KR101799429B1 - 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물 - Google Patents

신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물에 의하면, 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화와 관련된 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for inhibiting apoptosis of neuron or neurodegeneration}
신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경 세포는 발생이라는 정상적인 생리 작용 과정 또는 질병이라는 병리 과정에서 사멸할 수 있다. 발생 과정 동안에는 적정하고 정확한 전시냅스(presynapse) 및 후시냅스(postsynapse)의 연결을 위하여 과도한 신경 세포들은 세포 사멸 과정을 거쳐 제거된다(Neuron, 40:401-413(2003); Neuron, 20:633-647(1998)). 광범위한 신경 세포의 사멸은 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 병, 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환, 뇌졸증, 외상 후에 관찰이 된다. 이러한 질병들의 직접적인 원인은 아직 정확하게 밝혀지지 않았으나, 이는 세포 사멸과 연관이 있으며, 이러한 세포 사멸에 영향을 주는 원인으로는 산화적 스트레스 (oxidative stress), 칼슘의 항상성 조절(calcium homeostasis) 이상, 미토콘드리아의 기능 장애, 활성 산소종의 생성 증가, 흥분성 신경 독성, 카스파아제 활성화, 영양 인자 고갈 등이 원인이 된다(Nature Reviews Molecular Cell Biology, 1:120-130(2000), Neurotoxicology and Teratology , 24:675-682(2002)).
피킨스 병의 경우 미토콘드리아의 기능 장애는 칼슘의 분비와 활성 산소의 생성을 증가시켜 산화적 스트레스(oxidative stress)를 일으키게 되고, 항산화 시스템의 활성 감소가 보고되었으며, 글루타메이트에 의한 흥분성 신경 독성 또한 파킨스 병과 연관성이 있음이 보고되었다(Neurotoxicology and Teratology, 24:675-682(2002)).
알츠하이머 병에서의 신경 세포 사멸은 산화적 스트레스, 이온 항상성의 조절 장애 (dysregulation of ion homeostasis), 성장 인자 고갈 (growth factor deprivation), 아밀로이드 Aβ의 축적, 대사성 손상(metabolic impairment), 미토콘드리아의 기능 장애, DNA 손상, 단백질 응집과 연관성이 있음이 보고되었다(Nat . Rev. Neurosci ., 7:278-294(2006); Cerebellum, 2:270-278(2003))
현재 다양한 작용에 의해 유도되는 세포 사멸로부터 뉴런을 보호하기 위한 다양한 종류의 신경 보호 약물(neuroprotective agents)들이 제안되고 있다(Neurotoxicology and Teratology, 24:675-682(2002)). 예를 들면, 항산화제(antioxidants), 이온 킬레이터(ion chealators), 자유 라디컬 스케빈져 (free radical scavengers), 신경 영양 인자 (neurotrophic factors), 흥분성 아미노산 길항제(excitatory amino acid antagonists), 생체에너지 보충제(bioenergic supplement), 면역 억제제 (immunosuppressants), 단백질의 응집이나 축적을 막아주는 제제 등이 이에 해당한다. 그러나, 아직까지 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 효과적으로 억제하는 약제는 상용화되지 않은 상태로, 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물의 개발이 여전히 요구되고 있다.
신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
신경 보호 또는 신경 회복을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상은 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경 보호(neuroprotection)를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경 회복(neurorestoration)을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경 퇴행성 질환 또는 허혈 또는 재관류에 의한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 중풍, 알츠하이머 병, 헌팅톤 병, 파킨슨 병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jacob)병, 파킨스-ALS-치매 복합증, 윌슨병, 다발성 경화증, 진행성 핵상 신경마비, 신경병증 통증 양극성 장애, 피질바닥 변성, 정신 분열증, 주의력결핍 과다활동 장애, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 망막 질환, 간질, 뇌졸중, 일과성 허혈발작, 심근허혈, 근육허혈, 뇌에 대한 혈류의 연장된 정지와 관련한 외과적 기술로부터 야기된 허혈, 두부 외상, 척수 외상, 저산소증, 정신 분열증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
화학식 I
Figure 112010028596094-pat00001
상기 식에서 R은 치환되거나 비치환된 C1-C15 아릴알킬 및 C1-C10 헤테로아릴알킬; 및 치환되거나 비치환된 직쇄, 분지쇄 또는 고리형 C1-C10 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며;
Y는 O 및 -N-R1로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1은 H 및 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 최소 하나이며;
R2는 H 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 N, O, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되며;
B는 C 또는 N이며;
Z는 치환 또는 비치환된 헤테로고리; 카바메이트; -OC(=O)NR3R4; NH2; NR5R6; NC(=NH)NH2 및 -NC(=O)NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H; NH2 및 NR7R8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 치환 또는 비치환된 C1-C5 알킬; 및 C1-C3 알킬로 치환 또는 비치환된 헤테로고리로 이루어진 군으로 독립적으로 선택되거나, 또는 R3 및 R4는 함께 C1-C3 알킬로 치환 또는 비치환된 5 내지 7 원자의 헤테로고리를 형성할 수 있으며;
R5 및 R6은 각각 독립적으로 H; C2-C3 알켄; C2-C3 알킨; 및 -OH, -C(O)NH2, C1-C3 알콕시 및 카바메이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의해 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1~C7알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, R5 및 R6이 함께 치환 또는 비치환된 지방족 시클릭 아민 또는 방향족 시클릭 아민을 형성할 수 있고;
R7 및 R8은 각각 독립적으로 H 및 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 최소 하나이며;
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 0 내지 5의 정수이다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 치료학적 유효량의 상기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이성질체, 용매화물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함할 수 있다.
용어 "치료(treatment)"는 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화에 의해 발생하는 질병, 장애 또는 상태를 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질병, 장애, 또는 상태에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질병, 장애 또는 상태가 발생되는 것의 예방, 상기 질병, 장애 또는 상태의 억제, 즉 발전의 억제 및 상기 질병, 장애 또는 상태의 경감, 즉 질병, 장애 또는 상태의 퇴행 야기를 포함하는 것으로 해석된다. 따라서, 용어 "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
일 구체예에 따른 화학식 I의 아졸 유도체의 제조는 당업계에서 화합물 합성에 관한 통상의 지식을 가진 자라면, 공지의 화합물들, 또는 이로부터 용이하게 제조할 수 있는 화합물들을 사용하여 제조할 수 있다. 따라서 상기 아졸 유도체의 제조 방법과 관련된 하기의 설명은 하나의 예시적인 방법들을 제시하는 것에 지나지 않으며, 필요에 따라 단위 조작의 순서 등이 선택적으로 바뀔 수 있는 것으로서, 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
스킴 1: 아졸의 합성
Figure 112010028596094-pat00002
R은 벤질기일 수 있으며, R1, R2, Z, B, m, n은 상기 기재한 바와 같다. 일반적인 합성 방법은 출발 물질인 알데하이드(I)로부터 옥심(Ⅱ)을 만든 후 얻어진 옥심 화합물을 NaOCl 조건에서 알킨 또는 니트릴과 [3+2] 시클로첨가(cycloaddition) 반응을 하여 아졸화합물(Ⅲ 또는 Ⅳ)을 얻고, 이 화합물로부터 원하는 작용기를 도입하여 최종 화합물인 (Ⅴ)를 얻을 수 있다.
스킴 2: 티아졸의 합성
Figure 112010028596094-pat00003
R은 벤질기일 수 있으며, R2, Z, B, 및 m은 상기 기재한 바와 같다. 일반적인 합성 방법은 출발 물질인 아미드(Ⅵ)로부터 옥사티아졸론(Ⅶ)을 만든 후 얻어진 화합물을 NaOCl 조건에서 알킨 또는 니트릴과 [3+2] 사이클로첨가(cycloaddition) 반응을 하여 티아졸 화합물(Ⅷ)을 얻고, 이 화합물의 환원반응(Ⅸ) 및 작용기 도입 반응을 통하여 최종 화합물인 (Ⅹ)를 얻을 수 있다.
스킴 3
Figure 112010028596094-pat00004
R, R2, Z, A, m 및 B는 상기 기재한 바와 같다. 일반적인 합성 방법은 출발 물질인 화합물 (XI)의 디벤질 반응을 통해 하이드록시페닐 유도체(XⅡ)를 얻고 이 화합물에 원하는 작용기를 도입하여 최종 화합물 (XⅢ)을 얻을 수 있다.
스킴 4
Figure 112010028596094-pat00005
R, R1, R2, Z, A, m 및 B는 상기 기재한 바와 같다. 일반적인 합성 방법은 출발 물질인 니트로페닐 유도체 화합물(XⅣ)의 환원 반응을 통해 아미노페닐유도체(XⅤ)를 합성하고, 이 화합물과 원하는 알데히드와의 환원적 아민화(amination) 반응을 통해 최종 화합물인 (XⅥ)를 얻을 수 있다.
