CN104013621B - 用于抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物。所述药物组合物可有效地预防或治疗与神经元凋亡或神经退行性变相关的疾病。

Description

用于抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物
本申请是申请日为2011年5月3日、发明名称为“用于抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物”的中国专利申请No.201180022597.4的分案申请。
技术领域
本申请要求于2010年5月3日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2010-0041436的权益，其公开内容以参阅的方式全文并入于此。
本发明涉及用于抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物。
背景技术
正常的生理功能如神经发育或病理过程如疾病可诱导神经元的凋亡。在神经元的发育过程中，过量的神经元通过凋亡而移除，以达到突触前和突触后之间最佳、精确的连接(神经元(Neuron),40:401-413(2003)；神经元(Neuron),20:633-647(1998))。在神经退行性疾病中可观察到大范围的神经元凋亡，例如肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)，阿尔兹海默氏症(Alzheimer’s disease)和帕金森氏症(Parkinson’sdisease)，中风和外伤(external injuries)。虽然还没有发现这些疾病的直接病因，但是这与凋亡相关，且凋亡受多种因素影响，例如氧化应激、钙稳态失衡、线粒体功能障碍、产生的活性氧簇增加、兴奋性中毒、半胱天冬酶激活和营养缺失(自然评论：分子细胞生物学(Nature Reviews Molecular Cell Biology),1:120-130(2000),神经毒理学和畸形学(Neurotoxicology and Teratology),24:675-682(2002))。
关于帕金森氏症，据报道线粒体的功能障碍增加了钙的分泌和活性氧簇的产生，从而诱导氧化应激，降低抗氧化系统活性。另外，还有关于谷氨酸致神经性中毒和帕金森氏症之间关系的报道(神经毒理学和畸形学(Neurotoxicology and Teratology),24:675-682(2002))。
关于阿尔兹海默氏症，据报道神经元的凋亡与氧化应激、离子平衡失调、生长因子缺失、淀粉状物质Aβ积累、代谢功能损害、线粒体功能障碍、DNA损伤和蛋白质聚合有关(Nat.Rev.Neurosci.,7:278-294(2006)；小脑(Cerebellum),2:270-278(2003))。
目前，提出了各种类型的用于保护各种机制诱导的神经元凋亡的神经保护剂(神经毒理学和畸形学(Neurotoxicology and Teratology),24:675-682(2002))。这些神经保护剂的实例包括抗氧化剂、离子螯合剂、自由基清除剂、神经营养因子、兴奋性氨基酸拮抗剂、生物能补充剂、免疫抑制剂，以及抑制蛋白聚集和积累的制剂。然而，可有效抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物还不能商购得到，因此仍需要开发抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物。
发明内容
技术问题
本发明提供一种抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物。
本发明还提供一种用于神经保护或神经元恢复(neurorestoration)的药物组合物。
其他方面将部分描述于说明书中，这些方面遵循说明书，且其中部分通过说明书中将变得显而易见，或者可通过本发明实施方案的实践获知。
技术方案
下面将参考附图对本发明进行详述。
本发明提供一种抑制神经元凋亡或神经退行性变的药物组合物，所述组合物包括选自下组的治疗有效量的化合物：下式1表示的取代的唑类衍生物及其药用盐、取代的唑类衍生物的异构体、取代的唑类衍生物的溶剂化物及其组合，以及药用载体。
本发明还提供一种用于神经保护的药物组合物，包括选自下组的治疗有效量的化合物：下式1表示的取代的唑类衍生物及其药用盐、取代的唑类衍生物的异构体、取代的唑类衍生物的溶剂化物及其组合，以及药用载体。
本发明还提供一种用于神经元恢复的药物组合物，包括选自下组的治疗有效量的化合物：下式1表示的取代的唑类衍生物及其药用盐、取代的唑类衍生物的异构体、取代的唑类衍生物的溶剂化物及其组合，以及药用载体。
本发明还提供一种预防或治疗神经退行性疾病或缺血-或再灌注-相关疾病的药物组合物，包括选自下组的治疗有效量的化合物：下式1表示的取代的唑类衍生物及其药用盐、取代的唑类衍生物的异构体、取代的唑类衍生物的溶剂化物及其组合，以及药用载体。
本发明还提供一种预防或治疗选自下组疾病的药物组合物：中风、阿尔兹海默氏症、亨廷顿氏病、帕金森氏症、匹克氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、帕金森-ALS-痴呆综合征、威尔森氏症、多发性硬化症、进行性核上性麻痹、神经性疼痛相关的躁郁症、皮质变性、精神分裂症、注意缺陷多动障碍(ADHD)、痴呆症、肌萎缩侧索硬化、视网膜疾病、癫痫、卒中、短暂性脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血、与脑血流量暂停延长有关的外科手术引起的缺血、脑损伤、脊髓损伤、缺氧和抑郁症，所述组合物包括治疗有效量的选自下组的化合物：下式1表示的取代的唑类衍生物及其药用盐、取代的唑类衍生物的异构体、取代的唑类衍生物的溶剂化物及其组合，以及药用载体：
式1
其中，R选自取代或未取代的C1-C15芳基烷基，取代或未取代的C1-C10杂芳基烷基，及取代或未取代的、直链的、支链的或环状C1-C10烷基；
Y选自O和-N-R1；
R1选自H和直链或支链C1-C3烷基中的至少一种；
R2选自H和卤素；
A选自N、O和S；
B选自C或N；
Z选自取代或未取代的杂环基、氨基甲酸酯基、-OC(＝O)NR3R4、NH2、NR5R6、NC(＝NH)NH2和-NC(＝O)NH2；
R3和R4各自独立地选自H、未取代的或被选自NH2和NR7R8中至少一种取代的C1-C5烷基、未取代的或被C1-C3烷基取代的杂环基，或者R3和R4可一起形成未取代的或被C1-C3烷基取代的5元或7元杂环；
R5和R6各自独立地选自H，C2-C3烯烃，C2-C3炔烃，未取代的或被选自-OH、-C(O)NH2、C1-C3烷氧基和氨基甲酸酯基中至少一种取代的直链或支链C1-C7烷基；或者R5和R6可一起形成取代或未取代的脂族环胺或芳族环胺；
R7和R8各自独立地选自H和直链或支链C1-C3烷基中的至少一种；
m是0-4之间的整数；以及
n是0-5之间的整数。
所述药物组合物包括治疗有效量的选自下组的化合物：式1表示的取代的唑类衍生物，及其药用盐，取代的唑类衍生物的异构体，取代的唑类衍生物的溶剂化物，及其组合。
本文所用术语“治疗”应当理解为包括对于虽然尚未诊断出患有神经元凋亡或神经退行性变引发的疾病、紊乱或状况，但处于高风险的发展成该疾病、紊乱或状况的动物，预防所述疾病、紊乱或状况的发展，抑制疾病、紊乱或状况，即，抑制疾病、紊乱或状况的发展和减轻疾病、紊乱或状况，即疾病、紊乱或状况退行性变的原因。因此，本文所用术语“治疗有效量”是指用于达到上述药效的有效量。
式1的取代的唑类衍生物可用已知化合物或关于本发明所属的化合物合成领域的普通技术人员可以很容易制备的化合物进行制备。因此，下面将描述有关式1的取代的唑类衍生物的制备方法，其是仅以说明为目的的具体实施方式，必要时单元操作可有选择地改变，而不用来限制本发明的范围。
方案1：唑类的合成
R可为苄基，且R2、Z、B、m和n与上述定义的相同。唑类的一般合成方法可按如下方式进行：以醛(I)为起始原料制备肟(II)。在NaOCl存在下，用炔或腈对制备的肟化合物进行[3+2]环加成，得到唑类化合物(III或IV)，然后向该唑类化合物中引入所需官能团，得到最终化合物(V)。
方案2：噻唑的合成
R可为苄基，且R2、Z、B和m与上述定义的相同。噻唑的一般合成方法可按如下方式进行：以酰胺(VI)为起始原料制备噁噻唑酮(VII)。在NaOCl存在下，用炔或腈对制备的噁噻唑酮化合物进行[3+2]环加成，得到噻唑化合物(VIII)，然后将该噻唑化合物还原(IX)并向其中引入所需官能团，得到最终化合物(X)。
方案3
R、R2、Z、A、m和B与上述定义的相同。最终化合物(XIII)的一般合成方法可按如下方式进行：以化合物(XI)为起始原料通过脱苄基反应制备羟苯基衍生物(XII)，然后向其中引入所需官能团，得到最终化合物(XIII)。
方案4：
R、R1、R2、Z、A、m和B与上述定义的相同。最终化合物(XVI)的一般合成方法可按如下方式进行：以硝基苯基衍生物(XV)为起始原料进行还原反应，得到氨基苯基衍生物(XIV)，然后用所需醛对合成的化合物进行还原胺化，得到最终化合物(XVI)。
