KR100445640B1

KR100445640B1 - 부테인의 간경화 및 간섬유증 치료제 조성물

Info

Publication number: KR100445640B1
Application number: KR10-2001-0076524A
Authority: KR
Inventors: 손동환; 김윤철; 남극성; 이성희; 박은전; 우선욱
Original assignee: 학교법인 원광학원
Priority date: 2001-12-05
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2004-08-25
Also published as: KR20030046119A

Abstract

본 발명은 부테인(Butein)을 유효성분으로 함유하는 간섬유증(hepatic fibrosis) 및 간경화 치료제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은, 1) 간조직에서의 콜라겐발현억제 및 콜라겐분해를 촉진하고, 콜라겐을 생성하는 간성상세포의 증식 및 활성화를 억제함으로써, 간섬유증 및 간경화의 특징적 소견인 콜라겐의 과다축적을 저지하며; 2) 간섬유증 및 간경화 환자에게서 간세포기능 또는 간기능의 손상을 억제함으로써, 만성적인 간손상에 의한 간기능 저하로 유발되는 혈중 알부민 수치의 감소를 정상수준으로 회복시킬 수 있는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물에 관한 것이다.

Description

부테인의 간경화 및 간섬유증 치료제 조성물{A composition for treating hepatic fibrosis and cirrhosis containing butein}

본 발명은 부테인(Butein)을 유효성분으로 함유하는 간섬유증(hepaticfibrosis) 및 간경화 치료제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은, 1) 간조직에서의 콜라겐발현억제 및 콜라겐분해를 촉진하고, 콜라겐을 생성하는 간성상세포의 증식 및 활성화를 억제함으로써, 간섬유증 및 간경화의 특징적 소견인 콜라겐의 과다축적을 저지하며; 2) 간섬유증 및 간경화 환자에게서 간세포기능 또는 간기능의 손상을 억제함으로써, 만성적인 간손상에 의한 간기능 저하로 유발되는 혈중 알부민 수치의 감소를 정상수준으로 회복시킬 수 있는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물에 관한 것이다.

간섬유증은 만성염증상태에 있는 간조직이 손상과 재생을 반복하여, 조직 중에 콜라겐 등과 같은 결합조직이 과도하게 축적됨으로써, 간조직에 흉터(scar)가 생기는 질환을 의미한다.

일반적으로 간섬유증은 간경변과는 달리 가역적(reversible)이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule) 형성이 없다. 또한, 간손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있다. 그러나, 이러한 간섬유증 기작이 반복적으로 지속되면, 결합조직간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)가 축적되며, 간소엽의 정상구조를 상실하여 결절을 형성하는 것을 특징으로 하는 비가역적인(irreversible) 간경변으로 진행된다.

간질환은 그 원인이 다양하지만, 만성화될 경우 결국 그 원인과는 상관없이 공통적으로 간섬유증 내지 간경변에 이르게 된다. 간질환은 초기 자각증세가 없어 조기진단이 어렵고, 일반적으로 만성에 이르러서야 발견되기 때문에, 그 치료가 쉽지 않고, 사망률이 높아 사회적인 문제를 야기하고 있다. 또한, 효능이 우수한 치료제는 아직 개발되지 않았다.

당업계에서 간섬유증의 발병 기작은 세포, 사이토카인(cytokine) 및 결합조직(extracellular matrix, ECM)간의 복잡한 상호작용에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 간섬유화시 ECM의 과다생성은 간내 대식세포인 쿠퍼세포(Kupffer cell)가 활성화됨으로써 분비되는 여러 사이토카인에 의해 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)의 활성화가 촉진되고 활성화된 간성상세포에서 결합조직의 생성이 증가됨으로써 야기되는 것으로 알려져 있다.

간성상세포는 1876년 쿠퍼(Kupffer)에 의해 발견되었고, 이토(Ito)에 의해 기술되었으며, 1971년 웨이크(Wake)에 의해 정립되었다. 간성상세포는 동모양혈관 내피세포와 간세포사이의 딧세강(space of Disse)에 위치한 세포로서 별모양을 하고 있어서 간성상세포, 이토 세포(Ito cell), 비타민 A를 함유하고 있는 지방소적(lipid droplet)을 갖고 있어서 비타민 A 저장 세포(vitamin A storing cell), 지방 저장 세포(fat storing cell) 또는 동양구조유사 간 지질세포(perisinusoidal hepatic lipocyte) 등으로 여러 가지로 명명되었으나 1990년대 말에 공식용어로 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)라 결정되어 현재까지 사용되고 있다.

