DE60213958T2

DE60213958T2 - Aryl-n-cyanoguanidine derivate und deren verwendung

Info

Publication number: DE60213958T2
Application number: DE60213958T
Authority: DE
Inventors: Soumitra San Diego GHOSH; R. Tomas San Diego SZABO
Original assignee: Migenix Corp
Current assignee: Migenix Corp
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-27
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2022-02-28
Also published as: US20050182057A1; WO2002068381A2; WO2002068381A3; ATE336237T1; JP2004525906A; US20080032981A1; DE60213958D1; US7230132B2; ES2271247T3; US6927218B2; US20040067987A1; CA2475454A1; US6562821B2; EP1377282B1; EP1377282A2; AU2002254124A1; US20030045556A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verbindungen und Verfahren zum Behandeln von Arthritis und verwandten Funktionsstörungen und zum Behandeln von Erkrankungen, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion in Zusammenhang stehen, und spezieller Aryl-N-cyanoguanidinverbindungen und Derivate davon.
Hintergrund der Erfindung
Zahlreiche chronische, schwächende Krankheiten des Skelettsystems bei Wirbeltieren einschließlich von Arthritis und verwandten arthritischen Funktionsstörungen zeichnen sich durch Degeneration von spezialisiertem, avaskulären Knorpelgewebe aus. Dieses Knorpelgewebe ist als Gelenkknorpel, der bestimmte, Knorpel produzierende Zellen, die Gelenkchondrozyten, enthält, bekannt. Im Gegensatz zu anderen Chondrozyten wie zum Beispiel den Chondrozyten der Wachstumszone in der Epiphyse, die an den Enden von sich entwickelnden Röhrenknochen vorkommen (zum Beispiel endochondrale oder costochondrale Chondrozyten), befinden sich Gelenkchondrozyten im Gelenkknorpel, der keine Gefäßversorgung hat, und halten ihn instand. Da ihnen somit eine Blutversorgung als Sauerstoffquelle fehlt, nimmt man an, dass Gelenkchondrozyten Energie für den Stoffwechsel, zum Beispiel bioenergetische Produktion von ATP, vornehmlich durch anaerobe (zum Beispiel glykolytische) Atmung und nicht aus aerober, mitochondrialer, oxidativer Phosphorylierung (Stefanovic-Racic et al., J. Cell Physiol. 159:274–80, 1994) herstellen. Da Gelenkchondrozyten auch unter aeroben Bedingungen wenig Sauerstoff verbrauchen können und sich somit von einer Vielzahl von Zelltypen von Wirbeltieren zu unterscheiden scheinen (Stefanovic-Racic et al., 1994), wurde die Rolle von Mitochondrien bei arthritischen Funktionsstörungen weitgehend unbeachtet gelassen.
Der Bewegungsapparat liefert bei Wirbeltieren wie zum Beispiel Säugern, Reptilien, Vögeln und Fischen wirkungsvoll nützliche mechanische Energie und Tragkraft für Lasten, kann aber auch komplexe Makromoleküle synthetisieren, verarbeiten und organisieren, um Gewebe und Organe, die darauf spezialisiert sind, spezielle mechanische Funktionen auszuführen, zu bilden. Die Gelenke sind eine bedeutende Untergruppe der spezialisierten Strukturen des Bewegungsapparats und es gibt im Körper viele verschiedene Arten von Gelenken. Frei bewegliche Gelenke (zum Beispiel Knöchel, Ellbogen, Hüfte, Knie, Schulter und die Gelenke der Finger, Zehen und des Handgelenks) sind als diarthrotische Gelenke („echte Gelenke") oder Synovialgelenke bekannt. Im Gegensatz dazu sind die Intervertebralgelenke der Wirbelsäule keine diarthrotischen Gelenke, da sie fibrös und nicht frei beweglich sind, obwohl sie für die Flexibilität, die von der Wirbelsäule benötigt wird, sorgen. Die im diarthrotischen Gelenk an der Gelenkbildung beteiligten Knochenenden sind mit einer dünnen Schicht aus hydratisiertem, weichen Gewebe, das als Gelenkknorpel bekannt ist, überzogen. Weiter wird das Gelenk durch Bänder und Sehnen, die innerhalb oder außerhalb der Gelenkkapsel sein können, stabilisiert und seine Beweglichkeit wird durch sie kontrolliert.
Die Oberflächenbeläge von diarthrotischen Gelenken, das heißt die Synovialmembran und die Gelenkknorpelschichten, bilden die Gelenkhöhle, welche die Synovialflüssigkeit enthält. Somit bilden in Gelenken des Skeletts von Wirbeltieren die Synovialflüssigkeit, Gelenkknorpel und der abstützende Knochen ein glattes, nahezu reibungsloses tragendes System. Während diarthrotische Gelenke einem enormen und unterschiedlichen Bereich von Belastungsbedingungen ausgesetzt sind, unterliegen die Knorpeloberflächen unter normalen Umständen einem geringen Verschleiß (zum Beispiel strukturellen Abbau). Tatsächlich können die meisten Gelenke des Menschen unter sehr großen Belastungen und Beanspruchungen und bei sehr niedrigen Arbeitsgeschwindigkeiten in wirksamer Weise funktionieren. Diese Leistungsmerkmale erfordern wirksame Schmierverfahren, um die Reibung und Abnutzung des Knorpels im Gelenk zu minimieren. Eine schwerwiegende Beschädigung des Gelenkknorpels durch biochemische und/oder biomechanische Prozesse führt zu Arthritis, die daher allgemein als ein Versagen des Gewichtstragesystems bei Wirbeltieren definiert ist.
Gelenkchondrozyten synthetisieren und lagern die Bestandteile einer dreidimensionalen, knorpeligen, extrazellulären Matrix, die größtenteils von zwei wesentlichen Klassen von Makromolekülen, Kollagen und Proteoglykanen, umfasst wird, ab und befinden sich darin. Gelenkchondrozyten vermitteln so die Synthese, die Verbindung, den Abbau und den Durchsatz der Makromoleküle, welche die extrazelluläre Matrix (ECM oder einfach „Matrix") des Knorpels umfassen. Mechanochemische Eigenschaften dieser Matrix tragen maßgeblich zur biomechanischen Funktion von Knorpel in vivo bei.
Die strukturelle Integrität von Gelenkknorpel ist die Grundlage einer optimalen Funktion der Gelenke des Skeletts, wie zum Beispiel von denen, die in der Hüfte, den Schultern, den Ellbogen, den Sprunggelenken und den Knien von Wirbeltieren vorkommen. Eine eingeschränkte Funktion eines Gelenks des Skeletts mindert die Mobilität eines einzelnen Subjekts drastisch, wie zum Beispiel von einem, das am Aufstehen aus einer sitzenden Position oder am Hinauf- und Hinuntergehen von Stufen beteiligt ist. Wie oben erwähnt synthetisieren Gelenkchondrozyten ständig Kollagen und Proteoglykane, die Hauptbestandteile des Gelenkknorpels, um die strukturelle und funktionale Integrität des Gelenkknorpels zu erhalten; Chondrozyten sezernieren auch die reibungsvermindernde Synovialflüssigkeit. Diese dauernde Vervollständigung von Makromolekülen der ECM des Knorpels und von Synovialflüssigkeit durch Gelenkchondrozyten stattet den Gelenkknorpel mit einem Reparaturmechanismus für den größten Teil der mechanischen Abnutzung, die von der Reibung zwischen den Knochenenden verursacht werden kann, aus. Jedoch erzeugt eine solche stetige Biosynthese von Knorpelbestandteilen einen konstanten Bedarf an den Vorstufen oder Bausteinen dieser Makromoleküle und an Bestandteilen der Synovialflüssigkeit. Ein Mangel an diesen Vorstufen wird zu Defekten in der Struktur und der Funktion der Gelenke des Skeletts führen. Dieser Mangelzustand tritt oft auf, wenn der Grad der Aktivität sehr hoch ist oder wenn das Knorpelgewebe verletzt ist.
Die Menisken des Knies und andere ähnliche Strukturen wie zum Beispiel der Diskus des Temporomandibulargelenks und das Labrum der Schulter sind spezialisierte fibrocartilaginöse Strukturen, die für eine normale Gelenkfunktion entscheidend sind. Es ist bekannt, dass sie dem Gelenkknorpel beim Verteilen von Belastungen über das Gelenk helfen, Bänder und Sehnen beim Stabilisieren der Gelenke unterstützen und eine wichtige Rolle bei der Stoßdämpfung spielen und dass sie weiter beim Schmieren des Gelenks mithelfen können. Eine Schädigung dieser Strukturen kann zu einer beeinträchtigten Gelenkfunktion und zur Degeneration des Gelenkknorpels führen. Eine chirurgische Entfernung dieser fibrocartilaginösen Strukturen zum Beispiel nach offensichtlich irreparablen Knorpelrissen kann zu einem frühen Einsetzen von Osteoarthritis führen. Die Menisken, der Diskus und das Labrum sind hydratisierte Faserknorpelstrukturen, die hauptsächlich aus Typ-II-Kollagen bestehen, wobei auch kleinere Mengen von anderen Kollagenen und Proteoglykanen (einschließlich Aggrecan und den kleineren, nicht aggregierenden Proteoglykanen) vorkommen. Diese fibrocartilaginösen Strukturen enthalten eine spärliche Population ansässiger Zellen, die ähnlich wie die Gelenkchondrozyten des Knorpels für die Synthese und den Erhalt dieser extrazellulären Matrix verantwortlich sind.
Diarthrotische Gelenke ermöglichen alltägliche Körperbewegungen einschließlich von Bewegungen der Extremitäten, die mit motorischen Funktionen (zum Beispiel solchen, die mit dem Gehen verbunden sind) und anderen Aktivitäten des täglichen Lebens zusammenhängen. Ein Defekt der Gelenkoberflächen (das heißt des Gelenkknorpels) bedeutet, dass diese biomechanischen Lager darin versagen, ihre zentralen Funktionen, wie zum Beispiel zum Gehen erforderliche oder andere Art der Körperbewegung, Verteilung von mechanischer Energie und Tragen von Lasten, zu erfüllen.
Aus biomedizinischer Sicht führt ein Defekt von diarthrotischen Gelenken zu arthritischen Erkrankungen, wobei es sich bei den häufigsten Formen um Osteoarthritis oder degenerative Gelenkerkrankung oder Chondrocalcinose handelt. Andere Formen von arthritischen Erkrankungen schließen rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, Spondylitis ankylosans, Reiter-Syndrom, Arthritis psoriatica, Lupus erythematodes, Gicht, infektiöse Arthritiden und Chondrocalcinose (siehe zum Beispiel Gilliland et al., „Disorders of the joints and connective tissue", Abschnitt 14, Harrison's Principles of Internal Medicine, achte Auflage, Thorn et al., Hrsg., McGraw-Hill, New York, NY, 1977, pp 2048–80) und in tiermedizinischem Zusammenhang Dysplasien, wie zum Beispiel Hüftdysplasie bei Hunden, ein. Arthritische Erkrankungen können auch physisches Trauma (zum Beispiel eine akute physische Verletzung, die Gelenkgewebe schädigt, oder ein Syndrom der Bewegungswiederholung) oder mit der Ernährung zusammenhängende Umstände (zum Beispiel Rachitis oder andere ernährungsbedingte Mangelerkrankungen) einschließen oder darauf zurückzuführen sein.
Die bei weitem am meisten verbreiteten arthritischen Funktionsstörungen sind die rheumatoide Arthritis (RA) und die Osteoarthritis (OA). RA, von der man annimmt, dass sie eine Autoimmunerkrankung ist, ist teilweise auf eine Entzündung der Synovialmembran zurückzuführen. Bei Menschen liegt der häufigste Zeitpunkt des Ein setzens dieser Funktionsstörung bei Erwachsenen in einem Alter von mehr als 30 Jahren (üblicherweise in den Dreißigern und Vierzigern) und betrifft Frauen dreimal häufiger als Männer. Die chronische Entzündung erodiert und deformiert in extremen Fällen die Oberflächen der Gelenke und das Bindegewebe, was zu einer schweren Deformation von Gelenken und zu beständigem Schmerz führt. Außerdem führt RA oft zu OA, was die Zerstörung des Gelenks weiter verstärkt. Die häufigste arthritische Funktionsstörung, OA, ist durch degenerative Veränderungen an der Oberfläche des Gelenkknorpels gekennzeichnet. Veränderungen in der physikochemischen Struktur des Knorpels machen ihn für Druck- und Zugkräfte weniger widerstandsfähig. Schließlich kommt es zur vollständigen Erosion, was den Knochen unterhalb des Knorpels ungeschützt und für Abnutzung anfällig hinterlässt. Die Knie- und Handgelenke sind am häufigsten betroffen, es können auch ein oder mehrere Gelenke der Wirbelsäule, der Hüften, Knöchel und Schultern betroffen sein. Sowohl bei RA als auch bei OA kann die Degeneration der gewichtstragenden Gelenke wie zum Beispiel der Hüften und der Knie besonders schwächend sein und erfordert oft eine Operation, um Schmerz zu lindern und Mobilität zu steigern.
Es gibt derzeit kein Mittel zum Aufhalten oder Rückgängigmachen der degenerativen Veränderungen, die von RA, OA und verwandten arthritischen Funktionsstörungen bewirkt werden. Gleichzeitig begehren etwa 38 Millionen Amerikaner symptomatische Linderung in Form von verschreibungspflichtigen Arzneimitteln. In solchen Fällen werden am häufigsten nichtsteroidale Antiphlogistika (NSAIDS) verordnet. Während diese Verbindungen die arthritischen Symptome oft verringern oder lindern, haben sie oft unerwünschte Nebenwirkungen, zum Beispiel Brechreiz und die Bildung gastrointestinaler Ulcera. Andere Verbindungen, die häufig zur Behandlung arthritischer Funktionsstörungen verschreiben werden, sind die Corticosteroide wie zum Beispiel Triamcinolon, Prednisolon und Hydrocortison. Diese Medikamente haben auch unerwünschte Nebenwirkungen, besonders dort, wo ein Gebrauch über lange Zeit erforderlich sein kann, und können so bei vielen Patienten kontraindiziert sein. Zusätzlich zu Schwierigkeiten beim Festlegen der wirksamen Dosierungen wurde über eine Anzahl von Nebenwirkungen während einer intraartikulären Therapie mit diesen oder anderen Steroiden berichtet. Als Folge wird Einsatz von Corticosteroidtherapien in der Behandlung arthritischer Funktionsstörungen derzeit neu bewertet.
Als eine Alternative zu symptomatischen und palliativen Maßnahmen zum Behandlen von OA und RA wie oben beschrieben schließt die mechanische Reparatur von arthritischen Gelenken, wenn möglich, einen orthopädischen Eingriff zum Ersetzen von abgenutzten Gelenken mit einer künstlichen Prothese oder mit einem biologischen Transplantat ein. Bei mehr als dreißig Millionen Amerikanern, die an diesen deaktivierenden Krankheiten leiden, stellt eine solche Chirurgie enorme medizinische und ökonomische Herausforderungen dar und ist selbst nicht frei von Risiken und Kontraindikationen.
Wie oben erwähnt ist Osteoarthritis, auch als degenerative Gelenkerkrankung bekannt, eine der häufigsten Arten der Arthritis. Sie wird durch den Zusammenbruch des Knorpels innerhalb eines Gelenks gekennzeichnet, was ein schmerzhaftes Reiben eines Knochens des Gelenks gegen einen anderen Knochen verursacht und zu einem Bewegungsverlust im betroffenen Gelenk führt. Osteoarthritis kann von sehr leicht zu sehr schwer reichen und betrifft am häufigsten Menschen im mittleren Alter und ältere Menschen. Im Besonderen betrifft OA oft die Hände und Gewicht tragende Gelenke wie zum Beispiel die Knie, Hüften, Füße oder den Rücken. Obwahl das Alter einen führenden Risikofaktor darstellt, bleiben derzeit die Ätiologie und Pathogenese dieses Zustands weitgehend unbekannt. Viele Umweltfaktoren und andere unabhängige Gegebenheiten, einschließlich Adipositas, vorhergehender Verletzung und/oder Meniskektomie (zum Beispiel Verletzungen, die mit Sport in Beziehung stehen oder einer anderen, durch Unfall verursachten Verletzung), berufsbedingter Tätigkeiten, die zu wiederholtem Beugen der Knie führen, Rauchens, Sexualhormonen, gynäkologischen Funktionsstörungen und anderen metabolischer Faktoren, wurden mit einem erhöhten Risiko, an Osteoarthritis zu leiden oder Osteoarthritis zu entwickeln, in Verbindung gebracht. Chondrocalcinose ist eine andere Form von degenerativer Gelenkerkrankung, die mit Osteoarthritis verwandt ist und bei der es im Gelenkknorpel zu einer abnormalen Verkalkung kommt.
Aus den vorangehenden Ausführungen wird klar, dass keine der derzeitigen pharmakologischen Therapien den zugrunde liegenden biochemischen Defekt bei arthritischen Funktionsstörungen wie zum Beispiel RA und OA korrigiert. Ebenso verbessert keine dieser derzeit verfügbaren Behandlungsmethoden alle der physiologischen Abweichungen bei arthritischen Funktionsstörungen wie zum Beispiel abnorme Aktivität von Gelenkschondrozyten, Knorpelabbau, Erosion des Gelenks, und schwere Deformation des Gelenks. Weiterhin sind mit diesen Wirkstoffen Misserfolge bei der Behandlung häufig, so dass oft eine aus mehreren Arzneimitteln bestehende Behandlung erforderlich ist.
Es besteht offensichtlich ein Bedarf nach verbesserten Therapeutika, die darauf gerichtet sind, biochemische und/oder metabolische Defekte, die für Arthritis verantwortlich sind, zu korrigieren. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren, die zum Behandeln einer arthritischen Funktionsstörung und zum Behandeln von Krankheiten, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, nützlich sind, bereit und bietet andere, ähnliche Vorteile.
Gemäß nicht limitierender Theorie und wie in der mitanhängigen Anmeldung mit der U.S. laufenden Nummer 09/661.848 offenbart ist, können einige oder alle arthritischen Funktionsstörungen wie hier dargelegt Beispiele von Krankheiten, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, darstellen.
Als Hintergrund: Mitochondrien sind die Hauptenergiequelle in Zellen höherer Organismen und diese Organellen sorgen für direkte und indirekte biochemische Regulierung eines weiten Bereichs von Zellatmung, von oxidativen und metabolischen Prozessen (siehe Ernster und Schatz, J. Cell Biol 91:227s–255s, 1981 für eine Übersicht). Diese beinhalten Aktivität der Elektronentransportkette (ETC), welche oxidative Phosphorylierung vorantreibt, um metabolische Energie in der Form von Adenosintriphosphat (ATP) zu produzieren und die auch einer zentralen mitochondrialen Rolle in der intrazellulären Calciumhomöostase zugrunde liegt. Zusätzlich zu ihrer Rolle in metabolischen Prozessen sind Mitochondrien an der genetisch programmierten Zellsuizidsequenz, die als „Apoptose" bekannt ist, beteiligt (Green und Reed, Science 281:1309–12, 1998, Susin et al., Biochim. et Biophys. Acta 1366:151–65, 1998).
Gestörte mitochondriale Aktivität, einschließlich Versagens auf jeder Stufe des komplizierten, hochkomplexen, mitochondrialen Aufbaus, bekannt als die Elektronen transportkette (ETC), kann (i) zu Minderungen in der ATP-Produktion, (ii) zu Steigerungen in der Bildung von hochreaktiven freien Radikalen (zum Beispiel Superoxid, Peroxynitrit und Hydroxylradikalen und Wasserstoffperoxid), (iii) zu Störungen in der intrazellulären Calciumhomöostase und (iv) zur Freisetzung von Faktoren (wie zum Beispielen solchen wie Cytochrom c oder „apoptosis inducing factor"), welche die Apoptosekaskade initiieren oder stimulieren, führen. Wegen dieser biochemischen Änderungen hat mitochondriale Dysfunktion das Potential, ausgedehnten Schaden an Zellen und Geweben zu verursachen.
