KR20180007307A - 자가포식 향상물질 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 화학식 1 또는 2에 따른 화합물 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 화합물은 라이소좀 생성 촉진을 통한 자가포식 활성화라는 새로운 기전에 근거하여 2형 당뇨병, 인슐린 저항성 또는 비만을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자가포식 향상물질 및 그 용도 {Compound for enhancing autophagy and its use}

본원은 자가포식 조절제 및 이를 이용한 자가포식 관련 질환의 치료와 관련된 기술분야이다.

자가포식(Autophagy)은 라이소좀-의존 방식으로 세포내 구성물질을 변동, 조정하는 과정으로 그 종류로는 마크로-, 마이크로- 및 새파론- 매개 자가포식이 있다. 이들 중 마크로- 매개 자가포식(이하 자가포식이라 칭함)은 세포내의 세포질 격리 막 및 세포내 소기관을 재배열하여 새로운 기관-유사 구조(마크로 autophagosome)을 형성한다. 자가포식체는 라이소좀과 융합하여 자가포식라이소좀을 형성하고 여기에 격리된 물질은 라이소좀의 효소에 의해 분해된다 (Klionsky, DJ, and Emr, SD (2000) Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation. Science 290, 1717-1721). 자가포식의 생리적 역할은 세포내 소기관, 세포내 단백질의 질을 조절하고, 세포내 항상성 유지 또는 영양분 고갈시 에너지 균형 등을 유지하는 것으로 알려졌다 (Mizushima, N, and Komatsu, M (2011) Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell 147, 728-741).

자가포식은 아미노산, 지질 및 당과 같은 본질직인 다양한 영양소의 세포내 대사 조절에 매우 중요한 관련성이 있기 때문에, 전신의 대사 유지에도 중요한 역할을 할 것으로 생각되었다. 따라서, 자가포식이 조절되지 않으며 당뇨병 및 병적 상태에서 대사 증후군과 같은 대사성 질환이 초래될 수 있다. 특히 당뇨병에서는, 인슐린과 그 하류 인자인 mTOR(mechanistic target of rapamycin)가 자가포식의 억제자로 잘 알려져 있고 (Sarbassov, DD et al. (2005) Growing roles for the mTOR pathway. Curr Opin Cell Biol 17, 596-603), 인슐린과 반대활성을 갖는 글루카곤은 자가포식의 활성자로 잘 알려져 있기 때문에, 자가포식이 당뇨병의 다양한 측면에서 중요한 역할을 하는 요소일 것으로 생각되어 왔다. 나아가 베타 세포 기능 및 인슐린 민감성에 중요한 ER(Endoplasmic reticulum) 또는 미토콘드리아와 같은 소기관의 보전성(integrity)도 자가포식에 의존하는 것으로 알려져 있다 (Mizushima, 2011 ibid). 자가포식은 지질 및 단백질의 이동화(mobilizaton) 그리고 손상된 소기관의 재사용에 중요한 역할을 하기 때문에, 자가포식 활성의 결여는 과다 지방, 뭉쳐진 단백질의 축적을 초래하고, 기능을 하지 못하는 소기관을 발생시켜 대사가 방해되거나 당뇨병을 초래한다.

따라서, 특정 조직 또는 전신에 걸쳐 자가포식에 문제가 있는 유전적 모델을 사용하여 당뇨병 및 대사 증후군에서 자가포식의 인비보에서의 역할에 대하여 많은 연구가 이루어졌다 (Kim, J, et al. (2014) Amyloidogenic peptide oligomer accumulation in autophagy-deficient b-cells leads to diabetes. J Clin Invest 125, 3311-3324). 이러한 마우스는 자가포식 결함을 나타내는 부위 및 중증도에 따라서 다양한 대사성 문제를 나타냈다 (Coupe, B et al. (2012) Loss of autophagy in pro-opiomelanocortin neurons perturbs axon growth and causes metabolic dysregulation. Cell Metab 15, 1-9). 다양한 조직에서의 자가포식 문제가 에너지 대사의 조절에 미치는 복잡하며 상반된 효과에도 불구하고, 전신에 자가포식 활성이 향상된 경우 인비보에서 신체에 유익한 효과를 가져오며, 특히 대사성 스트레스 또는 비만에 유익한 효과가 있는 것으로 나타났다 (Kim et al,, 2014 ibid). 나아가 최근의 연구결과에 의하면, 자가포식 활성의 중요한 부분인 마이토파지(mitophagic) 활성이 당뇨병 발생의 중요한 인자인 고지방 식이 또는 노화로 인한 대사성 스트레스로 인해 인비보에서 현저하게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 자가포식 활성의 개선이 대사성 증후군 또는 당뇨병의 근본 원인을 개선할 수 있는 가능성을 나타낸다 (Sun, N et al. (2015) Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell 60, 685-696).

자가포식은 넓은 스펙트럼의 생물학적 과정과 다양한 질환과 관련성이 있기 때문에, 신경퇴행성질환, 감염성 질환, 암 또는 노화에 대한 치료효과를 갖는 신규한 화합물을 개발하기 위해 자가포식 조절자를 찾고자 하는 노력이 이어지고 있다. 예를 들면 천연 화합물, 다른 용도로 알려진 화합물, 또는 신규한 화합물 또는 펩타이드를 포함하는 자가포식 조절제가 개발되었다 (Eisenberg, T et al. (2009) Induction of autophagy by spermidine promotes longevity. Nature Cell Biol 11, 1305-1314; Shoji-Kawata, S et al. (2013) Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature 494, 201-206).

미국 공개특허공보 2014-0134661호는 치료를 위한 자가포식 조절에 관한 것으로 p62 단백질을 마커로 해서 이에 영향을 미치는 물질을 자가포식 조절제로 선별하는 스크리닝 방법을 개시하고 있다.

하지만 상술한 바와 같은 기존에 발굴된 조절제의 경우 거의 대부분 대사 질환과의 관계가 연구되지 않아 대사 질환, 당뇨병 등에 효과를 예측할 수 없고, mTOR와의 관계 또한 뚜렷하게 규명되지 않아 대사 질환에는 오히려 나쁜 영향을 줄 가능성도 있다. mTOR를 억제하면 자가포식은 향상되나, 췌장 소도가 감소하여 인슐린 분비가 저하되어 당뇨병이 악화될 수 있는 단점이 있어, mTOR와는 독립적으로 자가포식을 향상시킬 수 있는 자가포식 향상제의 개발이 필요하다.

본원은 라이소좀 생성 조절을 통한 자가포식 조절제 및 이를 이용한 2형 당뇨병, 인슐린 저항성 및 비만의 예방 또는 치료제를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

; 또는

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서, R은 F, Cl, 또는 Br)

본원에 따른 화합물 또는 이를 포함하는 약학조성물은 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 고지질혈증, 비만 또는 염증 중 하나 이상의 증상을 포함하는 대사성 질환 또는 대사 증후군의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 화합물은 자가포식의 증진, 향상, 촉진 또는 활성화를 나타내어, 자가포식 결핍으로 인해 발생할 수 있는 다양한 질환의 치료가 가능하며, mTOR를 억제하지 않아, 특히 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 고지질혈증, 비만 또는 염증 중 하나 이상의 증상을 포함하는 대사성 질환 또는 대사 증후군의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 화합물은 mTOR를 억제하지 않으면서도, 칼시뉴린의 활성, TFEB (Transcription Factor EB)의 활성, 라이소좀 생성 촉진을 통한 자가포식을 활성시킨다.

이에 또 다른 양태에서 본원에서는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 포함하는 않으며, 라이소좀 생성 촉진을 통한 세포의 자가포식 활성 방법 또는 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 포함하는 mTOR를 억제하지 않는 라이소좀 생성 촉진을 통한 세포의 지방제거용 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물과 세포를 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 접촉에 의해 상기 세포는 mTOR를 억제하지 않으면서 TFEB의 핵으로의 이동을 유발하는 것인, 인비트로에서 세포의 자가포식 활성 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물과 세포를 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 접촉에 의해 상기 세포의 자가포식이 활성화되고, 상기 자가포식에 의해 상기 세포의 지질이 제거되는 것인, 인비트로에서 세포의 지방 제거 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서는 본원에서 규명된 기전을 이용한 대사성 질환 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은 칼시뉴린, TFEB를 발현하며, 자가포식 기능을 갖는 진핵 세포를 제공하는 단계; 상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험물질로 처리된 세포에서 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성을 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 상기 시험물질로 처리되지 않은 경우와 비교하여, 상기 처리된 세포에서 상기 칼시뉴린, TFEB 및/또는 자가포식 활성이 향상된 경우, 상기 시험물질을 대사성 질환 예방 또는 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원은 또한 화학식 1의 화합물의 유도체로서 하기 화학식 2의 화합물을 제공한다.

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서, R은 F, Cl, 또는 Br)

