FI113537B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten indolokarbatsolijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

113537

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten indolo-karbatsolijohdannaisten valmistamiseksi

Keksinnön tausta 5 Keksintö koskee terapeuttisesti käyttökelpoisten indolokarbatsoliyhdisteiden valmistusta. Yhdisteet ovat käyttökelpoisia eturauhasen patologisen tilan hoidossa.

Eturauhasen sairaudet ovat yleisiä ikääntyvillä miehillä. Esimerkiksi eturauhasen liikakasvuun sairastuu 10 90 % miehistä 80 ikävuoteen mennessä. Kun liikakasvutila aiheuttaa virtsaputken tukkeutumisen, sitä lievitetään kirurgisella tekniikalla. Eturauhasen syöpää, joka on tällä hetkellä useimmin diagnosoitu syöpä miehillä, hoidetaan tavallisimmin leikkaamalla, sädehoidolla tai aiheuttamalla 15 androgeenin puute, esim. toteuttamalla kastraatio, käyttämällä estrogeenihoitoa, antamalla potilaalle adrenokorti-kotrooppisen hormonin (ACTH) analogeja (Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. painos, toimittajat Wilson et al., McGraw-Hill, NY, sivut 1629 - 1632) tai antamalla 20 Suraminia, ei-spesifistä ja erittäin myrkyllistä kasvutekijän estäjää.

• I 1 ' Kasvutekijöiden neurotrofUniryhmä sisältää hermo- kasvutekijän (NGF) , aivoperäisen neurotrofisen tekijän ·1·,. (BDNF) , neurotrof iini-3: n (NT-3) ja neurotrof iini-4/5: n : 25 (NT-4/5) . Nämä emäksiset proteiinit ovat pituudeltaan li- : .·, kimäärin 120 aminohappoa, ne jakavat « 50 %:n sekvenssiho- *!".1 mologian ja ne ovat erittäin hyvin säilyneitä nisäkäslajeilla (Issackson et ai., FEBS Lett., 285:260 - 264, 1991). Hermokasvutekijä (NGF) oli ensimmäinen havaittu ·· 30 kasvutekijä ja se on säilynyt parhaiten karakterisoituna t · neurotrofiinina. Hermokasvutekijää (NGF) tarvitaan tunto- i | hermosolujen ja sympaattisten hermosolujen normaaliin ke- • · .1··. hitykseen ja näiden solujen normaaliin toimintaan ai- • · kuisiällä (Levi-Montalcini, Annu. Rev. Neurosci., 5:341 - » · t * 35 362, 1982; Yankner et ai., Annu. Rev. Biochem. , 51:845 - "'“i 868, 1982).

2 113537

Neurotrofiinin sitoutuminen suuren affiniteetin omaavien reseptoreiden (trk:t) sarjaan ja sen aktivoituminen on välttämätöntä ja riittävää neurotrofiinien useimpien biologisten vaikutusten välittämiseksi. Trk:t ovat 5 transmembraaniproteiineja, jotka sisältävät ekstrasellu-laarisen ligandisitoutumisdomainin, transmembraanisekvens-sin ja soluliman tyrosiinikinaasidomainin. Trk:t käsittävät ryhmän rakenteellisesti läheisesti toisiinsa liittyviä proteiineja, joilla on valikoiva sitoutumisspesifisyys yk-10 sittäisten neurotrofiinien suhteen. TrkA, jota joskus kutsutaan trk:ksi, on NFG:n suhteen suuren affiniteetin omaava reseptori, mutta se voi myös välittää NT-3:een kohdistuvia biologisia vasteita määrätyissä olosuhteissa (Kaplan et ai., Science 252:554 - 558, 1991; Klein et ai., Cell 15 65:189 - 197, 1991; Cordon-Cardo et ai., Cell 66:173 - 183, 1991) . TrkB sitoo BNDF: n, NT-3:n ja NT-4/5:n ja vä littää niiden toimintoja (Klein et ai., Cell 66:395 -403, 1991; Squinto et ai., Cell 65:885 - 893, 1991; Klein et ai., Neuron 8:947 - 956, 1992). TrkC on suhteellisen spe-20 sifinen NT-3:n suhteen (Lamballe et ai., Cell 66:967 -979, 1991).

· EP-patenttijulkaisusta 303697 ja WO-julkaisusta : : 94/02488 tunnetaan terapeuttisesti käyttökelpoisia indolo- ·*·,. karbatsoliyhdisteitä. Näiden yhdisteiden ei kuitenkaan | 25 mainita olevan tehokkaita eturauhasen patologisia tiloja : ,*. vastaan.

,· ·’ K-252a, eli (8R*, 9S*, 11S*) - (-)-9-hydroksi-9-metok- sikarbonyyli-8-metyyli-2,3,9,10-tetrahydro-8 , 11-epoksi-lH, 8H,llH-l,7b,lla-triatsadibentso[a,g]-syklo-okta[cde]trin-• 30 den-l-oni (ks. esim. Cancer Chemother. Pharmacol., Voi.

29, s. 266 - 272 (1992)), alkaloidin kaltainen aine, joka on eristetty mikro-organismien Nocardiosis sp. ja Ac- • ·

.*·*. tinomadula sp. viljelyliemestä, on proteiinikinaasien C, A

ja G sekä myosiinin kevytketjukinaasin ja fosfory-’* ‘ 35 laasikinaasin estäjä.

3 113537

Keksinnön yhteenveto

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen indolikarbatsolijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava

H

(V°

*cVV

HO—Ί-'

5 X

j ossa R1 on halogeeni, CH2OCONHR14 tai NHC02R14; R2 on vety tai halogeeni; X on C02CH3, CH2OH tai CONHR15; 10 R14 on alempi alkyyli; R15 on vety, hydroksilla substituoitu alempi alkyyli tai fenyyli tai naftyyli; edellyttäen, että kun R1 on halogeeni ja R2 on ve- t...t ty, X ei ole CO2CH3 eikä CH2OH, edellyttäen, että kun R1 ja • * · 2 15 R ovat kumpikin halogeeni, X ei ole CO2CH3 ja edellyttäen, • · [;··" että kun R1 ja R2 ovat kumpikin Br, X ei ole CONHC6H5; • “ tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan val- i.i i mistamiseksi. Vaatimuksessa 1 mainituilla erotuslausumilla • 1 ·,· j on kaavan (III) mukaisten yhdisteiden joukosta poistettu 20 WO-julkaisussa 94/02488 kuvatut yhdisteet 11-10, 11-31, 11-32 ja 11-45.

Yhdisteet ovat käyttökelpoisia menetelmässä etu-rauhasen patologisen tilan hoitamiseksi nisäkkäällä, joi- • · loin mainittu tila on tila, joka on seurausta eturauhasen *. 25 solujen liiallisesta lisääntymisestä. Menetelmässä nisäk- tl» käälle annetaan hoidollinen määrä indolokarbatsoliyhdis-tettä, esim. yhdistettä K-252a tai sen funktionaalista • johdannaista.

"Ill -f 4 113537

Yhdisteen K-252a tiettyjä funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää eturauhasen kudoksen kasvun estämiseksi ja siten vaimentaa tai aiheuttaa taantumista tiloissa, joita osoittaa eturauhasen solujen patologinen lisään-5 tyminen, esim. hyvänlaatuisessa eturauhasen liikakasvussa tai eturauhasen syövässä, so. paikallisesti rajoittuneessa tai etäpesäkkeisessä eturauhassyövässä. Eturauhassolujen liiallista tai patologista lisääntymistä voivat osoittaa mitkä tahansa solumuutokset, mukaan luettuna, mutta ra-10 joittumatta niihin, neoplastinen muutos, lihas- ja sideku-dossolujen (peruskudossolujen) ja epiteelisolujen (erittävien solujen) muuttunut suhde eturauhasessa tai suuri muutos eturauhasen suurenemis- tai paisumisasteessa. Tämä voi tuottaa tulokseksi oireen, kuten epävarmuuden, heikon 15 virtsavirran, katkonaisen virtsavirran tai solujen kasvun elinkapselin (organ capsule) ulkopuolella.

"Funktionaalisella K-252a:n johdannaisella" tarkoitetaan K-252a-johdannaista, joka estää tyrosiinikinaa-sin (TK) aktiivisuutta, joka liittyy neurotrofiiniresepto-20 riin, esim. reseptoreihin trkA, trkB tai trkC. Edullisesti neurotrofiinireseptori on trkA ja se aktivoituu joutues-· saan kosketukseen NGF:n kanssa. Trk-reseptoreiden TK- :***: aktiivisuus K-252a-j ohdannaisen läsnä ollessa on edulli- sesti pienempi kuin trk-reseptoreiden TK-aktiivisuus K-: 25 252a-johdannaisen puuttuessa. Trk-reseptoreiden TK-aktii- ; .·. visuus voidaan mitata tässä julkaistujen menetelmien mu- ’!!.* kaisesti.

• » · * » ·

Edullisia kaavan III mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, jotka on esitetty taulukossa 1, ja joissa on teh-' 30 ty seuraavat substituutiot. Yhdisteet 1-23, 1-35, 1-36, I- .,.· 37, 1-39, 1-42, 1-43, 1-44 ja 1-45 kuvaavat keksinnön mu- j kaisia kaavan (III) yhdisteitä.

* · • · rt» • ta • » a

Miia 5 113537

Taulukko 1 * * 5 [*7 Z^> M C02CH3 OH H H,

H

1-2 CH2OH OH H H,

H

1-3 H OH H H,H

1-4 CONHj OH H H,

H

1-5 co2ch3 OH OH H,

H

1-6 CHjOCOCHj OH H H,

H

I-7C3) -CH2NHC02- - H H,

H

1-8 CH2SOCH3 OH H H,

H

1-9 CONHCjH5 OH H H,

H

:!* 1-10 CONHCjH, OH H H,

: !* H

i”·! Ml conO0 oh h H, ·':;/ h 1-12 CONH(CH2)2OH oh h h,

H

;:: 1.13c3) -ch2oc(ch3)2o- - h h,

,”: H

‘V;-: 1-14 ch=nnhconh2 oh h h,

C: H

6 113537 1-15(3) -CH2N(CH3)C02- - H H,

H

Γ-16 CHjNCCHj^ OH H H,

H

I_17(4,i2) CH2NH-Pro OH H H,

H

1-18«) CH2NH-Ser OH H H,

H

1-19 CH2OH OCH3 H H, _____ 1-20(3) CH2S-GIc OH H H,

H

1-21 CH2N3 OH H H,

H

1-22 C02CH3 OH H O

1-23 C02CH3 OH Br H,

H

1-24 CH2NHCOCH3 OH H H,

H

• · 1-25 CON(CH3)2 OH H H,

;_____H

1-26 CONHOH OH H H, h 1-27 COzCH3 OH NHCONHQHj H,

H

1-28 CH=NOH OH H H,

]· . H

1-29 CH=NNHC(=NH)-NH2 oh h h,

H

» I

7 113537 I Ϊ30 CH=NNH-^ I OH H H, __jjj____ 1-31 ch2co2ch3 oh h h,

H

1-32«.») CH2NH-Gly OH H H,

H

1-33 CONHC6H3 OH H H,

H

1-34 C02CH3 OH NHCONHC^ H,

H

1-35 C02CH3 OH CHjOCONHCjHj H,

H

1-36 CH2OH OH Βγ H,

H

1-37 C02CH3 OH NHC02CH3 H.H

1-38 C02CH3 OH CH3 H,

H

1-39«) C02CH3 OH Br H,

H

1-40 CH2SO<g> OH H H,

:·" ^ H

• * * ^ : :‘; 1-41 C02CH3 OH 0^0(¾ H,

:"·! H

« · · ___________ _ _ :':*; 1-42«) CH2OH OH Br H,

H

·· 1-43(6) CONHCH2CH2OH OH Br H,

/::. H

1-44(7) co2ch3 oh ci h, h

* · .-I.- .1 _____ I

» $ 8 113537 1-45 CONH2 OH Br H,

H

1-46 CHjNHCONHCjHj OH H H,

H

1-47 CHjNHCONHQHj OH H H,

H

1-48 CH=NN(C6H5)2 OH H H,

H

1-49 CH2SC6H5 OH H H,

H

1-50 CH2S<^> OH H H, ______JH_ 1-51 CH2SOC6Hs OH H H,

H

Π-1<8) - - H H,

H

Π-2(9'η) - - H H,

H

Π-3<10’η) - H H,

H

• * · • * · — 1--------------------·- -1- • » ♦ f: (6) R2 on Br.