쿠퍼세포는 여러 독성물질에 의해 손상된 간세포를 식작용(phagocytosis)함으로써 활성화되거나 또는 독성물질에 의해 직접 활성화되어 형질발현 성장인자-베타(transforming growth factor-β; TGF-beta), 혈소판-유도된 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF) 등의 사이토카인을 분비하며, 이들 사이토카인에 의해 쿠퍼세포 자기자신이 다시 활성화(autocrine)된다. 또한, 쿠퍼세포가 분비한 사이토카인들에 의해 간조직내 동모양혈관 내피세포(sinusoidal endothelial cell) 및 간성상세포가 활성화된다. 활성화된 간성상세포에 의해 분비되는 4형 콜라겐나아제(collagenase type IV)와 증가된 콜라겐 생산에 의해 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)의 정상구성비율이 깨지면서 기저막 ECM(basement membrane-like matrix, 예를 들어 4형 콜라겐)은 분해되고, 세포간 ECM(interstitial type matrix, 예를 들어 1형 및 3형 콜라겐)은 서로 꼬여 소섬유상 콜라겐(fibril-forming collagen)을 형성한 후 딧세강(space of Disse)에 축적되며, 분해된 기저막 ECM 및 축적된 세포간 ECM에 의해서 간성상세포가 활성화된다.

또한, 활성화된 간성상세포는 콜라겐분해효소(Metalloproteinase; MMP)의 활성 억제물질인 마크로글로불린(macroglobulin) 및 TIMP 등의 생성을 촉진시켜, 과도하게 생성되는 세포간 ECM의 분해도 억제한다. 딧세강에 축적된 세포간ECM에 의해 혈액과 간세포간의 물질교환이 저해됨으로써, 간세포는 영양물질의 공급 및 독성물질의 배출이 어렵게 되고, 간세포 역시 지속적으로 손상된다. 이러한 일련의 반응이 반복되면서 간조직 중에 결합조직이 축적되면서, 간섬유화 내지 간경화가 유발된다.

현재 간섬유증에 대한 연구는 ECM에 대한 연구, 이에 관여하는 세포와 각종 세포간의 관계, 세포의 활성화 기전, 각종 사이토카인 및 항섬유화제(antifibrogenic agents)에 대한 연구 등 여러가지 방면으로 활발히 진행되고 있으며, 간섬유증의 조기 진단방법 및 치료제 개발을 목표로 하고 있다. 특히, 과다축적된 결합조직의 생산을 수반하는 간섬유화 및 간경화의 가장 큰 유발원인이 간성상세포의 활성화라고 것이 밝혀지면서, 현재 성상세포(stellate cell)의 활성 및 활성화를 억제할 수 있는 약물 개발에 대한 연구가 지속되고 있다.

종래에 간섬유증 또는 간경화를 억제하는 물질로, 페니실라민, 16,16-디메틸 프로스티글라딘 E2, 비페닐 디메틸 디카르복실산, 콜키친, 글루코코티코이드, 말로틸산(malotilate), 감마-인터페론, 펜톡시필린(pentoxifylline), 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸)아미드 등이 개발되었지만, 임상에 적용시 작용이 미약하거나 부작용이 심하여, 현재로서는 임상에 사용되고 있는 간섬유증 및 간경화 치료제는 없다고 말할 수 있다(Boker et al., J. Hepatol., 13, s35, 1991; Tamayo et al., ibid, 3, 112, 1983; Jenkins et al., ibid, 1, 489, 1985; Kershenobich et al., ibid, 7, 1104, 1987; Svegliati et al., 18 209A, 1993; Guzelian et al., Gastro., 86, 897, 1984; Ala-Kokko et al., J. Lab. Clin. Med., 113, 177, 1989).

이에, 본 발명자 등은 간섬유증 및 간경화의 치료에 보다 효과적으로 이용될 수 있는 물질을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 부테인(Butein)이 간조직내 콜라겐의 생성을 억제하고, 콜라겐의 분해를 촉진시킬 수 있으며, 간손상에 의해 저하된 간기능을 회복시킬 수 있어, 부테인을 함유하는 조성물이 간섬유증 및 간경화 치료에 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은, 사염화탄소에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 실험동물모델로부터 추출한 간 조직에 대하여, 부테인이 활성화된 간성상세포의 증식을 억제함을 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 면역조직학적 염색법에 의해 보여준 도면이다.

도 2는, 사염화탄소에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 실험동물의 간 조직에서 α1(Ⅰ)콜라겐 및 TIMP-1을 코딩하는 유전자의 증가된 mRNA 발현을 부테인이 억제함을 보여주는 도면이다.

도 3은, 일차배양한 활성화된 간성상세포에서 부테인이 α1(Ⅰ)콜라겐 및 TIMP-1을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현을 억제하고, 콜라겐분해효소인 MMP-13을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현을 증가시킴을 보여주는 도면이다.

