ES2766351T3 - Composición farmacéutica para inhibir la apoptosis de neurona o la neurodegeneración - Google Patents

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Abstract

Composición farmacéutica para usar en un método de neuroprotección, que comprende; un compuesto de fórmula I, una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero, un solvato o un hidrato del mismo, o cualquier combinación de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable:**Fórmula** donde R es un grupo arialquilo C7-C15 sustituido o no sustituido; Y es O; R1 es H o un grupo alquilo C1-C3; R2 es H o un halógeno; A es N, O o S; B es C o N; Z es -OC(=O)NR3R4; cada uno de R3 y R4 es H o un alquilo C1-C5; m es un número entero en el rango de 0 a 4; y n es un número entero en el rango de 0 a 5.

Description

ES 2 766 351 T3
DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica para inhibir la apoptosis de neurona o la neurodegeneración
Campo técnico
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente coreana n.010-2010-0041436, presentada el 3 de mayo de 2010 en la oficina de propiedad intelectual coreana. La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para inhibir la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración.
Estado de la técnica
[0002] La apoptosis de neuronas se puede inducir en funciones fisiológicas normales tal como el desarrollo neural o en procesos patológicos tales como las enfermedades. Durante el proceso de desarrollo de las neuronas, el exceso de neuronas se elimina a través de la apoptosis para una conexión óptima precisa entre la presinapsis y la postsinapsis (Neuron, 40: 401-413 (2003); Neuron, 20: 633-647 (1998)). Un amplio rango de apoptosis de neuronas se observa en enfermedades neurodegenerativas tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, un accidente cerebrovascular y lesiones externas. La causa directa de estas enfermedades no se ha encontrado aún, sin embargo, esta está asociada a la apoptosis y la apoptosis se ve afectada por varios factores tales como el estrés oxidativo, la desregulación de la homeostasis del calcio, la disfunción de las mitocondrias, un aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno, la excitotoxicidad, la activación de caspasas y la privación trófica (Nature Reviews Molecular Cell Biology, 1: 120-130 (2000), Neurotoxicology and Teratology, 24: 675­ 682 (2002)).
[0003] En el caso de la enfermedad de Parkinson, se ha informado de que la disfunción de las mitocondrias aumenta la secreción de calcio y la generación de especies reactivas de oxígeno, induciendo así el estrés oxidativo para disminuir la actividad de los sistemas antioxidantes. Además, hay un informe acerca de la asociación entre la excitotoxicidad por glutamato y la enfermedad de Parkinson (Neurotoxicology and Teratology, 24: 675-682 (2002)).
[0004] En el caso de la enfermedad de Alzheimer, se ha informado de que la apoptosis de las neuronas está asociada al estrés oxidativo, la desregulación de la homeostasis iónica, la privación de factores de crecimiento, la acumulación de amiloide Ap, el deterioro metabólico, la disfunción de las mitocondrias, el daño del ADN y la agregación de proteínas (Nat. Rev. Neurosci., 7: 278-294 (2006); Cerebellum, 2: 270-278 (2003)).
[0005] La WO 2008/076356 divulga que la 4-[[3-[3-cloro-4-(1-isopropoxi)fenil]-1,2,4-oxadiazol-5-il]metil]-morfolina, el 3-(3-cloro-4-isopropoxi-fenil)-5-(3-tiofen-2-il-propil)-[1,2,4]oxadiazol, la 3-[3-(3-cloro-4-isopropoxi-fenil)-[1,2,4]oxadiazol-5-ilmetil]-piridina, la 4-{2-[3-(3-cloro-4-isopropoxi-fenil)-[1,2,4]oxadiazol-5-il]-etil}-piridina y determinadas estructuras relacionadas pueden ser útiles para tratar la esclerosis múltiple, la corea de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, un accidente cerebrovascular, la insuficiencia cardíaca, la depresión, la demencia, la esquizofrenia, el complejo demencia-SIDA y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.
[0006] La WO 03/078394 divulga que la 3,3-bis(4-hidroxi-3,5-dimetilfenil)-1-[[3-(4-metoxifenil)-[1,2,4]oxadiazol-5-il] metil]-1,3-dihidroindol-2-ona y determinadas estructuras relacionadas pueden ser útiles para tratar un accidente cerebrovascular y una lesión de la médula espinal, y trastornos asociados a la función cognitiva deteriorada.
[0007] Velikorodovav et al. ("Synthesis and cardiovascular activity of some azaheterocycles with carbamate groups", PHARMACEUTICAL CHEMISTRY JOURNAL, vol.40, n° 4, 1 de abril de 2006 (01-04-2006), páginas 182-185) divulgan que 3-(4-metoxifenil), 5-(N-fenilcarbamato) 5-isoxazolmetanol tiene propiedades antiisquémicas (isquemia miocárdica).
[0008] La DE 102005030051 divulga que la 3-[(3,4-difluorofenil)metil]-8-[[3-(4-metoxifenil)-1,2,4-oxadiazol-5-il]metil]-1-oxa-3,8-diazaespiro[4,5]decan-2-ona y determinadas estructuras relacionadas pueden ser útiles en la preparación de medicamentos para tratar y/o prevenir el dolor, trastornos de la absorción de alimentos; trastornos debidos al agua; migraña; hemicrania paroxística crónica; depresión; incontinencia urinaria; tos; asma; glaucoma; tinnitus; inflamaciones; enfermedades neurodegenerativas; disfunción cognitiva; síndrome de déficit de atención; epilepsia; depresión, isquemia cerebral y esquizofrenia.
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[0009] La WO 2007/017261 divulga que la 8-cloro-1-[4-[3-[4-(metiloxi)fenil]-1,2,4-oxadiazol-5-il]butil]-3,9-dihidro-3-pentil-1H-purina-2,6-diona, la 8-cloro-1-(4-{3-[4(dimetilamino)fenil]1,2,4-oxadiazol-5-il}butil)-3-pentil-3,7-dihidro-1H-purina-2,6-diona y determinadas estructuras relacionadas pueden ser útiles para tratar un accidente cerebrovascular, la esclerosis múltiple y afecciones inflamatorias tras daños hipóxicos o isquémicos (con o sin reperfusión), por ejemplo, en el cerebro o en la cardiopatía isquémica.
[0010] La DE 10 2005 049385 divulga que el ácido 6-amino-a-[1-[[3-(4-metoxifenil)-1,2,4-oxadiazol-5-il]metil]-1H-imidazol-4-il]-3-piridinpropanoico y sales del mismo pueden ser útiles para tratar un accidente cerebrovascular.
[0011] La EP 2 269 990 A1 divulga que la N,N-dimetil-4-(5-{[3-(trifluorometil)-4,5,6,7-tetrahidro-1H-indazol-1-il]metil}-1,2,4-oxadiazol-3-il)anilina y estructuras relacionadas pueden ser útiles para prevenir o tratar la depresión, la esquizofrenia o el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH).
[0012] La WO 2010/039947 divulga que la 1-[[3-(4-isobutoxifenil)-1,2,4-oxadiazol-5-il]metil]-3,3-difenilpiperidin-2-ona y estructuras relacionadas pueden ser útiles para tratar trastornos del sistema nervioso central.
[0013] La WO 2010/098600 divulga que determinados oxadiazoles tienen actividad inhibidora de monoamina-oxidasa B (MAO-B) y, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
[0014] Actualmente, se proponen varios tipos de agentes neuroprotectores usados para proteger las neuronas de la apoptosis inducida por varios mecanismos (Neurotoxicology and Teratology, 24: 675-682 (2002)). Los ejemplos de los agentes neuroprotectores incluyen antioxidantes, quelantes iónicos, eliminadores de radicales libres, factores neurotróficos, antagonistas de aminoácidos excitadores, suplementos bioenergéticos, inmunodepresivos y formulaciones que previenen la agregación o la acumulación de proteínas. Sin embargo, las medicinas que inhiben eficazmente la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración no están disponibles comercialmente aún y, por lo tanto, hay todavía una necesidad de desarrollar una composición farmacéutica para inhibir la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración.
Descripción de la invención
Problema técnico
[0015] La presente invención proporciona una composición farmacéutica para usos tal y como se define en las reivindicaciones. Se expondrán aspectos adicionales en la descripción que sigue y, en parte, serán evidentes a partir de la descripción o se pueden aprender mediante la práctica de las formas de realización presentadas.
Solución al problema
[0016] La presente invención se describirá ahora en detalle con referencia a los dibujos anexos.
[0017] La presente invención proporciona una composición farmacéutica para usar en un método de neuroprotección que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de azol sustituido representado por la fórmula 1 a continuación, sales farmacéuticamente aceptables del mismo, isómeros del derivado de azol sustituido, solvatos del derivado de azol sustituido y combinaciones de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0018] La presente invención proporciona también una composición farmacéutica para usar en un método de neurorrestauración que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de azol sustituido representado por la fórmula 1 a continuación, sales farmacéuticamente aceptables del mismo, isómeros del derivado de azol sustituido, solvatos del derivado de azol sustituido y combinaciones de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0019] La presente invención proporciona también una composición farmacéutica para usar en un método de prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, donde la enfermedad no es la enfermedad de Parkinson, donde la composición incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de azol sustituido representado por la fórmula 1 a continuación, sales farmacéuticamente aceptables del
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mismo, isómeros del derivado de azol sustituido, solvatos del derivado de azol sustituido y combinaciones de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable.
[0020] La presente invención proporciona también una composición farmacéutica para usar en un método de prevención o tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en un accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pick, la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, el complejo Parkinson-ELA-demencia, la enfermedad de Wilson, la esclerosis múltiple, la parálisis supranuclear progresiva, los trastornos bipolares relacionados con el dolor neuropático, la degeneración corticobasal, la esquizofrenia, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), la demencia, la esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad de la retina, la epilepsia, la apoplejía, los ataques isquémicos transitorios, la isquemia miocárdica, la isquemia muscular, la isquemia causada por técnicas quirúrgicas relacionadas con la suspensión prolongada del flujo sanguíneo al cerebro, una lesión cefálica, una lesión de la médula espinal, la hipoxia y la depresión, donde la composición incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de azol sustituido representado por la fórmula 1 a continuación, sales farmacéuticamente aceptables del mismo, isómeros del derivado de azol sustituido, solvatos del derivado de azol sustituido y combinaciones de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable:
Fórmula I
Figure imgf000004_0001
donde R se selecciona del grupo que consiste en un grupo arilalquilo C1-C15 sustituido o no sustituido, un grupo heteroarilalquilo C1-C10 sustituido o no sustituido y un grupo alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, lineal, ramificado o cíclico;
Y es O;
R1 es H o un grupo alquilo C1-C3 ;
R2 es H o un halógeno;
A es N u O;
B es C o N;
Z es -OC(=O)NR3R4 ;
cada uno de R3 y R4 es H o un alquilo C1-C5;
m es un número entero en el rango de 0 a 4; y
n es un número entero en el rango de 0 a 5.
[0021] La composición farmacéutica puede incluir una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un derivado de azol sustituido representado por la fórmula I, sales farmacéuticamente aceptables del mismo, isómeros del derivado de azol sustituido, solvatos del derivado de azol sustituido y combinaciones de los mismos.