除了式1的唑类衍生物以外，所述唑类衍生物还包括药用盐，即酸或碱的加成盐，及其立体化学异构体，所述盐可以是对施用对象保持母体化合物的活性且没有不良效果的任何盐。这类盐可为无机盐或有机盐。盐的实例包括乙酸、硝酸、天冬氨酸、磺酸、硫酸、马来酸、谷氨酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、邻苯二甲酸、单宁酸、酒石酸、氢溴酸、丙酸、苯磺酸、苯甲酸、硬脂酸、乙磺酸盐、乳酸、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、草酸、丁酸、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸(camsylic acid)、碳酸、氯苯甲酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、甲苯磺酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸(gluceptic acid)、羟萘酸(pamoate)、葡萄糖酸、乙醇酰基对氨苯基胂酸(glycollylarsanilic acid)、甲基硝酸、聚半乳糖醛酸、己基雷琐辛酸(hexylresorcinoic acid)、丙二酸、海巴明酸(hydrabamic acid)、盐酸、氢碘酸、羟基萘甲酸、羟基乙磺酸、乳糖酸、苦杏仁酸、丙酸酯十二烷基硫酸(estolic acid)、粘酸、萘磺酸、粘康酸、对-硝基甲磺酸、环己胺磺酸、泛酸、一氢磷酸、二氢磷酸、水杨酸、氨基磺酸、磺胺酸、甲磺酸和茶氯酸等。此外，碱基盐形式包括例如铵盐，碱金属盐和碱土金属盐，例如锂、钠、钾、镁和钙的盐，有机碱盐例如苄星、N-甲基-D-葡糖胺和海巴明的盐，以及含有氨基酸如精氨酸和赖氨酸的盐。同时，通过合适的碱或酸处理，盐形式可转化为游离形式。本文所用术语“加成盐”是指包括式1化合物或其盐能够形成的溶剂化物的盐。这类溶剂化物可为水合物或醇合物。
本文所述术语“式1的取代的唑类衍生物的立体化学异构体”是指式1的取代的唑类衍生物具有的所有可能形式。除非另有提及或指明，式1的取代的唑类衍生物的化学名称是指所有可能的立体化学异构体的混合物，该混合物包括基本分子结构的所有非对映体和对映体。具体地，每个立体中心可具有R-或S-构型；二价环状(部分)饱和基团上的取代基可具有顺式或反式构型。包含双键的化合物可具有E-或Z-立体化学异构。所有式1的取代的唑类衍生物的立体化学异构形式显然均包含在本发明的范围内。
如上述式1所定义的，取代的唑类衍生物的实例可包括氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-[1,2,4]噁二唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-异噻唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-[1,2,4]噻二唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-2-氯-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-3-氯-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-3-溴-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-3-氟-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-3,5-二甲基-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(1-苯基-乙氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2-氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(3-氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(4-氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2,6-二氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2,3-二氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(3,5-二氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(3,4-二氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2,4,6-三氟-苄氧基)-苯基]异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(3-三氟甲基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(3-氯-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2-氯-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(4-氯-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2,6-二氯-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2,5-二氯-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2-氯-5-氟-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(3-硝基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、4-[4-(5-氨基甲酰氧基甲基-异噁唑-3-基)-苯氧基甲基]-苯甲酸甲酯、氨基甲酸3-[4-(4-甲基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(2-甲基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(3-甲氧基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、3-[4-(3-三氟甲基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(4-异丙基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(4-叔丁基-苄氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯。这些唑类衍生物的制备方法公开于本申请的发明人提交的韩国专利申请No.2009-15856中，其公开内容以参阅的方式全文并入于此。
根据本发明的实施方案，式1的取代的唑类衍生物可为氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基甲酯(CBI)，由下式II表示：
式II
同时，根据本发明的实施方案，药物组合物还包括药用载体。
药物组合物中常用于制剂的药用载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。药物组合物可进一步包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、风味增强剂、乳化剂、混悬剂和防腐剂。合适的药用载体和制剂在雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)(19th ed.,1995)中公开。
根据本发明的实施方案，药物组合物可经口服或胃肠外给药。胃肠外给药包括静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药和直肠给药。对于口服给药，对药物组合物形成的活性药物进行包衣或对药物组合物组成进行配制以防消化。另外，药物组合物可通过能将活性物质转移至靶细胞的装置给药。
根据本发明的实施方案，药物组合物的合适剂量取决于多种因素，例如配制方法、给药方法、患者年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度、反应敏感性，具有普通技术的医生可以很容易地确定对所需治疗或预防有效的药物组合物的剂量并开处方。
通过本领域公知方法，可利用药用载体和/或添加剂配制药物组合物，制成单位剂量形式或包含在多-剂量容器中。在这方面，制剂可以是油或水介质的溶液，悬浮液、乳化溶液、提取物、粉剂、颗粒、片剂或胶囊，并进一步包括分散剂或稳定剂。另外，药物组合物可作为个体药物或同其他药物一起给药，可与已有药物顺序或同时给药。
药物组合物用于抑制神经元死亡或神经退行性变。
本文所用术语“神经元”是指由胞体和从胞体伸出的突起物之一即轴突或神经突，以及若干树突组成的动物细胞，神经元的实例包括感觉神经元、运动神经元和中间神经元。另外，神经元包括组成中枢神经系统、脑、脑干、脊髓及中枢神经系统和外周神经系统的突触区、神经支持细胞、神经胶质和施万细胞的神经元。
本文所用术语“神经元的死亡”可理解为包括凋亡所致的神经元死亡。另外，本文所用术语“神经退行性变”是指神经元的结构或功能逐渐变性，包括神经元的死亡。