도4는 일차배양한 활성화된 간성상세포에서 부테인이 콜라겐 및 α-SMA의 발현을 단백질 수준에서 억제함을 보여주는 도면이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 간섬유증 및 간경화로 진단된 환자의 치료에 이용될 수 있는 물질로서 부테인(Butein)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 의하면, 부테인은 콜라겐 단백질을 코딩하는 유전자로서 알려진 알파1(Ⅰ) 콜라겐 유전자의 발현을 억제하고, 콜라겐 단백질 분해효소로서 알려진 메탈로프로테인나아제-13(metalloproteinase-13; MMP-13) 유전자의 발현을 증가시키며, 상기 MMP-13 단백질의 활성억제 단백질로서 알려진 TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1) 유전자의 발현을 억제시킬 수 있기 때문에, 부테인을 유효성분으로 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 간조직에서의 콜라겐발현을 억제하고, 콜라겐분해를 촉진시켜, 간조직 내에 콜라겐이 과다축적되는 것을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은, 간성상세포의 증식 및 활성화를 억제함으로써, 간조직에서 과도하게 증가되는 콜라겐 및 결합조직(connective tissue)의 생성을 억제함으로써, 간섬유증 발현 및 간섬유증의 간경화으로의 발전을 막을 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은, 만성적인 간손상에 의한 간기능 저하로 유발되는 혈중 알부민 수치의 감소를 정상수준으로 회복시킬 수 있으며, 이는 부테인을 유효성분으로 함유하는 본 발명에 따른 조성물이 손상된 간세포기능 또는 간기능을 회복시킬 수 있다는 것을 의미한다.

부테인은 달베르지아 오도리퍼라(Dalbergia odorifera T. Chen)에 의해 분리된 플로보노이드(flavonoid)계에 속하는 성분으로 2',4',3,4-테트라히드록시칼콘(2',4',3,4-tetrahydroxychalcone)의 화학명을 갖고 있으며, 다음의 구조식을 갖는다.

현재, 인간의 건강에 칼콘 구조의 물질들이 어떠한 영향을 미치는지는 정확히 보고된 바가 없으나, 지금까지 밝혀진 바로는 몇몇 칼콘구조의 물질들이 항염작용, 항암작용 및 항진균작용을 가지고 있다고 보고되었다(Anto et al., Cancer Lett., 97, 33, 1995; Chin et al., Cancer Lett., 82, 65, 1994). 또한, 최근에는 이들 물질들이 cAMP-포스포디에스터라아제(cAMP-phosphodiesterase) 및 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(glutathione S-transferase)의 억제작용에도 관련되어 있는 것으로 보고되었다(Kuppusamy et al., Biochem. Pharmacol., 44, 1307, 1992; Zhang etal., Biochem. Pharmacol., 47, 2063, 1994). 또한, 부테인은 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase)의 억제제로서 쥐의 간 내 마이크로좀(rat liver microsomes)에서 지질과산화 작용(lipid peroxidation)을 억제한다고 보고되었다(Sogawa et al., Biol. Pharmacol. Bull., 17, 251, 1994).

한편, 부테인은 당업계에 통상적인 방법들을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 예를 들면, 통상적인 방법을 이용하여 칼콘 구조 내의 페닐그룹의 목적하는 위치를 히드록시 그룹으로 치환하여 칼콘 또는 그의 유도체로부터 합성하는 방법; 윙젯(Winget)의 압축(condensation), 산화 및 적당한 아세토페닐 그룹을 적당한 벤즈알데히드을 이용하여 환원시켜 제조할 수도 있으며; 상업적으로 시판되는 것, 즉 시그마사(Sigma RBI Homepage 참조)에서 공급하는 제품번호 B-178을 구입하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 간섬유증 및 간경화 치료제로서 부테인의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 부테인을 1∼2,000㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

부테인을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 간섬유증 및 간경화 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예들을 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니고, 당업자에 의해서 용이하게 실시될 수 있는 삽입, 삭제 및 수정 등의 변형 등도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 본 발명에서는 사염화탄소에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 실험동물 모델 및 1차 배양된 간성상세포 실험을 통해서 부테인의 이들 질환에 대한 치료효과를 보여주었지만, 본 발명은 사염화탄소에 의해 유도되는 간섬유증 및 간경화 실험동물 모델뿐만이 아니라 실제 임상현장에서 간섬유증 및/또는 간경화 환자들에 대해서도 그 치료효과가 있다는 것은 당업자에 의해서 자명하게 인식될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 치료제의 적용범위는 사염화탄소에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 실험동물모델에서 뿐만 아니라 임상현장 등의 그외 간섬유증 및/또는 간경화 환자에게까지도 적용하는 것도 포함한다.