[0022] El término "tratamiento" usado en la presente debería interpretarse para incluir, en animales que nunca han sido diagnosticados con enfermedades, trastornos o afecciones causados por apoptosis de neuronas o neurodegeneración, pero tienen un alto riesgo de desarrollar tales enfermedades, trastornos o afecciones, la prevención del desarrollo de las enfermedades, trastornos o afecciones, la inhibición de las enfermedades, trastornos o afecciones, es decir, la inhibición del desarrollo de las enfermedades, trastornos o afecciones y el alivio de las enfermedades, trastornos o afecciones, es decir, la causalidad de la degeneración de las enfermedades, trastornos o afecciones. Por lo tanto, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" usado en la presente se refiere a una cantidad suficiente usada en la consecución de los efectos farmacológicos anteriormente descritos.
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[0023] El derivado de azol sustituido de fórmula I puede prepararse usando compuestos conocidos o compuestos que pueden prepararse fácilmente a partir de los mismos por aquellas personas expertas en la materia con respecto al campo de la síntesis de compuestos en la materia a la que pertenece la presente invención. Por lo tanto, un método de preparación del derivado de azol sustituido de fórmula I, que se describirá después, es una forma de realización ejemplar solo para usos ilustrativos y el orden de las operaciones unitarias puede cambiarse selectivamente, si es necesario, no destinada a limitar el alcance de la invención.
Figure imgf000005_0001
R puede ser un grupo bencilo, y R2, Z, B, m y n son los mismos que se han definido anteriormente. Un método general de síntesis de azol se puede realizar de manera que se prepara oxima (II) a partir de aldehido (I) como material de partida, el compuesto de oxima preparado se somete a cicloadición [3+2] con alquinos o nitrilos en presencia de NaOCl para obtener un compuesto de azol (III o IV), y los grupos funcionales deseados se introducen entonces en el compuesto de azol para obtener un compuesto final (V).
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Figure imgf000006_0001
R puede ser un grupo bencilo, y R2, Z, B y m son los mismos que se han definido anteriormente. Un método general de síntesis de tiazol se puede realizar de manera que se prepara oxatiazolona (Vil) a partir de amida (VI) como material de partida, el compuesto preparado se somete a cicloadición [3+2] con alquinos o nitritos en presencia de NaOCl para obtener un compuesto de tiazol (VIII), y el compuesto de tiazol se reduce (IX) y los grupos funcionales deseados se introducen en el mismo para obtener un compuesto final (X).
Figure imgf000006_0002
R, R2, Z, A, m y B son los mismos que se han definido anteriormente. Un método general de síntesis de un compuesto final (XIII) se puede realizar de manera que se prepara un derivado de hidroxifenilo (XII) mediante la reacción de debencilación de un compuesto (XI) como material de partida, y los grupos funcionales deseados se introducen en el mismo para obtener el compuesto final (XIII).
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Figure imgf000007_0001
R, Ri, R2, Z, A, m y B son los mismos que se han definido anteriormente. Un método general de síntesis de un compuesto final (XVI) se puede realizar de manera que un derivado de aminofenilo (XV) se sintetiza por reducción de un derivado de nitrofenilo (XIV) como material de partida, y el compuesto sintetizado se somete luego a una aminación reductora con el aldehido deseado para obtener el compuesto final (XVI).
[0024] El derivado de azol incluye, además del derivado de azol de fórmula I, sales farmacéuticamente aceptables del mismo, es decir, sales adicionales de ácido o base e isómeros estereoquímicos del mismo, y las sales pueden ser cualquier sal que mantenga la actividad de un compuesto original en los sujetos administrados con el mismo sin efectos indeseables. Tales sales pueden ser sales inorgánicas u orgánicas. Los ejemplos de las sales incluyen ácido acético, ácido nítrico, ácido aspártico, ácido sulfónico, ácido sulfúrico, ácido maleico, ácido glutámico, ácido fórmico, ácido succínico, ácido fosfórico, ácido ftálico, ácido tánico, ácido tartárico, ácido bromhídrico, ácido propiónico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido esteárico, esilato, ácido láctico, ácido bicarbónico, ácido bisulfúrico, ácido bitartárico, ácido oxálico, ácido butírico, edetato de calcio, ácido cansílico, ácido carbónico, ácido clorobenzoico, ácido cítrico, ácido edético, ácido toluenosulfónico, ácido edisílico, ácido esílico, ácido fumárico, ácido glucéptico, pamoato, ácido glucónico, ácido glicolilarsanílico, ácido metilnítrico, ácido poligalactrónico, ácido hexilresorcinoico, ácido malónico, ácido hidrabámico, ácido clorhídrico, ácido yodhídrico, ácido hidroxinaftoico, ácido isetiónico, ácido lactobiónico, ácido mandélico, ácido estólico, ácido múcico, ácido napsílico, ácido mucónico, ácido pnitrometanosulfónico, ácido hexámico, ácido pantoténico, ácido monohidrogenofosfórico, ácido dihidrogenofosfórico, ácido salicílico, ácido sulfámico, ácido sulfanílico, ácido metanosulfónico y ácido teóclico. Además, la forma de sal básica puede incluir, por ejemplo, sal de amonio, sales de metales alcalinos y sales de metales alcalinotérreos tales como sales de litio, sodio, potasio, magnesio y calcio, sales de bases orgánicas tales como sales de benzatina, N-metil-D-glucamina e hidrabamina, y sales con aminoácidos tales como la arginina y la lisina. Mientras tanto, la forma de sales se puede convertir en formas libres por tratamiento con bases o ácidos adecuados. El término "sal adicional" usado en la presente significa sales que incluyen solvatos que pueden formar el derivado de azol sustituido de fórmula 1 o sales del mismo. Los solvatos pueden ser hidratos o alcoholatos.
[0025] Como se utiliza en la presente, el término "isómeros estereoquímicos del derivado de azol sustituido de fórmula I" se refiere a todas las posibles formas que puede tener el derivado de azol sustituido de fórmula I. A menos que se especifique o se mencione lo contrario, los nombres químicos del derivado de azol sustituido de fórmula I indica mezclas de todos los posibles isómeros estereoquímicos, incluidos todos los diastereómeros y enantiómeros de estructuras moleculares básicas. Particularmente, cada centro quiral puede tener o configuración R o S, y los sustituyentes en radicales (parcialmente) saturados cíclicos bivalentes pueden tener una configuración cis o trans. Los compuestos que
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tienen enlaces dobles pueden tener una estereoquímica E o Z. Todos los isómeros estereoquímicos del derivado de azol sustituido de fórmula I se destinan a estar incluidos dentro del alcance de la presente invención.
[0026] Según la definición de la fórmula I anterior, los ejemplos de los derivados de azol sustituidos pueden incluir éster 3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-fenil)-[1,2,4]oxadiazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-fenil)-isotiazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-fenil)-[1,2,4]tiadiazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-2-cloro-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-3-cloro-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-3-bromofenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-3-fluoro-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-(4-benciloxi-3,5-dimetil-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(1-fenil-etoxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(4-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2,6-difluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2,3-difluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3,5-difluorobenciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3,4-difluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2,4,6-trifluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3-cloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2-cloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(4-cloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2,6-dicloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2,5-dicloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2-cloro-5-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3-nitro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster metílico de ácido 4-[4-(5-carbamoiloximetil-isoxazol-3-il)-fenoximetil]-benzoico, éster 3-[4-(4-metil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(2-metil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3-metoxi-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, éster 3-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico, éster 3-[4-(4-isopropil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico y éster 3-[4-(4-tert-butil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico. Se describen métodos de preparación de estos derivados de azol en la solicitud de patente coreana n.02009-15856 presentada por los inventores de la presente solicitud.
[0027] Según una forma de realización de la presente invención, el derivado de azol sustituido de fórmula I puede ser éster 3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico (CBI) representado por la fórmula II a continuación:
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[0028] Mientras tanto, la composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable.
[0029] El portador farmacéuticamente aceptable en la composición farmacéutica, que se usa comúnmente en formulación, puede incluir lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato cálcico, alginatos, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceite mineral, pero no está limitada a los mismos. La composición farmacéutica puede incluir además un lubricante, un agente humectante, un edulcorante, un intensificador del sabor, un agente emulsionante, un agente de suspensión y un conservante. Se describen soportes farmacéuticamente aceptables y formulaciones adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences (19a ed., 1995).
[0030] La composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención se puede administrar por vía oral o por vía parenteral. La administración parenteral puede incluir una inyección intravenosa, una inyección subcutánea, una inyección muscular, una inyección intraperitoneal, una administración endotelial, una administración local, una administración intranasal, una administración intrapulmonar y una administración rectal. Para la administración oral, se puede recubrir una medicina activa formada por la composición farmacéutica o se puede formular
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la composición farmacéutica para evitar la digestión. Además, la composición farmacéutica se puede administrar mediante un dispositivo capaz de transferir un material activo a una célula diana.
[0031] Una dosis adecuada de la composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención puede depender de muchos factores, tales como los métodos de formulación, los métodos de administración, las edades de los pacientes, el peso corporal, el género, las afecciones patológicas, las dietas, el tiempo de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción y la sensibilidad de reacción, y una dosis de la composición farmacéutica que es eficaz para el tratamiento o la prevención deseados puede ser determinada fácilmente y prescrita por los médicos expertos en la materia.
[0032] La composición farmacéutica se puede formular utilizando un portador farmacéuticamente aceptable y/o un aditivo por un método bien conocido en la técnica para ser preparada en una forma de dosis unitaria o para estar contenida en un envase multidosis. A este respecto, la formulación puede ser una solución en aceite o un medio acuoso, una suspensión, una solución emulsionante, un extracto, polvo, gránulos, una pastilla o una cápsula, y puede incluir además un agente de dispersión o estabilizante. Además, la composición farmacéutica se puede administrar como un fármaco individual o junto con otros fármacos, y se puede administrar consecutiva o simultáneamente con fármacos preexistentes.
[0033] La composición farmacéutica se usa para inhibir la muerte de neurona o la neurodegeneración.
[0034] El término "neurona" usado en la presente se refiere a una célula animal consistente en un cuerpo celular, una de las protuberancias que se proyectan del cuerpo celular, es decir, un axón o neurita, y varias dendritas, y los ejemplos de la neurona pueden incluir neuronas sensoriales, motoneuronas e interneuronas. Además, la neurona puede incluir neuronas que constituyen un sistema nervioso central, un cerebro, tronco cerebral, médula espinal y regiones sinápticas del sistema nervioso central y sistemas nerviosos periféricos, células neurosustentaculares, glía y células de Schwann.
[0035] El término "muerte de neurona" usado en la presente se interpreta para incluir la muerte de neuronas por apoptosis. Además, el término "neurodegeneración" usado en la presente significa una degeneración gradual de la estructura o función de las neuronas, incluida la muerte de neuronas.