(7) R2 on Cl.

• · · : .·. Siten asiaan läheisesti liittyvän näkökohdan mu- • · · I*V 5 kaisesti menetelmässä eturauhasen patologisen tilan hoita- • · t miseksi nisäkkäällä nisäkkäälle annetaan hoidollinen määrä ♦ « · t t t * keksinnön mukaisella menetelmällä saatavaa indolokarbatso- liyhdistettä, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu yh-disteistä: 10 1-23, 1-35, 1-36, 1-37, 1-39, 1-42, 1-43, 1-44 ja .·. ; 1-45.

V’ Toisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisella me- • · • » V netelmällä saatava indolokarbatsoliyhdiste on valittu ryh- »ti ·.·' · mästä, joka koostuu yhdisteistä 1-35, 1-37, 1-43 ja 1-45.

"**: 15 Edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukaisella menetelmällä saatava indolokarbatsoliyhdiste on 1-42.

9 113537

Missä tahansa kuvatuista erilaisista menetelmistä keksinnön mukaisella menetelmällä saatava indolokarbatso-lijohdannainen voidaan antaa potilaalle yhdistelmässä farmakologisen täyteaineen kanssa tai farmaseuttisesti hyväk-5 syttävän suolan muodossa.

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisissa suoritusmuodoissa valmistetaan tyypillisesti seuraavat uudet yhdisteet: 1-35, 1-37, 1-42 ja 1-43.

Kaavassa (III) ryhmien määritelmissä alempi alkyy-10 li tarkoittaa suoraketjuista tai haaroittunutta alkyyli-ryhmää, jolla on 1 - 6 hiiliatomia, kuten metyyliä, etyyliä, propyyliä, isopropyyliä, butyyliä, isobutyyliä, sek-butyyliä, tert-butyyliä, pentyyliä, neopentyyliä ja hek-syyliä. Halogeeni sisältää fluorin, kloorin, bromin ja jo-15 din.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan (III) mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava

H

i···! R7^r^YTR! .;· tl Λ )—\ Jl J (Iii-i) : h : ηο-π ' : co2ch3 • · · jossa R1 on NHCO2R14 ja R2 ja R14 ovat edellä määri- * * · ···· teltyjä, yhdiste, jolla on kaava • · • · » · · » · • · · • * · • ♦ • t • t · « · · > 1 t » « 10 113537 co2ch3 R!YY^TTNHi 0 NN'/Ls^

n^-VV

h3cco2·^) / co2ch3 jossa R2 on edellä määritelty, saatetaan kosketukseen kaavan ZCO2R14 mukaisen halogeeniformiaatin kanssa, 5 jossa Z on halogeeni, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava co2ch3 H^CCOf^] :T: GOzCHa • · i1·., jossa R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, ja dease- j 10 tyloidaan kaavan O mukainen yhdiste; • 1 · » ; b) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, ( t t ··· jolla on kaava v : h 1 · 1 :'.: H.c-Aj y HO ^ co2ch3 · > i · ;·· 15 jossa R1 on CH2OCONHR14 ja R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, yhdiste, jolla on kaava 11 113537 CO CH, I 2 3 ^Nw> ch2oh ¥ T)M(T j (R) H,ci0/ h3cco 2"-| co2ch3 jossa R2 on edellä määritelty, saatetaan kosketukseen kaavan R14NCO mukaisen isosyanaatin kanssa, jolloin 5 saadaan yhdiste, jolla on kaava CO.CHj R2'Y^v^Q)^r^vCH2ocoNHR14 (S) H3CC02-"j co2ch3 • · · • · · ’*··’ jossa R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, ja dease- : ” 10 tyloidaan kaavan S mukainen yhdiste; • * ·,: * c) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, ': t jolla on kaava

H

/N ° (III-iv)

h3c-V V

ho-·) ·..* ch2oh : jossa R1 on halogeeni, CH2OCONHR14 tai NHC02R14 ja R2 15 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, yhdiste, jolla on kaava 12 113537

H

cV10 ( HI-!) -A°y HO-q ' co2ch3 jossa R1 on NHCO2R14 ja R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, pelkistetään; 5 d) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava

H

/Ν^° h3c"Y y Ηο-'η ' CONHR15 :***: jossa R1 on halogeeni, CH2OCONHR14 tai NHCO2R14 ja • * · • '•tt R2, R14 ja R15 ovat edellä määriteltyjä, kaavan C mukaisen : .·. 10 yhdisteen happo, jolla on kaava *: /N 0 N n (ci t, H,cVy H3COCO^f

cooH

· · » 13 113537 aktivoidaan, jolloin saadaan aktivoitu happo, joka saatetaan kosketukseen kaavan R15NH2 mukaisen amiinin kanssa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava

H

/N O

ΐ X )—( X Jt <e> H3c-vy h3cco2-^] 5 CONHR15 jossa R1, R2 ja R15 ovat edellä määriteltyjä, ja deasetyloidaan kaavan E mukainen yhdiste; ja e) haluttaessa näin saatu kaavan (III) mukainen yhdiste muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolak- 10 si.

Edullisesti yhdisteiden (III) farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin sisältyvät farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat, metallisuolat, ammoniumsuo-lat, orgaaniset amiiniadditiosuolat ja aminohappoadditio-15 suolat.

i i t (...t Esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttävistä hap- * » .!'* poadditiosuoloista ovat epäorgaaniset happoadditiosuolat, ; t kuten hydrokloridi, sulfaatti ja fosfaatti, ja orgaaniset

I * I

; happoadditiosuolat, kuten asetaatti, maleaatti, fumaraat- t! : 20 ti, tartraatti ja sitraatti. Esimerkkejä farmaseuttisesti : hyväksyttävistä metallisuoloista ovat alkalimetallisuolat, kuten natriumsuola ja kaliumsuola, maa-alkalimetallisuo-·;· lat, kuten magnesiumsuola ja kalsiumsuola, alumiinisuola ja sinkkisuola. Esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttä-_* 25 vistä ammoniumsuoloista ovat ammoniumsuola ja tetrametyy- '· liammoniumsuola. Esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttä- i · vistä orgaanisista amiiniadditiosuoloista ovat suolat, jotka on muodostettu morfoliinin ja piperidiinin kanssa. Esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttävistä aminohappoad- t 14 113537 ditiosuoloista ovat suolat, jotka on muodostettu lysiinin, glysiinin ja fenyylialaniinin kanssa.

Keksinnön muut ominaispiirteet ja edut ilmenevät seuraavasta keksinnön edullisesten suoritusmuotojen kuva-5 uksesta ja patenttivaatimuksista.

Yksityiskohtainen kuvaus Kuviot

Kuvio 1 on Western blot -menetelmän autoradiogram-mi, joka osoittaa K-252a-johdannaisten aiheuttamaa ligan-10 dista riippuvaisen trk-tyrosiinikinaasin fosforylaation estämistä.

Kuvio 2 on kaavamainen kuvaus yhdisteen III-2 synteesistä .

Kuvio 3 on kaavamainen kuvaus yhdisteen III-3 syn-15 teesistä.

Kuvio 4 on kaavamainen kuvaus yhdisteen III-4 synteesistä .

Patentin hakijat ovat määrittäneet, että ehdolla olevan yhdisteen kyky estää trk-reseptoreiden autofosfory-20 laatiota ennustaa sen mahdollista kykyä eturauhasen patologisen tilan hoitamiseksi. Tämä johtuu siitä, kuten tässä V : on osoitettu, että farmakologinen väliintulo käyttämällä trk-estäjiä voi estää spesifisesti eturauhassolujen kasvun ·*·,. in vivo. Lisääntyvät eturauhassolut ovat erityisiä tässä l 25 suhteessa johtuen siitä, että vaikka trk on läsnä ei-etu- • · · » : rauhasen lisääntyvien solutyyppien suuressa osajoukossa, • · · · lisääntymistä ei laita liikkeelle välttämättä syy-yhtey- * * · dellinen voima eikä ylläpitävä voima. Siten eturauhasen , patologisen tilan hoitamiseksi käyttökelpoisten yhdistei- j 30 den valinta voi kaventua oleellisesti yhdisteen kyvyn mu- ·’ kaan estää trk-autofosforylaatiota.

Yhdisteistä, jotka osoittavat positiivisia tulok-."·. siä trk-autofosforylaatioseulonnassa, tutkitaan erityises ti niiden kyky estää eturauhassolujen lisääntyminen sekä * 35 eturauhasesta peräisin olevissa solulinjoissa että sopi- ‘ * vassa eläinmallissa in vivo. Tässä julkaistut koetulokset 15 113537 osoittavat suoraa korrelaatiota yhdisteen kyvyn välillä estää autofosforylaatiota in vitro ja sen kyvyn välillä estää eturauhassolun lisääntymistä.

Tästä seuraa analyysi, joka koskee kinaasiestäjän 5 K-252a tiettyjen johdannaisten kykyä estää patologinen eturauhasen solun lisääntyminen perustuen niiden kykyyn estää trk-reseptoreiden autofosforylaatiota.

Esimerkki 1

Trk-reseptoreiden estäjien valinta 10 Ehdokasyhdisteet eturauhassolun lisääntymisen es tämiseksi valittiin perustuen niiden kykyyn estää tyrosii-nikinaasin aktiivisuutta, joka on yhteydessä trk-reseptoreihin. Sidottuaan NGF:n trkA läpikäy autofosfory-laation sen tyrosiinikinaasidomainin aktivoitumisen tulok-15 sena (Kaplan et ai., Nature 350:158 - 160, 1991). Trk-re septoreiden autofosforylaation aste voidaan mitata ja se on todettu tkr-kinaasiaktiivisuuden luotettavaksi määritykseksi. (Kaplan, 1991, supra).