[참고 실시예 1] 실험용 간경화 동물모델 및 부테인의 처리

통상적으로 실험용 간경화 및 간섬유증 동물모델은, 사염화탄소, 에탄올, 메토트렉세이트, 디메틸니트로사민에 실험동물을 노출시키거나 비타민 B₁₂를 결핍시켜 얻는다. 본 실시예에서는, 이러한 동물모델들 중에서 사염화탄소에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 흰쥐를 사용하여, 부테인의 간섬유증 및 간경화 억제효과를 시험하고자 하였다.

실험용 간섬유증 및 간경화 동물모델의 제조 및 그러한 동물에 사염화탄소 및/또는 부테인을 처리하는 방법은 다음과 같다.

우선, 체중 190∼220g의 수컷 흰쥐(대한 실험동물센터로부터 얻음; 충북 음성)를 1주간 실험실 환경에 적응시키고, 사료와 물을 충분히 공급하였다. 그런 다음, 표 1과 같이 부테인 및 사염화탄소를 처리하였다.

군 번호	군 명칭	투여마리수	투여물질(경구투여)
1	대조군	5	옥수수기름 + 증류수
2	부테인 단독 투여군	5	10㎎/㎏/일의 부테인 + 옥수수기름
3	부테인 단독 투여군	5	25㎎/㎏/일의 부테인 + 옥수수기름
4	사염화탄소 단독 투여군	12	1.0㎖/㎏의 사염화탄소 + 증류수
5	사염화탄소 및 부테인동시 투여군	14	1.0㎖/㎏의 사염화탄소 + 10㎎/㎏/day의 부테인
6	사염화탄소 및 부테인동시 투여군	14	1.0㎖/㎏의 사염화탄소 + 25㎎/㎏/day의 부테인

표 1에 기재된 각각의 투여물질은 존데(sonde)를 이용하여 경구투여 하였다. 대조군인 1군에는 부테인의 용매인 증류수를 매일 투여하면서 옥수수기름을 1주일에 2회(월요일, 목요일) 투여하였으며, 2 및 3군에는 물에 현탁시킨 부테인을 매일 투여하면서 옥수수기름을 1주일에 2회 투여하였고, 4군에는 매일 증류수를 투여하면서 사염화탄소를 1주일에 2회(월요일, 목요일) 투여하였으며, 5 및 6군에는 물에 현탁시킨 부테인을 매일 투여하면서 사염화탄소를 1주일에 2회 투여하였다. 사염화탄소는 사염화탄소와 동일량의 옥수수기름(동방유량 제품)과 혼합하여 경구투여 하였다. 간섬유증은 사염화탄소를 6주간 1주일에 2번씩 경구투여하여 유도하였다. 마지막 사염화탄소를 경구투여하고 72시간이 경과한 후, 각 군의 흰쥐를 마취한 다음, 심장천자(cardiopuncture)하여 혈액을 채취하고 상온에서 1시간 이상 방치한 뒤 원심분리하여 혈청을 얻었다. 또한, 상기 심장천자와 동시에, 간을 즉시에 적출하여 간 좌엽의 일부를 10% 포르말린에 넣어 두었다. 상기에서 분리된 각 군의 혈청 및 10% 포르말린에 넣어둔 간조직은 하기의 실험을 수행하기 위해서 영하 20℃에서 보관하였다.

[참고 실시예 2] 간성상세포 분리배양 및 부테인 처리

간섬유증 간에서 결합조직이 과다하게 축적되는 데에 있어서, 간성상세포는 결정적인 역할을 하며, 정상간에서는 약 7%의 비율로 존재한다.

간성상세포는 흰쥐로부터 프리에드만(Friedman) 등의 방법을 수정하여 분리하였다. 간단히 설명하면, 흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여, 5% CO₂및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca²⁺, Mg²⁺-없는 행크의 균형염 용액(Ca²⁺, Mg²⁺-free Hank's balaced salt solution)을 관에 흘려보내 간내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라겐나아제(collagenase type IV) 및 1mM CaCl₂용액을 흘려보냈다.

간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음, 간세포현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리한 후, 침전된 간세포를 제거한다. 간세포가 제거된 상청액을 11.5% 및 17% 메트리자마이드(metrizamide, Sigma)층 위에 쌓고, 1,700 ×g에서 15분간 원심분리하여, 간성상세포층을 얻는다. 이 간성상세포층을 행크의 균형염 용액으로 세척한 다음, 코팅되지 않은 배양용기에 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 50U/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams' Medium E; WME, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여, 세포수가 5×10⁵ 세포수/㎖ 되도록한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 5일동안 배양한 후, 배양액을 10% 대신 0.5%의 FBS가 첨가된 배양액으로 바꿔 1일간 배양시킨 다음, 부테인을 처리하였다. 부테인은 간성상세포에 독성을 미치지 않는 농도인 0.5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖로 1일 또는 2일간 처리하였다.

