KR20040084482A

KR20040084482A - 탄시논 ⅰ을 유효성분으로 함유하는 간섬유증 또는간경화증 치료제 조성물

Info

Publication number: KR20040084482A
Application number: KR1020030019599A
Authority: KR
Inventors: 손동환
Original assignee: 학교법인 원광학원
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2004-10-06

Abstract

본 발명은 탄시논 Ⅰ(tanshinone Ⅰ)을 유효성분으로 함유하는 간섬유증 (hepatic fibrosis) 또는 간경화증 치료제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은, 1) 간조직에서의 콜라겐 발현을 억제하고, 콜라겐을 생성하는 간성상세포의 고사를 촉진함으로써, 간섬유증 및 간경화증의 특징적 소견인 콜라겐의 과다축적을 저지하며; 2) 간섬유증 및 간경화증 환자에게서 간세포기능 또는 간기능의 손상을 억제함으로써, 만성적인 간손상에 의한 간기능 저하로 유발되는 간기능 수치의 감소를 정상수준으로 회복시킬 수 있는 간섬유증 및 간경화증 치료제 조성물에 관한 것이다.

Description

탄시논 Ⅰ을 유효성분으로 함유하는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물{A composition for treating hepatic fibrosis or cirrhosis containing tanshinone Ⅰ}

본 발명은 탄시논 Ⅰ(tanshinone Ⅰ)을 유효성분으로 함유하는 간섬유증(hepatic fibrosis) 및 간경화증 치료제 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 1) 간조직에서의 콜라겐 발현을 억제하고, 콜라겐을 생성하는간성상세포의 고사를 촉진함으로써, 간섬유증 및 간경화증의 특징적 소견인 콜라겐의 과다축적을 저지하며; 2) 간섬유증 및 간경화증에서 간세포기능 또는 간기능의 손상을 억제함으로써, 만성적인 간손상에 의한 간기능 저하로 유발되는 혈중 간기능 수치의 감소를 정상수준으로 회복시킬 수 있는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물에 관한 것이다.

간섬유증은 만성염증상태에 있는 간조직이 손상과 재생을 반복하여, 조직 중에 콜라겐 등과 같은 결합조직이 과도하게 축적됨으로써, 간조직에 흉터(scar)가 생기는 질환을 의미한다.

일반적으로 간섬유증은 간경변과는 달리 가역적(reversible)이고, 얇은 원섬유(thin fibril)로 구성되며, 결절(nodule) 형성이 없다. 또한, 간손상의 원인이 소실되면 정상회복이 가능할 수 있다. 그러나, 이러한 간섬유증 기작이 반복적으로 지속되면, 결합조직간의 교차결합(crosslinking)이 증가하여 두꺼운 원섬유(thick fibril)가 축적되며, 간소엽의 정상구조를 상실하여 결절을 형성하는 것을 특징으로 하는 비가역적인(irreversible) 간경변으로 진행된다.

간질환은 그 원인이 다양하지만, 만성화될 경우 결국 그 원인과는 상관없이 공통적으로 간섬유증 내지 간경변에 이르게 된다. 간질환은 초기 자각증세가 없어 조기진단이 어렵고, 일반적으로 만성에 이르러서야 발견되기 때문에, 그 치료가 쉽지 않고, 사망률이 높아 사회적인 문제를 야기하고 있다. 또한, 효능이 우수한 치료제가 아직 개발되지 않은 상태이다.

당업계에서 간섬유증의 발병 기작은 세포, 사이토카인(cytokine) 및 결합조직(extracellular matrix, ECM)간의 복잡한 상호작용에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 간섬유화시 ECM의 과다생성은 술, 바이러스, 약물, 자가면역 등의지속적인 자극에 의한 만성적인 염증반응에 의해 간내 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)의 활성화가 촉진되고, 활성화된 간성상세포에서 결합조직의 생성이 증가됨으로써 야기되는 것으로 알려져 있다.