PC12-solut (ATCC #CRL1721) ovat rotan lisä-20 munuaisytimen kromaffiinisolukasvaimen soluja, jotka kan tavat trkA-reseptoria ja erilaistuvat sympaattisiksi her-V * mosoluiksi käsiteltäessä ne NGF:llä. Näitä soluja kasva- ’·" · tettiin 100 mm:n maljoissa DMEM-elatusaineessa (GIBCO) , : joka sisälsi 7,5 % nautasikiön seerumia, 7,5 % hevosen • 25 seerumia, 2 mM glutamiinia ja 1 mM pyruvaattia. Soluja in- I I · · kuboitiin 37 °C: n lämpötilassa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 10 % CO2: a ja 90 % ilmaa. Lähes yhteenkasvaneita (subconfluent) soluviljelmiä inkuboitiin elatusaineessa , ilman seerumia yhden tunnin ajan, sitten niitä inkuboitiin > · ;;; 30 yhden tunnin ajan K-252a-johdannaisyhdisteen kanssa, jonka '··* konsentraatio oli 100 nM tai 500 nM, ja sitten niitä sti- muloitiin 5 minuutin ajan NGF:llä, jonka konsentraatio oli 50 ng/ml. Kummankin viljelmän solut hajotettiin ja hajote-,tut solutuotteet preparoitiin käyttämällä standarditek- 1 · ’ 35 nilkkaa, jonka alan ammattimiehet tuntevat. Kutakin hajo- * I J i » tettua solutuotetta inkuboitiin anti-trk-vasta-aineen 16 113537 kanssa, jolloin immuunikompleksit muodostuivat. Valmistettiin polyklonaaliset anti-trkA-, B- ja C-vasta-aineet trk:n 16 C-terminaalista aminohappoa vastaan (Kaplan et ai., 1991, edellä). Immuunikompleksit kerättiin talteen 5 käyttämällä Protein A-Sepharose -helmiä, ne erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesin (SDS-PAGE) avulla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridimembraaneille (PVDF-membraaneille) (Millipore Corp., Bedford, MA) käyttäen alan ammattimiesten hyvin tuntemaa tekniikkaa. Mem-10 braaneja inkuboitiin anti-fosfotyrosiinivasta-aineen kanssa, joka sitoutuu tyrosiinifosforyloituihin trk-resepto-reihin, mutta ei trk-reseptoreiden fosforyloitumattomaan muotoon. Anti-fosfotyrosiinivasta-aineeseen sitoutuneet proteiinit visuaalistettiin käyttämällä parannettua ke-15 miluminesenssia (ECL, Amersham) ja ne näkyvät tummina "täplinä" kuviossa 1.

Trk:n autofosforylaation mittaus tuottaa trk-tyrosiinikinaasin aktiivisuuden ja siten trk:n stimulaation hyvän indeksin. Ehdolla olevien estäjien puuttuessa li-20 sätty NGF tuotti tulokseksi trk:n tyrosiinifosforylaation lisääntymisen. Viitaten kuvioon 1, sarakkeeseen, jonka ot- V * sikko on DMSO( + ) (dimetyylisulfoksidi) , kantaja-aine • > osoittaa trkA:n oleellista f osf orylaatiota NGF:n läsnä ol- lessa ja ehdokasestäjäyhdisteen puuttuessa. Stimuloitaessa j j"j 25 soluviljelmiä NGF:llä, kun läsnä oli 100 nM:n konsentraa-• · · · : tio yhdisteitä 1-9, 1-7 tai 1-1, f osf orylaatiovaste puut- « · · · tui (ei täplää näkyvissä). Kun läsnä oli 100 nM:n konsent- • · · raatio yhdisteitä 1-20 ja 1-39, fosforylaatiovaste oli , jonkin verran pienentynyt (pienempi täplä näkyvissä). Kun 30 läsnä oli 100 nM:n konsentraatio K-252A-johdannaista, yh- • · ‘>··* distettä 734, ei ilmennyt vaikutusta autofosforylaatioon.

Johdannaisyhdiste 734 sisältyi kokeeseen ei-aktiivisena negatiivisena kontrollina ja osoittaa, että muiden tutkit- I I » tujen johdannaisten estävä aktiivisuus ei johdu ei- '·* * 35 spesifistä toksisuudesta.

• · 17 113537 K-252a yhdisteestä 1-1 ja 130 erilaisesta K-252a-johdannaisyhdisteestä tutkittiin, kuten edellä on kuvattu, niiden kyky estää trk:n tyrosiinikinaasidomainin autofos-forylaatiota (johdannaisyhdisteiden konsentraatiot olivat 5 100 nM ja/tai 500 nM) . Estämistä osoitti sellaisen täplän puuttuminen, joka siirtyi trk-merkintäaineen kanssa ja joka on esitetty kuvan vasemmalla puolella. Osittaista estämistä osoitti pienentyneen koon omaava täplä. Seitsemän-kymmentäkolme yhdistettä osoitti ainakin osittaista fosfo-10 rylaation estämistä, kun konsentraatio oli 500 nM tai vähemmän. Näiden yhdisteiden, jotka on taulukoitu taulukkoon 2, ennustetaan olevan funktionaalisia K-252a-johdannaisia eturauhasen solujen epänormaalin lisääntymisen hoitamiseksi. Keksinnön mukaisia kaavan (III) mukaisia yhdisteitä 15 ovat yhdisteet 1-23, 1-35, 1-36, 1-37, 1-39, 1-42, 1-43, 1-44 ja 1-45.

• 1 1 • · · * · · • · • · • · • 1 · • · • · · • · · *β· · • · · * · · • · · • · · • » · » » 1 • · » · • · · • t · • · · 18 113537

Taulukko 2

Yhdiste

100 nM 500 nM

I—1 + +

1-2 + NT

1-3 + NT

1-4 + +

1-5 + NT

1-6 + NT

1-7 + NT

1-8 - +

1-9 + NT

1-10 + NT

I-1J + NT

1-12 + NT

1-13 + +

1-14 + NT

• t · __ __

1-15 + NT

1-16 + NT

• : :’: Ι-Π - + • · · ·

:,: : l-is + NT

: I— 19 + NT

. 1-20 - + ·. 1-21 - +

/ . 1-22 + NT

• * 19 113537 1-23 - +

1-24 + NT

1-25 + NT

1-26 + NT

1-27 - +

1-28 + NT

1-29 - + 1-30 - +

1-31 + NT

1-32 + NT

1-33 - + 1-34 - + 1-35 + + -;---;--

1-36 + NT

1-37 + NT

1-38 + NT

1-39 + NT

1-40 + NT

1-41 + + : *·· 1-42 + + i.: i 1-43 - + • · · '.....' 11 “«—mmmm· ·';;/ 1-44 - + • Β^ΜΒΒΒΒ^Β^ΒΒΙΒΙΒΒΒΒΒΒ·

1-52 + NT

. 1-53 + NT

VB^WBnB^WMBBMBBBBBBB

1-54 + NT

1-55 + NT

# » Η·ΒΒ·ΒΙ·ΒβΙΒΒΒΙΙΒ·ΙΒΒΒ ΚΒΒΒΒΒΒΒΒΒΒ^ΜΒΜ^^ΜΒ· BUM·>^_Β*ΙΒΒΙΒ :./ 1-56 NT + • ·

"* 1-57 + NT

v [ 1-58 - + 1-59 - + 20 113537 1-60 - + 1-61 - + 1-62 + + 1-63 - + 1-64 - + 1-65 - + 1-66 - + 1-67 + + 1-68 - + 1-69 + + 1-70 + + 1-71 - + 1-72 - + 1-73 + + 1-74 + + I- 75 NT + :j’: 1-76 NT + II- l - + # · _ ^_______ : !* n-2 - + • · · * * * —— ' *** II—4 NT + * * * » —— V · NT: ei tutkittu; (+): esti fosforylaatiota; !* (-): ei estänyt fosforylaatiota.

5 Esimerkki 2 . Ihmisen eturauhasen syöpäsolujen kasvun estäminen ;*· viljelmässä • · *·;·’ K-252a:n funktionaalisista johdannaisista tutkit- ; tiin niiden kyky estää ihmisen eturauhasen androgeenistä 10 riippumattomien syöpäsolulinjojen Tsu-Prl (Iizumi, et ai., J. Urol., 137 : 1304 - 1306, 1987), DuPro-1 (Gingrich, et 21 113537

ai., J. Urol., 146 : 915 - 919, 1991), PC-3 (ATCC

#CRL1435) ja DU-145 (ATCC #HTB81) kasvu viljelmässä. Kokeen ajan Tsu-Prl- ja Du-Prol-soluja pidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa (GIBCO), joka sisälsi 10 % nautasikiön 5 seerumia (Hyclone), 2 mM glutamiinia, 100 U/ml penisilliiniä ja 100 pg/ml streptomysiiniä. PC-3-soluja pidettiin Ham's F12K -elatusaineessa (Irvine Scientific), joka sisälsi 10 % nautasikiön seerumia (Hyclone) , 2 mM glutamiinia, 100 U/ml penisilliiniä ja 100 pg/ml streptomysiiniä. 10 Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 °C:n lämpötilassa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5 % CC>2:a. DU-145-soluja pidettiin minimaalisessa oleellisessa elatusaineessa (Gib-co) , joka sisälsi 10 % nautasikiön seerumia (Hyclone), 2 mM glutamiinia eikä lainkaan antibiootteja.

15 Kokeet ehdokasyhdisteiden kasvua estävän vaikutuk sen tutkimiseksi suoritettiin käyttämällä seuraavaa menetelmää. Pantiin 96 kuoppaisen maljan (Falcon) jokaiseen kuoppaan 2 500 solua 0,1 ml:ssa elatusainetta. Viljelmiä inkuboitiin yön yli, minkä jälkeen jokaiseen kuoppaan li-20 sättiin 0,1 ml:n erä viljelmän elatusainetta. Kukin erä sisälsi 10 edustavan ehdokasyhdisteen (1-1, 1-5, 1-8, 1-12, 1-15, 1-16, 1-19, 1-20, 1-22 ja 1-42) eri konsent- raation. Kaksi ylimääräistä erää sisälsi K-252a-joh- t * · dannaiset cmp700 tai cmp783, joiden ei oltu havaittu estä-; 25 vän trk:n tyrosiinikinaasidomainin autofosforylaatiota ko- keessa, joka on kuvattu esimerkissä 1. Siten johdannaiset • t « cmp700 ja cmp783 oli sisällytetty kokeeseen negatiivisina kontrolleina osoittamaan, että syöpäperäisen eturauhasso-lun kasvun estäminen korreloi trk-reseptoreiden tyrosiini-. 30 kinaasidomainin autofosforylaation estämisen kanssa. Muut ‘-"J kontrollikuopat saivat elatusainetta ilman K-252a- .·, ; johdannaisyhdisteitä. Inkubointia jatkettiin kolmen päivän • t · ajan. Päivänä kolme kunkin kuopan solujen lukumäärä määri-tettiin käyttäen kalseiinif luoresenssimääritystä [Bozycz-: 35 ko-Coyne et ai., J. Neurosci. Meth., 50, 205 - 216 i (1993)].