본원에 따른 화학식 1의 화합물(MSL) 및 화학식 2의 화합물(MSL-7)은 라이소좀 기능을 호전시켜 자가포식을 향상시킬 수 있어, 자가포식의 억제로 인한 다양한 질환, 특히 비만, 2형 당뇨병 및 인슐린 저항성 질환을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본원에 따른 화합물은 mTOR 기전과는 독립적인 것으로, 기존의 mTOR 억제에 의한 췌장 소도세포 감소 결과 인슐린 분비가 저하되는 우려가 없어, 특히 제 2형 당뇨병의 치료에도 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 본원에 따른, 루시퍼라제 분석을 기반으로 하는 새로운 자가포식 향상제 스크리닝한 결과로, 도 1a는 본원에서 규명된 기전을 도식적으로 나타낸 것이다. 도 1b는 HEK 293 세포를 pRLuc(C124A)-LC3(wt) 또는 pRLuc(C124A)-LC3(G120A)로 전달이입한 후에 각 세포를 50μM의 각 약물로 6시간 동안 처리하였다. wt/G120A 활성 비는 처리되지 않은 대조군 세포의 값에 대한 퍼센트로 나타냈다. 도 1c는 1차 선별된 약물로 처리된 세포를 융해한 후 표시된 항체로 면역블랏을 수행한 결과이다. 도 1c, 1d 및 1e는 2차 선별된 약물로 처리된 세포를 융해한 후 표시된 항체로 면역블랏을 수행한 결과이다.
도 2는 본원에 따른 화학식 1의 화합물(이하, MSL)을 처리한 결과 HeLa 세포에서 자가포식 플럭스가 증가한 것을 나타내는 결과이다. 도 2a는 RFP-LC3 플라스미드로 48시간 동안 전달이입된 HeLa 세포를 매체 대조군 또는 MSL 화합물로 1시간 동안 처리하였다. 이어 세포를 LAMP1 항체로 면역블랏을 하였다. 화살표는 집락화된 점(puncta)을 나타낸다. LC3 또는 집락화 점의 수를 막대그래프로 또한 나타냈다. 도 2b는 HeLa 세포를 mRFP-GFP-LC3 플라스미드로 48시간 동안 전달이입한 후에 세포를 매체 대조군 또는 MSL 화합물로 1시간 동안 처리하였다. 자가포식체(노란 점) 또는 자가포식라이소좀(적색 점)을 Image J software를 이용하여 측정하였다. 점의 개수를 막대그래프로 나타냈다. 도 2c는 HeLa 세포를 FYVE-dsRed 플라스미드로 48시간 동안 전달이입한 후에 세포를 매체 대조군 또는 MSL 화합물로 1시간 동안 처리하였다. 세포의 FYVE-dsRed 베시클의 개수를 측정하였다. 측정값은 최소 3개 영상에서 수득한 값의 평균이다. Error bars, S.D. **, P < 0.01; ***, P < 0.001. 이는 본원에 따른 MSL 화합물이 자가포식 플럭스를 증가시킴을 나타내는 것이다.
도 3은 본원에 따른 MSL 화합물이 칼시뉴린 활성에 의한 TFEB 핵전위를 조절하는 것을 나타낸다. 도 3a는 TFEB-GFP HeLa 세포를 MSL 화합물로 4시간 동안 처리한 후 핵을 DAPI로 염색한 후 핵전위된 TFEB의 퍼센트를 그래프로 나타냈다. 도 3b는 HeLa 세포를 MSL 화합물 또는 매체 대조군의 존재하에서 24시간 동안 배양한 후에 형성된 산성 베시클 소기관을 아크리딘 오랜지 염색으로 관찰한 결과이다. 도 3c는 TFEB-GFP HeLa 세포를 MSL 화합물 또는 매체 대조군으로 4시간 처리한 후에 표시된 항체로 면역블랏을 수행한 결과이다. 도 3d 및 3e는 표시된 약물로 처리된 Hepa1c1c7 세포의 융해물에서 칼시뉴린의 활성을 측정한 결과이다. Error bars, S.D. **, P < 0.01; ***, P < 0.001. 이는 본원에 따른 MSL 화합물에 따른 자가포식 플럭스의 증가가 칼시뉴린의 활성을 통한 TFEB의 조절로 유도되는 작용기전을 나타내는 것이다.
도 4는 본원에 따른 MSL 화합물이 지질 점적의 제거를 향상시키는 것을 나타낸다. 도 4a는 팔미트 및 올레산으로 16시간 동안 처리된 HeLa 세포를 매체 대조군 또는 MSL 화합물로 20시간 동안 처리한 후, 세포의 점적을 BODIPY 493/503로 염색한 결과이다. 도 4b는 상기 세포를 라이소좀 관찰을 위해 LAMP1, 그리고 자가포식체 관찰을 위해 LC3로 염색한 결과이다. 도 4c는 팔미트 및 올레산으로 16시간 동안 처리된 HeLa 세포를 표시된 약물로 20시간 동안 처리하였다. 이어 세포당 지질 점적을 Image J software로 정량하였다. 측정값은 최소 3개 영상에서 수득한 값의 평균이다. Error bars, S.D. **, P < 0.01; ***, P < 0.001. 이는 본원에 따른 MSL 화합물에 의한 자가포식 플럭스를 증가가 대사성 질환시 증가하는 지질 점적의 제거를 향상시켜 대사성 질환 효과적으로 개선할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 5는 본원에 따른 MSL 화합물이 염증조절복합체의 활성화를 감소시키고 미토콘드리아 기능을 향상시키는 것을 나타낸다. 도 5a는 복강의 일차 대식세포를 분리하여 팔미트산, LPS 및 MSL로 처리한 후, 배양 상층액에서 IL-베타 농도를 ELISA를 이용하여 측정한 결과이다. Error bars, S.D. **, P < 0.01; ***, P < 0.001, two-way ANOVA. 도 5b 및 5c는 복강 일차 대식세포를 상기 도 5a와 동일한 조건으로 처리한 후에 세포를 각각 MitoSOX 도 5b로 처리하여 미토콘드리아 ROS를 측정하고, MitoTracker Red and Mitotracker Green 도 5c로 처리하여 미토콘드리아 전위를 FACs 분석으로 측정한 결과이며, 수치는 지정된(designated) 게이트에서 세포의 퍼센트를 나타낸다. 이는 본원에 따른 MSL 화합물에 의한 자가포식 플럭스를 증가가 대사성 질환 시 증가하는 염증반응을 개선하고 미토콘드리아 기능을 향상시킴으로써 대사성 질환 효과적으로 개선할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 6은 본원에 따른 MSL 화합물이 ob/ob 마우스에서 대사 파라미터를 향상시키는 것을 나타내는 결과이다. 도 6a는 ob/ob 마우스에게 매체 대조군 또는 MSL (50mg/kg/2days)을 8주 동안 투여한 후 측정한 공복 혈당 농도이고, 도 6b는 체중을 나타낸다. 도 6c는 또한 8주 동안 MSL 화합물 또는 매체 대조군을 투여한 ob/ob 마우스에서 사료 섭취량을 비교한 결과이다. 도 6d 및 6e는 투여 8주 후에 측정한 IPGTT 결과 및 AUC 값을 나타낸다. 도 6f 및 6g는 투여 8주 후에 측정한 ITT 결과 및 AUC 값을 나타낸다. 도 6h는 투여 8주 후에 측정한 공복 혈당 농도를 나타낸다. 도 6i는 투여 8주 후에 측정한 인슐린 농도를 나타낸다. 도 6j는 투여 8주 후에 측정한 HOMA-IR 결과를 나타낸다. 도 6k는 투여 8주 후에 측정한 인슐린 생성 지수(Insulinogenic index)를 나타낸다. Error bars, S.D. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. Students t-test and one-way ANOVA. 이는 본원에 따른 MSL 화합물이 질환 마우스에서 대사 파라미터를 향상시켜 대사성 질환 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
도 7은 본원에 따른 MSL 화합물이 인비보에서 자가포식 플럭스를 증가시키는 것을 나타낸다. 도 7a는 ob/ob 마우스에 30mg/kg leupeptin을 복강 투여 1시간 후에, 매체 대조군 또는 MSL 화합물을 복강 주사하였다. 세 시간 후에, 간조직의 융해물을 제조하여 면역블랏을 수행하였고, 밴드의 숫자는 베타 엑틴 밴드에 노말라이즈된 배수의 변화를 나타낸다. 도 7b는 Leupeptin을 처리하지 않은 상기와 동일한 간 시료에서 분리한 총 RNA를 사용하여 RT-PCR로 TFEB 관련 유전자의 mRNA 농도를 측정한 결과이다. 수치는 3마리에 대하여 mean±S.D를 나타냈고, 대조군 마우스 (매체 대조군)와 비교하여 증가한 배수로 표현한 것이다. 이는 본원에 따른 MSL 화합물에 의한 대사 파라미터의 개선이 자가포식 증가와 관련되어 있음을 나타내는 것이다.
도 8은 본원예 따른 MSL 화합물이 지방 간 및 대사성 염증을 개선한다는 것을 나타낸다. 도 8a는 8주 동안 매체 또는 MSL 화합물로 처리된 ob/ob 마우스 유래 간 절편에 대한 헤마토실린-에오신 염색 결과이다. 도 8b는 8주 동안 매체 또는 MSL 화합물로 처리된 ob/ob 마우스 유래 간에서 지질을 클로로포름/에탄올 혼합물로 추출하고 TG 농도를 자유 글리세롤 시약 함유 리파제로 측정하였다. 도 8c는 8주 동안 매체 또는 MSL 화합물로 처리된 ob/ob 마우스에서 수득한 혈청에 대하여 화학 분석기를 이용하여 혈액 화학 프로파일을 분석한 결과이다. 도 8d는 8주 동안 매체 또는 MSL 화합물로 처리된 ob/ob 마우스에서 백색 지방 조직 절편에 대한 헤마토실린-에오신 염색 결과이다. 도 8e는 상기 마우스의 백색 지방 조직에서 CLS(crown-like structures)의 빈도로 나타낸 지방세포 F4/80+ CLS 정량(우) 및 백색 지방 조직의 F4/80+ 세포에 대한 면역염색 결과(좌)이다. 도 8f는 상기 동일한 마우스 유래의 WAT에서 유전자 발현을 RT-PCR로 정량분석한 결과이다. Error bars, S.D. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. 이는 본원에 따른 MSL 화합물에 의한 자가포식 플럭스를 증가가 대사성 질환시 증가하는 지질 점적의 제거를 향상시켜 대사성 질환 효과적으로 개선할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 9는 본원에 따른 MSL 화합물이 라이소좀으로부터의 칼슘 방출에는 효과가 없음을 나타낸다. HeLa 세포를 perilysosomal GCaMP3-ML1 칼슘 프로브로 전달이입하고, Ratiometric 영상(474 및 410nm excitation)을 측정하였다. 뒤이은 GPN (200μM) 적용은 더 작은 반응을 유도하였다. 최대 반응은 ionomycin (1μM)에 의해 유도되었다. 이는 본원에 따른 MSL 화합물에 의한 TFEB의 조절이 라이소좀의 칼슘 방출와 관계없이 조절됨을 나타내는 것이다.
도 10은 본원에 따른 다른 자가포식 향상제로서 화학식 2의 화합물(이하, MSL-7)에 대한 실험결과이다. 도 10a는 HeLa 세포를 MSL 또는 MSL-7로 처리하고, 표시된 항체로 면역블랏을 수행한 결과이다. 도 10b는 매체 대조군 또는 상이한 농도의 MSL-7 (50-100μM)로 48시간 동안 처리한 HeLa 세포에 대하여 세포 생활도(viability)를 측정한 결과이다. 도 10c는 TFEB-GFP HeLa 세포를 매체 대조군 또는 MSL-7로 4시간 동안 처리하고, 핵을 DAPI로 염색한 결과이다. 그래프는 TFEB의 핵으로의 전위 퍼센트를 나타낸다. Error bars, S.D. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. 이는 본원에 따른 MSL 화합물의 유도체인 MSL-7이 MSL과 같이 자가포식을 향상시킴을 나타내는 것이다.
도 11은 본원에 따른 다른 자가포식 향상제인 화학식 2의 화합물(이하, MSL-7)이 ob/ob 마우스의 대사성 지표를 향상시키는 결과이다. 도 11a는 ob/ob 마우스에게 매체 대조군 또는 MSL-7 (50mg/kg/2days)를 8주 동안 투여한 후 공복 혈당을 측정하고, 도 11b는 체중을 모니터링 하였다. 도 11c는 IPGTT 및 도 11d는 ITT를 투여 8주 후에 수행하였다. 도 11e는 매체 대조군 또는 MSL-7 화합물로 8주 동안 투여된 ob/ob 마우스의 혈청을 채취하여 화학분석기를 이용하여 혈액 화학 프로파일을 측정하였다. Error bars, S.D. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. Students t-test and one-way ANOVA. 이는 본원에 따른 MMSL 화합물의 유도체인 MSL-7이 MSL보다 더 효과적으로 비만에 따른 대사성 질환 개선할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 12는 본원에 따른 화합물 MSL-7에 의한 HFD-식이 마우스의 대사 프로파일이 향상되었다는 것을 나타낸다. (A) 탠덤 mRFP-GFP-LC3 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HeLa 세포에 MSL-7을 처리하여 공초점 현미경으로 관찰하였다. 적색 점(puncta)은 오토파고라이소좀을 나타낸다. (B, C) 8주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 8주 동안 HFD 또는 정상 차우(chow) 식이(NCD)를 먹이고, 그 후 8주 동안 50mg/kg MSL-7를 1주에 3번 투여하였다. 비금식 혈당 레벨(B) 및 체중(C)을 모니터하였다. (D) IPGTT. (E) (D)의 AUC 곡선. (F) ITT. (G) (F)의 AUC 곡선. 이는 본원에 따른 MSL 화합물의 유도체인 MSL-7이 MSL보다 더 효과적으로 지방식이에 따른 대사성 질환 개선할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 13은 본원에 따른 화합물 MSL-7에 의해, 인간 타입 당뇨를 가진 마우스의 β-세포 기능 및 대사 프로파일이 향상되었다는 것을 나타낸다. (A) 비-아밀로이드생성 prepro-mIAPP-HA 또는 아밀로이드생성 prepro-hIAPP-HA 컨스트럭트로 트랜스펙션된 INS-1 세포에 MSL 또는 MSL-7을 처리하여, 항-HA 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (B) 상기 (A)의 트랜스펙션된 INS-1 세포에 바필로마이? 존재 또는 부존재하에서 MSL-7을 처리하여, 항-HA 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. (C) 3-MA 존재 또는 부존재하에 트랜스펙션된 세포에 MSL-7을 처리한 후, 세포 용해물에 함유되어 있는 올리고뉴클레오좀 함량을 측정하였다. (D) HFD-식이 hIAPP+ 마우스에 MSL-7을 투여하고, 비금식 혈당 레벨을 모니터하였다. (E) IPGTT. (F) HFD-식이 hIAPP+ 마우스에 MSL-7을 8주간 투여한 후 인슐린생성 지표를 측정하였다. (G) HFD-식이 hIAPP+ 마우스에 MSL-7을 8주간 투여한 후 췌장 섹션을 얻었다. A11 항체를 사용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다(왼쪽). DAPI+세포 중 A11-duatorehls 세포의 백분율(오른쪽). (H) 8주간 MSL-7을 투여한 HFD-식이 hIAPP+ 마우스에서 얻은 췌장 섹션의 FSB 염색(왼쪽). 평균 형광강도/면적(오른쪽). 이는 본원에 따른 MSL 화합물의 유도체인 MSL-7이 인간 타입 당뇨를 가진 마우스의 β-세포 기능 및 대사 프로파일이 향상시켜 질환 개선할 수 있음을 나타내는 것이다.
도 14는 본원에 따른 화합물 MSL 또는 MSL-7을 인비보 투여한 후 주요 장기 표본 생체검사에서 아무런 이상이 없었다는 것을 나타낸다. 8주간 MSL 또는 MSL-7을 투여한 ob/ob 마우스에서 주요 장기를 수집하여, H&E 염색한 후 조직학적 분석을 하였다. 지방간이 향상된 것을 제외하고 아무런 유의한 변화가 관찰되지 않았다(스케일 바, 500㎛). 이는 본원에 따른 MSL 또는 MSL-7을 인비보 투여한 후 주요 장기의 독성이 없음을 확인함으로써 치료제로의 가능성을 나타내는 것이다.