활성화된 간성상세포에 의해 분비되는 4형 콜라겐나아제(collagenase type Ⅳ)와 증가된 콜라겐 생산에 의해 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)의 정상구성비율이 깨지면서 기저막 ECM(basement membrane-like matrix, 예를 들어 4형 콜라겐)은 분해되고, 세포간 ECM(interstitial type matrix, 예를 들어 1형 및 3형 콜라겐)은 서로 꼬여 소섬유상 콜라겐(fibril-forming collagen)을 형성한 후 딧세강(space of Disse)에 축적된다. 딧세강에 축적된 세포간 ECM에 의해 혈액과 간세포간의 물질교환이 저해됨으로써, 간세포는 영양물질의 공급 및 독성물질의 배출이 어렵게 되고, 간세포 역시 지속적으로 손상된다. 이러한 일련의 반응이 반복되면서 간조직 중에 결합조직이 축적되고 간섬유화 내지 간경화가 유발된다.

현재 간섬유증에 대한 연구는 ECM에 대한 연구, 이에 관여하는 세포와 각종 세포간의 관계, 세포의 활성화 기전, 각종 사이토카인 및 항섬유화제(antifibrogenic agents)에 대한 연구 등 여러가지 방면으로 활발히 진행되고 있으며, 간섬유증의 조기 진단방법 및 치료제 개발을 목표로 하고 있다. 특히, 과다 축적된 결합조직의 생산을 수반하는 간섬유화 및 간경화의 가장 큰 유발원인이 간성상세포의 활성화인 것이 밝혀지면서, 현재 활성화된 간성상세포의 조절또는 고사시킬 수 있는 약물 개발에 대한 연구가 지속되고 있다. 이러한 치료 개념은 실험동물에서 담도결찰 등과 같은 간독성 물질로 유도된 간섬유화가 간독성 물질의 제거에 의한 회복과정에서 활성화된 간성상세포의 고사가 발견된 이후 활용되고 있다. 즉 ECM의 분비를 조절하기보다는, 과다하게 분비하고 있는 활성화된 간성상세포를 제거함으로써 더 효율적인 치료가 이루어질 수 있다( Gressner, A. M.Cell. Tissue. Res., 292, 447, 1998; Cals, P.Biomed & Pharmacother., 52, 259, 1998; Iredale, J. P.et al.,J. Clin. Invest., 102, 538, 1998).

이러한 연구결과로서, 페니실라민, 16,16-디메틸 프로스티글라딘 E2, 비페닐 디메틸 디카르복실산, 콜키친, 글루코코티코이드, 말로틸산(malotilate), 감마-인터페론, 펜톡시필린(pentoxifylline), 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸)아미드 등이 간섬유증 또는 간경화증을 억제하는 물질로 개발되었다. 그러나, 임상에 적용한 결과 그 작용이 미약하거나 심한 부작용을 수반하는 것으로 나타났다. 따라서, 현재로서는 임상에 사용되고 있는 간섬유증 및 간경화 치료제는 없다고 말할 수 있다(Bokeret al.,J. Hepatol., 13, s35, 1991; Tamayoet al.,ibid, 3, 112, 1983; Jenkinset al.,ibid,1, 489, 1985; Kershenobichet al.,ibid, 7, 1104, 1987; Svegliatiet al., 18 209A, 1993; Guzelianet al.,Gastro., 86, 897, 1984; Ala-Kokkoet al.,J. Lab. Clin. Med., 113, 177, 1989).

이에, 본 발명자는 간섬유증 또는 간경화증의 치료에 보다 효과적으로 이용될 수 있는 물질을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 탄시논 Ⅰ(tanshinone Ⅰ) 함유 조성물이 간조직내 콜라겐의 생성을 억제하고, 활성화된 간성상세포를 고사시켜, 간섬유증 또는 간경화증 치료에 이용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은, 담도결찰에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 실험동물모델로부터 추출한 간 조직에 대하여, 탄시논 Ⅰ이 콜라겐의 생성을 억제함을 마송 트리크롬 (Masson trichrome) 염색법에 의해 보여준 도면이다.