22 113 5 3 7

Solut ottavat kalseiini-AM:n (Molecular Probes, Eugene, OR) , mahdollisen väriainefluoreseiinidiasetaatin analogin, ja pilkkovat sen solunsisäisesti fluoresoiviksi suoloiksi, jotka elävien solujen vahingoittumattomat mem-5 braanit pidättävät. Siten tämä menetelmä tuottaa solujen eloonjäännin luotettavan ja kvantitatiivisen mittauksen. Kalseiini-AM laimennettiin 2 x Dulbeccon fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (D-PBS) kaksinkertaiseen lopulliseen määrityskonsentraatioon (6 μΜ) ja 100 μΐ lisättiin 10 viljelmän kuoppiin, jotka sisälsivät 100 μΐ elatusainetta. Maljoja inkuboitiin sitten yhden tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa. Sitten solut pestiin 4 kertaa D-PBS-liuoksella ylimääräisen kalseiinin poistamiseksi, jota solut eivät olleet ottaneet. Maljan laskenta toteutettiin käyttäen 15 Millipore-maljalaskinfluorimetriä (Cytoflor 2350) emission ollessa 485 nm ja viritteen ollessa 538 nm. Nollakokeen (kuopat, jotka sisälsivät elatusainetta, mutta ei soluja) arvojen vähentämisen jälkeen suhteelliset fluoresenssiar-vot tuottavat solujen eloonjäämisen kvantitatiivista mi-20 tan.

Solujen määrää kuopissa, jotka sisälsivät funktio-V 1 naalisia johdannaisia, verrattiin solujen lukumäärään ί<ΐ(ϊ kontrollikuopissa. Konsentraatio, joka esti solujen kasvua 50 %:lla, laskettiin ja siitä käytetään nimitystä "IC50"- • ·’· 25 arvo. Tulokset esitetään taulukossa 3.

• · · • « · 1 • » » • i » » ·

• I

• » • 1 · • » t 23 113 5 3 7

Taulukko 3 [Yhdiste TSo-Prl Do-Prol PC-3 DU-145 _ICgqQxM) IC^QiM) ICtpQxM) I—12 0,038 0,31 0,69 0,75 1-5 0,07 0,06 NT 0,08 1-19 0,07 0,27 5,0 0,11

1-42 0,09 NT NT NT

1-1 0,21 0,75 3,4 1,2

1-16 0,21 NT NT NT

1-15 0,51 NT NT NT

1-8 0,54 NT NT NT

1-22 0,69 NT NT NT

1-20 5,7 NT NT NT

cmp700* 2,7 >5 7,6 3,1 cmp783* 1,1 3,1 11 1,7 NT = ei tutkittu; * trk:n ei-estäjät, jotka sisältyivät kokeeseen • I » *·' ‘ 5 kontrolleina.

Kaikki taulukossa 3 luetellut yhdisteet estivät i *·· solun kasvua yhdessä tai useammassa eturauhassyövästä pe- • > jtj | räisin olevassa solulin j assa. Estämisen yleinen malli oli • sama kaikissa solulinj oissa (taulukko 3), vaikka kunkin 10 yhdisteen todellinen IC5o-konsentraatio vaihteli tutkittu jen solulinjojen joukossa. Esimerkiksi yhdisteet 1-12, 1-5 ja 1-19 olivat tehokkaimpia yhdisteitä kasvun estämiseksi : kaikissa neljässä solulinjassa, vaikka niillä oli erilai nen teho. Sitä vastoin yhdisteet 700 ja 783, jotka eivät 15 estä trk-reseptoreita, olivat selvästi tehottomampia etu- : rauhassolulinjan kasvun estäjiä. Trk-reseptoreiden estä- jillä näytti olevan vähiten vaikutusta PC-3-solulinjan ‘ . kasvuun. Trk-reseptoreiden lukumäärä, tyyppi ja/tai ja kauma voivat olla erilaisia PC-3-solulinjassa verrattuna 24 113537 muihin käytettyihin solulinjoihin. Taulukossa 3 esitetyt tiedot tukevat johtopäätöstä, että yhdisteet, joka estävät trk-reseptoreiden autofosforylaatiota, estävät ihmisen eturauhasen androgeenista riippumattomien syöpäsolujen 5 kasvua.

Esimerkki 3

Eturauhasen kasvun estäminen seksuaalisesti kypsy-mättömillä hiirillä Tässä esimerkissä ei ole tutkittu sinänsä keksin-10 nön mukaisesti valmistettuja kaavan (III) mukaisia yhdisteitä .

Seuraavaa eläinmallia voidaan käyttää funktionaalisen johdannaisen tehokkuuden tutkimiseksi proliferatii-visen eturauhasen sairauden hoitamiseksi. Seksuaalisesti 15 kypsymättömiä urospuolisia hiiriä, joiden paino oli 15 -20 g (Charles River Laboratories Raleig, N. C.) käytettiin seuraavassa in vivo -kokeessa. Hiirten annettiin sopeutua vähintään kolme päivää niiden hankkimisen jälkeen, ennen kuin niitä käytettiin missään kokeissa.

20 Valmistettiin päivittäin yhdisteiden 1-1, 1-12 ja cmp700 liuokset liuottamalla ne 10-%:iseen Tween 20 V * -liuokseen, 5-%:iseen etanolin ja 85-%:iseen fosfaatilla ϊ,,.ί puskuroituun suolaliuokseen (TEPBS). Kukin koeryhmä käsit- ti 12 hiirtä. Hiiriin ruiskutettiin ihonalaisesti joka • 25 päivä 21 päivän ajan TEPBS-liuosta, TEPBS-liuosta, joka

• < * I

: sisälsi yhdistettä 1-1 konsentraatioiden ollessa 1 tai 10 mg/kg, TEPBS-liuosta, joka sisälsi yhdistettä 1-12 kon- • » · sentraatioiden ollessa 1 tai 10 mg/kg tai TEPBS-liuosta, joka sisälsi yhdistettä cmp700 konsentraatioiden ollessa 1 30 tai 10 mg/kg. Sitten 21 päivää kestäneen annostus j akson '»·* lopussa hiiret lopetettiin ja koko ruumis, veri, dorsaali- nen eturauhanen, ventraalinen eturauhanen, hyytymisrauha- • · set (coagalating glands), rakkularauhaset, sydän, maksa, mahalaukku, keuhkot, munuaiset ja kivekset otettiin tal-’·' * 35 teen erikseen ja punnittiin.

25 113537

Plasman testosteronikonsentraatio määritettiin käyttäen Coat-A-Count Total Testosterone RIA -pakkausta (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA 90045) . Tämä tehtiin, jotta voitiin osoittaa, että yhdisteet estä-5 vät epiteelin kasvua mekanismin kautta, joka ei koske seerumin testosteronipitoisuuksien muuntamista.

Kunkin kudoksen keskimääräinen paino esitetään taulukoissa 4, 5, 6 ja 7. Tuloksia, jotka ovat peräisin hiiriltä, jotka saivat TEPBS:n ja yhdisteen 1-1 sisältävän 10 ruiskeen, TEPBS:n ja yhdisteen 1-12 sisältävän ruiskeen tai TEPBS:n ja yhdisteen cmp700 sisältävän ruiskeen, verrattiin tuloksiin, jotka olivat peräisin hiiriltä, jotka saivat pelkästään TEPBS-liuosta, käyttäen Dunnettin T-testiä tai ryhmä-t-testiä (taulukot 4 ja 5). Tuloksia, 15 jotka olivat peräisin hiiriltä, jotka saivat TEPBS:n ja yhdisteen 1-19 sisältävän ruiskeen, verrattiin tuloksiin, jotka olivat peräisin hiiriltä, jotka saivat pelkästään TEPBS-liuosta sisältävä ruiskeen, käyttäen Dunnettin T-testiä, Newman-Keul-testiä tai ryhmä-t-testiä (taulukot 20 6 ja 7) (Tallarida et ai., Manual of Pharmacologie Calcu lation with Computer Programs. 2. painos. Springer Verlag, v’: NY, 1987, sivut 121 - 125, 131 - 134, 145 - 148).

> i · * * * * 26 1 13537 ö _ 0 tn 2 6 m nj to m

G ' CO ^ ^ M O ^ O

•Hl .... . . .

<0 K) 4-> I—I CM M CM CM CM M

A -πω „ e w +l +l +l +1 +l + | +l S >1 m <D -PXl I—I CM LO M M O CD ctn £ >i 3 .... . .. o w >ι Γ0 LT) CO CO 00 CD CO r- 5 CN i—li—IC\J i—I i—li—I o 1 ---^^----v s (d | ^

3 2 ro m O

Γ, mm fd -k * * *r. 3 O M CO CTi en LO CM JTv ®m .... . .. pv.

«» rd en 3^5 -ΓΊ H g +| +| +| +| +| +1+1 -* .

6 M o m m en M roro £ S

O M +j .... . .. S'-1

2 ro 0 LO i—i co r- cd ^ LO C 3 P

« PC U) r- co co lo cd lolo Xjd]j nl m £ e

A ω ^ O

C -P p p: • J PC m n -P e

3<DCD CM * ^ m S

S PP to ro r-- . cm m m ^ a) % a ·Η cd ...iH . .. .H+’m Γ ·—I -P M M O M Οι—I m I m H te P +1 n -P m n rt cd ^ +1 +i +1 +1 +1+1 ω I ®

R P P tn ao cm r- . cd r- to c SS

jj Q ω - en to to m en m cd q^-P

rl M :<d rt Cd >

> r +> rt H

C e/) 40 £5^ J Ρω CD * ra CD CD ® f o -H ^ O -HP . en cd . . m cd t> O -m O Mrd O., o o .. C > ω

iz (ϋ JC CD CD O CD mP.M

Q, rt p +1 +1+1 I (d m .·:*. S4 P »o +1+1 +1+1 Ja 1 ... Λ 4-) P — ro mo (n w nj

p p tn . to to . . cm m s ω V

m ω-pgM . . m m .. tqCP+j ·,· .J-, £> ω -—' i—I M CD 1—1 M CD cd S ω o

--------EH

: ·.. CM M

* H -P ’3 : ,·, 1 o en -p -p ... H Ρί :rd CO :(d ··· · M 00 cd cd r~ r- m o »> :ro —, :.·. . CO .... . .. <D > :rd

··. _j O. OOOO O OM

· 1 e 4J m m ·'· h ή +I+I+I+I +1 +1+1 -Η+)ω v * -h Pi '3 1

β g LOCslorO (M COlO pPi-H

^ Cl) P .... . .. CL) ^ <D

τι Pin i—1 cm o o o CMcn g ω . 0 -H cd— en en pr) m ro ro cm Gp ;· ^ id--------td m ·· • ^ jj cd Jd ^

, pm Cn tn o 3 P

*, · H -H tn PJ tn Pi P p H

; p Ό Pi \ pi m. pj m . . nl ^ \ tn \ tn ω * ; * · tn g o tn g * m * • · 1—I £ ’—I |—I g ... 0> O I * I + o

li -P i—li—I O + O -k i—li—I

• · * 4-1 co o tn o tn I I

• -H OQI | Γ- Λί Γ- Pi CM CM

iT. tn CL, —li—ltd M. td 1—I 1—I

·.*· :fd Cd I I g tn g tn I I

, id Eh i—1 1—1 ogogi—1 1—1 113537

Jj CO LO

LDrHOOOO^^O A, r-COLOOOiHLOCO^ φ o +l +l +l +l +l + l +l lo

5 Ό v O

W Cfi -— [— t—I LO rH CM O CO ^ {; -V tJ1 O C\3 CO 1—f I— CM 00 (1, o 2 <C g σ σ r~ o o i—I co

