recipiente de reacción y la mezcla
resultante se irradió durante 15 minutos a 180ºC. Se combinaron los
contenidos de los dos recipientes de reacción. Se añadieron agua y
acetato de etilo a la mezcla y se agitó la mezcla. Se añadió ácido
clorhídrico (1 M) a la mezcla y la mezcla se agitó otra vez. Se
separaron las fases. Se lavó la fase orgánica con agua, se añadió
ácido clorhídrico (1 M), y se separaron las fases. La fase orgánica
se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó. El pH de
la fase acuosa se incrementó hasta aproximadamente seis mediante la
adición de carbonato sódico saturado y después la fase acuosa se
extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó sobre
sulfato de magnesio, se filtró, se añadió al residuo orgánico
anterior y se evaporó. La solución se purificó mediante
RP-HPLC en una columna C-18 Varian
Dynamax (250 x 41,4 mm) con un gradiente de 10 - 95% de
acetonitrilo/agua (ácido clorhídrico) durante 15 minutos en dos
lotes. Las fracciones se combinaron y se evaporaron produciendo
0,26 g del compuesto del título. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}, 400 MHz): \delta 1,10 (t, 3 H),
1,30 (t, 3 H), 1,49 - 1,60 (m, 2 H), 1,84 - 1,95 (m, 2 H), 2,32 -
2,36 (m, 3 H), 2,52 - 2,57 (m, 1 H), 2,78 (c, 2 H), 2,99 - 3,08
(m, 2H), 3,52 (c, 2 H), 3,78 (t, 2 H), 4,45 - 4,53 (m, 2 H), 4,56 -
4,64 (m, 2 H), 6,91 (d, 1 H), 8,05 (s, 1 H), 8,18 (d, 1 H), 9,63
(s, 1 H), 12,18 (s, 1 H). CLEM m/z 454.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede usar un ensayo in vitro para
evaluar la inhibición de la actividad de la enzima PDE5 mediante un
compuesto de ensayo. Como se describe más específicamente más
adelante, este ensayo mide el valor de CI_{50} de PDE5 para el
compuesto de ensayo (es decir, la concentración del compuesto de
ensayo requerida para inhibir el 50% de la hidrólisis catalizada
por la enzima PDE5 de cGMP a GMP con relación a la actividad de
controles no
inhibidos).
inhibidos).
La enzima PDE5 para uso en el ensayo se puede
obtener a partir de plaquetas humanas mediante la modificación
apropiada del procedimiento de Thompson, WJ y col.; Biochemistry 18
(23), 5228 - 5237, 1979, como han descrito Ballard SA y col.; J.
Urology 159 (6), 2164 - 2171, 1998. La enzima PDE5 aislada de
plaquetas humanas se puede usar para catalizar la hidrólisis de
[^{3}H]cGMP (Amersham Biosciences) a 5' nucleótido
[^{3}H]GMP. El [^{3}H]GMP se une a perlas de SPA
de silicato de itrio (Amersham Biosciences) y se detecta mediante
conteo de centelleo. Más específicamente, el efecto del compuesto
de ensayo a diferentes concentraciones se puede evaluar en el
ensayo poniendo en contacto el compuesto con una cantidad fija de
enzima PDE5 en presencia de sustrato (cGMP o cAMP en una relación
3:1 de no marcado a marcado con [^{3}H]. El conteo de centelleo se
puede usar como se ha descrito anteriormente para determinar la
actividad relativa de enzima PDE5. La inhibición de la actividad de
la enzima PDE5 se calcula después con relación a la actividad de la
enzima PDE5 total de los controles no inhibidos.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón A:
- Tris - HCl 20 mM, MgCl_{2} 5 mM, pH 7,4
- Tampón B:
- BSA 2 mg/ml en tampón A (tampón de enzima)
- Sustrato de cGMP:
- Concentración final de 500 nM en ensayo
La cantidad de sustrato marcado con ^{3}H
añadido depende de la actividad específica de [^{3}H]cGMP,
y el sustrato cGMP se diluye con solución madre 10 mM de cGMP fría
en tampón A para una concentración de sustrato final de 500 nM en
el ensayo.
- Enzima PDE:
- Preparada en tampón B. El factor de dilución se determina mediante actividad de la enzima.
- Perlas de SPA:
- 20 mg/ml de suspensión preparada en dH2O.
\vskip1.000000\baselineskip
Las soluciones madre de compuestos de ensayo y
del patrón se preparan a 5 mM en DMSO al 100%. El compuesto se
diluye en serie en una placa de dilución usando un formato de
dilución semilogarítmico de 10 puntos. Se añaden 2 \mul de la
dilución del compuesto por duplicado a los pocillos de la placa de
ensayo. Se añaden 2 \mul de DMSO al 100% a los pocillos de
control designados. Se añaden 25 \mul de tampón A a todos los
pocillos. Se añaden 25 \mul de tampón B a los pocillos de control
negativos. Se añaden 25 \mul de enzima a los pocillos restantes.
Se añaden 50 \mul de sustrato a cada pocillo. Las placas se sellan
e incuban durante 60 minutos sobre un agitador de placas a 30ºC. Se
añaden 50 \mul de perlas de SPA para parar la reacción. Las
placas se sellan de nuevo y se agitan durante 15 minutos para
permitir que las perlas se unan al producto de GMP. Las perlas se
dejan sedimentar durante 30 minutos y después se leen en un contador
de centelleo NXT Top Count. Los datos se analizan con una
aplicación de ajuste de curva para la selección basada en placas.
El porcentaje de inhibición en este ensayo se calcula como
sigue:
Inhibición (%)
= [(máximo medio - valor del compuesto / (máximo medio - mínimo
medio)] x
100.
El valor de CI_{50} se determina a partir de
curvas de respuesta a la dosis sigmoidales de actividad de enzima
contra la concentración de compuesto.
El compuesto de carboxipiperidina se ensayó de
acuerdo con el procedimiento 1. Los valores de CI_{50} de PDE5
correspondientes medidos se reseñan en la Tabla A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos previamente descritos en los
ejemplos del documento WO 2004096810 se ensayaron de acuerdo con el
procedimiento 1. Los valores de CI_{50} de PDE5 correspondientes
medidos se reseñan en la Tabla B.
La CI_{50} de la PDE5 de un compuesto de
ensayo también se puede medir en un ensayo in vitro
alternativo que varía del procedimiento 1 como se describe más
adelante:
\vskip1.000000\baselineskip
- Tampón A:
- Tris - HCl 20 mM, MgCl_{2} 5 mM, pH 7,4
- Tampón B:
- BSA 2 mg/ml en tampón A (tampón de enzima)
- Sustrato de cGMP:
- Concentración final de 50 nM en ensayo
La cantidad de sustrato marcado con ^{3}H
depende de la actividad específica de [^{3}H]cGMP, y se
diluye en tampón A.
- Enzima PDE:
- Preparada en tampón B. El factor de dilución se determina mediante actividad de la enzima.
- Perlas de SPA:
- 4 mg/ml de suspensión preparada en dH_{2}O.