도 2는, DNA 단편화 측정에서 탄시논 Ⅰ 처리를 거친 활성화된 간성상세포의 DNA가 농도 의존적으로 단편화되었음을 보여주는 도면이다.

도 3은, 간성상세포에서 탄시논 Ⅰ의 처리시간이 경과함에 따라 불활성화 캐스파아제-3 밴드(CPP 32로 표시)에 대해 활성화 캐스파아제-3 밴드(active CPP 32로 표시)가 증가됨을 단백질 수준에서 보여주는 도면이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 치료제 조성물은 간섬유증 또는 간경화로 진단된 환자의 치료에 이용될 수 있는 물질로서 탄시논 Ⅰ(tanshinone Ⅰ)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

탄시논 Ⅰ은 단삼(살비아 밀티오리자번지:Salvia miltiorrhizaBge)으로부터 분리된 디테르펜 퀴논(diterpene quinone)계에 속하는 성분으로, "1,6-디메틸-페난트로[1,2-b]푸란-10,1-디온(1,6-Dimethyl-phenanthro[1,2-b]furan-10,1- dione)"이라는 화학명을 갖고 있으며, 다음의 구조식을 갖는다.

지금까지 대부분의 탄시논계 화합물들이 항균작용, 항돌연변이작용, 항산화작용, 항염작용, 혈소판응고억제작용을 가지고 있다고 보고되었다(Wanget al.,Planta Medica55, 390, 1989; Satoet al.,Mutat Res265, 149, 1992; Caoet al.,Free Radical Biol Med20, 801, 1996). 또한, 이 화합물들이 인간 암세포주에서 항암작용과 증식억제작용이 있는 것으로 보고되었다(Wuet al., Am J Chin Med19, 207, 1991; Ryuet al.,Planta Medica63, 339, 1997).

본 발명에 의하면, 상기한 탄시논 Ⅰ은 간조직에서의 콜라겐 발현을 억제함으로써 간조직 내에 콜라겐이 과다축적되는 것을 억제할 수 있음이 확인되었다. 또한, 탄시논 Ⅰ은 활성화된 간성상세포의 고사를 촉진함으로써 간조직에서 과도하게 증가되는 콜라겐 및 결합조직(connective tissue)의 생성을 억제할 수 있으며, 나아가 만성적인 간손상에 의해 감소된 간기능 수치를 정상수준으로 회복시킴으로써 간세포기능 또는 간기능의 정상화를 이끌어낼 수 있다. 따라서, 탄시논 Ⅰ을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 간섬유증 발현 및 간섬유증의 간경화증으로의 발전을 막아 이들의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명에서 유효성분으로 하고 있는 탄시논 Ⅰ은, 당업계에 통상적인 방법들을 이용하여 분리 정제한 것이거나 상용 시판되는 것을 사용할 수 있다.

예를 들면, 용매 추출 정제한 것으로, 단삼을 메탄올로 가열추출하고 여과한 후 여액을 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻는 과정; 메탄올추출물을 증류수에 현탁시킨후 부탄올로 분배하여 부탄올 가용부를 얻는 과정; 부탄올 가용부는 다시 순차적으로 유기용매를 사용하여 분배하여 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 가용부를 얻는 과정; 및 이중 디클로로메탄 가용부를 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 세파덱스 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분리하는 과정;을 거쳐 제조된 것을 사용할 수 있다. 또는, 상용 시판되는 것으로, 생리활성물질연구소(National Institute for The Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing, China)에서 공급하는 제품번호 0867-9902를 구입하여 사용할 수도 있다.

상기한 탄시논 Ⅰ 함유 조성물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 담즙성 간 섬유화에 의한 간경화 치료 및 예방용으로 효과적으로 이용될 수 있으며, 본 조성물에 포함되는 탄시논 Ⅰ 함유 조성물의 유효량은 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환의 정도 등에 따라 광범위한 범위 내에서 결정될 수 있다. 일반적으로 1∼600㎎/㎏/일, 바람직하게는 1∼50㎎/㎏/일의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다.