[실시예 1] 부테인의 간조직 내 콜라겐의 생성 억제효과

콜라겐은 간의 결합조직을 구성하는 중요한 성분이다. 그러나, 상기에서 설명한 바와 같이, 간섬유증이 유발되거나 간섬유증이 간경화로 진행될 때, 간 조직에는 과도하게 많은 양의 콜라겐이 축적된다. 따라서, 종래에는 간조직에서 콜라겐의 양을 측정함으로써, 간섬유증의 유발 또는 간경화의 발병 가능성에 대해서 진단하여왔다.

따라서, 본 실시예에서는, 사염화탄소 및/또는 부테인을 처리한 간조직에서 콜라겐 양을 측정함으로써, 부테인의 간섬유화 억제작용에 대하여 검사하였다.

본 실시예에서 콜라겐의 양은 다음의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 콜라겐에서 특이적으로 나타나고 콜라겐의 약 10%를 차지하고 있는 아미노산 성분으로 히드록시프롤린의 양을 정량함으로써 간조직에서 발현되는 콜라겐의 양을측정하였다(Schuppan, J. Hepatol., 13, s17, 1991). 히드록시프롤린은 자말 등의 방법 (Jamall et al., Anal. Biochem., 112, 70, 1981)에 따라 정량하였다.

즉, 상기 참고 실시예 1에서와 같이 부테인 및 사염화탄소를 처리한 각 군의 간조직 0.2g을 6N 염산 6㎖로 균질화한 다음, 5% 간 균질액을 110℃에서 가수분해하여 여과하였다. 여액 50㎕를 취하여 80℃에서 감압하에 증발건조한 다음, 50% 이소프로판올액 1.2㎖에 용해시키고, 클로라민-T (Sigma사 제품) 200㎕로 산화시켰다. 그런 다음, 에를리히 반응액 0.1㎖로 발색시켜, 558㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2에서 보는 바와 같이, 부테인은 사염화탄소에 의해 증가된 간조직 중의 히드록시프롤린의 양, 즉 콜라겐의 양을 줄일 수 있음을 확인하였다. 즉, 이러한 결과는, 부테인이 간섬유증 또는 간경화의 치료에 이용될 수 있다는 것을 보여준다.

[실시예 2] 부테인의 혈중 알부민 감소에 대한 회복효과

알부민은 간세포에서 합성되는 혈중단백질로 간기능 저하시 간세포에서 그 합성이 감소되는 특징이 있다.

상기 참고 실시예 1의 방법과 동일한 방법에 의해서 사염화탄소 및 부테인을 처리한 동물의 각 혈청으로부터 알부민의 양을 측정하였다. 혈중의 알부민의 양은 ARKRAY FACTORY(일본)사에서 제공하는 키트 및 스포트켐 자동분석기Ⅱ(Spotchem-SP4410, 일본)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2에서 보는 바와 같이, 사염화탄소에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 동물모델에서, 부테인은 만성적인 간손상에 의한 간기능저하로 유발되는 혈중 알부민의 감소를 정상수준으로 회복시킴을 확인하였다. 이러한 결과는, 부테인이 간섬유증 또는 간경화에 의해 간세포기능 또는 간기능이 손상되는 것을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

군번호	히드록시프롤린(㎍/g)	알부민(mg/dl)
1	247±24	4.7±0.1
2	238±32	4.7±0.1
3	249±58	4.7±0.1
4	878±78^a	3.7±0.4^a
5	611±67^a,b	4.5±0.1^a,b
6	474±39^a,b	4.5±0.2^b
^aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임^bP< 0.001, 4군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

<결과>

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 사염화탄소에 의해 유발된 실험동물모델(4군)의 알부민 수치의 감소는, 부테인에 의해 거의 정상수준으로 회복되는 것이 확인되었다. 또한, 사염화탄소 처리시 증가된 콜라겐, 즉 히드록시프롤린의 양은 부테인에 의해 용량 의존적으로 30%(5군), 46%(6군) 감소되어, 부테인은 간섬유화를 억제할 수 있는 물질로서 확인되었다. 한편, 히드록시프롤린의 수치에 있어서, 2군 및 3군의 결과는 1군에 비해 통계학적 유의적인 차이가 보여지지 않았고, 이러한 결과로부터 부테인 자체는 간기능에 어떠한 부작용을 유발하지 않는다는 것을 의미한다.

