TWI308492B

TWI308492B -

Info

Publication number: TWI308492B
Application number: TW091102095A
Authority: TW
Inventors: Morishita Ryuichi; Aoki Motokuni; Ogiwara Toshio; Kaneda Yasufumi; Nakamura Hiroshige
Original assignee: Anges Mg Inc
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2009-04-11
Also published as: EP1362600A4; JP4987022B2; US9012417B2; JP3778357B2; JP2009102428A; DK1362600T3; US20040162251A1; EP1690544B1; JPWO2002066070A1; ES2307733T3; EP1362600B1; ATE390938T1; US20090105183A1; EP1362600A1; EP1690544A2; PT1362600E; EP1690544A3; WO2002066070A1; DE60225899T2; DE60225899D1

Description

1308492 A7 B7 五、發明説明（1 ) 技術範蜂本發明係關於一種包含存在於染色體上且會與轉錄調節因子結合之部位特異性結合之化合物（例如核酸及其之類似體）之组合物及其之使用方法。更詳細言之，係關於包含誘捕物化合物之組合物及其之使用方法。背景技術氣喘、癌症、心臟病、動脈瘤、自體免疫疾病以及病毒感染症等各種疾病，雖然分別顯示不同之症狀，但其之大部分起因於1種或數種蛋白質表現異常（過剩表現或過少表現）。一般而言，此等蛋白質之表現藉由各種轉錄活性因子及轉錄抑制基因等轉錄調節因子來控制。 NF- /c B為p65與p50之雜二聚體組成之轉錄調節因子。 NF- /c B，通常以與其.之抑制因子I /c B結合之形式存在於細胞質内，且其之核内移行被阻止。然而’，若基於某些原因，施以細胞激素、缺血及再灌流等刺激，I /c B將被磷酸化及分解，藉此NF- /c B被活性化及移行至核内。移行至核内之NF- /c B，結合於染色體上之NF- /c B結合部位，而促進其之下游基因之轉錄。關於NF- /c B結合部位之下游之基因，已知有例如IL-l、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子a(TNF α )等炎症性細胞激素類，以犮VC AM-1及IC AM-1等接著因子。 NF- /c B與腫瘤惡性度進行之開始有關（Rayet B et al·， Oncogene 1999 Nov. 22 ; 18 (49) 6938-47) ; NF-/CB 與腫瘤細胞對於低氧素症壓力之回應有關（Royd& JA et aL, Mol '-4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1308492 A7 B7 五、發明説明（2 )

Pathol 1998 Apr ; 51 (2) : 55-61) ; NF- /CB 誘捕物會抑制來自慢性風濕性關節炎患者之滑膜細胞中細胞激素及接著分子之表現（Tomita T et al.，Rheumatology (Oxford) 2000 Jul ; 39 (7) : 749-57);包含NF- /cB之複數個轉錄因子間之協力作用之抑制，會改變種種癌症之惡性表現型 (Denhardt DT，Crit Rev Oncog 1996 ; 7 (3-4) : 261-91);藉由綠茶聚酚使NF- /c B活性之調低，會封阻一氧化氮合成酵素之謗導及抑制A43 1人類表皮癌細胞（Lin JK et al.， Biochem Pharmacol 1999 Sep 15 ; 58 (6) : 911-5);在阿茲海默氏病患者之腦中見到之澱粉狀蛋白yS胜肽，在成神經細胞瘤細胞中藉由與75kD神經營養因子受體（p75NTR)結合，可以時間依存性方式及用量依存性方式活性化NF- /c B (Kuper P et al·，J N'eurosci Res 1998 Dec 15 ; 54 (6) : 798-804);被NF- /c B活性化之TNF α在絲球體腎炎之發病上扮演重要之角色（Ardaillous et al·, Bull Acad Natl Med 1995 Jan ; 179 (1) 103-15)。 NF- /c B誘捕物，在活體内會抑制被TNF α誘導之小鼠腎炎中之細胞激素及接著分子之表現（Tomita N et al.，Gene