탄시논 Ⅰ 함유 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약 형태나 드링크제, 의약품 내지는 건강보조식품의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여 경로를 통해 간 섬유화에 의한 간경화의 예방 및 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여 제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예들을 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해서 용이하게 실시될 수 있는 삽입, 삭제 및 수정 등의 변형 등도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

또한, 본 발명에서는 담도결찰에 의해 유도된 간섬유증과 간경화 실험동물 모델 및 간성상세포 실험을 통해서 탄시논 Ⅰ의 이들 질환에 대한 치료효과를 보여주었지만, 본 발명은 담도결찰에 의해 유도되는 간섬유증 또는 간경화증 실험동물 모델뿐만이 아니라 실제 임상현장에서 간섬유증이나 간경화 환자들에 대해서도 그 치료효과가 있다는 것은 당업자에 의해서 자명하게 인식될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 치료제의 적용범위는 담도결찰에 의해 유도된 간섬유증 및 간경화 실험동물모델에서 뿐만 아니라 임상현장 등의 그외 간섬유증이나 간경화 환자에게까지 적용하는 것도 포함한다.

[참고실시예 1] 실험동물 및 탄시논 Ⅰ의 처리

통상적으로 실험동물(이를 "간경화 동물"이라 칭한다)은 사염화탄소, 에탄올, 메토트렉세이트, 디메틸니트로사민에 실험동물을 노출시키거나 비타민 B₁₂를 결핍시켜 얻는데, 주로 사염화탄소로 처리한다. 그러나 이러한 간경화 동물은 임상에서의 간섬유화 및 간경화의 병리적인 소견과 차이가 많다. 이에 본 발명에서는 담도결찰 수술법을 채택하여 본 발명의 탄시논 Ⅰ 함유 조성물의 담즙성 간섬유화 억제 효과를 측정하였다. 실험용 간섬유증 및 간경화증 동물모델의 제조 및 그러한 동물에 사염화탄소 및/또는 탄시논 Ⅰ을 처리하는 방법은 다음과 같다.

우선, 체중 220∼250g의 웅성 흰쥐(대한 실험동물센터 충북 음성)를 1주간 실험실 환경에 적응시키고, 사료와 물을 충분히 공급하였다. 박은전 등의 방법 (박은전 등, 약학회지, 38, 338, 1994)으로 담도결찰 수술을 행한 간경화 동물군은 수술한 날부터 4주간 탄시논 Ⅰ 함유 조성물 투약군(1㎎/㎏/일)과 탄시논 Ⅰ 함유 조성물 투약군(5㎎/㎏/일)의 조성물을 생리식염수에 용해시켜 손데(sonde)로 경구투여하였고, 마취하고 개복한 후 생리식염수 2㎖을 주입하고 봉합하여 얻은 대조군에는 동량의 생리식염수를 경구투여하였다.

각 군과 실험동물의 수를 소개한다.

1군 (n=5) 정상군 생리식염수 투약군

2군 (n=4) 탄시논 Ⅰ 함유 조성물 투약군(1㎎/㎏/일, p.o.)

3군 (n=4) 탄시논 Ⅰ 함유 조성물 투약군(5㎎/㎏/일, p.o.)

4군 (n=8) 담도결찰에 의한 간 섬유화 유발군

5군 (n=8) 담도결찰 의한 간 섬유화 유발 후 본 발명의 탄시논 Ⅰ 함유 조성물 투약군(1㎎/㎏/일, p.o.)

6군 (n=8) 담도결찰 의한 간 섬유화 유발 후 본 발명의 탄시논 Ⅰ 함유 조성물 투약군(5㎎/㎏/일, p.o.)

1군과 4군은 대응량의 생리식염수를, 다른 군은 각각의 약물을 손데(sonde)를 이용하여 경구투여하였다.