또한, 상기 아졸 유도체는 상기 화학식 I로 표시되는 화합물뿐만 아니라 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 즉, 산 또는 염기의 부가염, 및 그의 입체화학적 이성체 형태가 모두 포함되며, 상기 염에는 투여 대상인 객체에서 모 화합물(parent compound)의 활성을 유지하고 바람직하지 못한 효과를 유발하지 않는 염이라면 어느 것이든 포함되는 것으로, 특별히 제한되는 것이 아니다. 그러한 염에는 무기염과 유기염이 포함되며, 예를 들어, 아세트산, 질산, 아스파트산, 술폰산, 설퓨릭산, 말레산, 글루탐산, 포름산, 숙신산, 인산, 프탈산, 탄닌산, 타르타르산, 히드로브롬산, 프로피온산, 벤젠술폰산, 벤조산, 스테아르산, 에실산, 락산, 비카르본산, 비설퓨릭산, 비타르타르산, 옥살산, 부틸산, 칼슘 이데트산, 캄실리산, 카르보닉산, 클로로벤조산, 시트르산, 이데트산, 톨루엔술폰산, 에디실린산, 에실린산, 퓨말산, 글루셉트산, 파모익산, 글루코닉산, 글리콜릴라르사닐산, 메틸니트릭산, 폴리갈라트록닉산, 헥실리소르시논산, 말론산, 히드라밤산, 히드로클로린산, 히드로요도익산, 히드록시나프톨산, 이세티온산, 락토비오닉산, 만델산, 에스톨린산, 점액산, 나프실릭산, 뮤코닉산, p-니트로메탄설포닉산, 헥사믹산, 판토테닉산, 모노히드로겐인산, 디히드로겐인산, 살리실산, 술파민산, 술파닐린산, 메탄술폰산, 테오클릭산일 수 있다. 또한, 상기 염기성 염의 형태로는 예를 들어, 암모늄 염, 리튬, 소듐, 포타슘, 마그네슘 및 칼슘 염과 같은 알칼리 및 알칼리 토금속 염, 예를 들어, 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 하이드라바민 염과 같은 유기 염기를 갖는 염 및 예를 들어, 아르기닌, 리신과 같은 아미노산을 갖는 염을 포함한다. 또한, 상기 염 형태는 적당한 염기 또는 산으로 처리함으로써 유리 형태로 전환될 수도 있다. 용어, "부가염(additional salt)"은 화학식 1의 화합물 및 그의 염이 형성할 수 있는 용매 화합물을 포함한다. 그러한 용매 화합물은 예를 들어, 수화물, 알콜화물이다.
또한, 일 구체예에 따른 화학식 I의 화합물의 입체화학적 이성질체 형태는 화학식 I의 화합물이 가질 수 있는 모든 가능한 화합물을 정의한다. 달리 언급하거나 지적하지 않는다면, 화합물의 화학적 명칭은 모든 가능한 입체화학적 이성체 형태의 혼합물을 지칭하며, 상기 혼합물은 기본 분자 구조의 모든 디아스테레오머 및 에난티오머를 포함한다. 특히, 입체 중심은 R- 또는 S-배위를 가질 수 있으며 2가 시클릭(부분적으로) 포화 라디칼 상의 치환기는 시스-또는 트랜스-배위를 가질 수 있다. 이중 결합을 포함하는 화합물은 상기 이중결합에서 E 또는 Z-입체화학을 가질 수 있다. 상기 화학식 I로 표시되는 화합물의 입체화학적 이성체 형태는 상기 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 화학식 I에서의 정의에 따라, 상기 아졸 유도체 화합물은 예를 들어,카밤산 3-(4-벤질옥시-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-페닐)-[1,2,4]옥사디아졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-페닐)-이소티아졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-페닐)-[1,2,4]티아디아졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-2-클로로-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-3-클로로-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-3-브로모-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-3-플루오로-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-(4-벤질옥시-3,5-디메틸-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(1-페닐-에톡시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2-플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(3-플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(4-플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2,6-디플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2,3-디플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(3,5-디플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(3,4-디플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2,4,6-트리플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(3-트리플루오로메틸-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(3-클로로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2-클로로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(4-클로로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2,6-디클로로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2,5-디클로로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2-클로로-5-플루오로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(3-니트로-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 4-[4-(5-카바모일옥시메틸-아이속사졸-3-일)-페녹시메틸]-벤조산 메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(4-메틸-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(2-메틸-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(3-메톡시-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 3-[4-(3-트리플루오로메틸-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 카밤산 3-[4-(4-이소프로필-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르 또는 카밤산 3-[4-(4-테르트-부틸-벤질옥시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르일 수 있다. 상기 화합물의 제조 방법은 본 발명자가 출원한 국내 특허 출원 제2009-15856호에 상세히 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로서 삽입된다.
일 구체예에 따르면, 상기 치환된 아졸 유도체 화합물은 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 카밤산 3-(4-벤질옥시-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르(이하, CBI)일 수 있다.
화학식 Ⅱ
Figure 112010028596094-pat00006
한편, 일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 것이다.
용어 "신경 세포(neuron)"는 하나의 세포체(cell body), 세포체의 돌기인 하나의 축삭(즉, 액손 또는 뉴라이트) 및 여러 개의 수상 돌기(즉, 덴드라이트)를 포함하는 동물 세포를 의미하며, 예를 들어, 상기 신경 세포는 감각 신경 세포, 운동 신경 세포, 연합 신경 세포일 수 있다. 또한, 상기 신경 세포는 중추 신경계, 뇌, 뇌간, 척수, 중추 신경계와 말초 신경계의 접합부분 등의 구조를 이루는 뉴런, 신경지지 세포, 글리아, 슈만 세포 등을 포함할 수 있다.
용어 "신경 세포의 사멸(death of neuron)"은 상기 신경 세포가 아폽토시스(apoptosis)에 의해 죽는 것을 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "신경 퇴화(neurodegeneration)"는 상기 신경 세포의 사멸을 포함하는 신경 세포의 구조 또는 기능의 점진적인 손상을 의미한다.
신경 세포의 사멸 또는 신경 퇴화는 예를 들어, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 병, 파킨스 병과 같은 다양한 뇌질환을 야기한다는 것이 당업자에게 널리 알려져 있으며, 상기 질환의 예방 또는 치료를 위해 신경 세포 사멸의 기전에 관한 연구가 진행되고 있다. Nature Reviews Molecular Cell Biology 1:120-130 (2000) 및 Journal of Cellular and Molecular Medicine, 12:2263-2280 (2008)은 신경의 세포 사멸이 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 허혈, 뇌졸증, 경화 등 다양한 증상의 원인이 되며, 산화적 스트레스(oxidative stress), 미토콘드리아의 기능 장애와 같은 신경세포 사멸에 대한 작용의 연구를 통해 신경 퇴화 질환의 예방 또는 치료의 방법을 제시할 수 있음이 개시되어 있다. 따라서, 신경 세포의 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하기 위한 효과를 갖는 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 상기 개시한 질병의 예방 또는 치료를 의미한다는 것을 의약 분야의 통상적인 기술자라면 명확하게 인식할 수 있을 것이다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 신경 보호를 위한 것이다.
용어 "신경 보호(neuroprotection)"는 신경 세포의 사멸 또는 신경 퇴화로부터 신경 세포를 보호하는 신경계 내에서의 작용을 의미하며, 구체적으로, 신경 상해를 감소, 억제하거나 개선시키는 효과, 또한 신경 상해에 의해 손상된 신경 조직 내의 신경 세포를 보호, 소생 또는 재생시키는 효과를 의미한다. 또한, 상기 용어 신경 보호는, 상기 의미로 당업자들에게 공지되어 일반적으로 널리 사용되고 있는 당업계의 표준 용어이다 (NeuroReport, 9:3955-3959(1998); Chen, J-F., J. Neurosci., 21:RC143(2001) 등). 용어 "신경 세포의 보호(protection of neuron cell)"는 신경성 인설트를 경감 또는 개선(amelioration)하는 작용, 또는 신경성 인설트에 의해 손상을 입은 신경 세포의 보호 또는 회복시키는 작용을 의미한다. 또한, 용어 "신경성 인설트(nervous insult)"는 다양한 원인(예를 들어, 대사성 원인, 독성 원인, 신경 독성 원인 및 화학적 원인, 등)에 의해 초래되는 신경 세포 또는 신경 조직의 손상을 의미한다. 상기 신경성 인설트의 구체적인 예를 들면, 산화적 스트레스(oxidative stress), 칼슘의 항상성 조절(calcium homeostasis)의 이상, 미토콘드리아 기능 장애, 흥분성 신경 독성(excitotoxicity), 카스파아제의 활성화(caspase activation), 영양 인자의 고갈(trophic deprivation) 등이 있다(Nature Reviews Molecular Cell Biology 1:120-130(2000), Neurotoxicology and Teratology 24:675-682(2002)) 등이 있다. 상기 약학적 조성물은 이러한 다양한 신경성 인설트로부터 신경세포의 사멸 또는 퇴화를 억제하거나 신경 세포를 보호하는 효과를 갖는다. 예를 들면, 신경성 인설트로서 산화적 스트레스(oxidative stress)는 다양한 신경세포 사멸 또는 퇴화와 관련된 질환, 예를 들어 알츠하이머 병, 근위축성 측삭 경화증, 탈수초성 질환 (demyelinating diseases), 당뇨병성 신경병증(diabetic polyneuropathy), 다운 증후군, HIV 신경병증, 헌팅턴 병, 다계통 위축(multiple system atrophy), 파킨슨 병, 뇌졸증-허혈 재관류 손상, 타우병증(tauopathy) 및 외상성 뇌손상 등을 야기할 수 있으며, 활성 산소종(reactive oxygen species)에 대해 방어 기능을 하는 항산화 효소(anti-oxidant enzyme)의 활성 증가 또한 신경 보호(neuroprotection) 작용을 하는 하나의 방법으로 알려져 있다(Free radical Biology & Medicine, 33(2):182-191(2002)). 따라서, 상기 약학적 조성물은 활성 산성종의 감소를 유도하여 산화적 스트레스를 억제함으로써, 신경 세포의 사멸을 막아 상기 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 상기 약학적 조성물은 국소빈혈, 발작, 경련 또는 외상 장애 등으로부터 뇌 또는 척수 손상을 방지하도록 의도된 의약품 또는 화학제인 신경 보호적 치료제로써 사용될 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 신경 회복을 위한 것이다.
용어 "신경 회복(neurorestoration)"은 신경 세포로부터 새로운 시냅스 연결 형성을 촉진시켜 손상된 신경계를 회복시키는 것을 의미한다. 상기 신경 회복은 손상된 신경 세포로 인한 기능 저하를 보상할 수 있는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 신경 회복은 신경 세포에서 주변 세포와의 교감을 위한 뉴라이트(neurite)의 생성 및 성장 또는 스파인(spine)의 수를 증가시키는 것일 수 있다.