神经元的凋亡或神经退行性变引发多种脑疾病例如肌萎缩侧索硬化、阿尔兹海默氏症、帕金森氏症的事实在本领域是公知的，为了预防或治疗这些疾病，关于神经元凋亡机制的研究已经进行。自然评论：分子细胞生物学(Nature Reviews Molecular CellBiology)1:120-130(2000)和细胞和分子药物杂志(Journal of Cellular and MolecularMedicine),12:2263-2280(2008)公开了神经元的凋亡是多种疾病的病因，例如阿尔兹海默氏症、帕金森氏症、亨廷顿氏病、局部缺血、中风和硬化症，通过研究关于可引起氧化应激和线粒体功能障碍的神经元的凋亡机制，已发现可预防或治疗神经退行性疾病的方法。因此，医学领域中的普通技术人员可清楚地了解包含对抑制神经元凋亡或神经退行性变有作用的化合物的组合物可用于预防或治疗上述疾病。
根据本发明的实施方案，药物组合物可用于神经保护。
本文所用术语“神经保护”是指神经系统内保护神经元免于凋亡或变性的机制，特别是指减少、抑制或减轻神经损伤的作用，也指保护、恢复或再生神经损伤破坏的神经组织中的神经元。另外，术语“神经保护”是本发明所属技术领域的人员通用的标准用语(NeuroReport,9:3955-3959(1998)；Chen,J-F.,J.Neurosci.,21:RC143(2001))。本文所用术语“神经元细胞的保护”是指减少或改善神经元损伤的机制，或保护或再生神经元损伤破坏的神经元。另外，本文所用术语“神经元损伤”是指多种因素引起的神经元或神经元组织损伤(例如，代谢因子、毒性因子、神经毒性因子和化学因子)。神经损伤的实例包括氧化应激、钙稳态失衡、线粒体功能障碍、兴奋性中毒、半胱天冬酶激活、营养缺失(自然评论：分子细胞生物学(Nature Reviews Molecular Cel l Biology)1:120-130(2000),神经毒理学和畸形学(Neurotoxicology and Teratology)24:675-682(2002))。该药物组合物具有抑制各种神经损伤引起的神经元的凋亡和神经退行性变的作用或保护神经元免于神经损伤的作用。例如，在上述神经元损伤中，氧化应激是与神经元凋亡和变性相关的疾病，可引发各种疾病，例如阿尔兹海默氏症、肌萎缩侧索硬化、脱髓鞘性病、糖尿病多发神经病变、唐氏综合征、HIV神经病变、亨廷顿氏病、多系统萎缩症、帕金森氏症、中风和缺血-再灌注损伤、Tau病和外伤性脑损伤。同时，已知抗活性氧簇的抗氧化物酶的活性增加也是神经保护机制之一(自由基生物学与药物(Free radical Biology&Medicine),33(2):182-191(2002))。因此，药物组合物可通过诱导活性氧簇减少抑制氧化应激，从而抑制神经元凋亡，由此可用于预防或治疗上述各种疾病。
相应地，药物组合物可用于神经保护剂，其可用于保护大脑和脊髓免于局部缺血、癫痫、抽搐或跌打损伤的损害。
本发明实施方案中药物组合物可用于神经元恢复。
本文所用术语“神经元恢复”是指通过促进神经元中形成新的突触连接进行损伤神经系统的恢复。神经元恢复可指受损神经元引起的功能障碍的恢复。例如，神经元恢复是指神经细胞中神经突的形成和生长，其用于周围细胞间的交流或增加突触棘的数量。
通过神经元恢复抑制或治疗神经系统的多种疾病的事实在本领域中是公知的。神经毒性研究(Neurotoxicity Research),2:71-84(2000)公开了通过用于神经元恢复的药物抑制或治疗特定疾病的可能性，例如亨廷顿氏病、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化和阿尔兹海默氏症，WO07/022182公开了疾病如亨廷顿氏病和通过中枢神经系统的神经元恢复治疗的可能。
如上所述，神经元的凋亡或神经退行性变由多种神经损伤引起，并与多种神经退行性疾病相关，因此本发明实施方案的药物组合物通过抑制各种神经损伤对抑制或治疗神经退行性疾病有效。
本发明实施方案的药物组合物可用于抑制或治疗神经退行性疾病或缺血-或再灌注-相关疾病。
药物组合物治疗的神经退行性疾病的实例包括但不局限于亨廷顿氏病、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化。另外，药物组合物治疗的缺血-或再灌注-相关疾病的实例包括但不局限于缺血性发作、短暂脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血和与脑血流量暂停延长有关的外科手术引起的缺血。
本发明实施方案的药物组合物可用于抑制或治疗选自下组的疾病：中风、阿尔兹海默氏症、亨廷顿氏病、帕金森氏症、匹克氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、帕金森-ALS-痴呆综合征、威尔森氏症、多发性硬化症、进行性核上性麻痹、神经性疼痛相关的躁郁症、皮质变性、精神分裂症、注意缺陷多动障碍(ADHD)、痴呆症、肌萎缩侧索硬化、视网膜疾病、癫痫、卒中、短暂性脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血、与脑血流量暂停延长有关的外科手术引起的缺血、脑损伤、脊髓损伤、缺氧和抑郁症。
本发明的实施方案中，提供一种治疗神经元的凋亡或神经退行性变相关疾病的方法，该方法包括将对象与药物组合物接触。该方法可包括抑制神经元的凋亡或神经退行性变的方法，包括将对象与药物组合物接触。所述疾病选自中风、阿尔兹海默氏症、亨廷顿氏病、帕金森氏症、匹克氏病、克罗伊茨费尔特-雅各布病、帕金森-ALS-痴呆综合征、威尔森氏症、多发性硬化症、进行性核上性麻痹、神经性疼痛相关的躁郁症、皮质变性、精神分裂症、注意缺陷多动障碍(ADHD)、痴呆症、肌萎缩侧索硬化、视网膜疾病、癫痫、卒中、短暂性脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血、与脑血流量暂停延长有关的外科手术引起的缺血、脑损伤、脊髓损伤、缺氧和抑郁症。
接触过程可在体外或体内进行，在体内进行的接触过程，该方法包括给对象施用药物组合物。
对象可以是细胞、组织、器官或个体。另外，施用过程可通过将药物组合物溶解于合适的缓冲液，然后直接接触细胞、组织或器官而进行，或通过对个体进行胃肠外给药。上述治疗方法中用到的药物组合物和给药方法的详细描述已在上述提供，因此本文不再提供以避免过度复杂。
药物组合物施加的对象包括所有动物。例如，动物可为人类、狗、猫或小鼠。
下面将参考以下实施例对本发明的一个或更多实施方案进一步详细描述。然而，这些实施例仅用于解释性目的，并不能用于限制本发明一个或更多实施方案的范围。
附图说明
参考附图及其示例性实施方案的详细描述，本发明的上述和其他特征和优势将更显而易见。
图1为显示本发明实施方案中施用CBI的MPTP-诱导的猴子的帕金森氏症程度图表；
图2为显示本发明实施方案中施用CBI的MPTP-诱导的猴子的中间纹状体和尾部纹状体中是否存在多巴胺转运体的显微镜图像；
图3为显示本发明实施方案中施用CBI的MPTP-诱导的猴子的悬尾试验结果的图表；
图4为显示本发明实施方案中施用CBI的MPTP-诱导的小鼠的纹状体中多巴胺浓度图表；
图5为显示本发明实施方案中施用CBI的MPTP-诱导的小鼠的黑质神经元减少程度图表；
图6为显示本发明实施方案中利用酪氨酸羟化酶作为抗体的免疫组化染色和甲酚紫染色观察到的施用CBI的6-OHDA-诱导的大鼠的黑质系统中神经元的减少程度图表；
图7为显示本发明实施方案中施用CBI的丙二酸酯-诱导的小鼠的纹状体是否从损伤中恢复的图像；
图8为显示本发明实施方案中施用CBI的丙二酸酯-诱导的小鼠的纹状体从损伤中恢复的恢复程度图表；
图9为显示本发明实施方案中用CBI处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的凋亡程度图表；
图10为显示本发明实施方案中用CBI处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的Bcl-2mRNA量的测量结果图表；
图11为显示本发明实施方案中用CBI处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的Bcl-2和Bcl-xL蛋白量的测量结果图；
图12为显示本发明实施方案中用CBI处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的BDNFmRNA量的测量结果图表；
图13为显示本发明实施方案中用CBI处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的GDNFmRNA量的测量结果图表；
图14为显示本发明实施方案中用CBI处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的NGFmRNA量的测量结果图表；
图15为显示本发明实施方案中施用CBI的小鼠的NGF mRNA量的测量结果图表；
图16为显示本发明实施方案中用CBI和MPP+处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的线粒体跨膜电位的图表；
图17为显示本发明实施方案中用CBI和MPP+处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的胞质中细胞色素C量的测量结果图表；
图18为显示本发明实施方案中用CBI和MPP+处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的半胱天冬酶-3活性的测量结果图表；