4주간 경과 후, 각 군의 흰쥐를 마취한 다음, 심장천자(cardiopuncture)하여 혈액을 채취하고 상온에서 1시간 이상 방치한 뒤 원심분리하여 혈청을 얻었다. 또한, 상기 심장천자와 동시에, 간을 즉시에 적출하여 간 좌엽의 일부를 10% 포르말린에 넣어 두었다. 상기에서 분리된 각 군의 혈청 및 10% 포르말린에 넣어둔 간조직은 하기의 실험을 수행하기 위해서 영하 20℃에서 보관하였다.

[참고실시예 2] 간성상세포 분리배양 및 탄시논 Ⅰ 처리

간섬유증 간에서 결합조직이 과다하게 축적되는 데에 있어서, 간성상세포는 결정적인 역할을 하며, 정상간에서는 약 7%의 비율로 존재한다.

간성상세포는 흰쥐로부터 프리에드만(Friedman) 등의 방법을 수정하여 분리하였다. 간단히 설명하면, 흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여, 5% CO₂및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca²⁺, Mg²⁺이 없는 행크의 균형염 용액(Ca²⁺, Mg²⁺-free Hank's balaced salt solution)을 관에 흘려보내 간내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라겐나아제(collagenase type Ⅳ) 및 1mM CaCl₂용액을 흘려보냈다.

간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음, 간세포현탁액을 만들어 50×g(480rpm)에서 2분간 원심분리한 후, 침전된 간세포를 제거한다. 간세포가 제거된 상청액을 11.5% 및 17% 메트리자마이드(metrizamide, Sigma)층 위에 쌓고, 1,700×g (2640rpm)에서 15분간 원심분리하여, 간성상세포층을 얻는다. 이 간성상세포층을 행크의 균형염 용액으로 세척한 다음, 코팅되지 않은 배양용기에 10%(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 50U/㎖의 페니실린 및 50㎍/㎖의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(William's Medium E; WME, GibcoBRL, 미국)를 배양액으로 하여, 세포수가 5×10⁵ 세포수/㎖ 되도록한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 5일동안 배양한 후, 배양액을 10% 대신 0.5%의 FBS가 첨가된 배양액으로 바꿔 1일간 배양시킨 다음, 탄시논 Ⅰ을 처리하였다. 탄시논 Ⅰ은 0.5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖로 1일 또는 2일간 처리하였다.

[실시예 1] 탄시논 Ⅰ의 간조직 내 콜라겐의 생성 억제효과

콜라겐은 간의 결합조직을 구성하는 중요한 성분이다. 그러나, 상기에서 설명한 바와 같이, 간섬유증이 유발되거나 간섬유증이 간경화로 진행될 때, 간 조직에는 과도하게 많은 양의 콜라겐이 축적된다. 따라서, 종래에는 간조직에서 콜라겐의 양을 측정함으로써, 간섬유증의 유발 또는 간경화의 발병 가능성에 대해서 진단하여 왔다.

따라서, 본 실시예에서는, 담도결찰 및/또는 탄시논 Ⅰ을 처리한 간조직에서콜라겐 양을 측정함으로써, 탄시논 Ⅰ의 간섬유화 억제작용에 대하여 검사하였다.

본 실시예에서 콜라겐의 양은 다음의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 콜라겐에서 특이적으로 나타나고 콜라겐의 약 10%를 차지하고 있는 아미노산 성분으로 히드록시프롤린의 양을 정량함으로써 간조직에서 발현되는 콜라겐의 양을 측정하였다(Schuppan,J. Hepatol., 13, s17, 1991). 히드록시프롤린은 자말 등의 방법 (Jamallet al.,Anal. Biochem., 112, 70, 1981)에 따라 정량하였다.