상기 신경 회복에 의해 다양한 신경 계통의 질환이 예방 또는 치료가 될 수 있음은 당업계에 잘 알려져 있다. Neurotoxicity Research, 2:71-84(2000)는 상기 신경 회복에 사용되는 약물에 의해 헌팅턴 병, 파킨슨 병, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 병과 같은 특정 질병의 예방 또는 치료가 가능함을 개시하고 있으며, WO 07/022182는 중추 신경계의 신경 회복을 통해 헌팅턴 병 등의 질환을 치료할 수 있음을 개시하고 있다.
상기와 같이, 신경 세포의 사멸 또는 퇴화는 다양한 신경성 인설트에 의해서 발생하고, 이러한 신경 세포의 사멸 또는 퇴화는 상기한 바와 같이 다양한 신경 퇴행성 질환에 관련되므로, 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 상기 다양한 신경성 인설트의 억제 작용을 통해 상기 신경 퇴행성 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 신경 퇴행성 질환 또는 허혈 또는 재관류에 의한 질환의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 상기 신경 퇴행성 질환은 예를 들어, 치매, 헌팅톤 병, 파킨슨 병 및 근위축성 측삭 경화증일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 약학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 상기 허혈 또는 재관류에 의한 질환은 예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 일과성 허혈발작, 심근허혈, 근육허혈 및 뇌에 대한 혈류의 연장된 정지와 관련한 외과적 기술로부터 야기된 허혈일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 중풍, 알츠하이머 병, 헌팅톤 병, 파킨슨 병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jacob)병, 파킨스-ALS-치매 복합증, 윌슨병, 다발성 경화증, 진행성 핵상 신경마비, 신경병증 통증 양극성 장애, 피질바닥 변성, 정신 분열증, 주의력결핍 과다활동 장애, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 망막 질환, 간질, 뇌졸중, 일과성 허혈발작, 심근허혈, 근육허혈, 뇌에 대한 혈류의 연장된 정지와 관련한 외과적 기술로부터 야기된 허혈, 두부 외상, 척수 외상, 저산소증, 정신 분열증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 약학적 조성물을 대상에 접촉시키는 단계를 포함하는 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화와 연관된 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 약학적 조성물을 대상에 접촉시키는 단계를 포함하는 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하는 방법을 포함할 수 있다. 상기 질환은 예를 들어, 중풍, 알츠하이머 병, 헌팅톤 병, 파킨슨 병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jacob)병, 파킨스-ALS-치매 복합증, 윌슨병, 다발성 경화증, 진행성 핵상 신경마비, 신경병증 통증 양극성 장애, 피질바닥 변성, 정신 분열증, 주의력결핍 과다활동 장애, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 망막 질환, 간질, 뇌졸중, 일과성 허혈발작, 심근허혈, 근육허혈, 뇌에 대한 혈류의 연장된 정지와 관련한 외과적 기술로부터 야기된 허혈, 두부 외상, 척수 외상, 저산소증, 정신 분열증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 접촉은 인 비트로 또는 인 비보로 수행될 수 있으며, 인 비보로 접촉하는 경우, 상기 약학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 대상은 세포, 조직, 기관 또는 개체일 수 있다. 또한, 상기 투여는 상기 약학적 조성물을 적절한 완충액에 용해하여 세포, 조직 또는 기관에 직접 접촉시키거나, 개체에 비경구 투여를 할 수 있다. 상기 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 또는 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물에 의하면, 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화와 관련된 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 MPTP-유도 원숭이의 파킨슨 장애의 정도를 확인한 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 MPTP-유도 원숭이의 중앙 선조체 및 꼬리 선조체에서 도파민 운반체 존재 여부를 확인한 현미경 사진이다.
도 3은 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 MPTP-유도 마우스의 꼬리 현수 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 MPTP-유도 마우스의 선조체 내 도파민 농도의 확인 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 MPTP-유도 마우스의 흑색질에서의 신경 세포 감소 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 6-OHDA-유도 랫트의 흑색질 치밀부의 세포 감소 정도를 티로신 히드록실라아제 항체를 이용한 면역조직화학 염색 및 크레실 바이올렛 염색을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 말로네이트-유도 마우스의 선조체의 손상 회복 여부를 나타내는 사진이다.
도 8은 일 구체예에 따른 CBI를 투여받은 말로네이트-유도 마우스의 선조체의 손상 회복 정도를 나타내는 그래프이다.
도 9는 일 구체예에 따른 CBI를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 세포 사멸 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 CBI를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 Bcl-2의 mRNA 양을 측정한 결과이다.
도 11은 일 구체예에 따른 CBI를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 Bcl-2 및 Bcl-xL 단백질의 양을 측정한 결과이다.
도 12는 일 구체예에 따른 CBI를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 BDNF의 mRNA 양을 측정한 결과이다.
도 13은 일 구체예에 따른 CBI를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 GDNF의 mRNA 양을 측정한 결과이다.
도 14는 일 구체예에 따른 CBI를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 NGF의 mRNA 양을 측정한 결과이다.
도 15는 일 구체예에 따른 CBI를 투여한 마우스에서 NGF의 mRNA 양을 측정한 결과이다.
도 16은 일 구체예에 따른 CBI 및 MPP+를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 미토콘드리아의 막 전위를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 일 구체예에 따른 CBI 및 MPP+를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 세포질 내의 시토크롬 c의 양을 측정한 결과이다.
도 18은 일 구체예에 따른 CBI 및 MPP+를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 카스파아제 3의 활성을 측정한 결과이다.
도 19는 일 구체예에 따른 CBI 및 MPP+를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 활성 산소종을 확인한 현미경 사진이다.
도 20은 일 구체예에 따른 CBI 및 MPP+를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 활성 산소종을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 일 구체예에 따른 CBI 및 MPP+를 처리한 MAO-B가 결핍된 SH-SY5Y 세포에서 카탈라아제, 과산소 디스뮤타아제 및 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성을 측정한 결과이다.
도 22는 일 구체예에 따른 CBI를 투여한 마우스의 선조체 및 흑색질에서 카탈라아제, 과산소 디스뮤타아제 및 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성을 측정한 결과이다.
도 23은 일 구체예에 따른 CBI를 투여한 MPTP-유도 마우스에서 신경 돌기 회복 여부를 확인한 현미경 사진 및 분석 그래프이다.
도 24는 일 구체예에 따른 CBI를 투여한 MPTP-유도 마우스에서 스파인의 회복 여부를 확인한 현미경 사진 및 분석 그래프이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 카밤산 3-(4- 벤질옥시 - 페닐 )- 아이속사졸 -5- 일메틸 에스테르(화학식 Ⅱ)의 제조
화학식 Ⅱ
Figure 112010028596094-pat00007
1.1. 4- 벤질옥시 - 벤즈알데히드 옥심의 합성
4-벤질옥시벤즈알데히드(4.24 g, 20 mmol)를 에탄올, 물(3:1 100 ㎖) 0.2 M 혼합액에 교반하면서 용해시켰다. 여기에 NH2OH-HCl(2.78g, 40 mmol)과 소듐아세테이트(2.46g, 30mmol)을 가하고 상온에서 약 30분 동안 교반하였다. 액체크로마토그래피로 반응의 종결을 확인한 다음, 물과 에탄올을 감압 증류하여 연노란색의 고체 화합물을 얻었다. 이 고체 화합물을 물과 에틸 아세테이트로 3회 추출하고 유기 용매 층을 감압한 다음, 조(crude) 화합물을 헥산/에틸아세테이트(10:1)로 재결정하여 흰색의 고체 화합물을 얻었다. 얻어진 고체는 추가 정제 과정 없이 다음 반응을 진행하였다.
1.2. [3-(4- 벤질옥시 - 페닐 )- 아이속사졸 -5-일]-메탄올의 합성
4-벤질옥시-벤즈알데히드옥심(2.27 g, 10 mmol; 92% 순도의 화합물)을 메틸렌클로라이드 (40 ㎖, 0.25 M)에 녹인 후 프로파르길 알콜(1.77 ㎖, 30 mmol)을 가하였다. 이 용액에 10% NaOCl (13.7 ㎖, 20 mmol)을 적하 깔대기(dropping funnel)를 이용하여 0℃에서 아주 천천히 적가하였다. NaOCl을 모두 넣어주고 나면 온도를 상온으로 서서히 올리면서 약 5 시간 동안 교반하였다. 액체크로마토그래피로 반응의 종결을 확인한 후 감압 증류하여 메틸렌클로라이드를 증발시키고, 잔여물에 물(200 ㎖)을 가한 후, 생긴 고체를 여과하였다. 여과된 화합물을 과량의 물로 세척하고, 마지막으로 디에틸에테르로 세척하였다. 상기 수득한 고체 화합물을 에틸아세테이트/헥산(1:2)으로 재결정하여 흰색의 고체의 [3-(4-벤질옥시-페닐)-아이속사졸-5-일]-메탄올을 얻었다(수득량: 2.5 g).