본원에서는 루시퍼라제 기반의 자가포식 플럭스 분석법을 이용하여 화합물 라이브러리를 스크리닝한 결과, mTOR와 독립적으로 라이소좀의 생성을 상향조절하여 자가포식을 향상시킬 수 있는 저분자 화합물의 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 하기 화학식 1(MSL) 또는 2(MSL-7)로 표시되는 화합물 또는 그 약학적으로 가능한 염을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

; 또는

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서 R은 F, Cl, 또는 Br이다.)

또 다른 양태에서 본원은 자가포식 활성을 향상 활성이 있는 화학식 2의 화합물(MSL-7)에 관한 것이다.

본원에 따른 화학식 2의 화합물은 하기 반응식 1의 방법으로 합성될 수 있다.

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서, R은 F, Cl 또는 Br)

상기 반응식 1의 1단계에서 브로모아세테이트 메틸에스터를 사용하여 벤젠설포닐아세테이트 메틸에스터를 합성할 수 있다. 상기 반응은 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 유기알코올 용매를 사용하여, 2시간 내지 30시간 동안, 상온 내지 용매의 끓는 온도에서 반응할 수 있다.

상기 반응식 1의 2단계에서 아자이드화합물을 사용하여 다이아조화합물을 합성할 수 있다(diazo transfer). 상기 반응은 4-아세토아미도벤젠설포닐 아자이드, 토실 아자이드 등을 이용할 수 있다. 아세토니트릴, 디클로로메탄 등의 유기용매하에서 TEA 등의 염기 존재하에서 반응할 수 있다.

상기 반응식 1의 3단계에서 옥사졸 고리를 형성시킬 수 있다. 상기 반응은 로듐(II) 촉매하에서 반응을 시킬 수 있다. 상기 로듐(II) 촉매로는 Rh₂(OAc)₂, Rh₂(CF₃CONH)₂ 등을 이용할 수 있다.

상기 반응식은 본원 화합물을 합성하는 방법 중 하나일 뿐이며, 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 다른 반응조건을 사용하거나, 다른 방법으로 합성할 수 있다.

본원에 따른 화합물은 자가포식을 활성화시켜, 따라서 치료 또는 예방에 이의 활성이 필요한 다양한 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

본원에서 자가포식(autophagy 또는 autophagocytosis)이란 라이소좀을 이용하여 세포내 불필요하거나 변성된 단백질을 포함하는 다양한 세포구성성분을 제거하는 이화작용을 일컫는 것으로, 자가포식의 조절은 세포내 성분의 정상적인 합성, 분해 및 재활용에 있어 필수적이다. 이 과정에서 자가포식체(autophagosome)가 형성되고 이는 리소좀과 융합되어, 세포구성성분이 분해되거나 재사용된다. 자가포식에는 마크로, 마이크로 및 세파론 매개된 자가포식이 있으며, 모두 본원에 포함될 수 있으며, 특히 마크로 매개된 자가포식이 포함된다.

본원에서 조절(modulation)이란, 생물학적 기능의 활성화, 자극 또는 상향 조절, 또는 저하 또는 하향 조절, 또는 양쪽 모두를 포함하는 것이다. 한 구현예에서는 자가포식 기능의 활성화를 의미한다. 나아가 조절이란, 인비트로 상태에서의 조절, 인비보 상태에서의 조절, 엑스비보 상태에서의 조절을 모두 포함하는 것이다.

자가포식은 아미노산, 지질 및 당과 같은 중요한 다양한 영양소의 세포내 대사 조절에 매우 중요한 관련성이 있기 때문에, 전신의 대사 유지에도 중요한 역할을 한다. 따라서, 자가포식이 조절되지 않으며 비만, 당뇨병 및 인슐린 저항성을 포함하는 인슐린저항성 증후군과 같은 대사성 질환이 초래될 수 있다. 2형 당뇨병의 주요한 두 가지 인자는 인슐린 저항성과 베타 세포 기능 부전이다. 그러나 이러한 현상에 이르는 분자 및 세포 수준에서 병인은 규명되지 않았다. 과량의 지질 축적, 케모카인 및 사이토카인의 유도로 인한 낮은 등급의 조직 염증, NF-kB 활성 및 JNK 활성이 중요한 분자 기전이다 (Arkan, MC et al. (2005) IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med 11, 191-198; Vandanmagsar, B et al. (2011) The NLRP3 inflammasome instigate obesity-induced inflammation and insulin resistance. Nat Med 15, 179-188). 소기관 수준에서 ER 및 미토콘드리아의 기능부전 및 스트레스도 당뇨병의 주요인자로 알려져 있으며 {Ozcan, U et al. (2004) Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 Diabetes. Science 306, 457-461; Petersen, KF et al. (2003) Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance. Science 300, 1140-1142}, 이는 상술한 분자 기전의 상위 또는 하위 수준에서 영향을 미칠 수 있다. 자가포식 활성이 노화 또는 지방과다 상태에서 감소되기 때문에 자가포식의 결핍은 ER 및 미토콘드리아의 기능부전으로 이어질 수 있다. 따라서 자가포식 결핍은 비만 또는 노화와 연관된 대사 증후군 및 당뇨병의 기저 원인이 될 수 있다.

따라서 자가포식 활성을 갖는 본원에 따른 화합물은 비만 또는 노화로 인한 대사성질환 또는 대사증후군, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 고지질혈증, 또는 비만, 또는 비만으로 인한 염증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에서 대사성 질환 또는 대사증후군은 대사 근원적 이상으로 인해 제2형 당뇨병, 고지질혈증, 비만, 및/또는 염증과 같은 다수 질환이 동시에 발생하는 것을 의미한다 (Pershadsingh HA, Dual Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-alpha/gamma Agonists : In the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus and the Metabolic Syndrome. Treat Endocrinol. 2006;5(2):89-99).

본 명세서에서 사용된 용어 "비만"은 에너지 불균형에 의하여 체내에 축적된 지방이 정상수치보다 높은 과다한 체지방을 가진 상태(condition) 또는 질환(disease)을 의미한다. 세계보건기구 WHO에 의하면 아시아 태평양 지역의 경우, 비만의 진단에 이용되는 것은 키(meter 단위)의 제곱으로 자신의 체중을 나눈 값이 되며, 이 값이 25.0 이상인 경우는 비만이라고 정의하고, 23 이상 25 미만은 과체중(위험체중)으로 정의하고 있다. 비만은 분류에 따라 내분비성 비만(내분비 이상 또는 뇌질환으로부터 기인), 단순성 비만(과다한 영양 섭취로부터 기인); 증식성 비만(지방세포수의 증가로 인한 비만), 비대형 비만(지방세포의 크기 증대로 인한 비만); 상반신 비만, 하반신 비만; 및 내장형 비만, 피하지방형 비만 등으로 나눌 수 있으며, 이들 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 한 구현예에서 상기 비만은 대사증후군과 관련된 비만이다.