Man nimmt an, dass eine Reihe von Krankheiten und Funktionsstörungen von Veränderungen im mitochondrialen Metabolismus und/oder von ungeeigneter Induktion oder Suppression von Funktionen, die mit Mitochondrien verbunden sind, wie zum Beispiel denen, die zu Apoptose führen, verursacht werden oder damit verbunden sind. Diese beinhalten beispielsweise chronische neurodegenerative Erkrankungen wie zum Beispiel Alzheimer-Krankheit (AD) oder Parkinson-Krankheit (PD); Autoimmunerkrankungen; Diabetes mellitus einschließlich Typ I und Typ II; mit Mitochondrien verbundene Krankheiten einschließlich von kongenitaler Muskeldystrophie mit mitochondrialen strukturellen Abnormitäten, von tödlicher, infantiler Myopathie mit schwerer mtDNA-Depletion und von benigner, „später einsetzender" Myopathie mit mäßiger Abnahme von mtDNA, von MELAS (mitochondriale Enzephalopathie, Lactatazidose und Schlaganfall) und von MIDD (mitochondrialer Diabetes und Taubheit), aber nicht darauf beschränkt; MERFF (Syndrom der Myoklonus-Epilepsie mit ,ragged-red-Fasern'); Arthritis; NARP (Neuropathie, Ataxie, Retinitis pigmentosa), MNGIE (Myopathie und externe Ophthalmoplegie, Neuropathie, gastrointestinal, Enzephalopathie), LHON (Lebers, hereditäre, Optikus, Neuropathie), Kearns-Sayre-Krankheit; Pearson-Syndrom; PEO (progressive externe Ophthalmoplegie); Wolfram-Syndrom DIDMOAD (Diabetes insipidus, Diabetes mellitus, Optikusatrophie, Schwerhörigkeit); Leigh-Syndrom; Dystonie; Schizophrenie und hyperproliferative Funktionsstörungen wie zum Beispiel Krebs, Tumore und Psoriasis.
Gemäß allgemein anerkannter Theorien der mitochondrialen Funktion erfordert eine korrekte respiratorische Aktivität der ETC ein Aufrechterhalten eines elektrochemischen Potentials (ΔΨm) in der inneren mitochondrialen Membran durch einen gekoppelten chemoosmotischen Mechanismus. Umstände, die dieses Membranpotential abbauen oder zum Erliegen bringen, einschließlich von Versagen auf jeder Stufe der ETC, aber nicht darauf beschränkt, können so Biosynthese von ATP verhindern und die Produktion einer vitalen biochemischen Energiequelle behindern oder unterbrechen. Veränderte oder gestörte mitochondriale Aktivität kann auch zu einem katastrophalen mitochondrialen Zusammenbruch, der als „mitochondrialer Permeabilitätsübergang" (MPT) bezeichnet wurde, führen. Zusätzlich können auf Grund von MPT (oder der Aktivität mitochondrialer Proteine wie zum Beispiel Bax) mitochondriale Proteine wie zum Beispiel Cytochrom und „apoptosis inducing factor" aus den Mitochondrien dissoziieren oder freigesetzt werden und können Proteasen, die als Caspasen bekannt sind, induzieren und/oder andere Ereignisse in der Apoptose stimulieren (Murphy, Drug Dev. Res. 46:18–25, 1999).
Gestörte mitochondriale Aktivität kann alternativ oder zusätzlich zur Bildung hochreaktiver freier Radikale, welche das Potential, Zellen und Gewebe zu schädigen, haben, führen. Diese freien Radikale können reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wie zum Beispiel Superoxid, Peroxynitrit und Hydroxylradikale und möglicherweise andere reaktive Spezies, die für Zellen toxisch sein können, einschließen. Zum Beispiel ist die von freien Sauerstoffradikalen induzierte Lipidperoxidation ein gut bekannter pathogenetischer Mechanismus beim insult des zentralen Nervensystem (CNS), wie zum Beispiel diejenige, die bei einer Zahl degenerativer Erkrankungen und bei Ischämie (das heißt Schlaganfall) gefunden wird. (Man nimmt an, dass mitochondriale Beteiligung an der Apoptosekaskade auch ein Schlüsselereignis in der Pathogenese des Todes von Neuronen ist.)
Es gibt darüber hinaus mindestens zwei schädliche Folgen des reaktiven, freien Radikalen, die auf mitochondriale Dysfunktion zurückzuführen sind, Ausgesetztseins, welche die Mitochondrien selbst beeinträchtigen. Erstens kann von freien Radikalen vermittelter Schaden eines oder mehrere der unzähligen Proteine der ETC inaktivieren. Zweitens kann von freien Radikalen vermittelter Schaden zu einem katastrophalen mitochondrialen Zusammenbruch, der als „Permeabilitätsübergang" bezeichnet wurde, führen. Gemäß allgemein anerkannter Theorien der mitochondrialen Funktion erfordert eine korrekte respiratorische Aktivität der ETC ein Aufrechterhalten eines elektro chemischen Potentials in der inneren mitochondrialen Membran durch einen gekoppelten chemoosmotischen Mechanismus. Oxidative Aktivität freier Radikale kann dieses Membranpotential abbauen und so Biosynthese von ATP verhindern und/oder mitochondriale Ereignisse in der Apoptosekaskade auslösen. Daher stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren, die nicht durch die bloße Bestimmung der von freien Radikalen induzierten Lipidperoxidation bereitgestellt werden, zum Schützen von Mitochondrien bereit, indem sie diese und andere Wirkungen der Oxidation durch freie Radikale auf mitochondriale Struktur und Funktion moduliert.
Zum Beispiel zieht schneller mitochondrialer Permeabilitätsübergang wahrscheinlich Änderungen in dem Transmembranprotein Adenylattranslokase der inneren mitochondrialen Membran, die zur Bildung einer „Pore" führen, nach sich. Ob diese Pore ein ausgeprägter Kanal oder einfach eine ausgedehnte Undichtigkeit in der Membran ist, ist ungelöst. Auf jeden Fall kann es wahrscheinlicher in den Mitochondrien von Zellen von Patienten, die mit Mitochondrien verbundene Krankheiten, die chronisch solchen reaktiven freien Radikalen ausgesetzt sind, haben, auftreten, weil mitochondrialer Permeabilitätsübergang durch freien Radikalen Ausgesetztsein potenziert wird.
Veränderte (zum Beispiel im Vergleich zu einer geeigneten Kontrolle, wie zum Beispiel einem von Krankheit freiem Individuum, in statistisch signifikanter Weise vermehrte oder verminderte) mitochondriale Funktion, die für mit Mitochondrien verbundene Krankheiten kennzeichnend ist, kann auch mit einem Verlust des elektrochemischen Potentials der mitochondrialen Membran durch andere Mechanismen als Oxidation durch freie Radikale verbunden sein und ein solcher Permeabilitätsübergang kann auf direkte oder indirekte Wirkungen mitochondrialer Gene, Genprodukte oder damit in Beziehung stehender, nachgeschalteter Mediatormoleküle und/oder extramitochondrialer Gene, Genprodukte oder damit in Beziehung stehender, nachgeschalteter Mediatormoleküle oder auf andere bekannte oder unbekannte Ursachen zurückzuführen sein. Der Verlust von mitochondrialem Potential kann daher ein kritisches Ereignis bei der Progression von mit Mitochondrien verbundenen oder degenerativen Erkrankungen sein.
Diabetes mellitus ist eine häufige, degenerative Krankheit, die 5 bis 10 Prozent der Bevölkerung in entwickelten Ländern betrifft. Die Neigung, Diabetes mellitus zu entwickeln, ist Berichten zufolge mütterlich vererbt, was auf eine mitochondriale genetische Beteiligung schließen lässt. (Alcolado, J.C. und Alcolado, R., Br. Med. J. 302:1178–80, 1991; Reny, S.L., International J. Epidem. 23:886–90, 1994.) Diabetes ist eine heterogene Funktionsstörung mit einer starken genetischen Komponente; eineiige Zwillinge sind in hohem Maße konkordant und es liegt eine hohe Inzidenz der Krankheit bei Verwandten ersten Grades von betroffenen Individuen vor.
Auf der zellulären Ebene beinhaltet der degenerative Phänotyp, der für den spät einsetzenden Diabetes mellitus typisch sein kann, Indikatoren für veränderte respiratorische Funktion in den Mitochondrien, zum Beispiel beeinträchtigte Insulinsekretion, verminderte Synthese von ATP und erhöhte Spiegel von reaktiven Sauerstoffspezies. Untersuchungen haben gezeigt, dass bestimmte verwandte Funktionsstörungen Diabetes mellitus vorausgehen oder damit verbunden sein können. Es wird zum Beispiel geschätzt, dass vierzig Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten an einer spät einsetzenden gestörten Glukosetoleranz (IGT) leiden. Patienten mit IGT können auf Glukose nicht mit erhöhter Insulinsekretion reagieren. Ein kleiner Prozentsatz von Individuen mit IGT (5–10 %) gleitet jährlich in nicht insulinabhängigen Insulinmangeldiabetes (NIDDM) ab. Einige dieser Individuen gleiten weiter in insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) ab. Diese Formen des Diabetes mellitus, NIDDM und IDDM sind mit einer verminderten Insulinfreisetzung durch Beta-Zellen des Pankreas und/oder einer herabgesetzten Reaktion der Endorgane auf Insulin verbunden. Andere Symptome von Diabetes mellitus und Zuständen, die Diabetes mellitus vorausgehen oder damit verbunden sind, schließen Übergewicht, pathologische Gefäßveränderungen, periphere und sensorische Neuropathien, Blindheit und Taubheit ein.
Aufgrund der starken genetischen Komponente von Diabetes mellitus bildete das im Kern befindliche Genom den Schwerpunkt der Suche nach ursächlichen genetischen Mutationen. Trotz intensiver Bemühungen sind jedoch Gene im Kern, die mit Diabetes mellitus segregieren, nur für seltene Mutationen im Insulingen, im Insulinrezeptorgen, im Adenosindeaminasegen und im Glucokinasegen bekannt. Dementsprechend können mitochondriale Defekte, die Defekte, die mit dem separaten, nicht im Kern befindlichen mitochondrialen Genom, das sich in mitochondrialer DNA befindet, verbunden sind, ent halten können, aber nicht darauf beschränkt sein müssen, maßgeblich zur Pathogenese von Diabetes mellitus beitragen (Anderson, Drug Dev. Res. 46:67–79, 1999).
Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine fortschreitende, chronische, mit Mitochondrien verbundene neurodegenerative Funktionsstörung, die von dem Verlust und/oder der Atrophie von Neuronen, die Dopamin enthalten, in der pars compacta der substantia nigra des Gehirns gekennzeichnet ist. Wie die Alzheimer-Krankheit (AD) betrifft auch PD die Älteren. Sie ist durch Bradykinesie (langsame Bewegung), Rigidität und einen Ruhetremor gekennzeichnet. Obwohl eine Behandlung mit L-Dopa bei den meisten Patienten den Tremor eine Zeit lang verringert, wird der Tremor letztendlich mehr und mehr unkontrollierbar, was es für die Patienten schwierig oder unmöglich macht, auch nur selbstständig Nahrung zu sich zu nehmen oder die Verrichtungen der eigenen grundlegenden Hygiene auszuführen.
Es wurde gezeigt, dass das Neurotoxin 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) bei Tieren und Menschen zumindest teilweise durch seine Wirkungen auf Mitochondrien Parkinsonismus hervorruft. MPTP wird in Dopamin-Neuronen in seinen aktiven Metaboliten, MPP+, umgewandelt; es wird dann in den Mitochondrien konzentriert. Das MPP+ hemmt dann selektiv das mitochondriale Enzym NADH:Ubichinon Oxidoreduktase („Komplex I"), was zur erhöhten Produktion freier Radikale, verminderter Produktion von Adenosintriphosphat und schließlich zum Tod der betroffenen Dopamin-Neuronen führt.
Mitochondrialer Komplex I setzt sich aus 40–50 Untereinheiten zusammen; für die meisten codiert das Genom des Kerns und für sieben das mitochondriale Genom. Da Parkinsonismus durch Einwirkung mitochondrialer Toxine, welche die Aktivität von Komplex I beeinträchtigen, hervorgerufen werden kann, erscheint es wahrscheinlich, dass Defekte in Proteinen von Komplex I zur Pathogenese von PD betragen können, indem sie ein ähnliches biochemisches Defizit in der Aktivität von Komplex I verursachen. Tatsächlich wurde über Defekte in der mitochondrialen Komplex-1-Aktivität im Blut und im Gehirn von Patienten mit PD berichtet (Parker et al., Am. J. Neurol. 26:719–23, 1989; Swerdlow und Parker, Drug Dev. Res. 46:44–50, 1999).
Es wurden ähnliche Theorien über analoge Beziehungen zwischen mitochondrialen Defekten und anderen neurologischen Krankheiten einschließlich der Alzheimer-Krankheit, Leberscher hereditärer Optikusneuropathie, Schizophrenie, „mitochondrialer Enzephalopathie, Lactatazidose und Schlaganfall" (MELAS) und „Myoklonus-Epilepsie mit ,ragged-red-Fasern'" (MERRF) aufgestellt.
Zum Beispiel ist Alzheimer-Krankheit (AD) eine chronische, progressive, neurodegenerative Funktionsstörung, die durch Verlust und/oder Atrophie von Neuronen in einzelnen Regionen des Gehirns gekennzeichnet ist und die mit extrazellulären Ablagerungen von β-Amyloid und der intrazellulären Ansammlung von Geflechten von Neurofibrillen einhergeht. Es handelt sich um eine nur beim Menschen vorkommende Erkrankung, die weltweit über 13 Millionen Menschen betrifft. Es handelt sich auch um eine einzigartig tragische Krankheit. Viele Menschen, die ein normales, produktives Leben gelebt haben, sind mit zunehmendem Alter langsam von AD geschlagen, und die Krankheit beraubt sie allmählich ihres Gedächtnisses und anderer mentaler Fähigkeiten. Schließlich können sie ihre Familie und die ihnen Nahestehenden nicht mehr erkennen und sie benötigen oft ununterbrochene Pflege, bis sie letztendlich sterben.
Es gibt Anzeichen dafür, dass Fehler bei der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien zumindest teilweise einen Grund von sporadischer AD darstellen. Das Enzym Cytochrom c Oxidase (COX), das einen Teil der mitochondrialen Elektronentransportkette bildet, ist bei Patienten mit AD in normalen Mengen vorhanden; es wurde jedoch festgestellt, dass die katalytische Aktivität dieses Enzyms bei Patienten mit AD und im Rahmen der Autopsie in Gehirnen von Patienten mit AD abnorm niedrig ist. Dies weist darauf hin, dass die COX bei Patienten mit AD fehlerhaft ist, was zu einer verminderten katalytischen Aktivität, die in gewisser Art und Weise die Symptome, die für AD kennzeichnend sind, verursacht oder zu ihnen beiträgt, führt.
Eine kennzeichnende Symptomatik von AD ist der Tod ausgewählter Neuronenpopulationen in einzelnen Regionen des Gehirns. Es wird angenommen, dass Zelltod bei AD apoptotisch ist, weil Zeichen von programmiertem Zelltod (PCD) beobachtet werden und Indikatoren von aktiver Gliose und Nekrose nicht gefunden werden (Smale et al., Exp. Neurolog. 133:225–30, 1995, Cotman et al., Molec. Neurobiol. 10:19–45, 1995). Die Folgen von Zelltod bei AD, Verlust von Neuronen und Synapsen, sind eng mit der klinischen Diagnose von AD verbunden und in hohem Maße mit dem Grad der Demenz bei AD korreliert (DeKosky et al., Ann. Neurol. 27(5):457–64, 1990).
Man nimmt an, dass mitochondriale Dysfunktion in der Kaskade der Ereignisse, die bei verschiedenen Zelltypen zur Apoptose führen, entscheidend ist (Kroemer et al., FASEB J. 9:1277–87, 1995) und eine Ursache von apoptotischem Zelltod bei Neuronen des Gehirns mit AD sein kann. Eine veränderte mitochondriale Physiologie kann unter den frühesten Ereignissen beim PCD sein (Zamzami et al., J. Exp. Med. 182:367–77, 1995; Zamzami et al., J. Exp. Med. 181:1661–72, 1995) und erhöhte Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die auf solch veränderte mitochondriale Funktion zurückzuführen sind, können die apoptotische Kaskade auslösen (Ausserer et al., Mol. Cell. Biol. 14:5032–42, 1994). In verschiedenen Zelltypen einschließlich von Neuronen, geht eine Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) dem Abbau der DNA im Kern, der mit Apoptose einhergeht, voraus. In zellfreien Systemen können mitochondriale, aber nicht nukleäre, angereicherte Fraktionen nukleäre Apoptose auslösen (Newmeyer et al., Cell 70:353–64, 1994). Eine Störung der mitochondrialen respiratorischen Aktivität, die zu veränderten zellulären, metabolischen Zuständen führt, wie zum Beispiel erhöhte intrazelluläre ROS, kann bei Krankheiten, die mit Mitochondrien verbunden sind, auftreten und kann weiter über apoptotische Mechanismen pathogene Ereignisse auslösen.
Oxidativ gestresste Mitochondrien können einen präformierten, löslichen Faktor, der chromosomale Kondensation, ein Ereignis, das Apoptose vorausgeht, auslösen kann, freisetzen (Marchetti et al., Cancer Res. 56:2033–38, 1996). Außerdem befinden sich Mitglieder der BcI-2-Familie von Antiapoptose-Genprodukten in der äußeren mitochondrialen Membran (Monaghan et al., J. Histochem. Cytochem. 40:1819–25, 1992) und diese Proteine scheinen Membranen vor oxidativem Stress zu schützen (Korsmeyer et al., Biochim. Biophys. Act. 1271:63, 1995). Lokalisierung von BcI-2 an diese Membran scheint für eine Modulation von Apoptose unerlässlich zu sein (Nguyen et al., J. Biol. Chem. 269:16521–24, 1994). Somit können Veränderungen in der mitochondrialen Physiologie wichtige Mediatoren von Apoptose sein. In dem Ausmaß, in dem apoptotischer Zelltod eine markante Eigenschaft von Verlust von Neuronen bei AD ist, kann mitochondriale Dysfunktion für das Fortschreiten der Erkrankung entscheidend sein und kann auch ein Faktor sein, der zu anderen Krankheiten, die mit Mitochondrien verbunden sind, beiträgt.
Fokale Defekte im Energiestoffwechsel in den Mitochondrien mit begleitenden Steigerungen von oxidativem Stress können mit AD verbunden sein. Es ist gut fundiert, dass der Energiestoffwechsel im Gehirn mit AD gestört ist (Palmer et al., Brain Res. 645:338–42, 1994; Pappolla et al., Am. J. Pathol. 140:621–28, 1992; Jeandel et al., Gerontol. 35:275, 1989; Balazs et al., Neurochem. Res. 19:1131–37, 1994; Mecocci et al., Ann. Neurol. 36:747–51, 1994; Gsell et al., J. Neurochem. 64:1216–23, 1995). Zum Beispiel wurde in einer Reihe von Positronenemissionstomographie-Untersuchungen über regional spezifische Defizite im Energiestoffwechsel in Gehirnen mit AD berichtet (Kuhl et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 7:S406, 1987; Grady et al., J. Clin. Exp. Neuropsychol. 10:576–96, 1988; Haxby et al., Arch. Neurol. 47:753–60, 1990; Azari et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 13:438–47, 1993). Metabolische Defekte im temporoparietalen Neocortex von Patienten mit AD kündigen kognitiven Verfall anscheinend mehrere Jahre im Voraus an. Hautfibroblasten von Patienten mit AD zeigen verringerte Glukoseverwertung und erhöhte Oxidation von Glukose, was zur Bildung von Glykosilierungsendprodukten führt (Yan et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91:7787–91, 1994). Corticales Gewebe aus postmortalem Gehirn mit AD zeigt verringerte Aktivität der mitochondrialen Enzyme Pyruvatdehydrogenase (Sheu et al., Ann. Neurol. 17:444–49, 1985) und α-Ketoglutaratdehydrogenase (Mastrogiacomo et al., J. Neurochem. 6:2007–14, 1994), die beide Schlüsselenzyme im Energiestoffwechsel sind. Untersuchungen mit funktioneller Magnetresonanzspektroskopie haben erhöhte Spiegel von anorganischem Phosphat im Vergleich zu Phosphocreatin im Gehirn mit AD gezeigt, was auf eine Kumulation von Vorstufen, die auf verringerte Produktion von ATP durch Mitochondrien zurückzuführen ist, hinweist (Pettegrew et al., Neurobiol. of Aging 15:117–32, 1994; Pettigrew et al., Neurobiol. of Aging 16:973–75, 1995). Außerdem wird berichtet, dass die Spiegel von Pyruvat, nicht aber von Glukose oder Lactat im Liquor cerebrospinalis von Patienten mit AD erhöht sind, was mit Defekten in der cerebralen Aktivität der mitochondrialen Elektronentransportkette (ETC) vereinbar ist (Parnetti et al., Neurosci. Lett. 199:231–33, 1995).