Ther 2000 Aug ; 7 (15) 1326-32)等。 r 曾暗示NF- /c B誘捕物會抑制為基質金屬蛋白酶（MMP ) 之成員之MMP 1及MMP9之轉錄程度（參見在大鼠絲球體腎小球繫膜細胞中IL-1卢-誘導之基質金屬蛋白酶-9表現藉超氧化物之增幅係由NF- /c B之活性增加及活性化蛋白質-1媒介，.以及涉及有絲分裂原-活性化之蛋白質激酶途徑 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1308492 A7 B7 五、發明説明（3 ) 之活性化，Eberhardt W, Huwiler A，Beck KF，Walpen S， Pfeilschifter J.，J Immunol 2000 Nov 15，165 (10)，5788-97 ; 在兔子皮膚成纖維細胞中核因子/c B活性為基質金屬蛋白酶-1 及-3 調升所必需 ’ Biochem Biophys Res Commun, Bond M, Baker AH, Newby AC, 1999 Oct 22, 264 (2), 561-7 ;金屬蛋白酶-9藉增殖因子及炎性細胞激素而增效性調升：轉錄因子NF- /c B為絕對必要條件，Bond M，Fabunmi RP, Baker AH, Newby AC. FEBS Lett 1998 Sep 11, 435 (1), 29-34 ;以及脂多糖在内皮細胞中經由NF- /c B-依存性途徑活化基質金屬蛋白酶-2，Kim H，Koh G. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Mar 16，269 (2)，401-5)。在異位性皮膚炎之病態或異位性皮膚炎模型動物中，已知NF- /c B之活性上升，將誘導各種細胞激素之表現上升且伴隨著淋巴球之浸潤或活性化，在病態之發病及進展上扮有重要角色（B7-CD28 / CTLA-4共刺激及NF- /cB在由 IL-1 6及RANTES媒介之過敏原誘生之T細胞趨化性上之角色，Hidi R, Riches V，Al-Ali M, Cruikshank WW，Center DM， Holgate ST, Djukanovic R, J Immunol 2000 Jan 1，164 (1), 412-8 ;在TCR-基因轉移模型中發育之調節及由Thl細胞 r . 產生之 IFN- 7 產量之檢查點，Anne O’ Garra. Immunology 1999 65, 41-44 ;在顯示異位性皮膚炎樣損害之NC/Nga小鼠中Th2-特異性化學激活素之過度生產，Christian

Vestergaard et al.，J. Clin. Invest. 1999 104, 1097-1 105 ;在人類B細胞中核因子/cB活化與IgE合成之關係，Yanagihara -6 · 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1308492 A7 B7 五、發明説明（4 ) Y, Basaki Y, Ikizawa K, Kajiwara K, Koshio T, Akiyama K, J Allergy Clin Immunol. 1996 Dec., 98 (6 Pt 2) : S224-9)。又，曾暗示在尋常性乾癬及接觸性皮膚炎等中，NF- /c B 之活性化為重要機制之一（在乾癬性關節炎患者之滑液膜及皮膚中巨嗤細胞衍生之細胞激素及核因子/c B p65之表現，Danning CL, Illei GG，Hitchon C，Greer MR，Boumpas DT, Mclnnes IB Arthritis Rheum 2000 Jun, 43 (6), 1244-56 I 在人類内皮細胞中，核因子/cB及基因表現被一般半抗原鎳

OsthoffK. J Immunol 1995 Sep 1 ; 155 (5):2459-67)。 GATA-3為在過敏性疾病之發病及進展上扮演重要角色之轉錄因子（在活體中及於試管中以過敏原挑釁後，在上呼吸道黏膜中轉錄：因子GATA-3之調升，Nakamura Y， Christodoulopoulos P, Cameron L, Wright E, Lavigne F, Toda M, Muro S, Ray A, Eidelman DH, Minshall E, Hamid Q, J Allergy Clin Immunol 2000 Jun 105 (6Ptl)，1 146-52 ;在氣喘之鼠模型中，過敏性發炎藉GATA-3之顯性-陰性突變體之表現而被抑制，Zhang DH，Yang L，Cohn L, Parkyn L,

Homer R, Ray P, Ray A, Immunity 1999 Oct 1 1 (4), 473- r 82) ° ST AT-6為藉IL-4之表現調節機構及IL-4而控制幫助者-τ 細胞之反應之轉錄因子（Wang LH, Yang XY，Kirken RA， Resau JH，Farrar WL, stat 6 DNA結合活性被寡核嘗誘捕物之標定干擾會封阻IL-4驅動之T(H)2細胞反應，blood 2000 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1308492 A7 B7 五、發明説明（5 )

Feb 15, 95 (4), 1249-57)。 AP-1為在過敏性疾病之發病及進展上扮演重要肩色之轉錄因子（IL-5基因由人類幫助者T細胞控制轉錄：IL-5合成以與IL-2或IL-4合成無關之方式被調節，Mori A, Kaminuma O, Mikami T, Inoue S, Okumura Y, Akiyama K, Okudaira H, J. Allergy Clin Immunol 1999 May 103 (5Pt2), S429-36 ;糖皮質受體基因為氣喘之基因治療之候選物， Mathieu M, Gougat C, Jaffuel D, Danielsen M, Godard P, Bousquet J, Demoly P, Gene Ther 1999 Feb, 6 (2), 245-52)。

