JP2004099560A - 薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】薬剤性腎障害の予防及び／又は治療に有用な医薬を提供する。
【解決手段】下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素原子、アリール基、アルキル基又はアルコキシカルボニルアルキル基を表し；Ｒ２は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基、アルキル基又はヒドロキシアルキル基を表し；あるいは、Ｒ１及びＲ２は、共同してアルキレン基を表し；Ｒ３は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基、フェニル基、又はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、アルキルメルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を表す。）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬。
【選択図】 なし
【解決手段】下記式（Ｉ）：
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素原子、アリール基、アルキル基又はアルコキシカルボニルアルキル基を表し；Ｒ２は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基、アルキル基又はヒドロキシアルキル基を表し；あるいは、Ｒ１及びＲ２は、共同してアルキレン基を表し；Ｒ３は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基、フェニル基、又はアルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシカルボニル基、アルキルメルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を表す。）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬、ならびに腎細胞アポトーシス阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬剤性腎障害は種々の薬剤や化学物質により惹起される重篤な副作用の一つである。これまでシスプラチンなどの抗癌剤、アミノグリシド系抗生物質などが薬剤性腎障害を引き起こすことが知られている。
シスプラチンは中心にプラチナ原子、塩素原子、及びシス位にアンモニア分子を含む白金複合体であり、あらゆる種類の腫瘍性疾患の治療に用いられている（非特許文献１参照）。シスプラチンは抗悪性腫瘍薬として有効である一方、腎障害、胃腸機能障害、耳毒性、及び末梢神経毒性などの多くの副作用がある（非特許文献２参照）。特に、腎毒性は主要な合併症であり、シスプラチン治療において用量を制限しなければならない理由となる。従って、シスプラチン治療時の腎毒性を軽減させる薬剤が望まれている。
【０００３】
一方、下記式（Ｉ）：
【化３】
（式中、Ｒ１は水素原子、アリール、炭素数１〜５のアルキル又は総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキルを表し、Ｒ２は、水素原子、アリールオキシ、アリールメルカプト、炭素数１〜５のアルキル又は１〜３のヒドロキシアルキルを表し、あるいは、Ｒ１及びＲ２は、共同して炭素数３〜５のアルキレンを表し、Ｒ３は水素原子、炭素数１〜５のアルキル、炭素数５〜７のシクロアルキル、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル、ベンジル、ナフチル又はフェニル、又は炭素数１〜５のアルコキシ、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル、炭素数１〜３のアルキルメルカプト、炭素数１〜４のアルキルアミノ、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ、ハロゲン原子、トリフルオロメチル、カルボキシル、シアノ、水酸基、ニトロ、アミノ、及びアセトアミドからなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニルを表す。）で表されるピラゾロン誘導体については、医薬の用途として、脳機能正常化作用（特許文献１参照）、過酸化脂質生成抑制作用（特許文献２参照）、抗潰瘍作用（特許文献３参照）、及び血糖上昇抑制作用（特許文献４参照）等が知られている。
【０００４】
また、上記式（Ｉ）の化合物のうち、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを有効成分とする製剤は、２００１年６月以来、脳保護剤（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ株式会社製造・販売）として上市されている。この「エダラボン」は、活性酸素に対して高い反応性を有することが報告されている（非特許文献３；非特許文献４参照）。このように、エダラボンは活性酸素をはじめとする種々のフリーラジカルを消去することで、細胞障害などを防ぐ働きをするフリーラジカルスカベンジャーである。しかしながら、これまでシスプラチン誘導腎障害などの薬剤性腎障害に対して有効であるか否かの検討については全く報告がない。
【非特許文献１】
Ｌｅｂｗｏｈｌ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ３４， １５２２−１５３４， １９９８
【非特許文献２】
Ｃｏｏｌｅｙ ＭＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｎｕｒｓ， １７， ２８３−２９３， １９９４
【特許文献１】
特公平５−３１５２３号公報
【特許文献２】
特公平５−３５１２８号公報（例１の化合物）
【特許文献３】
特開平３−２１５４２５号公報
【特許文献４】
特開平３−２１５４２６号公報
【非特許文献３】
Ｋａｗａｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２８１（２）， ９２１， １９９７
【非特許文献４】
Ｗｕ， ＴＷ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ６７（１９）， ２３８７， ２０００
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬、ならびに腎細胞アポトーシス阻害剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々の検討を行った結果、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が、シスプラチン暴露によって誘導したマウス近位尿細管細胞（ＰＴＣ）損傷を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、細胞毒性、ミトコンドリア膜電位低下、ＲＯＳ生成を抑制した。さらに、上記ピラゾロン誘導体等はマウスのシスプラチン誘導急性腎障害（ＡＲＦ）モデルを用いる ｉｎ ｖｉｖｏ試験において、腎やミトコンドリア障害、タンパク質酸化、アポトーシスを抑制し、腎保護作用を有することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
【０００７】
即ち、本発明によれば、下記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬が提供される。
【０００８】
【化４】
【０００９】
（式中、Ｒ１は、水素原子、アリール基、炭素数１〜５のアルキル基又は総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基を表し；Ｒ２は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基を表し；あるいは、Ｒ１及びＲ２は、共同して炭素数３〜５のアルキレン基を表し；Ｒ３は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基、フェニル基、又は炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を表す。）
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物である上記医薬が提供される。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、腎障害を副作用として起こす薬剤と同時に、別々に、又は経時的に使用するための上記医薬；該腎障害を副作用として起こす薬剤が白金含有製剤である上記医薬；該白金含有製剤がシスプラチン製剤である上記医薬が提供される。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む腎細胞アポトーシス保護剤が提供される。
【００１３】
本発明の別の局面によれば、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、薬剤性腎障害の予防及び／又は治療方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記医薬の製造のための式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬、ならびに腎細胞アポトーシス阻害剤（以下、これらを総称して本発明の医薬という）は、本明細書に定義する式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む。
【００１５】
本発明で用いる式（Ｉ）で示される化合物は、互変異性により、以下の式（Ｉ’）又は（Ｉ”）で示される構造をもとりうる。本明細書の式（Ｉ）には、便宜上、互変異性体のうちの１つを示したが、当業者には下記の互変異性体の存在は自明である。本発明の医薬の有効成分としては、下記の式（Ｉ’）又は（Ｉ”）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を用いてもよい。
【００１６】
【化５】
【００１７】
式（Ｉ）において、Ｒ１の定義におけるアリール基は単環性又は多環性アリール基のいずれでもよい。例えば、フェニル基、ナフチル基などのほか、メチル基、ブチル基などのアルキル基、メトキシ基、ブトキシ基などのアルコキシ基、塩素原子などのハロゲン原子、又は水酸基等の置換基で置換されたフェニル基等が挙げられる。アリール部分を有する他の置換基（アリールオキシ基など）におけるアリール部分についても同様である。
【００１８】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の定義における炭素数１〜５のアルキル基は直鎖状、分枝鎖状のいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。アルキル部分を有する他の置換基（アルコキシカルボニルアルキル基）におけるアルキル部分についても同様である。
【００１９】
Ｒ１の定義における総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基としては、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、プロポキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、メトキシカルボニルプロピル基等が挙げられる。
【００２０】
Ｒ２の定義におけるアリールオキシ基としては、ｐ−メチルフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、ｐ−クロロフェノキシ基、ｐ−ヒドロキシフェノキシ基等が挙げられ、アリールメルカプト基としては、フェニルメルカプト基、ｐ−メチルフェニルメルカプト基、ｐ−メトキシフェニルメルカプト基、ｐ−クロロフェニルメルカプト基、ｐ−ヒドロキシフェニルメルカプト基等が挙げられる。