[실시예 3] 간성상세포의 활성화 및 증식에 대한 부테인의 억제효과

간섬유증 및 간경화의 진행시, 간성상세포(hepatic stellite cells)가 활성화된다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 면역조직학적인 조직염색 방법을 이용하여, 간조직에서의 간성상세포의 활성화를 확인함으로써, 간섬유증 및 간경화의 진행을 판단할 수 있다. 따라서, 본 발명에서도 사염화탄소 및/또는 부테인을 처리한 간조직에서 이러한 간성상세포의 활성화를 확인함으로써, 부테인의 간섬유증 및 간경화 억제효과를 측정하고자 하였다. 간조직에서의 간성상세포의 활성화 정도는 간조직 내 α-SMA(α-smooth muscle actin)의 형성 정도로 파악할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본 실시예에서는, 간조직에서 α-SMA를 면역조직학적으로 염색하여, 그 분포 및 형성정도를 파악함으로써 활성화된 간성상세포의 양태를 알 수 있다. 따라서, 본 실시예에서는 사염화탄소에 의해 활성화된 간성상세포의 증식을 부테인이 억제할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

우선, 상기 참고 실시예 1에서와 같이 사염화탄소 및/또는 부테인을 처리한 다음, 각 군의 실험동물들로부터 간을 추출하여 10% 중성 포르말린에 넣어 24시간동안 고정시켰다. 그런 다음, 간조직을 파라핀 블록을 만든 다음, 3㎛의 절편을 만들어 슬라이드글라스에 부착시킨 후, 일반적인 방법에 따라 자일렌 I 및 II을 사용하여 탈파라핀(deparaffinization)하고, 100%, 95% 에탄올을 순차적으로 처리하여 탈수(rehydration)한 다음 증류수로 세척하였다. 그런 다음, LSAB^ⓡ2 키트(Dako)를 사용하여, 키트에 부착된 사용자 설명서에 따라 스트렙타비딘-바이오틴-퍼옥시다아제 복합체 형성(streptavidin-biotin- peroxidase complex) 방법(Guesdon et al., J. Histochem.Cytochem., 1979;27:1131, Warnke and Levy, J.Histochem.Cytochem., 1980;28:771)으로 간조직중 α-SMA의 염색을 수행하였다. 즉, 간 조직을 3% 과산화수소를 처리하여, 내생적인 퍼옥시다아제(peroxidase)를 제거하고, 1% 소혈청알부민(BSA)으로 10분간 블로킹하여, 1차 항체의 비특이적 결합을 억제하고, 1차 항체로서 200배 희석된 α-SMA 항체와 실온에서 2시간 반응시켜, 간조직 중 α-SMA와 결합시켰다. 그런 다음, 비오틴화된 항-토끼/항-마우스 면역글로블린(biotinylated anti-rabbit/anti-mouse immunoglobulin)을 키트에 부착된 사용자 설명서에 따라 처리한 다음, 스트렙타비딘-연결된 서양고추냉이 퍼옥시다아제(streptavidin conjugated horse radish peroxidase)를 처리하고, 3%의 3-아미노-9-에틸카바졸(ethylcarbazole)을 사용하여 염색하였다. 그런 다음, 메이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 핵염색을 하고, 0.25% 암모니아수로 부가한 다음, 증류수로 세척한 후, 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 1군의 간 조직(도 1A)은 혈관 평활근 세포(smooth muscle cell)와 그 주변의 세포일부에서만 α-SMA가 염색되어 있지만, 사염화탄소만을 투여한 군(4군)의 간 조직(도 1B)에서는 섬유화된 격막을 따라 상당한 부분에서 α-SMA가 검출되어, 활성화된 간성상세포가 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 한편, 사염화탄소와 함께 부테인을 각각 10, 25 ㎎/㎏/일 투여한 군(각각 5군 및 6군)의 간 조직(도 1C 및 도 1D)에서는 α-SMA가 도 1B에 비해 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 즉, 도 1의 결과로부터, 부테인이 간섬유증 및 간경화의 발전에 중요한 역할을 하고 있는 활성화된 간성상세포의 증식을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 이들 실험의 결과로부터, 부테인이 정상군의 쥐에서는 간독성을 유발하지 않았고, 사염화탄소에 의하여 유도된 간섬유증 및 간경화 간을 보호하고, 동시에 간섬유화를 억제할 수 있는 것을 확인하였다.

[실시예 4] 콜라겐, TIMP-1, MMP-13 유전자 발현에 대한 부테인의 작용

상기에서 확인한 바와 같이, 부테인은 사염화탄소에 의해서 유발된 간 조직에서 콜라겐의 양을 감소시킬 수 있다. 이에 관하여, 본 실시예에서는 콜라겐의 합성 및 분해에 관련된 유전자들의 발현에 있어서, 부테인의 작용을 확인하고자 하였다.

콜라겐 합성 및 분해에 관련된 유전자의 발현은, 역전사-폴리머라아제 연쇄중합반응법(RT-PCR; Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 확인하였다. 콜라겐 합성 및 분해에 관련된 유전자로는 알파-1(I) 콜라겐 유전자, 흰쥐에서 콜라겐 분해효소로 알려진 MMP-13 유전자, 콜라겐 분해효소 MMP-13의 활성을 억제하는 것으로 알려진 TIMP-1 유전자를 이용하였으며, RT-PCR을 통하여 이들 유전자의 mRNA로의 발현을 검사하고자 하였다.