Stat-1及E t s被認為係在過敏性疾病之發病及進展上扮演重要角色之轉錄因子。如上述，雖然暗示包含NF- /CB之轉錄因子，介入由其控制轉錄之多個基因之表現，而與多種疾病有關，但尚未 '提供有效處置此等疾病之方法。發明之揭示本發明提供一種組合物’其包含適於處置包含異位性皮膚炎、尋常性乾癬、接觸性皮膚炎、瘢痕瘤、褥瘡、潰瘡性大腸炎及克隆氏症（Crohn’s disease )等之皮膚疾病之誘捕物化合物，以及提供使用該組合物之方法。 r 本發明提供一種以誘捕物化合物為主成分之處置（治療及預防）皮膚疾病之組合物以及該疾病之處置方法。本發明者為了處置皮膚疾病，投與誘捕物化合物，結果發現有效，本發明至此於焉完成。本發晛係關於一種治療及預防皮膚疾病'用之醫藥組合 -8- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） !3〇8492 A7 B7 ^--- 五、發明説明（6 物，該组合物包含至少一種誘捕物以及醫藥上容許之載劑。上述至少一種誘捕物較佳選自NF- /c B之誘捕物、STAT-1 之誘捕物、GATA-3之誘捕物、STAT-6之誘捕物、^心之誘捕物及E t s之誘捕物所組成之族群。或者，上述至少一種誘捕物為由選自NF_ kb之誘捕物、 STAT-1之誘捕物、GATA-3之誘捕物、STAT-6之誘捕物、 AP-1之誘捕物及E t s之誘捕物所組成族群中之1個以上誘捕物結合而成之寡核甞酸。上述皮膚疾病可為異位性皮膚炎、尋常性乾癬 '接觸性皮膚炎、瘢痕瘤、褥瘡、潰瘍性大腸炎或克隆氏症。上述醫藥上容許之載劑較佳包含凡士林。上述醫藥上容許之:載劑較佳包含凡士林、包本二 ^ 匕令5 %硬脂醉之凡士林，或包含流動石臘之凡士林。圖式之簡單說明圖1為投與本發明組合物之小鼠之背上半部之 ⑧ 之螢光顯微鏡照片（X 400)。 τ本圖2Α為顯示本發明之效果之臨床皮膚症狀計分（規結果隨時間變化之圖。 ^ 1 ^ 圖2 Β為經Η Ε染色之對照群小鼠之背上半部之照片。 Κ皮膚標本圖2 C為經Η Ε染之照片。色之試驗群小鼠之背上半部之皮膚標本圖2 D為從背面拍攝對照群小鼠之照片。 -9-

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圖2 E為從背面拍攝試驗群小鼠之照片。圖2F為顯示在對照群及試驗群中，每皮膚單位，面積中肥胖細胞數目之測定結果之圖。、圖3 A為顯示本發明之效果之臨床皮膚症狀計分（規程2 ) 結果之隨時間變化圖。圖3 B為經Η E染色之對照群小鼠之背上半部之皮膚桴本之照片。农圖3C為經HE染色之試驗群小鼠之背上半部之皮膚桴本之照片。 "" 圖3 D為從背面拍攝對照群小鼠之照片。圖3 E為從正面拍攝對照群小鼠之照片。圖3 F為從背面拍攝試驗群小鼠之照片。圖3 G為從正面拍攝試驗群小鼠之照片。實施本發明之最佳形態匕在本發明中所用之術語r誘捕物」或「誘捕物化合物」係指在NF- /c B於染色體上之、结合部位，或者被nf_凡b控制之基因以外之轉錄調節因子於染色體上之結合部位（以下被稱為標的結合部位）’能夠結合於其上而拮抗或其他之轉錄因子與此等標的結，合部位之結合之化合物。代表性之誘捕物或锈捕物化合‘為核酸及其之類似物。心誘捕物存在於核内之情形，誘捕物會與轉綠調節因子競肀與轉錄調節因子之標的結合部位之結合，結果，藉由與轉錄調節因子之標的結合部位之結合而抑；其心之生物學機能。誘捕物包含至少一個能與標'的結合序列結 -10-