【００２１】
Ｒ２及びＲ３の定義における炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基等が挙げられる。Ｒ３の定義における炭素数５〜７のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
【００２２】
Ｒ３の定義において、フェニル基の置換基における炭素数１〜５のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられ、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシＳカルボニル基等が挙げられ、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト基、エチルメルカプト基、プロピルメルカプト基等が挙げられ、炭素数１〜４のアルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基等が挙げられ、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基等が挙げられる。
【００２３】
本発明の医薬の有効成分として好適に用いられる化合物（Ｉ）として、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（２−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（３−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（３，４−ジメチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−プロピルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２４】
１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−プロポキシフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジクロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２５】
１−（４−ブロモフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−フルオロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−（３−メチル−５−オキソ−２−ピラゾリン−１−イル）安息香酸；
１−（４−エトキシカルボニルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ニトロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−エチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−フェニル−３−プロピル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２６】
１，３−ジフェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−フェニル−１−（ｐ−トリル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３，４−ジメチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−イソブチル−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−（２−ヒドロキシエチル）−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−４−フェノキシ−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−４−フェニルメルカプト−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２７】
３，３’，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−２−フェニル−２Ｈ−インダゾール−３−オン；
３−（エトキシカルボニルメチル）−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１，３−ジメチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−エチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−ブチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−ヒドロキエチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−シクロヘキシル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−ベンジル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２８】
１−（α−ナフチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−メチル−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２９】
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−アミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ジメチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（アセトアミドフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；及び
１−（４−シアノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
【００３０】
本発明の医薬の有効成分としては、式（Ｉ）で表される遊離形態の化合物のほか、生理学的に許容される塩を用いてもよい。生理学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、臭化水素塩、リン酸等の鉱酸との塩；メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、アスコルビン酸、クエン酸、サリチル酸、ニコチン酸、酒石酸等の有機酸との塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属との塩；アンモニア、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルタミン、Ｌ−グルタミン等のアミンとの塩が挙げられる。また、グリシンなどのアミノ酸との塩を用いてもよい。
【００３１】
本発明の医薬の有効成分としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の水和物、又は上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の溶媒和物を用いてもよい。溶媒和物を形成する有機溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、エーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどを例示することができる。また、上記式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類により１以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。本発明の医薬の有効成分としては、純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを用いてもよい。
【００３２】
式（Ｉ）で表される化合物はいずれも公知の化合物であり、特公平５−３１５２３号公報などに記載された方法により当業者が容易に合成できる。
【００３３】
本発明の医薬の投与量は特に限定されないが、通常は、有効成分である式（Ｉ）で示される化合物の重量として一般に経口投与の場合には一日あたり０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、であり、非経口投与の場合には一日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回又は２〜３回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減してもよい。
【００３４】
本発明の医薬としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物を調製して投与することが好ましい。
【００３５】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
【００３６】
経口投与に適する医薬組成物には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００３７】
注射あるいは点滴用に適する医薬組成物には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の添加物を用いることができる。
【００３８】
本発明の医薬の形態は特に限定されず、当業者に利用可能な種々の形態をとることができる。経口投与に適する医薬として、例えば、固体の製剤用添加物を用いて錠剤、散剤、顆粒剤、硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、又はトローチ剤などを調製することができ、液状の製剤用添加物を用いてシロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤などを調製することができる。また、非経口投与に適する医薬として、注射剤、点滴剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを調製することができる。なお、上記の式（Ｉ）の化合物を有効成分とする脳保護剤（点滴剤）が、すでに臨床において使用されているので（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ株式会社製造・販売）、本発明の医薬において上記市販製剤をそのまま用いることができる。
【００３９】
本発明の医薬は、薬剤性腎障害に有効である。すなわち、本発明の医薬は、薬剤性腎障害を防止する予防剤としての作用、及び／又は薬剤性腎障害を正常な状態に回復させる治療剤としての作用を有している。
【００４０】
一般に、「薬剤性腎障害」とは、薬剤の副作用によって起こる腎障害をいい、かかる腎障害を副作用として起こす薬剤としては、代表的には以下のものが挙げられる。
１）抗癌剤：白金含有製剤（シスプラチン、カルボプラチン）、マイトマイシンＣ、ニトロソウレア、メチルＣＣＮＵ、ストレプトゾシン等
２）抗生物質：アミノグリコシド系（ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン等）、β−ラクタム系（ペニシリン、セファロスポリン等）、ＳＴ（スルファメトキサゾール／トリメトプリム）合剤、テトラサイクリン系（テトラサイクリン、ミノマイシン、ビブラマイシン、アクロマイシン等）、リファンピシン、エタンブトール、アンホテリシンＢ、ポリペプチド系（ポリミキシン、コリスチン等）等
３）抗炎症・抗鎮痛剤：インドメタシン、フェノプロフェン、フェナセチン、アスピリン等
４）利尿剤：クロロサイアザイド、フロセミド、トリアムテレン等
５）抗痙攣剤：フェノバルビタール、フェニトイン、カルバマゼピン等
６）抗リウマチ薬：金製剤、Ｄ−ペニシラミン、ブリラミン等
【００４１】