Las soluciones madre de compuestos de ensayo se
preparan a 2 mM en DMSO al 100%. El compuesto de ensayo se diluye
en serie en una placa de dilución usando un formato de dilución 1/5
logarítmico de 10 puntos de manera que la concentración de partida
en el ensayo es 2 \muM para una selección de la CI_{50} inicial;
las CI_{50} confirmatorias se hacen usando una dilución 1/3
logarítmica de 10 puntos. Se añaden 27 \mul de tampón A a los
pocillos de las placas de ensayo. A partir de la placa de dilución
se distribuyen 3 \mul de compuesto diluido por duplicado o se
añaden 3 \mul de DMSO al 100% (para controles positivos y
negativos). Se añaden 30 \mul de enzima. Para los pocillos de
control negativo, se añade el tampón B en lugar de la enzima. Se
añaden a todos pocillos 30 \mul de sustrato marcado.
Después de incubar durante 60 minutos a
temperatura ambiente, la reacción se para con la adición de 30
\mul de perlas de silicato de itrio. Estas perlas son densas y
requieren agitación constante mientras se añaden a la placa. Las
placas se sellan y se agitan en un agitador de placas durante quince
minutos para permitir que las perlas se unan al producto de
GMP.
Después de dejar que las perlas sedimenten
durante 30 minutos, las placas se leen en un contador de centelleo
NXT TopCount y se analizan los datos como sigue. Los valores de
porcentaje de inhibición se calculan usando las medias de los
controles al 0% y al 100% en cada placa. Las estimaciones de los 4
parámetros del modelo dosis - respuesta logístico, sigmoidal se
calculan después usando el valor de inhibición en porcentaje del
nivel del pocillo para el compuesto. La fórmula del modelo logístico
de cuatro parámetros se puede expresar como Y = ((a – d) / (1 +
(X / c)^b)) + d, donde Y es la respuesta, X es la concentración, a
es la asíntota inferior (respuesta mínima), d es la asíntota
superior (respuesta máxima), c es la CI_{50} del modelo (en las
mismas unidades que X), y b es la pendiente (como se describe en De
Lean, A., P. J. Munson, y D. Rodbard ("Simultaneous analysis of
families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand
assay, and physiological dose-response curves".
Am. J. Physiol, 235 (2): E97 - E102, 1978). Estas estimaciones se
usan para calcular la concentración que corresponde a un 50% de
inhibición.
El compuesto de carboxipiperidina se ensayó de
acuerdo con el procedimiento 1A. Los valores de CI_{50} de PDE5
correspondientes medidos se reseñan en la Tabla C.
Los compuestos previamente descritos en los
ejemplos del documento WO 2004096810 se ensayaron de acuerdo con el
procedimiento 1A. Los valores de CI_{50} de PDE5 correspondientes
medidos se reseñan en la Tabla D.
\vskip1.000000\baselineskip
La inhibición de la actividad de la enzima PDE6
mediante un compuesto de ensayo se puede medir de acuerdo con el
ensayo in vitro del procedimiento 1, pero usando la enzima
PDE6 semipurificada aislada de retina humana, bovina o canina en
lugar de la enzima PDE5. Este ensayo mide el valor de la CI_{50}
de la PDE6 para el compuesto de ensayo (es decir, la concentración
del compuesto de ensayo requerida para inhibir en un 50% la
hidrólisis catalizada por la enzima PDE6 de [^{3}H]GMP al
5' nucleótido [^{3}H]cGMP con relación a la actividad de
los controles no inhibidos). El [^{3}H]GMP se une a perlas
de SPA de silicato de itrio y se detecta mediante conteo de
centelleo.
Purificación de la PDE6: La PDE6 se
puede aislar y purificar a partir de lo siguiente: PDE6 de bastones
soluble/PDE6 del segmento externo de bastones de ojos de bovinos
(Charles River Ltd, Francia); PDE6 de conos de ojos de caninos
(LAS); o PDE6 de conos y bastones soluble de ojos humanos
(I.I.A.M.).
\vskip1.000000\baselineskip
- Hepes 20 mM (Sigma)
- 2,383 gramos
- EDTA 1 mM (Sigma)
- 0,186 gramos
Disolver en 300 ml de HPLC (Acros) o agua
desionizada dos veces.
- PMSF 100 mM (Sigma)
- 0,174 gramos/10 ml de etanol
Añadir 5 ml de solución de PMSF a tampón
lentamente para evitar la precipitación.
- Añadir Sacarosa 250 mM (Fisher)
- 42,78 gramos
Ajustar el volumen a 500 ml, agitar hasta
disolución.
Ajustar el pH hasta 7,2 usando NaOH 1 M.
Almacenar a 4ºC.
Preparación de la retina: Dejar que los
ojos se descongelen hasta que estén blandos y hasta que la córnea y
cristalino estén transparentes. Mientras que sujeta el ojo de forma
que la córnea esté en la parte superior, realizar una pequeña
incisión a través de la conjuntiva por debajo del nivel del iris. La
incisión debe ser suficiente para permitir que el humor se escape a
través del corte. Usando unas tijeras finas, realizar un corte
alrededor de la córnea para permitir que se despegue como una
solapa. Usando un gancho pequeño, enganchar el cristalino y
suavemente sacarlo fuera de la órbita, tener cuidado de no sacar la
retina al mismo tiempo. Dejar que la retina se caiga por su propia
voluntad hasta la base de la órbita.
Evaluar la retina con cuidado y localizar el
nervio óptico. Cortar a través del nervio óptico y transferir la
retina a una placa pequeña que contiene unos pocos ml de tampón de
homogeneización. Suavemente hacer flotar la retina fuera de la
superficie del tampón y retirar cualquier material pigmentado
evidente del iris. Colocar la retina en una segunda placa con
tampón de limpieza para retirar las últimas pequeñas cantidades de
pigmento y después transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml
Corning Costar (Sigma) y mantenerlo en hielo.
Aislamiento y purificación de la PDE6 de la
retina: Dejar 2 ml del tampón de homogeneización por retina de
bovinos y 1 ml por retina de perro y de ser humano. Homogeneizar
usando un homogeneizador de mano con ráfagas 3 x 5 segundos
enfriando en hielo entre cada ráfaga. Filtrar el homogenato a través
de dos capas de gasa quirúrgica. Centrifugar a 100.000 g durante 60
minutos a 4ºC. Filtrar el citosol o bien a través de un paquete
Steril-D de 0,22 \mum si existe suficiente
volumen o a través de filtro terminado en jeringa de 0,22 \mum
(por ejemplo Millex ® GV). Procesar a través de FPLC (Pharmacia
FPLC/FRAC-100, Pharmacia) o dividir en alícuotas y
almacenar en nitrógeno líquido según se necesite.
Procedimiento
2A
La inhibición de la actividad de la enzima PDE6
mediante un compuesto de ensayo se puede medir de acuerdo con el
ensayo in vitro del procedimiento 1A, pero usando la enzima
PDE6 semipurificada aislada de retina humana, bovina o canina en
lugar de la enzima PDE5. Este ensayo mide el valor de la CI_{50}
de la PDE6 para el compuesto de ensayo (es decir, la concentración
del compuesto de ensayo requerida para inhibir en un 50% la
hidrólisis catalizada por la enzima PDE6 de [^{3}H]cGMP al
5' nucleótido [^{3}H]GMP con relación a la actividad de
los controles no inhibidos). El [^{3}H]GMP se une a perlas
de SPA de silicato de itrio y se detecta mediante conteo de
centelleo.
La inhibición de la actividad de la enzima PDE11
mediante un compuesto de ensayo se puede medir de acuerdo con el
ensayo in vitro del procedimiento 1, pero usando la enzima
PDE11 expresada en células de insecto Sf9 en lugar de la enzima
PDE5. Este ensayo mide el valor de la CI_{50} de la PDE11 para el
compuesto de ensayo (es decir, la concentración del compuesto de
ensayo requerida para inhibir en un 50% la hidrólisis catalizada
por la enzima PDE11 de [^{3}H]cGMP al 5' nucleótido
[^{3}H]GMP con relación a la actividad de los controles no
inhibidos). El [^{3}H]GMP se une a perlas de SPA de
silicato de itrio y se detecta mediante conteo de centelleo.