Zeichen der oxidativen Schädigung sind herausragende Zeichen der Pathologie von AD und wie oben erwähnt sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS) entscheidende Mediatoren der Degeneration von Neuronen. Tatsächlich zeigen Untersuchungen bei der Autopsie, dass Marker von Protein, DNA und Lipidperoxidation beim Gehirn mit AD erhöht sind (Palmer et al., Brain Res. 645:338–42, 1994; Pappolla et al., Am. J. Pathol. 140:621–28; Jeandel et al., Gerontol. 35:275–82, 1989; Balazs et al., Arch. Neurol. 4:864, 1994; Mecocci et al., Ann. Neurol. 36:747–51, 1994; Smith et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:10540–43, 1991). In Gewebe aus Hippocampus von AD, aber nicht von Kontrollen, ist die Bildung von Carbonyl, die auf Oxidation von Protein hinweist, im neuronalen Zytoplasma und in Kernen von Neuronen und Glia erhöht (Smith et al., Nature 382:120–21, 1996). Neurofibrilläre Geflechte scheinen auch herausragende Stellen von Oxidation von Protein zu bilden (Schweers et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 92:8463, 1995; Blass et al., Arch. Neurol. 4:864, 1990). Unter gestressten und nicht gestressten Bedingungen zeigt die Inkubation von corticalem Gewebe aus Gehirnen mit AD, das bei der Autopsie entnommen wurde, erhöhte Produktion freier Radikale im Vergleich zu Kontrollen ohne AD. Außerdem sind die Aktivitäten entscheidender antioxidativer Enzyme, besonders Katalase, bei AD reduziert (Gsell et al., J. Neurochem. 64:1216–23, 1995), was darauf hinweist, dass das Gehirn mit AD anfällig für erhöhte ROS-Produktion ist. So kann oxidativer Stress wesentlich zur Pathologie von Krankheiten, die mit Mitochondrien verbunden sind, wie zum Beispiel AD, wo mitochondriale Dysfunktion und/oder erhöhte ROS vorliegen können, beitragen.
Zunehmende Indizien deuten auf die grundlegende Rolle von mitochondrialer Dysfunktion bei chronischen neurodegenerativen Krankheiten hin (Beal, Biochim. Biophys. Acta 9366:211–23, 1998) und neuere Studien beziehen Mitochondrien in die Regulation der Ereignisse, die zu nekrotischem und apoptotischen Zelltod führen, ein (Susin et al., Biochim. Biophys. Acta 1366:151–68, 1998). Gestresste (zum Beispiel unter anderem durch freie Radikale, hohes intrazelluläres Calcium, Verlust von ATP) Mitochondrien können präformierte, lösliche Faktoren, die Apoptose durch eine Interaktion mit Apoptosomen auslösen können, freisetzen (Marchetti et al., Cancer Res. 56:2033–38, 1996; Li et al., Cell 91:479–89, 1997). Die Freisetzung präformierter, löslicher Faktoren wie Cytochrom c durch gestresste Mitochondrien kann als Folge einer Reihe von Ereignissen auftreten. In jedem Fall nimmt man an, dass das Ausmaß des Stresses (ROS, intrazelluläre Calciumspiegel usw.) die Änderungen in der mitochondrialen Physiologie, welche letztendlich bestimmen, ob der Zelltod über einen nekrotischen oder apoptotischen Weg eintritt, beeinflusst. In dem Ausmaß, in dem apoptotischer Zelltod eine markante Eigenschaft von degenerativen Erkrankungen ist, kann mitochondriale Dysfunktion ein entscheidender Faktor für das Fortschreiten der Erkrankung sein.
Im Gegensatz zu chronisch neurodegenerativen Erkrankungen erfolgt der Tod von Neuronen nach einem Schlaganfall auf akute Art. Eine gewaltige Menge von Literatur dokumentiert nun die Bedeutung der mitochondrialen Funktion beim Tod von Neuronen nach einer Schädigung durch Ischämie/Reperfusion, die Schlaganfall, Herzstillstand und traumatische Hirnschädigung begleitet. Es häuft sich weiter experimentelle Unterstützung für eine zentrale Rolle von gestörtem Energiestoffwechsel, von Veränderung in der mitochondrialen Funktion, was zu erhöhter Produktion von Sauerstoffradikalen und zu gestörter intrazellulärer Calciumhomöostase führt, und von aktiver mitochondrialer Beteiligung an der apoptotischen Kaskade in der Pathogenese von akuter Neurodegeneration.
Ein Schlaganfall ereignet sich, wenn eine Region des Gehirns die Durchblutung verliert und Neuronen akut oder verzögert als Ergebnis dieses plötzlichen ischämischen Ereignisses absterben. Nach dem Aussetzen der Blutversorgung des Gehirns fällt die Konzentration von ATP im Gewebe innerhalb von Minuten auf vernachlässigbare Spiegel ab. Im Kern des Infarktes verursacht der Mangel an mitochondrialer Produktion von ATP einen Verlust der Ionenhomöostase, was zu osmotischer Zelllyse und nekrotischem Tod führt. Eine Reihe sekundärer Veränderungen kann auch zum Zelltod nach dem Abfall von mitochondrialem ATP beitragen. Zelltod bei akuter neuronaler Schädigung strahlt aus dem Zentrum eines Infarkts, wo Neuronen in erster Linie durch Nekrose sterben, über die Randzone, wo Neuronen der Apoptose unterliegen, in die Peripherie, wo das Gewebe noch nicht geschädigt ist, aus (Martin et al., Brain Res. Bull. 46:281–309, 1998).
Ein großer Teil der Schädigung von Neuronen in der Randzone wird durch Excitotoxizität, die durch während der Zelllyse am Mittelpunkt des Infarktes freigesetztes Glutamat hervorgerufen wird, verursacht, besonders, wenn dies durch bioenergetisches Versagen der Mitochondrien aufgrund von Sauerstoffmangel verschlimmert wird (MacManus und Linnik, J. Cerebral Blood Flow Metab. 17:815–32, 1997). Der initiale Auslöser bei Excitotoxizität ist der massive Einstrom von Ca²⁺ in erster Linie durch die NMDA-Rezeptoren, was zu vermehrter Aufnahme von Ca²⁺ in die Mitochondrien führt (Übersichtsarbeit von Dykens, „Free radicals and mitochondrial dysfunction in excitotoxicity and neurodegenerative diseases" in Cell Death and Diseases of the Nervous System, V.E. Koliatos und R.R. Ratan, Hrsg., Humana Press, New Jersey, pp 45–68, 1999). Die Überladung mit Ca²⁺ bringt das mitochondriale Membranpotential (ΔΨ_m) zum Erliegen und erzeugt vermehrte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (Dykens, J Neurochem 63:584–91, 1994; Dykens, „Mitochondrial radical production and mechanisms of oxidative excitotoxicity" in The Oxygen Paradox, K.J.A. Davies und F. Ursini, Hrsg., Cleup Press, U. of Padova, Seiten 453–67, 1995). Wenn sie schwerwiegend genug sind, können der Zusammenbruch von ΔΨ_m und die mitochondriale Sequestrierung von Ca²⁺ das Öffnen einer Pore in der inneren mitochondrialen Membran durch einen Prozess hervorrufen, der mitochondrialer Permeabilitätsübergang (MPT) genannt wird, was indirekt Cytochrom c und andere Proteine, die Apoptose auslösen, freisetzt (Bernardi et al., J Biol. Chem. 267:2934–39, 1994; Zoratti und Szabo, Biochim. Biophys. Acta 1241:139–76, 1995; Ellerby et al., J Neurosci 17:6165–78, 1997). Mit diesen Beobachtungen übereinstimmend kann von Glutamat hervorgerufene Excitotoxizität unterdrückt werden, indem mitochondriale Aufnahme von Ca²⁺ verhindert oder MPT geblockt wird (Budd und Nichols, J Neurochem 66:403–11, 1996; White und Reynolds, J Neurosci 16:5688–97, 1996; Li et al., Brain Res. 753:133–40, 1997).
Während von Mitochondrien vermittelte Apoptose bei degenerativen Erkrankungen entscheidend sein kann, nimmt man an, dass Funktionsstörungen wie zum Beispiel Krebs das unregulierte und unerwünschte Wachstum (Hyperproliferation) von Zellen, die irgendwie einem Mechanismus, der normalerweise in solchen unerwünschten Zellen Apoptose auslöst, entgangen sind, mit sich bringen. Gesteigerte Expression des antiapoptotischen Proteins BcI-2 und seiner Homologen ist an der Pathogenese von zahlreichen Arten von Krebs beim Menschen beteiligt. BcI-2 wirkt, indem es programmierten Zelltod hemmt und Überexpression von BcI-2 und dem verwandten Protein BcI-xL blockiert mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien und die Aktivierung von Caspase 3 (Yang et al, Science 275:1129–32, 1997; Kluck et al., Science 275:1132-36, 1997; Kharbanda et al., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 94:6939–42, 1997). Demgegenüber schützt Überexpression von BcI-2 und BcI-xL gegen die mitochondriale Dysfunktion, die der nukleären Apoptose, die von chemotherapeutischen Wirkstoffen hervorgerufen wird, vorausgeht. Außerdem ist eine erworbene multivalente Resistenz gegen zytotoxische Medikamente mit einer Hemmung der Freisetzung von Cytochrom c, die von einer Überexpression von BcI-xL abhängig ist, verbunden (Kojima et al., J. Biol. Chem. 273:16647–50, 1998). Weil Mitochondrien mit Apoptose in Verbindung gebracht wurden, wird erwartet, dass Wirkstoffe, die mit mitochondrialen Bestandteilen wechselwirken, sich auf die Fähigkeit einer Zelle, Apoptose zu unterliegen, auswirken werden. Somit wird erwartet, dass Wirkstoffe, die in hyperproliferativen Zellen Apoptose auslösen oder fördern, beim Behandeln von hyperproliferativen Funktionsstörungen und Erkrankungen wie zum Beispiel Krebs von Nutzen sind.
Somit hat eine Änderung der mitochondrialen Funktion ein großes Potential für eine therapeutische Strategie mit einer breiten Basis zum Konzipieren von Arzneimitteln zum Behandeln von Krankheiten, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, einschließlich (als nicht limitierende Theorie) bestimmter arthritischer Funktionsstörungen, degenerativer Funktionsstörungen und hyperproliferativer Erkrankungen. Weiterhin können gemäß nicht limitierender Theorie abhängig von der Erkrankung oder Funktionsstörung, für die eine Behandlung gesucht wird, solche Arzneimittel zum Beispiel Wirkstoffe, die Mitochondrien schützen, antiapoptotische Wirkstoffe oder proapoptotische Wirkstoffe sein.
Es besteht eindeutig ein Bedarf nach Verbindungen und Verfahren, die Schaden an Organellen, Zellen und Geweben, der direkt oder indirekt auf mitochondriale Dysfunktion zurückzuführen ist, zum Beispiel Schaden durch intrazellulär gebildete freie Radikale, begrenzen oder verhindern. Weil Mitochondrien unentbehrliche Organellen zum Produzieren von metabolischer Energie sind, würden im Besonderen Wirkstoffe, die Mitochondrien gegen einen solchen Schaden (zum Beispiel oxidativen Schaden durch freie Radikale) schützen, von speziellem Nutzen sein. Solche Wirkstoffe können zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen einschließlich von Erkrankungen, die mit Mitochondrien verbunden sind, geeignet sein. Vorhandene Ansätze zum Identifizieren von Wirkstoffen, die oxidativen Schaden begrenzen, können die Ermittlung, ob solche Wirkstoffe dabei helfen können, mitochondriale Struktur und/oder Funktion zu schützen, nicht enthalten.
Es besteht auch ein Bedarf nach Verbindungen und Verfahren, die Schaden an Zellen und Geweben, der direkt oder indirekt als Ergebnis von Nekrose und/oder unangebrachter Apoptose auftritt, begrenzen oder verhindern. Weil Mitochondrien Vermittler von apoptotischen Ereignissen sind, würden im Besonderen Wirkstoffe, die von Mitochondrien vermittelte proapoptotische Ereignisse modulieren, von speziellem Nutzen sein. Solche Wirkstoffe können für die Behandlung akuter degenerativer Ereignisse wie zum Beispiel Schlaganfall geeignet sein. In Anbetracht des limitierten therapeutischen Fensters zum Blockieren von nekrotischem Tod im Kern eines Infarkts kann es besonders wünschenswert sein, therapeutische Strategien zu entwickeln, um den Tod von Neuronen zu begrenzen, indem man in den nicht nekrotischen Regionen eines Infarkts mitochondriale Dysfunktion verhindert. Es wäre zu erwarten, dass Wirkstoffe und Verfahren, die während einer transienten Ischämie und der sich ergebenden Welle der Excitotoxizität die mitochondriale Integrität aufrechterhalten, neue, neuroprotektive Wirkstoffe, die zum Begrenzen von neuronalem Schaden, der mit einem Schlaganfall verbunden ist, nützlich sind, darstellen.
Es besteht auch ein Bedarf nach Verbindungen und Verfahren, die das Wachstum von Zellen und Geweben, die entsprechenden apoptotischen Signalen und auch zytotoxischen Wirkstoffen, die den Tod von unerwünschten (zum Beispiel Krebs) Zellen verursachen, entgangen sind, hemmen oder deren Tod fördern, indem man die apoptotische Kaskade auslöst. Weil Mitochondrien Vermittler von apoptotischen Ereignissen sind, würden im Besonderen Wirkstoffe, die von Mitochondrien vermittelte proapoptotische Ereignisse stimulieren, von speziellem Nutzen sein. Solche Wirkstoffe können für die Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen wie zum Beispiel Krebs und Psoriasis geeignet sein.
Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt weitere, damit in Beziehung stehende Vorteile bereit. Fachleute werden nach dem Lesen der Offenbarung weitere Vorteile und Gewinne der Erfindung erkennen.
Zusammenfassung der Erfindung
Kurz spezifiziert richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Behandlung einer arthritischen Funktionsstörung und/oder auf die Behandlung einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, indem einem warmblütigen Tier, welches dies benötigt, eine wirksame Menge einer Verbindung mit der folgenden allgemeinen Struktur (I):
einschließlich von Stereoisomeren, Propharmaka und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, wobei R₁ bis R₅ wie unten definiert sind, verabreicht wird.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Aryl-N-cyanoguanidinverbindung der Struktur (I) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, bereit. Gemäß anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln einer arthritischen Funktionsstörung bereit, indem einem Tier, welches dies benötigt, eine wirksame Menge einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht wird. Gemäß noch weiteren Ausführungsformen wird ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, bereitgestellt, das einem Tier, welches dies benötigt, Verabreichen einer wirksamen Menge einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung offensichtlich werden. Außerdem sind hier verschiedene Literaturzitate angegeben, die bestimmte Aspekte dieser Erfindung ausführlicher beschreiben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung mit einer Struktur
oder ein Stereoisomer, Acetat-, Formiat- oder Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon bereitgestellt, wobei R₃ Morpholinyl ist; und R₁, R₂, R₄ und R₅ gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten; oder R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsubstituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder substituierten kondensierten Heterocyclus bilden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verbindung mit einer Struktur
oder ein Stereoisomer, Acetat-, Formiat- oder Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon bereit, wobei R₁, R₂ und R₃ gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten; und R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsubstituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder kondensierten Heterocyclus bilden.
Kurze Beschreibung der Abbildung
1 veranschaulicht die Fähigkeit einer typischen Verbindung, von SIN-1 vermittelte Hemmung von mitochondrialer Atmung in TC28-Zeilen zu blockieren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es werden auch Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren, die bei der Behandlung von arthritischen Funktionsstörungen und/oder von Krankheiten, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, nützlich sind, offenbart. Spezieller haben die Verbindungen die folgende Struktur (I):
oder ein Stereoisomer, Propharmakon und pharmazeutisch annehmbares Salz davon,
wobei
R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten; oder R₃ zusammen mit R₄ oder R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsub stituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder substituierten kondensierten Heterocyclus bilden.
Die obigen Bezeichnungen haben die folgenden Bedeutungen:
„Alkyl" bedeutet einen geradkettigen oder verzweigten, nicht cyclischen oder cyclischen, ungesättigten oder gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff, der von 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, während die Bezeichnung „niederes Alkyl" dieselbe Bedeutung wie Alkyl hat, aber von 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Typische gesättigte, geradkettige Alkyle schließen Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, n-Pentyl oder n-Hexyl ein, während gesättigte, verzweigte Alkyle Isopropyl, sec-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl oder Isopentyl beinhalten. Typische gesättigte cyclische Alkyle beinhalten Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, -CHzCyclopropyl, -CH₂Cyclobutyl, -CH₂Cyclopentyl oder -CH₂Cyclohexyl; während ungesättigte cyclische Alkyle Cyclopentenyl und Cyclohexenyl einschließen. Cyclische Alkyle, die auch als „homocyclische Ringe" bezeichnet werden, schließen auch di- und polyhomocyclische Ringe wie zum Beispiel Decalin und Adamantyl ein: Ungesättigte Alkyle enthalten mindestens eine Doppel- oder Dreifachbindung zwischen zwei benachbarten Kohlenstoffatomen (als „Alkenyl" beziehungsweise „Alkinyl" bezeichnet). Typische geradkettige und verzweigte Alkenyle beinhalten Ethylenyl, Propylenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, Isobutylenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl oder 2,3-Dimethyl-2-Butenyl; während typische geradkettige und verzweigte Alkinyle Acetylenyl, Propinyl, 1-Butinyl, 2-Butinyl, 1-Pentinyl, 2-Pentinyl oder 3-Methyl-1-butinyl einschließen.
„Aryl" bedeutet eine aromatische, carbocyclische Komponente wie zum Beispiel Phenyl oder Naphthyl.
„Arylalkyl" bedeutet ein Alkyl, das mindestens eines der Alkyl-Wasserstoffatome durch eine Arylkomponente wie zum Beispiel Benzyl, -CH2-(1 oder 2-Naphthyl), -(CH2)2Phenyl, -(CH2)3Phenyl oder -CH(Phenyl)2 ersetzt hat.
„Heteroaryl" bedeutet einen aromatischen heterocyclischen Ring mit 5 bis 10 Ringatomen und mindestens einem Heteroatom, das aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt ist, welcher mindestens 1 Kohlenstoffatom enthält, einschließlich sowohl mono- als auch bicyclische Ringsysteme. Typische Heteroaryle beinhalten Furyl, Benzofuranyl, Thiophenyl, Benzothiophenyl, Pyrrolyl, Indolyl, Isoindolyl, Azaindolyl, Pyridyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Oxazolyl, Isooxazolyl, Benzoxazolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Benzimidazolyl, Thiazolyl, Benzothiazolyl, Isothiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Triazinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl oder Chinazolinyl.
„Heteroarylalkyl" bedeutet ein Alkyl, das mindestens ein Alkyl-Wasserstoffatom durch eine Heteroarylkomponente wie zum Beispiel -CH₂Pyridinyl oder -CH₂Pyrimidinyl ersetzt hat.