[0036] El hecho de que la apoptosis de una neurona o la neurodegeneración causan varias enfermedades cerebrales tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson es bien conocido en la técnica, y se ha realizado investigación sobre el mecanismo de apoptosis de neuronas para la prevención o el tratamiento de estas enfermedades. Nature Reviews Molecular Cell Biology 1: 120-130 (2000) y Journal of Cellular and Molecular Medicine 12: 2263-2280 (2008) divulgan que la apoptosis de neuronas es la causa de varias enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la isquemia, un accidente cerebrovascular y la esclerosis, y, a través de la investigación sobre el mecanismo de la apoptosis de neuronas que causa estrés oxidativo y disfunción de las mitocondrias, se descubrió un método de prevención o tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas. Así, se entiende claramente por aquellas personas expertas en la materia en el campo médico que una composición farmacéutica que incluye un compuesto con un efecto de inhibición de la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración se puede usar para la prevención o el tratamiento de las enfermedades anteriormente descritas.
[0037] La composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención se puede usar para la neuroprotección.
[0038] El término "neuroprotección" usado en la presente significa mecanismos en el sistema nervioso que protegen neuronas de la apoptosis o la degeneración y, en particular, significa efectos de reducción, inhibición o alivio de lesiones nerviosas, y significa también efectos de protección, recuperación o regeneración de neuronas en el tejido nervioso dañado por lesiones nerviosas. Además, el término "neuroprotección" es una terminología estándar que es utilizada generalmente por aquellas personas expertas en la materia a la que pertenece la presente invención (Neuro Report, 9: 3955-3959 (1998); Chen, J-F., J. Neurosci., 21: RC143 (2001)). El término "protección de una célula neuronal" usado en la presente significa mecanismos de reducción o mejora de un daño nervioso o mecanismos de protección o recuperación de neuronas dañadas por daño nervioso. Además, el término "daño nervioso" usado en la presente significa lesiones de neuronas o tejido nervioso causadas por varios factores (por ejemplo, factor metabólico, factor tóxico, factor neurotóxico y factor químico). Los ejemplos del daño nervioso pueden incluir el estrés oxidativo, la desregulación de la homeostasis del calcio, la disfunción de las mitocondrias, la excitotoxicidad, la activación de caspasas y la privación trófica (Nature Reviews Molecular Cell Biology 1: 120-130 (2000), Neurotoxicology and
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Teratology 24: 675-682 (2002)). La composición farmacéutica tiene un efecto de inhibición de la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración por estos varios daños nerviosos o un efecto de protección de las neuronas de los daños nerviosos. Por ejemplo, entre los daños nerviosos anteriormente descritos, el estrés oxidativo es una enfermedad relacionada con la apoptosis o la degeneración de neuronas y puede causar varias enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, las enfermedades desmielinizantes, la polineuropatía diabética, el síndrome de Down, la neuropatía del VIH, la enfermedad de Huntington, la atrofia multisistémica, la enfermedad de Parkinson, un accidente cerebrovascular y una lesión por isquemia-reperfusión, una taupatía y daño cerebral traumático. Mientras tanto, un aumento de la actividad de una enzima antioxidante contra especies reactivas de oxígeno se conoce también por ser uno de los mecanismos de neuroprotección (Free radical Biology & Medicine, 33(2): 182-191 (2002)). Por lo tanto, la composición farmacéutica inhibe el estrés oxidativo induciendo una reducción en las especies reactivas de oxígeno, evitando así la apoptosis de una neurona y, por lo tanto, se puede usar para la prevención o el tratamiento de las varias enfermedades anteriormente descritas.
[0039] Por consiguiente, la composición farmacéutica se puede usar como agentes terapéuticos neuroprotectores, que son medicinas o productos químicos destinados a evitar que el cerebro o la médula espinal sean dañados por isquemia, ataque, convulsión o lesiones traumáticas.
[0040] La composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención se puede usar para la neurorrestauración.
[0041] El término "neurorrestauración" usado en la presente se refiere a la restauración del sistema nervioso dañado acelerando la formación de nueva conexión sináptica de neuronas. La neurorrestauración puede significar la restauración de la disfunción causada por neuronas dañadas. Por ejemplo, la neurorrestauración puede significar la formación y el crecimiento de neuritas de una célula nerviosa, que son para la comunicación con las células ambientales, o el aumento del número de espinas.
[0042] El hecho de que varias enfermedades del sistema nervioso se pueden evitar o tratar mediante la neurorrestauración es bien conocido en la técnica. Neurotoxicity Research, 2: 71-84 (2000) divulga una posibilidad de prevención o tratamiento de enfermedades particulares tales como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Alzheimer, mediante medicinas usadas en la neurorrestauración, y la WO 07/022182 divulga que enfermedades tales como la enfermedad de Huntington y similares se pueden tratar mediante neurorrestauración del sistema nervioso central.
[0043] Como se ha descrito anteriormente, la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración está causada por los varios daños nerviosos y está relacionada con las varias enfermedades neurodegenerativas y, por lo tanto, la composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención puede tener un efecto de prevención o tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas mediante la inhibición de los varios daños nerviosos.
[0044] La composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención se puede usar para la prevención o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o enfermedades relacionadas con la isquemia o la reperfusión.
[0045] Los ejemplos de las enfermedades neurodegenerativas, que se pueden tratar mediante la composición farmacéutica, pueden incluir demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica, pero no se limitan a las mismas. Además, los ejemplos de las enfermedades relacionadas con la isquemia o la reperfusión, que se pueden tratar mediante la composición farmacéutica, pueden incluir un accidente cerebrovascular isquémico, ataques isquémicos transitorios, una isquemia miocárdica, una isquemia muscular y una isquemia causada por técnicas quirúrgicas relacionadas con una suspensión prolongada del flujo sanguíneo al cerebro, pero no se limitan a las mismas.
[0046] La composición farmacéutica según una forma de realización de la presente invención se puede usar para la prevención o el tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en un accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pick, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, el complejo Parkinson-ELA-demencia, la enfermedad de Wilson, la esclerosis múltiple, la parálisis supranuclear progresiva, los trastornos bipolares relacionados con el dolor neuropático, la degeneración corticobasal, la esquizofrenia, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), la demencia, la esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad de la retina, la epilepsia, la apoplejía, los ataques isquémicos transitorios, la isquemia miocárdica, la isquemia muscular, la isquemia causada por técnicas quirúrgicas relacionadas
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con una suspensión prolongada del flujo sanguíneo al cerebro, una lesión cefálica, una lesión de la médula espinal, la hipoxia y la depresión.
[0047] Según una forma de realización de la presente invención, un método de tratamiento de enfermedades relacionadas con la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración incluye poner en contacto a un sujeto con la composición farmacéutica. El método puede incluir un método de inhibición de apoptosis de neuronas o neurodegeneración, incluido poner en contacto a un sujeto con la composición farmacéutica. Las enfermedades se pueden seleccionar del grupo que consiste en un accidente cerebrovascular, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pick, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, el complejo Parkinson-ELA-demencia, la enfermedad de Wilson, la esclerosis múltiple, la parálisis supranuclear progresiva, los trastornos bipolares relacionados con el dolor neuropático, la degeneración corticobasal, la esquizofrenia, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), la demencia, la esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad de la retina, la epilepsia, la apoplejía, los ataques isquémicos transitorios, la isquemia miocárdica, la isquemia muscular, la isquemia causada por técnicas quirúrgicas relacionadas con una suspensión prolongada del flujo sanguíneo al cerebro, una lesión cefálica, una lesión de la médula espinal, la hipoxia y la depresión.
[0048] El proceso de contacto se puede realizar in vitro o in vivo y, cuando el proceso de contacto se realiza in vivo, el método puede incluir administrar la composición farmacéutica a un sujeto.
[0049] El sujeto puede ser una célula, un tejido, un órgano o un individuo. Además, el proceso de administración se puede realizar disolviendo la composición farmacéutica en un tampón adecuado y luego poniendo en contacto directamente una célula, tejido u órgano con la solución resultante, o mediante administración parenteral a un individuo. Una descripción detallada de la composición farmacéutica y el método de administración de la misma usado en el método de tratamiento anteriormente descrito ya se proporciona arriba y, por lo tanto, no se proporciona en la presente para evitar una complejidad excesiva.
[0050] Los sujetos a los que se administra la composición farmacéutica pueden incluir todos los animales. Por ejemplo, los animales pueden ser seres humanos, perros, gatos o ratones.
[0051] Una o más formas de realización de la presente invención se describirán ahora con más detalle con referencia a los ejemplos siguientes. Sin embargo, estos ejemplos son solo para los fines ilustrativos y no se destinan a limitar el alcance de la invención.
Breve descripción de los dibujos
[0052] Las características y ventajas anteriores y otras de la presente invención se harán más evidentes describiendo en detalle formas de realización ejemplares de las mismas con referencia a los dibujos adjuntos donde:
la figura 1 es un gráfico que muestra el grado de la enfermedad de Parkinson en un mono inducido por MPTP administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 2 ilustra imágenes microscópicas que muestran si existe o no un transportador de dopamina en el cuerpo estriado central y el cuerpo estriado de la cola de un mono inducido por MPTP administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de la prueba de suspensión por la cola de un ratón inducido por MPTP administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 4 es un gráfico que muestra la concentración de dopamina en el cuerpo estriado de un ratón inducido por MPTP administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 5 es un gráfico que muestra el grado de una disminución de neuronas de la sustancia negra de un ratón inducido por MPTP administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 6 ilustra gráficos que muestran el grado de una disminución de neuronas de la sustancia negra compacta de una rata inducida por 6-OHDA administrada con CBI, observado mediante tinción inmunohistoquímica usando tirosina hidroxilasa como anticuerpo y tinción de violeta de cresilo, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 7 ilustra imágenes que muestran si se recupera del daño o no el cuerpo estriado de un ratón inducido por malonato administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 8 es un gráfico que muestra el grado de recuperación del cuerpo estriado dañado de un ratón inducido por malonato administrado con CBI se recupera del daño, según una forma de realización de la presente invención;
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la figura 9 es un gráfico que muestra el grado de apoptosis en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la cantidad de ARNm de Bcl-2 en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 11 ilustra imágenes que muestran los resultados de medición de las cantidades de proteínas Bcl-2 y BclxL en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 12 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la cantidad de ARNm de BDNF en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI, según una forma de realización de la presente invención; la figura 13 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la cantidad de ARNm de GDNF en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI, según una forma de realización de la presente invención; la figura 14 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la cantidad de ARNm de NGF en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la cantidad de ARNm de NGF en un ratón administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 16 es un gráfico que muestra el potencial de membrana de las mitocondrias en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI y MPP+, según una forma de realización de la presente invención; la figura 17 ilustra imágenes que muestran los resultados de medición de la cantidad de citocromo c citoplásmico en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI y MPP+, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 18 es un gráfico que muestra los resultados de medición de la actividad de caspasa-3 en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI y MPP+, según una forma de realización de la presente invención; la figura 19 ilustra imágenes microscópicas de especies reactivas de oxígeno en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI y MPP+, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 20 es un gráfico que muestra que las especies reactivas de oxígeno existen en las células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI y MPP+, según una forma de realización de la presente invención; la figura 21 ilustra gráficos que muestran los resultados de medición de las actividades de catalasa, superóxidodismutasa (SOD) y glutatión-peroxidasa (GPx) en células SH-SY5Y deficientes en MAO-B tratadas con CBI y MPP+, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 22 ilustra gráficos que muestran los resultados de medición de las actividades de catalasa, SOD y GPx en el cuerpo estriado y la sustancia negra de un ratón administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención;
la figura 23 ilustra imágenes microscópicas y un gráfico de análisis que muestra si se recupera o no la neurita de un ratón inducido por MPTP administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención; y la figura 24 ilustra imágenes microscópicas y un gráfico de análisis que muestra si se recupera o no la espina de un ratón inducido por MPTP administrado con CBI, según una forma de realización de la presente invención.