- (a)
- Expresión: Infectar 200 ml de células de insecto Sf9 (Invitrogen, Carlsbad, CA) (1 x 10^{6}/ml) con una multiplicidad de infección de 2 usando un vector de expresión de baculovirus que contiene PDE- 11A1 transpuesta (SEQ ID Nº: 1) (sistema pFastBac, Invitrogen) (4 x 10^{7} ufp/ml). Incubar a 27ºC con agitación a 220 rpm durante 48 horas. Recoger las células infectadas mediante sedimentación centrifugando a 2000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Almacenar el sedimento de células infectadas a -80ºC hasta que esté listo para purificación. Resuspender los sedimentos de las células descongelados a 1 x 10^{7} células/ml (= 20 ml de tampón constituido por Hepes 20 mM (pH 7,2), EDTA 1 mM, sacarosa 20 mM, NaCl 150 mM y comprimidos de inhibidor de la proteasa). Mezclar completamente y dejar en reposo en hielo durante 10 minutos. Sonicar 5 veces durante 5 segundos, en hielo. Centrifugar la mezcla a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC en SS34. Almacenar el sedimento insoluble a -80ºC, y proceder a la purificación del material soluble.
- (b)
- Purificación. Preparar la columna (1,0 cm de diámetro, Kontes) mediante enjuagado de la columna vacía dos veces con TBS. Después mezclar las perlas (Anti-FLAG M2 Agarosa, Sigma) con TBS y añadir a la columna - dejar que las perlas sedimenten. Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de glicina 0,1 M (pH 3,5). Después lavar la columna con 5 volúmenes de columna de TBS (no dejar que se procese en seco). Aplicar el extracto a la columna y dejar que el extracto entre por flujo de gravedad. Volver a aplicar el flujo a través de la columna. Lavar la columna con 15 volúmenes de columna de TBS. Eluir la proteína con 5 alícuotas de 1 ml de péptido FLAG (Sigma) (es decir, 100 \mug/ml en TBS). Eluir la proteína restante con 1 ml de glicina 0,1 M, e inmediatamente añadir 25 \mul de Tris 1 M pH 8 para neutralizar.
\vskip1.000000\baselineskip
La inhibición de la actividad de la enzima PDE11
mediante un compuesto de ensayo se puede medir de acuerdo con el
ensayo in vitro del procedimiento 1A, pero usando la enzima
PDE11 expresada en células de insecto Sf9 en lugar de la enzima
PDE5. Este ensayo mide el valor de la CI_{50} de la PDE11 para el
compuesto de ensayo (es decir, la concentración del compuesto de
ensayo requerida para inhibir en un 50% la hidrólisis catalizada
por la enzima PDE11 de [^{3}H]cGMP al 5' nucleótido
[^{3}H]GMP con relación a la actividad de los controles no
inhibidos). El [^{3}H]GMP se une a perlas de SPA de
silicato de itrio y se detecta mediante conteo de centelleo.
El compuesto de carboxipiperidina se ensayó de
acuerdo con el procedimiento 2, procedimiento 2A, procedimiento 3,
y procedimiento 3A. Los valores de CI_{50} de la PDE6 y PDE11
correspondientes medidos se reseñan en la tabla E.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos previamente descritos en los
ejemplos del documento WO 2004096810 se ensayaron de acuerdo con el
procedimiento 2, procedimiento 2A, procedimiento 3 y procedimiento
3A. Los valores de CI_{50} de PDE6 y PDE11 correspondientes
medidos se reseñan en la Tabla F.
Los ensayos adicionales que se pueden usar para
evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo incluyen el
procedimiento 4, procedimiento 4A, procedimiento 5 y procedimiento 6
descritos más adelante:
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede usar un ensayo ex vivo para
medir el relajamiento directo de un anillo de aorta de rata expuesto
a un compuesto de ensayo. Como se describe más adelante más
específicamente, un compuesto de ensayo que inhibe la actividad de
la PDE5 induce un relajamiento del anillo de la aorta potenciando la
señal de cGMP (es decir, mediante la inhibición de la hidrólisis
catalizada por la enzima PDE5 de cGMP a GMP) provocada cuando el
anillo de la aorta se expone a un donante de óxido nítrico exógeno
estable, tal como dietiltriamina NONOato
(diazen-1-io-1,2-diolato,
también conocido como "DETA-NO"). El ensayo
mide el valor de la CE_{50} para el compuesto de ensayo (es
decir, la concentración del compuesto de ensayo que produce un 50%
de la respuesta eficaz posible máxima para el compuesto de
ensayo).
Se asfixiaron ratas macho
Sprague-Dawley (250 - 350 g) usando gas CO_{2} y
se extrajeron cuidadosamente sus aortas torácicas y se colocaron en
tampón de Krebs. Las aortas se diseccionaron cuidadosamente sin
tejido conectivo y se dividieron en 8 secciones, cada una de 3 - 4
mm de longitud.
Se suspendieron los anillos de la aorta entre
cables de acero inoxidable paralelos en un baño de tejidos de 15
ml, con camisa de agua (37ºC) bajo una tensión en reposo de 1 gramo.
La tensión se mide usando transductores de tensión isométrica y se
registraron usando un sistema de plataforma de tejido Ponemah. Se
deja que cada preparación se equilibre durante al menos 60 minutos
antes de ensayar el compuesto. Durante este tiempo, los tejidos
también se incuban con NG-monometil
L-arginina 200 \muM
("L-NMMA"), y se cambió el medio de incubación
cada 15 a 20 minutos (L-NMMA se añade después de
cada lavado para mantener la concentración final a 200 \muM en
cada baño de tejido).
Después del período de equilibrio, las tensiones
iniciales se registran para cada tejido. Se determina la respuesta
vasoconstrictora a fenilefedrina (1 \muM) y cuando la respuesta a
fenilefrina alcanza un máximo, se determina posteriormente la
reactividad vascular mediante una estimulación de acetilcolina (1
\muM). Después de otro período de lavado, se registra un segundo
valor inicial después de la adición de la noradrenalina
vasoconstrictora (25 \muM) a cada baño y se incuban los tejidos
durante un período de tiempo (aproximadamente 15 minutos)
suficiente para que los tejidos alcancen un tono estable. Se
suministra un estímulo de óxido nítrico exógeno usando el donante
de óxido nítrico estable, DETA-NO. La concentración
de DETA-NO se valora (de forma acumulada en
incrementos semilogarítmicos) para lograr aproximadamente 5 a 15% de
relajamiento de la preconstricción provocada por noradrenalina. Las
curvas de concentración - respuesta acumulativas se construyen en un
solo anillo, usando típicamente 5 dosis/anillo y dejando 15 minutos
entre cada adición.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento 4 se puede modificar para
proporcionar un protocolo alternativo para medir el relajamiento
directo de los anillos de la aorta de rata expuestos a un compuesto
de ensayo. El procedimiento alternativo varía del procedimiento 4
como se describe más adelante:
Para el procedimiento alternativo, se retira
primero el endotelio mediante fricción cuidadosa del lumen del vaso
conjuntamente entre los dedos antes de preparar los anillos (anillos
desnudos). La tensión en reposo se fija a 2 gramos y se determina
la respuesta vasoconstrictora a una concentración máxima de
fenilefrina (1 \muM), seguido (después de un periodo de lavado)
de dos exposiciones adicionales a fenilefrina 300 nM. La relación
concentración - respuesta a noradrenalina se construye en cada
tejido en el intervalo de concentración de 0,1 a 300 nM. Después de
otro período de lavado, los tejidos se encogen con una concentración
CE_{90} de noradrenalina para ensayar el compuesto.