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) δ7.7 (d, 2H), 7.4 (m, 4H), 7.1 (d, 2H), 6.5 (s, 1H), 5.1 (s, 2H), 4.8 (s, 2H)
1.3. 카밤산 3-(4- 벤질옥시 - 페닐 )- 아이속사졸 -5- 일메틸 에스테르의 합성
250 ㎖ 플라스크에 담긴 [3-(4-벤질옥시-페닐)-아이속사졸-5-일]-메탄올(2.813 g, 10 mmol)이 포함된 THF(50 ㎖, 0.2 M) 용액에 1.04 ㎖(12 mmol)의 클로로술포닐 이소시아네이트를 -78℃에서 천천히 가하였다. 액체크로마토그래피로 출발 물질이 모두 사라진 것을 확인한 후 물을 반응액에 가하였다. 1시간 후 감압증류하여 THF를 증발시키고, 여기에 100 ㎖의 물을 가한 다음, 생긴 고체를 여과하였다. 여과된 고체는 100 ㎖의 물과 에틸아세테이트/헥산(1:2)용액으로 각각 세척한 다음, 건조시켜 3.4 g의 조 생성물(순도: 95.9%)을 얻었다. 상기 조 생성물을 1% 메탄올을 포함하는 에틸아세테이트/헥산/메틸렌클로라이드(1:4:1)용액에서 재결정하여, 2.743 g의 카밤산 3-(4-벤질옥시-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르(이하 CBI로 명명함)를 99%의 순도로 얻었다.
1H-NMR (CDCl3, 200MHz) δ7.7 (d, 2H), 7.4 (m, 4H), 7.1 (d, 2H), 6.6 (s, 1H), 5.2 (s, 2H), 5.1 (s, 2H), 4.8 (brs, 2H)
실시예 2: MPTP -유도 원숭이 모델을 통한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)은 파킨슨 병 환자에서 관찰되는 것과 유사한 임상적, 생화학적, 병리적 특징들을 유도하는 것으로 보고 되었으며, 설치류 및 영장류에서 파킨슨 병에 대한 동물 모델을 만드는데 널리 사용되는 신경 독소로 알려져 있다(J. Neural Transm ., 103:987-1041(1996); Neurotoxicol . Teratol . 24:607-620(2002)). MPTP는 MAO-B 효소에 의해 1-메틸-4-페닐-피리디늄(MPP+)으로 전환되고, MPP+는 도파민 운반체(dopamine transporter, DAT)에 높은 결합력을 가지며, 미토콘드리아의 기능 장애와 산화적 스트레스를 유도하여, 그 결과 도파민의 생성을 유도하는 도파민성 뉴런의 세포 사멸을 초래한다(J. Neurochem ., 61:1191-1206(1993); J. Neural Transm ., 103:987-1041(1996); Mov . Disord ., 13:35-38(1998); Restor . Neurol . Neurosci ., 16:135-142(2000))
실험 모델은 마카크(macaque) 원숭이(n=35, 연령 3-4년)를 사용하였다. 상기 원숭이를 3 그룹으로 나누고, 여기에 0.2 mg/kg의 MPTP를 정맥 주사에 의해 투여하고(하루에 한번, 매일, 파킨슨 장애 스코어가 8에 도달할 때까지 또는 14일 동안 투여 하였다. 14일 투여를 마친 다음날부터, 각각 부형제(대조군), 1 mg/kg의 CBI 및 1 mg/kg의 라사질린(미국 특허 제5,457,133호에 기재된 R(+)-N-프로파길-1-아미노인단의 제조 방법에 따라 제조)을 4주 동안 경구 투여한 다음, 파킨슨 장애 스코어의 변화를 측정하였다. 또한, CBI의 도파민 작용제로써의 효과를 확인하기 위해 상기 MPTP-유도 원숭이 모델로부터 중앙 선조체(medial striatum) 및 꼬리 선조체(caudal striatum)에 존재하는 도파민 운반체를 도파민 운반체 결합 분석(dopamine transporter binding assay)을 통해 확인하였다.
실시예 2-1: 파킨슨 장애 정도의 측정
파킨슨 장애 정도는 a) 움직임의 범위, b) 운동 감소증, c) 자세의 비정상 정도, d) 떨림의 4가지 기준에 기초하여, 비디오 촬영된 행동의 분석에 의해 측정되었다. 파킨슨 장애 스코어는 (4 - 움직임의 범위) + 운동 감소증 + 자세의 비정상 정도 + 떨림의 총합으로 평가되었다. 이로부터 전체적인 파킨슨 장애 스코어의 최대값은 10이 된다. 상기 파킨슨 장애 테스트는 2시간에 걸쳐 매 30분마다 10분 동안 측정되었다. 즉, 최대 파킨슨 장애 스코어의 최대값은 40이다. 한편, 4가지 기준에 대한 평가 방법은 다음과 같으며, 하기 평가된 스코어는 관찰되는 기간에 걸쳐 대표적인 행동을 나타낸 것이다:
a) 움직임의 범위 스코어: 0 = 움직임 없음; 1 = 머리만 움직임; 2 =
관찰 시간의 30% 이상을, 운동 없이, 머리, 팔다리 및/또는 몸통을 움직임; 3 = 관찰 시간의 30% 이하를 걸어다니고/걸어다니거나 케이지의 벽을 타고 올라감; 4 = 관찰 시간의 30% 이상을 걸어다니고/걸어다니거나 케이지의 벽을 타고 올라감.
b) 운동 감소증 스코어: 0 = 정상적인 움직임의 속도 및 시작; 1 = 움직임이 약간 느려짐; 2 = 중간 정도의 느린 움직임, 움직임을 시작하고 유지하기 어려움, 몸이 뚜렷하게 굳어짐; 3 = 운동 불능, 지속적으로 몸이 굳어 움직일 수 없음.
c) 자세의 비정상 정도 스코어: 0 = 정상, 자세가 바름, 고개 듬, 정상적인 균형; 1 = 굽은 몸체, 고개 듬; 2 = 굽은 몸체 및 목, 고개를 들지 못함, 균형을 잃음.
d) 떨림 스코어: 0 = 없음; 1 = 있음.
상기와 같이 파킨슨 장애 정도를 측정한 결과, CBI를 투여받은 원숭이 그룹은 파킨슨 병의 치료에 사용되는 약물로 알려진 라사질린에 비해 파킨슨 장애의 정도가 현저하게 낮아짐을 확인할 수 있었다(도 1).
실시예 2-2: 도파민 운반체 결합 분석
뇌를 적출한 후, 뇌간을 분리하고, 대뇌 반구를 정중선을 따라 이등분하였다. 조직을 이소펜탄 (-45℃)에 침수시켜 즉시 냉동시킨 다음 -80℃에 저장하였다. -17℃의 저온 유지 장치에서 20 μm의 두께로 대뇌 반구의 관상 절편을 제작한 다음, 젤라틴이 코팅된 슬라이드 상에 해동하여 올려 놓고, 슬라이드 상에서 건조시킨 다음 -80℃에 저장하였다.
도파민 운반체 결합을 위해, [125I]-(E)-N-(3-요도프로-2-펜일)-2β카르복시메틸 -3β(4'-메틸페닐)-노르트로판 (PE2I)의 방사성 원소 표지는 도파민 신경 말단을 확인하기 위한 종래의 방법에 따라 스태닐(stannyl) 전구체로부터 수행되었다 (D. Guilloteau et al., 1998). 정제 후, [125I]PE2I는 2000 Ci/mmol의 활성을 갖는, 운반체가 첨가되지 않은 형태(no-carrier-added form)로 얻었다. 종래 개시된 방법과 같이 절편을 pH 7.4의 포스페이트 완충액 (NaH2PO4 10.14 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, KH2PO4 1.76 mM) 중 100 pM [125I]PE2I로 25℃에서 90분 동안 배양하였다 (S. Chalon et al., 1999; E. Bezard et al., 2001). 인접한 절편을 100 μM 코카인 (Sigma, St Louis, MO)의 존재 하에 배양하여 비특이적 결합을 확인하였다. 배양 후, 절편을 4℃에서 포스페이트 완충액에 20분 동안 2회 세척하고, 4℃에서 증류수에 1초 동안 헹구었다. 상온에서 건조시킨 다음, 절편을 X-선 카세트 중의 조정된 [125I]-마이크로스케일 (Amersham)과 함께, β 방사능-민감성 필름 (Hyperfilm β max, Amersham, Buckingamshire, UK)에 3일 동안 노출시켜, 원하는 지역에 결합된 방사능을 측정하였다.
도 2에서 나타난 바와 같이, CBI를 투여받은 원숭이 그룹은 중앙 및 꼬리 선조체에서 도파민 운반체가 다수 관찰되었으며, 동일한 용량을 투여한 라사질린에 비해 현저하게 많은 양의 도파민 운반체를 관찰할 수 있었다. 이는 CBI가 도파민 생성 뉴런의 세포 사멸을 효과적으로 억제함으로써, MPTP에 의한 도파민 운반체의 손실이 대조군 또는 라사질린 처리군에 비해 상대적으로 적음을 보여주는 결과이다. 상기 결과로부터 CBI는 파킨슨 병의 진행의 억제를 포함한 신경 보호 작용을 수행할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: MPTP -유도 마우스 모델을 통한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
실험 모델은 C57BL/6 마우스(n=94, 연령 8주; 웅성)를 사용하였다(substrain: C57BL/6NCrljBgi, ㈜ 오리엔트 바이오). 상기 마우스에 30 mg/kg의 MPTP를 복강 주사에 의해 매일 1회씩 4일 동안 투여하고, 마지막 투여일로부터 4일 후에, 상기 마우스를 3개의 그룹으로 나누어, 부형제(대조군), 1 mg/kg의 CBI 및 1 mg/kg의 라사질린을 매일 1회씩 10일 동안 경구 투여한 다음, 마지막 투여 다음날 꼬리 현수 테스트(tail suspension test, TST)을 수행한 후, 선조체(striatum)와 흑색질 뇌 조직을 추출하여 선조체 내 도파민 및 그 대사 산물의 농도 및 흑색질(substantia nigra)에서의 신경 세포 감소 정도를 확인하였다.