Modo para la invención
[0053] Se hará ahora referencia en detalle a formas de realización, ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos anexos, donde los números de referencia similares se refieren a los elementos similares en todo momento. A este respecto, las presentes formas de realización pueden tener formas diferentes y no deben interpretarse como limitadas a las descripciones expuestas en la presente. Por consiguiente, las formas de realización se describen meramente a continuación, por referencia a las figuras, para explicar aspectos de la presente descripción.
Ejemplo 1: preparación de éster 3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico (fórmula II)
[0054]
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1.1. Síntesis de 4-benciloxi-benzaldehído oxima
[0055] Se disolvieron 4,24 g de 4-benciloxi benzaldehído (20 mmol) en una solución 0,2 M mezclada de etanol y agua (3:1, 100 ml), seguido de agitación. Se añadieron 2,78 g de NH2 OH-HCl (40 mmol) y 2,46 g de acetato sódico (30 mmol) a la misma y se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Posteriormente, la finalización de la reacción se confirmó por cromatografía en fase líquida y se eliminaron el agua y el etanol por destilación bajo presión reducida para obtener un compuesto sólido amarillo pálido. El compuesto sólido amarillo pálido se extrajo tres veces con agua y acetato de etilo, se secó una capa de solvente orgánico bajo presión reducida para obtener un producto bruto y se purificó entonces el producto bruto con una solución de hexano/etilacetato (10:1) para obtener un compuesto sólido blanco. El compuesto sólido obtenido se sometió a reacciones posteriores sin purificación adicional.
1.2. Síntesis de [3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il]-metanol
[0056] Se disolvieron 2,27 g de 4-benciloxi-benzaldehído-oxima (10 mmol; 92% de pureza) en 40 ml de cloruro de metileno (0,25 M) y luego se añadieron 1,77 ml de alcohol propargílico (30 mmol) a la solución resultante. Luego se añadieron 13,7 ml de NaOCl al 10% (20 mmol) gota a gota muy lentamente a la solución resultante usando un embudo de goteo a 0°C. Después de completar la adición de NaOCl, la mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 5 horas mientras la temperatura se elevó lentamente hasta temperatura ambiente. Posteriormente, la finalización de la reacción se confirmó por cromatografía en fase líquida, la resultante se sometió a una destilación bajo presión reducida para evaporar el cloruro de metileno de la misma, se añadieron 200 ml de agua al residuo y luego se filtró el sólido obtenido. El compuesto filtrado se lavó con una gran cantidad de agua y luego se lavó con éter dietílico para obtener un compuesto sólido. El compuesto sólido obtenido se purificó con una solución de etilacetato/hexano (1:2) para obtener un [3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il]-metanol sólido blanco (rendimiento: 2,5 g).
[0057] 1H-RMN (CDCh, 200 MHz) 57,7 (d, 2H), 7,4 (m, 4H), 7,1 (d, 2H), 6,5 (s, 1H), 5,1 (s, 2H), 4,8 (s, 2H).
1.3. Síntesis de áster 3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico
[0058] Se añadieron 1,04 ml (12 mmol) de isocianato de clorosulfonilo lentamente a -78°C a una solución de THF (50 ml, 0,2 M) y [3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il]-metanol (2,813 g, 10 mmol), puesta en un matraz de 250 ml.
Posteriormente, la eliminación completa de un material de partida se confirmó por cromatografía en fase líquida y luego se añadió agua a la solución de reacción resultante. Después de una hora, la solución resultante se sometió a una destilación bajo presión reducida para evaporar el THF de la misma, se añadieron 100 ml de agua a la resultante y se filtró el sólido obtenido. El sólido filtrado se lavó con 100 ml de agua y una solución de etilacetato/hexano (1:2), respectivamente, y se secó para obtener 3,4 g de un producto bruto (pureza: 95,9%). El producto bruto se purificó en una solución de etilacetato/hexano/cloruro de metileno (1:4:1) con metanol al 1% a 2,743 g de éster 3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico (CBI) con una pureza del 99%.
H-RMN (CDCh, 200 MHz) 57,7 (d, 2H), 7,4 (m, 4H), 7,1 (d, 2H), 6,6 (s, 1H), 5,2 (s, 2H), 5,1 (s, 2H), 4,8 (brs, 2H).
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Ejemplo 2: confirmación del efecto neuroprotector del CBI usando mono inducido por MPTP
[0060] Se ha informado de que la 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) induce características clínicas, bioquímicas y patológicas similares a aquellas observadas en los pacientes con la enfermedad de Parkinson y se conoce como una neurotoxina que se utiliza ampliamente en la preparación de un animal modelo para la enfermedad de Parkinson en roedores y primates (J. Neural Transm., 103: 987-1041 (1996); Neurotoxicol. Teratol. 24: 607-620 (2002)). La MPTP es convertida en 1 -metil-4-fenil-piridinio (MPP+) por la monoaminooxidasa (MAO)-B, y el MPP+ tiene una alta afinidad para el transportador de dopamina (DAT) e induce la disfunción de las mitocondrias y el estrés oxidativo, dando como resultado la apoptosis de las neuronas dopaminérgicas que inducen la formación de dopamina (J.N eurochem., 61: 1191-1206 (1993); J. Neural Transm., 103: 987-1041 (1996); Mov. Disord., 13: 35-38 (1998); Restor. Neurol. Neurosci., 16: 135-142 (2000)).
[0061] Se usaron monos macacos (n = 35, de 3 a 4 años de edad) como modelo experimental. Los monos macacos se dividieron en tres grupos y se administraron 0,2 mg/kg de MPTP a cada grupo (una vez al día, a diario, hasta que la puntuación de la enfermedad de Parkinson alcanza 8 o durante 14 días) por inyección intravenosa. El día siguiente después de la administración del día 14, un excipiente (control), 1 mg/kg de CBI y 1 mg/kg de rasagilina (preparada usando un método de preparación de R(+)-N-propargil-1-aminoindanrasagilina, descrito en la solicitud de patente de EE.UU. n.05,457,133) se administraron respectivamente por vía oral a los tres grupos durante 4 semanas y se midieron los cambios de la puntuación de la enfermedad de Parkinson. Además, para confirmar el efecto del CBI como un agonista de la dopamina, los transportadores de dopamina existentes en el cuerpo estriado medial y el cuerpo estriado caudal tomados del modelo de mono inducido por MPTP se sometieron a un ensayo de unión de transportadores de dopamina.
Ejemplo 2-1: medición de la extensión de la enfermedad de Parkinson
[0062] La extensión de la enfermedad de Parkinson se midió analizando comportamientos grabados en vídeo de cada grupo de monos, en función de cuatro estándares: a) rango de movimiento, b) hipoquinesia, c) extensión de postura anormal y d) temblor. Una puntuación de la enfermedad de Parkinson se evaluó por la suma de (4-rango de movimiento) hipoquinesia extensión de postura anormal temblor. Por lo tanto, el valor máximo de la puntuación total de la enfermedad de Parkinson es 10. La puntuación de la enfermedad de Parkinson se midió durante 10 minutos cada 30 minutos a lo largo de 2 horas. Es decir, el valor máximo de la máxima puntuación de la enfermedad de Parkinson es 40. Mientras tanto, el método de medición realizado en función de los cuatro estándares fue de la siguiente manera, y las puntuaciones evaluadas a continuación representan comportamientos representativos observados a lo largo de periodos de observación:
a) puntuación del rango de movimiento: 0 = ningún movimiento; 1 = solo movimiento de la cabeza; 2 = movimiento de la cabeza, las extremidades y/o el cuerpo sin ejercicio no menos del 30% del tiempo de observación; 3 = caminar/caminar o escalar la pared de una jaula no más del 30% del tiempo de observación; 4 = caminar/caminar o escalar la pared de una jaula no menos del 30% del tiempo de observación.
b) Puntuación de hipoquinesia: 0 = velocidad normal del movimiento e inicio de movimiento normal; 1 = ligera lentitud de movimiento; 2 = velocidad media de movimiento lento, movimiento difícil de iniciar y mantener, rigidez obvia del cuerpo; 3 = incapacidad de realizar ejercicio, rigidez continua del cuerpo, que da como resultado incapacidad de movimiento.
c) Puntuación de la extensión de postura anormal: 0 = postura buena normal, posible levantar su cabeza, equilibrio normal; 1 = cuerpo doblado, posible levantar su cabeza; 2 = cuerpo doblado, imposible levantar su cuello y cabeza, pérdida de equilibrio.
d) Puntuación de temblor: 0 = ninguno; 1 = existente.
[0063] Como resultado de la medición de la extensión de la enfermedad de Parkinson, se confirmó que el grupo de monos administrados con CBI mostró una extensión disminuida significativamente de la enfermedad de Parkinson, en comparación con el grupo de monos administrados con rasagilina, conocida como una medicina usada en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (refiérase a la figura 1).
Ejemplo 2-2: análisis de unión de transportador de dopamina
[0064] Se extrajo un cerebro de cada grupo de monos, se separó el tronco cerebral del mismo y luego se dividió un hemisferio cerebral en dos a lo largo de una línea mediana. Se sumergió un tejido en isopentano a -45°C, se congeló inmediatamente y luego se almacenó a - 80°C. La sección de corona del hemisferio cerebral se preparó con un grosor
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de 20 en un criostato a -17°C y luego se descongeló. El resultante descongelado se montó en un portaobjetos recubierto con gelatina, se secó sobre el mismo y luego se almacenó a -80°C.
[0065] Para la unión de transportadores de dopamina, el marcaje con un elemento radiactivo de [125l]-(E)-N-(3-yodopro-2-fenií)-2pcarboximetil-3P(4'-metilfenil)-nortropano (PE2l) se realizó usando un precursor de estannilo según un método convencional usado para confirmar un terminal nervioso de dopamina (D. Guilloteau et al., 1998). El resultante se purificó para obtener una forma sin adición de portador de [121l]PE2l con una actividad de 2000 Ci/mmol. La sección coronal del hemisferio cerebral se incubó con 100 pM [125l]PE2l en un tampón fosfato pH7,4 (NaH2P04 10,14 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,76 mM) a 25°C durante 90 minutos, usando un método descrito en la técnica relacionada (S. Chalon et al., 1999; E. Bezard et al., 2001). La sección adyacente se incubó en presencia de 100 de cocaína (Sigma, StLouis, MO) y así se confirmó la unión inespecífica. Después de la incubación, la sección se lavó dos veces con un tampón fosfato a 4°C durante 20 minutos y se enjuagó con agua destilada a 4°C durante un segundo. La sección resultante se secó a temperatura ambiente y luego se expuso a una película sensible a la radiación p (Hyperfilm P max, Amersham, Buckingamshire, Reino Unido), junto con microbalanzas de [125l] calibradas (Amersham) en casetes de rayos X durante 3 días y, así, se midió la radiactividad unida a las regiones deseadas.