\vskip1.000000\baselineskip
El efecto de un compuesto de ensayo sobre la
presión sanguínea arterial sistémica se puede evaluar en un modelo
de rata hipertensa espontáneamente ("SHR") precanulada
consciente. Este ensayo se lleva a cabo usando un sistema
muestreador de sangre automatizado ("ABS"). El sistema ABS
Culex ^{TM} (Bioanalytical System, Inc., West Lafayette, IN)
comprende un ordenador portátil, cuatro unidades de control y jaulas
metabólicas. Este sistema ABS permite la recogida de múltiples
muestras de sangre a partir de una sola rata sin provocar estrés
excesivo al animal. Además, el sistema ABS permite la recogida de
muestras de orina que se pueden usar potencialmente para
identificaciones de biomarcador. Mediante este planteamiento, se
llevan a cabo estudios farmacocinéticos convencionales y de
eficacia en ratas SHR conscientes no reprimidas de manera simultánea
para definir la relación entre la concentración de fármaco libre en
plasma o biomarcador(es) potencial(es) y el efecto
farmacológico (reducción de la presión sanguínea arterial
media).
Las ratas SHR de 12 a 16 semanas de edad, de
peso aproximadamente 300 g, se someten a canulación quirúrgica de
ambas venas yugulares y la arteria carótida derecha. Después de la
recuperación quirúrgica, los animales se colocan en las jaulas
Culex ^{TM} y se atan a un brazo de sensibilidad al movimiento con
un sensor que controla el movimiento de la jaula cuando el animal
se mueve para evitar que los catéteres se tuerzan. Las conexiones
se realizan entre el catéter de la yugular derecha y el entubado
estéril Culex ^{TM} fijado para el muestreo de sangre, y el
catéter de la yugular izquierda para la administración de compuesto,
y el catéter en la arteria carótida derecha se conecta a un
transductor de presión para controlar la presión sanguínea. Para
mantener la evidencia de los catéteres, la cánula de la yugular
derecha se mantiene por la función "de servicio" del Culex
^{TM} que enjuaga el catéter con 20 \mul de solución salina de
heparina (10 unidades/ml) cada 12 minutos o entre los episodios de
muestreo, y la cánula de la yugular izquierda se carga con solución
salina de heparina (20 unidades/ml). La evidencia de la cánula de la
carótida derecha se mantiene mediante una infusión lenta de la
solución salina de heparina o bien directamente en el entubado de
extensión cuando la presión sanguínea no se registra o mediante el
transductor de presión durante el control de la presión sanguínea.
Se deja que los animales se aclimaten durante al menos dos horas
antes de la evaluación del compuesto. El compuesto de ensayo se
puede administrar por vía intravenosa o mediante sonda oral. Los
protocolos de muestreo de sangre (tiempo y volumen de muestreo) se
programan usando el software Culex ^{TM}. La cantidad total de
sangre extraída de cada animal no excederá de 750 \mul/24 horas y
10 ml/kg en dos semanas. Se controlan el ritmo cardíaco, presión
sanguínea, y concentración de fármaco.. Se registran la presión
sanguínea arterial sistémica y ritmo cardíaco mediante PONEMAH
(Gould Instrument System, Valley View, OH), un transductor de
presión mediante un sistema de adquisición de datos para registrar
la presión sanguínea y ritmo cardíaco, durante 6 a 24 horas
basándose en el protocolo experimental. La presión sanguínea
arterial media (punto final principal) se analiza para determinar
la eficacia del compuesto.
Se analizan las muestras de sangre para medir la
concentración de fármaco en plasma, usando el procedimiento
CL/EM/EM descrito más adelante, y para evaluar los potenciales
biomarcadores.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de muestras: Se mezclan muestras de
plasma (50 \mul sin conocer, control o blanco) con 10 \mul de
acetonitrilo:agua o una solución patrón del compuesto de ensayo y
150 \mul de solución patrón interna (100 ng/ml del compuesto de
ensayo en acetonitrilo). La mezcla se centrifuga a 3000 rpm durante
5 minutos, y se transfieren 125 \mul del sobrenadante a una placa
de 96 pocillos. El disolvente se evapora en una corriente de
nitrógeno y el residuo se reconstituye con 80 \mul de
acetonitrilo/ácido fórmico acuoso al 0,1% (20:80 v/v).
Un volumen de 20 \mul de cada muestra
preparada se inyecta en una columna Phenomenex Synergi 4 \mum
MAX-RP 2,0 x 75 mm y se eluyó a 0,4 ml/min usando
elución en gradiente desde ácido fórmico acuoso al 0,1% (fase móvil
A) a acetonitrilo (fase móvil B). El programa de gradiente consta de
aplicación inicial de fase móvil A al 90%, seguido de un gradiente
lineal hasta fase móvil B al 75% desde 0,2 a 1,15 minutos después de
la inyección y se mantuvo en la fase móvil B al 75% hasta 2,0
minutos. La fase móvil se cambió linealmente otra vez hasta fase
móvil A al 90% desde 2,00 a 2,10 minutos, y la siguiente inyección
tuvo lugar a 3,00 min. La detección se realizó mediante
espectrometría de masas usando ionización por electropulverización
(IEP) de ion positivo con un control de reacción múltiple de las
transiciones m/z 454,00 (MH + el compuesto de ensayo) \rightarrow
m/z 408,00, m/z 466,24 (MH + el compuesto de ensayo) \rightarrow
409,33.
El voltaje de pulverización iónica se fija a 5000. Se construye una curva de calibración usando relaciones de las áreas de los picos del analito con relación al patrón interno. Las concentraciones sujetos se determinan mediante una predicción inversa a partir de sus relaciones de las áreas de los picos contra la curva de calibración.
El voltaje de pulverización iónica se fija a 5000. Se construye una curva de calibración usando relaciones de las áreas de los picos del analito con relación al patrón interno. Las concentraciones sujetos se determinan mediante una predicción inversa a partir de sus relaciones de las áreas de los picos contra la curva de calibración.
El efecto de un compuesto de ensayo sobre la
presión sanguínea arterial sistémica se puede evaluar en un modelo
de rata hipertensa espontáneamente ("SHR") usando telemetría.
Las ratas SHR se anestesian con gas isoflurano mediante una máquina
de anestesia de isoflurano que se calibra para distribuir isoflurano
en un intervalo de porcentajes a medida que el oxígeno pasa a
través de las cámaras internas de la máquina. Los animales se
colocan en una cámara de inducción y se administra isoflurano al 4 -
5% para alcanzar un plano quirúrgico de anestesia. Después se
mantienen al 1 - 2% durante el procedimiento quirúrgico mediante un
cono nasal, distribuyéndose el isoflurano mediante un dispositivo
de anestesia de isofluorano más pequeño en la mesa quirúrgica.