1308492 A7 B7__ 五、發明説明（8 ) 合之核酸岸列。謗捕物，只要具有與標的結合序列結合之活性，就可用於本發明之醫藥組合物之調製。較佳誘捕物之例子例如為5’-CCT-TGA-AGG-GAT-TTC-CCT-CC-3'(序列編號 l)(NF-/cB誘捕物），5，-GAT-CTA-GGG-ATT-TCC-GGG-AAA-TGA-AGC-T-3,（序列編號2) (STAT-1 誘捕物），5,-AGC-TTG-AGA-TAG-AGC-T-3,(序列編號3)(GATA-3 之誘捕物），5’-0八丁-€入八-0八0(：丁1'-丁1'(：-CCA-AGA-AAT-CTA-T-3'(序列編號 4 ) ( STAT-6 之誘捕物），5.-AGC-TTG-TGA-GTC-AGA-AGC-T-3,（序列編號5) (AP-1 之誘捕物）以及 5，-AAT-TCA-CCG-GAA-GTA-TTC-GA-3’（序列編號6 ) (E t s之誘捕物），或者包含此等之互補體之寡核苷酸，此等之變異體，或者將此等含於分子内之化合物。寡核苷酸:可為DN A，亦可為RN A，或者在該寡核甚酸内包含核酸修飾體及/或擬核酸者。又，此等寡核苷酸、其之變異體或將此等含於分子内之化合物，可為單股亦可為雙股，可為鏈狀亦可為環狀。所謂變異體’係表示上述核酸之一部分發生變異、置換、插入及缺失’且會特異性拮抗NF- /c B或被NF- /c B控制之基因以外之其他轉錄調節因子與核酸結合部位之結合之核酸。 r 較佳之诱捕物，例如為包含1個或複數個上述核酸序列之雙股寡核苷酸或其之變異體。包含1個或複數個上述核酸序列之核酸，為了顯示所含核酸序列之數目，在所含核酸序列為2個之場合被稱為嵌合誘捕物（雙誘捕物），以及在3個之場合被稱為三聯誘捕物。 -11 - ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1308492 A7 B7 五、發明説明（9 ) 本發明所使用之寡核甞酸包含具有將鱗酸二酯键結部之氧原子用硫原子取代而得之硫代鱗酸二醋鍵之寡核^:酸 (S-oligo)，或磷酸二酿鍵被不帶電荷之鱗酸甲醋基取代之寡核益酸等，為了在身體内使寡核：y：酸難以被分解而改變之寡核誓酸等。關於本發明所用誘捕物之製造方法，可以採用本領域公知之化學合成法或生化學之合成法。例如使用核酸做為誘捕物化合物之場合，可以採用遣傳工程學一般使用之核酸合成法，例如，可以使用DN A合成裝置直接合成目的誘捕物核酸，或者此等核酸，在合成包含其之核酸或其之一部分後，用p C R法或選殖載體等增幅。再者，將藉由此等方法得到之核酸用限制酵素等切斷，用dn A配體等進行鍵結，可以製造目的核酸。又，為得到在細胞内較安定之誘捕物核酸，對於核酸之鹼基、糖及磷酸部分施行例如烷基化或醯基化等化學修飾。本發明提供一種醫藥組合物，其包含單獨的上述誘捕物化合物’或其與安定化化合物、稀釋劑、載劑或者其他成分或藥劑之組合。本發明之醫藥組合物，以誘捕物可以進入患部之細胞内或目標組織滅丨r句八斗人 ’ 一囷牙適合性醫藥載 3生理食鹽水、緩衝化生理食鹽水但不限於此等）中被投與。此等分子之任^ 木日* π如丁 <任—者，可在與適 ^形劑、佐劑及/或醫藥上容許之載劑私合而成之„ -12-

1308492 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 組合物中，以單獨或與其他藥劑組合之形式投與患者。在本發明之實施態樣中，醫藥上容許之載劑為不具醫藥活性者。本發明之醫藥组合物之投與藉由經口或非經口而達成。關於非經口送達之方法，例如為局部、皮膚塗佈、動脈内 (例如直接投入腫瘤及動脈瘤中）、肌肉内、皮下、髓内、蜘蛛膜下腔内、腦室内、靜脈内、腹腔内、或鼻孔内之投與。本發明之醫藥組合物，為了調製供醫藥使用之製劑，除了包含誘捕物化合物之外，尚包含醫藥上容許之適當載劑，該載劑包含賦形劑或促進誘捕物化合物加工用之其他化合物。處方及投與技術之更詳細說明被記載於「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES」（Maack Publishing Co.，Easton:，PA)之最後一版中。以下將詳細例示說明本發明之醫藥組合物之投與形態以及所用之醫藥上容許之載劑。又，以下所示之本發明醫藥組合物為本發明之例示，本發明非限於此。供經口投與用之醫藥組合物，可用該領域周知之醫藥上容許之載劑而被處方成適於投與之投與形式。此等載劑為可以使醫藥組合物被處方成適於讓患者攝取之鍵劑、丸劑、糖衣劑、膠囊劑、液體'凝膠、軟膏糖漿劑、漿體及懸浮物等者。供經口使用之醫藥組合物，可藉由將誘捕物化合物與做為載劑之固體賦形劑組合，視期望可將得到之混合物粉碎，若要得到錠劑或糖衣劑之蕊心，可於'添加適當的化 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1308492 A7

合物後，將顆粒形之為碳水化合物或蛋白：加工而得到。適當的賦形劑入物.勺八— < 質无填劑，包含但非限於以下之化合物·包含乳糖、 ,A . ‘”、、甘露醇或山梨醇之糖；玉米、小麥、水稻、馬鈴荽 *〜二w 飞其他來自植物之澱粉；甲基纖維今，.素或竣甲基纖維素鈉等纖維素；包〇阿拉伯膠及西黃耆膠之谢晚. 二Μ 售膠义树膠，以及如明膠及膠原之蛋白貝。如期望，可以：表士山、sn „ 添加朋玫劑如被交聯之聚乙埽吡咯暖_、瓊脂、海藻酸„戈装夕豳,η 劑。 …Κ例如海蕩酸納），或可溶化 ’十I糖衣此，與適當的包覆劑如濃縮糖溶液一起提供。其尚可含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙稀,比她、聚，乙埽凝膠(吻。1gel)、聚乙二醇及/或二氧化飲、嚴漆洛液以及適當的有機溶媒或溶媒混合液。為了製品