„Heterocyclus" (hier auch als ein „Heterocyclenring" bezeichnet) bedeutet einen monocyclischen Heterocyclenring mit 5 bis 7 Ringatomen oder einen polycyclischen Heterocyclenring mit 7 bis 14 Ringatomen, der entweder gesättigt, ungesättigt oder aromatisch ist und der von 1 bis 4 Heteroatome, die unabhängig voneinander aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind, enthält und worin die Stickstoff- und Schwefel-Heteroatome wahlweise oxidiert sein können und das Stickstoff-Heteroatom wahlweise quaternisiert sein kann, einschließlich bicyclischer Ringe, in denen jeder der obigen Heterocyclen an einen Benzolring kondensiert ist, und auch tricyclischer (und höherer) Heterocyclenringe. Der Heterocyclus kann durch jedes beliebige Heteroatom oder Kohlenstoffatom verbunden sein. Heterocyclen schließen Heteroaryle wie oben definiert ein. Somit schließen Heterocyclen zusätzlich zu den oben aufgeführten aromatischen Heteroarylen auch Morpholinyl, Pyrrolidinonyl, Pyrrolidinyl, Piperidinyl, Hydantoinyl, Valerolactamyl, Oxiranyl, Oxetanyl, Tetrahydrofuranyl, Tetrahydropyranyl, Tetrahydropyridinyl, Tetrahydroprimidinyl, Tetrahydrothiophenyl, Tetrahydrothiopyranyl, Tetrahydropyrimidinyl, Tetrahydrothiophenyl oder Tetrahydrothiopyranyl ein.
„Heterocycloalkyl" bedeutet ein Alkyl, das mindestens ein Alkyl-Wasserstoffatom durch einen Heterocyclus wie zum Beispiel -CH₂Morpholinyl ersetzt hat.
Die Bezeichnung „substituiert" bedeutet jede beliebige der obigen Gruppen (zum Beispiel Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl, Heterocyclus, Heterocycloalkyl usw.), in der mindestens ein Wasserstoffatom durch einen Substituenten ersetzt ist. Im Fall eines Keto-Substituenten („=O") sind zwei Wasserstoffatome ersetzt. Wenn substituiert ist, beinhalten Substituenten Halogen, Hydroxy, Cyano, Nitro, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Halogenalkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, Heteroaryl, substituiertes Heteroaryl, Heteroarylalkyl, substituiertes Heteroarylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl, substituiertes Heterocycloalkyl, -NR_aR_b, -NR_aC(=O)R_b, -NR_aC(=O)NR_aNR_b, -NR_aC(=O)OR_b, -NR_aSO₂R_b, -OR_a, -C(=O)R_a, -C(=O)OR_a, -C(=O)NR_aR_b, -OC(=O)NR_aR_b, -SH, -SR_a, -SOR_a, -S(=O)₂R_a, -OS(=O)₂R_a, -S(=O)₂OR_a, wobei R_a und R_b gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, Halogenalkyl, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, Heteroaryl, substituiertes Heteroaryl, Heteroarylalkyl, substituiertes Heteroarylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten. Zum Beispiel schließt substituiertes Alkyl Trifluormethyl ein.
„Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom und Iod.
„Halogenalkyl" bedeutet ein Alkyl, das mindestens ein Wasserstoffatom durch Halogen ersetzt hat, wie zum Beispiel Trifluormethyl.
„Alkoxy" bedeutet eine Alkylkomponente, die durch eine Sauerstoffbrücke (das heißt -O-Alkyl) verbunden ist, wie zum Methoxy, Ethoxy.
In einer genaueren Offenbarung stellen mindestens zwei von R₁ bis R₅ Wasserstoff dar, in einer anderen Offenbarung stellen mindestens drei von R₁ bis R₅ Wasserstoff dar und in einer noch anderen Offenbarung stellen mindestens vier von R₁ bis R₅ Wasserstoff dar.
In einer weiteren Offenbarung sind R₁ bis R₅ gleich oder voneinander verschieden und unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl, substituiertes Alkyl, Hydroxyl, Halogen oder Alkoxy, wobei typisches Alkyl Methyl beinhaltet, typisches Alkoxy Methoxy beinhaltet und typisches substituiertes Alkyl Trifluormethyl beinhaltet.
In einer anderen Offenbarung stellt mindestens einer von R₁ bis R₅ einen Heterocyclus wie zum Beispiel Morpholinyl dar.
In einer noch einer anderen Offenbarung bilden R₃ zusammen mit R₄ oder R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsubstituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder substituierten kondensierten Heterocyclus. Zum Beispiel haben im Fall eines unsubstituierten oder substituierten Aryls typische Verbindungen die folgende Struktur (II), wenn R₄ zusammen mit R₅ ein kondensiertes Aryl bildet, und Struktur (III), wenn R₃ zusammen mit R₄ ein kondensiertes Aryl bildet:
wobei der Anteil mit dem kondensierten Aryl von Struktur (II) oder (III) wahlweise mit einem oder mehreren Substituenten wie oben dargestellt substituiert sein kann.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit bekannten organischen Syntheseverfahren hergestellt werden, einschließlich der Verfahren, die in den Beispielen ausführlicher beschrieben werden. Im Allgemeinen können die Verbindungen dieser Erfindung mittels des folgenden Reaktionsschemas hergestellt werden: Reaktionsschema:
Im obigen Reaktionsschema wird N-Cyano-S-methylisothioharnstoff 1 in i-PrOH gelöst, gefolgt von der Zugabe von NaOH. Die resultierende Lösung wird erhitzt und dann abgekühlt, um das Salz Natriumdicyanamid 2 als Zwischenprodukt zu schaffen. Dieses Salz als Zwischenprodukt wird dann zu dem entsprechend substituierten Anilin 3 in HCl gegeben. Die Reaktionsmischung wird erhitzt; gekühlt und dann verdampft, um eine Verbindung der Struktur (I) als Rohprodukt, das dann gereinigt werden kann, um eine Verbindung der Struktur (I) mit der gewünschten Reinheit zu ergeben, hervorzubringen.
Wie oben erwähnt sind klinische Parameter und Kriterien zur Ermittlung des Vorliegens oder eines Risikos einer arthritischen Funktionsstörung gut etabliert (zum Beispiel Gilliland et al., „Disorders of the joints and connective tissue", Abschnitt 14, Harrison's Principles of Internal Medicine, achte Auflage, Thorn et al., Hrsg., McGraw-Hill, New York, NY, 1977, pp 2048–2080), wie auch Kriterien zur Ermittlung des Vorliegens oder eines Risikos einer Zahl von anderen Erkrankungen, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, gut etabliert sind, wie es hier auch dargelegt wird (zum Beispiel für AD McKhann et al., Neurology 34:939, 1984; DeKosky et al., Ann. Neurology 27(5):457–64, 1990; für Diabetes Gavin et al., Diabetes Care 22(suppl. 1):S5– S19, 1999; andere diagnostische Kriterien für Erkrankungen, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, werden Fachleuten vertraut sein und auf der Offenbarung hierin beruhen). „Veränderte mitochondriale Funktion" kann sich auf jeden Umstand oder Zustand, einschließlich derer, die gemäß nicht limitierender Theorie eine arthritische Funktionsstörung begleiten können, beziehen, wobei jede Struktur oder Aktivität, die direkt oder indirekt mit einer mitochondrialen Funktion in Zusammenhang steht, auf statistisch signifikante Art und Weise im Vergleich zu einer Kontrolle oder einem Standard geändert ist. Veränderte mitochondriale Funktion kann ihren Ursprung in extramitochondrialen Strukturen oder Ereignissen wie auch in mitochondrialen Strukturen oder Ereignissen, in direkten Interaktionen zwischen mitochondrialen und extramitochondrialen Genen und/oder ihren Genprodukten oder in strukturellen oder funktionellen Änderungen, die als Ergebnis von Interaktionen zwischen Zwischenprodukten, die als Ergebnis solcher Interaktionen gebildet werden können, einschließlich Metaboliten, Kataboliten, Substraten, Vorstufen oder Kofaktoren, auftreten, haben.
Zusätzlich kann veränderte mitochondriale Funktion veränderte respiratorische, metabolische oder andere biochemische oder biophysikalische Aktivität in einigen oder allen Zellen von einer biologischen Quelle beinhalten. Als Beispiele kann eine deutlich beeinträchtigte Aktivität der ETC in Beziehung zu veränderter mitochondrialer Funktion stehen, wie es auch die Bildung von vermehrten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder fehlerhafte oxidative Phosphorylierung kann. Als weitere Beispiele können verändertes mitochondriales Membranpotential (zum Beispiel PCT/US99/22261; PCT/US00117380), veränderte mitochondriale Regulation der intrazellulären Calciumhomöostase (zum Beispiel U.S. Patent Nr. 6.140.067), Auslösen apoptotischer Wege und Bildung von atypischen, chemischen und biochemischen vernetzten Arten innerhalb einer Zelle, ob durch enzymatische oder nicht enzymatische Mechanismen, alle als Beispiele für veränderte mitochondriale Funktion angesehen werden. Diese und andere Beispiele von veränderter mitochondrialer Funktion sind unten ausführlicher beschrieben.
Ohne durch Theorie gebunden sein zu wollen kann veränderte mitochondriale Funktion, die kennzeichnend für eine arthritische Funktionsstörung oder für eine andere Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion wie hier dargelegt verbunden ist, sein kann, auch durch andere Mechanismen als Oxidation durch freie Radikale, zum Beispiel durch Defekte in transmitochondrialen Membranvehikeln und Transportern wie zum Beispiel dem mitochondrialen Adenin-Nukelotidtransporter oder dem Malat- Aspartat-Shuttle, durch intrazellulären Calciumfluss, durch Fehler in der Biosynthese von ATP, durch gestörte Verbindung von Hexokinasen oder anderen Enzymen mit mitochondrialem Porin (auch zum Beispiel als spannungsabhängiger Anionenkanal, VDAC, bekannt) oder durch andere Ereignisse mit Verlust von mitochondrialem, elektrochemischen Membranpotential in Beziehung stehen. Ein solcher Zusammenbruch des mitochondrialen inneren Membranpotentials kann auf direkte oder indirekte Wirkungen von mitochondrialen Genen, Genprodukten oder verwandten nachgeschalteten Mediatormolekülen und/oder von extramitochondrialen Genen, Genprodukten oder verwandten nachgeschalteten Mediatoren oder auf andere bekannte oder unbekannte Ursachen zurückzuführen sein.
Als Hintergrund enthalten funktionsfähige Mitochondrien Genprodukte, für welche mitochondriale Gene, die sich in mitochondrialer DNA (mtDNA) befinden, und extramitochondriale Gene (zum Beispiel nukleäre Gene), die sich nicht auf dem zirkulären mitochondrialen Genom befinden, codieren. Die 16,5 kb lange mtDNA codiert für 22 tRNAs, zwei ribosomale RNAs (rRNA) und für 13 Enzyme der Elektronentransportkette (ETC), des komplizierten, aus vielen Komplexen bestehenden, mitochondrialen Gebildes, wo zum Beispiel die respiratorische oxidative Phosphorylierung stattfindet. Für die überwiegende Mehrheit der strukturellen und funktionellen mitochondrialen Proteine codieren extramitochondriale und in den meisten Fällen wahrscheinlich nukleäre Gene. Dementsprechend können mitochondriale und extramitochondriale Gene direkt oder indirekt über Genprodukte und ihre nachgeschalteten Zwischenprodukte einschließlich Metaboliten, Kataboliten, Substraten, Vorstufen oder Kofaktoren interagieren. Änderungen in der mitochondrialen Funktion, zum Beispiel beeinträchtigte Elektronentransportaktivität, fehlerhafte oxidative Phosphorylierung oder erhöhte Produktion von freien Radikalen können daher als Ergebnis von fehlerhafter mtDNA, von fehlerhafter extramitochondrialer DNA, von fehlerhaften mitochondrialen und extramitochondrialen Genprodukten, von fehlerhaften nachgeschalteten Zwischenprodukten oder von einer Kombination von diesen und anderen Faktoren entstehen.
Da die vorliegende Erfindung eine arthritische Funktionsstörung und/oder eine Erkrankung, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, betrifft, kann gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Ermittlung einer veränderten (zum Beispiel in statistisch signifikanter Art und Weise im Vergleich mit einer Kontrolle gesteigerten oder verminderten) mitochondrialen Funktion das Überwachen der intrazellulären Calciumhomöostase und/oder von zellulären Reaktionen auf Störungen dieser Homöostase einschließlich physiologischer und pathophysiologischer Calciumregulation mit sich bringen. Im Besonderen wird gemäß diesen Ausführungsformen eine zelluläre Reaktion auf erhöhtes intrazelluläres Calcium in einer biologischen Probe von einem Individuum, von dem man weiß oder vermutet, dass es eine mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbundene Krankheit hat, mit der Reaktion in einer biologischen Probe aus einem Kontrollindividuum verglichen. Der Bereich der zellulären Reaktionen auf erhöhtes intrazelluläres Calcium ist breit, ebenso wie der Bereich von Verfahren und Reagenzien für den Nachweis solcher Reaktionen. Fachleuten sind viele spezifische zelluläre Reaktionen bekannt; diese Reaktionen werden von den speziellen Zelltypen, die in einer ausgewählten biologischen Probe vorliegen abhängig sein. Als nicht limitierende Beispiele beinhalten zelluläre Reaktionen auf erhöhtes intrazelluläres Calcium die Sekretion spezieller sekretorischer Produkte, Exozytose bestimmter präformierter Bestandteile, gesteigerten Glycogenstoffwechsel und Zellproliferation (siehe zum Beispiel Clapham, Cell 80:259, 1995; Cooper, The Cell – A Molecular Approach, 1997 ASM Press, Washington, D.C.; Alberts, B., Bray, D. et al., Molecular Biology of the Cell, 1995 Garland Publishing, NY).
Als kurzer Hintergrund sind normale Änderungen von intramitochondrialem Ca²⁺ mit normaler Stoffwechselregulation verbunden (Dykens, 1998 in Mitochondria & Free Radicals in Neurodegenerative Diseases, Beal, Howell und Bodis-Wollner, Hrsg., Wiley-Liss, New York, pp. 29–55; Radi et al., 1998 in Mitochondria & Free Radicals in Neurodegenerative Diseases, Beal, Howell und Bodis-Wollner, Hrsg., Wiley-Liss, New York, pp. 57–89; Gunter und Pfeiffer, Am. J. Physiol. 27:C755, 1991; Gunter et al., Am. J. Physiol. 267:313, 1994). Zum Beispiel können fluktuierende Spiegel von mitochondrialem freien Ca²⁺ über allosterische Regulation von Enzymen (Übersichtsarbeit von Crompton et al., Basic Res. Cardiol. 88, 513–23, 1993) und des Glycerophosphat-Shuttles (Gunter et al., J. Bioenerg. Biomembr. 26:471, 1994) für die Regulation des oxidativen Stoffwechsels als Reaktion auf erhöhte Verwertung von ATP verantwortlich sein.
Eine normale mitochondriale Funktion beinhaltet die Regulation der Spiegel von freiem Calcium im Zytosol durch Sequestrierung von überschüssigem Ca²⁺ innerhalb der mitochondrialen Matrix. Abhängig vom Zelltyp beträgt die Konzentration von Ca²⁺ im Zytosol üblicherweise 50–100 nM. Wenn die Ca²⁺-Spiegel 200–300 nM erreichen, beginnen in normal funktionierenden Zellen Mitochondrien, Ca²⁺ als Funktion des Gleichgewichts zwischen Einstrom über einen Ca²⁺-Uniporter in der inneren mitochondrialen Membran und Ca²⁺-Ausstrom sowohl über Na⁺-abhängige als auch über Na⁺-unabhängige Calciumträger zu akkumulieren. Unter bestimmten Umständen ist eine Störung der intrazellulären Calciumhomöostase ein Merkmal von Krankheiten, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, gleichgültig ob die Dysfunktion des Calciumregulation die Ursache oder eine Folge der veränderten mitochondrialen Funktion ist.
So können sich, wie oben beschrieben, erhöhte mitochondriale Calciumspiegel als Reaktion auf eine ursprüngliche Erhöhung des freien Calciums im Zytosol bilden. Solche erhöhten mitochondrialen Calciumkonzentrationen können in Kombination mit vermindertem ATP oder anderen Umständen, die mit pathologischen mitochondrialen Verhältnissen verbunden sind, zum Zusammenbruch des mitochondrialen inneren Membranpotentials führen (siehe Gunter et al., Biochim. Biophys. Acta 1366:5, 1998; Rottenberg und Marbach, Biochim. Biophys. Acta 1016:87, 1990). Im Allgemeinen ist der extramitochondriale (der im Zytosol vorhandene) Ca²⁺-Spiegel in einer biologischen Probe höher als derjenige, der innerhalb der Mitochondrien vorliegt. Im Fall einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, können die Calciumspiegel in den Mitochondrien und im Zytosol von den obigen Bereichen abweichen und können von beispielsweise etwa 1 nM bis etwa 500 mM reichen, typischer von etwa 10 nM bis etwa 100 μM und üblicherweise von etwa 20 nM bis etwa 1 μM, wobei „etwa" ± 10 % bezeichnet. Im Fachgebiet ist eine Reihe von Calciumindikatoren bekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf beispielsweise fura-2 (McCormack et al., Biochim. Biophys. Acta 973:420, 1989); mag-fura-2; BTC (U.S. Patent Nr. 5.501.980); fluo-3, fluo-4 und fluo-5N (U.S. Patent Nr. 5.049.673); rhod-2; benzothiaza-1 und benzothiaza-2 (alle davon sind von Molecular Probes, Eugene, OR, erhältlich). Diese und jegliche anderen Mittel zum Überwachen von intrazellulärem Calcium werden zum Ermitteln des Vorliegens einer veränderten mitochondrialen Funktion in Erwägung gezogen (siehe zum Beispiel PCT/US01/01500).
Somit sind Fachleuten Verbindungen, die erhöhte zytoplasmatische und mitochondriale Konzentrationen von Ca²⁺ hervorrufen, einschließlich Calciumionophore, zum Ermitteln einer veränderten mitochondrialen Funktion, die als zelluläre Antwort auf erhöhtes intrazelluläres Calcium offenkundig ist, gut bekannt, wie es auch Verfahren zum Messen von intrazellulärem Calcium sind (siehe zum Beispiel Gunter und Gunter, J. Bioenerg. Biomembr. 26:471, 1994; Gunter et al., Biochim. Biophys. Acta 1366:5, 1998; McCormack et al., Biochim. Biophys. Acta 973:420, 1989; Orrenius und Nicotera, J. Neural. Transm. Suppl. 43:1, 1994; Leist und Nicotera, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 132:79, 1998 und Haugland, 1996, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals – Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, OR). Dementsprechend kann ein Fachmann leicht ein geeignetes Ionophor (oder eine andere Verbindung, die zu erhöhten zytoplasmatischen und/oder mitochondrialen Konzentrationen von Ca²⁺ führt) und ein geeignetes Mittel zum Nachweisen von intrazellulären Calcium zur Verwendung beim Erkennen einer veränderten mitochondrialen Funktion gemäß dieser Offenbarung und gut bekannten Verfahren auswählen.
Der Einstrom von Ca²⁺ in Mitochondrien scheint zum größten Teil von dem negativen elektrochemischen Transmembranpotential (ΔΨ), das mittels Elektronentransfers an der inneren mitochondrialen Membran aufgebaut ist, abhängig zu sein und kann auch vollständig davon abhängig sein. In Abwesenheit eines ΔΨ kann ein solcher Einstrom nicht auftreten, auch wenn ein achtfacher Konzentrationsgradient von Ca²⁺ angelegt wird (Kapus et al., 1991 FEBS Lett. 282:61). Dementsprechend können Mitochondrien Ca²⁺ freisetzen, wenn das Membranpotential abgebaut ist, wie es mit Entkopplern wie 2,4-Dinitrophenol und Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) erfolgt. Somit kann gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung der Zusammenbruch von ΔΨ durch Einströme von freiem Calcium aus dem Zytosol in die Mitochondrien ermöglicht werden, wie es unter bestimmten physiologischen Bedingungen einschließlich derjenigen, die bei Zellen eines Individuums, das eine arthritische Funktionsstörung hat, angetroffen werden, erfolgen kann. Der Nachweis eines solchen Zusammenbruchs kann durch eine Reihe von Mitteln wie hier dargelegt bewerkstelligt werden.