^ S t—I '—I 1—I CM CM CM i—I 'V

s I H ^ ^ 11 a Λί ’Π C D m cd cm σ oo lo i—I cd eye 6m « 0 CM rH i—I CM CM rH CM ^

” Ή C

co +| +1 +1 +1 +| +| +| -H p

w P —- -P p cC

P C O' co oo o ,-h co i—I cm cn^C

+> D g r- σ lo co σι σ lo a) m -h

P S'-'LOlO lO lo lo lo lo -P .□ CD

X--------I £ ^ -d + m 7 > a Z m -H 7 +j

CM -P i—l 00 CM -PijC

rH Q) VD 'X* \—i CO \—1 \—I lO -P I O

I m φ .m m Η -¾ +| +| +| +| +| +| +| C g cd — c β c

β > t7 CM co LT) 00 rH Γ- 3 >, (D

Φ -rlgOrH O O rH σ 00 Qj,CU

φ y '— CM CM CM CM CM rH rH CO

m a -P J (D

H * n b

Ti σ cm co σ ^ <-η σ o n O

43 - o . . - . - > > *

Sj LDv^r-OOLOOiHr,

\—I 00 i—I \—I 1—I 1—I CNJ CO /t< -P

iff Ο *Πθ •r-ι +1+1 +1 +1 +1 +1 +1 C £ t>

33 — CD m -H

p O' ο σ co o cm -¾1 co a> πί >i T CD g CO CM CO 00 rH ST LD C £ -p Γ. y — CM CM CM CM co CM CM -H Ή --------r f m

n cci m 'P

... S' oo co co co o -i i .,— co ; ; ; Λ ^'crLnocMr^com^ ... _ οο'^ΌΓ-Γ'-οοσρ'Ρ.Αί

• · m , cc m -P

9? e +l +l +i +i +i +i +i pi o :·. fi =(0 — -n ·· -P C C H <3· CM [~- ^ σ CM -r-H .

• 2 >i g r- co lo co co r- LO .p ^

« · * * "H UI <—I \—I rH rH rH rH rH COrn-P

: *---------=" . V -I—1 • * · Φ (1) :m " X +0 m en I-H Λ!ΓΜΟΟΓ'ίΟΟθσ-ΓΗρφ I D CM rH CO rH CM CM rH PC g |

H CC p <1 -H

ΙΟ Ή +| +| +| +| H-1 +| +| CD n\ CD

ö <c — 6 %

0(1) χίΟίΜ-οοίΟΓ-ι-ισο C

• 44 φ m g σ σο σ r- ^ cm r- m m ·’ 4* +> S CM CM CM CM CO CO CM cCrjp!

. . 3 m--------o Λ M

... * 1—I ·Η P u Eh g -g ö ω w • · nt JS 0 He Ι'.ί ΕΗ>4θί>ι * ra +

' ‘ ti rH C , ..O' CT

,··· -rl (D tTPi*Di*Pc: tCP4 • · nJ+J Λ4·\ΟΛίΟ·\Λ!\ λ -P ^ \ Di o \ o cH \ 01 -H OQ D" gr-Dir-SCMDiCMg

'·· C CO CUrHgrH ft £ Oi rHgrH

. φ :m ω I log g O I IO

. -P y Eh I—I i—I I—I i—t O '—I O i—C I—I '—I I—I '—I

113537 :fd

1 M

^ rc m ' m CT> CO O

(ΰ— o^co^m ^ ln r- M tJ1 *»*»*· ^ · m i co £ cmt-ho νι_π._ι +1 +1 +1 -H - ° O J Π3 g +1+1+1 v 2 co + cd 00 J +j V o + .+ tr O VO 00 +j(U co co vo ^ 3 Ei o o o >1 M ^ ^ d. v m S'-'CN'-I Ή >1 di o + oo H---- 2 + CM CM CM k a *

_ >1 JO

(0..51 (0 r K d + m 0) + oo r~ 1 "> «> 3 (0 >-1 d oo i i i i os —- + cm o β Λί "Oj , i , I , i C (ij hi ^ + 3 ro +1+1+1 0 M£ CM CM CM d ^ o ro -Ξ- -H K m c tn o r- oo β ,—I + s +| +| -M c a> 3 g co co co

rl P+) 1 1 1 m -H H S'-'LO + LO

rt + as + o o 3 + +)---- ft Mm -. ^ + co ° ^ (0(0 rH o cm _. <u

c 2 + (- CO LO d .μ C

<D -H I (1) β P + Jj m 0+1 M +Υλ; o (D cd r-- co

rt Φ (m O β tO

.β t- C 10 xj d c: £ Ή+ +1+1 +1 P mm ^ d r £ rt(D —

rt r 3 . S *CD 3 >. "J ft > CO O CO

U Sm JT o _ Q U + ε O o o

β Jr 3 Ö 2 - cm cm CM

£ 33 +i +1 5 rt + S---- ® to ro + 1 J + 3 ö M M - Φ ^ ” to ns 5

rt, Mdtn^vOsiPpco J

d Q S ä " 5 " S s g φ 2 s s 8 d c S -S +| +| +| β <»φ3 -p + —

•H £ <00! CDm^· CO d tn O 00 CD

g, c £ CO + + .S .s S μ S S S m S

•S js <s o~ o o f ? - o m ._i id -C ίτ< * cö (m

β 3 2 +i +i +i -J .J + V -H

• * H d 3 m + CO u ::: 3 ^2~00^+2οα φ oo * M ^^^••-^dr^ ft <—1 cm co ·.,,· m >a>—'ΓΗ,-ir-t^rtr0 c coc +1+1 +1 .. 3---- (0 β :ιτ) >

• · +> + .+ 3+)7320 O VO

: " β +i_r; + .2p>,g+coco .. χ coto(03,*c/3-— ++ + ; ; ; ·η :3 -m '-ro S ·Η---- .... m CO CO LT) > ’£ > cd :.\ > — ''^asmasd > ::: ien o o o m 2 3 -+ 3

OS d +> I) +) + OS -V

+ + +l+l+l+,+ co h + + cm + V* 1 +0 2 0 2 a> 13 + + + H £d O σ CM S-| S-| + H 3 VO 3 + ^ v v (U m φ I Γ" + +1+1 +1 rj 33 On] < li I g Ϊ g H β 3 — o 0) CC O, 000000 c 3 O <D + tn cm cm cm X <D----3m(rtp-*<l>3gr- (+ + 2 +) dmro^Ai-PS—CMCM cm .·. pm tn o o o ' P m---- • rH *r| tn 2 d (, V-j d + *rl ;* β Ό ^\ωωω3β·θ rt^ \ 51 S rt Λ ,,. H X >1 tng-sc^^SEHiH^ + g as + tn

Φ o 2 (D tr M

• · + + + + +S \ ’,,.· + en - + co\tn . + Ρ3σσ σ + ωσοσ£

111 CO Prt !—I <—I 1—I (0 0-1 1 1 ^ 1—I

; i :3 Mil I :(Ö ω I I O

2 +1—Il—I I—I 2+1—I 1—I 1—I <—I

29 113537

Yksikään tutkituista yhdisteistä ei vähentänyt merkitsevästi ruumiinpainoa tai mahalaukun, sydämen, keuhkojen, kivesten, munuaisten tai maksan painoa (taulukot 5 ja 7). Sitä vastoin (kuten taulukoissa 4 ja 6 on esitetty) 5 yhdiste 1-1 annoksen ollessa 1 mg/kg vähensi merkitsevästi ventraalisten eturauhasten painoa ja rakkularauhasten painoa. Suurempi annos yhdistettä 1-1 ei tuottanut yhtään suurempaa vaikutusta. Yhdiste 1-12 annosten ollessa 1 mg/kg ja 10 mg/kg vähensivät ventraalisten eturauhasten 10 ja rakkularauhasten painoa. Dorsaalisen eturauhasen paino väheni ainoastaan, kun käsittely suoritettiin 1 mg:lla/kg yhdistettä 1-12. Yhdiste 1-19 konsentraatioiden ollessa 1 mg/kg ja 10 mg/kg vähensi merkitsevästi ventraalisen eturauhasen, dorsaalisen eturauhasen, rakkularauhasten ja 15 hyytymisrauhasten painoa. Cmp700, johdannainen, joka ei estänyt trk:n tyrosiinikinaasiaktiivisuutta, ei estänyt eturauhaskudoksen kasvua, mutta aiheutti rakkularauhasen painon vähenemisen, kun annos oli 1 mg/kg, mutta ei 10 mg/kg.

20 Ei ilmennyt merkitsevää eroa plasman testosteroni- konsentraatiossa minkään ryhmien välillä. Siten ventraa-V * listen eturauhasten, dorsaalisten eturauhasten tai rakku- ·>(>ί larauhasten painon väheneminen ei johtunut verenkierrossa : olevan testosteronin vähentyneestä määrästä.

• 25 Esimerkki 4 .*. Eturauhasen syövän estäminen käyttämällä funktio- , naalisia johdannaisia i i i

Edellä esimerkissä 3 tuotettujen menetelmien lisäksi tässä tuotettujen K-252a-johdannaisten hyödyllisyys ; 30 erityisesti eturauhassyövän hoitamiseksi voidaan määrittää ’··’ useilla eläinmalleilla. Kaksi näistä malleista sisältää 1) kokeen, joka koskee funktionaalisen johdannaisen vaikutus-ta ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjojen kasvuun immunolo- • | » gisesti vastustuskyvyttömillä hiirillä; ja 2) kokeen, joka ‘ 35 koskee funktionaalisen johdannaisen vaikutusta Dunning- ' ‘ eturauhaskasvainten kasvuun rotilla.

30 113537

Yhdisteiden tutkimiseksi immunologisesti vastus-tuskyvyttömillä hiirillä ihmisen eturauhasen solulinjaa, esim. solulinjoja Tsu-Prl, DuPro-1, PC-3 tai DU-145, jotka on kuvattu esimerkissä 2, voidaan kasvattaa standardiolo-5 suhteissa ja ruiskuttaa (1 x 106 solua/0,1 ml - 107 solua/ 1 ml) ihonalaisesti aikuisten, kateenkorvattomien, immunologisesti vastustuskyvyttömien hiirten takalonkkaan (Glea-ve, et ai., Cancer Res., 51 : 3753 - 3761, 1991). Tutkittavien yhdisteiden vaikutus kasvaimen kasvuun määritetään 10 mittaamalla kasvaimen koko ja kasvunopeus tutkittavan yhdisteen läsnä ollessa ja puuttuessa.

Rotan Dunning-eturauhaskasvaimen solulinjat ovat siirrettäviä rotan kasvaimia, joista on tullut standardi-malleja mahdollisten syöpähoitojen määrittämiseksi. Yksi 15 Dunning-kasvainten käyttömenetelmä mahdollisten syöpää vastustavien yhdisteiden vaikutusten määrittämiseksi on kuvattu yksityiskohtaisesti (Isaacs, Cancer Res., 49:6290 - 6294, 1989). Tässä tuotettujen K-252a-johdan- naisten hyödyllisyys kasvainten vähentämiseksi tässä mal-20 lissa käsittää tutkittavien yhdisteiden kasvaimen kasvunopeuteen kohdistuvan vaikutuksen mittaamisen. Tutkittavat V * yhdisteet liuotetaan ja ruiskutetaan kuten edellä on ku- t · » • · vattu.