图19为显示本发明实施方案中用CBI和MPP+处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞的活性氧簇的显微镜图像；
图20为显示本发明实施方案中用CBI和MPP+处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞中存在的活性氧簇的图表；
图21为显示本发明实施方案中用CBI和MPP+处理的MAO-B-缺陷型SH-SY5Y细胞中过氧化氢酶，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性的测量结果图表；
图22为显示本发明实施方案中施用CBI的小鼠的纹状体和黑质中过氧化氢酶、SOD和GPx活性的测量结果图表；
图23为显示本发明实施方案中施用CBI的MPTP-诱导的小鼠的神经突是否恢复的显微镜图像和分析图表；和
图24为显示本发明实施方案中施用CBI的MPTP-诱导的小鼠的突出棘(spine)是否恢复的显微镜图像和分析图表。
具体实施方式
现在将详细参考实施方案，其实施例在附图中示出，其中相同的参考标记表示相同的要素。在这方面，实施方案可具有不同的形式，并且不应当被解释为限于这里所阐述的描述。相应地，各实施方案通过参照附图仅是说明性的，以解释本说明书的各方面。
实施例1：氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基甲酯(式II)的制备
式II
1.1.4-苄氧基-苯甲醛肟的合成
将4.24g4-苄氧基-苯甲醛(20mmol)溶解于0.2M的乙醇与水(3:1，100ml)的混合溶液中，然后搅拌。向此混合物中加入2.78gNH2OH-HCl(40mmol)和2.46g乙酸钠(30mmol)，室温下搅拌约30min。之后，利用液相色谱确认反应完全，然后减压蒸馏除去水和乙醇，得到淡黄色固体化合物。将该淡黄色固体化合物用水和乙酸乙酯萃取三次，减压干燥有机层，得到粗产物，然后用己烷/乙酸乙酯溶液(10:1)进行纯化，得到白色固体化合物。得到的固体化合物无需额外纯化，用于后续反应。
1.2.[3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基]甲醇的合成
将2.27g4-苄氧基-苯甲醛肟(10mmol，纯度92％)溶解在40ml二氯甲烷(0.25M)中，向所得溶液中加入1.77ml炔丙醇(30mmol)。在0，℃用滴液漏斗向所得溶液中非常缓慢地滴加13.7ml10％的NaCl(20mmol)。加完NaOCl后，将混合物搅拌约5h，同时缓慢升温至室温。之后，利用液相色谱确认反应完全，减压蒸馏混合物除去二氯甲烷。向残余物中加200ml水，滤出所得固体。用过量的水洗涤滤出的化合物，然后用乙醚洗涤得到固体化合物。用乙酸乙酯/己烷溶液(1:2)对得到的固体化合物进行纯化，得到[3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基]甲醇白色固体(产量：2.5g)。
1H-NMR(CDCl3,200MHz)d7.7(d,2H),7.4(m,4H),7.1(d,2H),6.5(s,1H),5.1(s,2H),4.8(s,2H)。
1.3.氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基]甲酯的合成
在-78℃下将1.04ml(12mmol)的磺酰氯异氰酸酯缓慢加入THF(50ml，0.2M)和[3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基]甲醇(2.813g，10mmol)的溶液中，置于250ml烧瓶内。之后，利用液相色谱确认起始原料耗尽，然后在所得反应溶液中加水。1小时后，将所得溶液减压蒸馏，从中除去THF，向产物中加入100ml水，滤出所得固体。滤出的固体分别用100ml水和乙酸乙酯/己烷溶液(1:2)洗涤，然后干燥，得到3.4g粗产物(纯度：95.9％)。在含1％甲醇的乙酸乙酯/己烷/二氯甲烷(1:4:1)溶液中对粗产物进行纯化，得到2.743g氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基]甲酯(CBI)，纯度99％。
1H-NMR(CDCl3,200MHz)δ7.7(d,2H),7.4(m,4H),7.1(d,2H),6.6(s,1H),5.2(s,2H),5.1(s,2H),4.8(brs,2H)。
实施例2：利用MPTP-诱导的猴验证CBI的神经保护作用
据报道1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)可诱导出与帕金森氏症患者观察到的相似的临床、生物化学和病理特点，公知被作为广泛用于制作帕金森氏症动物模型的神经毒素(J.Neural Transm.,103:987-1041(1996)；Neurotoxicol.Teratol.24:607-620(2002)。MPTP经单氧化酶(MAO)-B转化为1-甲基-4-苯基-吡啶鎓(pyridinium)离子(MPP+)，MPP+对多巴胺转运蛋白(DAT)具有高亲和力，并诱导线粒体功能障碍和氧化应激，导致可诱导多巴胺形成的多巴胺能神经元凋亡(J.Neurochem.,61:1191-1206(1993)；J.NeuralTransm.,103:987-1041(1996)；Mov.Disord.,13:35-38(1998)；Restor.Neurol.Neurosci.,16:135-142(2000))。
利用猕猴(n＝35，3-4岁)作为实验模型。将猕猴划分为三组，每组通过静脉注射施加0.2mg/kg MPTP(一天一次，每天注射，直至帕金森氏症评分达到8，或注射14天)。给药14天后的次日，分别对三组口服给予赋形剂(对照)、1mg/kg CBI和1mg/kg雷沙吉兰(利用美国专利申请No.5,457,133公开的制备R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚雷沙吉兰(aminoindanrasagiline)的方法制备)4周，测量帕金森氏症评分的变化。另外，为验证CBI作为多巴胺激动药的效果，将存在于MPTP诱导的猴模型中取出的中间纹状体和尾部纹状体中的多巴胺转运体进行多巴胺转运体结合试验。
实施例2-1：帕金森氏症程度的测量
通过分析每组猴的视频录像行为测量帕金森氏症的程度，基于四个标准：a)活动范围，b)运动功能减退，c)异常姿势程度，和d)震颤。帕金森氏症评分通过(4-活动范围)+运动减少+异常姿势程度+震颤的总和进行评价。由此，帕金森氏症总评分的最大值为10。2h内每30min进行测量帕金森氏症评分10min。即帕金森氏症最高评分的最大值是40。同时，基于这四个标准完成的测量方法如下，以下评价分数表示在观察期观察到的代表性行为：
a)活动范围评分：0＝没有活动；1＝仅头部活动；2＝头部、四肢和/或身体活动，锻炼不少于观察时间的30％；3＝步行/步行或爬笼壁，不长于观察时间的30％；4＝步行/步行或爬笼壁，不少于观察时间的30％。
b)运动功能减退评分：0＝正常的运动速度和开始运动正常；1＝运动轻微缓慢；2＝运动中速缓慢，开始和保持运动困难，身体明显僵直；3＝锻炼无能，身体持续僵直，导致运动无能。
c)异常姿势程度评分：0＝正常，良好姿势，能抬头，平衡正常；1＝身体弯曲，能抬头；2＝身体弯曲，不能仰脖和抬头，丧失平衡。
d)震颤评分：0＝无；1＝有。
根据帕金森氏症程度的测量结果，可证实与施用已知用于治疗帕金森氏症的雷沙吉兰的猴子组相比，施用CBI的猴子组显示帕金森氏症的程度明显减少(参考图1)。
实施例2-2：多巴胺转运蛋白结合的分析
从每组猴中取出大脑，从中分离脑干，沿中线将大脑半球分成两半。-45℃将组织浸泡于异戊烷，速冻，-80保℃存。在-17℃恒冷切片机中制备大脑半球的冠状面切面，厚度20μm，之后解冻。将解冻产物装在涂有明胶的载玻片上，之后立即干燥，-80保℃存。
根据用于验证多巴胺神经末梢的常规方法(D.Guilloteau等,1998)，利用甲锡烷基前体化合物完成用放射性元素[125I]-(E)-N-(3-碘代丙-2-苯基)-2β羧甲基-3β(4'-甲基苯基)-去甲莨菪烷(PE2I)标记多巴胺转运蛋白结合。纯化产物，得到活性2000Ci/mmol的无载体添加形式的[125I]PE2I。利用现有技术(S.Chalon等,1999；E.Bezard等,2001)中公开的方法，将大脑半球的冠状面切片在100pM[125I]PE2I pH7.4的磷酸盐缓冲液(NaH2PO410.14mM,NaCl137mM,KCl2.7mM,KH2PO41.76mM)中在25℃孵育90min。相邻切片在100μM可卡因(Sigma,St Louis,MO)中孵育，并验证非特异性结合。孵育之后，将切片用磷酸盐缓冲液在4℃洗涤两次，每次20min，用蒸馏水在4℃冲洗1秒。将得到的切片在室温干燥，在X-射线胶片暗匣中，与[125I]-微量(Amersham)一同曝光于β射线-敏感胶片(Hyperfilmβmax,Amersham,Buckingamshire,UK)3天，测量结合域特定区域的放射活性。
如图2所示，施用CBI的猴组显示在中间纹状体和尾部纹状体中有大量多巴胺转运蛋白，比施用与CBI等量的雷沙吉兰的猴组显示的多巴胺转运蛋白的量明显增多。结果表明CBI可有效抑制多巴胺能神经元的凋亡，MPTP导致的转运蛋白的损耗比对照组或施用雷沙吉兰的猴组相对较低。从此结果中可验证CBI可实现神经保护，包括抑制帕金森氏症的进展。