Después de la administración de la anestesia, a
las ratas se les implantan transmisores usando procedimientos
asépticos con unidades de radio telemetría estériles disponibles en
el medio (Data Sciences, Internacional, Roseville, MN 55113 -
1136). Antes de cirugía se afeita el campo quirúrgico, se friega con
solución antimicrobiana de la marca Dial ^{TM} (que contiene
gluconato de clorhexidina al 4% y alcohol isopropílico al 4%)
seguido de una aplicación de una solución pulverización de yodo
(10%). Se realiza una laparotomía de 2,5 a 3,0 cm y las unidades de
radio-telemetría se implantan en el abdomen, con la
punta del catéter insertada en la aorta abdominal. Se usan
retractores Baby Weitlaner para retener el tejido blando. Una
sección de 1 cm de la aorta abdominal se disecciona parcialmente y
esa sección se pinza de manera cruzada brevemente, se perfora con
una aguja de calibre 21 y la punta del catéter del transmisor se
introduce en el vaso y se asegura mediante una sola sutura con hilo
de seda 4,0 anclada al músculo psoas adyacente. Después el cuerpo
del transmisor se inserta en la cavidad abdominal y se asegura
simultáneamente a la pared del músculo abdominal mientras se cierra
con sutura continua con hilo de seda 4,0. La capa de piel se cierra
con sutura absorbible 4,0 continua subdérmica. Una administración
subcutánea (s. c.) de marciana seguida de una aplicación tópica de
yodo se administra en y alrededor de la línea de sutura,
respectivamente, tras el cierre. Todas las ratas reciben una
inyección postoperatoria de buprenorfina a 0,05 mg/kg s. c. antes
de que recupere la conciencia. Un volumen de dosis típico para una
rata de 0,300 kg será 0,050 ml. Las ratas se deben recuperar
completamente de su anestesia operativa antes de la administración
de buprenorfina. Después reciben la misma dosis una vez al día
durante dos días consecutivos, salvo que el animal muestre que está
en un dolor postoperativo comprometedor.
Después de la cirugía, las ratas se vuelven a
sus jaulas y se alojan individualmente en una jaula de fondo sólido
con lecho de papel. Se deja un período de no menos de 7 días para la
recuperación antes de que se inicien los procedimientos
experimentales. Se ha observado que las ratas son típicamente
hipertensas durante varios días después de la cirugía y vuelven a
niveles de "tensión normal" aproximadamente el 7º día después
de la cirugía. Se alimentan con comida de pienso de rata
convencional y agua a voluntad a lo largo del tiempo
experimental.
Los compuestos de ensayo se administran por vía
intragástrica (i. g) mediante sonda nasofaríngea, usando una aguja
de sonda nasofaríngea de acero inoxidable, de 2,5 pulgadas (6,35 cm)
de calibre 18 con un extremo en bola. Para la dosificación diaria
individual, el volumen diana es 3,33 ml/kg. i. g. El volumen de
dosis para el compuesto de ensayo es aproximadamente 1 ml/rata. Los
vehículos en los que el compuesto de ensayo se administra es
metilcelulosa (0,5%) + Tween 80 (0,1%) en tampón citrato 50 mM pH =
5,0.
Los datos de presión sanguínea se obtendrán
usando el programa de adquisición de datos de Data Sciences
International (Versión 3.0). Las muestras de presión sanguínea se
registran a intervalos de 1,5 - 3 minutos durante una duración de 5
segundos 24 horas al día durante el estudio entero. Estos datos se
procesan mediante el software de análisis de datos de Data Science
en promedios de los intervalos de tiempo deseados. Toda la otra
reducción de datos se realiza en hojas de cálculo Microsoft Excel
^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ensayo de micronúcleos in vitro se
puede usar para determinar el potencial mutagénico de un compuesto
de ensayo. Este ensayo detecta anormalidades de cromosomas que se
producen por la exposición a un compuesto de ensayo midiendo la
formación de pequeños fragmentos de ADN unidos a membrana tales como
micronúcleos en el citoplasma de células de interfase.
El ensayo se lleva a cabo usando células de
ovario de hámster chino (CHO) en diferentes condiciones de ensayo
en ausencia y presencia de activación metabólica. La concordancia de
resultados entre este ensayo de selección y la citogenética in
vitro es aproximadamente el 85%. El ensayo directo (-S9) se
lleva a cabo usando tratamientos continuos de 24 horas o 3 horas,
mientras que el ensayo con activación metabólica (+S9) implica un
tratamiento de 3 horas. La clastogenicidad se indica mediante un
incremento en el número de células micronucleadas en la primera
interfase después de exposición (en células binucleadas con
citocinesis bloqueda). Los resultados se comparan con el nivel de
citotoxicidad (medida por la proporción de células binucleadas) que
produce un compuesto de ensayo. Para demostrar la validez del
ensayo, se requieren controles negativos (tratado con vehículo) y
positivos (un respondedor conocido) que respondan dentro intervalos
históricos establecidos.
Negativo - Un resultado negativo se identifica
con ausencia de peligro genotóxico definido por el punto final del
ensayo específico (por ejemplo, miconúcleo in vitro
negativo). Un compuesto de ensayo que muestra una respuesta
negativa no ha cumplido el criterio de evaluación específico para el
ensayo que puede incluir uno o ambos de lo siguiente: 1) un
incremento reproducible dependiente de la concentración en el punto
final de ensayo específico cuando se compara con un control
negativo (vehículo) y/o 2) una o más concentraciones de ensayo que
logran un número de veces de incremento mínimo en el punto final
específico sobre los controles.
Positivo - Un resultado positivo se identifica
con un peligro genotóxico definido mediante el punto final de
ensayo específico (por ejemplo, micronúcleo in vitro
positivo). Un compuesto de ensayo que muestra una respuesta
positiva ha cumplido el criterio de evaluación específico para el
ensayo que puede incluir uno o ambos de lo siguiente: 1) un
incremento reproducible dependiente de la concentración en el punto
final de ensayo específico cuando se compara con un control
negativo (vehículo) y/o 2) una o más concentraciones de ensayo que
logran un número de veces de incremento mínimo en el punto final
específico sobre los controles.
Equívoco - Un resultado equívoco se reserva para
situaciones en las que el compuesto de ensayo se ha evaluado en una
prueba o pruebas de ensayo válido(s) (es decir, criterios de
aceptabilidad de ensayo satisfactorios), pero no muestra un
resultado negativo o positivo como se define mediante criterios de
evaluación establecidos. Esto puede acarrear la presencia de una
respuesta positiva débil que requiere ensayo repetido adicional o
ensayo confirmatorio eventual caso por caso.
No concluyente - Un resultado no concluyente se
reserva para situaciones en las que el compuesto de ensayo se ha
evaluado en una prueba de ensayo no válido (es decir, criterios de
aceptabilidad de ensayo no satisfactorios por razones técnicas, por
ejemplo los controles negativos o positivos no responden de manera
apropiada). Se recomienda ensayo de repetición con el fin de
establecer un resultado de prueba de ensayo válido.
El compuesto de carboxipiperidina se ensayó de
acuerdo con el procedimiento 7 y produjo un resultado equívoco.
Los compuestos descritos anteriormente en los
ejemplos del documento WO 2004096810 se ensayaron de acuerdo con el
procedimiento 7. Los resultados del ensayo de micronúcleo
correspondientes se reseñan en la tabla G.
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Los ensayos adicionales que se pueden usar para
evaluar la toxicidad de un compuesto de ensayo (por ejemplo, cuando
el ensayo de micronúcleo produce un resultado equívoco) incluyen el
procedimiento 8, procedimiento 9, y procedimiento 10 descritos más
adelante:
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede usar un ensayo de aberración
estructural de cromosomas in vitro para evaluar en un
compuesto de ensayo la capacidad para inducir aberraciones
estructurales y numéricas de cromosomas en presencia y ausencia de
activación metabólica de mamíferos en linfocitos periféricos
humanos.