RT-PCR 분석은, 상기 참고 실시예 1에서 사염화탄소 및 부테인을 동시에 투여한 5군 및 6군으로부터 각각에서 3마리 흰쥐를 얻고, 이로부터 추출한 각 간 조직에 대하여 수행하였으며, 음성 대조군(C)으로 옥수수 기름과 증류수를 투여한 1군의 간 조직을, 양성 대조군(N)으로는 사염화탄소와 증류수를 처리한 3군의 간 조직을 이용하였다.

또한, 세포실험으로서는 상기 참고 실시예 2에서와 같이 부테인을 0, 0.5 및1.0㎍/㎖로 1일간 처리한 간성상세포에 대해서도 RT-PCR을 수행하여, 상기 콜라겐 생성 및 분해에 관련된 유전자의 발현을 확인하였다.

우선, 각 군의 간 조직 및 간성상세포 중의 전체 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 5㎍의 전체 RNA를 올리고-dT 프라이머와 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스의 역전사 효소(moloney murine leukaemia virus-reverse transcriptase)(Superscript™ II RT, GibcoBRL)를 이용하여 다음과 같은 조건으로 단일쇄 cDNA를 합성하였다; 추출한 RNA 1 ㎍당 oligo(dT)_12-18프라이머(GibcoBRL)가 1pmol이 되도록 첨가한 후, 70℃에서 10분, 37℃에서 5분간 반응시킨 다음, RNase 억제제(RNasin^®, Promega), 0.1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, GibcoBRL), 2.5μM dNTP (Prime-a-gene^®, Promega), 역전사 효소(Superscript™ II RT, GibcoBRL)를 더 첨가한 후, 42℃에서 60분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 10배 희석하고, 이를 주형으로 하여 알파1(I)콜라겐, TIMP-1, MMP-13의 특이적인 부분을 증폭하기 위한 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

알파1(I)콜라겐	센스 프라이머	5'-TAC TAC CGG GCC GAT GAT G-3'
알파1(I)콜라겐	안티센스 프라이머	5'-CTT GGG GTT TGG GCT GAT GT-3'
TIMP-1	센스 프라이머	5'-CCA CAG ATA TCC GGT TCG CCT ACA-3'
TIMP-1	안티센스 프라이머	5'-GCA CAC CCC ACA GCC AGC ACT AT-3'
MMP-13	센스 프라이머	5'-AAA GAA CAT GGT GAC TTC TAC C-3'
MMP-13	안티센스 프라이머	5'-ACT GGA TTC CTT GAA CGT C-3'

PCR 반응조건은, 1.5mM MgCl₂존재하에서 94℃에서 변성(denaturation) 30초, 55∼57℃에서 어닐링(annealing) 30초, 72℃에서 확장(extension) 30초의 사이클을 35회 반복하고, 최종적으로 72℃에서 5분의 확장반응으로 하였다.

PCR 생성결과물에 대한 대조군으로는 GAPDH 유전자를 이용하였으며, GAPDH 유전자의 PCR 증폭용 프라이머로는 5'-CCC CTT CAT TGA CCT CAA CTA C-3'의 서열을 갖는 센스 프라이머 및 5'-CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG-3'의 서열을 갖는 안티센스 프라이머를 이용하였다.

상기와 같은 조건에서 PCR 반응 수행한 후, PCR 증폭산물은 아가로즈 겔 전기영동하였고, EtBr(ethidium bromide staining) 염색에 의해서 가시화하였고, 사진농도계분석을 이용하여 확인하였다. 간 조직에 대한 결과를 도 2에 나타내었고, 간성상세포에 대한 결가를 도 3에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 부테인은 간조직 중의 알파1(Ⅰ)콜라겐 유전자의 mRNA 발현을 현저하게 감소시켰으며, 콜라겐 분해효소인 콜라겐나아제의 억제효소로서 TIMP-1 유전자의 mRNA 발현도 현저하게 감소시켰다.

또한, 도3에서 보는 바와 같이, 1차 배양한 간성상세포에서도 부테인은 상기 도 2의 결과와 동일하게, 알파1(Ⅰ)콜라겐 유전자 및 TIMP-1 유전자의 mRNA 발현을 억제하였으며, 콜라겐 분해효소인 MMP-13의 발현은 증가시켰다. 이러한 결과는, 부테인이 간섬유증 및/또는 간경화의 진행시 콜라겐 생합성을 유전자 수준에서 억제하고 콜라겐 분해 역시 유전자 수준에서 증가시킴을 나타낸다. 따라서, 간섬유증 및 간경화를 치료하는데 있어서, 부테인은 매우 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

[실시예 5] 단백질 수준에서의 콜라겐 및 간성상세포 활성화에 대한 부테인의 억제효과

상기에서 확인한 바와 같이, 부테인은 사염화탄소에 의해서 유발된 간 조직에서 콜라겐 발현 및 분해에 관련된 유전자의 발현에 작용한다. 이에 관하여, 본 실시예에서는 부테인이 콜라겐 및 α-SMA 유전자의 발현을 단백질 수준에서 억제할 수 있는지를 면역블랏(immunoblotting) 검사법을 이용하여 확인하고자 하였다.