实施例3：利用MPTP-诱导的小鼠模型的CBI的神经保护作用
利用C57BL/6小鼠(n＝94，8周龄；雄性)作为实验模型(品系：C57BL/6NCrljBgi,ORIENT BIO INC)。通过腹腔内注射向小鼠施用30mg/kg MPTP，每天1次，共4天。最后1天施用的4天后，将小鼠分成三组，分别对三组口服施用赋形剂(对照)，1mg/kg CBI和1mg/kg雷沙吉兰，每天1次，共10天。最后1天施用后次日，对每组进行悬尾试验(TST)，从每组小鼠中取出纹状体和黑质脑组织，测量纹状体中多巴胺和代谢产物的浓度以及黑质中神经元的减少程度。
实施例3-1：通过悬尾试验分析小鼠的行为
根据施用的MPTP和药物，进行悬尾试验测量行为丧失原因的程度。TST试验以此种方式进行，将上述化合物分别施用于三组后7天，将宽度1cm的圆形不锈钢棍在位于35cm高度处固定于宽16cm和高40cm的笼子上，其左、右侧有黑色木头覆盖。在总共6min时间内，测量小鼠的运动时间，单位为秒，由此评价药物的作用。
由TST分析可知，在施用MPTP的小鼠组显示的行为丧失有意义时，与施用雷沙吉兰的MPTP-诱导的小鼠相比，施用CBI的MPTP-诱导的小鼠显示的行为程度与正常小鼠的行为相同，显示了很好的行为恢复能力。
实施例3-2：纹状体中多巴胺及其代谢产物的测量
根据施用的MPTP和上述化合物，利用高效液相色谱(HPLC)测量纹状体中多巴胺及其代谢产物量的变化。分别对三组施用上述化合物7天后，通过颈脱位法处死每组小鼠，从小鼠中迅速取出脑组织。从脑组织中收集纹状体，将0.5ml HPLC检测稀释液(0.1M HClO4,0.1mM EDTA)加入纹状体，利用超声波处理器制备组织匀浆。将匀浆以12000rpm离心15min，用消化纤维素滤膜(0.2μm,Millipore)过滤上清。对于HPLC分析，利用HR-80柱(80mmx4.6mm,粒径:3μm,ESA,USA)，流动相(0.07M磷酸氢二钠，1mM辛磺酸钠，0.1μM EDTA,5％乙腈，pH3.2)的流速维持0.7ml/min，电化学检测器(Coulochem III,ESA,USA)的电极电势为E1＝-100mV,E2＝350mV。
通过实验分析纹状体中多巴胺的浓度，证实与正常小鼠相比，施用雷沙吉兰的小鼠组显示多巴胺浓度恢复至约40％，而与正常小鼠相比，施用CBI的MPTP-诱导的小鼠显示多巴胺浓度恢复至约70％(参见图4)。
实施例3-3：利用酪氨酸羟化酶抗体的免疫化学染色
根据施用的上述化合物，利用免疫化学染色法测量纹状体和黑质中抗酪氨酸羟化酶抗体表达的变化。用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉每组小鼠，打开小鼠胸腔，向心脏灌注200ml0.1M的PBS(pH7.4)，由此使血液移至血管中。血液全部移除后，向心脏内灌注250-300ml4％的多聚甲醛/PBS固定溶液。取出大脑，在冷冻条件下用多聚甲醛/PBS固定溶液对大脑进行后固定24h。之后用PBS彻底洗涤脑组织除去固定溶液，防止冷冻过程中产生的冰结晶。将得到的脑组织置于30％蔗糖溶液中保存直至下沉。用冻结包埋剂(OCT化合物)将所得的组织包埋并在-40℃冻结。用恒冷切片机(Reichert Frigocut model2000)制备包含纹状体和黑质的中脑部的连续冠状面切片，厚度40μm。冠状面切片在3％H2O2/PBS中维持30min，之后在含有0.3％TritonX-100和3％牛血清白蛋白的0.1M PBS中维持30min。为选择性对包含多巴胺的细胞染色，将切片与作为一抗的抗小鼠单克隆抗体TH(ChemiconInternational,Temecula,CA；1:500)反应，室温过夜。将生物素羊抗鼠IgG(Vector Lab,Burlingame,CA,1:200)用作二抗。之后，用Vectastain elite ABC试剂盒(Vector Lab,Burlingame,CA)诱导亲和素-生物素结合，用3,4-二氨基联苯(DAB)对组织进行染色显像。将得到的组织置于PBS，装于载玻片上，干燥所得物，用盖玻片覆盖。用配置有200x放大倍数的数字照相机(Olympus BX-60,日本奥林巴斯光学公司)的显微镜对所得物的中脑部的黑质进行观察。观察和记录对抗酪氨酸羟化酶抗体呈阳性反应的细胞，用Graph pad Prism4程序进行统计学分析(单因素方差)。
通过分析上述抗酪氨酸羟化酶抗体的免疫组化染色分析黑质中神经元的减少程度，MPTP-诱导的施用CBI的组显示的黑质中神经元减少程度与MPTP-诱导的施用雷沙吉兰的组相同(参考图5)。结果证实CBI作为多巴胺激动药有功效，能够实现神经保护，比传统多巴胺激动药雷沙吉兰的效果更好。
实施例4：利用6-OHDA-诱导的大鼠模型确认CBI的神经保护作用
已知6-羟基多巴胺(6-OHDA)是增加羟基自由基形成的神经毒素，因此会诱导黑质和纹状体中神经元的变性。羟基自由基可迅速破坏神经元的末梢部(J.Neural.Transm.,103:987-1041(1996)；J.Neurosci.,19:1284-1293(1999))，因此引起黑质致密部(SNpc)细胞的逐渐丧失，已知这种丧失与早期帕金森氏症患者观察到的黑质和纹状体中的逐渐变性相似(Brain Res.,26:301-307(1991)；Neurosci.,59:401-415(1994)；Neurosci.,67:631-647(1995)；Neurosci.,72:641-653(1996))。
利用ORIENT BIO INC.提供的Wistar大鼠(赋形剂和CBI，n＝7，雷沙吉兰n＝6；6周龄，20只雄性大鼠)作为实验模型。对每只大鼠的纹状体，单侧注射3μl包含20 μg/μl 6-OHDA的溶液(位置：前-1.0 mm，后-3.0 mm，后腹部-5.0 mm)，诱导纹状体中神经元的变性。将大鼠分成三组，在施用6-OHDA前1h，分别对三组口服施用赋形剂(对照)、1mg/kg CBI和1mg/kg雷沙吉兰，隔天一次，共6周。最后1天施用后4、5和6周，对每组进行阿扑吗啡诱导的旋转试验。阿扑吗啡诱导的旋转试验以如下方式进行，通过腹腔注射向每组大鼠施用0.5mg/kg阿扑吗啡，将每组大鼠置于旋转槽上，对其旋转运动记录45min，测量每组大鼠的分钟旋转数来测定其平均值。最后1天施用后6周完成阿扑吗啡诱导的旋转试验，之后处死每组大鼠，利用抗酪氨酸羟化酶抗体和甲酚紫染色进行免疫组化染色，验证黑质致密部神经元的减少程度。如上述实施例3-3所示，制备包含黑质的中脑部的连续切片，切片放于PBS中，将得到的切片加到硅烷覆盖的载玻片上并干燥，将载玻片分别置于二甲苯、100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇、蒸馏水中5min、2min、1min、1min和2min。之后，将得到的载玻片浸泡于1％甲酚紫溶液中5min并分别用蒸馏水、70％乙醇、95％乙醇、100％乙醇和二甲苯洗涤2min、1min、1min、2min和5min，用盖玻片盖住载玻片，用配置有数字照相机(Olympus BX-60, 日本奥林巴斯光学公司)的显微镜观察。用200 x放大倍数观察中脑部的黑质。观察和记录对甲酚紫呈阳性反应的细胞，用Graph pad Prism 4程序进行统计学分析(单因素方差)。
如图6所示，6-OHDA-诱导的施用CBI的大鼠组显示神经元减少程度明显降低，比6-OHDA-诱导的施用雷沙吉兰的大鼠组效果更好。
实施例5：利用丙二酸酯-诱导的小鼠模型验证CBI的神经保护作用
丙二酸酯是琥珀酸脱氢酶的可逆抑制剂，其为线粒体酶，已知可抑制线粒体的电子传递体系，从而诱导兴奋性中毒神经元的变性，或增加从纹状体中释放多巴胺从而引起纹状体的丧失。线粒体中生物能不足与多种神经退行性疾病的病理现象有关，例如帕金森氏症、亨廷顿氏病、阿尔兹海默氏症、肌萎缩侧索硬化，(Ann.Neurol.,58:495-505(2005)；Nat.Rev.Neurosci.,7:278-294(2006))。将丙二酸酯注射入动物纹状体引起的丢失与局部缺血或亨廷顿氏病观察到的相似(Experimental Neurology,178:301-305(2002))。这会引起几组神经元的代谢性应激，导致黑质和纹状体多巴胺细胞的细胞体中多巴胺量减少(J.Neurochem.,61:1147-1150(1993)；Brain Res.,773:223-226(1997)；Neuroscience,96:309-316(2000))。
利用ICR小鼠(n＝34，10周龄；雄性)作为实验模型。通过对每只小鼠腹腔内注射5ml/kg equithesin进行麻醉，将立体定向仪的两校平机在外耳道处设定为0mm，在立体定向仪中将小鼠颅骨穿破，前(AP)0.5mm，右侧纹状体旁侧(前卤点)1.2mm，硬脑膜物下3.1mm，以0.2mg/ml抗坏血酸用作对照，对损伤组和化合物处理组用汉密尔顿注射器(10μl,26G针头)以1μL/min速度注入2.4μmol/2μl丙二酸酯。将施用丙二酸酯的组分成两组，在术前2h和术后1h、1天、2天和3天，即总共5次通过腹腔内注射，分别对两组施用0.5ml/kg赋形剂(n＝12)和5mg/kg CBI(n＝14)。将丙二酸酯注入小鼠纹状体，3天后处死小鼠，从小鼠中取出大脑制备切片。之后用对切片进行2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)染色。