Hil為了識別活性化合物之量（即用量），可在鍵劑或糖衣劑中添加染料或色素。可以經口使用之醫藥製劑，包含例如明膠膠囊、明膠及包覆劑（例如甘法或山梨醇）组成之軟封閉膠囊。明膠膠囊可以含有與充填劑如乳糖或澱粉、粘合劑、潤滑劑如滑石粉或硬脂酸缓、或視期望使用之安定化劑混合之活性成分。在軟膠囊中，誘捕物化〃合物可與安定化劑一起或不連同安定化劑溶解或懸浮於適當的液體如脂肪油、流動石臘或液狀聚乙二醇中。非經口投與用之醫藥製劑包含活性化合物之水溶液。為供注射用，本發明之醫藥组合物可被處方'成在水溶液、 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ' --—--- 1308492

五、發明説明（生理食浮物可素納、以調製載劑包三酸甘濃度溶溶解度較佳在漢克斯溶液、林格兒溶液、十土 .從或者如緩衝化鹽水炙生理學上適合之緩衝液中。 . 、，人+ 水性汪射用懸以含有增加懸浮物之枯度之物質（例如羧甲基纖唯山梨醇或葡聚糖）。再者，活性化合物之懸浮物可成適當的油狀注射懸浮物。適當的親油性溶媒或含脂肪酸如芝麻油、合成脂肪酸酯如油酸乙酯或油脂、或者微脂粒。如期望，懸浮物可含有使高液之製劑可以製成之安定化劑或者可使化合物2 增加之適當藥劑或試藥。 13 為了供局部或鼻孔投與，在製劑中可以使用能浸透特定障壁之適當浸透劑。此等浸透劑—般為本領域所公知。本發明之醫藥組合物，可以與本領域公知模式同樣之模式（例如藉由先前之混合、溶解、顆粒化、糖衣劑製作、水簸、乳化、膠囊化或凍結乾燥之手段）製造。在局部投與至患部之細胞或目標組織之細胞内之場合，本發明之醫藥组合物較佳含有做為載劑之合成或天然親水性聚合物。 ^ 關於此等親水性聚合物之例子，例如為羥丙基纖維素及聚乙二醇等。將本發明之誘捕物化合物與在適當溶媒中之該親水性聚合物混合，藉由'風乾等方法將溶媒除去，成形為期望之形態例如片狀後，施加於標的部位。此等 έ有親水性聚合物之製劑，由於水分含量少，所以保存存性優良，使用之時，由於吸收水分成為凝膠狀，所以誘捕物化合物之貯留性優異。此等片狀製、劑，亦可以用 -15- 1308492 A7 B7 五、發明説明（13 ) 將纖維素、澱粉及其之衍生物或合成高分子化合物等多價醇混合以調整硬度而形成之親水性片，做為上述組成以外之類似物。此等片狀製劑，可以在腹腔鏡下，藉由使用例如腹腔鏡技術而被施加於標的部位。目前腹腔鏡手術驚人地發展，以做為非侵襲性方法，藉由與本發明醫藥组合物之組合，提供一種非侵襲性、可以反覆治療之疾病之處置方法。或者，在使用核酸或其之修飾體做為誘捕物之場合，本發明之醫藥組合物，利於採用一般基因導入法使用之形態，例如使用仙台病毒等之膜融合微脂粒製劑及利用内呑作用之微脂粒製劑等微脂粒製劑，含有脂染胺 (lipofectoamine，東方生命科技公司製）等陽離子性脂質之製劑，或使用反錄病毒載體或腺病毒載體等之製劑，尤其以膜融合微脂粒製劑為宜。關於微脂粒製劑，其之微脂粒構造體可為大單層膜微脂粒（LUV)、多重膜微脂粒（MLV)及小單層膜微脂粒（SUV) 之任一者。關於其之尺寸，LUV可得到200至1000 nm之粒子系，MLV可得到400至3500 nm之粒子系，.SUV可得到約2 0至5 0 nm之粒子系，不過，在使用仙台病毒等之膜融合微脂粒製劑之場合，較佳使用粒子系200至1000 nm 之 MLV。關於微脂粒之製造方法，只要能保持誘捕物，將無特殊限定，可以採用習用之方法，例如逆相蒸發法（Szoka F et -16- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1308492 A7 B7