실시예 3-1: 꼬리 현수 테스트를 통한 마우스의 행동 분석
MPTP 및 약물 투여에 따른 행동 손상의 유발 정도를 측정하기 위하여 꼬리 현수 테스트(tail suspension test)를 수행하였다. 상기와 같이 화합물을 투여하고, 7일이 경과한 후, 폭 1 cm의 원형 스테인리스 봉을 35 cm 높이에 있는 좌우가 검은색 목재로 차폐된 폭 16 cm, 높이 40cm의 케이지에 고정하여 실험하였다. 총 6분 동안 마우스의 움직이는 시간을 초단위로 측정하여 상기 화합물의 효능을 평가하였다.
꼬리 현수 분석 결과, MPTP를 처리한 그룹에서는 유의미한 행동 손상을 보인 반면 CBI를 투여한 MPTP-유도 마우스는 정상 마우스와 동일한 정도의 행동을 나타내었으며, 라사질린을 투여한 그룹의 마우스에 비해서도 우수한 행동 회복 능력을 보임을 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 3-2: 선조체 내 도파민 및 그 대사 산물의 함량 측정
MPTP 및 상기 화합물의 투여에 따른 선조체 내 도파민 및 도파민 대사물질의 함량 변화를 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 이용하여 측정하였다. 상기와 같이 화합물을 투여하고, 7일이 경과한 후, 마우스를 경추 탈골에 의해 희생시키고 즉시 뇌조직을 적출하였다. 적출된 뇌조직으로부터 선조체를 얻어 차가운 0.5 ml 의 HPLC 분석 용액(0.1 M의 과염소산, 0.1 mM EDTA)을 첨가한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 조직 균등액을 제조하였다. 상기 균등액을 12,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 그 상층액을 니트로셀룰로스 막 여과지(0.2 um, Millipore)로 여과하였다. HPLC 분석에는 HR-80 컬럼(80 mm x 4.6 mm, 입자 크기: 3 ㎛, ESA, USA)을 사용하였으며, 이동상(0.07 M 모노베이직 소듐 포스페이트, 1 mM 소듐 옥타술폰산, 0.1 uM EDTA, 5% 아세토니트릴, pH 3.2)의 유속은 0.7 ml/min으로 유지하였고, 전기 화학 검출기 (Coulochem III, ESA, USA)의 전극 전위는 E1 = -100 mV, E2 = 350mV 로 수행하였다.
상기 실험을 통해 선조체 내의 도파민 농도를 분석한 결과, 라사질린을 투여한 마우스는 정상 마우스에 비하여 약 40% 수준의 도파민 농도의 회복을 보였으나, CBI를 투여한 MPTP-유도 마우스는 정상 마우스에 비하여 약 70%의 회복을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 3-3: 티로신 히드록실라아제 항체를 이용한 면역조직화학 염색
상기 화합물의 투여에 따른 선조체와 흑색질에서 티로신 히드록실하아제(tyrosine hydroxylase) 항체 발현 변화를 면역조직화학 염색을 통하여 측정하였다. 마우스를 소듐 펜토바르비탈 (50 mg/kg)로 마취시키고, 흉곽을 열어 심장으로 200 ml의 0.1 M PBS (pH 7.4)를 관류시켜 혈관 내의 혈액을 제거하였다. 혈액을 충분히 제거한 후, 250-300 ml의 4% 파라포름알데히드/PBS 고정액을 관류시키고, 뇌를 적출하여 상기 고정액으로 24 시간 동안 냉장 상태에서 후고정(postfixation)을 실시하였다. 이후, 뇌조직을 PBS로 깨끗이 세척하여 고정액을 제거하고, 동결 시 일어나는 결빙 과립(ice crystal)을 방지하기 위해 30% 수크로즈 용액으로 옮겨 조직이 가라앉을 때까지 보관하였다. 상기 조직을 동결용 포매제(OCT compound)로 포매하고 -40℃에서 냉동 시킨 다음, Cryostat (Reichert Frigocut model 2000)을 사용하여 선조체와 흑색질을 포함하는 중뇌 부분을 40 ㎛ 두께의 연속 관상 절편을 제작하였다. 보관된 조직은 3% H2O2/PBS 에서 30분 동안 반응 시킨 후 0.3% Triton X-100, 3% 소 혈청 알부민 이 포함되어 있는 0.1 M PBS에서 30분 동안 반응시켰다. 도파민이 존재하는 세포를 선택적으로 염색하기 위해, 일차 항체는 항-마우스 모노클로날 TH (Chemicon International, Temecula, CA; 1:500)를 사용하여 상온에서 밤새 반응시켰으며, 이차 항체로 비오틴화된 고트-항-마우스 IgG (Vector Lab, Burlingame, CA, 1:200)를 사용하였다. 이후, Vectastain elite ABC kit (Vector Lab, Burlingame, CA)를 사용하여 아비딘-비오틴 결합을 유도한 다음, 3,4-디아미노벤지딘 (DAB)을 이용하여 발색시켰다. 발색시킨 조직을 PBS에 넣어 슬라이드 글라스에 옮긴 다음, 건조 후 커버글라스를 덮었다. 이를 디지털 카메라가 부착된 현미경(Olympus BX-60, Olympus Optical, Tokyo, Japan)을 이용하여 중뇌 흑색질 부분을 200배의 배율로 관찰한 후, 티로신 히드록실라아제 항체에 양성 반응을 나타내는 세포를 관찰하고, 이를 기록한 다음, Graph pad Prism 4 프로그램을 이용하여 통계 분석(One-way ANOVA)을 하였다.
상기와 같이 티로신 히드록실라아제 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 통해, 흑색질에서의 신경 세포 감소 정도를 분석한 결과, CBI를 투여한 MPTP-유도 마우스는 라사질린을 투여한 마우스와 동일한 정도의 감소를 나타내었다(도 5). 상기 결과로부터 CBI는 도파민 작용제로써의 기능을 하여 신경 보호 작용을 수행할 수 있으며, 종래 알려진 도파민 작용제인 라사질린보다 우수한 효과를 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 6- OHDA -유도 랫트 모델을 통한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
6-히드록시도파민(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)는 히드록시 라디칼의 생성을 증가시킴으로써 흑색질 선조체 뉴런의 퇴화를 유도하는 것으로 알려져 있는 신경 독소 이다. 히드록시 라디칼은 신경 세포의 말단 부분을 빠르게 파괴하여(J. Neural. Transm ., 103:987-1041(1996); J. Neurosci ., 19:1284-1293(1999)), 흑색질 치밀부(substantia nigra pars compacta, SNpc)에 있는 세포들의 점진적 손실을 가져오게 되며, 이러한 손상은 초기 파킨슨 병 환자들에서 관찰되는 점진적 흑색질 선조체의 퇴화와 유사한 것으로 알려져 있다(Brain Res ., 26:301-307(1991); Neurosci., 59:401-415(1994); Neurosci ., 67:631-647(1995); Neurosci ., 72:641-653(1996)).
실험 모델은 ㈜ 오리엔트 바이오에서 공급된 위스타(Wistar) 랫트(부형제 및 CBI n=7, 라사질린 n=6; 연령 6주; 20마리의 웅성)를 사용하였다. 상기 랫트에 20 ㎍/㎕의 6-OHDA을 포함하는 용액 3 ㎕를 선조체에 일측 주사(위치: 전면-1.0 mm, 후면-3.0 mm, 후복부면-5.0 mm)하여, 선조체 내 뉴런의 퇴행을 유발시켰다. 상기 랫트를 3개의 그룹으로 나누어, 부형제(대조군), 1 mg/kg의 CBI 및 1 mg/kg의 라사질린을 각각 6-OHDA 투여 1시간 전 및 하루 간격으로 1회씩 6주 동안 경구 투여한 다음, 마지막 투여일로부터 4주, 5주 및 6주째 되는 날에 아포모르핀-유도 회전 시험을 수행하였다. 아포모르핀-유도 회전 시험은 상기 각 그룹의 랫트에 0.5 mg/kg의 용량의 아포모르핀을 복강 주사로 투여하고, 랫트를 회전 챔버에 놓은 다음, 45분 동안 회전 동작을 기록하여 각 그룹의 랫트들의 분당 회전 횟수를 측정하여 평균값을 결정하는 방법으로 수행하였다. 또한, 6주째의 아포모르핀-유도 회전 시험 후에 랫트를 희생시켜 티로신 히드록실라아제 항체를 이용한 면역조직화학 염색 및 크레실 바이올렛 염색으로 흑색질 치밀부의 세포 감소 정도를 확인하였다. 상기 실시예 3-3과 같은 방법으로 연속 관상 절편을 제작한 다음, 상기 절편을 PBS에 넣고 실린이 코팅된 슬라이드에 붙인 다음, 건조시키고, 슬라이드를 자일렌, 100% 알코올, 95% 알코올, 70% 알코올 및 증류수에 각각 5분, 2분, 1분, 1분 및 2분 동안 넣었다. 이후, 1% 크레실 바이올렛 용액에 5분 동안 침수 시키고, 상기 방법과 반대의 순서로 슬라이드를 세척한 다음, 커버글라스를 덮고 디지털 카메라가 부착된 현미경(Olympus BX-60, Olympus Optical, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 중뇌 흑색질 부분을 200배의 배율로 관찰한 다음, 크레실 바이올렛에 양성 반응을 나타내는 세포를 관찰하고, 이를 기록하였다. 상기 기록한 데이터는 Graph pad Prism 4 프로그램을 이용하여 통계 분석(One-way ANOVA)을 하였다.