In bestimmten verwandten Ausführungsformen der Erfindung kann ein verändertes (zum Beispiel in statistisch signifikanter Art und Weise im Vergleich mit einer Kontrolle gesteigertes oder vermindertes) Membranpotential einen Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion darstellen. Typischerweise kann das mitochondriale Membranpotential gemäß Verfahren, mit denen Fachleute leicht vertraut sein werden, bestimmt werden, einschließlich des Nachweises und/oder der Messung nachweisbarer Verbindungen wie zum Beispiel fluoreszierender Indikatoren, optischer Sonden und/oder sensitiver pH- und ionenselektiver Elektroden (siehe zum Beispiel Ernster et al., J. Cell Biol. 91:227s, 1981 und zitierte Literaturstellen; siehe auch Haugland, 1996, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals – Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, OR, pp. 266–274 und 589–594). Zum Beispiel können als Veranschaulichung die fluoreszierenden Sonden 2-,4-Dimethylaminostyryl-N-methyl-pyridinium (DASPMI) und Tetramethylrhodaminester (wie zum Beispiel Tetramethylrhodaminmethylester, TMRM; Tetramethylrhodaminethylester, TMRE) oder verwandte Verbindungen (siehe zum Beispiel Haugland, 1996, oben zitiert) nach Akkumulation in Mitochondrien, einem Prozess, der abhängig vom und proportional zum mitochondrialen Membranpotential ist (siehe zum Beispiel Murphy et al., 1998 in Mitochondria & Free Radicals in Neurodegenerative Diseases, Beal, Howell und Bodis-Wollner, Hrsg., Wiley-Liss, New York, pp. 159–186 und darin zitierte Literaturstellen und Molecular Probes On-line Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals unter httpa/www.probes.com/handbook/toc.html), quantifiziert werden. Andere fluoreszierende nachweisbare Verbindungen, die mit der Erfindung verwendet werden können, beinhalten Rhodamin 123, Rhodamin-B-Hexylester, DiOC₆(3), JC-1 [5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1',3,3'-Tetraethylbenzimidazolcarbocyanin-iodid] (siehe Cossarizza et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 197:40, 1993; Reers et al., Meth. Enzymol. 260:406, 1995), rhod-2 (siehe U.S. Patent Nr. 5.049.673; alle der vorstehenden Verbindungen sind von Molecular Probes, Eugene, Oregon, erhältlich) und Rhodamin 800 (Lambda Physik, GmbH, Göttingen, Deutschland; siehe Sakanoue et al., J. Biochem. 121:29, 1997). Verfahren zum Überwachen von mitochondrialem Membranpotential sind auch in der U.S. Anmeldung Nr. 09/161.172 offenbart.
Mitochondriales Membranpotential kann auch durch nicht fluoreszierende Mittel, zum Beispiel unter Verwendung von TTP (Tetraphenylphosphoniumion) und einer TTP-sensitiven Elektrode (Kamo et al., J. Membrane Biol. 49:105, 1979; Porter und Brand, Am. J. Physiol. 269:R1213, 1995) gemessen werden. Fachleute werden in der Lage sein, geeignete nachweisbare Verbindungen oder andere geeignete Mittel zum Messen von ΔΨm auszuwählen. Als Beispiel und nicht als Einschränkung ist TMRM in gewisser Weise dem TMRE vorzuziehen, weil TMRE nach dem Ausstrom aus Mitochondrien ein wenig mehr Restsignal im endoplasmatischen Retikulum und im Zytoplasma ergibt als TMRM.
Als weiteres Beispiel kann das Membranpotential zusätzlich oder alternativ aus indirekten Messungen der mitochondrialen Permeabilität für nachweisbare, geladene, gelöste Substanzen unter Verwendung des Matrixvolumens und/oder von Pyridinnukleotid-Redoxbestimmung in Kombination mit spektrophotometrischer oder fluorimetrischer Quantifizierung berechnet werden. Die Messung von Substrataustausch oder -diffusion, der oder die vom Membranpotential abhängig ist, über die innere mitochondriale Membran kann auch eine indirekte Messung des Membranpotentials liefern. (Siehe zum Beispiel Quinn, 1976, The Molecular Biology of Cell Membranes, University Park Press, Baltimore, Maryland, pp. 200–217 und darin zitierte Literaturstellen.)
Eine außerordentliche Empfindlichkeit gegenüber außergewöhnlichen mitochondrialen Ansammlungen von Ca²⁺, die auf eine Erhöhung von intrazellulärem Calcium wie oben beschrieben zurückzuführen sind, kann auch eine Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, kennzeichnen. Zusätzlich kann eine Reihe von physiologisch entsprechenden Wirkstoffen einschließlich Hydroperoxid und freien Radikalen mit Ca²⁺ zusammenwirken, um einen Zusammenbruch von ΔΨ hervorzurufen (Novgorodov et al., Biochem. Biophys. Acta 1058:242, 1991; Takeyama et al., Biochem. J. 294:719, 1993; Guidox et al., Arch. Biochem. Biophys. 306:139, 1993). Dementsprechend beinhalten Beispiele von Verfahren zum Nachweisen einer veränderten mitochondrialen Funktion, die in zellulären Reaktionen auf erhöhtes intrazelluläres Calcium oder als verändertes mitochondriales Membranpotential manifestiert ist, Untersuchungen des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨ_m) (in der mit anhängigen U.S. Patentanmeldung laufende Nr. 60/140.433 beschrieben) und Untersuchungen des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs (MPT) (in der mitanhängigen U.S. Patentanmeldung laufende Nr. 09/161.172 beschrieben).
Eine veränderte mitochondriale Funktion kann auch festgestellt werden, indem man eine zelluläre Reaktion auf einen Stimulus, der Apoptose auslöst („apoptogen"), in einer biologischen Probe von (i) einer Testperson, von der man annimmt, dass sie das Risiko für eine Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, trägt, und (ii) einer Kontrollperson vergleicht. Der Bereich zellulärer Reaktionen auf verschiedene bekannte apoptogene Stimuli ist weit, wie es auch der Bereich von Verfahren und Reagenzien für den Nachweis solcher Reaktionen ist. Es ist daher in Erwägung der vorliegenden Erfindung, eine Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, nachzuweisen, indem man eine zelluläre Reaktion auf einen apoptogenen Stimulus so vergleicht, wobei eine solche Reaktion ein Indikator für eine veränderte mitochondriale Funktion wie hier dargelegt ist.
Wie oben erwähnt können mitochondriale Dysfunktion und/oder damit in Beziehung stehende erhöhte Spiegel von ROS in verschiedenen Zelltypen frühe Ereignisse, die zu Apoptose führen, auslösen (Kroemer et al., FASEB J. 9:1277–87, 1995; Zamzami et al., J. Exp. Med. 182:367–77, 1995; Zamzami et al., J. Exp. Med. 181:1661–72, 1995; Ausserer et al., Mol. Cell. Biol. 14:5032–42, 1994). In verschiedenen Zelltypen geht eine Verringerung des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) dem Abbau der DNA im Kern, der mit Apoptose einhergeht, voraus. In zellfreien Systemen können mitochondriale, aber nicht nukleäre, angereicherte Fraktionen nukleäre Apoptose auslösen (Newmeyer et al., Cell 70:353–64, 1994). Eine Störung der mitochondrialen respiratorischen Aktivität, die zu veränderten zellulären, metabolischen Zuständen führt, wie zum Beispiel erhöhte intrazelluläre ROS, kann bei einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, auftreten und kann weiter über apoptotische Mechanismen pathogene Ereignisse auslösen.
Oxidativ gestresste Mitochondrien können einen präformierten, löslichen Faktor, der chromosomale Kondensation, ein Ereignis, das der Apoptose vorausgeht, auslösen kann, freisetzen (Marchetti et al., Cancer Res. 56:2033–38, 1996). Außerdem befinden sich Mitglieder der BcI-2-Familie von Antiapoptose-Genprodukten in der äußeren mitochondrialen Membran (Monaghan et al., J. Histochem. Cytochem. 40:1819–25, 1992) und diese Proteine scheinen Membranen vor oxidativem Stress zu schützen (Korsmeyer et al., Biochim. Biophys. Act. 1271:63, 1995). Lokalisierung von BcI-2 an diese Membran scheint für eine Modulation von Apoptose unerlässlich zu sein (Nguyen et al., J. Biol. Chem. 269:16521–24, 1994). Somit können Veränderungen in der mitochondrialen Physiologie wichtige Mediatoren von Apoptose sein.
Veränderte mitochondriale Funktion, wie sie gemäß der vorliegenden Offenbarung verwendet werden kann, um ein Risiko für eine Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, bei einer Testperson zu erkennen, kann daher den Schwellenwert für das Einleiten von Apoptose durch ein Apoptogen erniedrigen. Fachleuten ist eine Reihe von Apoptogenen bekannt (siehe zum Beispiel Green et al., Science 281:1309, 1998 und darin zitierte Literaturstellen) und kann als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung Apoptogene beinhalten, welche, wenn sie unter geeigneten Bedingungen, mit denen Fachleute vertraut sein werden, zu Zellen gegeben werden, spezielle Rezeptoren wie zum Beispiel die Tumornekrosefaktor-, FasL-, Glutamat-, NMDA-, IL-1-, IL-3-, Corticosteron-, Mineralcorticoid- oder Glucocorticoidrezeptoren benötigen. Apoptogene können weiterhin Herbimycin A (Mancini et al., J. Cell. Biol. 138:449–69, 1997); Paraquat (Costantini et al., Toxicology 99:1–2, 1995); Ethylenglycole; Proteinkinase-Inhibitoren wie zum Beispiel Staurosporin, Calphostin C, Kaffeesäurephenethylester, Chelerythrinchlorid, Genistein; 1-(5-Isochinolinsulfonyl)-2-methlypiperazin; N-[2-((p-Bromcinnamyl)amino)ethyl]-5-5-isochinolinsulfonamid; KN-93; Quercitin; d-Erythro-sphingosin-Derivate; UV-Strahlung; Ionophore wie zum Beispiel Ionomycin, Valinomycin und andere, im Fachgebiet bekannte Ionophore; Induktoren der MAP-Kinase wie zum Beispiel Anisomycin und Anandamin; Zellzyklusblocker wie zum Beispiel Aphidicolin, Colcemid, 5-Fluoruracil und Homoharringtonin; Inhibitoren der Acetylcholinesterase wie zum Beispiel Berberin; Antiöstrogene wie zum Beispiel Tamoxifen; Prooxidantien wie zum Beispiel tert-Butylhydroperoxid, Peroxynitrit, Wasserstoffperoxid und Stickoxid-Donatoren einschließlich aber nicht beschränkt auf L-Arginin, 5,5'-Dinitrosodithiol, N-Hydroxy-L-arginin, S-Nitroso-N-acetylpenicillamin, S-Nitrosoglutathion, NOR-1, NOR-3, NOR4, 4-Phenyl-3-furoxancarbonitril, 3-Morpholinosydnonimin, Natriumnitroprussid und Streptozotocin; Glutathion abreichernde Wirkstoffe wie zum Beispiel Etacrynsäure (Meister, Biochim. Biophys. Acta, 1271:35, 1995); freie Radikale wie zum Beispiel Stickoxid; anorganische Metallionen wie zum Beispiel Cadmium, Inhibitoren der DNA-Synthese wie zum Beispiel Actinomycin D, Stoffe, die in DNA interkalieren wie zum Beispiel Doxorubicin, Bleomycinsulfat, Hydroxyharnstoff, Methotrexat, Mitomycin C, Camptothecin und Daunorubicin; Inhibitoren der Proteinsynthese wie zum Beispiel Cycloheximid, Puromycin und Rapamycin; Wirkstoffe, die sich auf die Bildung oder Stabilität von Mikrotubuli auswirken, wie zum Beispiel Vinblastin, Vincristin, Colchicin, 4-Hydroxyphenylretinamid und Paclitaxel; und andere Induktoren des MPT wie zum Beispiel, Bax Protein (Jurgenmeier et al., PNAS 95:4997–5002, 1998), Calcium und anorganisches Phosphat (Kroemer et al., Ann. Rev. Physiol. 60:619, 1998) beinhalten.
Zellen in einer biologischen Probe, von denen man vermutet, dass sie Apoptose unterliegen, können auf morphologische Veränderungen, Permeabilitätsänderungen und auf andere Veränderungen, die für einen apoptotischen Zustand kennzeichnend sind, untersucht werden. Zum Beispiel und als Veranschaulichung kann Apoptose in vielen Zelltypen ein verändertes morphologisches Erscheinungsbild verursachen, wie zum Beispiel Bläschenbildung („blebbing") der Plasmamembran, Änderung der Zellform, Verlust von Substratadhäsionseigenschaften oder andere morphologische Veränderungen, die von einem Fachmann zum Beispiel unter Einsatz von Lichtmikroskopie leicht festgestellt werden können. Als weiteres Beispiel können Zellen, die der Apoptose unterliegen, Fragmentierung und Zerfall von Chromosomen zeigen, was mittels Mikroskopie und/oder der Verwendung von für DNA oder für Chromatin spezifischen Farbstoffen, die im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich fluoreszierender Farbstoffe ersichtlich werden kann. Solche Zellen können auch veränderte Eigenschaften der Permeabilität der Plasmamembran aufweisen, was leicht durch die Verwendung von Vitalfarbstoffen (zum Beispiel Propidiumiodid, Trypanblau) oder durch den Nachweis des Austretens von Lactatdehydrogenase in das extrazelluläre Milieu festgestellt werden kann. Diese und andere Mittel zum Erkennen von apoptotischen Zellen mittels morphologischer Kriterien, veränderter Permeabilität der Plasmamembran und zugehöriger Veränderungen werden Fachleuten ersichtlich sein.
Alternativ können Zellen in einer biologischen Probe, wenn der Indikator der veränderten mitochondrialen Funktion eine zelluläre Reaktion auf ein Apoptogen ist, auf eine Translokation von Phosphatidylserin (PS) der Zellmembran aus der inneren Lage in die äußere Lage der Plasmamembran untersucht werden, was zum Beispiel durch. Messen der Bindung der äußeren Lage durch das für PS spezifische Protein Annexin festgestellt werden kann. (Martin et al., J. Exp. Med. 182:1545, 1995; Fadok et al., J. Immunol. 148:2207, 1992.) In noch einem anderen Verfahren zum Ermitteln von veränderter mitochondrialer Funktion durch Überwachen einer zellulären Reaktion auf ein Apoptogen wird die zelluläre Reaktion auf das Apoptogen durch eine Untersuchung auf Induktion spezifischer Proteaseaktivität in jedem Mitglied einer Familie von Proteasen, die durch Apoptose aktiviert werden und als das Caspasen bekannt sind, bestimmt (siehe zum Beispiel Green et al., Science 281:1309, 1998). Fachleute werden leicht mit Verfahren zum Bestimmen von Caspase-Aktivität vertraut sein, zum Beispiel durch Bestimmen von durch Caspase vermittelter Spaltung von spezifisch erkannten Proteinsubstraten. Diese Substrate können zum Beispiel poly-(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) oder andere natürlich vorkommende oder synthetische Peptide und Proteine, die von Caspasen gespalten werden und im Fachgebiet bekannt sind, beinhalten (siehe zum Beispiel Ellerby et al., J. Neurosci. 17:6165, 1997). Das synthetische Peptid Z-Tyr-Val-Ala-Asp-AFC (SEQ ID NO:_;), wobei „Z" eine Benzoylcarbonylkomponente bedeutet und AFC 7-Amino-4-trifluormethylcumarin bedeutet (Kluck et al, Science 275:1132, 1997; Nicholson et al., Nature 376:37, 1995), ist ein solches Substrat. Andere Beispiele von Substraten beinhalten nukleäre Proteine wie zum Beispiel U1-70 kDa und DNA-PKcs (Rosen und Casciola-Rosen, J. Cell. Biochem. 64:50, 1997; Cohen, Biochem. J. 326:1, 1997).
Wie oben beschrieben kann die innere mitochondriale Membran eine in hohem Maße selektive und geregelte Permeabilität für viele kleine gelöste Stoffe aufweisen, ist aber für große (>~ 10 kDa) Moleküle undurchlässig. (Siehe zum Beispiel Quinn, 1976, The Molecular Biology of Cell Membranes, University Park Press, Baltimore, Maryland). In Zellen, die der Apoptose unterliegen, kann hingegen der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials von einer erhöhten Permeabilität, welche eine Diffusion von Makromolekülen über die mitochondriale Membran erlaubt, begleitet sein. Somit kann in einem anderen Verfahren zum Untersuchen einer zellulären Reaktion auf ein Apoptogen ein Nachweis eines mitochondrialen Proteins, zum Beispiel von Cytochrom c oder eines Proteins des Raums zwischen den Membranen, das aus Mitochondrien in apoptotischen Zellen ausgetreten ist, den Beweis für eine Reaktion auf ein Apoptogen liefern, was leicht festgestellt werden kann. (Liu et al., Cell 86:147, 1996.) Ein solcher Nachweis von Cytochrom c kann spektrophotometrisch, immunchemisch oder durch andere, gut etablierte Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens eines bestimmten Proteins erbracht werden.
Zum Bespiel kann der Freisetzung von Cytochrom c aus Zellen, die mit apoptotischen Stimuli (zum Beispiel Ionomycin, ein gut bekanntes Ionophor für Calcium) belastet wurden, eine Reihe immunologischer Verfahren folgen. Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/-Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF) Massenspektrometrie mit Affinitätsreinigung gekoppelt ist besonders für eine solche Untersuchung geeignet, da Apo-Cytochrom c und Holo-Cytochrom c auf der Grundlage ihrer eindeutigen Molekulargewichte unterschieden werden können. Zum Beispiel kann das oberflächenaktivierte Laserdesorptions-/-ionisations (SELDI^TM) System (Ciphergen, Palo Alto, California) eingesetzt werden, um die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien in Zellen, die mit einem Apoptogen behandelt wurden, zu erfassen. In diesem Ansatz wird ein spezifischer Antikörper gegen Cytochrom c, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, verwendet, um freigesetztes Cytochrom c, das in einem löslichen Zellextrakt vorliegt, zu erfassen. Das erfasste Protein wird dann in eine Matrix eines Energieabsorptionsmoleküls (EAM) eingeschlossen und wird von der Oberfläche des festen Trägers mittels gepulster Laserexzitation desorbiert. Die Molekularmasse des Proteins wird durch seine Flugzeit zum Detektor des SELDI^TM-Massenspektrometers bestimmt.
Ein Fachmann wird leicht verstehen, dass es andere geeignete Verfahren zum Quantifizieren von Apoptose geben kann, und solche Verfahren zu Zwecken des Ermittelns veränderter mitochondrialer Funktion, wie sie in einer zellulären Reaktion auf einen apoptogenen Stimulus hin offenkundig ist, sind innerhalb des Umfangs der Verfahren, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden.
Der Nachweis von Produktion von freien Radikalen in einer biologischen Probe kann auch dazu eingesetzt werden, das Vorliegen einer veränderten mitochondrialen Funktion in einer biologischen Probe von einer Versuchsperson festzustellen. Obwohl Mitochondrien eine Hauptquelle von freien Radikalen in biologischen Systemen sind (siehe zum Beispiel Murphy et al., 1998 in Mitochondria & Free Radicals in Neurodegenerative Diseases, Beal, Howell und Bodis-Wollner, Hrsg., Wiley-Liss, New York, pp. 159–186 und darin zitierte Literaturstellen), sollte die Erfindung nicht so eingeschränkt sein und die Produktion von freien Radikalen kann ungeachtet des jeweiligen subzellulären Herkunftsortes ein Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion sein. Zum Beispiel sind zahlreiche intrazelluläre biochemische Wege, die durch Produktion von Metaboliten wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid, Stickoxid oder Superoxidradikalen über Reaktionen, die von Enzymen wie zum Beispiel mit Flavin verbundene Oxidasen, Superoxid-Dismutase oder Stickoxidsynthetase katalysiert werden, zur Bildung von Radikalen führen, im Fachgebiet bekannt, wie es auch Verfahren zum Nachweisen solcher Radikale sind (siehe zum Beispiel Kelver, Crit. Rev. Toxicol. 23:21, 1993; Halliwell B. et al., Free Radicals in Biology and Medicine, 1989, Clarendon Press, Oxford, UK; Davies, K.J.A. et al., The Oxygen Paradox, Cleup Univ. Press, Padova, IT). Eine veränderte mitochondriale Funktion wie zum Beispiel eine Störung bei jedem beliebigen Schritt der ETC kann auch zur Bildung von hochgradig reaktiven, freien Radikalen führen. Wie oben erwähnt beinhalten Radikale, die sich aus einer veränderten mitochondrialen Funktion ergeben, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), zum Beispiel Superoxid-, Peroxynitrit- und Hydroxylradikale und möglicherweise andere reaktive Spezies, die für Zellen toxisch sein können. Dementsprechend kann in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ein Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion eine nachweisbare Spezies von freien Radikalen, die in einer biologischen Probe vorliegt, sein. In bestimmten, besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das nachweisbare freie Radikal eine ROS sein.