本発明における「薬剤性腎障害」は、特にはシスプラチン製剤による腎障害をいうが、これに限定されるわけでなく、上記に例示した種々の薬剤による腎障害をも含むものとする。
【００４２】
本発明においては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物と、腎障害を副作用として起こす薬剤とを同時に、別々に、又は経時的に使用することが可能である。すなわち、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む医薬と、腎障害を副作用として起こす薬剤とを、それぞれの患者の年齢、病態、性別、症状等により適宜増減して決定した投与量に基づいて、一つの医薬組成物として投与することも可能であるし、それぞれ別々の医薬組成物として投与することも可能である。別々の医薬組成物として投与する場合には、それぞれ同じか、又は異なる投与形態で、同時に投与することも可能であるし、それぞれ同じか、又は異なる投与形態で同じ日に時間をずらして、あるいは患者の年齢、病態、性別、症状等により数日間、数週間、又は数ヶ月にわたり所定間隔で投与することも可能である。
【００４３】
本明細書において、「薬剤性腎障害」とは、上記の各種薬剤より直接的にまたはその代謝物により間接的に惹起された腎細胞の損傷、腎機能の低下などの病態をいう。この用語は、上記の定義に合致するかぎり最も広義に解釈されるべきであり、疾患名の異同に拘泥して解釈されるべきではない。なお、薬剤性腎障害に相当する疾患であるか否かは熟練した医師ならば容易に診断可能である。薬剤性腎障害としては、上記の薬剤によって惹起される腎障害、具体的には、急性腎不全（急性腎前性腎不全、急性腎性腎不全）、慢性腎不全などが挙げられ、特には急性腎性腎不全、具体的には急性尿細管壊死、急性間質性腎炎をいう。
【００４４】
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口的または非経口的に投与することができる。例えば、上記疾患を引き起こしうる薬剤を用いる治療に先立って、本発明の医薬を予防的に経口投与しておくことができ、あるいは上記疾患を引き起こしうる薬剤と併用して本発明の医薬を経口投与することもできる。また、上記各疾患の患者に対しては、症状の悪化の防止ないしは症状の軽減などを目的として、静脈内、動脈内に注射により投与することもできる。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
【００４６】
合成例：３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（以下、エダラボンと称す）の合成
エタノール５０ｍｌ中にアセト酢酸エチル１３．０ｇ及びフェニルヒドラジン１０．８ｇを加え、３時間還流攪拌した。反応液を放冷後、析出した結晶をろ取し、エタノールより再結晶して、表題の化合物１１．３ｇを無色結晶として得た。
収率 ６７％
融点 １２７．５〜１２８．５℃
【００４７】
実施例１（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
（１）実験方法
▲１▼細胞生存性アッセイ
マウス腎臓近位尿細管上皮ｍＰｏｘ２４細胞（ＰＴＣ）を４ｍＭグルタミン、５％仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトアビジンを添加したダルベッコの改変イーグル培地を用い、９５％室内空気−５％ＣＯ２ガス混合物の雰囲気下、１％ゼラチンを被覆したディッシュ上で３７℃にて培養した。
生細胞数はトリパンブルー排除法によって、ミトコンドリア生存性（細胞増殖・毒性）はテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）分解アッセイによって試験した。
トリパンブルー排除法では、細胞を１２ウェルプレートに撒き、続いてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）又は２０μＭシスプラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ 社製）を含む培地に２４時間エダラボン有り又は無しの状態でさらした。非接着細胞を除去し、接着細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ消化によって収集し、０．４％トリパンブルーで５分間３７℃にて染色した。トリパンブルーを排除する細胞の数を血球計数器でカウントし、ベヒクルで処理した細胞と比較した生存細胞の割合（％）で表した。
ミトコンドリア生存性はミトコンドリア脱水素酵素活性を有するテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）の分解によって測定される。ＷＳＴ−１分解アッセイでは、細胞を９６ウェルプレートに置き、２０μＭシスプラチンと２４時間インキュベートした。ＷＳＴ−１測定は製造業者のプロトコル（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ， タカラバイオメディカル社製）に従って実施した。
トリパンブルー排除法及びＷＳＴ−１分解アッセイはいずれも三重で実施し、少なくとも２度繰り返した。
【００４８】
▲２▼ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）及び活性酸素産生の測定
ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）はミトコンドリアの機能および障害の重要な指標となる。シスプラチンにより誘導されるミトコンドリア損傷を評価するために、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の変化を、電位測定用蛍光染色剤５，５’６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリル−カルボシアニンヨウ化物（ＪＣ−１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 社製）を用いた（Ｄｉ ＬＦ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｌｏｎｄ）， ４８６， １−１３， １９９５）。
細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルの変化は細胞透過性２’，７’−ジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ−ＤＡ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の蛍光ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）への酸化的転換を共焦点レーザー走査顕微鏡又は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって測定することによって調べた（Ｍａｎｃｉｎｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ， ５， ２８７−２９５， １９９８）。
【００４９】
細胞を６ウェルプレートに撒き、続いてＰＢＳ又は２０μＭシスプラチンを含む培地にエダラボン有りまたは無しの状態で６時間さらした。細胞を５μｇ／ｍｌ ＪＣ−１又は２０μＭ ＤＣＦＨ−ＤＡと共に培地内で１５分間３７℃にて暗所でインキュベートした。浮遊及び接着細胞の両方を集め、５００×ｇ、５分間遠心分離することによってペレット化した。各試料において、最小数１０，０００細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（日本ベクトンディキンソン社製）及びＣｅｌｌＱｅｓｔソフトウェア（日本ベクトンディキンソン社製）を用いるＦＡＣＳに供した。染料の細胞内分布を共焦点レーザー走査顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴ（Ｌｅｉｃａ−ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）によって評価した。各試験はいずれも三重で実施し、少なくとも２度繰り返した。
【００５０】
（２）実験結果
▲１▼細胞生存性アッセイ
生存ＰＴＣの数は２０μＭシスプラチンで２４時間処理することによって減少した。ところが、エダラボンよる処理はシスプラチン誘導性細胞毒性を顕著に用量依存的に減少させた。１００μＭエダラボンによる処理では細胞生存性を４５．０％増加させた（シスプラチン：３８．６±４．３％；シスプラチン＋１００μＭエダラボン：８３．６±５．２％；Ｐ＜０．０１；ｎ＝６）（図１Ａ）。
また、シスプラチンは顕著にミトコンドリア脱水素酵素活性を減少させた。これに対し、種々の濃度のエダラボンとのインキュベーションにより用量依存的に生存率が増加した（図１Ｂ）。１００μＭエダラボンによる処理でシスプラチンによって誘導されるミトコンドリア機能障害が顕著に回復した（シスプラチン：５５．１±９．１％；シスプラチン＋１００μＭエダラボン：８４．９±１２．６％；Ｐ＜０．０１；ｎ＝６）
【００５１】
▲２▼ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）及び活性酸素産生の測定
ミトコンドリア膜電位が高いときは、ＪＣ−１は十分に蓄積して凝集し、最大発光で大きな赤色（５９０ｎｍ）シフトが生じる。またミトコンドリア膜電位が低いときは、緑色の蛍光（５３０ｎｍ）モノマーとして存在する。図２Ａに示すように赤色のＪＣ−１蛍光がコントロール細胞で観察された。２０μＭシスプラチンにて６時間処理したシスプラシチン処理群では赤色の蛍光がコントロール群よりも弱くなる一方、緑色の蛍光が強くなった。即ち、シスプラチン暴露後、ＪＣ−１染色は低いΔΨｍを示した。しかしながら、１００μＭエダラボン処理によって、膜電位レベルがコントロール群のパターンの近くに上昇した。
ＦＡＣＳ分析よれば、コントロール細胞においては高いΨｍが維持された（図２Ｂ）。シスプラチン処理後、高いΨｍ率が減少し、低いΔΨｍ率が増加した。エダラボンとのプレインキュベーションによって、Ψｍは高いレベルに維持された。
【００５２】
ＲＯＳ生成増加がシスプラチン処理細胞で観察される一方、コントール細胞ではＲＯＳ生成増加が明白ではなかった。エダラボン処理によってシスプラチン処理近位尿細管細胞（ＰＴＣ）におけるＲＯＳ生成が減少した（図３Ａ）。ＦＡＣＳ分析ではシスプラチンがＲＯＳ生成を顕著に増加させたことを示す（１．４％対７４．５％）（図３Ｂ）。一方、ＰＴＣを１００μＭエダラボンと前インキュベーションすると、顕著にＲＯＳレベルが減少した（２２．３％）。
【００５３】
実施例２ （ｉｎ ｖｉｖｏ試験）
（１）実験方法
▲１▼試験動物
雄性ウイスターラット（３００±３０ｇ体重；チャルズリバー社製）を標準食及び水道水を自由に与えて飼育した。ラットを以下の４つの群に分けた。第１群：コントロール（生理食塩水処理）（ｎ＝７）、第２群：シスプラチン処理ラット（ｎ＝７）、第３群：シスプラチン＋エダラボン１ｍｇ／ｋｇ処理ラット（ｎ＝７）、第４群：シスプラチン＋エダラボン５ｍｇ／ｋｇ処理ラット（ｎ＝７）。エーテル麻酔下、動物に１ｍｇ／ｋｇ 生理食塩水又は５ｍｇ／ｋｇシスプラチンを腹腔内に投与した。同時に、０．１ｍｇ／ｋｇの生理食塩水、１ｍｇ／ｋｇ 又は５ｍｇ／ｋｇのエダラボンを単回静脈注射によって投与した。シスプラチン又は生理食塩水注射後４日目に各群のラットについて採尿、採血を行い、下記の血液・尿検査に供した。そして５日目にラットをペントバルビタール麻酔下で屠殺し、腎臓を切除した。腎臓標本を直ちに簡易凍結させ、未固定のクリオスタット切片（５μｍ厚さ）を調製した。別の腎臓横断面を４％中性緩衝化パラホルムアミド中に採取して下記の組織学的試験に、また腎臓の残りの部分を液体窒素中で簡易凍結させ、ＤＮＡ及びタンパク質単離のために−８０℃で保存した。
【００５４】
▲２▼腎組織学的試験（ＨＥ染色）
パラホルムアルデヒド中に採取した組織を処理し、パラフィンで覆い、セグメント化し（４μｍ厚さ）、ヘマトキシリン及びエオジンにて染色した。盲検様式で腎臓切片の半定量化分析を行った。尿細管、特にシスプラチン毒性の主要部位である近位尿細管Ｓ３部位における、腫れ、空胞形成、壊死、剥離などの変化を観察した。尿細管障害は次のように等級化した。０＝損傷なし；１＋＝損傷面積＜５０％；２＋＝損傷面積＞５０％ 髄放線内Ｓ３部位の部分的病巣を伴う；３＋＝損傷面積１００％ 髄放線内Ｓ３部位のびまん性病巣を伴う。各群の平均スコアを計算した。