1308492 A7 B7 五、發明説明（15 ) 現具體說明微脂粒製劑之製造法之例子，例如，將上述微脂粒形成物質連同膽固醇溶解於四氫呋喃、氯仿及乙醇等有機溶媒中，將其置入適當的容器中，於減壓下餾去溶媒，以在容器内面形成微脂粒形成物質之膜。在其中加入含有謗捕物之緩衝液並攪拌，在得到之微脂粒中視需要再添加上述膜融合促進物質後，單離微脂粒。將如此得到之含誘捕物之微脂粒懸浮於適當溶媒中，或者將經凍結乾燥者再分散於適當溶媒中以用於治療。膜融合促進物質可於微脂粒單離後至使用前之期間添加。本發明之醫藥組合物包括含有以能達成意圖目的之有效量之誘捕物化合物之組合物。「治療有效量」或「藥理學之有效量」為本技藝人士充分了解之用語，其係指產生意圖之藥理學結果之有效藥劑量。因此，治療有效量為足以減輕被處置病患之徵候之量。確認所定適應症用之有效量（例如治療有效量）之一有用測定法為測定目標疾病之回復程度。實際投與之量，依處置適用之個體而定，較佳為期望之效果顯著但不會帶來副作用之最適量。治療有效量之決定完全在本技藝人士之能力範圍内。對於任一化合物，治療有效量係在細胞培養測定或任意適當動物模型之任一者中進行最初估計而得。又動物模型係為了探索期望之濃度範圍及投與路徑而被使用。繼而，使用如此得到之資料，決定在人類中投與之有用量及路徑。· ' -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1308492 A7 B7 五、發明説明（16 ) 所謂治療有效量係指可以減輕疾病之徵候或狀態之誘捕物化合物之量。此等化合物之治療效果及毒性_，可藉由在細胞培養或實驗動物中標準的藥學程序（例如E D 5G :在集團之5 0 %中之治療有效用量；以及L D 5〇 :對於集團之 5 0 %為致死之用量）而決定。治療效果與毒性效果之間之用量比為治療係數，其以ed5〇/ld5()比表示。以呈現高治療係數之醫藥組合物為較佳。從細胞培養測定及動物實驗中得到之數據被用於將在人類中之用量公式化。此等化合物之用量較佳在包含大體或全然不會造成毒性之 ED5〇之循環濃度之範圍内。該用量可視被使用之投與形態、患者之感受性及投與路徑而變化。舉例言之，誘捕物之投與量，可依據年齡及其他患者條件、疾病之種類、使用之誘捕物之種類等而適當選擇，例如在血液内投與、肌肉内投與及關節内投與之場合，一般而言，每次1 // g〜100 mg，1日1次至數次。正確的用量，由個別臨床醫師考慮被治療之患者而選擇。用量及投與，依據是否能提供充分濃度之活性部份或維持期望之效果而調整。應考慮之因子例如有疾病狀態之嚴重度（例如腫瘤之尺寸及位置；患者之年齡、體重及性別；投與之誘捕物制限時間及頻率；藥物組合；反應感受性及對於治療之耐受性及回應）。持續作用性醫藥组合物，視特定製劑之半衰期及廓清速度，可每3〜4曰，每週或每2週投與1次。關於特定用量及送達方法之指南被記載在本領域公知之文獻上。 ' -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1308492 17 五、發明説明（含有如此得到之誘捕物以做為主成分之醫藥品，可依昭疾病（種類及使用之誘捕物之種類以各種方與 =血性疾病、炎症性疾病、自體免疫疾病以及癌= #心閏及,€、病質，可經由血管内投與；塗佈於患病部位；投與至患病部位内；或在患部部位投與至血管内等。’ 更具體之例子，例如在器官棱塞等中進行ΜΑ之p 合’可於同時或其之前後投與至患部血管内，又：二移植等中’ F可用本發明所用之製劑預先處置移植之器吕。又，例如在慢性風濕性關節炎等中，可入關節内。盈禪）王對於皮膚疾病’本發明之组合物較佳以軟膏之形投與至皮膚之患部。該軟膏為容易塗料皮膚、且適a 稠度《全質均等半固形外用劑，其通常包含做為載^ U、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石壤、壤、硬膏劑、树脂、塑膠、二元醇、高級醇、甘油、水或乳化劑、縣洋化劑，其以此等載劑做為基劑，將誘捕物化合物^ 地混合於其中而製成。視基劑’可以為油脂性軟膏、乳劑性軟膏及水溶性軟膏之形態。油脂性敕膏，以 =及螺’或者凡士林及流，動石㈣做為基劑性軟膏為將油脂性物質及水用乳化劑乳化者，可 ^ 中油型（0/W)或油中水型（w/0)之任一者。由2 (0/w)可以為親水軟膏，油中水型叫開始時= =目者可包含親水凡士林及精製羊毛脂，包含水相者可 13吸水軟骨及加水羊毛脂。水溶性軟膏以、完全溶於水之 _____ -20- i紙银尺度顏t a a家標準(CNS) Α4··(21〇Χ2^5Τ 1308492 A7 B7 五、發明説明（18 聚乙二醇（macrogol)基劑做為主成份。雖使用以下之實施例說明本發明’但此等實施例僅為本發明之例示’非意圖用於限定。實施例依據以下之程序’確認本發明組合物之效果。