도 6에서 나타나는 바와 같이, CBI를 처리한 6-OHDA-유도 랫트는 신경 세포의 감소 정도가 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며, 라사질린을 처리한 그룹보다 그 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 말로네이트 -유도 마우스 모델을 통한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
말로네이트는 미토콘드리아의 효소인 숙시네이트 탈수소효소의 가역적인 억제제로, 미토콘드리아의 전자 전달계를 억제하여, 흥분 독성 뉴런 퇴화를 유도하거나, 선조체에서 도파민 유출을 증가시켜 선조체의 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 미토콘드리아의 생체 에너지 결핍은 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병 및 근위축성 측삭 경화증과 같은 다양한 신경 퇴화 질환들의 병리 현상과 연관되어 있으며 (Ann . Neurol ., 58:495-505(2005); Nat . Rev . Neurosci ., 7:278-294(2006)), 동물의 선조체로 말로네이트의 주입은 국소 허혈이나 헌팅턴 병에서 관찰되는 것과 유사한 손상이 유발된다(Experimental Neurology, 178:301-305(2002)). 이는 여러 뉴런 집단에 대사 스트레스를 일으켜 결국 흑질 도파민 세포의 세포 몸체뿐만 아니라 선조체의 도파민의 양도 감소하게 된다(J. Neurochem ., 61:1147-1150(1993); Brain Res ., 773:223-226(1997); Neuroscience, 96:309-316(2000)).
실험 모델은 ICR 마우스(n=34, 연령 10주; 웅성)를 사용하였다. 상기 마우스에 에퀴테신(5 ml/kg)을 복강으로 주사하여 마취시키고 뇌 저위 수술기구에 양쪽 외이도선을 기준으로 하여 두 개의 수평조절기를 0 mm에 고정시킨 후, 두개골을 천공하였다. 대조군은 0.2 mg/ml 아스코브산을 사용하고, 병변군과 화합물 처리군은 말로네이트 (2.4 umole/2 μl)를 오른쪽 선조체(브레그마(bregma)를 기준으로 앞으로(AP) 0.5 mm, 옆으로(ML) 1.2 mm, 경막(dura matter)에서 밑으로(DV) 3.1 mm)에 Hamilton syringe(10 ul, 26G 바늘)를 사용하여 분당 1 uL의 속도로 주입하였다. 이 중 말로네이트 투여군은 2개의 그룹으로 나누어, 부형제 용액(n=12) 및 5 mg/kg의 CBI 용액(n=14)을 각각 수술 2 시간 전에 0.5 ml/kg씩 복강 주사로 투여하고 다시, 수술 후 1시간, 1일, 2일 및 3일 총 5회에 걸쳐 투여하였다. 말로네이트를 선조체에 주입하고 3일 후에 마우스를 희생시키고, 뇌를 적출하여 단편을 만든 다음, 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드 (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)로 염색하였다.
도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이, CBI의 처리는 말로네이트에 의해 유도된 선조체에서의 뉴런의 사멸을 억제시켜 선조체의 손상 부위를 현저하게 감소시킴을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 결과는 CBI가 미토콘드리아의 손상에 의한 뉴런의 사멸을 완화시킴을 제시한다.
실시예 6: 신경 세포의 항- 아폽토시스에 의한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
뇌졸중, 뇌손상, 척수 손상, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병 및 파킨슨 병과 같은 많은 신경 퇴행성 질환은 뉴런 세포의 사멸을 특징으로 하며 (The New England Journal of Medicine, 348:1365(2003)), 만성 신경퇴행성 질환들은 여러 가지의 내재적 또는 외부적 요인들에 의한 아폽토시스 경로의 유도에 의해 일어난다고 알려져 있다. 세포 사멸 동안 일어나는 생화학적, 분자생물학적 변화들을 설명하기 위해, 뉴런 세포 사멸의 여러 단계에서 다중 방향성 작용을 보이는 물질을 찾거나 신경 보호 약물과 함께 처리하는 노력이 진행 중에 있다 (CNS drugs, 19:723(2005); Nat . Rev . Neurosci ., 7:295(2006)).
하기 실시예 6 내지 10에서는 CBI가 상기 여러 가지의 내재적 또는 외부적 요인들에 유발되는 신경 세포의 아폽토시스를 억제함으로써 신경 퇴행성 질환을 치료한다는 효과를 제시하도록 한다.
본 실시예에서는 MAO-B가 결핍된 인간 신경아세포종(neuroblastoma) SH-SY5Y 세포(한국세포주 은행)을 사용하였다. 상기 세포에 대한 아폽토시스의 유발은 혈청 고갈(serum starvation)에 의하였다. 정상배지에서 배양한 세포를 6-웰 플레이트에 1.8 x 105의 농도로 분주하여 하루 동안 배양한 후, CBI (0.1, 1 및 10 μM), 라사질린 (0.1, 1 및 10 μM)을 포함한 혈청 고갈 배지, 또는 상기 CBI 또는 라사질린 중 어느 것도 포함하지 않은 혈청 고갈 배지로 교체한 후 48 시간 동안 5%의 CO2, 37℃에서 추가 배양하였다. 이후, 아폽토시스를 유발시키지 않은 대조군과 비교하여 사멸된 세포의 숫자를 백분율로 표시하였다.
도 9에서 나타난 바와 같이, 아폽토시스를 유발시킨 신경 세포에 CBI를 처리하였을 때, 세포 사멸 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 10 μM의 CBI를 처리한 경우, 동량의 라사질린을 처리한 경우보다 약 33%의 세포 사멸 감소 효과가 더 나타나는 것으로 확인되었다.
한편, 아폽토시스를 매개 또는 억제하기 위한 과정에는 다양한 신호전달 단백질들이 관여하고 있으며, 그 중 가장 대표적인 것이 Bcl-2 유전자 패밀리 단백질들이다(Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 37:179- 190(2005); J. Cell Mol. Med ., 7:249-257(2003); Genes and Development, 13:1899-1911(1999)). 따라서, 상기와 같이 아폽토시스를 유발시킨 세포에 각각 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM의 CBI 또는 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM 의 라사질린을 첨가하고, 5%의 CO2, 37℃에서 24 시간 동안 추가로 배양한 세포로부터 mRNA를 추출하거나 또는 세포 추출물을 얻어, Bcl-2 mRNA의 양 및 Bcl-2와 Bcl-xL 단백질의 양을 측정하였다. Bcl-2 mRNA의 양은 실시간 RT-PCR 방법에 의하여 측정하였으며, Bcl-2와 Bcl-xL 단백질 양은 웨스턴 블롯 방법에 의하여 확인하였다.
총 RNA는 SH-SY5Y 세포를 무혈청 배지에서 24시간 동안 CBI 또는 라사질린을 처리한 다음, RNeasy® Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 2 ug의 총 RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)를 사용하여 역전사한 다음, Bcl-2에 대한 TaqMan 프로브 (Applied Biosystems, USA)로 실시간 PCR (Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR SYSTEM)을 수행하였다. 내부 대조군으로, 18S RNA에 대한 mRNA를 증폭하였다. 표적 유전자의 mRNA 수준의 상대적인 정량은 ddCt 방법 (Takekawa, 1998)을 사용하여 결정하였다.
웨스턴 블롯을 위하여 RIPA buffer(50mM Tris-Cl pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA)로 세포를 용해시킨 후, 원심분리기를 이용하여 세포 추출물을 얻었다. 상기 추출물을 정량화 하여 SDS-PAGE 젤에 동일 용량을 넣어 전기영동 한 다음, 니트로셀룰로즈 멤브레인에 옮기고, Bcl-2 항체(Cat#: 2872, Cell Signaling, USA), Bcl-xL 항체(Cat#: 2762, Cell Signaling, USA)를 각각 1:5000으로 희석하여, 당업계에 공지된 방법에 따라 블롯팅한 다음, ECL 키트 (Amersham Pharmacia)를 이용하여 Bcl-2 및 Bcl-xL의 단백질 발현량을 확인하였다. 대조군으로는 b-actin 항체(Cat#: A2228, Sigma, USA)를 사용하여 b-actin의 단백질 발현량을 확인하였다.
도 10 및 도 11에서 나타낸 바와 같이, 아폽토시스를 유발시킨 신경 세포에 CBI를 처리한 경우, 항-아폽토시스의 기능을 갖는 Bcl-2의 mRNA의 양은 대조군에 비해 1.5 내지 2배 정도 증가하였으며, 단백질의 양 또한 동일하게 증가함을 확인할 수 있었다. 또 다른 항-아폽토시스 단백질인 Bcl-xL도 대조군에 비해 그 양이 증가하였음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로 볼 때, CBI는 신경 세포의 아폽토시스를 억제하기 위한 효과를 보여주며, 이를 통해 신경 보호에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 신경 영양 인자의 발현 유도에 의한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
신경 영양 인자는 신경 세포의 발달, 재생, 치유에 중요한 기능을 하는 단백질로, 대표적인 신경 영양 인자로는 뇌-유래 신경 영양 인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 신경아교세포계 신경 영양 인자(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) 및 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF)가 있다. 상기 신경 영양 인자의 유도는 신경 세포의 사멸을 억제시키는 기능을 할 수 있다(Nature medicine, 15:331-337(2009); Brain Research Bulletin, 57:817-822(2002); The Journal of Neuroscience, 21:8108-8118(2001); The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 322:59-69(2007); TRENDS in Pharmacological Sciences, 27:619-625(2006)).
실시예 6과 동일한 방법으로 아폽토시스를 유발시킨 세포에 각각 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM의 CBI 또는 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM 의 라사질린을 첨가하고, 5%의 CO2, 37℃에서 24시간 동안 추가로 배양한 세포로부터 mRNA를 추출하여, BDNF, GDNF, NGF의 mRNA 양을 실시간 RT-PCR 방법에 의하여 측정하였다.
도 12 내지 도 14에서 나타낸 바와 같이, 아폽토시스를 유발시킨 신경 세포에 CBI를 처리한 경우, 각각의 mRNA 양은 BDNF가 1.5 내지 2배, GDNF가 4 내지 8배, NGF의 mRNA 양이 2 내지 2.5배 정도 증가하였음을 확인할 수 있었다.