【００５５】
▲３▼血液・尿検査による腎機能の評価（血中尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、尿中ＮＡＧ、クリアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の測定）
各群の動物から採取した尿、血液について血中尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、尿中Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）排泄量、クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）を測定した。
【００５６】
▲４▼組織ミトコンドリア活性の測定（チトクローム−ｃオキシダーゼ染色）
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるミトコンドリア活性を確認するために、チトクローム−ｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）染色法（Ｓｅｌｉｇｍａｎ ＡＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ３８， １−１４， １９６８）を用いた。糸球体の除外を有するＣＯＸ−陽性領域の割合をイメージアナライザー（ＭＣＩＤイメージアナライザー、富士写真フイルム社製）を用いることによって測定した。各ラットの腎皮質から１０個の連続的な視野をランダムに選択し、倍率１００で評価した。
【００５７】
▲５▼酸化タンパク質、脂質、及び核酸の分析（ウェスタンブロット分析）
腎試料を０．２５Ｍ シュクロース、５０ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、５００μＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフッ化物、０．８μＭ アプロチニン、２１μＭ ロイペプチン、３６μＭ ベスタチン、１５μＭ ペプスタチンＡ、１４μＭ（４−グアニジノ）ブタン及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む溶解緩衝液でホモジナイズした。遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）後、上清をウェスタンブロッティングに用いた。タンパク質濃度はタンパク質濃度アッセイキット（ＱｕａｎｔｉＰｒｏ ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ， Ｓｉｇｍａ社製）を用いて測定した。
酸化タンパク質ウェスタンブロット分析は既報（Ｋｅｌｌｅｒ ＲＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ， ６， ４３０−４３３， １９９３）に記述されるように、製造者のプロトコル（Ｏｎｃｏｒ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に従い、Ｏｎｃｏｒ Ｏｘｙｂｌｏｔ ｋｉｔを用いて行った。
４−ヒドロキシ−２−ノネナル（ＨＮＥ）イムノブロットは以下のようにして行った。まず、タンパク質（１０μｇ）を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて分離し、フッ化ポリビニリデン膜上に移した。膜を抗−ＨＮＥモノクローナル抗体（日本老化制御研究所、１μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベートし、続いてパーオキシダーゼ結合ヤギ−抗−マウスＩｇＧ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）を１時間インキュベートした。バンドをＥＣＬ−Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて可視化した。
【００５８】
▲６▼組織活性酸素測定によるＤＮＡ酸化損傷の評価（ＤＣＦＨ染色）
ＤＮＡ中の８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の量を競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（８−ＯＨｄＧ Ｃｈｅｃｋ； 日本老化制御研究所）（Ｔｏｙｏｋｕｎｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７６， ３６５−３７４， １９９７）を用いて測定した。腎臓からのゲノムをＤＮＡｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｏｒｉｅｎｔａｌ 社製）を用いて抽出した。ＤＮＡヌクレアーゼ及びアルカリホスファターゼにて加水分解した後、１０μｇＤＮＡをＥＬＩＳＡに用いた。
ＤＮＡのアプリン酸／アピリミジン酸（ＡＰ）部位の数をＤＮＡ損傷定量キット（Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 製）を用いて検出した。精製したＤＮＡ（１μｇ）をＡＰ部位に特異的に結合するＮ’−アミノオキシメチルカルボニル−ヒドラジノ−ｄ−ビオチンと３７℃にて１時間インキュベートした。９６ウェルプレートに室温で一晩固定化した後、プレートをパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジンと３７℃にて１時間インキュベートした。基質溶液で発色させた後、吸光度を６６０ｎｍにて測定した。
【００５９】
▲７▼アポトーシスの評価（ＴＵＮＥＬ染色）
アポトーシス核をアポトーシス検出キット（Ｉｎ ｓｉｔｕ アポトーシス検出キット；タカラバイオメディカル社製）を用いて製造業者のプロトコルに従って、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ）法にて検出した。分析を盲検様式で行った。ランダムな領域を倍率１００で観察し、尿細管皮質に存在するアポトーシス核の数をスコアした。少なくとも２０のランダムな視野内で染色された細胞の平均数をＴＵＮＥＬ−陽性細胞の数として表した。
【００６０】
▲８▼統計学的分析
全てのデータは平均値±ＳＥＭで表した。２つの群の比較のためにｔ−ｔｅｓｔを用いた。統計学的分析をＳｔａｔ Ｖｉｅｗを用いて行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差ありとした。
【００６１】
（２）実験結果
▲１▼腎組織学的試験（ＨＥ染色）
ＨＥ染色試験によれば、シスプラチン処理群の腎組織切片はコントロール群と比較すると、尿細管の壊死、変性、注出、及び赤血球細胞溢血によって特徴付けられる構造的損傷が顕著に現われた（図４）。これらの変化はＳ３セグメント全体に含まれていた。
組織学的病変の半定量的評価はシスプラチン処理ラット対コントロールにおいて顕著に高いスコアを表した（表１参照：２．７±０．２対０．１±０．１、Ｐ＜０．０５）。エダラボン処理群（５ｍｇ／ｋｇ）ではシスプラチン処理群に比べて顕著に半定量的スコアが低下した（シスプラチン±５ｍｇ／ｋｇエダラボン：１．７±０．３、Ｐ＜０．０５対シスプラチン処理群）
【００６２】
【表１】
【００６３】
▲２▼血液・尿検査による腎機能の評価（血中尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、尿中ＮＡＧ、クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の測定）
シスプラチン注射後５日目には血漿中ＢＵＮレベルが顕著に増加したが、エダラボンの投与によって顕著にＢＵＮの増加が抑制された。クレアチニン（Ｃｒ）レベルもまたエダラボン処理によって改善した。エダラボンのみ（５ｍｇ／ｋｇ）の投与はＢＵＮ及びクレアチニンの血漿レベルに関して評価すべき効果はなかった。シスプラチン注射後５日目に、Ｃｃｒにおける注目すべき顕著な減少がシスプラチン処理群対コントロール群において観察された（０．０５±０．０１ｍｌ／分／１００ｇ体重対０．９３±０．０５ｍｌ／分／１００ｇ体重、ｐ＜０．０５）。下記表２に示すように、Ｃｃｒはコントロール群に比べてエダラボン処理群において顕著に高くなかった。尿細管損傷のマーカーである尿中ＮＡＧ排出量もまた、シスプラチン処理群で増加したが、エダラボン５ｍｇ／ｋｇの投与によって顕著に減少した（１．０１±０．１５ＩＵ／日対０．４８±０．０７ＩＵ／日、Ｐ＜０．０５）。
【００６４】
【表２】
【００６５】
▲３▼組織ミトコンドリア活性の測定（チトクローム−ｃオキシダーゼ染色）
ミトコンドリア損傷はシスプラチンによって誘導される腎細胞損傷において必須の役割を果たしていると考えられている（Ｄａｖｉｓ ＣＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ， １２， ２６８３−２６９０， ２００１；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ， ３８７， ７８−８４， ２００１）。
組織化学的ＣＯＸ染色によるＣＯＸ活性分析結果を図５Ａに示す。ＣＯＸによる組織化学的染色はコントロール群の尿細管細胞では強く、はっきりとした粒状パターンを表した。シスプラチン処理群では尿細管のＣＯＸ反応性がコントロール群に比べて顕著に減少した。一方、エダラボン処理群ではコントロール群に匹敵するＣＯＸ反応性を表した。ＣＯＸ陽性領域はエダラボン処理によって顕著に増加した（図５Ｂ；シスプラチン，４４．７％；シスプラチン＋エダラボン５ｍｇ／ｋｇ，７９．６％）。
【００６６】
▲４▼酸化タンパク質、脂質、及び核酸の分析（ウェスタンブロット分析）
カルボキシル基はタンパク質酸化（Ｓｔａｄｍａｎ ＥＲ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７， １２２０−１２２４， １９９２）の標準マーカーとなる。図６Ａに示されるように、多くのカルボキシル基がシスプラチン処理ラットのサイトゾルタンパク質に存在した。エダラボン（５ｍｇ／ｋｇ）はサイトゾル抽出物中のシスプラチンによるタンパク質酸化を減少させた。また、脂質過酸化の指標であるＨＮＥ含量はシスプラチン処理によって増加したが（図６Ｂ）、その増加は５ｍｇ／ｍｌエダラボンによる処理で完全に抑制された。
【００６７】
▲５▼組織活性酸素測定によるＤＮＡ酸化損傷の評価（ＤＣＦＨ染色）
シスプラチン処理によってコントロール群に比べて８−ＯＨｄＧ及びＡＰが顕著に増加した（表３）。８−ＯＨｄＧ及びＡＰ部位の増加はエダラボン処理によって用量依存的に減少した。
【００６８】
【表３】
【００６９】
▲６▼アポトーシスの評価（ＴＵＮＥＬ染色）
図７Ａに示すように、シスプラチン処理群ではアポトーシス核の数が顕著に増加したが、エダラボン処理群ではアポトーシス核はほとんど観察されなかった。図７Ｂはシスプラチン投与後５日目のアポトーシス核の定量結果を示す。シスプラチン処理、及びシスプラチン＋エダラボン処理群ではアポトーシス核の増加はそれぞれコントロール（生理食塩水処理）群の１０倍及び２．５倍であった。
【発明の効果】
本発明の医薬は、シスプラチンなどの種々の薬剤により引き起こされる腎障害の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞生存性アッセイの結果を示す（図１Ａ：トリプンブルー排除法によって測定した細胞生存率；図１Ｂ：ＷＳＴ−１アッセイによって測定したミトコンドリア脱水素活性）。＊：Ｐ＜０．０１対シスプラチン（＋）＋エダラボン（−）。
【図２】図２Ａはミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）変化を示す。図２Ｂはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。横座標は低いΔΨｍの細胞を表す５３０ｎｍ発光を示し、縦座標は高いΔΨｍの細胞を表す５９０ｎｍ発光を示す。各パネルは計１０，０００インプット細胞からの結果を表す。