Los cálculos de concentración se basan en el
factor del resto correspondiente de 1,000. El compuesto de ensayo
se disuelve y se diluye en DMSO, que servirá como el control de
vehículo a un volumen equivalente al que se usa para administrar el
compuesto de ensayo (concentración final al 1%).
Se añade sangre de vena periférica humana
heparinizada de un voluntario masculino sano a medio de cultivo,
seguido de la adición de fitohemaglutinina M (Sigma Chemical Co.,
Saint Louis, Missouri) para estimular la división celular de
linfocitos. Los cultivos primarios se incuban durante al menos 46
horas antes del tratamiento con el compuesto de ensayo.
Se utiliza el siguiente control positivo:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se utilizan los siguientes tratamientos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se seleccionan para el ensayo los siguientes
niveles de dosis:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se administran dosis de cultivos individuales de
células para cada concentración y un control de vehículo. Los
cultivos de células se exponen a 0,1 \mug/ml de Colcemid ® (Ciba,
Suiza) durante dos horas antes de la recolección. Las células se
recogen mediante centrifugación, se hinchan en una solución
hipotónica y después se fijan en una solución fijadora de
metanol:ácido acético glacial. La suspensión de células fijadas se
deposita por goteo en portaobjetos de microscopio húmedos, se
secan, y se tiñen con Giemsa. Para cada concentración de fármaco
ensayado, se preparan al menos 2 portaobjetos por cultivo.
La citotoxicidad se mide mediante una
determinación de morfología de cromosoma y de la inhibición de
mitosis (índice mitótico). Se determina un índice mitótico para
todas las condiciones de tratamiento puntuando 1000 células por
condición para la proporción de células en metafase.
La concentración máxima seleccionada para la
puntuación de aberraciones de cromosomas es la dosis mayor a la que
se espera un número suficiente de células en metafase analizables.
Si es posible, la dosis mayor seleccionada suprimiría el índice
mitótico en una reducción de aproximadamente 50%, pero no superior
al 70%.
Al menos una concentración en cada una de las
condiciones de ensayo se selecciona para análisis junto con el
vehículo de manera simultánea y control positivo. Los portaobjetos
no se analizan de una manera ciega. A la discreción del director
del estudio, las concentraciones de ensayo adicionales se pueden
evaluar después de que la evaluación inicial se haya completado
para proporcionar la clarificación adicional de un efecto (es
decir, incremento o ausencia de aberraciones).
La concentración de ensayo más alta seleccionada
para análisis debe cumplir 1 de los siguientes criterios: (1)
produce aproximadamente una reducción de un 50% del índice mitótico
comparada con los controles de vehículo, (2) muestra evidencia de
solubilidad incompleta, o (3) es equivalente a la concentración
máxima de 5000 \mug/ml o 10 mM (la que sea menor). Cuando es
posible, se evalúa en 100 células en metafase diploides aceptables
de cada cultivo el daño en cromosomas. Una excepción a esto es un
incremento aparente en la frecuencia de células anormales durante
la recogida de datos (es decir, > 10 células aberrante se cuentan
en las primeras 50 células aceptables) en este caso se interrumpe
el análisis posterior. Las células en metafase seleccionadas para
análisis deben estar intactas (es decir, tienen 46 \pm 2
cromosomas), y tienen un mínimo de superposición de cromosomas.
Además, los cromosomas deben aparecer alargados de manera que los
brazos individuales y regiones centroméricas se puedan identificar
fácilmente. Cada célula en metafase se clasifica como normal o
anormal con el (los) tipo(s) y número de anormalidades
presentes por célula registrada. Para las células anormales, se
registran las coordenadas X e Y vernier de la platinadel
portaobjetos. Las aberraciones estructurales de cromosomas se
clasifican como rotura de cromátida (Ct brk), fragmentos de
cromátida (Ct Frg), daño de cromátida incluyendo intercambios,
anillos, dicéntricos y translocaciones (R), roturas de cromosomas
(Cs Brk), fragmentos de cromosomas (Cs Frg) y roturas múltiples
(M). Además, las células con cromosomas pulverizados (PV) se recogen
en el número de aberraciones totales. Las células que contienen
huecos se registran pero no se incluyen en el número de
aberraciones totales. Las aberraciones de cromosomas numéricas se
determinan para cada condición de tratamiento y los controles de
vehículo simultáneos mediante la evaluación del número de células
poliploides y endorreduplicadas. Los índices de poliploidía se
obtienen puntuando cuando sea posible 1000 células en
metafase/cultivo mientras se tabula el número de células en metafase
que son poliploides o
endorreduplicadas.
endorreduplicadas.
Un ensayo de 1 cola exacto de Fisher sobre el
número total de células aberrantes de cada grupo tratamiento
comparado con las células aberrantes totales de los controles
negativos se usa como análisis estadístico. ^{5} Un valor de p
\leq 0,05 se considera que es estadísticamente significativo.
Se considera un ensayo válido si se cumplen los
siguientes criterios:
1. El control positivo induce un incremento
estadísticamente significativo en el porcentaje de células con
aberraciones de cromosomas cuando se compara con el control de
vehículo simultáneo y las frecuencias inducidas son comparables con
los datos publicados o históricos.
2. Cultivos de control de vehículo tienen
\leq 3% de células con aberraciones o un porcentaje considerado
comparable con los datos publicados o históricos.
3. Aproximadamente un 50% de inhibición de
índice mitótico se observa al nivel de dosis más alto. Este
requerimiento no es aplicable a compuestos de ensayo para los que
no se podría lograr citotoxicidad aparente a la concentración
máxima soluble o dosis permisible más alta.
\vskip1.000000\baselineskip
La toxicidad de un compuesto de ensayo se puede
evaluar en un modelo de rata. Este estudio determina la potencial
toxicidad de y una exposición sistémica a los compuestos de ensayo,
cuando se administra mediante sonda oral, una vez al día, durante 7
días consecutivos, a ratas macho de 6 a 8 semanas de edad Charles
River SD/IGS que pesan entre 175 g y 200 g. Este estudio se lleva a
cabo usando el sistema Xybion path/Tox (Xybion Medical Systems
Corporation, Cedar Knolls, NJ).
El compuesto de ensayo se dosifica por vía oral
una vez durante 7 días por sonda nasofaríngea a un volumen de 10
ml/kg de peso corporal. El compuesto de ensayo se administra a 3
grupos de ratas (n = 5) consiguiendo dosis de 30 mg/kg/día, 100
mg/kg/día, y 500 mg/kg/día, respectivamente. Un grupo de control (n
= 5) recibe vehículo (metilcelulosa al 0,5% (p/v) y Polisorbato 80
al 0,1% (v/v) en tampón fosfato 50 mM). La vía oral se usa debido a
que es la vía propuesta de exposición en seres humanos. La cantidad
apropiada de compuesto de ensayo se suspende en metilcelulosa al
0,5% (p/v) y polisorbarto 80 al 0,1% (v/v) en tampón citrato 50 mM.
El pH de la suspensión de dosificación se mantiene entre 3 y 9.