α-SMA 단백질 양을 측정하기 위하여, 참고실시예 2에서와 같이 처리된 간성상세포를, 리파완충액(RIPA buffer; 50 mmol/ℓ Tris-HCl pH 7.4; 1%(v/v) Triton X-100, 1mmol/ℓ EDTA, 1mmol/ℓ 류펩틴(leupeptin), 1mmol/L 페닐메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride))으로 현탁한 다음, 14,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리하여, 상청액을 분리하였다. 콜라겐은 분비성 단백질이므로, 배양액 중의 단백질 양을 직접 측정하였다. 배양액 및 세포용해액 중 단백질 농도는 Bio-Rad DC 단백질 검사 키트(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 측정하였다. 배양액 및 세포용해액로부터 분리한 단백질 20㎍을 각각 10%(w/v) SDS 겔(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 200V로 1시간동안 전기영동시켰다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량크기에 따라 분리되고, 이러한 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)(Millipore)에 30V로 16시간동안 트랜스퍼(transfer)시켰다. 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 200배 희석된 토끼 항-콜라겐 1형 항체(rabbit anti-collagen type I antibody; Calbiochem) 또는 250배 희석된 마우스 항-알파 SMA 항체(mouse monoclonal anti-alpha SMA antibody; Sigma)를 1차 항체로 사용하여, 2시간동안 실온에서 반응시켰다. 2차 항체로서, 콜라겐의 경우 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-토끼 면역글로블린 G(horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG; Santacruz)를, α-SMA의 경우 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-마우스 면역글로불린 G(horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG; Santacruz)를 2,000배 희석한 것을 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 발색은 강화된 화학발광 웨스턴 블랏 검출 시스템 키트(enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection system kit; Amersham)를 이용하여, 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름(Agfa, EC)에 노출시켜 확인하였다. 확인된 필름에서 콜라겐 및 α-SMA는 사진농도계분석을 이용하여 그 양을 측정하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 부테인은 간성상세포에서 합성되는 콜라겐의 양을 단백질 수준에서 유의성있게 감소시켰으며, 간성상세포의 활성화의 지표인 α-SMA의 발현도 단백질 수준에서 유의성있게 감소시켰다. 이러한 결과는, 부테인이 간섬유증 및/또는 간경화 진행시 간성상세포에서 콜라겐이 생합성되는 것을 억제하며, 간성상세포의 활성화도 억제됨을 보여준다. 따라서, 부테인을 간섬유증 및 간경화를 치료하는데 이용할 수 있음을 세포실험 수준에서 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 부테인(Butein)은 콜라겐 합성 및 분해에 관련된 효소의 적절한 조절을 통해 간섬유증 및 간경화 간 조직에서 과다하게 축적되는콜라겐을 감소시킬 있고; 간섬유증의 유도에 의한 간성상세포의 증식 및 활성화를 억제시키며; 간섬유증 및 간경화의 진행으로 인한 간손상 결과로 감소된 혈중 알부민 수치를 정상수준으로 회복시킴으로써, 간세포의 정상화를 이끌어 낼 수 있다. 따라서, 부테인을 함유한 조성물은 간섬유증 및 간경화의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

간섬유증(hepatic fibrosis) 및 간경화(hepatic cirrhosis) 치료에 유효한 양의 부테인(butein)을 함유함을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 간섬유증 및 간경화는 사염화탄소에 의해서 유발됨을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 부테인은 간 조직 내의 콜라겐 양을 감소시킴을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 부테인은 간조직 및 간성상세포에서 TIMP-1 및 α1(Ⅰ)콜라겐을 코딩하는 유전자의 발현억제 및 콜라겐 분해효소인 MMP-13을 코딩하는 유전자의 발현증가를 유발시킴을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 부테인은 간성상세포(hepatic stellate cell)의 활성화 및 증식을 억제함을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 부테인은 만성염증에 의해 감염된 간 조직 및 간세포의 손상을 회복시킴을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 부테인은 만성 간손상시 간조직중 감소되는 혈중 알부민 수치을 정상수준으로 회복시킴을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료제는 부테인을 1∼2,000㎎/㎏체중의 농도로 함유함을 특징으로 하는 간섬유증 및 간경화 치료제.