【図３】図３Ａはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける反応性酸素種（ＲＯＳ）生成を示す（倍率：×２００）。図３ＢはＤＣＦ蛍光の変化を示す。横座標はＲＯＳ生成細胞を表す５３０ｎｍ発光を示し、縦座標は細胞数を示す。
【図４】ＨＥ染色した腎細胞の光学顕微鏡写真を示す（倍率：×２０）。
【図５】図５Ａは組織化学的ＣＯＸ染色によるＣＯＸ活性分析結果を示す（倍率：×１００）。図５Ｂはイメージアナライザーによって測定したＣＯＸ陽性領域の割合を示す。＊：Ｐ＜０．０５対シスプラチン処理群。
【図６】図６Ａはカルボキシル基を含む酸化タンパク質、図６ＢはＨＮＥを含む酸化タンパク質のウェスタンブロット分析結果を示す。
【図７】図７はＴＵＮＥＬ法による免疫染色図を示す（倍率：×１００）。図７ＢはＴＵＮＥＬ陽性核の定量結果を示す。＊：Ｐ＜０．０５対シスプラチン処理群。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬、ならびに腎細胞アポトーシス阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬剤性腎障害は種々の薬剤や化学物質により惹起される重篤な副作用の一つである。これまでシスプラチンなどの抗癌剤、アミノグリシド系抗生物質などが薬剤性腎障害を引き起こすことが知られている。
シスプラチンは中心にプラチナ原子、塩素原子、及びシス位にアンモニア分子を含む白金複合体であり、あらゆる種類の腫瘍性疾患の治療に用いられている（非特許文献１参照）。シスプラチンは抗悪性腫瘍薬として有効である一方、腎障害、胃腸機能障害、耳毒性、及び末梢神経毒性などの多くの副作用がある（非特許文献２参照）。特に、腎毒性は主要な合併症であり、シスプラチン治療において用量を制限しなければならない理由となる。従って、シスプラチン治療時の腎毒性を軽減させる薬剤が望まれている。
【０００３】
一方、下記式（Ｉ）：
【化３】
【０００４】
また、上記式（Ｉ）の化合物のうち、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを有効成分とする製剤は、２００１年６月以来、脳保護剤（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ株式会社製造・販売）として上市されている。この「エダラボン」は、活性酸素に対して高い反応性を有することが報告されている（非特許文献３；非特許文献４参照）。このように、エダラボンは活性酸素をはじめとする種々のフリーラジカルを消去することで、細胞障害などを防ぐ働きをするフリーラジカルスカベンジャーである。しかしながら、これまでシスプラチン誘導腎障害などの薬剤性腎障害に対して有効であるか否かの検討については全く報告がない。
【非特許文献１】
Ｌｅｂｗｏｈｌ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ３４， １５２２−１５３４， １９９８
【非特許文献２】
Ｃｏｏｌｅｙ ＭＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｎｕｒｓ， １７， ２８３−２９３， １９９４
【特許文献１】
特公平５−３１５２３号公報
【特許文献２】
特公平５−３５１２８号公報（例１の化合物）
【特許文献３】
特開平３−２１５４２５号公報
【特許文献４】
特開平３−２１５４２６号公報
【非特許文献３】
Ｋａｗａｉ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， ２８１（２）， ９２１， １９９７
【非特許文献４】
Ｗｕ， ＴＷ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ， ６７（１９）， ２３８７， ２０００
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬、ならびに腎細胞アポトーシス阻害剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々の検討を行った結果、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物が、シスプラチン暴露によって誘導したマウス近位尿細管細胞（ＰＴＣ）損傷を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、細胞毒性、ミトコンドリア膜電位低下、ＲＯＳ生成を抑制した。さらに、上記ピラゾロン誘導体等はマウスのシスプラチン誘導急性腎障害（ＡＲＦ）モデルを用いる ｉｎ ｖｉｖｏ試験において、腎やミトコンドリア障害、タンパク質酸化、アポトーシスを抑制し、腎保護作用を有することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
【０００７】
即ち、本発明によれば、下記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬が提供される。
【０００８】
【化４】
（式中、Ｒ１は、水素原子、アリール基、炭素数１〜５のアルキル基又は総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基を表し；Ｒ２は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基を表し；あるいは、Ｒ１及びＲ２は、共同して炭素数３〜５のアルキレン基を表し；Ｒ３は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基、フェニル基、又は炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を表す。）
【００１０】
本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物である上記医薬が提供される。
【００１１】
本発明の好ましい態様によれば、腎障害を副作用として起こす薬剤と同時に、別々に、又は経時的に使用するための上記医薬；該腎障害を副作用として起こす薬剤が白金含有製剤である上記医薬；該白金含有製剤がシスプラチン製剤である上記医薬が提供される。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む腎細胞アポトーシス保護剤が提供される。
【００１３】
本発明の別の局面によれば、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、薬剤性腎障害の予防及び／又は治療方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記医薬の製造のための式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物の使用が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬、ならびに腎細胞アポトーシス阻害剤（以下、これらを総称して本発明の医薬という）は、本明細書に定義する式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を含む。
【００１５】
本発明で用いる式（Ｉ）で示される化合物は、互変異性により、以下の式（Ｉ’）又は（Ｉ”）で示される構造をもとりうる。本明細書の式（Ｉ）には、便宜上、互変異性体のうちの１つを示したが、当業者には下記の互変異性体の存在は自明である。本発明の医薬の有効成分としては、下記の式（Ｉ’）又は（Ｉ”）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を用いてもよい。
【００１６】
【化５】
式（Ｉ）において、Ｒ１の定義におけるアリール基は単環性又は多環性アリール基のいずれでもよい。例えば、フェニル基、ナフチル基などのほか、メチル基、ブチル基などのアルキル基、メトキシ基、ブトキシ基などのアルコキシ基、塩素原子などのハロゲン原子、又は水酸基等の置換基で置換されたフェニル基等が挙げられる。アリール部分を有する他の置換基（アリールオキシ基など）におけるアリール部分についても同様である。
【００１８】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の定義における炭素数１〜５のアルキル基は直鎖状、分枝鎖状のいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。アルキル部分を有する他の置換基（アルコキシカルボニルアルキル基）におけるアルキル部分についても同様である。
【００１９】
Ｒ１の定義における総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基としては、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、プロポキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、メトキシカルボニルプロピル基等が挙げられる。
【００２０】
Ｒ２の定義におけるアリールオキシ基としては、ｐ−メチルフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、ｐ−クロロフェノキシ基、ｐ−ヒドロキシフェノキシ基等が挙げられ、アリールメルカプト基としては、フェニルメルカプト基、ｐ−メチルフェニルメルカプト基、ｐ−メトキシフェニルメルカプト基、ｐ−クロロフェニルメルカプト基、ｐ−ヒドロキシフェニルメルカプト基等が挙げられる。
【００２１】
Ｒ２及びＲ３の定義における炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基等が挙げられる。Ｒ３の定義における炭素数５〜７のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
【００２２】
Ｒ３の定義において、フェニル基の置換基における炭素数１〜５のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられ、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシＳカルボニル基等が挙げられ、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト基、エチルメルカプト基、プロピルメルカプト基等が挙げられ、炭素数１〜４のアルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基等が挙げられ、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基等が挙げられる。
【００２３】
本発明の医薬の有効成分として好適に用いられる化合物（Ｉ）として、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（２−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（３−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（３，４−ジメチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−プロピルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２４】
１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−プロポキシフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジクロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２５】
１−（４−ブロモフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−フルオロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−（３−メチル−５−オキソ−２−ピラゾリン−１−イル）安息香酸；