[0066] Como se muestra en la figura 2, el grupo de monos administrados con CBl mostró un gran número de transportadores de dopamina en su cuerpo estriado medial y su cuerpo estriado caudal, y mostró una cantidad significativamente mayor de transportadores de dopamina que la mostrada por el grupo de monos administrados con la misma cantidad de rasagilina que la de CBl. Este resultado indica que el CBl inhibe eficazmente la apoptosis de neuronas dopaminérgicas y, por lo tanto, la pérdida de transportadores de dopamina por MPTP es relativamente inferior a la del control o el grupo de monos administrados con rasagilina. A partir de los resultados, se confirmó que el CBl es capaz de implementar neuroprotección, incluida la inhibición de la progresión de la enfermedad de Parkinson.
Ejemplo 3: efecto neuroprotector del CBl usando un modelo de ratón inducido por MPTP
[0067] Se usaron ratones C57BL/6 (n = 94, de 8 semanas de edad; machos) como modelo experimental (subcepa:
C57BL/6NCrljBgi, ORlENT BlO lNC.). Se administraron 30 mg/kg de MPTP a los ratones por inyección intraperitoneal una vez al día durante 4 días. Cuatro días después del último día de administración, los ratones se dividieron en tres grupos, y un excipiente (control), 1 mg/kg de CBl y 1 mg/kg de rasagilina se administraron respectivamente por vía oral a los tres grupos una vez al día durante 10 días. El día siguiente después del último día de administración, se realizó una prueba de suspensión por la cola (TST) en cada grupo y se extrajo tejido cerebral del cuerpo estriado y de la sustancia negra de cada grupo de ratones y, así, se midieron las concentraciones de dopamina y el producto metabólico de la misma en el cuerpo estriado y la extensión de una disminución de neuronas en la sustancia negra.
Ejemplo 3-1: análisis de comportamientos de ratones mediante la prueba de suspensión por la cola
[0068] La prueba de suspensión por la cola se realizó para medir la extensión de la causalidad de la pérdida conductual según la administración de MPTP y medicinas. La TST se realizó de manera que 7 días después de que los compuestos anteriormente descritos se administren respectivamente a los tres grupos, una barra circular de acero inoxidable con un ancho de 1 cm se fijó a una jaula con un ancho de 16 cm y una altura de 40 cm localizada a una altura de 35 cm y cuyos lados derecho e izquierdo estaban cubiertos por madera negra. El tiempo de movimiento de los ratones se midió durante 6 minutos en una segunda unidad y, así, se evaluaron las eficacias de los compuestos.
[0069] Como resultado del análisis TST, se confirmó que, mientras que el grupo de ratones administrados con MPTP mostró una pérdida conductual significativa, el grupo de ratones inducidos por MPTP administrados con CBl mostró la misma extensión de comportamientos que los de ratones normales y mostraron una capacidad excelente de restauración conductual, en comparación con el grupo de ratones inducidos por MPTP administrados con rasagilina (refiérase a la figura 3).
Ejemplo 3-2: medición de cantidades de dopamina y producto metabólico de la misma en el cuerpo estriado
[0070] Un cambio en las cantidades de dopamina y producto metabólico de la misma en el cuerpo estriado según la administración de MPTP y los compuestos anteriormente descritos se midió por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Siete días después de que los compuestos anteriormente descritos se administren respectivamente a los tres grupos, los ratones en cada grupo se sacrificaron por dislocación cervical y se extrajeron inmediatamente los tejidos cerebrales de los ratones. Se recogió el cuerpo estriado del tejido cerebral, se añadieron 0,5 ml de un diluyente de ensayo de HPLC (0,1 M HCl04, 0,1 mM EDTa ) al cuerpo estriado y luego se preparó un
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homogeneizado de tejido usando un procesador ultrasónico. El homogeneizado se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 15 minutos y el sobrenadante se filtró con un filtro de nitrocelulosa (0,2 um, Millipore). Para el análisis de HPLC, se usó una columna HR-80 (80 mm x 4,6 mm, tamaño de partícula: 3 pm, ESA, EE.UU.), se mantuvo en 0,7 ml/min el caudal de una fase móvil (0,07 M fosfato sódico monobásico, 1 mM ácido octasulfónico de sodio, 0,1 uM EDTA, acetonitrilo al 5%, pH 3,2) y el potencial del electrodo de un detector electroquímico (Coulochem III, ESA, EE.UU.) estaba a E1 = -100 mV, E2 = 350 mV.
[0071] Como resultado del análisis de la concentración de dopamina en el cuerpo estriado a lo largo del experimento, se confirmó que el grupo de ratones administrados con rasagilina mostró una restauración de la concentración de dopamina a aproximadamente un 40% en comparación con los ratones normales, mientras que el grupo de ratones inducidos por MPTP administrados con CBI mostró una restauración de la concentración de dopamina a aproximadamente un 70% en comparación con los ratones normales (refiérase a la figura 4).
Ejemplo 3-3: tinción inmunohistoquímica usando un anticuerpo para la tirosina hidroxilasa
[0072] Un cambio en la expresión de un anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa en el cuerpo estriado y la sustancia negra según la administración de los compuestos anteriormente descritos se midió por tinción inmunohistoquímica. Cada grupo de ratones se anestesió con pentobarbital sódico (50 mg/kg), se abrió el tórax del ratón y se perfundieron en el corazón 200 ml de 0,1 M de PBS (pH 7,4), eliminando así la sangre de los vasos sanguíneos. Después de que se eliminara la sangre completamente, se perfundieron en el corazón 250-300 ml de una solución de fijación de paraformaldehído al 4%/PBS, el cerebro se extrajo y el cerebro se sometió a una postfijación con la solución de fijación de paraformaldehído/PBS en una condición refrigerada durante 24 horas. Posteriormente, el tejido cerebral se lavó íntegramente con PBS para eliminar la solución de fijación y, para evitar cristales de hielo producidos durante la congelación, el tejido cerebral resultante se colocó en una solución de sacarosa al 30% y se almacenó en la misma hasta que se hundió. El tejido resultante se incluyó con un agente de inclusión para congelar (compuesto OCT) y se congeló a -40°C, y la sección coronal sucesiva de una región del mesencéfalo con el cuerpo estriado y la sustancia negra se preparó con un grosor de 40 pm usando un criostato (modelo 2000 de Reichert Frigocut). La sección coronal se mantuvo en H2O2 al 3%/PBS durante 30 minutos y luego se mantuvo en 0,1 M de PBS con Tritón X-100 al 0,3% y albúmina de suero bovino al 3% durante 30 minutos. Para teñir selectivamente las células que contienen dopamina, la sección se hizo reaccionar con TH monoclonal anti-ratón (Chemicon International, Temecula, CA; 1:500) como anticuerpo primario a temperatura ambiente durante toda la noche, y se usó IgG anti-ratón de cabra biotinilada (Vector Lab, Burlingame, CA, 1:200) como anticuerpo secundario. Posteriormente, la unión de avidina-biotina se indujo usando el kit Vectastain elite ABC (Vector Lab, Burlingame, CA) y el desarrollo de color se realizó en el tejido usando 3,4-diaminobencidina (DAB). El tejido resultante se colocó en PBS, se montó sobre un vidrio portaobjetos y el resultante se secó y se cubrió luego por un cubreobjetos. La sustancia negra de la región del mesencéfalo en el resultante se observó usando un microscopio equipado con una cámara digital (Olympus BX-60, Olympus Optical, Tokio, Japón) con un aumento de 200x, las células que mostraron una reacción positiva al anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa se observaron y se registraron, y se realizó un análisis estadístico (ANOVA unidireccional) usando un programa Graph pad Prism 4.
[0073] Como resultado del análisis de la extensión de una disminución de neuronas en la sustancia negra por tinción inmunohistoquímica usando el anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa como se ha descrito anteriormente, el grupo de ratones inducidos por MPTP administrados con CBI mostró la misma extensión de una disminución de neuronas en la sustancia negra que la del grupo de ratones inducidos por MPTP administrados con rasagilina (refiérase a la figura 5). A partir de los resultados, se confirmó que el CBI funciona como un agonista de la dopamina, siendo así capaz de implementar neuroprotección, y tiene un efecto superior a la rasagilina, que se conoce de forma convencional como un agonista de la dopamina.
Ejemplo 4: confirmación del efecto neuroprotector del CBI usando un modelo de rata inducido por 6-OHDA
[0074] La 6-hidroxidopamina (6-OHDA) se conoce como una neurotoxina que aumenta la formación de radicales hidroxilo, induciendo así la degeneración de neuronas de la sustancia negra y el cuerpo estriado. Los radicales hidroxilo destruyen rápidamente la región terminal de una neurona (J. Neural. Transm., 103: 987-1041 (1996); J. Neurosci., 19: 1284-1293 (1999)), causando así una pérdida gradual de células en la pars compacta de la sustancia negra (SNpc), y tal pérdida se conoce por ser similar a la degeneración gradual de la sustancia negra y el cuerpo estriado, observada en pacientes con la enfermedad de Parkinson en etapas tempranas (Brain Res., 26: 301-307 (1991); Neurosci., 59: 401-415 (1994); Neurosci., 67: 631-647 (1995); Neurosci., 72: 641-653 (1996)).
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[0075] Se usaron ratas Wistar proporcionadas por ORIENT BIO INC. (excipiente y CBI n = 7, rasagilina n = 6; de 6 semanas de edad; 20 ratas macho) como modelo experimental. Se realizó una inyección unilateral de 3 gl de una solución que contiene 20 gg/gl de 6-OHDA en el cuerpo estriado de cada rata (posición: frontal -1,0 mm, posterior-3,0 mm, lado postabdominal-5,0 mm), induciendo así la degeneración de neuronas en el cuerpo estriado. Las ratas se dividieron en tres grupos, y un excipiente (control), 1 mg/kg de CBI y 1 mg/kg de rasagilina se administraron respectivamente por vía oral a los tres grupos 1 hora antes de la administración de 6-OHDA y una vez cada dos días durante 6 semanas. Se realizó una prueba de rotación inducida por apomorfina en cada grupo 4, 5 y 6 semanas después del último día de administración. La prueba de rotación inducida por apomorfina se realizó de manera que se administraron 0,5 mg/kg de apomorfina a cada grupo de ratas por inyección intraperitoneal, cada grupo de ratas se colocó en una cámara de rotor y el movimiento giratorio de la misma se registró durante 45 minutos, y, así, se midió el número de rotación por minuto de cada grupo de ratas para determinar el valor medio del mismo. Además, después de la prueba de rotación inducida por apomorfina realizada 6 semanas después del último día de administración, se sacrificó cada grupo de ratas y, así, se confirmó la extensión de una disminución de neuronas de la pars compacta de la sustancia negra usando una tinción inmunohistoquímica usando un anticuerpo contra la tirosina hidroxilasa y tinción de violeta de cresilo. Como se describe en el ejemplo 3-3 anterior, se preparó una sección coronal sucesiva de una región del mesencéfalo con la sustancia negra, la sección se puso en PBS, la sección resultante se unió a un vidrio portaobjetos recubierto de silano y se secó, y el vidrio portaobjetos se colocó luego en xileno, alcohol al 100%, alcohol al 95%, alcohol al 70% y agua destilada durante 5 minutos, 2 minutos, 1 minuto, 1 minuto y 2 minutos, respectivamente. Posteriormente, el vidrio portaobjetos resultante se sumergió en una solución de violeta de cresilo al 1% durante 5 minutos y se lavó con agua destilada, alcohol al 70%, alcohol al 95%, alcohol al 100% y xileno durante 2 minutos, 1 minuto, 1 minuto, 2 minutos y 5 minutos, respectivamente, y el vidrio portaobjetos se cubrió con un vidrio cubreobjetos y se observó usando un microscopio equipado con una cámara digital (Olympus BX-60, Olympus Optical, Tokio, Japón). La sustancia negra de la región del mesencéfalo se observó con un aumento de 200x, se observaron y se registraron las células que mostraron una reacción positiva al violeta de cresilo y luego se realizó un análisis estadístico (ANOVA unidireccional) usando un programa Graph pad Prism 4.