Verfahren zum Nachweisen eines freien Radikals, die als Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion von Nutzen sein können, sind im Fachgebiet bekannt und werden vom jeweiligen Radikal abhängen. Üblicherweise kann der Grad der Produktion von freien Radikalen in einer biologischen Probe gemäß Verfahren, mit denen Fachleute leicht vertraut sein werden, bestimmt werden, einschließlich des Nachweises und/oder der Messung von: Glykoxidationsprodukten einschließlich Pentosidin, Carboxymethyllysin und Pyrrolin; Lipoxidationsprodukten einschließlich Glyoxal, Malondialdehyd und 4-Hydroxynonenal; Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS; siehe zum Beispiel Steinbrecher et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:3883, 1984; Wolff, Br. Med Bull. 49:642, 1993) und/oder anderer chemischer Nachweismittel wie zum Beispiel das Einfangen von Hydroxylradikalen mittels Salicylat (zum Beispiel Ghiselli et al., Meths. Mol. Biol. 108:89, 1998; Halliwell et al., Free Radic. Res. 27:239, 1997) oder der Bildung spezifischer Addukte (siehe zum Beispiel Mecocci et al., Ann. Neurol. 34:609, 1993; Giulivi et al., Meths. Enzymol. 233:363, 1994) einschließlich der Bildung von Malondialdehyd, Protein-Nitrosylierung, DNA-Oxidation einschließlich der Oxidation von mitochondrialer DNA, 8'-OH-Guanosin-Addukte (zum Beispiel Beckman et al., Mutat. Res. 424:51, 1999), Proteinoxidation, Protein-Carbonyl-Modifikation (zum Beispiel Baynes et al., Diabetes 40:405, 1991; Baynes et al., Diabetes 48:1, 1999); Elektronenspinresonanz (ESR) Sonden, cyclische Voltametrie; Fluoreszenz- und/oder Chemolumineszenzindikatoren (siehe auch zum Beispiel Greenwald, R.A. (Hrsg.), Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, 1985, CRC Press, Boca Raton, FL; Acworth und Bailey, (Hrsg.), Handbook of Oxidative Metabolism, 1995, ESA, Inc., Chelmsford, MA; Yla-Herttuala et al., J. Clin. Invest. 84:1086, 1989; Velazques et al., Diabetic Medicine 8:752, 1991; Belch et al., Int. Angiol. 14:385, 1995; Sato et al., Biochem. Med. 21:104, 1979; Traverso et al., Diabetologia 41:265, 1998; Haugland, 1996, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals – Sixth Ed., Molecular Probes, Eugene, OR, pp. 483–502, und darin zitierte Literaturstellen). Zum Beispiel kann als Veranschaulichung die Oxidation der fluoreszierenden Sonden Dichlordihydrofluorescein-diacetat und seines carboxylierten Derivats Carboxydichlordihydrofluorescein-diacetat (siehe zum Beispiel Haugland, 1996, oben zitiert) nach der Akkumulation in Zellen quantifiziert werden, ein Prozess, der von dem Vorliegen reaktiver Sauerstoffspezies abhängig ist und dazu proportional ist (siehe auch zum Beispiel Molecular Probes On-line Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals unter httg://www.grobes.com/handbook/toc.html). Andere fluoreszierende, nachweisbare Verbindungen, die im Rahmen der Erfindung zum Nachweis der Produktion freier Radikale verwendet werden können, schließen Dihydrorhodamin und Dihydrorosaminderivate, cis-Parinarsäure, Resorufinderivate, Lucigenin und jegliche andere geeignete Verbindung, die Fachleuten bekannt sein kann, ein.
So kann, wie ebenfalls oben beschrieben, ein von freien Radikalen vermittelter Schaden eines oder mehrere der unzähligen Proteine der ETC inaktivieren und kann damit den mitochondrialen chemoosmotischen Mechanismus, der für die oxidative Phosphorylierung und die Produktion von ATP verantwortlich ist, entkoppeln. Indikatoren einer veränderten mitochondrialen Funktion, die Faktoren der Biosynthese von ATP darstellen, sind zum Beispiel in PCT/US00/25317 und im U.S. Patent Nr. 6.140.067 ausführlicher beschrieben. Von freien Radikalen vermittelter Schaden an der mitochondrialen funktionalen Integrität ist auch nur ein Beispiel von vielen Mechanismen, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, welches zum Zusammenbruch des elektrochemischen Potentials, das von der inneren mitochondrialen Membran aufrechterhalten wird, führen kann. Verfahren zum Nachweisen von Veränderungen am inneren mitochondrialen Membranpotential sind oben und in der mitanhängigen U.S. Patentanmeldung Nummer 09/161.172 beschrieben.
Biologische Proben können jedes Gewebe oder jede Aufbereitung von Zellen, in der mindestens ein Kandidat für einen Indikator von veränderter mitochondrialer Funktion nachgewiesen werden kann, umfassen und können sich in ihrer Natur dementsprechend unterscheiden, abhängig von dem jeweiligen Indikator (den jeweiligen Indikatoren), der (die) verglichen werden soll(en). Somit wird es für Fachleute auf der Grundlage der hier dargelegten Offenbarung offensichtlich sein, dass in bestimmten, in hohem Maß bevorzugten Ausführungsformen biologische Proben Zellen oder Aufbereitungen von Zellen, die Mitochondrien enthalten, umfassen und in bestimmten, anderen Ausführungsformen biologische Proben submitochondriale Partikel umfassen können. Biologische Proben können bereitgestellt werden, indem eine Blutprobe, eine Probe für eine Biopsie, eine Gewebsexplantat, eine Organkultur oder jedes andere Gewebe oder jede andere Zellaufbereitung einem Individuum oder einer biologischen Quelle entnommen wird. Das Individuum oder die biologische Quelle kann ein Mensch oder ein nicht menschliches Tier, eine primäre Zellkultur oder eine kulturadaptierte Zelllinie sein, einschließlich gentechnologisch behandelter Zelllinien, die in Chromosomen integrierte oder episomal vorliegende rekombinante Nukleinsäuresequenzen enthalten können, immortalisierter Zelllinien und solcher, die immortalisiert werden können, somatischer Zellhybridlinien oder zytoplasmatischer Hybrid-, „Cybrid"-, Zelllinien, differenzierter oder differenzierbarer Zelllinien oder transformierter Zelllinien. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Individuum oder die biologische Quelle ein Mensch oder ein nicht menschliches Wirbeltier und in anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Individuum oder die biologische Quelle eine von einem Wirbeltier stammende primäre Zellkultur oder eine kulturadaptierte Zelllinie wie hier dargelegt. Als ein Beispiel im Wege der Veranschaulichung betrachtet die Erfindung in bestimmten Ausführungsformen eine biologische Probe, bei der es sich um Gewebe, das nicht von einem Wirbeltier stammt, oder um eine Aufbereitung von Zellen handeln kann, welche künstlich manipuliert worden ist, zum Beispiel durch rekombinante genetische Manipulation, damit sie ein oder mehrere von Wirbeltieren stammend(e) Gen(e), Genprodukte oder Ähnliches wie zum Beispiel mitochondriale molekulare Bestandteile und/oder Faktoren der Biosynthese von ATP, wie zum Beispiel in PCT/US00/25317 und im U.S. Patent Nr. 6.140.067 bereitgestellt, enthält. Zum Beispiel kann eine Anzahl von Hefe- und Insektenzelllinien leicht mit heterologen, von Wirbeltieren stammenden Bestandteilen entsprechend etablierter Verfahren, mit denen Fachleute vertraut sein werden, rekonstituiert werden, um ein Modellsystem für einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, wie hier dargelegt, zu schaffen.
In bestimmten anderen, besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann vermutet werden, dass das Individuum oder die biologische Quelle eine arthritische Funktionsstörung und/oder eine Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, hat oder ein Risiko dafür trägt, und in bestimmten, bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann bekannt sein, dass das Individuum oder die biologische Quelle frei vom Risiko oder dem Vorliegen einer solchen Krankheit ist. In bestimmten anderen, bevorzugten Ausführungsformen, wo es wünschenswert ist, zu bestimmen, ob ein Individuum oder eine biologische Quelle in die klinischen Parameter, die für eine arthritische Funktionsstörung kennzeichnend sind, fällt oder nicht, können Zeichen und Symptome einer arthritischen Funktionsstörung, die von Fachleuten anerkannt werden, verwendet werden, um ein Individuum oder eine biologische Quelle so zu bezeichnen, zum Beispiel klinische Zeichen, auf die in Primer on the Rheumatic Diseases (7. Auflage, J.H. Klippel (Hrsg.), 1997 The Arthritis Foundation, Atlanta, GA) und in den darin zitierten Literaturstellen verwiesen wird, oder andere Mittel, die im Fachgebiet zum Diagnostizieren eine arthritischen Funktionsstörung bekannt sind. In ähnlicher Weise sind klinische Parameter, die für bestimmte andere Krankheiten, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden sind, kennzeichnend sind, wie hier dargelegt, dem Fachgebiet bekannt und werden oben erörtert.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können biologische Proben von einem Individuum oder einer biologischen Quelle, in dem oder in der mindestens eine veränderte mitochondriale Funktion nachgewiesen wurde, vor und nach dem In-Kontakt-Bringen des Individuums oder der biologischen Quelle mit einer Zusammensetzung der Struktur (I) wie zum Beispiel einem Aryl-N-cyanoguanidin-Wirkstoff wie hier dargelegt verglichen werden, zum Beispiel um eine mitochondriale Funktion als Kandidaten, bei dem der Wirkstoff eine Änderung im Vergleich zum Grad der mitochondrialen Funktion, der vorlag, bevor das Individuum oder die biologische Quelle dem Wirkstoff ausgesetzt wurde, zu bewirken vermag, zu identifizieren.
In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die biologische Quelle, in der eine veränderte mitochondriale Funktion festgestellt wurde, einen Chondrozyten und noch bevorzugter, einen Gelenkchondrozyten. Chondrozyten können zum Beispiel aus normalem, reifen Knorpelgewebe gewonnen werden. Zum Beispiel offenbaren die U.S. Patente Nr. 4.846.835 und 5.041.138 eine Isolation von Chondrozyten durch Verdau von Gelenkknorpel in einer Kollagenaselösung, gefolgt von einer mitotischen Vermehrung der Chondrozyten in vitro. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die biologische Probe, die mindestens einen Kandidaten für einen Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion enthält, ein Matrixvesikel (MV), das von einem Chondrozyten stammt (zum Beispiel Anderson, Rheum. Dis. Clin. North Amer. 14:303, 1988; Doyle, J. Pathol. 136:199, 1982; Doherty, Hosp. Pract. Off. Ed. 29:93, 1994), umfassen, zum Beispiel ein MV, das entsprechend einer jeglichen aus einer Zahl von etablierten Prozeduren (zum Beispiel Johnson et al., J. Bone Miner. Res. 14:883, 1999) oder mittels anderer Verfahren, mit denen Fachleute vertraut sein werden, hergestellt wurde.
Die Aktivierung von Matrixverkalkung durch Chondrozyten und auch durch Osteoblasten scheint durch die Freisetzung von membranbegrenzten Zellfragmenten, die als Matrixvesikel (MV) bekannt sind, vermittelt zu werden. Bestandteile von MV einschließlich einer Reihe von Enzymen modifizieren die extrazelluläre Matrix und die Innenräume von MV dienen als geschützte Umgebung für die Bildung von Hydroxyapatit-Kristallen (Anderson, Clin. Orthopaed. Rel. Res. 314:266–80, 1995; Boskey et al., Calcif. Tissue Int. 60:309–15, 1997; Boskey, Connect. Tissue Res. 35:357–63, 1996; und Goldberg, Prog. Histochem. Cytochem. 31:1–187, 1996). Verfahren zum Herstellen von MV sind hier beschrieben und weitere Verfahren sind im Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel Johnson et al., J. Bone Mine. Res. 14:883–92, 1999, und U.S. Patent Nr. 5:656.450).
Mitochondrien und SMP können mittels einer Reihe von Verfahren zubereitet werden (siehe zum Beispiel Fleischer et al., Methods Enzymol. 31:292–99, 1974; Pedersen et al., Methods Cell. Biol. 20:411–81, 1978; della-Cioppa et al., Mol. Cell. Endocrinol. 48:111–20, 1986; und Lauquin et al., Biochim. Biophys. Acta 460:331–45, 1977). Zum Beispiel kann die folgende Vorgehensweise verwendet werden, um Mitochondrien und/oder SMP zuzubereiten: Zelllysate werden 10 Minuten lang bei 600 × g und bei 4°C zentrifugiert und dieser erste Überstand wird abgenommen und beiseite gestellt. Das Pellet, das Plasmamembranmaterial umfasst, wird mit 100 μl MSB (210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 10 mM EDTA) gewaschen und 10 Minuten lang bei 600 × g und bei 4°C zentrifugiert, um einen zweiten Überstand herzustellen. Der erste und der zweite Überstand werden zusammengefasst und bei 14.000 × g und bei 4°C 15 Minuten lang zentrifugiert; das sich daraus ergebende Pellet stellt eine mitochondriale Fraktion, die in MSB resuspendiert wird, um Mitochondrien zuzubereiten, dar. Solche Mitochondrien können mit 25 mg/ml Digitonin (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) 2 Minuten lang inkubiert und 3 Minuten lang bei einer Aussteuerung von 50 % in einem „cup-horn"-Sonicator beschallt werden, um submitochondriale Partikel (SMP) herzustellen.
Dementsprechend kann eine biologische Probe wie hier dargelegt in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen einen Chondrozyten, von Chondrozyten stammende MV und/oder von Chondrozyten stammende submitochondriale Partikel (SMP), in denen Spiegel von einem oder mehreren Indikatoren einer veränderten mitochondrialen Funktion verglichen werden können, umfassen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die biologische Probe, die mindestens einen Kandidaten für einen Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion enthält, Vollblut umfassen und kann in einer anderen bevorzugten Ausführungsform eine rohe Leukozytenfilmfraktion des Vollbluts, von der im Fachgebiet bekannt ist, dass sie weiter eine besondere Fraktion des Vollbluts, die mit Plättchen und kernhaltigen Blutzellen (zum Beispiel weiße Blutkörperchen wie Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten einschließlich Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen) angereichert ist und im Wesentlich arm an Erythrozyten ist, umfasst, umfassen. Fachleute werden wissen, wie eine solche Leukozytenfilmfraktion, die zum Beispiel mittels Differentialdichtesedimentation von Blut unter definierten Bedingungen einschließlich der Verwendung von dichteabhängigen Separationsmedien und mittels anderer Verfahren hergestellt werden kann, herzustellen ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann die biologische Probe, die mindestens einen Kandidaten für einen Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion enthält, eine angereicherte, isolierte oder gereinigte Fraktion mit einer Subpopulation von Blutzellen umfassen wie zum Beispiel Lymphozyten, polymorphzellige Lymphozyten, Granulozyten und Ähnliches. Verfahren zur selektiven Zubereitung von Subpopulationen bestimmter hämatopoetischer Zellen sind im Fachgebiet gut bekannt (siehe zum Beispiel Current Protocols in Immunology, J.E. Coligan et al., (Hrsg.) 1998, John Wiley & Sons, NY).
Gemäß bestimmter Ausführungsformen der Erfindung kann der jeweilige Zelltyp oder Gewebstyp, aus dem eine biologische Probe gewonnen wird, qualitative oder quantitative Aspekte von mindestens einem darin enthaltenen Kandidaten für einen Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion im Vergleich zu dem entsprechenden Kandidaten für einen Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion, der aus verschiedenen Zell- oder Gewebstypen einer gewöhnlichen biologischen Quelle gewonnen wurde, beeinflussen. Es liegt daher innerhalb der Erwägung der Erfindung, mindestens einen Kandidaten für einen Indikator einer veränderten mitochondrialen Funktion in biologischen Proben aus verschiedenen Zell- oder Gewebstypen zu quantifizieren, wie es die Vorteile der Erfindung für eine bestimmte Indikation, zum Beispiel für eine arthritische Funktionsstörung oder für eine Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist wie hier dargelegt und weiter für ein bestimmtes Maß des Fortschreitens einer bekannten oder vermuteten arthritischen Funktionsstörung (oder einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist) in einem Individuum, das ein Wirbeltier ist, am nützlichsten machen wird. Die relevanten Zell- oder Gewebstypen werden denen, die mit solchen Krankheiten vertraut sind, bekannt sein.
Zum Beispiel können, wie hier dargelegt, Gelenkknorpelchondrozyten einen besonders bevorzugten Zelltyp im Zusammenhang mit einer arthritischen Funktionsstörung darstellen, wie es auch andere Zelltypen bei Prozessen der Entwicklung, Stabilisierung, Erhaltung und Reparatur von Gelenken wie zum Beispiel Knorpelhomöostase, Heilen von Knochen- oder Bandtransplantaten, Resorption von Narbengewebe oder Umbau von Bindegewebe können, zum Beispiel Knochenzellen, Osteoblasten, Osteoklasten, Stromazellen des Knochenmarks, Myozyten, Zellen der Endplatte von motorischen Nerven, Enzündungszellen und/oder Synoviozyten.
Um festzustellen, ob eine mitochondriale Veränderung zu einem bestimmten Krankheitszustand beitragen kann, kann es von Nutzen sein, ein Modellsystem für diagnostische Tests und zum Durchmustern von Kandidaten für therapeutische Wirkstoffe, bei denen der genetische Hintergrund im Kern konstant gehalten werden kann, während das mitochondriale Genom modifiziert wird, zu entwerfen. Es ist im Fachgebiet bekannt, wie mitochondriale DNA aus kultivierten Zellen abgereichert wird, um p⁰-Zellen herzustellen, womit die Expression und Replikation mitochondrialer Gene verhindert und die mitochondriale Funktion inaktiviert wird. Es ist im Fachgebiet weiter bekannt, wie solche p⁰-Zellen mit Mitochondrien, die aus fremden Zellen stammen, neu besiedelt werden, um den Beitrag des mitochondrialen Donor-Genotyps zum respiratorischen Phänotyp der Empfängerzelle zu bewerten. Solche zytoplasmatischen Hybridzellen, die genomische und mitochondriale DNA aus verschiedenen biologischen Quellen enthaften, sind als Cybride bekannt. Siehe zum Beispiel internationale Publikationsnummer WO 95/26973 und U.S. Patent Nr. 5.888.498 und die darin zitierten Literaturstellen.
In bestimmten anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten, der eine arthritische Funktionsstörung hat, bereit, indem dem Patienten eine Zusammensetzung verabreicht wird, welche einen Wirkstoff mit der chemischen Struktur (I), der mindestens ein klinisches Kriterium dafür, eine arthritische Funktionsstörung zu haben oder ein Risiko, sie zu haben, zu tragen, wesentlich verbessert (zum Beispiel in statistisch signifikanter Art und Weise so ändert, dass es einem Kontroll- oder asymptomatischen Zustand näher kommt), umfasst (siehe zum Beispiel Primer on the Rheumatic Diseases,. 7. Auflage, J.H. Klippel (Hrsg.), 1997 The Arthritis Foundation, Atlanta, GA). Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten, der eine Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, hat, bereit, indem dem Patienten eine Zusammensetzung verabreicht wird, welche einen Wirkstoff mit der chemischen Struktur (I), der mindestens ein klinisches Kriterium dafür, eine solche Krankheit zu haben oder ein Risiko, sie zu haben, zu tragen, wesentlich verbessert (zum Beispiel in statistisch signifikanter Art und Weise so ändert, dass es einem Kontroll- oder asymptomatischen Zustand näher kommt), wie im Fachgebiet bekannt und hier dargelegt, umfasst. Fachleute können leicht feststellen_; ob eine Änderung in einem solchen klinischen Kriterium dieses Niveau näher an einen normalen Wert heranbringt und/oder sich positiv auf die Testperson auswirkt. Somit kann ein bevorzugter Wirkstoff, der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, einen Wirkstoff enthalten, welcher imstande ist, ein solches Niveau in vollem Umfang oder teilweise wieder herzustellen.