１−（４−エトキシカルボニルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ニトロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−エチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−フェニル−３−プロピル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２６】
１，３−ジフェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−フェニル−１−（ｐ−トリル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３，４−ジメチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−イソブチル−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
４−（２−ヒドロキシエチル）−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−４−フェノキシ−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−４−フェニルメルカプト−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２７】
３，３’，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−２−フェニル−２Ｈ−インダゾール−３−オン；
３−（エトキシカルボニルメチル）−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１，３−ジメチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−エチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−ブチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−ヒドロキエチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−シクロヘキシル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−ベンジル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２８】
１−（α−ナフチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−メチル−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（２−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
【００２９】
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（３，４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−アミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−メチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−エチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ブチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（４−ジメチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；
１−（アセトアミドフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン；及び
１−（４−シアノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
【００３０】
本発明の医薬の有効成分としては、式（Ｉ）で表される遊離形態の化合物のほか、生理学的に許容される塩を用いてもよい。生理学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、臭化水素塩、リン酸等の鉱酸との塩；メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、アスコルビン酸、クエン酸、サリチル酸、ニコチン酸、酒石酸等の有機酸との塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属との塩；アンモニア、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルタミン、Ｌ−グルタミン等のアミンとの塩が挙げられる。また、グリシンなどのアミノ酸との塩を用いてもよい。
【００３１】
本発明の医薬の有効成分としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の水和物、又は上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の溶媒和物を用いてもよい。溶媒和物を形成する有機溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、エーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどを例示することができる。また、上記式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類により１以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。本発明の医薬の有効成分としては、純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを用いてもよい。
【００３２】
式（Ｉ）で表される化合物はいずれも公知の化合物であり、特公平５−３１５２３号公報などに記載された方法により当業者が容易に合成できる。
【００３３】
本発明の医薬の投与量は特に限定されないが、通常は、有効成分である式（Ｉ）で示される化合物の重量として一般に経口投与の場合には一日あたり０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは一日あたり０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、であり、非経口投与の場合には一日あたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回又は２〜３回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減してもよい。
【００３４】
本発明の医薬としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物を調製して投与することが好ましい。
【００３５】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
【００３６】
経口投与に適する医薬組成物には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００３７】
注射あるいは点滴用に適する医薬組成物には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の添加物を用いることができる。
【００３８】
本発明の医薬の形態は特に限定されず、当業者に利用可能な種々の形態をとることができる。経口投与に適する医薬として、例えば、固体の製剤用添加物を用いて錠剤、散剤、顆粒剤、硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、又はトローチ剤などを調製することができ、液状の製剤用添加物を用いてシロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤などを調製することができる。また、非経口投与に適する医薬として、注射剤、点滴剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを調製することができる。なお、上記の式（Ｉ）の化合物を有効成分とする脳保護剤（点滴剤）が、すでに臨床において使用されているので（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ株式会社製造・販売）、本発明の医薬において上記市販製剤をそのまま用いることができる。
【００３９】
本発明の医薬は、薬剤性腎障害に有効である。すなわち、本発明の医薬は、薬剤性腎障害を防止する予防剤としての作用、及び／又は薬剤性腎障害を正常な状態に回復させる治療剤としての作用を有している。
【００４０】
一般に、「薬剤性腎障害」とは、薬剤の副作用によって起こる腎障害をいい、かかる腎障害を副作用として起こす薬剤としては、代表的には以下のものが挙げられる。
１）抗癌剤：白金含有製剤（シスプラチン、カルボプラチン）、マイトマイシンＣ、ニトロソウレア、メチルＣＣＮＵ、ストレプトゾシン等
２）抗生物質：アミノグリコシド系（ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン等）、β−ラクタム系（ペニシリン、セファロスポリン等）、ＳＴ（スルファメトキサゾール／トリメトプリム）合剤、テトラサイクリン系（テトラサイクリン、ミノマイシン、ビブラマイシン、アクロマイシン等）、リファンピシン、エタンブトール、アンホテリシンＢ、ポリペプチド系（ポリミキシン、コリスチン等）等
３）抗炎症・抗鎮痛剤：インドメタシン、フェノプロフェン、フェナセチン、アスピリン等
４）利尿剤：クロロサイアザイド、フロセミド、トリアムテレン等
５）抗痙攣剤：フェノバルビタール、フェニトイン、カルバマゼピン等
６）抗リウマチ薬：金製剤、Ｄ−ペニシラミン、ブリラミン等
【００４１】
本発明における「薬剤性腎障害」は、特にはシスプラチン製剤による腎障害をいうが、これに限定されるわけでなく、上記に例示した種々の薬剤による腎障害をも含むものとする。
【００４２】
本発明においては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物と、腎障害を副作用として起こす薬剤とを同時に、別々に、又は経時的に使用することが可能である。すなわち、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む医薬と、腎障害を副作用として起こす薬剤とを、それぞれの患者の年齢、病態、性別、症状等により適宜増減して決定した投与量に基づいて、一つの医薬組成物として投与することも可能であるし、それぞれ別々の医薬組成物として投与することも可能である。別々の医薬組成物として投与する場合には、それぞれ同じか、又は異なる投与形態で、同時に投与することも可能であるし、それぞれ同じか、又は異なる投与形態で同じ日に時間をずらして、あるいは患者の年齢、病態、性別、症状等により数日間、数週間、又は数ヶ月にわたり所定間隔で投与することも可能である。
【００４３】
本明細書において、「薬剤性腎障害」とは、上記の各種薬剤より直接的にまたはその代謝物により間接的に惹起された腎細胞の損傷、腎機能の低下などの病態をいう。この用語は、上記の定義に合致するかぎり最も広義に解釈されるべきであり、疾患名の異同に拘泥して解釈されるべきではない。なお、薬剤性腎障害に相当する疾患であるか否かは熟練した医師ならば容易に診断可能である。薬剤性腎障害としては、上記の薬剤によって惹起される腎障害、具体的には、急性腎不全（急性腎前性腎不全、急性腎性腎不全）、慢性腎不全などが挙げられ、特には急性腎性腎不全、具体的には急性尿細管壊死、急性間質性腎炎をいう。