[0076] Como se muestra en la figura 6, se confirmó que el grupo de ratas inducidas por 6-OHDA administradas con CBI mostró una extensión disminuida significativamente de una disminución de neuronas y tuvo un efecto superior al del grupo de ratas inducidas por 6-OHDA administradas con rasagilina.
Ejemplo 5: confirmación del efecto neuroprotector del CBI usando un modelo de ratón inducido por malonato
[0077] El malonato es un inhibidor reversible de la succinato deshidrogenasa, que es una enzima de las mitocondrias, y se conoce por inhibir el sistema de transporte de electrones de las mitocondrias para inducir la degeneración de neuronas excitotóxicas o para aumentar la liberación de dopamina del cuerpo estriado para causar la pérdida del cuerpo estriado. Una deficiencia de bioenergía en las mitocondrias se asocia al fenómeno patológico de varias enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica (Ann. Neurol., 58: 495-505 (2005); Nat. Rev. Neurosci., 7: 278-294 (2006)), y la inyección de malonato en el cuerpo estriado de un animal causa una pérdida similar a la observada en la isquemia focal o la enfermedad de Huntington (Experimental Neurology, 178: 301-305 (2002)). Esto causa un estrés metabólico en varios grupos de neuronas, dando como resultado una disminución de la cantidad de dopamina tanto del cuerpo celular de una célula de dopamina de la sustancia negra como del cuerpo estriado (J. Neurochem., 61: 1147-1150 (1993); Brain Res., 773: 223-226 (1997); Neuroscience, 96: 309-316 (2000)).
[0078] Se usaron ratones ICR (n = 34, de 10 semanas de edad; machos) como modelo experimental. Se administraron 5 ml/kg de equitesina a cada ratón por inyección intraperitoneal para ser anestesiarlos, dos niveladores de un instrumento estereotáctico se establecieron a 0 mm de ambos canales auditivos externos y se perforó el cráneo del ratón en el instrumento estereotáctico. Se usaron 0,2 mg/ml de ácido ascórbico como control y se inyectaron 2,4 umol/2 de malonato en un grupo de lesiones y un grupo de tratamiento de compuesto 0,5 mm hacia adelante (AP) y 1,2 mm hacia un lado del cuerpo estriado en el lado derecho (bregma) y 3,1 mm hacia abajo de la duramadre usando una jeringa Hamilton (10 gl, aguja 26G) a una velocidad de 1 uL/min. Los grupos administrados con malonato se dividieron en dos grupos y se administraron 0,5 ml/kg de excipiente (n = 12) y 5 mg/kg de CBI (n = 14) respectivamente a los dos grupos por inyección intraperitoneal 2 horas antes de una operación, y se administraron de nuevo 1 hora, 1 día, 2 días y 3 días después de la operación, es decir, en total cinco veces. El malonato se inyectó en el cuerpo estriado del ratón, el ratón se sacrificó después de 3 días y el cerebro se extrajo del ratón para preparar una sección. Luego, la sección se tiñó con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC).
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[0079] Como se muestra en las figuras 7 y 8, se confirmó que el CBI inhibió la apoptosis de neuronas en el cuerpo estriado inducida por malonato, reduciendo así significativamente las regiones dañadas del cuerpo estriado. Así, el resultado indica que el CBI alivia la apoptosis de neuronas causada por daño de las mitocondrias.
Ejemplo 6: confirmación del efecto neuroprotector del CBI por antiapoptosis de neuronas
[0080] Muchas enfermedades neurodegenerativas tales como un accidente cerebrovascular, lesiones cerebrales, lesiones de la médula espinal, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson se caracterizan por la apoptosis de neuronas (The New England Journal of Medicine, 348: 1365 (2003)), y las enfermedades neurodegenerativas crónicas se conocen por estar causadas por la inducción de vías de apoptosis por varios factores internos o externos. Para explicar cambios bioquímicos y biológicos moleculares que ocurren en la apoptosis de neuronas, se ha puesto en marcha un enfoque de búsqueda de materiales que muestren mecanismos multidireccionales en varios pasos de la apoptosis de neuronas o el tratamiento de medicinas neuroprotectoras (CNS drugs, 19: 723 (2005); Nat. Rev. Neurosci., 7: 295 (2006)).
[0081] En referencia a las figuras 6 a 10, se confirma que el CBI inhibe la apoptosis de neuronas causada por los varios factores internos o externos, exhibiendo así un efecto terapéutico en enfermedades neurodegenerativas.
[0082] En esta forma de realización, se usaron células SH-SY5Y de neuroblastoma humano deficientes en MAO-B (banco de líneas celulares coreano). La apoptosis de las células de neuroblastoma humano se indujo por privación de suero. Las células SH-SY5Y de neuroblastoma humano deficientes en MAO-B cultivadas en un medio normal se distribuyeron en una placa de 6 pocillos con una concentración de 1,8 x 105 células/pocillo y se incubaron durante 1 día, el medio se cambió por un medio sin suero con CBI (0,1, 1 y 10), un medio sin suero con rasagilina (0,1, 1 y 10) o un medio sin suero sin CBI ni rasagilina, y la célula se incubó adicionalmente en 5% de CO2 a 37°C durante 48 horas. Posteriormente, el número de células muertas se representó como un porcentaje, en comparación con un control que no causa la apoptosis de neuronas.
[0083] Como se muestra en la figura 9, se confirmó que, cuando la neurona con inducción de apoptosis fue administrada con CBI, la extensión de la apoptosis de neuronas disminuyó. En particular, se confirmó que, cuando la neurona con inducción de apoptosis fue administrada con 10 de CBI, mostró una extensión más alta de una disminución de la apoptosis de neuronas, es decir, aproximadamente un 33% que la del caso de la neurona con inducción de apoptosis administrada con 10 de rasagilina.
[0084] Mientras tanto, una variedad de proteínas de transducción de señales está implicada en un proceso para mediar o inhibir la apoptosis, y los ejemplos representativos de las mismas incluyen las proteínas de la familia génica Bcl-2 (Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 37: 179-190 (2005); J. Cell Mol. Med., 7: 249-257 (2003); Genes and Development, 13: 1899-1911 (1999)). Por lo tanto, 0,1, 1 y 10 de CBI o 0,1, 1 y 10 de rasagilina se añadieron respectivamente a las células con inducción de apoptosis como se ha descrito anteriormente, las células resultantes se incubaron adicionalmente en 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas, se extrajo el ARNm de las células cultivadas o se obtuvo un extracto celular de las mismas y, así, se midieron la cantidad de ARNm de Bcl-2 y las cantidades de proteínas Bcl-2 y Bcl-xL. La cantidad de ARNm de Bcl-2 se midió por RT-PCR en tiempo real y las cantidades de proteínas Bcl-2 y Bcl-xL se midieron por transferencia Western.
[0085] El ARN total de la célula SH-SY5Y se extrajo usando el RNeasy MiniKit (Qiagen) después de que la célula SH-SY5Y fuera tratada con CBI o rasagilina en un medio sin suero durante 24 horas. Se retrotranscribieron 2 ug del ARN total usando el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) y se realizó una PCR en tiempo real (Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR SYSTEM) sobre el mismo usando una sonda TaqMan (Applied Biosystems, EE.u U.) para Bcl-2. Como control interno, se amplificó ARNm para l8SARN. La cuantificación relativa de los niveles de ARNm de los genes diana se determinó por el método ddCt (Takekawa, 1998).
[0086] Para la transferencia Western, las células SH-SY5Y se lisaron con tampón RIPA (50 mM Tris-Cl pH 7,4, NP-40 al 1%, deoxicolato sódico al 0,25%, SDS al 0,1%, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) y se centrifugaron luego para obtener un extracto celular. Posteriormente, se cuantificó el extracto celular, se cargó la misma cantidad del extracto celular sobre un gel SDS-PAGE seguido de electroforesis, se transfirió el gel sobre una membrana de nitrocelulosa, se transfirió la membrana usando un anticuerpo contra Bcl-2 (n.0 cat.: 2872, Cell Signaling, EE.UU.) y un anticuerpo contra Bcl-xL (n.0 cat.: 2762, Cell Signaling, EE.UU.) que se diluyeron respectivamente a 1:5000 usando un método bien conocido en la técnica y se confirmaron las cantidades de expresión de proteínas Bcl-2 y Bcl-xL usando el kit ECL (Amersham
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Pharmacia). Un anticuerpo contra la P-actina (n.0 cat.: A2228, Sigma, EE.UU.) se usó como control y se confirmó la cantidad de expresión de proteína P-actina.
[0087] Como se muestra en las figuras 10 y 11, se confirmó que, en el caso de la neurona con inducción de apoptosis administrada con CBI, la cantidad de ARNm de la proteína Bcl-2 que tiene una función antiapoptótica fue de 1,5 a 2 veces mayor que la del control y la cantidad de la proteína Bcl-2 fue también de 1,5 a 2 veces mayor que la del control. Además, se confirmó que la cantidad de Bcl-xL, que es la otra proteína antiapoptótica, fue mayor también que la del control. A partir de los resultados, se confirmó que el CBI tuvo un efecto de inhibición de la apoptosis de neuronas y, por lo tanto, tuvo un efecto neuroprotector.
Ejemplo 7: confirmación del efecto neuroprotector del CBI por inducción de la expresión de un factor neurotrófico
[0088] Un factor neurotrófico es una proteína que juega un papel crucial en el desarrollo, la regeneración y la reparación de neuronas, y los ejemplos del factor neurotrófico incluyen un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), un factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) y un factor de crecimiento nervioso (NGF). La inducción del factor neurotrófico permite la inhibición de la apoptosis de neuronas (Nature medicine, 15: 331-337 (2009); Brain Research Bulletin, 57: 817-822 (2002); The Journal of Neuroscience, 21: 8108-8118 (2001); The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 322: 59-69 (2007); TRENDS in Pharmacological Sciences, 27: 619-625 (2006)).
[0089] Usando el mismo método que en el ejemplo 6, se añadieron 0,1, 1 y 10 de CBI o 0,1, 1 y 10 de rasagilina, respectivamente, a células con inducción de apoptosis, las células resultantes se incubaron adicionalmente en 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas, se extrajo ARNm de las células cultivadas y, así, se midieron las cantidades de ARNm de BDNF, GDNF y NGF por RT-PCR en tiempo real.