如图7和8所示，证实CBI可抑制丙二酸酯诱导的纹状体神经元的凋亡，由此可明显减少纹状体的损伤部。因此，结果表明CBI可减轻线粒体损伤引起的神经元凋亡。
实施例6：利用神经元的抗凋亡验证CBI的神经保护作用
许多神经退行性疾病，例如中风、脑损伤、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、阿尔兹海默氏症和帕金森氏症均以神经元凋亡为特征(新英格兰医学期刊(The NewEngland Journal of Medicine),348:1365(2003))，已知慢性神经退行性疾病是由若干外因或内因凋亡通路的诱导引发的。为了阐明发生在神经元凋亡中的生物化学和分子生物学改变，正在进行寻找在神经元凋亡步骤中或神经保护药物治疗中表现出多方向机制的物质(CNS drugs,19:723(2005)；Nat.Rev.Neurosci.,7:295(2006))。
参考图6-10，CBI可抑制几种内因或外因引起的神经元的凋亡，因此对神经退行性疾病表现出治疗效果。
该实施方案中，使用MAO-B缺陷型人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank))。用血清饥饿法诱导人神经母细胞瘤的凋亡。将常规培养基中培养的MAO-B缺陷型人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞以1.8×105个细胞/孔的浓度分散至六孔板中，孵育1天，用含有CBI(0.1、1和10μM)的无血清培养基，或含有雷沙吉兰(0.1、1和10μM)的无血清培养基，不含CBI或雷沙吉兰的无血清培养基更换培养基，细胞进一步在5％CO2，37℃孵育48h。之后，以未引起神经元凋亡为对照，以百分比表示死亡细胞数。
如图9所示，证实当在凋亡诱导的神经元中施用CBI时，神经元凋亡的程度降低。尤其是证实在凋亡诱导的神经元中施用10μMCBI，神经元凋亡的降低程度更高。即，其为施用10μM雷沙吉兰的凋亡诱导的神经元的约33％。
同时，在调节或抑制凋亡的过程中涉及多种信号转导蛋白，其代表性实例包括Bcl-2基因家族蛋白(生物能与生物膜杂志(Journal of Bioenergetics andBiomembranes),37:179-190(2005)；J.Cell Mol.Med.,7:249-257(2003)；基因和发育(Genes and Development),13:1899-1911(1999))。如上所述，将0.1μM、1μM和10μM CBI或0.1μM、1μM和10μM雷沙吉兰分别加入凋亡诱导的细胞中，得到的细胞进一步在5％CO2，37℃孵育24h。从培养细胞中提取mRNA或得到细胞提取物，测量Bcl-2 mRNA的量和Bcl-2和Bcl-xL蛋白的量。利用实时RT-PCR测量Bcl-2 mRNA的量，并用蛋白质印迹法测量Bcl-2和Bcl-xL蛋白的量。
无血清培养基中CBI或雷沙吉兰处理SH-SY5Y细胞24h后，用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取SH-SY5Y细胞的中的总RNA，利用高容量cDNA逆转录试剂盒(Biosystems提供)逆转录2μg总RNA，之后利用Bcl-2的TaqMan探针(Biosystems提供，美国)完成实时PCR(Biosystems提供，7500实时定量体系)。扩增18S RNA的mRNA作为内对照。通过ddCt方法(Takekawa,1998)测定目标基因的mRNA水平的相对量。
对于蛋白质印迹法，将SH-SY5Y细胞溶解于RIPA缓冲液(50mM Tris-Cl pH7.4,1％NP-40,0.25％去氧胆酸钠,0.1％SDS,150mM NaCl,1mM EDTA)，离心得到细胞提取物。之后，将细胞提取物进行定量，等量的细胞提取物载于SDS-PAGE凝胶上电泳，将凝胶转移至硝酸纤维素膜，通过现有技术中公知方法将抗体分别稀释至1:5000，用抗Bcl-2(Cat#:2872,细胞信号转导(Cell Signaling),USA)抗体和抗Bcl-xL(Cat#:2762,细胞信号转导(CellSignaling),USA)抗体对膜进行印迹，利用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia)测定Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表达量。抗β-actin(Cat#:A2228,Sigma,USA)抗体作为对照，并测定β-actin的蛋白表达量。
如图10和11所示，证实在用CBI处理凋亡诱导的神经元的情况下，具有抗凋亡功能的Bcl-2蛋白的mRNA量比对照高1.5-2倍，Bcl-2蛋白的量比对照高1.5-2倍。另外，证实另一种抗凋亡蛋白Bcl-xL的量也高于对照组。从此结果证实CBI具有抑制神经元凋亡的效果，并具有神经元保护作用。
实施例7：通过诱导神经营养因子的表达验证CBI的神经保护作用
神经营养因子在神经元的发展、再生和修复中起着关键作用，神经营养因子的实例包括脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞原性神经营养因子(GDNF)，和神经生长因子(NGF)。神经营养因子的诱导能够抑制神经元的凋亡(自然医学(Nature medicine),15:331-337(2009)；脑研究通报杂志(Brain Research Bulletin),57:817-822(2002)；神经科学杂志(The Journal of Neuroscience),21:8108-8118(2001)；药理学和实验性疗法杂志(The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics),322:59-69(2007)；药理科学趋势(TRENDS in Pharmacological Sciences),27:619-625(2006))。
通过应用于实施例6相同的方法，将0.1μM、1μM和10μM CBI或0.1μM、1μM和10μM雷沙吉兰分别加入凋亡诱导的细胞中，得到的细胞进一步在5％CO2，37℃孵育24h。从培养细胞中提取mRNA，通过实时RT-PCR测量BDNF、GDNF和NGF的mRNA量。
如图12-14所示，证实在用CBI处理凋亡诱导的神经元的情况下，BDNF、GDNF和NGF的mRNA量分别比对照组高1.5-2倍、4-8倍和2-2.5倍。
另外，为证实CBI处理在体内是否诱导神经营养因子，利用了C57BL/6小鼠(n＝12，8周龄，雄性，ORIENT BIO INC.)。将小鼠分成三组(每组n＝4)，分别对未经神经毒素处理的三组口服施用赋形剂(对照)、1mg/kg CBI和1mg/kg雷沙吉兰，1天1次，8天。最后1天施用后第二天，从每组小鼠中取出纹状体和黑质。从取出组织的细胞中提取mRNA，通过实时RT-PCR测量NGF的mRNA量。
如图15所示，证实在CBI处理的小鼠组中，纹状体中NGF的mRNA量比另外一组小鼠高1.7-2.5倍。特别是，证实关于CBI处理的小鼠组，纹状体中NGF的表达高于雷沙吉兰处理组。结果表明CBI诱导神经元的神经营养因子的表达，由此能够抑制神经元的凋亡。
实施例8：通过改善神经元中线粒体的功能验证CBI的神经保护作用
在此实施方案中，使用MAO-B缺陷型人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank))。细胞在DMEM培养基中5％CO2，37℃孵育24h。将培养细胞划分为5组，每组加入2mM1-甲基-4-苯基-吡啶鎓离子(MPP+)，5组中的3组分别用1nM、10nM和50nM CBI处理，另外2组中1组用10nM雷沙吉兰处理，并且用CBI-或雷沙吉兰-处理的4组进一步在5％CO2，37℃孵育24h。如上所述，将仅加MPP+的组在相同条件下孵育。之后，根据厂家的说明书，利用MitoPTtm试剂盒(Immunochemistry Technology)检测线粒体的跨膜电位。用荧光板读器测定线粒体的跨膜电位。线粒体的跨膜电位低时，显示绿色荧光，另一方面，其很高时，显示红色荧光。由此，从结果中可测定RFU值(红色荧光值/绿色荧光值)，结果如图16所示。
MPP+降低线粒体的跨膜电位，从而诱导线粒体膜的不稳定性。线粒体膜透化作用是凋亡中的必要过程，由此线粒体膜的稳定性能成为抗凋亡的机制(Brain Res.Rev.,29:1-25(1999))。如图16所示，证实关于加入MPP+的神经元，对于CBI处理，线粒体跨膜电位是浓度依赖性的稳定。线粒体跨膜电位的稳定作用比与CBI相同浓度雷沙吉兰处理组高不少于2倍。
如上所述，许多神经退行性疾病，例如中风、脑损伤、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、阿尔兹海默氏症和帕金森氏症均以神经元凋亡为特征(新英格兰医学期刊(The New England Journal of Medicine),348:1365(2003))，已知慢性神经退行性疾病是由若干外因或内因凋亡通路的诱导引发的。另外，线粒体膜的稳定性是抗凋亡的机制，已知神经元的凋亡可被Bcl-2或Bcl-xL蛋白抑制，此蛋白可使线粒体膜稳定(BiochemBiophys Res Commun.,304(3):433-435(2003)；N Engl J Med.,348(14):1365-1375(2003)；Brain Res Rev.,29(1):1-25(1999)；神经科学杂志(Journal of NeurologicalSciences),283:240-320(2009))。因此，结果表明CBI可稳定线粒体的跨膜电位，由此能够预防或治疗上述神经退行性疾病。
另外，已知凋亡可由线粒体中细胞色素C的释放和半胱天冬酶3的激活机制引发(新英格兰医学期刊(The New England journal o f Medicine),348:1365-1375(2003))。为证实CBI处理的线粒体的跨膜电位的稳定性与神经元的抗凋亡有关，从这些细胞组中获取细胞提取物，由此可测量细胞质中细胞色素C的量和半胱天冬酶3的活性。
实施例8-1：测量细胞色素C的释放
SH-SY5Y细胞在与实施例7所述相同的条件下孵育，PBS洗涤。在高渗缓冲液(20mMHEPES,10mM KCl,2mM MgCl2,1mM EDTA)中加入蛋白酶抑制剂混合物(罗氏)和磷酸酶抑制剂混合物(罗氏)。用100μl所得溶液处理SH-SY5Y细胞，均匀悬浮。所得无置于冰上维持30min，12000rpm离心20min。之后，取等量上清载于SDS-PAGE凝胶上电泳，凝胶转移至硝酸纤维素膜。通过现有技术中公知方法将细胞色素C(Santacruz,sc13156)稀释至1:2000，进行膜印迹，利用ECL试剂盒(Amersham Pharmacia)评价细胞色素C的表达量。
如图17所示，证实在添加MPP+的神经元的情况下，由于CBI的处理，细胞质中细胞色素C的量减少，从线粒体释放的细胞色素C的量小于与CBI同等量的雷沙吉兰处理的添加MPP+的神经元。
实施例8-2：测量半胱天冬酶3/7的活性
SH-SY5Y细胞以5×105细胞/孔的浓度在上述相同条件下在96-孔板中孵育，用2mMMPP+和CBI(1,5,10and50nM)或雷沙吉兰(50nM)处理细胞，得到的细胞孵育24h。之后，将100μl Apo-ONE半胱天冬酶3/7试剂(Promega,G7790)加入其中，随即混合，所得物进一步孵育4h。孵育终止后，用荧光板读器(GeminiXPS,Molecular Devices)在495nm激发波长和521nm发射波长测量荧光。如图18所示，证实与雷沙吉兰相似，由于CBI的处理，半胱天冬酶3的活性减少。
从实施例8的结果证实CBI可稳定神经元中线粒体膜的稳定性，因而阻止线粒体中细胞色素C的释放，并相应减少半胱天冬酶3的活性，因此抑制神经元的凋亡。
如上所述，许多神经退行性疾病例如中风、脑损伤、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、阿尔兹海默氏症和帕金森氏症以神经元凋亡为特征，结果表明CBI可抑制神经元凋亡，因此能够预防或治疗神经退行性疾病。
实施例9：通过抑制神经元的活性氧簇验证CBI的神经保护作用
在此实施例中，利用MAO-B缺陷型人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank))。细胞在DMEM培养基中5％CO2，37℃孵育24h。将培养细胞划分为3组，每组加入2mM MPP+，3组中的1组用50nM CBI处理，另外2组中1组用50nM雷沙吉兰处理，这3组进一步在5％CO2，37℃孵育24h。如上所述，仅加MPP+的组在相同条件下孵育。之后，细胞用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)染色，其为能够检测活性氧簇的荧光染料，然后用共聚焦显微镜(Nikon Co.,日本)观察。
如图19和20所示，在添加MPP+的神经元的情况下，与CBI相同浓度雷沙吉兰处理的添加MPP+的神经元组相似，由于CBI的处理活性氧簇明显减少。
已知细胞内活性氧簇的产生和增加可诱导凋亡，因此从上述结果可证实CBI诱导活性氧簇的减少，因而抑制凋亡。已知此氧化应激可引发多种与神经元凋亡或神经退行性变有关的疾病，例如，阿尔兹海默氏症，肌萎缩侧索硬化，脱髓鞘性病，糖尿病多发神经病变，唐氏综合征，HIV神经病变，亨廷顿氏病，多系统萎缩症，帕金森氏症，中风和缺血-再灌注损伤，Tau病和外伤性脑损伤(自由基生物医学(Free radical Biology&Medicine),33(2):182-191(2002))。结果表明CBI诱导活性氧簇的减少，因此抑制氧化应激，相应阻止神经元的凋亡，用于预防或治疗各种神经退行性疾病。
实施例10：通过抗氧化酶活性验证CBI的神经保护作用
在此实施例中，使用MAO-B缺陷型人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞(韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank))。将MAO-B缺陷型人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞以1.8×105个细胞/孔的浓度分散至六孔板中，在5％CO2，37℃孵育24h。将得到的细胞划分为3组，每组加入2mMMPP+，3组中的2组分别用0.1μM和1μM CBI处理，所得物进一步在5％CO2，37℃孵育24h。如上所述，不加MPP+处理的对照组在相同条件下孵育。之后，从细胞中获取细胞提取物，测量抗氧化酶活性，即过氧化氢酶，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。
如图21所示，与未经MPP+处理的细胞组相比，添加MPP+的神经元表现出过氧化氢酶和GPx活性降低的趋势。CBI处理的添加MPP+的神经元表现出增加了抗氧化酶降低的活性。特别是，证实此组中GPx的活性比对照组高2.5-4倍。
另外，为证实CBI处理在体内是否增加抗氧化酶的活性，使用C57BL/6小鼠(n＝12，8-9周龄，雄性)(ORIENT BIO INC.)。将C57BL/6小鼠分成三组(每组n＝4)，分别对未经神经毒素处理的三组口服施用赋形剂(对照)、1mg/kg CBI和1mg/kg雷沙吉兰，8天。最后1天施用后第二天，从每组小鼠中取出纹状体和黑质。从组织的细胞中获取细胞提取物，从而测量过氧化氢酶，SOD和GPx。
如图22所示，施用CBI的小鼠组中，SOD活性没有明显变化，然而，纹状体中过氧化氢酶活性提高约13％并且黑质中GPx活性提高约28％。
已知细胞内活性氧簇的产生和增加可诱导凋亡，已知抗氧化酶可分解活性氧簇，因此，从结果可证实CBI可增加神经元内抗氧化酶的活性，特别是黑质中GPx活性，从而诱导活性氧簇的减少，相应地能够抑制凋亡。另外，结果表明CBI可诱导活性氧簇的减少，从而抑制氧化应激以阻止神经元的凋亡，因而可用于预防或治疗上述各种疾病。
实施例11：验证CBI的神经元恢复作用
利用C57BL/6小鼠(n＝8/组(共4组)，8周龄；雄性)作为实验模型(品系：C57BL/6NCrljBgi,ORIENT BIO INC)。通过腹腔内注射向小鼠施用30mg/kg MPTP，每天1次，4天。最后1天注射后的4天，将小鼠分成三组(n＝4/组)，分别对三组口服施用赋形剂(对照)、1mg/kgCBI和1mg/kg雷沙吉兰，每天1次，10天。最后1天施用后的第二天，对每组进行悬尾试验(TST)，从每组小鼠中取出纹状体和黑质组织，测量纹状体中多巴胺和代谢产物的浓度和黑质中神经元的减少程度。为观察组织中每个神经元的神经突起和突触棘的数量是否增加，利用振动切片机制备包含纹状体或黑质的200μm厚的冠状切片。将每组小鼠处死，从每组中取出大脑，置于冷的高浓度蔗糖剥离缓冲液中，用碳合气(carbogen)冒泡(5％CO2和95％O2)(87mM NaCl,2.5mMKCl,1.25mM NaH2PO4,25mM NaHCO3,1mM CaCl2,3mM MgCl2,10mM葡萄糖,和75mM蔗糖)。进行振动切片机时，将切片室用均一的糖化蔗糖剥离缓冲液充满。切片结束后，PBS洗涤全部切片，PBS溶液的4％多聚甲醛固定。将固定的脑切片置于1.5％琼脂糖(PBS中)封闭。应用图像浏览软件(Carl Zeiss Microimaging,Germany,version4.0SP2)用共聚焦显微镜(ZEISS LSM510META)获得其图像。
如图23和24所示，在施用CBI的MPTP-诱导的小鼠组中，神经突起的数量增加，神经棘的数量恢复至正常水平。特别是，在施用雷沙吉兰的MPTP-诱导的小鼠组中，观察到神经棘的数量增加，然而，神经突起的增加显示无统计学意义。从结果验证CBI抑制凋亡和对提高神经可塑性有效。
实施例12：CBI给药和含有CBI的片剂的制备(预测)
本发明中，药物组合物用于抑制神经元的凋亡或神经退行性变，或神经保护或神经元恢复。药物组合物的临床合适剂量(口服给药)为成人25mg-100mg。
基于此剂量，利用常规方法制备含有表1所示组分的片剂。利用Avicel102(微晶纤维素)作为赋形剂。
表1
组分 量
CBI ～25mg
Pobidon K30 ～100mg
微晶纤维素 ～100mg
羧甲基淀粉钠 ～7.5mg
硬脂酸镁 ～2.5mg
总量 ～235mg
对于体重60kg的成年人，组分的合适剂量是含有组分的片剂每天1或2片。
根据本发明的一个或多个实施方案，药物组合物可有效抑制或治疗神经元的凋亡或神经退行性变相关的疾病。
尽管已经针对上述具体实施方案显示和描述了本发明，应当理解，在不脱离所附权利要求限定的精神和保护范围内，本领域技术人员可做出的各种形式和细节的改变。

Claims (5)