【００４４】
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口的または非経口的に投与することができる。例えば、上記疾患を引き起こしうる薬剤を用いる治療に先立って、本発明の医薬を予防的に経口投与しておくことができ、あるいは上記疾患を引き起こしうる薬剤と併用して本発明の医薬を経口投与することもできる。また、上記各疾患の患者に対しては、症状の悪化の防止ないしは症状の軽減などを目的として、静脈内、動脈内に注射により投与することもできる。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
【００４６】
合成例：３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（以下、エダラボンと称す）の合成
エタノール５０ｍｌ中にアセト酢酸エチル１３．０ｇ及びフェニルヒドラジン１０．８ｇを加え、３時間還流攪拌した。反応液を放冷後、析出した結晶をろ取し、エタノールより再結晶して、表題の化合物１１．３ｇを無色結晶として得た。
収率 ６７％
融点 １２７．５〜１２８．５℃
【００４７】
実施例１（ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験）
（１）実験方法
▲１▼細胞生存性アッセイ
マウス腎臓近位尿細管上皮ｍＰｏｘ２４細胞（ＰＴＣ）を４ｍＭグルタミン、５％仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトアビジンを添加したダルベッコの改変イーグル培地を用い、９５％室内空気−５％ＣＯ２ガス混合物の雰囲気下、１％ゼラチンを被覆したディッシュ上で３７℃にて培養した。
生細胞数はトリパンブルー排除法によって、ミトコンドリア生存性（細胞増殖・毒性）はテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）分解アッセイによって試験した。
トリパンブルー排除法では、細胞を１２ウェルプレートに撒き、続いてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）又は２０μＭシスプラチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ 社製）を含む培地に２４時間エダラボン有り又は無しの状態でさらした。非接着細胞を除去し、接着細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ消化によって収集し、０．４％トリパンブルーで５分間３７℃にて染色した。トリパンブルーを排除する細胞の数を血球計数器でカウントし、ベヒクルで処理した細胞と比較した生存細胞の割合（％）で表した。
ミトコンドリア生存性はミトコンドリア脱水素酵素活性を有するテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）の分解によって測定される。ＷＳＴ−１分解アッセイでは、細胞を９６ウェルプレートに置き、２０μＭシスプラチンと２４時間インキュベートした。ＷＳＴ−１測定は製造業者のプロトコル（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ， タカラバイオメディカル社製）に従って実施した。
トリパンブルー排除法及びＷＳＴ−１分解アッセイはいずれも三重で実施し、少なくとも２度繰り返した。
【００４８】
▲２▼ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）及び活性酸素産生の測定
ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）はミトコンドリアの機能および障害の重要な指標となる。シスプラチンにより誘導されるミトコンドリア損傷を評価するために、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の変化を、電位測定用蛍光染色剤５，５’６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンズイミダゾリル−カルボシアニンヨウ化物（ＪＣ−１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 社製）を用いた（Ｄｉ ＬＦ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｌｏｎｄ）， ４８６， １−１３， １９９５）。
細胞内反応性酸素種（ＲＯＳ）レベルの変化は細胞透過性２’，７’−ジクロロフルオレセイン二酢酸塩（ＤＣＦＨ−ＤＡ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の蛍光ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）への酸化的転換を共焦点レーザー走査顕微鏡又は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって測定することによって調べた（Ｍａｎｃｉｎｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ， ５， ２８７−２９５， １９９８）。
【００４９】
細胞を６ウェルプレートに撒き、続いてＰＢＳ又は２０μＭシスプラチンを含む培地にエダラボン有りまたは無しの状態で６時間さらした。細胞を５μｇ／ｍｌ ＪＣ−１又は２０μＭ ＤＣＦＨ−ＤＡと共に培地内で１５分間３７℃にて暗所でインキュベートした。浮遊及び接着細胞の両方を集め、５００×ｇ、５分間遠心分離することによってペレット化した。各試料において、最小数１０，０００細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（日本ベクトンディキンソン社製）及びＣｅｌｌＱｅｓｔソフトウェア（日本ベクトンディキンソン社製）を用いるＦＡＣＳに供した。染料の細胞内分布を共焦点レーザー走査顕微鏡ＴＣＳ−ＮＴ（Ｌｅｉｃａ−ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ 社製）によって評価した。各試験はいずれも三重で実施し、少なくとも２度繰り返した。
【００５０】
（２）実験結果
▲１▼細胞生存性アッセイ
生存ＰＴＣの数は２０μＭシスプラチンで２４時間処理することによって減少した。ところが、エダラボンよる処理はシスプラチン誘導性細胞毒性を顕著に用量依存的に減少させた。１００μＭエダラボンによる処理では細胞生存性を４５．０％増加させた（シスプラチン：３８．６±４．３％；シスプラチン＋１００μＭエダラボン：８３．６±５．２％；Ｐ＜０．０１；ｎ＝６）（図１Ａ）。
また、シスプラチンは顕著にミトコンドリア脱水素酵素活性を減少させた。これに対し、種々の濃度のエダラボンとのインキュベーションにより用量依存的に生存率が増加した（図１Ｂ）。１００μＭエダラボンによる処理でシスプラチンによって誘導されるミトコンドリア機能障害が顕著に回復した（シスプラチン：５５．１±９．１％；シスプラチン＋１００μＭエダラボン：８４．９±１２．６％；Ｐ＜０．０１；ｎ＝６）
【００５１】
▲２▼ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）及び活性酸素産生の測定
ミトコンドリア膜電位が高いときは、ＪＣ−１は十分に蓄積して凝集し、最大発光で大きな赤色（５９０ｎｍ）シフトが生じる。またミトコンドリア膜電位が低いときは、緑色の蛍光（５３０ｎｍ）モノマーとして存在する。図２Ａに示すように赤色のＪＣ−１蛍光がコントロール細胞で観察された。２０μＭシスプラチンにて６時間処理したシスプラシチン処理群では赤色の蛍光がコントロール群よりも弱くなる一方、緑色の蛍光が強くなった。即ち、シスプラチン暴露後、ＪＣ−１染色は低いΔΨｍを示した。しかしながら、１００μＭエダラボン処理によって、膜電位レベルがコントロール群のパターンの近くに上昇した。
ＦＡＣＳ分析よれば、コントロール細胞においては高いΨｍが維持された（図２Ｂ）。シスプラチン処理後、高いΨｍ率が減少し、低いΔΨｍ率が増加した。エダラボンとのプレインキュベーションによって、Ψｍは高いレベルに維持された。
【００５２】
ＲＯＳ生成増加がシスプラチン処理細胞で観察される一方、コントール細胞ではＲＯＳ生成増加が明白ではなかった。エダラボン処理によってシスプラチン処理近位尿細管細胞（ＰＴＣ）におけるＲＯＳ生成が減少した（図３Ａ）。ＦＡＣＳ分析ではシスプラチンがＲＯＳ生成を顕著に増加させたことを示す（１．４％対７４．５％）（図３Ｂ）。一方、ＰＴＣを１００μＭエダラボンと前インキュベーションすると、顕著にＲＯＳレベルが減少した（２２．３％）。
【００５３】
実施例２ （ｉｎ ｖｉｖｏ試験）
（１）実験方法
▲１▼試験動物
雄性ウイスターラット（３００±３０ｇ体重；チャルズリバー社製）を標準食及び水道水を自由に与えて飼育した。ラットを以下の４つの群に分けた。第１群：コントロール（生理食塩水処理）（ｎ＝７）、第２群：シスプラチン処理ラット（ｎ＝７）、第３群：シスプラチン＋エダラボン１ｍｇ／ｋｇ処理ラット（ｎ＝７）、第４群：シスプラチン＋エダラボン５ｍｇ／ｋｇ処理ラット（ｎ＝７）。エーテル麻酔下、動物に１ｍｇ／ｋｇ 生理食塩水又は５ｍｇ／ｋｇシスプラチンを腹腔内に投与した。同時に、０．１ｍｇ／ｋｇの生理食塩水、１ｍｇ／ｋｇ 又は５ｍｇ／ｋｇのエダラボンを単回静脈注射によって投与した。シスプラチン又は生理食塩水注射後４日目に各群のラットについて採尿、採血を行い、下記の血液・尿検査に供した。そして５日目にラットをペントバルビタール麻酔下で屠殺し、腎臓を切除した。腎臓標本を直ちに簡易凍結させ、未固定のクリオスタット切片（５μｍ厚さ）を調製した。別の腎臓横断面を４％中性緩衝化パラホルムアミド中に採取して下記の組織学的試験に、また腎臓の残りの部分を液体窒素中で簡易凍結させ、ＤＮＡ及びタンパク質単離のために−８０℃で保存した。
【００５４】
▲２▼腎組織学的試験（ＨＥ染色）
パラホルムアルデヒド中に採取した組織を処理し、パラフィンで覆い、セグメント化し（４μｍ厚さ）、ヘマトキシリン及びエオジンにて染色した。盲検様式で腎臓切片の半定量化分析を行った。尿細管、特にシスプラチン毒性の主要部位である近位尿細管Ｓ３部位における、腫れ、空胞形成、壊死、剥離などの変化を観察した。尿細管障害は次のように等級化した。０＝損傷なし；１＋＝損傷面積＜５０％；２＋＝損傷面積＞５０％ 髄放線内Ｓ３部位の部分的病巣を伴う；３＋＝損傷面積１００％ 髄放線内Ｓ３部位のびまん性病巣を伴う。各群の平均スコアを計算した。
【００５５】
▲３▼血液・尿検査による腎機能の評価（血中尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、尿中ＮＡＧ、クリアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の測定）
各群の動物から採取した尿、血液について血中尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、尿中Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）排泄量、クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）を測定した。
【００５６】
▲４▼組織ミトコンドリア活性の測定（チトクローム−ｃオキシダーゼ染色）
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるミトコンドリア活性を確認するために、チトクローム−ｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）染色法（Ｓｅｌｉｇｍａｎ ＡＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ３８， １−１４， １９６８）を用いた。糸球体の除外を有するＣＯＸ−陽性領域の割合をイメージアナライザー（ＭＣＩＤイメージアナライザー、富士写真フイルム社製）を用いることによって測定した。各ラットの腎皮質から１０個の連続的な視野をランダムに選択し、倍率１００で評価した。
【００５７】