또한, CBI의 처리에 의한 신경 영양 인자의 유도 여부를 인 비보에서 확인하기 위해, C57BL/6 마우스 모델(n=12, 8주령의 웅성, ㈜ 오리엔트 바이오)을 사용하였다. 상기 마우스를 3개의 그룹(n=4)으로 나누어, 부형제(대조군), 1 mg/kg의 CBI 및 1 mg/kg의 라사질린을 각각 신경 독소의 처리 없이 8일 동안 하루에 한번씩 경구 투여한 다음, 마지막 투여 다음날 각 그룹의 마우스로부터 선조체 및 흑색질 조직을 적출하였다. 상기 적출된 조직의 세포로부터 mRNA를 추출하여, NGF의 mRNA 양을 실시간 RT-PCR 방법에 의하여 측정하였다.
도 15에서 나타낸 바와 같이, 마우스에 CBI를 처리한 경우, NGF의 mRNA 양은 선조체에서 약 1.7배 내지 2.5배 정도 증가하였음을 확인할 수 있었다. 특히, CBI를 처리한 경우, 라사질린과 비교하여 마우스의 선조체에서 NGF의 발현을 현저하게 증가시킴을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, CBI는 신경 세포의 상기 신경 영양 인자들의 발현을 유도하여 신경 세포의 사멸을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 신경 세포의 미토콘드리아 기능 향상에 의한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
본 실시예에서는 MAO-B가 결핍된 인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포(한국세포주 은행)를 사용하였다. 상기 세포를 DMEM 배지로 5%의 CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 5개의 그룹으로 나누어, 각각 2 mM의 1-메틸-4-페닐피리디늄(MPP+)를 첨가하고, 이 중 3개의 그룹에 각각 1 nM, 10 nM 및 50 nM의 CBI를 처리하고, 1개의 그룹에 10 nM의 라사질린을 처리한 다음, 24시간 동안 5%의 CO2, 37℃에서 추가로 배양하였다. 나머지 1개의 그룹은 MPP+만 첨가하고 다른 처리를 하지 않은 상태로 상기와 동일한 조건으로 배양하였다. 이후, 제조사의 프로토콜에 따라 MitoPTtm 키트(Immunochemistry Technology)를 사용하여 미토콘드리아의 막 전위(transmembrane potential)를 결정하였다. 미토콘드리아의 막 전위는 형광 플레이트 리더기(Tecan, Austria)를 사용하여 확인하였다. 미토콘드리아의 막 전위가 낮으면 녹색 형광을, 높으면 적색 형광을 나타내므로, 상기 결과로부터 RFU 값(적색 형광 수치/녹색 형광 수치)를 결정하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
MPP+는 미토콘드리아의 막 전위를 낮추어, 막의 불안정성을 유도하는 화합물이다. 미토콘드리아의 막 투과성(membrane permeabilization)은 아폽토시스의 과정에 있어서 필수적인 과정이므로, 미토콘드리아 막의 안정성은 항-아폽토시스의 기작이 될 수 있다(Brain Res . Rev ., 29:1-25(1999)). 도 16에서 나타나는 바와 같이, MPP+가 첨가된 신경 세포는 CBI의 처리에 의해 농도 의존적으로 막 전위가 안정되는 것을 관찰할 수 있었으며, 동일 농도의 라사질린을 처리한 그룹보다 약 2배 이상의 미토콘드리아 막 전위 안정 효과를 확인할 수 있었다.
상기 설명한 바와 같이, 뇌졸중, 뇌손상, 척수 손상, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병 및 파킨슨 병 등의 신경 퇴행성 질환은 뉴런의 세포의 사멸을 특징으로 하며 (The New England Journal of Medicine, 348:1365(2003)), 세포의 사멸은 여러 가지의 내재적 또는 외부적 요인들에 의한 아폽토시스 경로의 유도에 의해 일어난다. 또한, 미토콘드리아의 막 안정성은 항-아폽토시스의 기작으로, Bcl-2 또는 Bcl-xL에 의해 아폽토시스가 억제되고, 상기 단백질에 의해 미토콘드리아의 막이 안정된다고 알려져 있다(Biochem Biophys Res Commun ., 304(3):433-435(2003); N Engl J Med ., 348(14):1365-1375(2003); Brain Res Rev ., 29(1):1-25(1999); Journal of Neurological Sciences, 283:240-320(2009)). 따라서, 상기 결과는 CBI가 미토콘드리아의 막 전위를 안정화시켜 상기 신경 퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 제시한다.
또한, 아폽토시스는 미토콘드리아로부터 시토크롬 c가 방출되고 카스파아제 3(caspase 3)가 활성화되는 기작으로 진행되는 것으로 알려져 있다(The New England journal of Medicine, 348:1365-1375(2003)). 상기 CBI의 처리로 인한 미토콘드리아 막 전위의 안정성이 신경 세포의 항-아폽토시스와 관련이 있는지 여부를 확인하기 위해, 상기 그룹의 세포로부터 세포 추출물을 얻어, 세포질 내의 시토크롬 c의 양과 카스파아제 3의 활성을 측정하였다.
실시예 8-1: 시토크롬 c 방출 측정
SH-SY5Y 세포를 상기와 같이 배양한 후, PBS로 세척하였다. 고장 완충액(hypertonic buffer) (20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA)에 protease inhibitor cocktail (Roche) 및 phosphatase inhibitor cocktail (Roche)을 첨가하고, 그 중 100 ul를 상기 세포에 처리하여 균일하게 현탁 시켰다. 상기 결과물을 얼음에 30분 동안 방치한 다음, 12,000 rpm 에서 20분 동안 원심 분리하였다. 이후, 상기 상층액을 이용하여 동일 용량을 SDS-PAGE에 로딩하여 전기영동 한 다음, 니트로셀룰로즈 멤브레인에 옮기고, 시토크롬 c (Santacruz, sc13156)를 1:2000으로 희석하여, 당업계에 공지된 방법에 따라 블롯팅한 다음, ECL 키트 (Amersham Pharmacia)를 이용하여 시토크롬 c의 발현 여부를 조사하였다.
도 17에서 나타난 바와 같이, MPP+가 첨가된 신경 세포는 CBI의 처리에 의해 세포질 내에 시토크롬 c의 양이 감소하였으며, 동일 농도의 라사질린을 처리한 것보다 미토콘드리아로부터 방출된 시토크롬 c의 양이 더 적음을 확인할 수 있었다.
실시예 8-2: 카스파아제 3/7 활성 측정
5 x 105 개의 SH-SY5Y 세포를 96 웰-플래이트에 상기와 같이 배양하고, 2 mM의 MPP+ 및 CBI (1, 5, 10 및 50 nM), 라사질린 (50 nM)을 처리한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 100 ul의 Apo-ONE caspase 3/7 reagent(Promega, G7790)를 첨가하여 혼합하고, 다시 4 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 형광 플레이트 리더(GeminiXPS, Molecular Devices)를 이용하여 여기(excitation) 파장 495 nm, 방출(emission) 파장 521 nm에서 형광을 측정하였다. 도 18에서 나타난 바와 같이, 라사질린과 마찬가지로, CBI의 처리로 인하여 카스파아제 3의 활성이 감소하였음을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 8의 결과로부터, CBI는 신경 세포에서 미토콘드리아 막을 안정시켜 시토크롬 c의 방출을 막고, 이에 따라 카스파아제 3의 활성을 감소시킴으로써 세포 사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
상기한 바와 같이, 뇌졸중, 뇌손상, 척수 손상, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴 병, 알츠하이머 병 및 파킨슨 병 등의 신경 퇴행성 질환은 뉴런의 세포의 사멸을 특징으로 하므로, 상기 결과는 CBI가 신경 세포 사멸을 억제함으로써 상기 신경 퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 제시한다.
실시예 9: 신경 세포의 활성 산소종 저해에 의한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
본 실시예에서는 MAO-B가 결핍된 인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포(한국세포주 은행)를 사용하였다. 상기 세포를 DMEM 배지로 5%의 CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 3개의 그룹으로 나누어, 각각 2 mM의 MPP+를 첨가하고, 이 중 1개의 그룹에 50 nM의 CBI를 처리하고, 1개의 그룹에 50 nM의 라사질린을 처리한 다음, 24시간 동안 5%의 CO2, 37℃에서 추가로 배양하였다. 나머지 1개의 그룹은 MPP+만 첨가하고 다른 처리를 하지 않은 상태로 상기와 동일한 조건으로 배양하였다. 이후, 상기 세포에 활성 산소종을 검출할 수 있는 형광 다이인 2,7-디클로로플루오레세인 디아세테이트(2,7-dichlorofluorescein diacetate, DCF-DA)로 염색한 다음, 공초점 현미경(Nikon Co., Japan)으로 관찰하였다.
도 19 및 도 20에서 나타난 바와 같이, MPP+가 첨가된 신경 세포는 동일 농도의 라사질린을 처리하였을 경우와 마찬가지로, CBI의 처리에 의해 활성 산소종이 현저하게 감소하였다.
세포에서의 활성 산소종의 생성 및 증가는 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, 상기 결과로부터, CBI는 신경 세포에서 활성 산소종의 감소를 유도 세포 사멸을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 산화적 스트레스는 다양한 신경세포 사멸 또는 퇴화와 관련된 질환, 예를 들어 알츠하이머 병, 근위축성 측삭 경화증, 탈수초성 질환 (demyelinating diseases), 당뇨병성 신경병증(diabetic polyneuropathy), 다운 증후군, HIV 신경병증, 헌팅턴 병, 다계통 위축(multiple system atrophy), 파킨슨 병, 뇌졸증-허혈 재관류 손상, 타우병증(tauopathy) 및 외상성 뇌손상 등을 야기할 수 있다고 알려져 있으므로(Free radical Biology & Medicine, 33(2):182-191(2002)), 상기 결과는 CBI가 활성 산성종의 감소를 유도하여 산화적 스트레스를 억제함으로써, 신경 세포의 사멸을 막아 상기 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있음을 제시한다.