Esimerkki 5 • 25 Trk-antagonistien tehokkuus eturauhassyövän eläin- • * · · : malleissa > i · » · ♦ · Tässä esimerkissä ei ole tutkittu sinänsä keksin- * » · nön mukaisesti valmistettuja kaavan (III) mukaisia yhdisteitä.

30 Trk-antagonistien tehokkuus eturauhasen andro- geenistä riippumattomien syöpäsolujen kasvun estämisessä in vitro osoitti, että molekyylit ovat todennäköisesti te-hokkaita androgeenistä riippumattoman eturauhassyövän in vivo -malleissa. Tutkimme yhdisteiden 1-19 ja 1-5 vaiku- *·’ * 35 tukset androgeenistä riippumattoman Dunning R-3327 AT-2- ' * eturauhassyöpäkasvaimen kasvuun rotalla in vivo. AT-2- 31 113537 kasvain on erittäin anaplastinen solulinja, joka on peräisin rotan alkuperäisestä, hitaasti kasvavasta, andro-geeniriippuvaisesta Dunning R-3327 H eturauhaskasvaimesta (Issacs et ai., Prostate 9:261 - 281, 1986). AT-2- 5 kasvainmallia on käytetty muiden mahdollisten eturauhassyöpää vastustavien aineiden karakterisoimiseksi, mukaan luettuna linomidi (Ichikawa et ai., Cancer Research 52:3022 - 3028, 1992) ja suramiini (Morton et ai., Prostate 17:327 - 336, 1990), joka on parhaillaan arvioitavana 10 kliinisissä kokeissa androgeenistä riippumattoman eturauhassyövän hoitamiseksi (Eisenberger et ai., J. Natl. Can. Inst., 85:611 - 621, 1993).

Koeprotokolla: 24 sisäsiittoiseen, urospuoliseen Kööpenhamina-rottaan istutettiin ihonalaisesti kylkeen 1 x 15 106 elävää AT-2.1-kasvainsolua. Kaikkien eläinten annet tiin kehittää kasvain, jonka koko oli suunnilleen 2,7 cm3 (suunnilleen 14 päivää) ennen kuin ne jaettiin sattumanvaraisesti kolmeen ryhmään, joissa oli kussakin 8 eläintä. Ryhmä 1 sai päivittäin ihonalaisen ruiskeen, jossa oli 20 pelkästään kantaja-ainetta (1 ml/ruumiinpaino-kg). Ryhmä 2 sai päivittäin ihonalaisen ruiskeen, jossa oli yhdistettä V · 1-19 (1 ml/kg liuosta, joka sisälsi yhdistettä 1-19 10 :it>: mg/ml) . Ryhmä 3 sai päivittäin ihonalaisen ruiskeen, jossa i’\. oli yhdistettä 1-5 (1 ml/kg liuosta, joka sisälsi yhdis- • ;’· 25 tettä 1-5 3 mg/ml) . Kaikkien eläinten kasvainten koko ar- ♦ · » · : .·. vioitiin 16 päivän jaksolta. Kasvaimen tilavuus laskettiin » · , käyttäen kaavaa (1 x w2) x 0,5.

* » ·

Tulokset: Kokeen tulokset esitetään taulukossa 8.

, Sekä yhdiste 1-19 (10 mg/kg/päivä) että yhdiste 1-5 * · ’· 30 (3 mg/kg/päivä) olivat tehokkaita estäen AT-2.1-kasvainten » '··* kasvua likimäärin 50 - 60 %:lla. Nämä tulokset osoittavat :* · näiden yhdisteiden hyödyllisyyttä eturauhasen syöpäsolujen • > kasvun estämisessä in vivo.

• · » » » • III* 32 113537

Taulukko 8

Yhdisteiden 1-19 ja 1-5 tehokkuus Dunning R-3327 ΆΤ-2.1 -eturauhaskasvaimen kasvun estämisessä aikuisilla urospuolisilla Kööpenhamina-rotilla 5______ Käsittely- Kasvaimen tilavuus (cm3) annettuna käsittelypäivänä ryhmä___ _ __ __Päivä 0 Päivä 3 Päivä 8__Päivä 13 Päivä 16

Vain kanta- 2,73+0,50 6,66+1,48 21,0+3,0 37,3+4,0 58,7+5,0 ja-aine (kontrolli)______ 1-19 2,62+0,53 5,52+1,10 11,3+1,8 22,4+2,7 28,4+5,1 10 mg/kg/ päivä________ 1-5 2,70+1,06 5,64+1,32 10,7+2,9 19,8+5,6 24,6+6,2 3 mg/kg/ päivä______

Yhdisteiden synteesi

Menetelmät yhdisteiden (III) tuottamiseksi kuvataan seuraavassa.

t > · ’·' 10 Esimerkki 6

Yhdiste 1-45 · * ’·· Yhdiste (A-2-1; kuvio 2; Rla = Br, R2 = H) (250 mg, |j j 0,46 mmol) liuotettiin 1 ml:aan dimetyyliformamidia ja I sitten saatuun liuokseen lisättiin 0,25 ml natriumhydrok- • » * · 15 sidin (23,5 mg) vesiliuosta ja sen jälkeen liuosta sekoi- »

tettiin huoneenlämpötilassa 4 tunnin ajan. Lisättiin 1 N

.suolahappoa liuoksen pH:n säätämiseksi arvoon 1-2, minkä jälkeen sakat kerättiin talteen suodattamalla, jolloin H' saatiin 223 mg (saanto 91 %) yhdistettä (B-l; Rla = Br, *·**-: 20 R2 = H) .

» * ' 1H-NMR (DMSO-dg) 6 (ppm) : 2,00(1H, dd, J=5,l, 14,0Hz), 2,22(3H, s), 5,01(2H, s), 7,10(1H, '* i dd, J-5,7, 7,0Hz), 7,26-8,08 (6H, m), 8,65(1H, s), 9,36(1H, d, J-2Hz) 33 113537

Yhdiste (B-l; Rla = Br, R2 = H) (210 mg, 0,39 mmol) liuotettiin 3 ml:aan pyridiinia ja sitten saatuun liuokseen lisättiin 0,44 ml (4,7 mmol) etikkahappoanhydridiä ja sen jälkeen seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 4 päi-5 vän ajan. Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäännökseen lisättiin 4 ml 1 N suolahappoa ja sakat kerättiin talteen suodattamalla, jolloin saatiin 223 mg (saanto 99 %) yhdistettä (C—1; Rla, R2 = H) .

1H-NMR (DMSO-dg) S (ppm) : 1,66(3H, s), 2,48(3H, s), 5,02(2H, s), 7,16-8108(7H, m), 8,69(1H, S), 9,34 (1H, d, J=2Hz) 10 Yhdiste (C-l; Rla = Br, R2 = H) (100 mg, 0,17 mmol) suspendoitiin 3 ml:aan tionyylikloridia ja sen jälkeen seosta sekoitettiin 90 °C:n lämpötilassa 4,5 tunnin ajan. Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäännökseen lisättiin dietyylieetteriä ja sakat kerättiin talteen suodattamalla, 15 jolloin saatiin 84 mg (saanto 83 %) yhdistettä (D-l; Rla = Br, R2 = H) .

Yhdiste (D-l; Rla = Br, R2 = H) (84 mg, 0,39 mmol) liuotettiin 2 ml:aan etyleenidikloridia ja sitten saatuun liuokseen lisättiin 3 ml 0,8-%:ista NH3: a/tetrahydro- ’· * 20 furaanissa jäähdyttäen jäällä ja sen jälkeen seosta sekoi- tettiin samassa lämpötilassa yhden tunnin ajan. Liuottimen • ’·. haihduttamisen jälkeen jäännös liuotettiin seokseen, jossa • » jj : oli 2 ml tetrahydrofuraania ja 0,5 ml metanolia, ja sitten ; saatuun liuokseen lisättiin 1 ml 1 N NaOHra ja sen jälkeen 25 sitä sekoitettiin huoneenlämpötilassa 3 tunnin ajan. Liu- t okseen lisättiin 1 N suolahappoa (1,2 ml) neutralointia varten ja sen jälkeen se laimennettiin tetrahydrofuraanil- ! la. Seos pestiin suolaliuoksella ja kuivattiin natriumsul- » ’;· faatilla. Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäännös saa- 1 · \ 30 tettiin silikageelipylväskromatografiaan (kloroformi/meta- ; noli = 98/2), jolloin saatiin 54 mg (saanto 72 %) yhdis tettä 1-45.

f * ! j » 34 113537 1H-NMR (DMSO-dg) S (ppm): 2,018(1H, dd, J=4;6, 13,7Hz), 2,183(3H, s), 4,985(1H, d, J=17fOHz) , 5,054(1H, d, J=17,lHz), 6,308(1H, s), 7, 057(1H, dd, J=4,9, 7,5Hz), 7,353-8,092(8H, m), 8,696(1H, s), 9,385(1H, d, J=2,1Hz) SIMS (m/z): 531 (M+l)+

Esimerkki 7 Yhdiste 1-35

Yhdiste (F; kuvio 3) (70 mg, 0,12 mmol) liuotet- 5 tiin seokseen, jossa oli 3 ml tetrahydrofuraania ja 1 ml dimetyyliformamidia, ja sitten saatuun liuokseen lisättiin 34 μΐ (0,24 mmol) trietyyliamiinia ja 19 μΐ (0,24 mmol) etyyli-isosyanaattia ja sen jälkeen seosta sekoitettiin 50 °C:n lämpötilassa 6 tunnin ajan. Seos laimennettiin 10 kloroformilla, minkä jälkeen se pestiin peräkkäin vedellä ja suolaliuoksella ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäännös saatettiin silika-geelipylväskromatografiaan (kloroformi/metanoli = 99/1), jolloin saatiin 71 mg (saanto 91 %) yhdistettä (G).

1H-NMR (CDC13) δ (ppm): 1,16(3H, t, J-7,3Hz), 1,800(3H, s), 2,150(1H, dd, J-5,1, 14,5Hz), V ; 2,282(3H, s), 2,849(3H, s), 3,273(1H, m), 3,978 (1H, dd, J—71 5, 14,5Hz), 4,011(3H, s), i'·.. 5,355(2H, brs) , 5,406(1H, d, J=17,4Hz), ; 5,449(1H, d, J=17,4Hz), 7,007(1H, dd, J=5,l, • 7 f 4Hz) , 7,427-8,098(6H, m), 9,245(1H, s) ; 15 FAB-MS (m/z): 652 (M)+

Yhdiste (G) (44 mg, 0,067 mmol) liuotettiin seok- seen, jossa oli 1 ml etyleenidikloridia ja 0,5 ml me- ! tanolia, ja sitten saatuun liuokseen lisättiin 13 μΐ 28- » ♦ %:ista natriummetoksidia/metanolissa ja sen jälkeen seosta * » ·,* · 20 sekoitettiin huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. Seok- seen lisättiin Amberlist 15:ttä neutralointia varten ja liukenemattomat aineet suodatettiin pois. Liuottimen haih- 1 t 1 duttamisen jälkeen jäännös saatettiin preparatiiviseen 35 113537 TLC: hen (kloroformi/metanoli = 95/5), jolloin saatiin 68,9 mg (saanto 24 %) yhdistettä 1-35.