Dementsprechend umfasst in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wie hier dargelegt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zum Behandeln einer arthritischen Funktionsstörung und/oder zum Behandeln einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, geeignet ist, einen Wirkstoff von der Struktur (I), zum Beispiel einen Aryl-N-cyanoguanidin-Wirkstoff. Im Fall der arthritischen Funktionsstörungen können solche Wirkstoffe verwendet werden, um arthritische Funktionsstörungen wie zum Beispiel Osteoarthritis oder degenerative Gelenkserkrankung zu verhindern oder zu behandeln und die Heilung von verletztem Knorpel, zum Beispiel von Knorpel, der durch Verletzung oder durch eine von sich wiederholenden Bewegungen verursachte Funktionsstörung geschädigt ist, zu fördern. Ohne durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen können einige dieser Wirkstoffe eine Aktivität als Antioxidantien besitzen und vermutlich wirken, indem sie die Wirkungen von Schaden durch oxidativen Stress an Mitochondrien verhindern oder abmildern (siehe zum Beispiel Kowaltowski et al., Free Radical Biol. Med. 26:463–471, 1999 für eine Übersicht). Diese und/oder andere derartige Wirkstoffe können bewirken, dass programmierter Zelltod (Apoptose), der zur Entwicklung von Osteoarthritis (Blanco et al., Arthritis & Rheumatism 41:284–289, 1998) und/oder zu anderen Krank heiten, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion wie hier dargelegt verbunden sind, beiträgt, verhindert wird oder können durch andere Mechanismen klinisch günstige Einflüsse ausüben.
Somit kann in diesen und andern zugehörigen Ausführungsformen eine Zusammensetzung, die Struktur (I) (zum Beispiel ein Aryl-N-cyanoguanidin-Wirkstoff) umfasst, wie zum Beispiel jene, die hier bereitgestellt werden, einem Patienten zur Behandlung oder zum Verhindern einer arthritischen Funktionsstörung oder einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist, wie hier dargelegt, verabreicht werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Wirkstoff daher ein Agens, das die mitochondriale Funktion verändert. Therapeutische Wirkstoffe, die hier bereitgestellt werden, sind vorzugsweise Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wenn sie in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird zusätzlich zu einem oder mehreren Wirkstoffen, welche die mitochondriale Funktion verändern, mindestens einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisches annehmbares Verdünnungsmittel oder Vehikel und wahlweise andere Bestandteile enthalten.
Eine Verbindung gemäß dieser Erfindung (zum Beispiel eine Zusammensetzung von Struktur (I) wie zum Beispiel ein Aryl-N-cyanoguanidin-Wirkstoff) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon wird einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge, die so berechnet ist, dass die gewünschte Wirkung erreicht wird. Es wird einem Fachmann klar sein, dass der Weg der Verabreichung mit der jeweiligen Behandlung variieren wird. Verabreichungswege können entweder nicht invasiv oder invasiv sein. Nicht invasive Verabreichungswege beinhalten oral, buccal/sublingual, rectal, nasal, topisch (einschließlich transdermal und ophthalmisch), vaginal, intravesical und pulmonal. Invasive Verabreichungswege beinhalten intraarteriell, intravenös, intradermal, intramuskulär, subcutan, intraperitoneal, intrathekal und intraokular.
Die erforderliche Dosierung kann mit der jeweiligen Behandlung und dem Verabreichungsweg variieren. Im Allgemeinen werden Dosierungen für Verbindungen dieser Erfindung wie zum Beispiel Aryl-N-cyanoguanidin-Wirkstoffe von der Struktur (I) wie hier beschrieben von etwa 1 bis etwa 5 Milligramm der Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht des Wirtstieres pro Tag betragen; häufig wird sie zwischen etwa 100 μg und etwa 5 mg betragen, kann aber bis zu etwa 50 mg der Verbindung pro kg Körpergewicht pro Tag variieren. Therapeutische Verabreichung wird im Allgemeinen unter der Anleitung eines Arztes vorgenommen und pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten den Wirkstoff in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Diese Träger sind im Fachgebiet gut bekannt und enthalten üblicherweise nicht toxische Salze und Puffer. Solche Träger können Puffer wie physiologisch gepufferte Salzlösung, mit Phosphat gepufferte Salzlösung, Kohlenhydrate wie zum Beispiel Glucose, Mannose, Saccharose, Mannitol oder Dextrane, Aminosäuren wie zum Beispiel Glycin, Antioxidantien, Chelatbildner wie zum Beispiel EDTA oder Glutathion, Hilfsstoffe und Konservierungsmittel umfassen. Annehmbare nicht toxische Salze beinhalten Säureadditionssalze oder Metallkomplexe, zum Beispiel mit Zink, Eisen, Calcium, Barium, Magnesium, Aluminium oder Ähnliches (die für Zwecke dieser Anmeldung als Additionssalze betrachtet werden). Veranschaulichend für solche Säureadditionssalze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Tannat, Oxalat, Fumarat, Gluconat, Alginat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat oder Tartrat. Wenn der aktive Inhaltsstoff in Tablettenform verabreicht werden soll, kann die Tablette ein Bindemittel wie zum Beispiel Tragant, Getreidestärke oder Gelatine enthalten; ein Sprengmittel wie zum Beispiel Alginsäure und ein Gleitmittel wie zum Beispiel Magnesiumstearat. Wenn eine Verabreichung in flüssiger Form gewünscht wird, können Süßstoffe oder Aromastoffe verwendet werden und intravenöse Verabreichung kann in isotonen Salz- oder Phosphatpufferlösungen vorgenommen werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Verbindungen dieser Erfindung umfassen, in Liposomen eingeschlossen. Liposomen sind mikroskopische Sphären mit einem wässrigen Kern, der von einer oder mehreren äußeren Lage(n) aus Lipiden, die in einer zweischichtigen Konfiguration ausgerichtet sind, umgeben ist (siehe zum Beispiel Chonn et al., Current Op. Biotech. 6:698, 1995). Das therapeutische Potential von Liposomen als Mittel zur Arzneimittelabgabe wurde vor nahezu dreißig Jahren erkannt (Sessa et al., J. Lipid. Res. 9:310, 1968). Liposomen schließen „sterisch stabilisiertes Liposom" ein, ein Begriff, der, wie hier verwendet, ein Liposom, das ein oder mehrere spezialisierte Lipide umfasst, welche, wenn sie in Liposomen aufgenommen werden, zu verbesserten Überlebensdauern in der Zirkulation im Vergleich zu Liposomen, die solche spezialisieren Lipide nicht haben, führen, betrifft. Beispiele von sterisch stabilisierten Liposomen sind solche, in denen ein Teil des Lipidanteils des Liposoms, der Vesikel bildet, (A) ein oder mehrere Glycolipide wie zum Beispiel Monosialogangliosid G_M1 umfasst oder (B) mit einem oder mehreren hydrophilen Polymeren wie zum Beispiel einer Polyethylenglykol (PEG) Komponente derivatisiert ist. Obwohl man nicht durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden sein will, wird im Fachgebiet angenommen, dass zumindest für sterisch stabilisierte Liposomen, die Ganglioside, Sphingomyelin oder mit PEG derivatisierte Lipide enthalten, die verbesserte Halbwertszeit in der Zirkulation dieser sterisch stabilisierten Liposomen auf eine verminderte Aufnahme in Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) zurückzuführen ist (Allen et al., FEBS Letters, 223:42, 1987; Wu et al., Cancer Research 53:3765, 1993).
Im Fachgebiet sind verschiedene Liposomen, die ein oder mehrere Glycolipide umfassen, bekannt. Papahadjopoulos et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci., 507:64, 1987) berichteten über die Fähigkeit von Monosialogangliosid G_M1, Galactocerebrosidsulfat und Phosphatidylinositol, die Halbwertszeiten von Liposomen im Blut zu verbessern. Diese Ergebnisse wurden von Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:6949, 1988) vertieft. U.S. Patent Nr. 4.837.028 und WO 88/04924, beide an Allen et al, offenbaren Liposomen, die (1) Sphingomyelin und (2) das Gangliosid G_M1 oder Galactocerebrosidsulfatester umfassen. U.S. Patent Nr. 5.543.152 (Webb et al.) offenbart Liposomen, die Sphingomyelin umfassen. Liposomen, die 1,2-sn-Dimyristoylphosphatidylcholin umfassen, sind in WO 97/13499 (Lim et al.) offenbart.
Im Fachgebiet sind verschiedene Liposomen, die mit einem oder mehreren hydrophilen Polymeren derivatisiert sind und Verfahren zu ihrer Herstellung bekannt. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn. 53:2778, 1980) beschrieben Liposomen, die ein nichtionisches Detergens, 2C₁₂15G, das eine PEG-Komponente enthält, umfassen. Illum et al. (FEBS Letters 167:79, 1984) bemerkten, dass hydrophiles Beschichten von Polystyrenpartikeln mit polymeren Glykolen zu signifikant verbesserten Halbwertszeiten im Blut führten. Synthetische Phospholipide, die durch das Anbinden von Carboxylgruppen von Poly alkylenglykolen (zum Beispiel PEG) modifiziert sind, sind von Sears (U.S. Patente Nr. 4.426.330 und 4.534.899) beschrieben. Klibanov et al. (FEBS Letts. 268:235, 1990) beschrieben Experimente, die zeigten, dass Liposomen, die Phosphatidylethanolamin (PE), das mit PEG oder PEG-Stearat derivatisiert ist, umfassen, signifikante Steigerungen der Halbwertszeit in der Blutzirkulation haben. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta 1029:91, 1990) dehnten solche Beobachtungen auf andere, mit PEG derivatisierte Phospholipide, zum Beispiel DSPE-PEG, das aus der Kombination von Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE) und PEG gebildet wird, aus. Liposomen, die auf ihrer äußeren Oberfläche kovalent gebundene PEG-Komponenten haben, sind im Europäischen Patent Nr. 0 445 131 B1 und WO 90/04384 an Fisher beschrieben. Liposomzusammensetzungen, die 1–20 Molprozent von mit PEG derivatisiertem PE enthalten, und Verfahren ihrer Verwendung sind von Woodle et al (U.S. Patente Nr. 5.013.556 und 5.356.633) und Martin et al. (U.S. Patent Nr. 5.213.804 und Europäisches Patent Nr. EP 0 496 813 B1 ) beschrieben. Liposomen, die eine Anzahl von anderen Lipid-Polymer-Konjugaten umfassen, sind in WO 91/05545 und U.S. Patent Nr. 5.225.212 (beide an Martin et al.) und in WO 94/20073 (Zalipsky et al.) offenbart. Liposomen, die mit PED modifizierte Ceramidlipide umfassen, sind in WO 96/10391 (Choi et al.) beschrieben. Die U.S. Patente Nr. 5.540.935 (Miyazaki et al.) und 5.556.948 (Tagawa et al.) beschreiben PEG enthaltende Liposomen, die weiter mit funktionellen Komponenten auf ihren Oberflächen derivatisiert werden können.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel Verbindungen von Struktur (I) wie zum Beispiel Aryl-N-cyanoguanidin-Wirkstoffe), wie sie von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, schließen auch Propharmaka davon ein. Ein „Propharmakon" wie hier verwendet ist jeder kovalent gebundene Träger, der in vivo das aktive Stammarzneimittel freisetzt, wenn ein derartiges Propharmakon einem Individuum, bei dem es sich um ein Wirbeltier handelt, verabreicht wird. Propharmaka einer gegebenen Verbindung werden hergestellt, indem funktionelle Gruppen, die an der Verbindung vorliegen, so modifiziert werden, dass die Modifikationen entweder im Rahmen einer Routinemanipulation oder in vivo zu der Stammverbindung gespalten werden. Propharmaka beinhalten Verbindungen, in denen Hydroxy- oder Amingruppen über eine Verbindung, die sich spaltet, um das freie Hydroxyl beziehungsweise Amino zu bilden, wenn das Propharmakon einem Individuum verabreicht wird, an jede beliebige Gruppe der Stammverbindung gebunden sind. Typische Beispiele von Propharmaka schließen Acetat-, Formiat- und Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen ein.
„Pharmazeutisch annehmbare Träger" zur therapeutischen Verwendung sind im pharmazeutischen Fachgebiet gut bekannt und sind zum Beispiel in Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, Hrsg., 1985) beschrieben. Zum Beispiel können sterile Salzlösung und mit Phosphat gepufferte Salzlösung bei physiologischem pH-Wert verwendet werden. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Farbstoffe und auch Aromastoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt werden. Zum Beispiel können Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester der p-Hydroxybenzoesäure als Konservierungsmittel zugegeben werden. Zusätzlich können Antioxidantien und Stellmittel verwendet werden. Wahlweise kann für bestimmte Verabreichungswege ein Anästheticum in die Formulierung aufgenommen werden.
Pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindungen dieser Erfindung können mittels Methoden, die im Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden, wie zum Beispiel dadurch, dass man die freien Säure- oder Basenformen dieser Verbindungen mit einer stöchiometrischen Menge der geeigneten Base oder Säure in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel reagieren lässt. In diesem Zusammenhang geeignete Salze können in Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985 gefunden werden.
Als Beispiel beinhalten geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze von Verbindungen dieser Erfindung Säureadditionssalze, die gebildet werden können, indem zum Beispiel eine Lösung der Verbindung gemäß der Erfindung mit einer Lösung einer annehmbaren Säure gemischt wird, wie zum Beispiel Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Fumarsäure, Oxalsäure, p-Toluolsulfonsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Kohlensäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure. Die Salze können durch herkömmliche Mittel gebildet werden, wie zum Beispiel, indem man die freie Basenform des Produkts mit einem oder mehreren Äquivalenten der entsprechenden Säure in einem Lösungsmittel oder Medium, in dem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie zum Beispiel Wasser, das im Vakuum oder mittels Gefriertrocknung entfernt wird, reagieren lasst oder indem man die Anionen eines vorliegenden Salzes gegen ein anderes Anion auf einem geeigneten Ionenaustauscherharz austauscht. Als Beispiel beinhalten geeignete pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindungen dieser Erfindung Säureadditionssalze, die zum Beispiel gebildet werden können, indem eine Lösung der Verbindung gemäß der Erfindung mit einer Lösung einer annehmbaren Säure gemischt wird, wie zum Beispiel Bromwasserstoffsäure, Chlorwasserstoffsäure, Fumarsäure, Oxalsäure, p-Toluolsulfonsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Kohlensäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure. Die Salze können durch herkömmliche Mittel gebildet werden, wie zum Beispiel, indem man die freie Basenform des Produkts mit einem oder mehreren Äquivalenten der entsprechenden Säure in einem Lösungsmittel oder Medium, in dem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel wie zum Beispiel Wasser, das im Vakuum oder mittels Gefriertrocknung entfernt wird, reagieren lasst oder indem man die Anionen eines vorliegenden Salzes gegen ein anderes Anion auf einem geeigneten Ionenaustauscherharz austauscht.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Verbindungen der Erfindung wie hier offenbart enthalten, können in jeder Form, die es erlaubt, die Zusammensetzung einem Patienten zu verabreichen, vorliegen. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung in der Form eines Feststoffes, einer Flüssigkeit oder eine Gases (Aerosols) vorliegen. Typische Verabreichungswege beinhalten ohne Einschränkung den oralen, topischen, parenteralen (zum Beispiel sublingual oder buccal), sublingualen, rectalen, vaginalen und intranasalen Weg. Der Begriff parenteral wie hier verwendet schließt subcutane Injektionen, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale, intrathekale, intracavernöse, intrameatale, intraurethrale Injektions- oder Infusionsverfahren ein. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist so formuliert, dass es ermöglicht wird, dass die darin enthaltenen Wirkstoffe nach der Verabreichung der Zusammensetzung an einen Patienten bioverfügbar sind. Zusammensetzungen, die einem Patienten verabreicht werden, haben die Form von einer oder mehreren Dosierungseinheiten, wobei zum Beispiel eine Tablette eine einzelne Dosierungseinheit sein kann und ein Gebinde von einer oder mehreren Verbindungen der Erfindung ein Form eines Aerosols eine Vielzahl von Dosierungseinheiten enthalten kann.
Für die orale Verabreichung kann ein Vehikel und/oder Bindemittel vorliegen. Beispiele sind Saccharose, Kaolin, Glycerin, Stärkedextrine, Natriumalginat, Carboxymethylcellulose und Ethylcellulose. Farbstoffe und/oder Aromastoffe können dabei sein. Es kann eine beschichtende Ummantelung eingesetzt werden. Die Zusammensetzung kann in der Form einer Flüssigkeit, zum Beispiel eines Elixiers, eines Sirups, einer Lösung, einer Emulsion oder einer Suspension vorliegen. Die Flüssigkeit kann, als zwei Beispiele, zur oralen Verabreichung oder zur Verabreichung mittels Injektion bestimmt sein. Wenn sie zur oralen Verabreichung bestimmt ist, enthalten bevorzugte Zusammensetzungen zusätzlich zu einer oder mehreren Verbindung(en) von Struktur (I) ein oder mehrere Süßmittel, Konservierungsmittel, Farbstoff/Färbemittel und Geschmacksverstärker. In einer Zusammensetzung, die zur Verabreichung mittels Injektion bestimmt ist, können ein oder mehrere Tenside, Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Dispergiermittel, Stellmittel, Puffer, Stabilisatoren und isotone Mittel enthalten sein.
Eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung wie hier verwendet, ob in der Form einer Lösung oder Suspension, kann einen oder mehrere der folgenden Hilfsstoffe enthalten: Sterile Verdünnungsmittel wie zum Beispiel Wasser zu Injektion, Salzlösung, vorzugsweise physiologische Salzlösung, Ringer-Lösung, isotones Natriumchlorid, Fettöle wie zum Beispiel synthetische Mono- oder Diglyceride, die als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium dienen können, Polyethylenglycole, Glycerin, Propylenglycol oder andere Lösungsmittel; antibakterielle Wirkstoffe wie zum Beispiel Benzylalkohol oder Methylparaben; Antioxidantien wie zum Beispiel Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner wie zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer wie zum Beispiel Acetate, Citrate oder Phosphate und Wirkstoffe zum Einstellen der Tonizität wie zum Beispiel Natriumchlorid oder Dextrose. Die parenterale Zubereitung kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Gefäßen aus Glas oder Plastik für viele Dosierungseinheiten eingeschlossen sein. Physiologische Salzlösung ist ein bevorzugter Hilfsstoff. Eine injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise steril.
Eine flüssige Zusammensetzung, die entweder für parenterale oder orale Verabreichung bestimmt ist, sollte eine solche Menge einer Verbindung von Struktur (I), dass eine geeignete Dosierung erreicht werden wird, enthalten. Üblicherweise beträgt diese Menge mindestens 0,01 Gewichtsprozent einer Verbindung der Erfindung in der Zusammensetzung. Wenn sie zur oralen Verabreichung bestimmt ist, kann diese Menge so variiert werden, dass sie zwischen 0,1 und etwa 70 % des Gewichts der Zusammensetzung beträgt. Bevorzugte orale Zusammensetzungen enthalten zwischen etwa 4 % und 50 % der Verbindung der Erfindung. Bevorzugte Zusammensetzungen und Zubereitungen werden so hergestellt, dass eine parenterale Dosierungseinheit zwischen 0,01 und 1 Gewichtsprozent der aktiven Verbindung enthält.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur topischen Verabreichung bestimmt sein. In diesem Fall kann der Träger geeigneterweise eine Lösung, Emulsion, Salbe oder ein Gel als Grundlage umfassen. Die Grundlage kann zum Beispiel einen oder mehrere der folgenden Stoffe umfassen: Petrolatum, Lanolin, Polyethylenglycole, Bienenwachs, Mineralöl, Verdünnungsmittel wie zum Beispiel Wasser und Alkohol, und Emulgatoren und Stabilisatoren. Eindickungsmittel können in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur topischen Verabreichung vorkommen. Wenn sie zur transdermalen Verabreichung bestimmt ist, kann die Zusammensetzung ein Transdermalpflaster oder eine Vorrichtung zur lontophorese enthalten. Topische Formulierungen können eine Konzentration der Verbindung der Erfindung von etwa 0,1 bis etwa 10 % w/v (Gewicht pro Volumeneinheit) enthalten.