즉, 상기 참고실시예 1에서와 같이 탄시논 Ⅰ 및 담도결찰을 처리한 각 군의 간조직 0.2g을 6N 염산 6㎖로 균질화한 다음, 5% 간 균질액을 110℃에서 가수분해하여 여과하였다. 여액 50㎕를 취하여 80℃에서 감압하에 증발건조한 다음, 50% 이소프로판올액 1.2㎖에 용해시키고, 클로라민-T(Sigma사 제품) 200㎕로 산화시켰다. 그런 다음, 에를리히 반응액 0.1㎖로 발색시켜, 558㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

하기 표 1에서 보는 바와 같이, 탄시논 Ⅰ은 담도결찰에 의해 증가된 간조직 중의 히드록시프롤린의 양, 즉 콜라겐의 양을 줄일 수 있음이 확인되었다. 즉, 이러한 결과는, 탄시논 Ⅰ 함유 조성물이 간섬유증 또는 간경화의 치료에 이용될 수 있다는 것을 보여준다.

[실시예 2] 탄시논 Ⅰ의 혈중 간기능에 대한 회복효과

ALT, AST 및 ALP는 간기능의 지표로 간세포 손상시 혈중농도가 증가되는 특징이 있다.

ALT, AST 및 ALP는 아크레이 제조사(ARKRAY FACTORY, 일본)의 키트를 이용하여, 스포트켐 자동분석기 Ⅱ(Spotchem-SP4410, 일본)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.

담도결찰로 유발된 흰쥐에 탄시논 Ⅰ 함유 조성물을 투여하고, 혈청중 ALT(알라닌 트랜스아미나제; Alanine transaminase), AST(아스파르테이트 트랜스아미나제; Aspartate transaminase), ALP(알칼린 포스파타제)의 양을 측정하였다.

하기 표 1에서 보는 바와 같이, 탄시논 Ⅰ은 담도결찰로 유도된 담즙성 간 섬유화 동물모델에 대해서 ALT, AST, ALP를 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는, 탄시논 Ⅰ이 간섬유증 또는 간경화에 의해 간세포기능 또는 간기능이 손상되는 것을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

군번호	히드록시프롤린(㎍/g)	ALT(IU/L)	AST(IU/L)	ALP(IU/L)
1	279±41	47±6	84±18	599±102
2	287±36	34±15	86±12	605±109
3	278±32	32±12	81±17	588±103
4	1177±186^a	155±12^a	668±92^a	1345±162^a
5	889±121^b	103±15^b	476±94^b	878±109^b
6	719±107^b	92±19^b	442±85^b	833±121^b
^aP< 0.001, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임^bP< 0.001, 4군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

<결과>

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 담도결찰 처리시 증가된 콜라겐, 즉 히드록시프롤린의 양은 탄시논 Ⅰ에 의해 용량 의존적으로 30%(5군), 46%(6군) 감소되어, 탄시논 Ⅰ은 간섬유화를 억제할 수 있는 물질로서 확인되었다. 한편, 히드록시프롤린의 수치에 있어서, 2군 및 3군의 결과는 1군에 비해 통계학적 유의적인 차이가 보여지지 않았고, 이러한 결과로부터 탄시논 Ⅰ 자체는 간기능에 어떠한 부작용도 유발하지 않는다는 것을 의미한다.

[실시예 3] 간 조직의 마송 트리크롬 (Masson trichrome) 염색

참고실시예 1 에서 담도결찰로 유도된 간 섬유화 간 조직을 탈파라핀하고, 함수, 증류수로 수세한 다음 포르말린에 고정된 절편은 브앙(Bouin)액에 옮겨 56∼60℃에서 1시간 매염하고 50∼70% 에틸 알코올에 옮겨 피크로산을 제거한 다음 수도물로 수세하여 웨이거트 철 헤마톡신(Weigert iron heatoxylin)액에 10분, 베브리흐 스칼렛산 후치신(Biebrich scarlet-acid fuchsin)액에 10분간 증류수로 헹군 다음, 포스포몰리브딕-포스포텅스텐산 (phosphomolybdic- phosphotungstic acid) 액에 15분, 아닐린 블루(aniline blue)액에 2∼5분, 1% 아세트산 수용액에 3∼5분 염색한 후 탈수, 투명, 봉입한다.