실시예 10: 항산화 효소의 활성 증가에 의한 CBI 의 신경 보호 효과 확인
본 실시예에서는 MAO-B가 결핍된 인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포(한국세포주 은행)를 사용하였다. 상기 세포를 1.8 x 105개씩 6-웰 플레이트에 분주하고, 5%의 CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 3개의 그룹으로 나누어, 각각 2 mM의 MPP+를 첨가하고, 이 중 2개의 그룹에 0.1 μM 및 1 μM의 CBI를 처리한 다음, 24시간 동안 5%의 CO2, 37℃에서 추가로 배양하였다. 나머지 1개의 그룹은 MPP+도 처리 하지 않은 상태로 상기와 동일한 조건으로 배양하였다. 이후, 상기 세포로부터 세포 추출물을 얻어, 항산화 효소인 카탈라아제(catalase), 과산소 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD) 및 글루타티온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase, GPx)의 활성을 측정하였다.
도 21에서 나타난 바와 같이, MPP+가 첨가된 신경 세포는 MPP+가 첨가되지 않은 그룹에 비해 카탈라아제 및 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성이 감소되는 경향을 보여 주었으며, CBI의 처리는 감소된 항산화 효소의 활성을 증가 시켜주는 양상을 보였다. 특히, 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성은 대조군에 비해 2.5배 내지 4배 정도 크게 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, CBI의 처리에 의한 항산화 효소의 활성이 증가 여부를 인 비보에서 확인하기 위해, C57BL/6 마우스 모델(n=4, 8-9 주령의 웅성)을 사용하였다(㈜ 오리엔트 바이오). 상기 마우스를 3개의 그룹(n=4)으로 나누어, 부형제(대조군), 1 mg/kg의 CBI 및 1 mg/kg의 라사질린을 각각 신경 독소의 처리 없이 8일 동안 경구 투여한 다음, 마지막 투여 다음날 각 그룹의 마우스로부터 선조체 및 흑색질 조직을 적출하였다. 상기 적출된 조직의 세포로부터 세포 추출물을 얻어, 카탈라아제, 과산소 디스뮤타아제 및 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성을 측정하였다.
도 22에서 나타낸 바와 같이, 마우스에 CBI를 처리한 경우, 과산소 디스뮤타아제의 활성은 큰 변화가 없었으나, 카탈라아제의 활성은 선조체에서 약 13% 정도, 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성은 흑색질에서 약 28% 정도 증가하였다.
세포에서의 활성 산소종의 생성 및 증가는 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 항산화 효소는 상기 활성 산소종을 분해하는 것으로 알려져 있으므로, 상기 결과로부터, CBI는 신경 세포에서 항산화 효소, 특히, 흑색질에서 글루타티온 퍼옥시다아제의 활성을 증가시켜 활성 산소종의 감소를 유도함으로써 세포 사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 상기 결과는 CBI가 활성 산성종의 감소를 유도하여 산화적 스트레스를 억제함으로써, 신경 세포의 사멸을 막아 상기 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있음을 제시한다.
실시예 11: CBI 의 신경 세포 회복 효과 확인
실험 모델은 C57BL/6 마우스(n=8/그룹(총4그룹), 연령 8주; 웅성)를 사용하였다(substrain: C57BL/6NCrljBgi, 구입처: ㈜오리엔트 바이오). 상기 마우스에 30 mg/kg의 MPTP를 복강 주사에 의해 매일 1회씩 4일 동안 투여하고, 마지막 투여일로부터 4일 후에, 상기 마우스를 3개의 그룹(n=4)으로 나누어, 부형제(대조군), 1 mg/kg의 CBI 및 1 mg/kg의 라사질린을 매일 1회씩 10일 동안 경구 투여한 다음, 마지막 투여 다음날 선조체 및 흑색질 조직을 적출하였다. 상기 조직 중의 신경 세포 당 신경 돌기 숫자 및 스파인(spine)의 숫자의 증가 여부를 관찰하기 위해, 진동 절편기(vibratome)을 사용하여 선조체 또는 흑색질을 포함하는 관상 슬라이스 (200 ㎛의 두께)를 제작하였다. 마우스를 희생시킨 다음, 뇌를 적출하여 카르보겐 (5 % CO2 및 95 % O2)으로 버블링된 차가운 고농도의 수크로즈 해부 완충액(87 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 1 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 10 mM 덱스트로즈, 및 75 mM 수크로즈)에 옮겼다. 진동 절편을 수행하는 동안, 슬라이싱 챔버(slicing chamber)는 일정하게 카로보겐화된 상기 해부 완충액으로 채웠다. 절편화가 완료된 다음, 모든 절편을 PBS로 세척하고, PBS 용액 중 4%의 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 뇌 절편은 1.5 % 아가로즈 (PBS 중) 블록 위에 위치시켰다. 이미지는 Zeiss LSM 이미지 브라우져 소프트웨어 (Carl Zeiss Microimaging, Germany, version 4.0 SP2)를 사용하여 콘포칼 형광 현미경(ZEISS LSM 510 META)으로 얻었다.
도 23 및 도 24에서 나타난 바와 같이, MPTP-유도 마우스에 CBI를 처리한 경우 신경 돌기의 수의 증가뿐만 아니라 스파인의 숫자도 정상세포의 수준으로 회복되었다. 특히, 라사질린의 경우는 스파인의 수의 증가는 관찰되었으나 신경 돌기의 증가는 통계적 유의성을 보이지 않았다. 상기 결과로부터, CBI는 세포 사멸을 억제할 뿐 아니라, 신경 가소성(neural plasticity)를 증진시키는 데 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 12: CBI 의 투여 및 CBI 를 포함하는 타블렛의 제조(예상)
본 발명에 따른 화합물은 신경 세포 사멸 또는 신경 퇴화를 억제하거나, 신경 보호 또는 신경 회복에 사용된다. 임상적인 적정 투여량(경구 투여)은 성인을 기준으로 25 mg이다.
상기 투여량을 기준으로, 하기 표 1의 성분을 함유하는 타블렛을 통상적인 방법으로 제조하였다. 부형제는 아비셀(Avicel) 102(미세결정형 셀룰로즈)를 사용하였다.
성분 양
CBI ~ 25 mg
포비돈 K30 ~ 100 mg
미세결정형 셀룰로즈 ~ 100 mg
소듐 스타치 글리코레이트 ~ 7.5 mg
마그네슘 스테아레이트 ~ 2.5 mg
총량 ~ 235 mg
상기 화합물의 적정 투여량은 60 kg의 성인을 기준으로 하였을 때, 하루에 상기 화합물을 포함하는 타블렛 1개 또는 2개이다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 신경 보호(neuroprotection)를 위한 약학적 조성물.
    화학식 I
    Figure 112017028352608-pat00038

    상기 식에서 R은 C7-C15 페닐알킬이고;
    Y는 O이며;
    R1은 H 또는 C1-C3 알킬이고;
    R2는 H 또는 할로겐이며;
    A는 O이고;
    B는 C 이며;
    Z는 -OC(=O)NR3R4이고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이며;
    m은 0 내지 2의 정수이고;
    n은 0 또는 1의 정수이다.
  3. 삭제
  4. 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 파킨슨씨 병을 제외한 신경 퇴행성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
    화학식 I
    Figure 112017045249309-pat00039

    상기 식에서 R은 C7-C15 페닐알킬이고;
    Y는 O이며;
    R1은 H 또는 C1-C3 알킬이고;
    R2는 H 또는 할로겐이며;
    A는 O이고;
    B는 C 이며;
    Z는 -OC(=O)NR3R4이고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이며;
    m은 0 내지 2의 정수이고;
    n은 0 또는 1의 정수이다.
  5. 치료학적 유효량의 하기 화학식 I로 표시되는 치환된 아졸 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로부터 선택되는 화합물; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 중풍, 알츠하이머 병, 헌팅톤 병, 피크(Pick)병, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jacob)병, 파킨스-ALS-치매 복합증, 윌슨병, 다발성 경화증, 진행성 핵상 신경마비, 신경병증 통증, 양극성 장애, 피질기저핵 변성(corticobasal degeneration), 정신 분열증, 주의력결핍 과다활동 장애, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 망막 질환, 간질, 뇌졸중, 일과성 허혈발작, 심근허혈, 근육허혈, 뇌에 대한 혈류의 연장된 정지와 관련한 외과적 기술로부터 야기된 허혈, 두부 외상, 척수 외상, 저산소증 및 우울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
    화학식 I
    Figure 112017045249309-pat00040

    상기 식에서 R은 C7-C15 페닐알킬이고;
    Y는 O이며;
    R1은 H 또는 C1-C3 알킬이고;
    R2는 H 또는 할로겐이며;
    A는 O이고;
    B는 C 이며;
    Z는 -OC(=O)NR3R4이고;
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이며;
    m은 0 내지 2의 정수이고;
    n은 0 또는 1의 정수이다.
  6. 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환된 아졸 유도체 화합물은
    카밤산 3-(4-벤질옥시-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르,
    카밤산 3-(4-벤질옥시-2-클로로-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르,
    카밤산 3-(4-벤질옥시-3-클로로-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르,
    카밤산 3-(4-벤질옥시-3-브로모-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르,
    카밤산 3-(4-벤질옥시-3-플루오로-페닐)-아이속사졸-5-일메틸 에스테르, 및
    카밤산 3-[4-(1-페닐-에톡시)-페닐]-아이속사졸-5-일메틸 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  7. 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환된 아졸 유도체 화합물은 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물인 것인 약학적 조성물.
    화학식 Ⅱ
    Figure 112016103704624-pat00013

  8. 삭제
  9. 삭제
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