1H-HMR (CDClj) S (ppm) : 1,103(311, t# J=7,2Hz), 2, 163(3H, S), 2,232(1H, dd, J=5,0, 14,3Hz), 3,184(2H, q, J«7,2Hz), 3,288(1H, dd, J=7,5, 14,3Hz), 4,023(3H, s), 4,866(1H, d, J=17,0Hz), 4,937(1H, d, J=16,9Hz), 5,230(2H, S), 6,856(1H, dd, J=5,0, 7,5Hz), 7,306-7,882(6H, ffl), 9,148(1H, s) FAB-MS (m/z):569 (M+l)+

Esimerkki 8 5 Yhdiste 1-37

Yhdiste (N; kuvio 4) (98 mg, 0,17 mmol) liuotet tiin 5 ml:aan etyleenidikloridia ja sitten saatuun liuokseen lisättiin 39 μΐ metyylikloroformaattia ja 71 μΐ tri-etyyliamiinia ja sen jälkeen seosta sekoitettiin huoneen-10 lämpötilassa 1,5 tunnin ajan. Liuokseen lisättiin me-tanolia (1 ml) ja liuotin haihdutettiin. Jäännös saatettiin preparatiiviseen TLC:hen (kloroformi/metanoli = 98/2) ja saatu raaka tuote kiteytettiin uudelleen etyyliasetaatista, jolloin saatiin 18 mg (saanto 17 %) yhdistettä (Ον"·' 15 1, R14 = CH3) .

: 1H-NHR (CDC13) δ (ppm) ί 1,783 (3H, S), 2,125(1H, dd, J=5,0, 14,6Hz) , 2,269 (3H, s), 2,810(3H, s), j .·. 3,828 (3H, S), 3,965 (1H, dd, J-7,4, 14,6Hz), \‘ym 4,007 (3H, s), 5,357 (1H, d, J=17,8Hz), 5,403 (1H, d, J=17,6Hz) , 6,963(1H, dd, J=4,9, 7,6Hz), 7,411-8,071(6H, m), 8,944(1H, d, J=2,0Hz) 1 · ; Oleellisesti sama menetelmä kuin esimerkissä 7 ’;·* toistettiin käyttäen 8 mg (0,013 mmol) edellä saatua yh- distettä (0-1; R14 = CH3) , jolloin saatiin 5 mg (saanto 20 71 %) yhdistettä 1-37.

36 113537 1H-NMR (DMSO-dg) S (ppm): 1,999(1H, dd, J«=4,6, 13,9Hz) , 2,146(3Hr s) , 3,373(1H, dd, J=7,7, 14,2HZ), 3,688 (3H, s), 3,924(3H, s), 4,959(1H, d, J=17,6Hz), 5,020(1H, d, J=17.6HZ), 6,311(1H, s), 7,081(1H, dd, J-5,0,7,OHz), 7,333-8,052(6H, m), 8,553(1H, s) FAB-MS (m/z): 541 (M+l)+

Esimerkki 9

Yhdiste 1-42

Yhdiste (A-l-1, menetelmä 1; Rla = R2a = Br) (62,5 5 mg, 0,1 mmol) liuotettiin seokseen, jossa oli 3 ml tetra-hydrofuraania ja 1 ml metanolia, ja sitten saatuun liuokseen lisättiin 19 mg (0,5 mmol) natriumboorihydridiä ja sen jälkeen seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 12 tunnin ajan. Seoksen pH säädettiin arvoon 1-2 käyttämäl-10 lä 1 N suolahappoa, minkä jälkeen seos pestiin suolaliuoksella ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäännös saatettiin preparatiiviseen TLC:hen (kloroformi/metanoli = 95/5), jolloin saatiin 37 mg (saanto 62 %) yhdistettä 1-42. v : ^H-NMR (DMSO-dg) S (ppa): 1,918(1H, dd, J=4,9, 5,1Hz), 2,140 (3H, s), 3,149(1H, dd, J+7, 3 , j··. 7,6Hz) , 3,728-3,836(2H, m), 5,009(1H, d, i J=17,8HZ), 5,070(1H, d, J=17,5HZ), 5,144(1H, t, J=5,1Hz), 5,439(1H, s), 6,994(1H, dd, f * * · J=4,9, 7,5Hz) , 7,573-8,184 (5H, m), 8,701(1H, S), 9,387(1H, d, J=2,2HZ) FAB-MS (m/z): 598 (M+l)+ ;· 15

Esimerkki 10 y Yhdiste 1-43 ; Oleellisesta sama amidointimenetelmä kuin esimer- kissa 6 toistettiin käyttäen 67 mg (0,1 mmol) yhdistettä . 20 (D-2; Rla = R2 = Br) ja 120 μΐ etanoliamiinia ja sitten > oleellisesti sama deasetylointimenetelmä kuin esimerkissä 7 toistettiin, jolloin saatiin 30 mg yhdistettä 1-43.

37 113537 1H-NMR (DMSO-dg) 5 (ppm): 2,009(1H, dd, J=4,7, 13,9HZ), 2,102(3H, s), 4,832(1H, t, J=5,5Hz), 5,004(1H, d, J=17,3Hz), 5,073(1H, d, J=17,3Hz), 6,509(1H, s), 7,055(1H, dd, J=4,7, 7,3Hz), 7,586-8,270(6H, m) , 8,695(1H, s) , 9,380(1H, d, J=2,2Hz) FAB-MS (m/z): 655 (M+l)+

Esimerkki 11 Menetelmä 1

Yhdiste (III-l) [yhdiste (III), jossa R1 ja R2 ovat 5 toisistaan riippumatta halogeeni ja X on CH2OH] voidaan valmistaa seuraavan reaktiovaiheen avulla:

H H

pelkisty^ H,C-V^i H»C^0Vf

ΗΟΠ HO I

COjCKj CHjOH

V*; (A-l) («I-D

• · • · ♦ » » • · • " 10 (Kaavassa Rla ja R2a esittävät toisistaan riippu- : matta halogeenia) .

·,; · Radikaalien Rla ja R2a määritelmässä halogeenilla : : : on sama merkitys kuin edellä on määritelty.

Lähtöyhdiste (A-l) on julkaistu japanilaisessa 15 julkaistussa tutkimattomassa patenttihakemuksessa 120 388/87, joka liitetään tähän viittauksena.

·’ Yhdiste (III-l) voidaan saada käsittelemällä yh- diste (A-l) 2-10 ekvivalentilla pelkistävää ainetta inertissä liuottimessa. Esimerkki pelkistävästä aineesta . 20 on natriumboorihydridi. Esimerkiksi inertistä liuottimesta on liuotinseos, joka koostuu eetteristä, kuten dietyyli-eetteristä tai tetrahydrofuraanista, ja alkohololista, ku- 38 113537 ten metanolista tai etanolista. Eetterin ja alkoholin välinen suhde on edullisesti 1:1 - 5:1. Reaktio saadaan päätökseen 3-24 tunnissa 0 - 50 °C:n lämpötilassa.

Menetelmä 2 5 Yhdiste (III-2) [yhdiste (III), jossa R1 on halo geeni, R2 on vety tai halogeeni ja X on CONHR15] voidaan valmistaa seuraavien reaktiovaiheiden avulla, jotka on esitetty kuviossa 2. (Kaavoissa radikaaleilla Rla, R2 ja R15 on samat merkitykset kuin edellä on määritelty).

10 Lähtöaineyhdiste (A-2) on julkaistu japanilaisessa julkaistussa tutkimattomassa patenttihakemuksessa 120 388/87 (supra).

Yhdiste (B) voidaan saada hydrolysoimalla yhdiste (A-2) käyttämällä 1 - 1,5 ekvivalenttia alkalimetallihyd-15 roksidia. Esimerkkejä alkalimetallihydroksideista ovat natriumhydroksidi ja kaliumhydroksidi. Reaktioliuottimena käytetään dimetyyliformamidia tai vastaavaa. Reaktio saadaan päätökseen 1-24 tunnissa 0 - 50 °C:n lämpötilassa.

Yhdiste (C) voidaan saada saattamalla reagoimaan 20 yhdiste (B) 3-20 ekvivalentin kanssa asetyloivaa ainet ta. Esimerkki asetyloivasta aineesta on etikkahappoanhyd- V · ridi. Reaktioliuottimena käytetään pyridiinia tai vastaa- vaa. Reaktio saadaan päätökseen 1 tunnissa - 4 päivässä : 0 - 50 °C:n lämpötilassa.

• 25 Yhdiste (D) voidaan saada saattamalla reagoimaan j .·. yhdiste (C) karboksyyliryhmän halogenoivan aineen kanssa, joka toimii myös liuottimena. Esimerkkejä halogenoivasta aineesta ovat tionyylikloridi ja oksalyylikloridi. Reaktio saadaan päätökseen 1-3 tunnissa 50 - 100 °C:n lämpöti- ;;; 30 lassa.

* * ’·** Yhdiste (E) voidaan saada saattamalla reagoimaan yhdiste (D) 5-30 ekvivalentin kanssa yhdistettä R15NH2.

• ·

Reaktioliuottimena käytetään halogenoitua hiilivetyä, kuten metyleenikloridia, kloroformia tai etyleenidikloridia, » 35 dimetyyliformamidia tai vastaavaa. Reaktio saadaan päätökseen 1-24 tunnissa 0-50 °C:n lämpötilassa.

39 113537

Yhdiste (III—2) voidaan saada deasetyloimalla yhdiste (E) käyttämällä 0,5 - 10 ekvivalenttia deasetyloivaa ainetta. Esimerkkejä deasetyloivasta aineesta ovat alkali-metallialkoksylaatti, kuten natriummetylaatti ja alkalime-5 tallihydroksidi, kuten natriumhydroksidi. Reaktioliuotti-mena käytetään liuotinseosta, joka koostuu halogenoidusta hiilivedystä, kuten metyleenikloridista, kloroformista tai etyleenidikloridista, ja alkoholista, kuten metanolista tai etanolista, liuotinseosta, joka koostuu eetteristä, 10 kuten dioksaanista tai tetrahydrofuraanista, ja alkoholista, kuten metanolista tai etanolista, tai vastaavaa. Halo-genoidun hiilivedyn ja alkoholin välinen suhde tai eetterin ja alkoholin välinen suhde on 1:5 - 1:1. Reaktio saadaan päätökseen 5 minuutin - 1 tunnin kuluessa 0 - 50 °C:n 15 lämpötilassa.

Menetelmä 3

Yhdiste (III-3) [Yhdiste (III), jossa R1 on CH2OCONHR14 ja X on CO2CH3] voidaan valmistaa seuraavien reaktiovaiheiden avulla, jotka on esitetty kuviossa 3. 20 (Kaavoissa R14 esittää alempaa alkyyliä).

LähtÖyhdiste (F) on julkaistu japanilaisessa jul-V * kaistussa tutkimattomassa patenttihakemuksessa 295 588/88 :,>t‘ (liitetään tähän viittauksena) .

Yhdiste (G) voidaan saada saattamalla reagoimaan • 25 yhdiste (F) 1-5 ekvivalentin kanssa yhdistettä R14NC0 • · » » .*. emäksen läsnä ollessa. Esimerkki emäksestä on trietyyli- • » · • · » · amiini. Reaktioliuottimena käytetään liuotinseosta, joka koostuu tetrahydrofuraanista ja dimetyyliformamidista, tai , vastaavaa. Tetrahydrofuraanin ja dimetyyliformamidin väli- ‘ t · ' 30 nen suhde on 5:1 - 1:1. Reaktio saadaan päätökseen 5-24 ·;·’ tunnissa 10 - 70 °C: n lämpötilassa.