도 1에서 보는 바와 같이, 1군의 간 조직(도 1a)은 혈관 평활근 세포(smooth muscle cell)와 그 주변의 세포 일부에서만 콜라겐이 염색되어 있지만, 담도결찰 군(4군)의 간 조직(도 1b)에서는 섬유화된 격막을 따라 상당한 부분에서 콜라겐이 검출되어 있다.

한편, 담도결찰과 함께 탄시논을 각각 1, 5㎎/㎏/일 투여한 군(각각 5군 및 6군)의 간 조직(도 1c 및 도 1d)에서는 콜라겐이 도 1B에 비해 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 즉, 도 1의 결과로부터, 탄시논이 간섬유증 및 간경화의 발전에중요한 역할을 하고 있는 콜라겐 생성을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 이들 실험의 결과로부터, 탄시논이 정상군의 쥐에서는 간독성을 유발하지 않았고, 담도결찰에 의하여 유도된 간섬유증 또는 간경화증 간을 보호하고, 동시에 간섬유화를 억제할 수 있는 것을 확인하였다.

[실시예 4] 활성화된 간성상세포에 대한 탄시논 Ⅰ의 고사효과

간성상세포는 간염바이러스, 알콜, 자가면역, 약물 등에 의해 간이 지속적으로 염증을 받게 되면 활성화, 증식된다. 활성화된 간성상세포는 콜라겐을 과다분비 축적하여 간섬유증 및 간경화를 일으킨다. 치료를 위해 콜라겐 분비를 조절하기도 하지만, 보다 근본적으로는 활성화 및 증식된 간성상세포를 고사시켜 제거하는 것이 간경화의 치료에 더 효과적인 방법으로 당업계에 공지되어 있다.

본 실시예에서는 탄시논 Ⅰ이 간성상세포에 대한 고사작용을 DNA 단편화 및 캐스파아제-3(caspase-3) 활성화를 측정하는 방법을 이용하여 확인하고자 하였다.

DNA 단편화를 측정하기 위하여 2×10⁶세포/디쉬로 세포를 배양했다. 0.5, 5, 10, 25μＭ의 탄시논 Ⅰ이 포함된 윌리엄스 미디움 E(William's Medium E)로 24시간 처리를 했다. 약물처리를 마친 간성상세포를 DNA 분리정제용 키트(프로메가, 미국)를 이용하여 DNA를 분리 정제하였다. 다음 0.1㎍/㎖ 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)가 포함된 1.2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 한다. 그리고 자외선 램프 아래서 DNA 단편화를 관찰했다.

DNA 단편화 측정에서 탄시논 Ⅰ 처리를 거친 활성화된 간성상세포의 DNA가 농도 의존적으로 단편화되었음을 도 2에서와 같이 명확한 밴드로 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 탄시논 Ⅰ은 활성화된 간성상세포에 대해 고사작용이 있음을 확인할 수 있었다.