Cada animal se desangra en serie a 1, 3, 8 y 24
horas después de la dosis el día 1. Se recoge orina aproximadamente
24 horas para análisis metabólico. Las observaciones de
supervivencia y mortalidad se llevan a cabo una vez al día durante
el período de pretratamiento. Los signos clínicos se observan
diariamente, 1 - 3 horas después de la dosis. Los animales se
sacrifican mediante exanguinación después de 7 días. Los animales
encontrados muertos se refrigeran y se les hace la necropsia en el
tiempo más temprano posible (dentro de las horas de trabajo). No se
recogen los pesos corporales terminales, muestras de sangre y pesos
de de los animales encontrados muertos. Los animales moribundos/no
programados/programados que se sacrifican se toman inmediatamente
para necropsia, y se recogen los pesos corporales, muestras de
sangre, y todas las muestras de patología clínica excepto las
muestras de
orina.
orina.
\newpage
Se pesarán diversos tejidos (adrenal, hueso de
fémur, cerebro, ciego, colon, duodeno, epidídimo, corazón, íleon,
yeyuno, riñón, hígado, páncreas, músculo esquelético femoral del
bíceps, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, médula espinal
lumbar, y ganglio linfático mesentérico), se ultracongelan, se tiñen
y se fijan. Después de examen macroscópico, los tejidos recogidos
con grandes anormalidades se mantienen en formalina. Todos los
tejidos recogidos con grandes anormalidades se procesan y se
examinan microscópicamente por el patólogo. Los tejidos se cortan,
se incrustan, se seccionan, y se tiñen con hematoxilina y eosina y
se examinan microscópicamente por el patólogo a la discreción del
patólogo. Se preparan frotis de médula ósea y se tiñen con tinte de
Wright. Para aclarar la naturaleza del cambio de tejido de animales
individuales, se lleva a cabo la recogida de tejido adicional,
corte en secciones, tinción y examen microscópico según requiera el
patólogo.
Las observaciones clínicas, pesos corporales,
observaciones de necropsia, y hallazgos histopatológicos se
introducen directamente en el Sistema Xybion Path/Tox.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ensayo de mutagenicidad de Salmonella
(también conocido como el ensayo Ames) se puede usar para determinar
el potencial mutagénico de un compuesto de ensayo. Este ensayo mide
la tasa de mutación de las bacterias que se exponen a un compuesto
de ensayo. Véase, por ejemplo, Ames, B. N., Durston, W. E.,
Yamasaki, E. y Lee, F. D. (1973) Carcinogens are mutagens: a simple
test system combining liver homogenates for activation and bacteria
for detection. Proc. Natl Acad Sci USA, 70, 2281 - 2285). Algunos
carcinógenos se hacen activos cuando se transforman enzimáticamente
en una especie electrófila capaz de unirse covalentemente a ADN. En
el ensayo Ames, se preparan fracciones S9 (sobrenadante de 9000 g)
a partir de los hígados de ratas pretratadas con fenobarbital
(PB)/5,6-benzoflavona (BF) o Aroclor 1254 para
inducir la actividad de la enzima que metaboliza tal fármaco.
El ensayo de BioLum Ames es una versión de
selección de mayor rendimiento del ensayo de mutación de genes
bacterianos (Ames) convencional. Para demostrar la validez del
ensayo, se requieren controles negativos (tratados con vehículo) y
positivos (un respondedor conocido) que responde dentro de
intervalos históricos establecidos.
Negativo - Un resultado negativo se identifica
con la ausencia de peligro genotóxico definido por el punto final
del ensayo específico (por ejemplo, miconúcleo in vitro
negativo). Un compuesto de ensayo que muestra una respuesta
negativa que no ha cumplido el criterio de evaluación específico
para el ensayo que puede incluir uno o ambos de lo siguiente: 1) un
incremento reproducible dependiente de la concentración en el punto
final de ensayo específico cuando se compara con un control
negativo (vehículo) y/o 2) una o más concentraciones de ensayo que
logran un número de veces de incremento mínimo en el punto final
específico sobre los controles.
Positivo - Un resultado positivo se identifica
con un peligro genotóxico definido mediante el punto final de
ensayo específico (por ejemplo, miconúcleo in vitro
positivo). Un compuesto de ensayo que muestra una respuesta
positivo ha cumplido el criterio de evaluación específico para el
ensayo que puede incluir uno o ambos de lo siguiente: 1) un
incremento reproducible dependiente de la concentración en el punto
final de ensayo específico cuando se compara con un control
negativo (vehículo) y/o 2) una o más concentraciones de ensayo que
logran un número de veces de incremento mínimo en el punto final
específico sobre los controles.
Equívoco - Un resultado equívoco se reserva para
situaciones en las que el compuesto de ensayo se ha evaluado en una
prueba o pruebas de ensayo válido (es decir, criterios de
aceptabilidad de ensayo satisfactorios), pero no muestra un
resultado negativo o positivo como se define mediante criterios de
evaluación establecidos. Esto puede acarrear la presencia de una
respuesta positiva débil que requiere ensayo repetido adicional o
ensayo confirmatorio eventual caso por caso.
No concluyente - Un resultado no concluyente se
reserva para situaciones en las que el compuesto de ensayo se ha
evaluado en una prueba de ensayo no válido (es decir, criterios de
aceptabilidad de ensayo no satisfactorios por razones técnicas, por
ejemplo los controles negativos o positivos no responden de manera
apropiada). Se recomienda ensayo de repetición con el fin de
establecer un resultado de prueba de ensayo válido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede usar un modelo in vivo para
evaluar las propiedades farmacocinéticas de una dosis individual y
la biodisponibilidad oral absoluta de un compuesto de ensayo. Como
se describe más específicamente a continuación, se administra un
compuesto de ensayo a ratas Sprague - Dawley (SD) o bien por vía
intravenosa u oral en un diseño de estudio
de sobrecruzamiento y se miden las propiedades farmacocinéticas resultantes y la biodisponibilidad oral se miden.
de sobrecruzamiento y se miden las propiedades farmacocinéticas resultantes y la biodisponibilidad oral se miden.
A ratas macho se les administran una dosis por
vía oral de 2,0 mg/kg (n = 2) mediante sonda nasofaríngea en forma
de una suspensión (metilcelulosa al 0,5%/Tween 80 al 0,1% en agua
destilada). Después de 72 horas de período de lavado, a las mismas
ratas se les administra una dosis embolada de 2,0 mg/kg por vía
intravenosa (n = 2) en forma de una solución (PEG 400 al 70%/tampón
citrato 0,05 M al 20% pH 3/etanol al 10%). Se recogen muestras de
sangre en serie (para plasma) de cada rata durante 24 horas después
de la dosis para cada vía. Las concentraciones en plasma del
compuesto de ensayo se determinan usando un procedimiento CL/EM/EM
con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de 1,2 (para -534)
ng/ml. Los parámetros farmacocinéticos de un compuesto de ensayo se
determinan a partir de los datos de concentración en plasma - tiempo
usando procedimientos no compartamentales.
CL/EM/EM: 1) Columna: Hyperso; columna AQUASIL
C-18 2,1 x 20 mm, 3,0 \mum; 2) fase móvil: Acuosa
agua con ácido fórmico al 0,1%, Orgánica: acetonitrilo; ionización:
+IEP (IPA 4000), MRM: m/z 494,4 \rightarrow m/z 394,0 (ejemplo
261 en el documento WO 2004096810), m/z 509,44 \rightarrow m/z
409,80 (ejemplo 263 en el documento WO 2004096810), m/z 495,33
\rightarrow m/z 395,20 (ejemplo 262 en el documento WO
2004096810). Los límites de detección son 0,12 ng/ml (ejemplo 261
del documento WO 2004096810), 1,3 ng/ml (ejemplo 263 del documento
WO 2004096810) y 0,11 ng/ml (ejemplo 262 del documento WO
2004096810).