Yhdiste (111—3) voidaan saada yhdisteestä (G) sa-maila tavalla kuin yhdisteen (111 — 2) valmistuksessa.

Menetelmä 4 35 Yhdiste (III-4) [yhdiste III, jossa R1 on NHC02R14 ja X on CO2CH3] voidaan valmistaa seuraavien reaktiovai- 40 113537 heiden avulla, jotka on esitetty kuviossa 4. (Kaavoissa R14 esittää alempaa alkyyliä).

Lähtöyhdiste (N) on julkaistu japanilaisessa julkaistussa tutkimattomassa patenttihakemuksessa 295 588/88 5 (liitetään tähän viittauksena).

Yhdiste (O) voidaan saada saattamalla reagoimaan yhdiste (N) 1-5 ekvivalentin kanssa yhdistettä CICO2R14, kun läsnä on 1 - 5 ekvivalenttia emästä. Esimerkki emäksestä on trietyyliamiini. Reaktioliuottimena käytetään ha-10 logenoitua hiilivetyä, kuten metyleenikloridia, kloroformia tai etyleenidikloridia, tai vastaavaa. Reaktio saadaan päätökseen 1-3 tunnissa 0 - 50 °C:n lämpötilassa.

Yhdiste (111 — 4) voidaan saada yhdisteestä (O) samalla tavalla kuin yhdisteen (III-2) valmistuksessa.

15 K-252a-johdannaisten valmistus

Muita yhdisteen 1-1 funktionaalisia johdannaisia voidaan valmistaa de novo kemiallisten synteesien avulla käyttäen alan ammattimiesten tuntemia menetelmiä ja noudattamalla menetelmiä, jotka kaikki on liitetty tähän 20 viittauksena. Esimerkiksi menetelmät yhdisteen I valmistamiseksi on kuvattu lähteessä Murskata et ai., US-patentti * * · * 4 923 986, joka liitetään tähän viittauksena. Menetelmät * * · yhdisteen II valmistamiseksi on kuvattu julkaisuissa Moody j et ai., J. Org. Chem. , 57:2105 - 2114 (1992); Steglich et j 25 ai., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 19:459 - 460 (1980); Na- * kanishi et ai., J. Antibiotics 39:1066 - 1071 (1986); ja JP-patenttihakemuksessa 60-295 172 (1985). Muita menetel- » · miä yhdisteen I valmistamiseksi on kuvattu JP-patentti-hakemuksissa 60-295 173 (1985), 62-327 858 (1987), 62- ;; 30 327 859 (1987) ja 60-257 652 (1985) [Meiji Seika Kaisha ·;’ Ltd. ] .

Hoito • · Tässä tuotetut yhdisteet voidaan formuloida far-maseuttisiksi koostumuksiksi sekoittamalla farmaseuttises- * > * ’ 35 ti hyväksyttävien, myrkyttömien täyteaineiden ja kantaja- aineiden kanssa. Kuten edellä on mainittu, tällaiset koos- 41 113537 tumukset voidaan valmistaa annettavaksi potilaalle paren-teraalisesti, erityisesti nestemäisten liuosten ja suspensioiden muodossa; annettavaksi potilaalle suun kautta, erityisesti tablettien tai kapseleiden muodossa; tai ne-5 nänsisäisesti, erityisesti jauheiden, nenätippojen tai aerosolien muodossa.

Koostumus voidaan antaa tarkoituksenmukaisesti yk-sikköannosmuodossa ja se voidaan valmistaa käyttämällä mitä tahansa farmaseuttisella alalla tunnetuttuja menetelmiä 10 tai esimerkiksi kuten on kuvattu lähteessä Remington's

Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980). Valmisteet annettavaksi potilaalle parenteraalisesti voivat sisältää yleisinä täyteaineina steriiliä vettä tai suolaliuosta, polyalkyleeniglykoleja, kuten polyeteenigly-15 kolia, öljyjä, jotka ovat kasviperäisiä, hydrattuja nafta-leeneja ja vastaavia. Erityisesti biologisesti yhteensopivat, biologisesti hajoavat laktidipolymeeri, lakti-di/glykolidikopolymeeri tai polyoksieteenipolyoksipropee-nikopolymeerit voivat olla käyttökelpoisia täyteaineita 20 aktiivisten yhdisteiden vapautumisen kontrolloimiseksi.

Näiden aktiivisten yhdisteiden muihin mahdollisesti käyt-ν' ’ tökelpoisiin parenteraalisiin vapauttamisjärjestelmiin si- : sältyvät eteeni-vinyyliasetaattikopolymeerihiukkaset, os- moottiset pumput, implantoitavat infuusio j ärj estelmät ja • 25 liposomit. Valmisteet, jotka on tarkoitettu annettavaksi : ,·. potilaalle sisään hengittämällä, sisältävät täyteaineita, t i · , ;·, esimerkiksi laktoosia, tai ne voivat olla vesiliuoksia, 1 » · jotka sisältävät esimerkiksi polyoksieteeni-9-lauryyli-eetteriä, glykokolaattia ja deoksikolaattia, tai ne ovat ’ 30 öljyisiä liuoksia annettavaksi nenätippojen muodossa tai geelin muodossa käytettäväksi nenänsisäisesti. Valmisteet, jotka on tarkoitettu annettavaksi potilaalle parenteraali- • » .·*·. sesti, voivat myös sisältää glykokolaattia, jolloin val- miste annetaan poskeen, metoksisalisylaattia, jolloin val-* 35 miste annetaan peräsuolen kautta, tai sitruunahappoa, jol- ' * loin valmiste annettaan emättimen kautta.

42 113537 Tässä kuvattujen yhdisteiden konsentraatiot hoidollisessa koostumuksessa vaihtelevat riippuen monista tekijöistä, mukaan luettuna annettavan lääkkeen annostus, käytettyjen yhdisteiden kemialliset tunnuspiirteet (esim.

5 hydrofobisuus) ja antotapa. Yleisesti tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet voidaan tuottaa vesipitoisessa fysiologisessa puskuriliuoksessa, joka sisältää noin 0,1 - 10 % (paino/tilavuus) yhdistettä annettavaksi paren-teraalisesti. Tyypillinen annos on välillä noin 1 10 pg/paino-kg/päivä - noin 1 g/paino-kg/päivä; edullinen annoksen vaihtelualue on noin 0,01 mg/paino-kg - 100 mg/paino-kg/päivä. Edullinen lääkkeen annostus, joka aiotaan antaa potilaalle, riippuu todennäköisesti sellaisista muuttujista kuin eturauhastaudin etenemisen tyypistä ja 15 laajuudesta, nimenomaisen potilaan yleisesti terveydentilasta, valitun yhdisteen biologisesta tehokkuudesta ja yhdisteen täyteaineiden formuloinnista ja yhdisteen antotavasta .

Muut suoritusmuodot sisältyvät seuraaviin patent-20 tivaatimuksiin.

* I ' · » »

I > I

t

Claims (4)

43 113537

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen indo-likarbatsolijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava 5 H .n o RrI H3cYY HÖH-' X j ossa R1 on halogeeni, CH2OCONHR14 tai NHC02R14; R2 on vety tai halogeeni; 10. on C02CH3, CH2OH tai CONHR15; R14 on alempi alkyyli; R15 on vety, hydroksilla substituoitu alempi alkyyli tai fenyyli tai naftyyli; ... edellyttäen, että kun R1 on halogeeni ja R2 on ve- 15 ty, X ei ole C02CH3 eikä CH2OH, edellyttäen, että kun R1 ja *;’** R2 ovat kumpikin halogeeni, X ei ole C02CH3 ja edellyttäen, : ** että kun R1 ja R2 ovat kumpikin Br, X ei ole CONHC6H5; : tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan val- ·,: | mistamiseksi, tunnettu siitä, että : 20 a) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava H : : /Nw> S R2YY#tYR' H JL /-\ A (III-i) ;T: HO·^] • co2ch3 44 113537 jossa R1 on NHC02R14 ja R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, yhdiste, jolla on kaava CCLCH, I 2 3 H,c--Yy H3CCOf^\ co2ch3 5 jossa R2 on edellä määritelty, saatetaan kosketukseen kaavan ZCO2R14 mukaisen halogeenitormiaatin kanssa, jossa Z on halogeeni, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava co2ch3 /y.° R2Y^yYQ)^YNHCOA4 ··/'·· (o) o , CO,CH, : : : 10 2 4 • 1 I jossa R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, ja dease-tyloidaan kaavan 0 mukainen yhdiste; b) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, ; 15 jolla on kaava H T (in-iii) H.C-YV : ho j co2ch3 45 113537 jossa R1 on CH2OCONHR14 ja R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, yhdiste, jolla on kaava co2ch3 IVy h3cco2-^] co2ch3 5 jossa R2 on edellä määritelty, saatetaan kosketuk seen kaavan R14NCO mukaisen isosyanaatin kanssa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava CCLCH, I 2 3 /N ° n (S) ;!? H3CC02-^n C02CH3 • 10 : jossa R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, ja dease- * » · tyloidaan kaavan S mukainen yhdiste; c) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava :* H (in-iv) ::: VvN v: E>c\_y ; HO I ^ CHLOH 15 2 46 113537 jossa R1 on halogeeni, CH2OCONHR14 tai NHC02R14 ja R2 ja R14 ovat edellä määriteltyjä, yhdiste, jolla on kaava H rV° n (Hl-i) -.-ry HO-q co2ch3 jossa R1 on NHC02R14 ja R2 ja R14 ovat edellä määri-5 teltyjä, pelkistetään; d) kaavan III mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava H /Ny,° ίi j y—(ji j (iii-v) y Ηο^η CONHR15 t t I • '·* jossa R1 on halogeeni, CH2OCONHR14 tai NHC02R14 ja : ; j 10 R2, R14 ja R15 ovat edellä määriteltyjä, kaavan C mukaisen • ;j· yhdisteen happo, jolla on kaava : H Λ (C) O hsc-v y h3coco-^[ I COOH 47 113537 aktivoidaan, jolloin saadaan aktivoitu happo, joka saatetaan kosketukseen kaavan R15NH2 mukaisen amiinin kanssa, jolloin saadaan yhdiste, jolla on kaava H fV° li JL )—\ Ji J <e) h3cco2-^|

5 CONHR15 jossa R1, R2 ja R15 ovat edellä määriteltyjä, ja deasetyloidaan kaavan E mukainen yhdiste; ja e) haluttaessa näin saatu kaavan (III) mukainen yhdiste muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolak-10 si.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (III) mukainen yhdiste, jossa X on C02CH3, R1 on CH2OCONHC2H5 ja R2 on vety. V * 15

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ίιΐ(.* tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (III) mukai- nen yhdiste, jossa X on C02CH3, R1 on NHC02CH3 ja R2 on ve- : ty· * i v *

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, • * * * 5 » 20 tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan III mukainen * - t yhdiste, jossa X on CH2OH, R1 on Br ja R2 on Br. - · * t » * 1 j · * · » I · t . I • 2 » t ft 48 113537