본원에 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 관련 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본원에 따른 조성물의 투여로 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원 조성물은 자가포식 억제로 인한 증상이 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

이에 본원의 자가포식 조절제는 약학 조성물로 제조될 수 있다. 약학 조성물은 동시에 또는 연속적으로 투여가능하며, 상기 질환 치료를 위한 다른 약학적 활성성분과 병행하여 투여될 수도 있다.

본원에 따른 치료제 또는 약학 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 예로서 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

본원의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

본원의 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탁액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화 되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본원의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 유효 투여량은 통상적으로 성인(60kg)의 경우, 약 1ng 내지 10mg/일, 특히 약 1μg 내지 1mg/일이다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동 가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

본원에 사용된 스크리닝 방법은 자가포식 정도 및 자가포식 플럭스에 대한 변별력이 없는 기존 LC3-기반의 분석법 {Rubinsztein, DC et al. Nat Rev Drug Discov 11, 709-730}의 단점을 해결한 것이다. 기존의 방법은 대부분 자가포식 수준만을 측정할 수 있으며 자가포식 활성을 측정하지 못한다. 이에 따라 자가포식 억제제가 자가포식 증진제로 오인되는 반대의 결과를 가져올 수도 있다. 또한 기존의 자가포식 활성 측정법은 개별 측정은 가능하나 대량 스크리닝에는 적당치 않았는데 본 방법은 자가포식 활성을 고 처리양으로 측정할 수 있다.

본원에 따른 화합물은 라이소좀의 생성을 촉진하여 자가포식을 향상시킨다. 라이소좀 생성은 상술한 바와 같이 자가포식에 필수적 구성이다. 본원의 화합물은 특히 mTOR 억제와 독립적으로, 즉 mTOR 기전을 억제하지 않으면서 라이소좀 생성을 촉진하여 자가포식을 활성화 시킨다.

이런 측면에서 본원에 따른 화합물은 라이소좀 생성을 통한 자가포식 조절 또는 향상 키트에 관한 것이다.

본원에 따른 키트는 인비보 또는 인비트로에서 세포의 자가포식 향상이 필요한 다양한 방법에 사용될 수 있다.

이런 측면에서 본원은 화학식 1 또는 2의 화합물과 세포를 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 접촉에 의해 상기 세포는 mTOR를 억제하지 않으면서 TFEB의 핵으로의 이동을 유발하는 것인, 인비보, 엑스비보 또는 인비트로에서 세포의 자가포식 활성 방법에 관한 것이다.

또한 본원에 따른 화합물은 지질 대사 및 염증조절복합체(inflammasome) 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 본원에 따른 화합물은 라이소좀의 생성을 촉진하고, 그 결과 생성된 자가포식라이소좀은 세포내 지질과 직접 상호작용하여 지질을 제거하고, 본원은 본원에 따른 화합물은 지질과다 또는 비만과 관련된 대사 프로파일을 향상시킬 수 있다.

따라서 이런 측면에서 본원은 또한 화학식 1 또는 2의 화합물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

또한 이런 측면에서 본원에 따른 화학식 1 또는 2의 화합물을 포함하는 mTOR 억제와 독립적인 라이소좀 생성 촉진을 통한 세포의 지방제거용 키트에 관한 것이다.

이러한 본원에 따른 키트는 인비보 또는 인비트로에서 세포의 지질 제거가 필요한 다양한 방법에 사용될 수 있다.

이런 측면에서 본원은 화학식 1 또는 2의 화합물과 세포를 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 접촉에 의해 상기 자가포식이 활성화되고, 상기 자가포식에 의해 상기 세포의 지질이 제거되는 것인, 인비보, 엑스비보 또는 인비트로에서 세포의 지방 제거 방법에 관한 것이다.

기존에 자가포식과 질환의 발생과의 연관성은 주로 암, 신경퇴행성질환, 및 감염성 질환 분야에서 연구되어 왔으며, 대사성 질환에서의 역할을 보고된 바가 없으며, 본원에서는 자가포식의 조절을 통해 염증조절복합체의 조절, 세포내 지질제거 등을 통해 대사성 질환의 치료가 가능하다는 것을 규명하고, 이에 이르는 분자기전을 또한 규명하였다 (도 1a, 1b 참조).

따라서 또 다른 양태에서 본원은 본원에서 규명된 기전을 기반으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 스크리닝 방법은 일 구현예에서 시험에 사용될 진핵세포를 제공하는 단계; 상기 세포에 대사성 스트레스를 가하는 단계; 상기 대사성 스트레스를 가하기 전 또는 그 후에 상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질로 처리된 세포에서 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 측정 결과, 시험물질로 처리되지 않은 경우와 비교하여, 상기 시험물질로 처리된 세포에서 상기 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성이 향상된 경우, 상기 시험물질을 대사성 질환 예방 또는 치료제 후보물질로 선별할 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포는 인비트로 상태에의 세포 또는 실험동물 중의 세포 즉 실험동물을 포함하는 것이다. 자가포식은 앞서 설명한 바와 같이, 세포의 항상성 유지에 중요하여 모든 세포가 필요로 하는 작용이기 때문에, 이러한 자가포식 기능을 보유한 다양한 세포가 본원의 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 따라서 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 세포는 시험물질의 처리 또는 비처리에 의한 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성을 측정할 수 있는 것이면 제한되지 않으며, 예를 들면, HeLa, TFEB-GFP-HeLa, 지방세포, 또는 SK-HEP1(hepatoma cell line) 및 Hepa1c1c7(hepatoma cell line)를 포함하는 간세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에서는 후술하는 시험물질의 처리 전 또는 후에 세포에 대사성 스트레스를 가하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에서 대사성 스트레스란 일 구현예에서 영양분과 관련된 스트레스로 특정 영양분이 과하거나 또는 부족할 경우에, 세포의 바이오에너지 요구(bioenergetic needs)를 유지 또는 맞추기 위해서, 세포가 이를 인지하고 대응하는 일련의 과정으로 특히 대사성 질환의 측면에서 자가포식의 활성 또는 불활성과 관련된 관점에서 해석된다. 따라서, 본원에 따른 방법에서 자가포식 조절제를 스크리닝하기 위해서는 세포로 하여금 자가포식을 활성화 또는 비활성화할 수 있는 적절한 처리가 필요하다.

일 구현예에서 이러한 대사성 스트레스는 세포에 적절한 지질 예를 들면 팔미트산 또는 올레산을 처리하거나, 또는 포도당을 고갈시키는 것일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 본원에 실시예를 포함하는 본원에 기술된 사항을 참조하여 적절한 조건을 선택할 수 있을 것이다.

상기 세포에서 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 것으로 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법을 이용하여 적절한 것을 어려움 없이 선택하여 사용할 수 있을 것이다. 또한 비처리 세포와 비교하여, 시험물질로 처리된 세포에서의 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성의 기준 또한 본원 실시예를 포함하여 본원에 개시된 사항을 참조하여 판단할 수 있을 것이다.

본원에 따른 스크리닝 방법에 사용되는 시험물질은 mTOR를 억제하지 않고, 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성을 유도할 것으로 기대되는 시험물질을 의미하며, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다.

대사성 질환의 치료 및/또는 예방하는 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다. 시험물질의 양은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는, 상기 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을, 대사성질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료방법을 제공한다.

본원에 따른 화합물 또는 이를 포함하는 조성물, 그리고 치료가능한 질환에 대한 설명은 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.

본원에 따른 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은 대상성 질환의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에게 투여된다. 대상체는 인간 또는 영장류를 포함하는 포유류, 특히 인간을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 본원에서, "치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험예 1.

실험방법 및 재료

자가포식 향상 또는 증진제( enhancer ) 스크리닝. 10cm 배양 접시의 HEK 293 세포는 5μg의 pRLuc(C124A)-LC3(wt) 또는 pRLuc(C124A)-LC3(G120A) 플라스미드를 10μl의 lipofectamine {Faskas, 2009 #2848}을 제조자의 방법대로 이용하여 전달이입하였다. 이어 상기 유전자를 안정적으로 발현하는 세포는 400μg/ml G418에서 세포를 배양하고 125nM Rapamycin으로 6시간 처리한 후에 야생형/돌연변이 노말라이즈된 루시퍼라제 비가 < 0.7인 클론을 라이브러리 스크리닝에 사용하였다.

루시퍼라제 분석. 파이어플라이 및 레닐라 루시퍼라제 분석은 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)을 제조자의 방법대로 사용하여 수행하였다. 요약하면 세포를 1x 융해완충액에서 융해하고, 1회의 냉동/해동을 수행하였다. 파이어플라이 루시퍼라제는 25μl의 루시퍼라제 분석제 II와 5μl의 융해제를 혼합한 용액을 사용하여 측정하였다. 레닐라 루시퍼라제는 추가로 20μl의 Stop&Glo를 사용하여 측정하였다.

세포배양 및 약물 처리. HeLa, TFEB-GFP-HeLa, SK-HEP1(hepatoma cell line) 및 Hepa1c1c7(hepatoma cell line)세포는 다음 배양액에서 배양하였다 : (정상) Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM, Sigma-Aldrich) 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin 포함; (starvation) HBSS Ca 및 Mg, 10mM HEPES 포함. 약물처리: MSL 화합물(50-100μM); Rapamycin (2.5mg/ml); Torin-1 (1μM);Bafilomycin (100nM); Cyclosporin A (10μM); 및 FK506 (5μM). 세포를 올레산 (400μM) 및 팔미트산 (400μM)으로 24h 동안 처리하였다. 필요한 경우 세포는 HBSS로 세척하고 MSL을 포함하거나 또는 포함하지 않은 DMEM으로 16시간 배양하였다. 마우스의 인슐린종 세포주인 INS-1 세포 종래 문헌(Kim et al., 2014 ibid)에 기재된 바와 같이, 10nM 바필로마이신 존재 또는 부존재하에서 배양하고, MSL-7으로 처리되었다.

LDH (Lactate dehydrogenase ) 분석. 세포독성은 LDH kit (Roche)를 제조자의 방법대로 사용하여 세포배양 배지로 방출된 LDH를 측정하여 분석하였다.