裝 1·首先’藉由將FITC標識之NF-/CB誘捕物軟膏付諸於小鼠’而確認藉由使用NF- λ:Β誘捕物軟膏（其之組成被示於下述之2 ) ’ NF- /c B誘捕物可被確實導入表皮間質及真皮内之細胞中。圖1為將螢光色素FITC標識之NF- /c B誘捕物軟膏塗佈於背上半部之皮膚4曰後，NC/Nga小鼠之背上半部之皮膚標本又螢光顯微鏡照片（X 400)。如圖1所示，在表皮細胞之間質全體觀察到一致的螢光發色，以及在真皮内之淋巴球及毛囊構成細胞中觀察到綠色之螢光發色，因而確認 η

NF- /c B誘捕物可被確實導入表皮間質及真皮内之細胞中。 .接下來，將NC/Nga小鼠（異位性自然發病模型小鼠）分為NF- /c B誘捕物軟膏局部投與群（試驗群）及對照誘捕物軟膏局部投與群（對照群）2巧，然後比較及檢討對於異位性皮膚炎之局部效果。又，其中為了將在小鼠中之異位性皮膚炎之自然發病率提高至8〇%至1〇〇%，購入只添

加人蝨而飼育之4週齡上述系統雄鼠，做為異位性皮膚炎誘導小鼠。 H 現簡述.該試驗。將購入之NC/Nga小鼠分為2群，對於每 -21 -

1308492 A7 B7 五、發明説明（19 ) 群之各個小鼠，依照下述之規程（規程】及2 )，將具下述組成之NF- /c B誘捕物軟膏分別局部投與至兩耳、·背上半部及頭（塗佈於皮膚）（ΝΡΛ；Β誘捕物軟膏局部投與群）。另一群之小鼠，將具下示組成之對照誘捕物軟膏，以與nF_ /CB誘捕物軟膏局部投與群同樣之方式局部投與（對照諸捕物軟膏局部投與群），然後比較檢討在各群之小鼠中對於異位性皮膚炎之局部效果。 NF- /c B誘捕物軟膏之組成： NF-/CB誘捕物i〇mg，硬脂醇3〇mg，凡士林〇 6 g。對照誘捕物軟音之組忐: NF-/CB誘捕物10mg，硬脂醇3〇mg，凡士林〇 6§。規程1 藉由塗侔上述軟膏，對於每隻小鼠投與約丨mg之誘捕物或對照誘捕物；於出生後4週〜2週，合計塗佈4 久，每次以上述比率塗佈，於出生後〗2週進行評價。規程2 藉由塗体上述軟膏，對於每隻小鼠投與約2mg之誘捕物或對照誘捕物；於出生後第29週塗佈卜欠，於出生後3 0週進行評價。投與夂上述軟膏對於異位性丄膚炎之局部效果，用臨床皮膚症狀計分進行巨視評價。再者，依照習知方法使用 Η E染色’以微視評價該局部效果。圖2 A，為在依照上述規程丨評價對異位性皮膚炎之局部效果之試驗中’以各群之平均值表示臨床、皮膚症狀計分 -22-

20 1308492 五、發明説明（ f結果。如圖所示，於出生後丨2週’在NF_ π誘捕物軟貧局部投與群中，6隻之平均臨床症狀計分具有比、對照誘捕物軟膏局部投與群低之傾向，因而確認誘捕物軟膏之長期投與之效果。圖2 Β及圖2 C分別為NF- /c Β誘捕物軟膏局部投與群及對照誘捕物軟膏局部投與群小鼠之背上半部之皮膚標本（i 2 週：HE染色）之照片。從圖2 β及圖2 c可以明白，在NF_冗 Β誘捕物軟膏局部投與群中，與對照謗捕物軟膏局部投與群相比可見到表皮肥厚改善，有棘層肥厚改善以及顆粒層減少’此顯示藉由NF_ κ Β誘捕物浸潤至皮膚内，皮膚組織在病理學上可以改善。圖2 D及圖2 E分別為從背面拍攝對照誘捕物軟膏局部投與群及NF- /c B誘捕物軟膏局部投與群之照片。如圖2 D及圖2 E所見，在NF- /c B誘捕物軟膏局部投與群中，與對照誘捕物軟膏局部投與群相比，伴隨發紅之溼疹改善，而且見到搔癢痕跡減少，此顯示異位性皮膚炎之症狀藉由NF_ /c B誘捕物浸潤至皮膚内而被改善。圖2 F為在NF- /c B誘捕物軟膏局部投與群及對照誘捕物軟膏局部投與群中，以平均值/表示每皮膚單位面積之肥胖，，、田胞數之測定結果。從圖2 f可以明白’在NF- /c B誘捕物軟骨局部投與群之小鼠中，與對照誘捕物軟膏局部投與群相比，肥胖細胞數有意義地減少。此顯示NF_ κ B誘捕物可以抑制產生與異位性皮膚炎症狀相關之細胞激素之肥胖細胞之聚積。 ' -23 紙張尺度適财關家料A4^(21GX297公着)- 1308492