[0090] Como se muestra en las figuras 12 a 14, se confirmó que, en el caso de la neurona con inducción de apoptosis tratada con CBI, las cantidades de ARNm de BDNF, GDNF y NGF fueron, respectivamente, de 1,5 a 2 veces, de 4 a 8 veces y de 2 a 2,5 veces mayores que en el control.
[0091] Además, para confirmar in vivo si se indujo o no el factor neurotrófico por el tratamiento de CBI, se usaron ratones C57BL/6 (n = 12, de 8 semanas de edad, machos, ORIENT BIO INC.). Los ratones se dividieron en tres grupos (n = 4 para cada grupo), y un excipiente (control), 1 mg/kg de CBI y 1 mg/kg de rasagilina se administraron respectivamente por vía oral a los tres grupos sin tratamiento de una neurotoxina una vez al día durante 8 días. El día siguiente después del último día de administración, se extrajeron tejidos del cuerpo estriado y la sustancia negra de cada grupo de ratones. Se extrajo ARNm de la célula del tejido tomado y, así, se midió la cantidad de ARNm de NGF por RT-PCR en tiempo real.
[0092] Como se muestra en la figura 15, se confirmó que, en el caso del grupo de ratones tratados con CBI, la cantidad de ARNm de NGF en el cuerpo estriado fue aproximadamente de 1,7 a 2,5 veces mayor que la de los otros grupos de ratones. En particular, se confirmó que, en el caso del grupo de ratones tratados con CBI, la expresión de NGF en el cuerpo estriado fue significativamente mayor que la del grupo de ratones tratados con rasagilina. Los resultados indican que el CBI induce la expresión de los factores neurotróficos de neuronas, siendo así capaz de inhibir la apoptosis de neuronas.
Ejemplo 8: confirmación del efecto neuroprotector del CBI por mejora de funciones de las mitocondrias en las neuronas
[0093] En esta forma de realización, se usaron células SH-SY5Y de neuroblastoma humano deficientes en MAO-B (banco de líneas celulares coreano). Las células se incubaron en un medio DMEM en 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. Las células cultivadas se dividieron en cinco grupos, se añadieron 2 mM de 1 -metil-4-fenil-piridio (MPP+) a cada grupo, tres de los cinco grupos fueron tratados respectivamente con 1 nM, 10 nM y 50 nM de CBI, uno de los otros dos grupos fue tratado con 10 nM de rasagilina y los cuatro grupos tratados con CBI o rasagilina se incubaron adicionalmente en 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. El grupo con solo MPP+ añadido al mismo se incubó bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Posteriormente, según los protocolos del fabricante, el potencial de transmembrana de las mitocondrias se determinó usando el kit MitoPTtm (Immunochemistry Technology). El potencial de transmembrana de las mitocondrias se confirmó usando un lector de placas fluorescente (Tecan, Austria). Cuando el potencial de transmembrana de las mitocondrias es bajo, se exhibe fluorescencia verde, por otro lado, cuando es
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alto, se exhibe fluorescencia roja. Así, se determinaron los valores RFU (valor de fluorescencia roja/valor de fluorescencia verde) a partir de los resultados, y los resultados se muestran en la figura 16.
[0094] El MPP+ reduce el potencial de transmembrana de las mitocondrias, induciendo así la inestabilidad de la membrana de las mitocondrias. La permeabilización de la membrana de las mitocondrias es un proceso esencial en la apoptosis y, así, la estabilidad de la membrana de las mitocondrias puede volverse un mecanismo de antiapoptosis (Brain Res. Rev., 29: 1-25 (1999)). Como se muestra en la figura 16, se confirmó que, en el caso de las neuronas con MPP+ añadido a las mismas, el potencial de transmembrana de las mitocondrias se estabilizó de manera dependiente de la concentración por el tratamiento de CBI y el efecto de estabilidad del potencial de transmembrana de las mitocondrias fue alrededor de no menos de 2 veces superior al del grupo de las neuronas tratadas con la misma concentración de rasagilina que la del CBI.
[0095] Como se ha descrito anteriormente, muchas enfermedades neurodegenerativas tales como un accidente cerebrovascular, lesiones cerebrales, lesiones de la médula espinal, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson se caracterizan por la apoptosis de neuronas (The New England Journal of Medicine, 348: 1365 (2003)), y la apoptosis de las neuronas está causada por la inducción de vías de apoptosis por varios factores internos o externos. Además, la estabilidad de la membrana de las mitocondrias es un mecanismo de antiapoptosis, y se sabe que la apoptosis de las neuronas es inhibida por la proteína Bcl-2 o BclxL y la membrana de las mitocondrias está estabilizada por la proteína (Biochem Biophys Res Commun., 304(3): 433­ 435 (2003); The New England Journal of Medicine, 348(14): 1365-1375 (2003); Brain Res Rev., 29(1): 1-25 (1999); Journal of Neurological Sciences, 283: 240-320 (2009)). Así, los resultados indican que el CBI estabiliza el potencial de transmembrana de las mitocondrias, siendo así capaz de prevenir o tratar las enfermedades neurodegenerativas anteriormente descritas.
[0096] Además, la apoptosis se conoce por estar causada por mecanismos de liberación de citocromo c de las mitocondrias y la activación de la caspasa 3 (The New England journal of Medicine, 348: 1365-1375 (2003)). Para confirmar si la estabilidad del potencial de transmembrana de las mitocondrias por el tratamiento de CBI está asociada o no a la antiapoptosis de las neuronas, se obtuvieron extractos celulares de los grupos de células y, así, se midieron la cantidad de citocromo c y la actividad de la caspasa 3 en el citoplasma celular.
Ejemplo 8-1: medición de la liberación de citocromo c
[0097] Las células SH-SY5Y se incubaron bajo las mismas condiciones que se han descrito en el ejemplo 7 y luego se lavaron con PBS. Un cóctel inhibidor de proteasas (Roche) y un cóctel inhibidor de fosfatasas (Roche) se añadieron a un tampón hipertónico (20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCh, 1 mM EDTA), y las células SH-SY5Y fueron tratadas con 100 ul de la solución resultante y luego se suspendieron uniformemente. La resultante se mantuvo en hielo durante 30 minutos y luego se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 20 minutos. Posteriormente, se cargó la misma cantidad del sobrenadante sobre un gel SDS-PAGE seguido de electroforesis, el gel se transfirió sobre una membrana de nitrocelulosa, la membrana se transfirió usando citocromo c (Santacruz, sc13156) diluido a 1:2000 usando un método bien conocido en la técnica y se evaluó la expresión de citocromo c usando un kit ECL (Amersham Pharmacia).
[0098] Como se muestra en la figura 17, se confirmó que, en el caso de las neuronas con MPP+ añadido, la cantidad de citocromo c en el citoplasma disminuyó por el tratamiento de CBI, y la cantidad de citocromo c liberado de las mitocondrias fue menor que en el caso de las neuronas con MPP+ añadido tratadas con la misma cantidad de rasagilina que la de CBI.
Ejemplo 8-2: medición de la actividad de la caspasa 3/7
[0099] Las células SH-SY5Y se incubaron en una placa de 96 pocillos con una concentración de 5 x 105 células/pocillo bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente, las células fueron tratadas con 2 mM de MPP+ y CBI (1, 5, 10 y 50 nM) o rasagilina (50 nM) y las células resultantes se incubaron durante 24 horas. Posteriormente, 100 gl de reactivo de la caspasa 3/7 Apo-ONE (Promega, G7790) se añadió a las mismas y se mezclaron con las mismas, y la resultante se incubó adicionalmente durante 4 horas. Después de que se terminara la incubación, se midió la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 495 nm y una longitud de onda de emisión de 521 nm usando un lector de placas de fluorescencia (GeminiXPS, Molecular Devices). Como se muestra en la figura 18, se confirmó que la actividad de la caspasa 3 se redujo por el tratamiento de CBI, como en el caso de las células tratadas con rasagilina.
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[0100] De los resultados del ejemplo 8, se confirmó que el CBI estabiliza una membrana de las mitocondrias en las neuronas, evitando así la liberación de citocromo c de las mitocondrias, y reduce la actividad de la caspasa 3 en consecuencia, inhibiendo así la apoptosis de neuronas.
[0101] Como se ha descrito anteriormente, muchas enfermedades neurodegenerativas tales como un accidente cerebrovascular, lesiones cerebrales, lesiones de la médula espinal, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson se caracterizan por la apoptosis de neuronas y, así, los resultados indican que el CBI inhibe la apoptosis de neuronas, siendo así capaz de prevenir o tratar las enfermedades neurodegenerativas.
Ejemplo 9: confirmación del efecto neuroprotector del CBI por inhibición de especies reactivas de oxígeno de neuronas
[0102] En esta forma de realización, se usaron células SH-SY5Y de neuroblastoma humano deficientes en MAO-B (banco de líneas celulares coreano). Las células se cultivaron en un medio DMEM a 37°C con 5% de CO2 durante 24 horas. Las células cultivadas se dividieron en tres grupos, se añadieron 2 mM de MPP+ a cada grupo, uno de los tres grupos fue tratado con 50 nM de CBI, uno de los otros dos grupos fue tratado con 50 nM de rasagilina, y los tres grupos se incubaron adicionalmente con 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. El grupo solo con MPP+ añadido al mismo se incubó bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Posteriormente, las células se tiñeron con 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA), que es un colorante de fluorescencia capaz de detectar especies reactivas de oxígeno, y luego se observaron usando un microscopio confocal (Nikon Co., Japón).
[0103] Como se muestra en las figuras 19 y 20, en el caso de las neuronas con MPP+ añadido, las especies reactivas de oxígeno disminuyeron significativamente por el tratamiento de CBI, como en el caso de las neuronas con MPP añadido tratadas con la misma concentración de rasagilina que la de CBI.
[0104] La generación y un aumento de las especies reactivas de oxígeno en las células se conocen por inducir la apoptosis y, por lo tanto, de los resultados anteriormente descritos, se confirmó que el CBI induce una disminución de las especies reactivas de oxígeno, inhibiendo así la apoptosis. Tal estrés oxidativo se conoce por causar varias enfermedades relacionadas con la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, las enfermedades desmielinizantes, la polineuropatía diabética, el síndrome de Down, la neuropatía de VIH, la enfermedad de Huntington, la atrofia multisistémica, la enfermedad de Parkinson, un accidente cerebrovascular y una lesión por isquemia-reperfusión, una taupatía y daños cerebrales traumáticos (Free radical Biology & Medicine, 33(2): 182-191 (2002)) y, así, los resultados indican que el CBI induce una disminución de las especies reactivas de oxígeno, inhibiendo así el estrés oxidativo, y previene la apoptosis de neuronas en consecuencia, y, por tanto, se usa para la prevención o el tratamiento de las varias enfermedades neurodegenerativas.