전달이입 및 플라스미드. 세포는 3xFLAG-hTFEB (A Ballabio), FYVE-dsRed (Cantley LC), RFP-LC3 또는 mRFP-GFP-LC3 플라스미드를 lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 제조자의 방법대로 사용하여 전달이입하였다. INS-1 세포는 jetPEIDNA를 제조자의 방법대로 사용하여 prepro-mIAPP-HA 또는 prepro-hIAPP-HA로 전달이입되었다.

이미징 및 이미지 정량. 영상은 ×40 대물렌즈를 장착한 LSM780 confocal microscope (Zeiss) 현미경을 이용하여 촬영하였다. 영상 분석 (spot count per cell) Image J 소프트웨어를 사용하였다. 필요한 경우 세포는 BODIPY 493/503 (Invitrogen, 20μg/ml, 20min)를 제조자의 방법대로 사용하여 세포의 지질미적을 염색하였다. 산성 소포성 기관은 아크리딘 오렌지 (Invitrogen, 5ug/ml, 10min)로 염색하였다.

항체 및 웨스턴블랏 . 세포 또는 조직은 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 포함하는 융해완충액에서 융해하여, 단백질 농도는 Bradford 방법으로 측정하였다. 10 내지 30μg 단백질을 4-12% Bis-Tris gel (NUPAGE, Invitrogen) 또는 8-15% SDS-PAGE에 로딩하여 전개하고 PVDF 막으로 전달한 후 ECL 방법(Pierce)을 사용하여 분석하였다. 사용한 항체는 다음과 같다: LC3 (Novus NB100-2331, 1:1,000), p62 (Progen GP62-C, 1:1,000), b-actin (Santa Cruz sc-47778, 1:5,000), FLAG (Sigma-Aldrich F1804, 1:2,000), 70S6K (Cell Signaling 9202S, 1:1000), p-70S6K (Cell Signaling 9206S, 1:1000), mTOR (Cell Signaling 2983, 1:1000), pmTOR (Cell Signaling 2971S, 1:1000), TFEB (Cell Signaling 4240, 1:1000). 단백질 농도는 Image J 소프트웨어로 분석하였다.

RNA 추출, RT 및 real-time RT- PCR . 세포 또는 조직에서 총 RNA는 TRIzol (Invitrogen)을 제조자의 방법대로 사용하여 추출하고, cDNA MMLV-Rtase (Promega)는 제조자의 방법대로 사용하여 합성하였다. 실시간 RT-PCR은 ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems) 장비를 이용하여 SYBR을 이용하여 수행하였다. 모든 측정값은 GAPDH mRNA 농도에 노말라이즈 하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다 : TFEB-F (5´-CCAGAAGCGAGAGCTCACAGAT-3´), TFEB-R (5´-TGTGATTGTCTTTCTTCTGCCG-3´), MCOLN1-F (5´-TTGCTCTCTGCCAGCGGTACTA-3´), MCOLN1-R (5´-GCAGTCAGTAACCACCATCGGA-3´), UVRAG-F (5´-CTGTTTGGATGGGCTGAAAT-3´), UVRAG-R (5´-YGCGAACACAGTTCTGATCC-3´), CLCN7-F (5´-TGATCTCCACGTTCACCCTGA-3´), CLCN7-R (5´-TCTCCGAGTCAAACCTTCCGA-3´), LAMP1-F (5´-ACGTTACAGCGTCCAGCTCAT-3´), LAMP1-R (5´-TCTTTGGAGCTCGCATTGG-3´), CTSA-F (5´-CAGGCTTTGGTCTTCTCTCCA-3´), CTSA-R (5´-TCACGCATTCCAGGTCTTTG-3´), CTSD-F (5´-AACTGCTGGACATCGCTTGCT-3´), CTSD-R (5´-CATTCTTCACGTAGGTGCTGGA-3´), CTSF-F (ACAGAGGAGGAGTTCCGCACTA-3´), CTSF-R (5´-GCTTGCTTCATCTTGTTGCCA-3´), ATP6V0E1-F (5´-CATTGTGATGAGCGTGTTCTGG-3´), ATP6V0E1-R (5´-AACTCCCCGGTTAGGACCCTTA-3´), ATP6V1H-F (5´-GGAAGTGTCAGATGATCCCCA-3´), ATP6V1H-R (5´-CCGTTTGCCTCGTGGATAAT-3´), GAPDH-F (5´-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3´), 및 GAPDH-R (5´-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3´).

GCaMP3 Ca2 + 이미징 . HeLa 세포는 15mm 커버슬립에서 배양하여 perilysosomal-localized ML1-GCaMP3 calcium probes를 코딩하는 플라스미드로 전달이입 하였다. 470nm에서 형광 신호는 LSM780 confocal microscope (Zeiss)를 이용하여 모니터링 하였다. 48h 후에, 라이소좀 Ca2+ 방출은 basal Ca2+ 용액 (145mM NaCl, 5mM KCl, 3mM MgCl₂, 10mM glucose, 1mM EGTA, 20mM HEPES (pH 7.4) with or without MSL). GPN (200μM, 라이소좀 와해 용액)은 라이소좀에서 칼슘이온 방출을 유도하기 위해 양성 대조군으로 사용하였다. Ionomycin (1μM)은 모든 실험의 마지막에 추가하여 비교를 위해 최대 반응을 유도하였다.

칼시뉴린 포스파타제 활성 분석. 칼시뉴린 포스파타제 활성은 칼시뉴린 포스파타제 활성 키트 (Abcam, ab139464)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다.

조직분석. 조직은 10% buffered 포르말린에서 고정하고 파라핀에 포매하여 절편(5μm)은 형태분석을 위해 hematoxylin-eosin으로 염색하거나 또는 지방세포 주위에 왕관구조 응집체 (CLS) F4/80 양성 대식세포를 검출하기 위해 처리하였다. IAPP 올리고머를 탐지하기 위하여, 냉동 췌장 섹션을 A11 항체(Millipore)로 면역염색한 후, Alexa 488-접합 염소 항-래빗 면역글로불린 G로 배양하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.

아밀로이드 염색. 탈포매된 췌장 섹션을 70% 포름산으로 20분간 처리하고 나서, 10 mM FSB (Millipore)으로 1시간 동안 배양하였다. DAPI-대비염색된 섹션은 형광현미경(Nikon)으로 관찰하였다. 평균 형광 강도/면적은 NIS-Elements AR 3.0 software (Nikon)로 측정하였다.

IL-1 베타 ELISA 분석. 3.85% 티오글라콜레이트 배지를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 일차 복강 대식세포를 분리하여 500ng/ml LPS의 존재 또는 부재 중에서 PA로 처리하였다. 24시간 처리 후에, 세포 배양 상층액에서 마우스 ELISA kit (R&D Systems)를 제조자의 방법대로 사용하여 IL-1베타를 측정하였다.

미토콘드리아 변화. 미토콘드리아 전위를 측정하기 위해, 복강 대식세포는 MitoTracker Green 및 MitoTracker Red (Invitrogen) 각 1μM 농도로 37도에서 25분간 염색하였다. 이어 세포를 1% FBS를 포함하는 PBS에 현탁하여 FlowJo software (TreeStar) 및 FACSVerse (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 미토콘드리아의 ROS 농도는 세포를 5μM MitoSOX (Invitrogen)용액을 이용하여 37도에서 5분간 배양한 후 상술한 바와 같은 세포 분류(sorting) 분석을 수행하였다.

동물실험. Ob/ob 마우스 (Jackson Laboratory)에게 12-hr 명/12-hr 암 주기를 유지하면서 차우(chow) 식이를 공급하였다. 8주령의 수컷 ob/ob 마우스에게 8주동안 1주 당 3회 50mg/kg MSL, MSL-7 또는 비히클을 복강내 투여하였다. 관찰기간동안, 마우스의 혈당 프로파일을 모니터링하고 체중을 쟀다. 식이-유도 비만 모델을 사용한 실험에서, 8주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 8주 동안 HFD를 먹이고, 그 후 8주 동안 HFD 식이와 함께 50mg/kg MSL 또는 MSL-7을 1주당 3회 투여하였다. 상기 문헌(Kim et al., 2014, ibid)에 기재된 바와 같이, 아밀로이드생성 hIAPP (hIAPP+ mice) (Jackson Laboratory)를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 사육하여 유지시켰다. 16주령 수컷 hIAPP+ 마우스에게 8주 동안, hIAPP 올리고머의 축적을 촉진시키기 위하여 HFD 식이를 하는 동시에, 이와 함께 MSL-7을 투여하였다. 모든 동물 실험은 실험동물 사용에 대한 공중 보건 서비스 정책에 따라 수행되었다. Ob /ob 마우스는 8주 동안 vehicle (n=9) 또는 MSL (n=9)(복강 투여; 50mg/kg/2days)로 처리하였다. 처리기간 동안 마우스를 모니터링하고 체중을 측정하였다. 마우스 실험은 연세대학교 실험동물 위원회의 IACUC, AAALAC-accredited unit에 의해 승인되었다.

내당 및 인슐린 내성 시험. IPGTT는 하룻밤 절식 후에 1g/kg 글루코스를 복강 투여하였다. 혈당은 글루코스 투여 전 (0 min) 및 투여 15, 30, 60, 120 및 180분 후에 ACCU-CHEK glucometer (Roche)를 이용하여 측정하였다. ITT는 0.75 U/kg의 일반 인슐린을 공복 마우스에게 0.75 U/kg 농도로 복강 투여하고, 혈당을 0, 15, 30, 60 및 120 min에 측정하였다. 혈청 인슐린 농도는 ELISA kit (Shibayagi)를 사용하여 측정하였다. HOMA-IR은 하기 식으로 계산하였다 : (공복 insulin × 공복 glucose)/22.5. 인슐린 생성 지수(Insulinogenic index)는 다음 식으로 계산하였다 : (insulin 15 min-insulin 0min)/(glucose 15 min-glucose 0min).

혈액 분석(Blood chemistry). 혈청 ALT/AST, TG, 총 cholesterol, ALP, ALB, DBIL,GTT 및 LDH 농도는 Fuji Dri-Chem blood chemistry analyzer를 제조사의 방법대로 측정하였다. Hamevet950 Blood Analyzer (Drew Scientific)를 제조사의 방법대로 사용하여 헤파린화 혈액에서 헤모그램을 얻었다.

TG 측정. 균질화 조직에서 chloroform/methanol mixture (2:1)를 이용하여 지질을 추출하였다. 증발 후 지질 잔류물을 100% 에탄올 중의 1% Triton X-100 현탁하고, 리파제를 포함하는 Free Glycerol Reagent (Sigma)과 혼합하였다. 37도에서 5분간 배양한 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 이용하여 TG 농도를 계산하였다.