圖3 A為在依照上述規程2評價對異位性皮膚炎之局部效果之試驗中’以各群之平均值表示臨床皮膚症狀計分 ^，，Ό果如圖所不，於出生後30週，在NF- /c Β誘捕物軟膏局部技與群中’ 6隻之平均臨床症狀計分具有比對照誘捕物軟膏局部投與群低之傾向，因而確認Nf_ & β誘捕物軟^'在短期間之效果。圖3 B及圖3 C分別為依照上述規程2之對照誘捕物軟膏局部投與群及NF- /c B誘捕物軟膏局部投與群小鼠之背上半部之皮膚標本（12週：HE染色）之照片。從圖3B及圖 3 C可以明白，在NF- « B誘捕物軟膏局部投與群中，與對照"秀捕物軟膏局部投與群相比，可見到表皮肥厚改善，有棘層肥厚改善以及顆粒層減少’此顯示藉由NF_ 誘捕物浸潤至皮膚内，皮膚組織在病理學上可以改善。圖3 D為從背面及圖3 E為從正面，拍攝對照誘捕物軟膏局部投與群小鼠之照片。如圖3 D及圖3 E所見，在此群之各小鼠中’可以見到伴隨發—紅之溼疹及搔疼痕跡，其為異位性皮膚炎特有之症狀。圖3F為從背面及圖3〇為從正面，拍攝NF- /c B誘捕物軟霄局部投與群小鼠之照片。如圖3 F及圖3 G所見，在此群 <各小鼠中’可以見到伴隨發紅之溼疹改善以及搔癢痕跡減少’此顯示異位性皮膚炎之症狀藉由NF_ & b誘捕物浸潤至皮膚内而被改善。產業上利用之可能性本發明.提供一種組合物’其包含適於處置包含異位性皮 -24- 本紙張尺度適财g g轉準(CNS) A4規格"(⑽丨297公复) 1308492 A7 B7 五、發明説明（22) 膚炎、尋常性乾癖、接觸性皮膚炎、疲痕瘤、褥瘡、潰瘡性大腸炎及克隆氏症（Crohn’s disease)等之皮膚疾病之誘捕物化合物，以及提供使用該組合物之方法。本發明提供以誘捕物化合物為主成分，用於處置（治療及預防）皮膚疾病之組合物以及該疾病之處置方法。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1308492 A7 B7 五、發明説明（23 ) 序列表 < 110> MedGene Bioscience, Inc. < 120 >含有誘捕物之醫藥組合物及其之使用方法 <130〉 < 160> 2 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211 > 2 0 <212> DN A <213 >人造序列 <220> < 223 >人造序列之說明：NF- /c B謗捕物 < 300> <400> 1 ccttgaaggg atttccctcc 20 <210> 2 <211 > 2 8 <212> DN A <213 >人造序列 <220〉 < 223 >人造序列之說明：STAT-1誘捕物 <400> 2 gatctaggga tttccgggaa atgaagct 28

< 2 10 > 3 <211 > 16 <212> DN A < 2 13 >人造序列 <220> -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1308492 A7 B7 五、發明説明（24 ) < 223 >人造序列之說明：GATA-3謗捕物 <400> 3 ' agcttgagat agagct 16

<210> 4 <211 > 2 8 <212> DN A < 213 >人造序列 <220> <223 >人造序列之說明：STAT-6誘捕物 <400> 4 gatcaagacc ttttcccaag aaatctat 28 <210> 5 <211 > 19 <212> DN A <213 >人造序列 <220> < 223 >人造序列之說明：AP-1誘捕物 <400> 5 agcttgtgag tcagaagct 19 <210> 6 <211 > 2 0 〆

<212> DN A < 2 13 >人造序列 <220> < 223 >人造序列之說明：E t s誘捕物 <400> 6 aattcaccgg aagtattcga 20 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x297公釐）

Claims

13Οδ4^)]1102095號專利申請案中文申請專利範圍替換本丨97年1 g _________ ^ 申請專利範園 1· 一種醫藥組合物之用途，其係用於製備使用於皮膚以治療異位性皮膚炎之藥劑者，該組合物係包含N F _凡Β之誘捕物以及醫藥上容許之載劑。其中該NF-/CB之誘捕物其中該醫藥上容許之載其中該醫藥上容許之載 2. 如申請專利範圍第1項之用途包含序列編號1之序列。 3. 如申請專利範圍第1項之用途劑包含凡士林。 4_如申請專利範圍第1項之用途劑包含凡士林、含5 %石由Γ» , 更月曰％之凡士林或含流動石蠟之凡士林。 5.如申請專利範圍第μ之用途，其中該組合物係軟膏型態者。本紙張尺度適财® ®家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐).