KR101867779B1 - 피라졸 유도체를 유효성분으로 함유하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 검출하기 위한 스크리닝 방법 - Google Patents

피라졸 유도체를 유효성분으로 함유하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 검출하기 위한 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피라졸 유도체를 유효성분으로 함유하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 검출하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것으로써, 본 발명에 따른 소양증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 세포 내의 Mrgpr X1 활성을 억제시켜 소양증 증상을 완화시킬 수 있다. 또한, 세포 내의 hH1R 활성을 억제시킴으로써 소양증 증상을 완화시켜 히스타민 매개 소양증의 예방 또는 치료제로도 유용하게 쓰일 수 있다. 나아가, 피부건조증(Dry skin)에 대해서도 유의성 있는 개선 효과를 가지는 것이 피부건조증 마우스 모델 실험을 통해 입증되었으므로 피부건조증의 치료제로써도 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 건선에 의한 소양증 증상을 완화시킬 수 있으므로, 건선의 치료제로써도 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 생체 내 약물 투여시에도 이상 반응을 일으키지 않고 안정적인 활동능력을 유지할 수 있다.

Description

피라졸 유도체를 유효성분으로 함유하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 검출하기 위한 스크리닝 방법{Pharmaceutical composition for prevention and treatment of pruritus comprising pyrazole derivatives and method for screening of the same}
본 발명은 피라졸 유도체를 유효성분으로 함유하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 검출하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
소양감(가려움증, pruritus, or itch)이란 신체 전반에 걸친 여러 피부질환의 두드러진 증상이다. 소양증은 가려움을 유발하여 벌레, 독성 식물 또는 다른 유해한 자극으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 그러나 소양증이 유익한 역할만을 하는 것은 아니다. 만성 소양증(chronic itch)은 습진, 신장 질환, 간경변 및 일부 암을 포함한 피부 질환을 수반하며, 많은 신경과 관련한 질병 또한 심각한 가려움을 유발하는데 그 예로 다발성 경화증, 당뇨병성 신경 병증 및 포진 후 신경통 (대상 포진) 등이 있다. 이러한 가려움은 감각신경세포에 의해 발생 되며, 이 신경세포는 등뿌리 신경절(dosal root ganglion)에 세포체(cell body)를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
소양증의 여러 형태가 히스타민(histaminegic pruritus)에 의해 매개 된다고 알려져 있으며, 말라리아 치료제인 클로로퀸(chloroquine)은 그 부작용으로 히스타민-비의존적(non-histaminergic pruritus) 소양증을 유발하는 것으로 알려져 있다.
Mas-related G protein-coupled receptor (Mrgprs) 종류의 수용체들이 말초 감각뉴런에만 발현되는 G단백질 연결수용체(GPCR: G protein-coupled receptors)로서 히스타민-비의존적(non-histaminergic pruritus)수용체로 알려져 있다. 이 수용체들은 성인의 다양한 조직들에서 관찰되는데 특히 신경세포에 많이 분포한다(Dong et al. 2001). 그 중에서 Mrgpr X1은 사람의 등뿌리 신경 절(dosal root ganglion)에 분포한다.
히스타민(histaminegic pruritus)에 의해 매개되는 소양증은 히스타민 수용체 1(human histamine receptor 1)의 길항물질(antagonist)에 의해 방어된다고 알려져있지만(비특허문헌 1), 히스타민-비의존적(non-histaminergic pruritus) 소양증에는 효과가 없다. 알레르기성 가려움증(allergic itch)은 히스타민(histamine)을 매개로 한 것으로, 전체 가려움증의 1/3을 차지하고 있을 뿐이다. 따라서 알레르기성 가려움증은 항히스타민제(antihistamines)로 치료될 수 있지만, 대부분의 가려움증은 그렇지 못하다.
현재 소양증의 치료제로는 칼라민(calamine) 로션이나 1% 멘톨 로션으로 피부를 시원하게 하는 제제, 스테로이드제, 항히스타민제 등이 사용되고 있다. 그러나 피부를 시원하게 하는 제제의 경우 극히 일시적인 효과만 나타낸다는 한계점이 있다. 반면, 스테로이드제는 강력한 항염증 작용으로 관절, 뇌혈관, 염증, 알레르기 질환 등 다양한 질환의 병증을 가라앉히는 효과가 탁월하고 신속해 치료에 사용되지만 장기, 과다 사용시 발생 되는 부작용이 밝혀지면서 사용이 제한되고있다. 또한, 항히스타민제는 주로 먹는 약으로 이용되는데, 소양증에 직접 관여하는 H1 수용체만을 억제하는 제제들이 개발되고 있지만, 전반적으로 인지능력 및 운동신경이 둔해지는 부작용을 야기하므로 이 역시 사용이 제한적이다. 이처럼 현재까지 소양증에 보편적인 치료방법이 없어 안전하고 효과가 좋은 제품이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 히스타민 매개 소양증 뿐만 아니라 히스타민 비의존성 소양증에도 안전한 효과를 보이는 치료제를 연구하던 중, 피라졸 유도체 화합물이 Mrgpr X1 및 hH1R(human histamin receptor subtype 1)의 활성억제에 효과적인 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
2009 Sensory neuron-specific GPCR Mrgprs are itch receptors mediating chloroquine-induced pruritus. Cell 139, 1353-1365 (2009)
본 발명의 목적은 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 소양증의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소양증 예방 또는 치료용 화합물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017122515211-pat00001
(상기 화학식 1에서,
R1, R2, R3, A, m 및 n은 본 명세서에서 정의한 바와 같다.)
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 소양증의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017122515211-pat00002
(상기 화학식 1에서,
R1, R2, R3, A, m 및 n은 본 명세서에서 정의한 바와 같다.)
나아가, 본 발명은 MRGPR X1(Mas-related G protein-coupled receptor)을 발현하는 세포에 소양증 유발 물질을 처리하여 배양시키는 단계(단계 1); 및
상기 소양증이 유발된 세포에 후보 물질을 처리한 후 MRGPR X1의 활성 억제를 측정하는 단계(단계 2);를 포함하는 소양증 예방 또는 치료용 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 hH1R(human Histamine 1 Receptor)을 발현하는 세포에 소양증 유발 물질을 처리하여 배양시키는 단계(단계 1); 및
상기 소양증이 유발된 세포에 후보 물질을 처리한 후 hH1R의 활성 억제를 측정하는 단계(단계 2);를 포함하는 소양증 치료 또는 예방용 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 소양증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 세포 내의 Mrgpr X1의 활성을 억제시킴으로써 소양증 증상을 완화시킬 수 있으므로 히스타민 비 의존성 소양증의 예방 또는 치료제로 유용하게 쓰일 수 있다. 또한, 세포 내의 hH1R 활성을 억제시킴으로써 소양증 증상을 완화시킬 수 있으므로 히스타민 매개 소양증의 예방 또는 치료제로도 유용하게 쓰일 수 있다. 나아가 피부건조증(Dry skin)에 대해서도 유의성 있는 개선 효과를 가지는 것이 피부건조증 마우스 모델 실험을 통해 입증되었으므로 피부건조증의 치료제로써도 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 건선에 의한 소양증 증상을 완화시킬 수 있으므로, 건선의 치료제로써도 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 생체 내 약물 투여시에도 이상 반응을 일으키지 않고 안정적인 활동능력을 유지할 수 있다.
도 1은 Mrgpr X1 세포에 클로로퀸만을 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 Mrgpr X1 세포에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을클로로퀸과 함께 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 hH1R 세포에 Histamine만을 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 hH1R 세포에 Histamine 과 Diphenhydramine를 함께 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 hH1R 세포에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 Histamine과 함께 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 히스타민 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.