간마이크로좀 안정성. 100 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.4) 내의 인간 간 마이크로좀(BD Gentest) 및 10μM 시험물질로 반응혼합물을 만들었다. 37C에서 5분간 전(pre)-배양한 후, NADPH 재생 용액(BD Biosciences)을 첨가하여 상기 반응을 개시시켰다. 0 및 30분에 샘플(50μl)을 수집하였다. 얼음으로 차갑게 한 450μl의 이미프라민 아세토니트릴 용액 (100ng/mL, internal standard)을 첨가하여 상기 반응을 종결시켰다. 13,000 rpm, 4℃에서 5분간 격렬히 혼합(vortex)시켜 원심분리한 후, 투명한 상청액을 모아, 액체 크로마토그래피(LC) 바이알로 옮겨, LC-MS/MS로 분석하여 화합물을 정량하였다.

통계분석. 모든 값은 삼중으로 실험된 ≥3의 독립적인 결과로부터 means±s.e.m.로 표시하였다. 다른 언급이 없다면 Two-tailed Student's t-test를 이용하여 두 그룹 간의 수치를 비교하였다. One-way ANOVA with Tukeys test는 다수 그룹 간의 수치를 비교하는데 사용되었다. Two-way repeated measures ANOVA with Bonferronis post test 그룹간 다수의 반복 측정값의 비교에 사용되었다. 수치가 없는 경우에는 two-way ANOVA using the linear mixed model을 사용하였다. P values <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1. 화학식 1의 화합물( MSL )의 합성

화학식 1의 화합물은 시중에서 구입하였다 (Chembridge, Cas No. 831243-88-0).

실시예 2. 2-(2- 클로로페닐 )-5- 메톡시 -4-( 페닐설포닐 ) 옥사졸의 제조 (화학식 2의 화합물: MSL -7)

실시예 2-1. 메틸 2-( 페닐설포닐 )아세테이트의 제조

에탄올(200mL) 중의 메틸 브로모아세테이트(10g, 65.38mmol) 및 벤젠술핀산 소디움염(12.9g, 78.4mmol) 용액을 밤새 환류하였다. 이어 과량의 용매를 감압하에서 제거하였다. 이어 반응 혼합물을 디클로로메탄(400mL)에 용해하고 물(2 x 200mL) 및 브라인(50mL)으로 세척하였다. 이어 유기층을 무수 Na₂SO₄에서 건조하고 감압하에서 농축하여 표제화합물을 수득하였다 (13.5g, 96%). 상기 화합물을 별도의 정제과정 없이 다음 단계 화합물 합성에 사용되었다.

실시예 2-2. 메틸 2- 다이아조 -2-( 페닐설포닐 )아세테이트의 제조

0℃에서 교반한 아세토니트릴(500mL) 중의 메틸 2-(페닐설포닐)아세테이트(13.5g, 67.7mmol) 및 4-아세트아미도벤젠설포닐 아자이드(16.65g, 69.31mmol) 용액에 트리에틸아민(7.0g, 69.3mmol)을 한방울씩 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 여과하여 얻은 고체를 에틸아세테이트로 세척하였다. 상기 여과물을 진공(in vacuo) 건조시켰다. 얻은 잔류물을 에틸 아세테이트 및 n-헥세인을 사용하여 플래시 크로마토그래피로 정제하여 흐린 노란색의 표제 화합물을 고형물로 수득하였다 (15g, 99%).

실시예 2-3. 2-(2- 클로로페닐 )-5- 메톡시 -4-( 페닐설포닐 ) 옥사졸의 제조

2-클로로벤조나이트릴(600mg, 4.36mmol) 및 로디움(II) 아세테이트(38.55mg, 0.087mmol)의 클로로포름(10ML) 용액을 환류시키면서 여기에 메틸 2-디아조-2-(페닐설포닐)아세테이트(1.15g, 4.8mmol)의 클로로포름(10mL) 용액을 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 상기 반응 혼합물을 3시간 동안 계속 환류시켰다. 반응 혼합물을 차갑게 한 후 감압 농축시켰다. 상기 잔류물로 컬럼크로마토그래피를 수행하여 흰 고체의 표제화합물을 얻었다 (1.4g, 92%).

실시예 3. mTOR 억제 기능이 없는 자가포식 향상 물질 스크리닝

이를 위해 HEK 293 세포를 pRLuc(C124A)-LC3(wt) 또는 pRLuc(C124A)-LC3(G120A) 벡터로 전달이입하였다. LC3의 G120A 치환은 LC3-I 및 -II의 형성에 필수적인 단백질분해에 대한 저항성을 부여하여 LC3의 자가포식체 국소화를 억제하게 된다 (Faskas, T et al. (2009) Identification of novel autophagy regulators by a luciferase-based assay for the kinetics of autophagic flux. Autophagy 5, 1018-1025). 한편 pRLuc의 C124A 치환은 자가포식 비의존적으로 RLuc의 회전률을 감소시킨다 (Faskas, 2009 ibid; Loening, AM et al. Protein Eng Des Sel 19, 391-400).

이어 상기 전달이입된 세포를 7,800개의 구입한 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리 (Korea Chemical Bank)로 처리하여 50μM 농도에서 독성을 나타내지 않으며 (viability, > 80%), 야생형/돌연변이 루시퍼라제 비가 < 0.6 로 감소된 화합물을 선별하였다. 2회 스크리닝을 수행하여 재현성 있는 자가포식 향상 활성을 나타내는 39개의 후보물질을 선별하였다 (도 1a, 1b 참조).

이어 자가포식 향상 활성을 SK-Hep1 세포를 이용한 웨스턴블랏으로 확인하였다. 그 결과 39개 물질 중에서 16개의 물질이 bafilomycin의 존재 중에서 LC3-I의 LC3-II의 전환 증가를 유도하는 것으로 나타났다 (도 1c 참조). 이러한 결과는 이들이 자가포식 플럭스를 증가시킬 수 있는 신뢰할 수 있는 자가포식 조절제임을 나타내는 것이다. 이들은 또한 bafilomycin의 부재 중에서는 p62를 감소시키는 것으로 나타났다 (도 1c 참조).

이어, 대사 프로파일 및 췌장 베타 세포의 기능에 미치는 악영향을 미칠 수 있는 mTOR 억제 물질을 제외하기 위해서 상기 물질이 mTOR 활성을 억제할 수 있는지를 시험하였다. 이를 위해 웨스턴블랏을 수행하여 16개 중 8개가 S6K1 인산화는 억제하지 않으면서 자가포식 플럭스는 향상시키는 것으로 나타났다 (도 1e). 이러한 결과는 이들 물질이 mTOR 비의존적으로 자가포식 활성을 유도한다는 것을 나타낸다.

이어 이중 MSL 화합물의 증가된 자가포식 활성을 확인을 하기 위하여, 자가포식 활성과 관련된 라이소좀 이벤트를 시험하였다. MSL 화합물로 유도된 LC3+ 자가포식체는 라이소좀 마커인 LAMP1에 대하여 양성이었으며, 이는 자가포식 소기관 및 라이소좀이 함께 위치(colocalization)하고 있는 것을 나타내는 것으로, 즉 자가포식라이소좀 형성 과정의 라이소좀 이벤트가 발생했음을 나타내는 것이다 (도 2a). 나아가 tandem mRFP-GFP-LC3B 프로브의 전달이입 후 콘포칼 현미경 관찰 결과에 의하면 MSL 화합물 처리 후에 yellow puncta (RFP+ GFP+; representing early autophagic organelles) 및 red puncta (RFP+ GFP-, representing autolysosomes)가 증가한 것으로 나타났으며, 이는 자가포식 과정에서의 라이소좀 단계가 일어났음을 확인하는 것이다 (도 2b). 또한 자가포식체의 핵화(nucleation)를 시험하였다. FYVE-dsRed+ vesicle의 리쿠르트는 MSL 화합물 처리로 인해 증가한 것으로 나타났으며, 이는 자가포식체의 형성에 필수 단계인 Vps34a 및 PI3P (phosphatidylinositol-3-phosphate)의 생산을 말하는 것이다 (도 2c). 종합하면, 상기 결과는 MSL 화합물이 자가포식 플럭스를 향상시켰음을 나타내는 것이다.

실시예 4. 라이소좀을 중심으로 한 자가포식 활성 기전 규명

본 실시예에서는 mTOR 활성의 억제와는 관련되지 않은 MSL 화합물에 의한 자가포식 활성의 분자 기전을 규명하였다. 이를 위해 MSL 화합물에 의해 활성화되는 자가포식의 라이소좀 단계를 시험하였다. 라이소좀 생성 및 자가포식의 주요 조절자인 TFEB의 변화를 조사한 결과, MSL 화합물로 처리된 HeLa 세포에서 대다수가 핵으로 이동한 것으로 나타났다 (도 3a). TFEB 양성을 나타내는 핵은 비처리 세포와 비교하여 MSL 화합물 처리된 세포에서 크게 증가하였다 (도 3a). 이러한 결과와 일치하는 결과로, 아크리딘 오랜지 염색 후 적색 형광도 유의적으로 증가하였으며, 이는 MSL 화합물 처리된 세포에서 라이소좀 산성화 및 내용물이 증가된 것을 나타낸다 (도 3b).

이어 mTOR 억제와 관련되지 않은, MSL 화합물에 의한 TFEB 전위의 기전을 규명하였다 (도 3c). 이를 위해 TFEB의 탈인산화를 초래하여 이의 전위를 향상시키는 것으로 알려진 라이소좀 칼슘-칼시뉴린 경로를 연구하였다 (Medina, DL et al. (2015) Lysosomal calcium signalling regulates autophagy through calcineurin and TFEB. Nature Cell Biol 17, 288-299).

따라서 MSL 화합물에 의해 라이소좀 특이적 Ca2+ 프로브 {Medina, 2015 ibid}인 GCaMP3-ML1로 전달이입된 HeLa 세포에서 라이소좀 Ca2+ 방출이 증가하는지 여부를 시험한 결과, 라이소좀트로프제(lysosomotropic agent)인 GPN 또는 칼슘 아이오노포인, 아이오노마이신은 처리한 경우는 라이조솜 칼슘이 증가 되었으나, 시험 대상의 경우, 관찰되지 않았다 (도 9). 따라서 MSL 화합물이 라이소좀 Ca2+ 이플럭스와 상관없이 칼시뉴린의 활성을 증가시키는지 여부를 시험한 결과, 인비트로 칼시뉴린 포스파타제 분석에서 칼시뉴린의 활성이 MSL 화합물에 의해 유의하게 증가된 것으로 나타났다 (도 3d). 나아가 이러한 증가된 포스파타제 활성은 사이클로스포린 A (CsA) 또는 FK506에 의해 유의하게 억제되는 것으로 나타났으며, 이는 MSL 화합물이 칼시뉴린의 활성을 향상시킴을 증명하는 것이다 (도 3e). CsA 또는 FK506는 또한 MSL 화합물에 의한 TFEB의 전위가 사라졌으며, 이는 MSL 화합물의 TFEB 전위에서 칼시뉴린 활성의 역할과도 일치하는 결과이다. MSL 화합물에 의해 증가된 칼시뉴린의 활성은 웨스턴블랏에서 TFEB의 이동이 향상된 것으로도 증명된다 (결과는 나타내지 않음).

실시예 5. 인비트로에서 MSL 화합물의 지질 대사 및 염증조절복합체(inflammasome) 활성에 미치는 영향 분석

본 실시예에서는 MSL 화합물이 세포의 대사에 영향을 미치지는 여부를 조사하였다. 이를 위해 murin hepatoma 세포인 Hepa1c1c7 세포 (ATCC　 CRL 2026™)를 PA 및 OA로 적하하고 MSL 화합물이 이러한 지질 미적의 제거를 향상시키는 지를 실험하였다. 비처리 대조군과 비교하여 MSL 화합물로 16시간 동안 처리된 세포에서는 지질 미적 염색된 BODIPY 함량이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (도 4a). 또한 BODIPY와 함께 있는 LC3 또는 LAMP1도 BODIPY와 공위치화된 것으로 나타났다 (도 4b). 이러한 결과는 자가포식라이소좀과 세포내 지질의 직접적 상호작용을 확인하는 것이다. 이러한 지질 염색결과와 일치하는 것으로, PA(팔미트산) 및 OA(올레산)로 적하된 세포의 지질함량이 MSL 화합물에 의해 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (도 4c). 이러한 결과는 MSL 화합물이 칼시뉴린 활성의 향상을 통해 자가포식 또는 지질포식을 활성화시켜 지질 전환율을 증가시켰음을 나타내는 것이다. 또한 이러한 결과는 MSL 화합물이 지질과다 또는 비만과 관련된 대사 프로파일을 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

NLRP3을 통한 염증조절복합체의 활성은 비만에서 인슐린 저항성과 관련된 대사성 염증의 중요한 성분이며, 팔미트산(PA)과 같은 지질은 NLRP3의 리간드로 작용한다 (Vandanmagsar, B et al. (2011) The NLRP3 inflammasome instigate obesity-induced inflammation and insulin resistance. Nat Med 15, 179-188). 나아가 NLRP3 활성은 영양소 상태 또는 소기관 기능뿐만 아니라 내인성 또는 적응성 면역을 조절하는 자가포식에 의해 조절된다 {Levine, 2007 #1718}. 대식세포(MΦs)를 LPS와 함께 PA로 처리한 경우, ELISA로 분석한 결과 IL-1베타의 방출이 MSL 화합물로 처리된 대식세포에서 비처리 대조군과 비교하여 유의하게 감소한 것으로 나타났으며 (도 5a), 이는 MSL 화합물에 의한 지질 유도된 염증조절복합체 활성을 나타내는 것이다. 웨스턴블랏 결과, MSL 화합물에 의해 카스파제-1 절단 및 IL-1베타 성숙이 감소된 것으로 나타났으며, 이는 위의 IL-1베타 방출 결과를 뒷받침하는 것이다 (결과 나타내지 않음).

종전 연구결과에 의하면 자가포식은 염증조절복합체 활성의 허브 소기관으로 작용하는 기능을 하지 못하는 미토콘드리아의 전환을 조절하여 염증조절복합체의 활성을 조절하는 것으로 보고되었다 (Misawa, T et al. (2013) Microtubule-driven spatial arrangement of mitochondria promotes activation of the NLRP3 inflammasome. Nat Immunol 14, 454-460). 따라서 본 실시예에서는 MSL 화합물로 처리된 세포에서 미토콘드리아 이벤트를 조사하였다. 미토콘드리아의 기능 부전 또는 손상을 반영하는 미토콘드리아 ROS 함량을 MitoSox 염색으로 측정한 결과, LPS와 PA의 조합이 대식세포의 미토콘드리아 ROS의 함량을 유의적으로 증대시킨 것으로 나타났다. 본 실시예에서, MSL 화합물 처리는 LPS와 PA로 처리된 세포에서 미토콘드리아 ROS의 함량을 유의적으로 감소시켰다 (도 5b). 또한 미토콘드리아 전위를 MitoTracker Red 염색으로 분석한 결과 전위가 LPS와 PA로 처리된 세포에서 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 이는 MSL 화합물 처리로 인해 LPS와 PA로 처리된 세포에서 미토콘드리아 전위가 유의적으로 감소되었음을 나타낸다 (도 5c).

이러한 결과는 MSL 화합물이 염증조절복합체 활성의 리간드로 작용하는 지질 함량을 감소시키고 지질로 과적된 세포의 미토콘드리아의 기능을 향상시켜 염증조절복합체의 활성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 6. MSL 화합물에 의한 인비보에서 대사 향상

이어 MSL 화합물이 인비보에서 자가포식 플럭스(flux)를 활성화할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 leupeptin (Ueno, T et al. (1991) Membrane markers of endoplasmic reticulum preserved in autophagic vacuolar membranes isolated from leupeptin-administered rat liver. J Biol Chem 266, 18995-18999) 전처리 후에 MSL 화합물을 투여한 결과, 간에서 LC3-I의 LC3-II로의 전환이 증가한 것으로 나타났으며, 이는 MSL 화합물이 인비보에서 자가포식 플럭스를 증가시킬 수 있음을 나타내는 것이다. 이어 MSL 화합물이 비만과 관련된 대사 프로파일을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 그 결과 8주 동안 50mg/kg의 양으로 MSL 화합물이 투여된 ob/ob 마우스의 경우, 사료 섭취 및 체중은 MSL 화합물의 투여에 영향을 받지 않았지만, 비공복 혈당은 대조군 ob/ob 마우스와 비교하여 유의하게 감소한 것으로 나타났다 (도 6a).

공복 혈당도 8주간의 MSL 화합물 투여로 인해 유의하게 개선된 것으로 나타났다 (도 6h). 나아가 IPGTT 및 ITT도 내당성 및 인슐린 민감성에 있어서 유의한 개선이 있는 것으로 나타났다 (도 6d, 6f). 이러한 결과는 또한 AUC의 감소와 동반되었다 (도 6e, 6g). 인슐린 저항성을 나타내는 HOMA-IR 인덱스는 MSL 화합물이 투여된 마우스에서 대조군과 비교하여 감소하였다 (도 6j). MSL 화합물의 8주간 투여 후 개선된 대사 프로파일은 leupeptin 투여 후 측정된 간에서의 증가된 자가포식 활성이 동반되었다 (도 7a). 주목할 만한 것은, 유전자 분석결과 TFEB 조절된 유전자 발현이 MSL 화합물이 투여된 마우스에서 대조군과 비교하여 유의적으로 높은 것으로 나타났다 (도 7b). 이러한 결과는 인비트로에서 MSL 화합물 처리된 세포에서 TFEB의 핵으로의 전위 결과와 일치하는 것이다.

이어 지질과 연관된 지방간의 개선을 시험하였다. MSL 화합물로 8주간 처리 결과 ob/ob 마우스의 간에서 지질 비말의 축적이 명백하게 감소한 것으로 나타났다 (도 8a). Oil Red O 염색을 통해 MSL 화합물이 8주간 투여된 ob/ob 마우스에서 대조군 마우스와 비교하여 지질 함량이 줄어든 것을 확인하였다 (결과는 나타내지 않음). 혈청 ALT/ASL 농도 또한 MSL 화합물이 8주간 투여된 마우스에서 유의적으로 감소하였다. 또한 이러한 마우스에서 인슐린 저항성에서 중요한 역할을 하는 대사 염증의 변화를 조사한 결과, MSL 화합물이 8주간 투여된 마우스의 WAT에서, 대상 염증의 심각성을 나타내는 죽은 지방세포 주위의 대식세포 응집체인 CLS (crown-like structures)의 수가 대조군과 비교하여 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (도 8d, 8e). 이러한 결과는 MSL 화합물에 의해 대상 염증이 개선될 수 있음을 나타내는 것이다. 실시간 RT-PCR 결과 TNF-알파, IL-6, IL-1베타 및 F4/80와 같은 염증 마커의 발현이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다 (도 8f). 이러한 결과는 비만 마우스에서 MSL 화합물에 의해 대사 염증이 감소하였음을 나타내는 것이다.

또한 MSL 화합물을 화학적으로 개질하여 효능 및 약물화(druggability) 측면에서 개선된 유도체를 개발하였다. 이 중 MSL-7 화합물(화학식 2의 화합물)이 도 10a에 나타난 바와 같이 뚜렷한 자가포식 향상 활성을 나타냈으며, 세포독성 또는 mTOR 억제는 없는 것으로 나타났다 (도 10b). MSL-7 화합물은 또한 TFEB의 핵전위 활성을 나타냈다 (도 10c). ob/ob 마우스에게 투여시 체중에 유의한 영향을 미치지 않으면서 비공복 혈당을 개선시키는 것으로 나타났다 (도 11a, 11b). IPGTT 및 ITT 결과 당내성 및 인슐린 민감성도 개선된 것으로 나타났다 (도 11c, 11d).

마지막으로 MSL 화합물 및 MSL-7 화합물의 전신 독성여부를 시험한 결과, 이들 물질에 의한 CBC의 변화는 없는 것으로 관찰되었다 (표 1). 심장, 신장, 근육, 이자, 폐 및 췌장을 포함하는 주요 장기의 생검 결과 조직학적 측면에서 유의한 변화가 없었으며 (도 14), 이는 이러한 장기에 본원에 따른 화합물이 독성을 없음을 나타낸다.

실시예 7. 본원에 따른 자가포식 향상제에 의한 비만 마우스의 대사 프로파일이 향상 효과

다음으로 ob/ob 마우스보다 더 생리학적인 식이-유도 비만 모델을 적용하였다. 8주 동안 MSL을 투여하면 고지방식이(HFD)를 먹인 마우스에서 비금식(nonfasting) 혈당 및 당 불내성이 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 IPGTT 동안 특정 부분을 제외한 배부분의 비교에서 통계적 유의점은 나타나지 않았다. 따라서 MSL이 마이크로좀 안정성이 낮기 때문에(인간 간 마이크로좀과 배양시 30분 후에 10% 이하만 남음), 더욱 효율적이고 의약품이 될만한 화합물을 만들기 위하여 MSL을 화학적으로 변형시켰다. 여러 유도체 중에서, 본원에서는 마이크로좀 안정성이 향상된(30분 후 90.5%가 남아있음) 화합물(MSL-7)을 선택하였다. 본원에서는 MSL-7이 인비트로에서 세포독성 활성을 가지지 않으면서 오토파고라이소좀을 형성하여 TFEB와 핵 내 이동을 유도한다는 것을 확인하였다(도 12a 및 도 10c). ob/ob 마우스에게 투여하였을 때에, MSL-7은 체중변화 없이 비금식 혈당 레벨을 상당히 감소시켰다(도 12d, c). IPGTT 및 ITT는, AUC가 감소되면서, 각각 혈당 불내성 및 인슐린 민감성을 상당히 향상시키는 것으로 입증되었다(도 12d-g). 이는 화학적으로 변형된 자가포식 향상제가 ob/ob 마우스 뿐만 아니라 식이-유도 비만을 가진 마우스의 당 프로파일을 향상시킬 수 있다는 것을 의미한다. MSL-7은 야윈 또는 차우를 먹인 마우스의 당 프로파일에는 영향을 미치지 않았다.

실시예 8. 본원에 따른 MSL -7에 의한 hIAPP + 마우스의 β-세포 기능 및 대사 프로파일 개선 효과

인간 및 뮤린 당뇨는, 당뇨가 있는 인간의 >90%에서 췌장소도 아밀로이드 축적되지만 뮤린 당뇨에서는 그렇지 않는 것에서 서로 다른데, 이는 췌장소도-관련 폴리펩타이드(IAPP)의 아미노산서열의 차이점에 기인한다(Westermark et al. (2011)Islet amyloid polypeptide, islet amyloid, and diabetes mellitus. Physiol Rev. Jul;91(3):795-826). 본원에서는, 자가포식에 의해 조절되는 독성 인간-타입 IAPP(hIAPP) 올리고머의 축적에 대한 본원의 자가포식 향상제의 효과를 조사하였다. 그 결과 MSL 및 MSL-7 둘다, 아밀로이드생성 prepro-hIAPP와 트랜스펙션한 후에 INS-1 인슐린종(insulinoma) 세포에서 pro-hIPP 이합체의 축적을 감소시켰고, MSL-7의 효과가 더 커진것으로 나타났다(도 13a). MSL-7 처리에 의한 pro-hIAPP 축적 감소가, pro-hIAPP 이합체의 회복 및 pro-hIAPP 삼합체 출현에 의해 나타난 바와 같이, 바필로마이신에 의해 없어졌는데(도 13b), 이는 MSL-7이 가자포식 활성을 향상시킴으로써 pro-hIAPP 이합체 축적을 감소시킨다는 것을 의미한다. 본원에서는 hIAPP 올리고머 축적에 기인한 세포 사멸을 연구하였을 때(Kim et al., 2014, ibid), MSL-7 처리에 의해 3-MA 존재시의 prepro-hIAPP트랜스펙션 후의 세포사멸을 상당히 감소시켰는데(도 13c), 이는 MSL-7에 의한 hIAPP 올리고머 제거에 기인하는 것일 수 있다. MSL-7 투여에 의해 또한, HFD에 의한 당뇨를 유발하는 췌장 β-세포에서 hIAPP를 발현하는 트랜스제닉 마우스(hIAPP+마우스)의 비금식 혈당 레벨을 상당히 감소시켰다(도 13d). 당 불내성 및, hIAPP+마우스의 HFD 섭취후의 β-세포 기능이상을 나타내는 감소된 인슐린생성 지표 또한 8주간 MSL-7 투여에 의해 상당히 향상되었는데(도 13e, f), 이는 인간-타입 당뇨에 대한 자가포식 향상제의 인비보 효과를 입증하는 것이다. 본원에서는 hIAPP 올리고머를 인식하는 A11 항체를 사용하여 면역형광 염색을 수행하였다. HFD에 의해 촉진되는 hIAPP+ 마우스 췌장소도에의 hIAPP 올리고머 축적이 8주간 MSL-7 투여에 의해 상당히 감소되었는데, 이는 본원에 따른 MSL-7에 의해 hIAPP 올리고머 클리어런스가 향상된다는 것을 의미한다. HFD-식이 hIAPP+ 마우스에서의 EE-1-플로오로-2,5-비스(3-하이드록시카르보닐-4-하이드록시)스티릴벤젠(FSB)-염색 췌장소도 아밀로이드가 8주간 MSL-7 투여에 의해 유사하게 감소되었는데(도 13h), 이는 췌장 소도에의 아밀로이드 축적에 대한 MSL-7 효과를 입증하는 것이다.

최종적으로 본원에서는 자가포식 향상제의 독성에 대해 시험하였다. 8주간 MSL 또는 MSL-7 투여는, 대사 프로파일을 향상시키고 간 효소 레벨을 감소시키는 것(하기 표 1)을 제외하고는, ob/ob 마우스의 헤모그램 또는 혈액 화학에 영향을 미치지 않았다. 주요 장기의 생검사(biopsy)에서 지방간 변화가 향상된 갓을 제외하고 아무런 부작용이 나타나지 않았는데(도 14), 이는 MSL 또는 MSL-7에 유의한 독성이 없으며 잠재적으로 약효성(druggability)을 가짐을 뒷받침하는 것이다.

[표 1]

상기 표 1은 8주간 자가포식 향상제를 인비보 투여한 후의 헤모그램 및 혈액화학을 나타낸 것이다. 간 효소 및 TG의 혈청 레벨이 감소되거나 대사 프로파일이 향상된 것을 제외하고는, 헤모그램(윗쪽) 또는 혈액화학(아래쪽)에 아무런 부정적인 변화가 나타나지 않았다. 따라서, MSL을 투여한 마우스에 비하여 MSL-7을 투여한 마우스에서 혈청 TG 및 LDH 레벨이 상당히 낮았다 (WBC, while blood cell; NEU, neutrophil; LYM, lymphocyte; MONO, monocyte; EOS, eosinophil; BASO, basophil; RBC, red blood cell; HGB, hemoglobin; HCT, hematocrit; PLT, platelet; TG, triglyceride; TCHO, total cholesterol; ALP, alkaline phosphatase; ALB, albumin; DBIL, direct bilirubin; GGT, g-glutamyltransferase; LDH, lactate dehydrogenase; CRE, creatinine; CPK, creatine phosphokinase; CA, Ca2+;BUN,bloodureanitrogen).

종합하면, 2형 당뇨병의 주요한 두 가지 인자는 인슐린 저항성과 베타 세포 기능 부전이다. 그러나 이러한 현상에 이르는 분자 및 세포 수준에서의 병인은 규명되지 않았다. 과량의 지질 축적, 케모카인 및 사이토카인의 유도로 인한 낮은 등급의 조직 염증, NF-kB 활성 및 JNK 활성이 중요한 분자 기전이다 (Vandanmagsar, 2011, ibid). 소기관 수준에서 ER 및 미토콘드리아의 기능부전 및 스트레스도 당뇨병의 주요 인자로 알려져 있으며 (Ozcan et al.(2004) Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 Diabetes. Science 306, 457-461), 이는 상술한 분자 기전의 상위 또는 하위 수준에서 영향을 미칠 수 있다. 자가포식 활성이 노화 또는 지방과다 상태에서 감소되기 때문에 자가포식의 결핍은 ER 및 미토콘드리아의 기능부전으로 이어질 수 있다. 또한 자가포식 결핍은 비만 또는 노화와 연관된 대사 증후군 및 당뇨병의 기저 원인이 될 수 있다. 반면 자가포식 활성의 유도는 대사성질환 또는 당뇨병의 새로운 치료 접근방법이 될 수 있고, 이는 자가포식이 기저 결함으로 인한 비정상적 분자 또는 세포적 과정이라기 보다는 당뇨병 병인을 이루는 기저 결함이라는 종전의 생각과는 상이한 것이다.

기존에 자가포식과 질환의 발생과의 연관성은 주로 암, 신경퇴행성질환, 및 감염성 질환 분야에서 연구되어 왔으며, 대사성 질환에서의 역할을 보고된 바가 없으며, 본원에 개시된 사항은 자가포식의 조절을 통해 대사성 질환의 치료가 가능하다는 것을 나타낸다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   ; 또는
   [화학식 2]
   

   

   
   (상기 화학식 2에서, R은 F, Cl, 또는 Br).
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 대사성 질환은 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 고지질혈증, 비만 또는 염증 중 하나 이상의 증상을 포함하는 것인, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 세포에 처리하는 단계를 포함하며, 상기 처리에 의해 상기 세포는 mTOR(mechanistic target of rapamycin)를 억제하지 않으면서 TFEB(Transcription Factor EB)의 핵으로의 이동을 유발하는 것인, 인비트로 또는 인간을 제외한 동물에서 세포의 자가포식 활성 방법:
   [화학식 1]
   

   

   ; 또는
   [화학식 2]
   

   

   
   (상기 화학식 2에서, R은 F, Cl, 또는 Br).
   
4. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 세포에 처리하는 단계를 포함하며, 상기 처리에 의해 상기 세포의 자가포식이 활성화되고, 상기 자가포식에 의해 상기 세포의 지방이 감소 또는 제거되는 것인, 인비트로 또는 인간을 제외한 동물에서 세포의 지방제거 방법:
   [화학식 1]
   

   

   ; 또는
   [화학식 2]
   

   

   
   (상기 화학식 2에서, R은 F, Cl, 또는 Br).
   
5. 제 1 항에 따른 화합물을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 하기 화학식 2의 화합물:
   [화학식 2]
   

   

   
   (상기 화학식 2에서, R은 F, Cl, 또는 Br).
   
7. 제 6 항에 따른 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 대사성 질환은 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병, 고지질혈증, 비만 또는 염증 중 하나 이상의 증상을 포함하는 것인, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 대사성 질환 예방 또는 치료제 스크리닝 방법으로,
   진핵세포를 제공하는 단계;
   상기 진핵세포에 대사성 스트레스를 가하는 단계;
   상기 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
   상기 시험물질로 처리된 세포에서 칼시뉴린, TFEB (Transcription Factor EB) 및 자가포식 활성을 측정하는 단계; 및
   상기 측정 결과, 상기 시험물질로 처리되지 않은 경우와 비교하여, 상기 처리된 세포에서 상기 칼시뉴린, TFEB 및 자가포식 활성이 향상된 경우, 상기 시험물질을 대사성 질환 예방 또는 치료제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 대사성 질환 예방 또는 치료제 스크리닝 방법.

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