1.式I的化合物、其药用盐或立体化学异构体，或其任何组合在制造用于预防或治疗选自下组疾病的药剂中的应用：中风、阿尔兹海默氏症、亨廷顿氏病、帕金森-ALS-痴呆综合征、痴呆症、肌萎缩侧索硬化、卒中、短暂性脑缺血发作、心肌缺血、肌肉缺血、与脑血流量暂停延长有关的外科手术引起的缺血、脑损伤和脊髓损伤：
式I
其中，R为C1-C15芳基烷基；
Y为O；
R1选自H和直链或支链C1-C3烷基中的至少一种；
R2选自H和卤素；
A为O；
B为C；
Z为-OC(＝O)NR3R4；
R3和R4各自为H或未取代的C1-C5烷基；
m是0-2之间的整数；以及
n是0或1。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述式I的化合物选自：氨基甲酸3-(4-苄氧基-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-2-氯-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-3-氯-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-3-溴-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-(4-苄氧基-3-氟-苯基)-异噁唑-5-基甲酯、氨基甲酸3-[4-(1-苯基-乙氧基)-苯基]-异噁唑-5-基甲酯。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述式I的化合物为式II的化合物：
式II
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述疾病选自痴呆症、亨廷顿氏病和肌萎缩侧索硬化。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述疾病选自中风、脑损伤、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病和阿尔兹海默氏症。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102191562B1 (ko) 2012-11-07 2020-12-15 에스케이바이오팜 주식회사 난용성 약물의 고체분산체 및 이의 제조방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102333764A (zh) * 2009-02-25 2012-01-25 爱思开生物制药株式会社 取代的吡咯衍生物、含这些衍生物的药用组合物以及用其治疗帕金森氏病的方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4407047A1 (de) * 1994-03-03 1995-09-07 Merck Patent Gmbh Acetamide
JP2001519341A (ja) * 1997-10-06 2001-10-23 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 神経保護剤として有用な新規化合物
DE19962924A1 (de) * 1999-12-24 2001-07-05 Bayer Ag Substituierte Oxazolidinone und ihre Verwendung
JP2006508893A (ja) * 2002-03-15 2006-03-16 イーライ・リリー・アンド・カンパニー ステロイドホルモン核内レセプターモジュレーターとしてのジヒドロインドール−２−オン誘導体
AU2004309390B2 (en) * 2003-12-22 2011-06-02 Gilead Sciences, Inc. Imidazo[4,5-c]pyridine compounds and methods of antiviral treatment
FR2866886B1 (fr) * 2004-02-26 2007-08-31 Sanofi Synthelabo Derives d'aryl-et d'heteroaryl-akylcarbamates, leur preparation et leur application en therapeutique
US20080207608A1 (en) * 2004-04-12 2008-08-28 Prabhat Kumar 2-Propene-1-Ones As Hsp 70 Inducers
WO2006042245A1 (en) * 2004-10-11 2006-04-20 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Novel isoxazole compounds having ppar agonist activity
EP3067053A1 (en) * 2004-10-13 2016-09-14 PTC Therapeutics, Inc. Compounds for nonsense suppression, and methods for their use
DE102005030051A1 (de) 2005-06-27 2006-12-28 Grünenthal GmbH Substituierte 1-Oxa-3,8-diazaspiro[4,5]-decan-2-on-Verbindungen und deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln
WO2007013830A1 (en) * 2005-07-26 2007-02-01 Portela & Ca. S.A. Nitrocatechol derivatives as comt inhibitors
AR055369A1 (es) 2005-08-10 2007-08-22 Smithkline Beecham Corp Compuestos derivados de xantina, su uso para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por el receptor hm74a, formulaciones y combinacion farmaceuticas que la comprenden y metodo de preparacion de los mismos
JP2009504748A (ja) 2005-08-15 2009-02-05 ユニバーシティ オブ バージニア パテント ファウンデーション Ｒ（＋）プラミペキソールを用いた神経回復
DE102005049385A1 (de) 2005-10-15 2007-04-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Imidazolderivate als Inhibitoren von TAFIa
US7598282B2 (en) * 2005-11-01 2009-10-06 University Of Kansas Neuroprotective agents
CA2656039A1 (en) * 2006-06-23 2007-12-27 Incyte Corporation Purinone derivatives as hm74a agonists
BRPI0720043A2 (pt) * 2006-12-15 2014-01-07 Abbott Lab Composto oxadiazol
EP1935420A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-25 Merck Sante 2-Adamantyl-butyramide derivatives as selective 11beta-HSD1 inhibitors
TWI415607B (zh) * 2007-12-25 2013-11-21 Kissei Pharmaceutical 新穎兒茶酚衍生物、含有其之醫藥組成物及該等之用途
JPWO2009119088A1 (ja) * 2008-03-25 2011-07-21 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
JP2011526620A (ja) 2008-07-04 2011-10-13 アンスティトゥート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシャルシュ・メディカル・（インセルム） プロテアソームモジュレーターとしての窒素複素環誘導体
EP2350002A1 (en) * 2008-10-02 2011-08-03 Abbott Laboratories Novel compounds as calcium channel blockers

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102333764A (zh) * 2009-02-25 2012-01-25 爱思开生物制药株式会社 取代的吡咯衍生物、含这些衍生物的药用组合物以及用其治疗帕金森氏病的方法

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