약물 처리 시간에 따른 고사작용을 알아보기 위해 DNA 단편화가 충분히 일어나는 10μＭ의 탄시논을 간성상세포에 처리시 캐스파아제-3의 활성 변화를 측정하였다. 리파완충액(RIPA buffer; 50mmol/ℓ Tris-HCl pH 7.4; 1%(v/v) 트리톤 X-100(Triton X-100), 1mmol/ℓEDTA, 1mmol/ℓ류펩틴(leupeptin), 1mmol/ℓ페닐메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride))으로 현탁한 다음, 14,000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리하여, 상청액을 분리하였다. 세포용해액 중 단백질 농도는 Bio-Rad DC 단백질 검사 키트(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 측정하였다. 배양액 및 세포용해액로부터 분리한 단백질 50㎍을 각각 10%(w/v) SDS 겔(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel))에서 200Ｖ로 1시간동안 전기영동시켰다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량크기에 따라 분리되고, 이러한 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)(Millipore)에 30Ｖ로 16시간동안 트랜스퍼(transfer)시켰다. 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 200배 희석된 랫트 항-캐스파아제-3 1형 항체(rabbit anti-collagen type Ⅰ antibody; Calbiochem)를 1차 항체로 사용하여, 2시간동안 실온에서 반응시켰다. 2차 항체로서, 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-토끼 면역글로블린 G(horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG; Santacruz)를 2,000배 희석한 것을 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 발색은 강화된 화학발광 웨스턴 블랏 검출 시스템 키트(enhanced chemiluminescence (ECL) western blotting detection system kit; Amersham)를 이용하여, 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름(Agfa, EC)에 노출시켜 확인하였다.

캐스파아제-3 활성화 정도를 측정한 결과, 불활성화 캐스파아제-3 밴드(CPP 32로 표시)에 대해 활성화 캐스파아제-3 밴드(active CPP 32로 표시)가 도 3에서와 같이 생성되었고, 탄시논 Ⅰ의 처리시간이 지남에 따라 유의성 있게 활성화가 증가됨을 단백질 수준에서 확인할 수가 있었다. 이러한 시간 의존적인 결과는, 상기의 농도의존적인 DNA 단편화 실험결과와 함께, 탄시논 Ⅰ이 활성화된 간성상세포에 대해 고사작용이 있음을 증명하였다. 따라서, 탄시논 Ⅰ을 간섬유증 및 간경화를 치료하는데 이용할 수 있음을 세포실험 수준에서 확인할 수 있었다.

[실시예 5] 급성독성 시험

생쥐에 대하여 각 군당 10마리씩으로 실험군을 구성하여 경구투여 경로를 통하여 실시예 2의 탄시논 Ⅰ을 투여하고 7일간 관찰하여 최대허용량을 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2의 결과로부터, 경구 투여시에 최대허용량이 600㎎/㎏이상으로서 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 간보호 및 섬유화 억제 조성물은 생체에 대해 안전하게 투여될 수 있음을 알 수 있다.

	군당 마리수	투여량(㎎/㎏)	치사여부	최대허용량(㎎/㎏)
실험군	10	100	0/10	-
	10	200	0/10	-
	10	300	0/10	-
	10	600	0/10	600 이상
대조군	10	0	0/10

이상에서 살펴본 바와 같이, 단삼(Salvia miltiorrhizaBge)으로부터 분리된 탄시논 Ⅰ(tanshinone Ⅰ)은 간섬유증 또는 간경화증 간 조직에서 과다하게 축적되는 콜라겐을 감소시킬 있고; 간섬유증의 유도를 일으키는 증식 및 활성화된 간성상세포를 고사시키며; 간섬유증 또는 간경화증의 진행으로 인한 간손상 결과로 증가된 AST, ALT, ALP 수치를 정상수준으로 회복시킴으로써, 간세포의 정상화를 이끌어낼 수 있다. 따라서, 탄시논 Ⅰ을 함유한 본 발명의 조성물은 간섬유증 또는 간경화증의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims

탄시논 Ⅰ(tanshinone Ⅰ)을 유효량만큼 함유함을 특징으로 하는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 간섬유증 또는 간경화증은 담도결찰에 의해서 유발된 것임을 특징으로 하는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 탄시논 Ⅰ은 간 조직 내의 콜라겐 양을 감소시킴을 특징으로 하는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 탄시논 Ⅰ은 간성상세포 고사시킴을 특징으로 하는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 탄시논 Ⅰ은 만성염증에 의해 감염된 간 조직 및 간세포의 손상을 회복시킴을 특징으로 하는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 탄시논 Ⅰ이 1∼50㎎/㎏체중/일의 농도로 투여되도록 함유함을 특징으로 하는 간섬유증 또는 간경화증 치료제 조성물.