▲５▼酸化タンパク質、脂質、及び核酸の分析（ウェスタンブロット分析）
腎試料を０．２５Ｍ シュクロース、５０ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、５００μＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフッ化物、０．８μＭ アプロチニン、２１μＭ ロイペプチン、３６μＭ ベスタチン、１５μＭ ペプスタチンＡ、１４μＭ（４−グアニジノ）ブタン及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む溶解緩衝液でホモジナイズした。遠心分離（８０００×ｇ、１０分、４℃）後、上清をウェスタンブロッティングに用いた。タンパク質濃度はタンパク質濃度アッセイキット（ＱｕａｎｔｉＰｒｏ ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ， Ｓｉｇｍａ社製）を用いて測定した。
酸化タンパク質ウェスタンブロット分析は既報（Ｋｅｌｌｅｒ ＲＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ， ６， ４３０−４３３， １９９３）に記述されるように、製造者のプロトコル（Ｏｎｃｏｒ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に従い、Ｏｎｃｏｒ Ｏｘｙｂｌｏｔ ｋｉｔを用いて行った。
４−ヒドロキシ−２−ノネナル（ＨＮＥ）イムノブロットは以下のようにして行った。まず、タンパク質（１０μｇ）を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて分離し、フッ化ポリビニリデン膜上に移した。膜を抗−ＨＮＥモノクローナル抗体（日本老化制御研究所、１μｇ／ｍｌ）と１時間インキュベートし、続いてパーオキシダーゼ結合ヤギ−抗−マウスＩｇＧ抗体（０．１μｇ／ｍｌ）を１時間インキュベートした。バンドをＥＣＬ−Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて可視化した。
【００５８】
▲６▼組織活性酸素測定によるＤＮＡ酸化損傷の評価（ＤＣＦＨ染色）
ＤＮＡ中の８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の量を競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（８−ＯＨｄＧ Ｃｈｅｃｋ； 日本老化制御研究所）（Ｔｏｙｏｋｕｎｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７６， ３６５−３７４， １９９７）を用いて測定した。腎臓からのゲノムをＤＮＡｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｏｒｉｅｎｔａｌ 社製）を用いて抽出した。ＤＮＡヌクレアーゼ及びアルカリホスファターゼにて加水分解した後、１０μｇＤＮＡをＥＬＩＳＡに用いた。
ＤＮＡのアプリン酸／アピリミジン酸（ＡＰ）部位の数をＤＮＡ損傷定量キット（Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 製）を用いて検出した。精製したＤＮＡ（１μｇ）をＡＰ部位に特異的に結合するＮ’−アミノオキシメチルカルボニル−ヒドラジノ−ｄ−ビオチンと３７℃にて１時間インキュベートした。９６ウェルプレートに室温で一晩固定化した後、プレートをパーオキシダーゼ結合ストレプトアビジンと３７℃にて１時間インキュベートした。基質溶液で発色させた後、吸光度を６６０ｎｍにて測定した。
【００５９】
▲７▼アポトーシスの評価（ＴＵＮＥＬ染色）
アポトーシス核をアポトーシス検出キット（Ｉｎ ｓｉｔｕ アポトーシス検出キット；タカラバイオメディカル社製）を用いて製造業者のプロトコルに従って、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ）法にて検出した。分析を盲検様式で行った。ランダムな領域を倍率１００で観察し、尿細管皮質に存在するアポトーシス核の数をスコアした。少なくとも２０のランダムな視野内で染色された細胞の平均数をＴＵＮＥＬ−陽性細胞の数として表した。
【００６０】
▲８▼統計学的分析
全てのデータは平均値±ＳＥＭで表した。２つの群の比較のためにｔ−ｔｅｓｔを用いた。統計学的分析をＳｔａｔ Ｖｉｅｗを用いて行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差ありとした。
【００６１】
（２）実験結果
▲１▼腎組織学的試験（ＨＥ染色）
ＨＥ染色試験によれば、シスプラチン処理群の腎組織切片はコントロール群と比較すると、尿細管の壊死、変性、注出、及び赤血球細胞溢血によって特徴付けられる構造的損傷が顕著に現われた（図４）。これらの変化はＳ３セグメント全体に含まれていた。
組織学的病変の半定量的評価はシスプラチン処理ラット対コントロールにおいて顕著に高いスコアを表した（表１参照：２．７±０．２対０．１±０．１、Ｐ＜０．０５）。エダラボン処理群（５ｍｇ／ｋｇ）ではシスプラチン処理群に比べて顕著に半定量的スコアが低下した（シスプラチン±５ｍｇ／ｋｇエダラボン：１．７±０．３、Ｐ＜０．０５対シスプラチン処理群）
【００６２】
【表１】
▲２▼血液・尿検査による腎機能の評価（血中尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、尿中ＮＡＧ、クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の測定）
シスプラチン注射後５日目には血漿中ＢＵＮレベルが顕著に増加したが、エダラボンの投与によって顕著にＢＵＮの増加が抑制された。クレアチニン（Ｃｒ）レベルもまたエダラボン処理によって改善した。エダラボンのみ（５ｍｇ／ｋｇ）の投与はＢＵＮ及びクレアチニンの血漿レベルに関して評価すべき効果はなかった。シスプラチン注射後５日目に、Ｃｃｒにおける注目すべき顕著な減少がシスプラチン処理群対コントロール群において観察された（０．０５±０．０１ｍｌ／分／１００ｇ体重対０．９３±０．０５ｍｌ／分／１００ｇ体重、ｐ＜０．０５）。下記表２に示すように、Ｃｃｒはコントロール群に比べてエダラボン処理群において顕著に高くなかった。尿細管損傷のマーカーである尿中ＮＡＧ排出量もまた、シスプラチン処理群で増加したが、エダラボン５ｍｇ／ｋｇの投与によって顕著に減少した（１．０１±０．１５ＩＵ／日対０．４８±０．０７ＩＵ／日、Ｐ＜０．０５）。
【００６４】
【表２】
▲３▼組織ミトコンドリア活性の測定（チトクローム−ｃオキシダーゼ染色）
ミトコンドリア損傷はシスプラチンによって誘導される腎細胞損傷において必須の役割を果たしていると考えられている（Ｄａｖｉｓ ＣＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ， １２， ２６８３−２６９０， ２００１；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ， ３８７， ７８−８４， ２００１）。
組織化学的ＣＯＸ染色によるＣＯＸ活性分析結果を図５Ａに示す。ＣＯＸによる組織化学的染色はコントロール群の尿細管細胞では強く、はっきりとした粒状パターンを表した。シスプラチン処理群では尿細管のＣＯＸ反応性がコントロール群に比べて顕著に減少した。一方、エダラボン処理群ではコントロール群に匹敵するＣＯＸ反応性を表した。ＣＯＸ陽性領域はエダラボン処理によって顕著に増加した（図５Ｂ；シスプラチン，４４．７％；シスプラチン＋エダラボン５ｍｇ／ｋｇ，７９．６％）。
【００６６】
▲４▼酸化タンパク質、脂質、及び核酸の分析（ウェスタンブロット分析）
カルボキシル基はタンパク質酸化（Ｓｔａｄｍａｎ ＥＲ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７， １２２０−１２２４， １９９２）の標準マーカーとなる。図６Ａに示されるように、多くのカルボキシル基がシスプラチン処理ラットのサイトゾルタンパク質に存在した。エダラボン（５ｍｇ／ｋｇ）はサイトゾル抽出物中のシスプラチンによるタンパク質酸化を減少させた。また、脂質過酸化の指標であるＨＮＥ含量はシスプラチン処理によって増加したが（図６Ｂ）、その増加は５ｍｇ／ｍｌエダラボンによる処理で完全に抑制された。
【００６７】
▲５▼組織活性酸素測定によるＤＮＡ酸化損傷の評価（ＤＣＦＨ染色）
シスプラチン処理によってコントロール群に比べて８−ＯＨｄＧ及びＡＰが顕著に増加した（表３）。８−ＯＨｄＧ及びＡＰ部位の増加はエダラボン処理によって用量依存的に減少した。
【００６８】
【表３】
▲６▼アポトーシスの評価（ＴＵＮＥＬ染色）
図７Ａに示すように、シスプラチン処理群ではアポトーシス核の数が顕著に増加したが、エダラボン処理群ではアポトーシス核はほとんど観察されなかった。図７Ｂはシスプラチン投与後５日目のアポトーシス核の定量結果を示す。シスプラチン処理、及びシスプラチン＋エダラボン処理群ではアポトーシス核の増加はそれぞれコントロール（生理食塩水処理）群の１０倍及び２．５倍であった。
【発明の効果】
本発明の医薬は、シスプラチンなどの種々の薬剤により引き起こされる腎障害の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞生存性アッセイの結果を示す（図１Ａ：トリプンブルー排除法によって測定した細胞生存率；図１Ｂ：ＷＳＴ−１アッセイによって測定したミトコンドリア脱水素活性）。＊：Ｐ＜０．０１対シスプラチン（＋）＋エダラボン（−）。
【図２】図２Ａはミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）変化を示す。図２Ｂはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。横座標は低いΔΨｍの細胞を表す５３０ｎｍ発光を示し、縦座標は高いΔΨｍの細胞を表す５９０ｎｍ発光を示す。各パネルは計１０，０００インプット細胞からの結果を表す。
【図３】図３Ａはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける反応性酸素種（ＲＯＳ）生成を示す（倍率：×２００）。図３ＢはＤＣＦ蛍光の変化を示す。横座標はＲＯＳ生成細胞を表す５３０ｎｍ発光を示し、縦座標は細胞数を示す。
【図４】ＨＥ染色した腎細胞の光学顕微鏡写真を示す（倍率：×２０）。
【図５】図５Ａは組織化学的ＣＯＸ染色によるＣＯＸ活性分析結果を示す（倍率：×１００）。図５Ｂはイメージアナライザーによって測定したＣＯＸ陽性領域の割合を示す。＊：Ｐ＜０．０５対シスプラチン処理群。
【図６】図６Ａはカルボキシル基を含む酸化タンパク質、図６ＢはＨＮＥを含む酸化タンパク質のウェスタンブロット分析結果を示す。
【図７】図７はＴＵＮＥＬ法による免疫染色図を示す（倍率：×１００）。図７ＢはＴＵＮＥＬ陽性核の定量結果を示す。＊：Ｐ＜０．０５対シスプラチン処理群。
Claims (7)
- 下記式（Ｉ）：
で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む薬剤性腎障害の予防及び／又は治療のための医薬。 - 式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンである請求項１に記載の医薬。
- 腎障害を副作用として起こす薬剤と同時に、別々に、又は経時的に使用するための請求項１又は２に記載の医薬。
- 前記薬剤が白金含有製剤である請求項３に記載の医薬。
- 前記白金含有製剤がシスプラチン製剤である請求項４に記載の医薬。
- 下記式（Ｉ）：
で示されるピラゾロン誘導体若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む腎細胞アポトーシス阻害剤。 - 式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体が３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンである請求項６に記載の腎細胞アポトーシス阻害剤。
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