Watson (versión 6.4.0.04) se usa para calcular
las concentraciones medias del compuesto de ensayo, las desviaciones
típicas (SD) correspondientes, y porcentaje de coeficiente de
variación (%CV), y para estimar parámetros farmacocinéticos
(derivados mediante procedimientos no compartamentales) y parámetros
estadísticos asociados (media, SD y % CV) si es aplicable. (Ya que
n = 2, no se calcula ni la SD ni CV?). Las concentraciones por
debajo del límite de cuantificación (BLQ) se reseñan como cero (0)
y se usan en la evaluación de las concentraciones medias y la
estimación de AUC. La concentración en plasma máxima (C_{máx}) y
el tiempo para alcanzar la concentración máxima (t_{máx}) se
registran directamente a partir de los perfiles de concentración en
plasma - tiempos individuales. La fase lineal logarítmica terminal
de la curva concentración en plasma - tiempo se identifica mediante
regresión lineal de los puntos de datos. La semivida terminal
(t_{1/2}) se calcula como ln (2) dividido por un valor absoluto
de la pendiente de la fase lineal logarítmica terminal. El área bajo
la curva concentración en plasma - tiempo desde el tiempo cero
hasta el tiempo de la última concentración cuantificable (t) [AUC
_{(0-t)}] se determina usando el procedimiento
trapezoidal lineal. El área bajo la curva concentración en plasma -
tiempo desde el tiempo cero hasta infinito [AUC _{(0-\infty)}] se
determina como AUC _{(0-t)} más el área
extrapolada. El área extrapolada se determina dividiendo la última
concentración en plasma observada por la pendiente de la fase
lineal logarítmica terminal. La eliminación del plasma sistémica
(CL) se calcula como la dosis/AUC _{(0-\infty)} mientras que el
volumen de distribución en el estado estacionario (V_{dSS}) se
calcula como CL x MRT, donde MRT (tiempo de residencia medio) se
define como AUMC _{(0-\infty)}/AUC _{(0-\infty)}. La
biodisponibilidad PO absoluta (F) se calcula como una relación entre
la AUC _{(0-\infty)} normalizada por la dosis del animal
individual después de la administración Po y la AUC _{(0-\infty)}
normalizada por la dosis del animal individual después de la
administración IV dada por el diseño del estudio de
sobrecruzamiento. La concentración en plasma máxima (C_{máx}), el
tiempo para alcanzar la concentración máxima (_{máx}), la
semivida terminal (t_{1/2}), el área bajo la curva concentración
en plasma - tiempo desde el tiempo cero hasta infinito [AUC
_{(0-\infty)}], el volumen de la distribución en el estado
estacionario (V_{dSS}), la eliminación del plasma sístémica (CL),
y la biodisponibilidad PO absoluta (F) se muestran en la
tabla C.
tabla C.
El compuesto de carboxipiperidina se ensayó de
acuerdo con el procedimiento 11 y los resultados se reseñan en la
tabla H. Los compuestos previamente descritos en los ejemplos del
documento WO 2004096810 se ensayaron de acuerdo con el
procedimiento 11. Los resultados de estos compuestos también se
muestran en la tabla H.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se llevó a cabo un estudio para determinar el
efecto de la dosificación oral repetida del compuesto de
carboxipiperidina sobre la reducción de la presión sanguínea y si
la coadministración del compuesto de carboxipiperidina y el
inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina enalapril
podría dar como resultado una reducción adicional de la presión
sanguínea. El estudio consistía en el tratamiento de ratas
hipertensas espontáneamente (SHR) telemedidas como se describe en
el procedimiento F con el compuesto de carboxipiperidina (1 mg/kg
una vez al día por vía oral) y enalapril (0,007% en agua de bebida)
solos y en combinación durante 7 días (figura 1) (n = 12/grupo). El
compuesto de carboxipiperidina reducía la presión sanguínea a partir
de un valor inicial antes de la dosis en comparación con un grupo
tratado con vehículo en 11 \pm 1 mm de Hg (1,47 \pm 0,13 kPa)
el día 1. La reducción de la presión sanguínea se mantuvo durante el
período de 7 días permaneciendo 9 \pm 1 mm de Hg (1,20 \pm 0,13
kPa) por debajo del valor inicial antes de la dosis el día 7.
El enalapril también reducía la presión
sanguínea respecto a un valor inicial antes de la dosis en
comparación con un grupo tratado con vehículo con una reducción
máxima de 22 \pm 2 mm de Hg (2,93 \pm 0,27 kPa) el día 7. La
combinación del compuesto de carboxipiperidina más enalapril reducía
la presión sanguínea más de lo que cada agente en solitario reducía
la presión sanguínea todos los días.
Los cambios en el biomarcador mecanístico de
cGMP urinario se determinaron durante el período de 24 horas el día
9. El cGMP estaba elevado en una recogida de orina de 0 - 24 horas
tanto en el grupo del compuesto de carboxipiperidina como en el
grupo de la combinación del compuesto de carboxipiperidina +
enalapril en comparación con el grupo tratado con vehículo (Figura
2) (n = 12/grupo).
Cuando se introducen elementos de la presente
invención o de la/las realización (ones) preferidas de la misma,
los artículos "uno (a) (os) (as)", "el (la) (los) (las)" y
"dicho (a) (os) (as)" pretenden significar que hay uno u más
elementos. Los términos "comprendiendo", "incluyendo" y
"teniendo" pretenden ser inclusivos y significan que pueden
haber elementos adicionales distintos de los elementos
enumerados.
<110> Pfizer Inc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ÁCIDO
1-(1-(2-ETOXIETIL)-3-ETIL-7-(4-METILPIRIDIN-2-ILAMINO)-1H-PIRAZOLO[4,3-D]PIRIMIDIN-5-IL)PIPERIDINA-4-CARBOXÍLICO
Y LAS SALES DEL MISMO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PC033153A
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<150> 60/735320
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<151>
2005-11-10
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<160> 1
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<170> PatentIn version 3.3
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1518
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un compuesto que tiene la estructura
o una sal farmacéuticamente
aceptable del
mismo.
2. El compuesto de la reivindicación 1 en forma
del ácido libre.
3. El compuesto de la reivindicación 1 en la
forma de una sal farmacéuticamente aceptable.
4. Una composición farmacéutica que comprende el
compuesto de la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. La composición farmacéutica de la
reivindicación 4, en la que el compuesto de la reivindicación 1 está
en la forma del ácido libre.
6. La composición farmacéutica de la
reivindicación 4, en la que el compuesto de la reivindicación está
en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. La composición farmacéutica de la
reivindicación 4 que comprende además un antagonista de
endotelina.
8. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo para usar como un
medicamento.
9. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en el tratamiento
de hipertensión.
10. El compuesto de la reivindicación 1 o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo para usar en el
tratamiento de hipertensión pulmonar.
11. El compuesto de la reivindicación 1 o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con un
antagonista de endotelina para usar en el tratamiento de
hipertensión pulmonar.
12. El uso del compuesto de la reivindicación 1
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de hipertensión pulmonar.
13. Un método de preparación del compuesto de la
reivindicación 1 que comprende poner en contacto un compuesto que
tiene la estructura
con ácido isonipecótico para proporcionar el
compuesto de la reivindicación 1.
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