Ejemplo 10: confirmación del efecto neuroprotector del CBI por un aumento de la actividad de enzima antioxidante
[0105] En esta forma de realización, se usaron células SH-SY5Y de neuroblastoma humano deficientes en MAO-B (banco de líneas celulares coreano). Las células SH-SY5Y se distribuyeron en una placa de 6 pocillos con una concentración de 1,8 x 105 células/pocillo y luego se incubaron con 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. Las células resultantes se dividieron en tres grupos, 2 mM de MPP+ se añadió a cada grupo, dos de los tres grupos fueron tratados respectivamente 0,1 y el resultante se incubó adicionalmente con 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas. El grupo de control que no se trató con MPP+ se incubó bajo las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Posteriormente, se obtuvieron extractos celulares de las células y, así, se midieron las actividades de enzimas antioxidantes, es decir, catalasa, superóxido-dismutasa (SOD) y glutatión-peroxidasa (GPx).
[0106] Como se muestra en la figura 21, las neuronas con MPP+ añadido mostraron una tendencia de una disminución de las actividades de catalasa y GPx, en comparación con el grupo de células que no fueron tratadas con MPP+ , y las neuronas con MPP+ añadido tratadas con CBI mostraron un aumento de una actividad disminuida de las enzimas antioxidantes. Particularmente, se confirmó que la actividad de la GPx en este grupo fue aproximadamente de 2,5 a 4 veces mucho más alta que en el control.
[0107] Además, para confirmar in vivo si las actividades de las enzimas antioxidantes aumentaron por el tratamiento de CBI, se usaron ratones C57BL/6 (n = 12), machos de 8 a 9 semanas de edad) (ORIENT BIO INC.). Los ratones C57BL/6 se dividieron en tres grupos (n = 4 para cada grupo), y un excipiente (control), 1 mg/kg de CBI y 1 mg/kg de rasagilina
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se administraron respectivamente por vía oral a los tres grupos sin tratamiento de una neurotoxina durante 8 días. El día siguiente después del último día de administración, se extrajeron tejidos del cuerpo estriado y la sustancia negra de cada grupo de ratones. Se obtuvieron extractos celulares de las células de los tejidos y, así, se midieron las actividades de la catalasa, la SOD y la GPx.
[0108] Como se muestra en la figura 22, en el grupo de ratones administrados con CBI, no hubo ningún cambio significativo en la actividad de la SOD, sin embargo, la actividad de la catalasa estaba aumentada aproximadamente un 13% en el cuerpo estriado y la actividad de la GPx estaba aumentada aproximadamente un 28% en la sustancia negra.
[0109] La generación y un aumento de las especies reactivas de oxígeno en las células se conocen por inducir la apoptosis, y las enzimas antioxidantes se conocen por descomponer las especies reactivas de oxígeno y, por lo tanto, a partir de los resultados, se confirma que el CBI aumenta la actividad de enzimas antioxidantes en las neuronas, en particular, la actividad de la GPx en la sustancia negra, induciendo así una disminución de las especies reactivas de oxígeno, y es capaz de inhibir la apoptosis, en consecuencia. Además, los resultados indican que el CBI induce una disminución de las especies reactivas de oxígeno, inhibiendo así el estrés oxidativo para prevenir la apoptosis de neuronas y, así, se puede usar para la prevención o el tratamiento de las varias enfermedades anteriormente descritas.
Ejemplo 11: confirmación del efecto neurorrestaurador del CBI
[0110] Se usaron ratones C57BL/6 (n = 8/grupo (4 grupos en total), de 8 semanas de edad; machos) como modelo experimental (subcepa: C57BL/6NCrljBgi, disponible de ORIENT BlO INC.). Se administraron 30 mg/kg de MPTP a los ratones por inyección intraperitoneal una vez al día durante 4 días. Cuatro días después del último día de administración, los ratones se dividieron en tres grupos (n = 4/grupo), y un excipiente (control), 1 mg/kg de CBI y 1 mg/kg de rasagilina se administraron respectivamente por vía oral a los tres grupos una vez al día durante 10 días. El día siguiente después del último día de administración se extrajeron, tejidos del cuerpo estriado y la sustancia negra de cada grupo de ratones. Para observar si el número de neuritas y de espinas por neurona en los tejidos estaba aumentado o no, se preparó un corte coronal con un grosor de 200 um con el cuerpo estriado o la sustancia negra usando un vibrátomo. Se sacrificó cada grupo de ratones y se extrajo el cerebro de cada grupo y luego se colocó en un tampón de disección de sacarosa muy concentrada frío burbujeado con carbógeno (5 % de CO2 y 95% de O2) (87 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 1 mM CaCl2, 3 mM MgCb, 10 mM dextrosa y 75 mM sacarosa). Mientras se operaba el vibrátomo, se rellenó una cámara de corte con el tampón de disección de sacarosa uniformemente carbogenado. Después de que terminase el proceso de corte, se lavaron todos los cortes con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% en una solución de PBS. Los cortes de cerebro fijados se colocaron en un bloque de agarosa al 1,5% (en PBS). Se obtuvieron imágenes de los mismos usando un microscopio confocal (ZEISS LSM 510 META) usando el software Zeiss LSM image browser (Carl Zeiss Microimaging, Alemania, versión 4.0 SP2).
[0111] Como se muestra en las figuras 23 y 24, en el caso del grupo de ratones inducidos por MPTP administrados con CBI, el número de neuritas aumentó y el número de espinas también se recuperó al nivel de las células normales. En particular, en el caso del grupo de ratones inducidos por MPTP administrados con rasagilina, se observó un aumento del número de espinas, sin embargo, un aumento de las neuritas no mostró significación estadística. A partir de los resultados, se confirma que el CBI inhibe la apoptosis y tiene también un efecto de mejora de la plasticidad neural.
Ejemplo 12: administración de CBI y preparación de pastilla que contiene CBI (predicción)
[0112] La composición farmacéutica según la presente invención se usa en la inhibición de la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración, o en la neuroprotección o la neurorrestauración. Una dosis clínicamente adecuada (administración oral) de la composición farmacéutica es 25 mg ~ 100 mg para un adulto.
[0113] En función de la dosis, se preparó una pastilla que contiene los componentes mostrados en la tabla 1 a continuación usando un método general. Se usó Avicel 102 (celulosa microcristalina) como excipiente.
Tabla 1
[0114]
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[Tabla 1]
Figure imgf000023_0001
[0115] Una dosis adecuada de los componentes es 1 o 2 pastillas que contienen los componentes por día para un adulto con un peso corporal de 60 kg.
[0116] Según una o más formas de realización de la presente invención, una composición farmacéutica puede prevenir o tratar eficazmente enfermedades relacionadas con la apoptosis de neuronas o la neurodegeneración.

Claims (6)

ES 2 766 351 T3REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica para usar en un método de neuroprotección, que comprende:
un compuesto de fórmula I, una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero, un solvato o un hidrato del mismo, o cualquier combinación de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable:
Figure imgf000024_0001
donde R es un grupo arilalquilo C7-C15 sustituido o no sustituido;
Y es O;
Ri es H o un grupo alquilo C1-C3 ;
R2 es H o un halógeno;
A es N, O o S;
B es C o N;
Z es -OC(=O)NR3R4 ;
cada uno de R3 y R4 es H o un alquilo C1-C5;
m es un número entero en el rango de 0 a 4; y
n es un número entero en el rango de 0 a 5.
2. Composición farmacéutica para usar en un método de neurorrestauración, que comprende:
un compuesto de fórmula I, una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero, un solvato o un hidrato del mismo, o cualquier combinación de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable:
Figure imgf000024_0002
donde R es un grupo arilalquilo C7-C15 sustituido o no sustituido;
Y es O;
R1 es H o un grupo alquilo C1-C3 ;
R2 es H o un halógeno;
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A es N, O o S;
B es C o N;
Z es -OC(=O)NR3R4 ;
cada uno de R3 y R4 es H o un alquilo C1-C5;
m es un número entero en el rango de 0 a 4; y
n es un número entero en el rango de 0 a 5.
3. Composición farmacéutica para usar en un método de prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, donde la enfermedad no es la enfermedad de Parkinson, donde la composición comprende: un compuesto de fórmula I, una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero, un solvato o un hidrato del mismo, o cualquier combinación de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable:
Fórmula I
Figure imgf000025_0001
donde R es un grupo arilalquilo C7-C15 sustituido o no sustituido;
Y es O o -N-R1;
Ri es H o un grupo alquilo C1-C3 ;
R2 es H o un halógeno;
A es N, O o S;
B es C o N;
Z es -OC(=O)NR3R4 ;
cada uno de R3 y R4 es H o un alquilo C1-C5;
m es un número entero en el rango de 0 a 4; y
n es un número entero en el rango de 0 a 5.
4. Composición farmacéutica para usar en un método de prevención o tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en un accidente cerebrovascular, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Pick, la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, el complejo Parkinson-ELA-demencia, la enfermedad de Wilson, la esclerosis múltiple, la parálisis supranuclear progresiva, los trastornos bipolares relacionados con el dolor neuropático, la degeneración corticobasal, la esquizofrenia, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), la demencia, la esclerosis lateral amiotrófica, una enfermedad de la retina, la epilepsia, la apoplej ía, los ataques isquémicos transitorios, la isquemia miocárdica, la isquemia muscular, la isquemia causada por técnicas quirúrgicas relacionadas con una suspensión prolongada del flujo sanguíneo al cerebro, una lesión cefálica, una lesión de la médula espinal, la hipoxia y la depresión, donde la composición comprende:
un compuesto de fórmula I, una sal farmacéuticamente aceptable, un isómero, un solvato del derivado de azol sustituido, o un hidrato del mismo, o cualquier combinación de los mismos; y un portador farmacéuticamente aceptable:
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Figure imgf000026_0001
donde R es un grupo arilalquilo C7-C15 sustituido o no sustituido;
Y es O o -N-R1;
Ri es H o un grupo alquilo C1-C3 ;
R2 es H o un halógeno;
A es N, O o S;
B es C o N;
Z es -OC(=O)NR3R4 ;
cada uno de R3 y R4 es H o un alquilo C1-C5;
m es un número entero en el rango de 0 a 4; y
n es un número entero en el rango de 0 a 5.
5. Composición farmacéutica para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto de fórmula I se selecciona del grupo que consiste en:
éster 3-(4-benciloxi-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-fenil)-[1,2,4]oxadiazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-fenil)-isotiazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-fenil)-[1,2,4]tiadiazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-2-cloro-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-3-cloro-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-3-bromo-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-3-fluoro-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-(4-benciloxi-3,5-dimetil-fenil)-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(1-fenil-etoxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(3-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(4-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2,6-difluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2,3-difluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(3,5-difluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(3,4-difluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2,4,6-trifluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(3-cloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2-cloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(4-cloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2,6-dicloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2,5-dicloro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2-cloro-5-fluoro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(3-nitro-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster metílico de ácido 4-[4-(5-carbamoiloximetil-isoxazol-3-il)-fenoximetil]-benzoico,
éster 3-[4-(4-metil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
éster 3-[4-(2-metil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
ES 2 766 351 T3
éster 3-[4-(3-metoxi-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico,
áster 3-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico,
éster 3-[4-(4-isopropil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico, y
éster 3-[4-(4-tert-butil-benciloxi)-fenil]-isoxazol-5-il metílico de ácido carbámico.
6. Composición farmacéutica para usar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto de fórmula I es un compuesto representado por la fórmula II:
ES11777560T 2010-05-03 2011-05-03 Composición farmacéutica para inhibir la apoptosis de neurona o la neurodegeneración Active ES2766351T3 (es)

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