Die Zusammensetzung kann zur rectalen Verabreichung bestimmt sein, zum Beispiel in der Form eines Suppositoriums, das im Rectum schmelzen und das Arzneimittel freisetzen wird. Die Zusammensetzung zur rectalen Verabreichung man eine fettige Grundlage als geeignetes, nicht reizendes Vehikel enthalten. Solche Grundlagen schließen Lanolin, Kakaobutter und Polyethylenglycol ein.
In bestimmten bevorzugten Verfahren der Erfindung kann (können) die Verbindung(en) der Erfindung durch die Verwendung von (einer) Einlage(n), (einem) Kügelchen, (einer) Formulierung(en) mit zeitgesteuerter Freisetzung, (einem) Pflaster(n) oder (einer) Formulierung(en) mit schneller Freisetzung verabreicht werden. Es wird für Fachleute offensichtlich sein, dass die optimale Dosierung des (der) Wirkstoffe(s) vom Gewicht und dem physischen Zustand des Patienten, von der Schwere und Dauer des physischen Zustands, der behandelt wird, von der jeweiligen Form des Wirkstoffs, von der Art der Verabreichung und von der eingesetzten Zusammensetzung abhängig sein kann. Es soll verstanden werden, dass die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der Chemotherapie zur Folge haben kann, dass solch ein Wirkstoff an eine andere Verbindung gebunden wird, zum Beispiel an einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, ein Protein oder ein Liposom, was die Freisetzung der besagten Verbindung unterstützen wird.
Diese und andere damit verbundene Vorteile werden von Fachleuten begrüßt werden. Die folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung geboten.
BEISPIELE
Beispiel 1
Allgemeine Synthese von typischen Verbindungen
N-Cyano-S-methylisothioharnstoff (1,38 g, 12,0 mmol) wurde in i-PrOH (18,0 ml) gelöst. Zu dieser gerührten Lösung wurde wässriges NaOH (2,0 M, 6,0 ml) gegeben und die sich daraus ergebende Reaktionsmischung wurde 30 min lang bei 100°C erhitzt. Man ließ die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und Portionen mit 2,0 ml (jede ca. 1,0 mmol des vermutlichen intermediären Salzes, Natriumdicyanamid enthaltend) wurden zu einer Lösung des jeweiligen Anilins (1,0 mmol) in HCl_(aq) (1,0 M, 1,0 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren 60 min lang bei 100°C erhitzt.
Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck verdampft, was das Rohprodukt von Struktur (I) ergab. Vor der Reinigung wurde jede Rohmischung in MeOH (10 ml) aufgenommen, beschallt, um Feststoffe aufzubrechen und durch PTFE-Membranfilter von 0,20 micron gefiltert. Präparative RP-HPLC wurde auf einem automatisierten Gilson 215 HPLC-System durchgeführt, wobei jedes Derivat in drei Portionen (3,3 ml Injektatvolumina) über eine Betasil^TM C18 Säule (150 × 20 mm, 5 μ Partikel, 100 Å Poren, Keystone Scientific, Inc., Bellafonte, PA) gereinigt wurde. Das Produkt wurde unter Verwendung eines Gradienten von MeCN:TFA (10000:5) in H₂O:TFA (10000:5) bei einer Flussrate von 15,0 ml/min eluiert. Die jeweiligen Fraktionen wurden mit LC/MS auf das Vorhandensein des gewünschten Produkts untersucht. Die gesammelten Fraktionen wurden konzentriert und wiederholt zusammen mit MeOH (3 × 5,0 ml) verdampft. LC/MS und NMR Untersuchungen wurden zur endgültigen Bestätigung der Struktur verwendet. Die Ausbeuten lagen im Bereich 10–65 %.
Die typischen Verbindungen, die mit dieser Prozedur hergestellt wurden, sind zusammen mit entsprechenden analytischen Daten in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 Typische Verbindungen
Beispiel 2
Typische Synthese von Verbindung (1) in großem Maßstab
N-Cyano-S-methylisothioharnstoff (576 mg, 5,00 mmol) wurde in i-PrOH (7,5 ml) gelöst. Zu dieser gerührten Lösung wurde wässriges NaOH (2,0 M, 2,5 ml) gegeben und die sich daraus ergebende Reaktionsmischung wurde 30 min lang auf 100°C erhitzt. Man ließ die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Zu dieser Dicyanamidlösung wurde eine Lösung von 4-Hydroxy-2-methylanilin (616 mg, 5,00 mmol) in HCl_(aq) (1,0 M, 5,0 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 60 min lang bei 100°C erhitzt und nach Abkühlen auf Raumtemperatur zur Trockne verdampft. Zu dem Rohprodukt wurde ein äquivalentes Gewicht von Silica-Gel und MeOH (10 ml/g Rohprodukt) gegeben. Nachdem einige Minuten lang gerührt worden war, wurde das MeOH mittels Rotationsverdampfung entfernt und die Mischung aus Silica-Gel und Rohprodukt wurde durch Verdampfen von zugegebenem Dichlormethan (DCM, 10 ml/g Rohprodukt) weiter von MeOH gereinigt. Dieser Schritt des gemeinsamen Verdampfens wurde dreimal wiederholt. Die Mischung aus Silica-Gel und Rohprodukt wurde auf eine Flash-SGC, die mit DCM/MeOH (95:5) äquilibriert worden war, aufgetragen. Elution mit einem abgestuften MeOH-Gradienten in DCM (5–10 %) ergab nach Trocknen unter Hochvakuum Verbindung (1) als hellbraunen Feststoff. Ausbeute: 482 mg (50,7 %).
Beispiel 3
Chondrozyten-Aktivitäts-Assay
Immortalisierte TC28 (auch bekannt als „T/C-28") Chondrozyten aus juveniler Rippe wurden von Dr. Man Goldring (Harvard Medical School, Boston, MA) bereitgestellt. Die TC28-Zellen wurden in Monoschichtkultur in DMEM/Ham's F12 (1:1) gehalten und mit 10 % FCS, 1 % L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 50 mg/ml Streptomycin (Omega Scientific, Tarzana, Ca) supplementiert und bei 37°C mit 5 % CO2 kultiviert. Zusätzlich wurden, um chondrozytische Zellen in einem physiologischeren, nicht adhärenten Zustand weiter zu untersuchen, in einigen Experimenten TC28-Zellen auf 6-Loch-Platten, die vorher 18 Stunden lang bei 22°C mit einer 10 % (v/v) Lösung des Zelladhäsionsinhibitors poly-2-Hydroxethyl-metacrylat (polyHEME) in 95 % Ethanol beschichtet worden waren, gefolgt von zwei Waschgängen in PBS, übertragen. Vollständiges DMEM/Ham's F12 Medium wurde dann in die Aussparungen zugegeben und die Zellen wurden bis zu 72 Stunden lang in Kultur untersucht (Folkman J und Moscona A: Role of cell shape in growth control, Nature 273:345–349, 1978; Reginato A, Iozzo R, Jimenez S: Formation of Nodular Structures Resembling Mature Articular Cartilage in Long-Term Primary Cultures of Human Fetal Epiphyseal Chondrocytes on a Hydrogel Substrate, Arthritis Rheum 37: 1338–1349, 1994). Die Expression von Typ-II-Kollagen und Aggrecan wurde mittels RT-PCR bestätigt, was die Aufrechterhaltung des Chondrozyten-Phänotyps bestätigte.
Die für Chondrozyten protektiven Wirkungen von typischen Verbindungen wurden in vitro untersucht. Die Agonisten schlossen eine Substanz, die Stickoxid abgibt (NOC-12), eine Substanz, die Peroxynitrit abgibt (SIN-1), und humanes rekombinantes IL-1 beta ein. Als toxische Stimuli für adhärente Zellen wurden SIN-1 mit 100 μM und NOC-12 mit 250 μM verwendet. In Experimenten, bei denen TC28-Zellen, die in polyHEME-Platten kultiviert waren, eingesetzt wurden, wurden SIN-1 mit 10 μM, NOC-12 mit 25 μM und IL-1 mit 10 ng/ml als pro-osteoarthritische Auslöser in Abwesenheit oder Gegenwart von 1 μM einer typischen Verbindung aus Beispiel 1 verwendet. Zytotoxizität wurde unter Verwendung eines Standard-LDN-Freisetzungsassays untersucht und intrazelluläres ATP im Chondrozyten wurde durch einen Standard-Luciferase-Assay gemessen.
Die vermehrte Freisetzung von Glykosaminoglykanen (GAG) aus Chondrozyten ist eine zentrale Eigenschaft von osteoarthritischen Chondrozyten und es ist bekannt, dass sie durch IL-1, das wie NO und Peroxynitrit ein wichtiger pathogener Faktor bei Osteoarthritis ist, stark stimuliert wird. Somit wurde auch die Freisetzung von GAG untersucht, wobei, um den Untersuchungsassay zu optimieren, ein einstündiger Verdau der im polyHEME-System gebildeten Knorpel-„Knötchen" unter Einsatz von 300 μg/ml Papain in 20 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA und 2 mM DTT (pH 6,8) durchgeführt wurde. Der Verdau der störenden Proteine, der auf diese Art erreicht wurde, ermöglichte es, dass die Freisetzung von GAG leichter feststellbar war, und die Freisetzung von GAG wurde durch den colorimetrischen Standardassay der Bindung des Farbstoffs Dimethylenblau (DMB) quantifiziert. In Kürze wurde der verdaute Zellextrakt von oben mit 46 μM DMB, 40 mM Glycin und 40 mM NaCl (pH 3,0) zusammengefasst und unverzüglich bei 525 nm gemessen und wieder mit einer Standardkurve, die mit Proben von 1–50 μg/ml Chondroitinsulfat erzeugt worden war, verglichen (Farndale R, Buttle D, Barrett A: Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue, Biochimica et Biophysica. Acta 883: 173–177, 1986; Sztrolovics R, White R, Poole R, Mort J, Roughley P: Resistance of small leucine-rich repeat proteoglycans to proteolytic degradation during interleukin-1 stimulated cartilage catabolism, Biochem J. 339: 571–577, 1999). Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2 Abnahme der Freisetzung von GAG in %
Beispiel 4
Weitere Assays unter Verwendung von Verbindung (1)
Zell-Lebensfähigkeits-Assay
1 × 10⁵ TC28-Zellen (DMEM/F12-Medien mit 10 % FCS, 1 % Glutamin, 1 % P/S) wurden in jede Aussparung einer 96-Loch-Platte plattiert und man ließ sie über Nacht anhaften. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und die Medien wurden gewechselt, so dass sie nur 1 % FCS enthielten. Verbindung (1) wurde den Zellen zu einer Vorbehandlung von 1 Stunde in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die Medien wurden entfernt und es wurden frische Verbindung +/– die toxischen Stimuli zugegeben. Die Zellen wurden dann 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Medien gesammelt und zur Untersuchung im CytTox 96 Nonradioactive Cytotoxicity Assay (Promega, Madison, WI) verwendet. In Kürze wurde die Freisetzung von LDH aus den toten Zellen in einer enzymatischen Reaktion von 30 min, die zur Umwandlung von Tetrazolium-saletin in ein rotes Formazan-Produkt führt, quantifiziert. Die Ergebnisse wurden dann als Prozent der toten Zellen im Vergleich zur Freisetzung von LDH durch Kontrollzellen ausgedrückt.
ATP-Assay
5 × 10⁵ TC28-Zellen wurden in eine Schale von 60 mm plattiert und man ließ sie über Nacht anhaften. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und die Medien wurden gegen Medien, die nur 1 % FCS enthielten, gewechselt. Verbindung (1) wurde zu einer Vorbehandlung der Zellen von 1 Stunde bei 37°C zugegeben. Die Medien wurden entfernt und es wurden frische Verbindung +/– die toxischen Stimuli zugegeben und die Zellen wurden dann 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden sanft in PBS geschabt und gewaschen und dann wurden die Pellets in Trockeneis schockgefroren. Die Zellen wurden dann in 0,4 N Perchlorsäure extrahiert und 15 min lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden bei 14.000 rpm 15 min lang zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. 24 % (auf Volumen bezogen) von 2,2 M KHCO₃ wurden zugegeben, um die Lösung zu neutralisieren und der Niederschlag wurde durch Zentrifugation in ein Pellet überführt. Dieser Überstand wurde mit dem ATP-Assay-Mix aus dem Sigma ATP Luciferase Kit gemischt, und die Reaktion wurde dreifach 15 s lang (mit einer initialen Verzögerung von 5 s) gezählt. Die Zählimpulse wurden um die Gesamt-DNA im Zell-Pellet korrigiert (siehe Tabelle 3).
Die Ergebnisse des obigen Zell-Lebensfähigkeits-Assays und des ATP-Assays sind in Tabelle 3 dargestellt, welche die annäherungsweisen EC₅₀-Werte (μM) zum Verhindern von Zelltod, der durch SIN-1 und NOC-12 vermittelt ist, und von ATP-Abreicherung durch Verbindung 1 bereitstellt. In diesen Assays wurden die TC28-Zellen eine Stunde lang vorbehandelt, gefolgt von einer Einwirkung des Auslösers von 24 Stunden in Gegenwart von Verbindung (1). Tabelle 3 Erhaltung der Zell-Lebensfähigkeit und der ATP-Spiegel in Gegenwart von proosteoarthritischen Auslösern

^a NOC-12-Belastung: 250 μM. ^b SIN-1-Belastung: 100 μM.

Kollagensynthese
Kollagenproduktion wurde gemessen, indem die Inkorporation von ³H-Prolin verfolgt wurde wie in Johnson et al., Arthritis Rheum. 43:11560–70, 2000 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt, welche die annäherungsweisen EC₅₀-Werte (μM) zum Verhindern von Freisetzung von GAG, die durch SIN-1, NOC-12 und IL-1 vermittelt ist (über Beispiel 3), und zum Hemmen der Kollagensynthese (über Johnson et al.) in Chondrozyten durch Verbindung (1) bereitstellt. In diesen Experimenten wurden TC28-Zellen auf mit polyHEME beschichteten Platten eine Stunde lang vorbehandelt, gefolgt von einer 72 Stunden langen Einwirkung des Auslösers in Gegenwart von Verbindung (1).
Zusätzlich wurden auch die Geschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs von TC28-Zellen in Monoschichtkultur durch die Verfahren von Johnson et al. ausgewertet. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt, die zeigt, dass Verbindung (1) die von SIN-1 vermittelte Hemmung der mitochondrialen Atmung in TC28-Zellen blockiert. In diesem Experiment wurden TC28-Zellen 4 Stunden lang mit 500 μM SIN-1 +/– 10 μM Verbindung (1) behandelt: Zustand 3/4 – basale Respirationsrate ohne Substratzugabe; Zustand 4 – Respirationsrate in Gegenwart von 5 μM/ml Oligomycin; Zustand 3U – maximale entkoppelte Respirationsrate von Zustand 3 aufgrund der Zugabe des Entkopplers CCCP. Tabelle 4 Erhaltung der Matrix in chondrozytischen Zellen in Gegenwart von proosteoarthritischen Auslösern

^a NOC-12-Belastung: 25 μM. ^b SIN-1-Belastung: 10 μM. ^c IL-1-Belastug: 10 ng/ml.

Organkulturverfahren für Rinderknorpel
Es wurden Knie von erwachsenen Rindern erworben und Knorpel von den femoralen Kondylen und vom Patellagleitlager wurde in Scheiben mit allen Knorpelschichten (1–3 mm) entfernt. Zirkuläre Kerne (6–7 mm im Durchmesser) wurden aus dem Gewebe herausgestanzt. Die Kerne wurden zweimal mit Medien (1 % FCS, 1 % P/S, 1 Glutamin mit Hoch-Glucose-DMEM) gewaschen und dann in 96-Loch-Platten gelegt. Die Scheiben wurden in Medien (wie oben) bei 37°C 48 Stunden lang inkubiert, um eine Erholung von den Maßnahmen zur Isolierung zuzulassen. Nach der Erholungsperiode wurden die Medien entfernt und frische Medien mit Verbindung (1) wurden für eine Vorbehandlungsperiode von 6 Stunden zu den Scheiben gegeben. Dann wurden die Medien entfernt und frische Verbindung (1) +/– IL-1 (mit 10 ng/ml) wurde zugegeben und bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert. Die aufbereiteten Medien wurden gesammelt und die Freisetzung von GAG und NO wurden untersucht. Schließlich wurden die Scheiben gewogen, um kleine Variationen in Größe oder Dicke zu korrigieren. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 5 dargestellt, welche die annäherungsweisen EC₅₀-Werte (μM) zum Verhindern von Freisetzung von GAG und NO, die durch IL-1 vermittelt ist, in Knorpel vom Rind durch Verbindung (1) bereitstellt.
Tabelle 5 Verhindern von Matrixabbau und Hemmung der NO-Freisetzung in Rinderknornelscheiben als Reaktion auf einen IL-1-Stimulus

Claims

Verbindung mit der Struktur:
oder ein Stereoisomer, Acetat-, Formiat- oder Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R₃ Morpholinyl ist; und R₁, R₂, R₄ und R₅ gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten; oder R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsubstituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder substituierten kondensierten Heterocyclus bilden.
Verbindung mit der Struktur:
oder ein Stereoisomer, Acetat-, Formiat- oder Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R₁, R₂ und R₃ gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten; und R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoff atom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsubstituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder kondensierten Heterocyclus bilden.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R₁ Wasserstoff oder Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei R₁ Methyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R₂ Wasserstoff, Halogen, Alkoxy, Alkyl oder substituiertes Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R₂ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R₃ Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkoxy oder Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R₃ ein Heterocyclus ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₄ Wasserstoff oder Alkoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₅ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, eine unsubstituierte kondensierte Phenylgruppe bilden.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂, R₄ und R₅ Wasserstoff sind.
Verbindung mit der Struktur
oder ein Stereoisomer, Acetat-, Formiat- oder Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R₁ Methyl ist; R₂, R₄ und R₅ Wasserstoff sind; und R₃ Hydroxy ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verbindung mit der Struktur:
oder ein Stereoisomer, Acetat-, Formiat- oder Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten; oder R₃ zusammen mit R₄ oder R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsubstituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder substituierten kondensierten Heterocyclus bilden, zur Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln einer arthritischen Störung.
Verbindung mit der Struktur:
oder ein Stereoisomer, Acetat-, Formiat- oder Benzoatderivate von funktionellen Alkohol- und Amingruppen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ gleich oder voneinander verschieden sind und unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, substituiertes Alkyl, Aryl, substituiertes Aryl, Arylalkyl, substituiertes Arylalkyl, einen Heterocyclus, einen substituierten Heterocyclus, Heterocycloalkyl oder substituiertes Heterocycloalkyl bedeuten; oder R₃ zusammen mit R₄ oder R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, ein unsubstituiertes oder substituiertes kondensiertes Aryl oder einen unsubstituierten oder substituierten kondensierten Heterocyclus bilden, zur Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln einer Krankheit, die mit einer veränderten mitochondrialen Funktion verbunden ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₁ Wasserstoff oder Alkyl ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₁ Methyl ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₂ Wasserstoff, Halogen, Alkoxy, Alkyl oder substituiertes Alkyl ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₂ Wasserstoff ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₃ Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkoxy oder Alkyl ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₃ ein Heterocyclus ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₃ Morpholinyl ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₄ Wasserstoff oder Alkoxy ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₅ Wasserstoff ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₄ zusammen mit R₅ und außerdem zusammen mit dem jeweiligen Kohlenstoffatom, an welches diese Gruppen gebunden sind, eine unsubstituierte oder substituierte kondensierte Phenylgruppe bilden.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₂, R₄ und R₅ Wasserstoff sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei R₁ Methyl ist und R₃ Hydroxy ist.