도 7은 클로로퀸 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.도 8은 피부건조증(Dry skin) 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.도 9는 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 마우스의 Rota rod 운동 능력 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 건선(Psoriatic) 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017122515211-pat00003
이때, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알콕시, -NO2, -NR4R5 또는 비치환 또는 치환된 C6-C12 아릴일 수 있고, 상기 치환된 C6-C12 아릴은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알콕시, -NO2 및 -NR4R5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 이때, 상기 R4 및 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬일 수 있고;
R3는 수소, -(C=O)OR6 또는 비치환 또는 치환된 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 3 내지 10 각 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐일 수 있고, 이때, 상기 R6는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬일 수 있고, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬 및 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A는 -NH-, -O-, -S-, -(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-8의 정수일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시, -NO2, -NR4R5 또는 비치환 또는 치환된 C6-C10 아릴일 수 있고, 상기 치환된 C6-C10 아릴은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시, -NO2 및 -NR4R5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 이때, 상기 R4 및 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고;
R3는 수소, -(C=O)OR6 또는 비치환 또는 치환된 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 3 내지 8 각 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐일 수 있고, 이때, 상기 R6는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬 및 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A는 -NH-, -O-, -S-, -(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-6의 정수일 수 있다.
나아가, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, -NO2 또는 비치환 또는 치환된 페닐일 수 있고, 상기 치환된 페닐은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시 및 -NO2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
R3는 수소, -(C=O)OR6 또는 비치환 또는 치환된 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 5 내지 7 각 헤테로사이클로알킬일 수 있고, 이때, R6는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬로 치환될 수 있고;
A는 -(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-5의 정수일 수 있다.
더 나아가, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 메틸 또는 비치환 또는 치환된 페닐일 수 있고, 상기 치환된 페닐은 메틸, 메톡시 및 -NO2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
R3는 -(C=O)OH 또는 하나 이상의 메틸기로 치환된 피페리디닐일 수 있고;
A는 -(C=O)NH- 또는 -NH(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-3의 정수일 수 있다.
상기 소양증은 히스타민 의존성 소양증일 수 있으며, 히스타민 비의존성 소양증일 수 있고, 클로로퀸 유발 소양증일 수 있고, 피부 건조증에서 유발되는 소양증일 수 있고, 건선(Psoriatic)에서 유발되는 소양증일 수 있다. 또한, 신경 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 자가 감작성 피부염, 모충 피부염, 피지결핍(asteatosis), 노인성 소양증 피부, 벌레 물림, 감광성 피부염, 두드러기, 양진, 헤르페스, 농가진(impetigo), 습진(eczema), 백선(tinea), 태선(lichen), 개선(scabies) 또는 심상성 여드름에 의해 유발된 소양증일 수 있다. 이때, 히스타민 의존성 소양증의 경우, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 hH1R(human Histamine 1 Receptor)에 대한 가역적, 경쟁적 길항작용에 의해 히스타민의 작용을 차단하는 역할을 함으로써 히스타민으로부터 유발되는 소양증을 치료 또는 예방한다.
또한, 클로로퀸 유발 소양증의 경우, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 MRGPR X1에 대한 가역적, 경쟁적 길항작용에 의해 클로로퀸의 작용을 차단하는 역할을 함으로써 클로로퀸으로부터 유발되는 소양증을 치료 또는 예방한다.
상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 질산, 탄산 등과 같은 무기산과의 염, 개미산, 초산, 프로피온산, 옥살산, 석신산, 벤조산, 시트르산, 말레인산, 말론산, 타르타르산, 글루콘산, 락트산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과의 염, 글리신, 알라닌, 바닐린, 이소루신, 세린, 시스테인, 시스틴, 아스파라진산, 글루타민, 리진, 아르기닌, 타이로신, 프롤린 등과 같은 아미노산과의 염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산과의 염, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속과의 반응에 의한 금속염, 또는 암모늄 이온과의 염 등을 포함한다.
상기 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 무독성이면서 약학적으로 허용 가능한 담체, 보강제 및 부형제 등을 첨가하여 제형화 될 수 있으며, 예컨대 정제, 캅셀제, 트로키제, 액제, 현탁제 등의 경구 투여용 제제 또는 비경구 투여용 제제로 제조될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등 이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 있으며, 예를 들면 락토스, 덱스트 로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 마그네슘 스테아 린산염, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소디움 알진산염, 메틸셀룰로오스, 소디움 카르복실메틸셀룰로오스, 아가, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등을 들 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병 정도에 따라 달라질 수 있으나, 몸무게가 70 kg인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적인 투여용량은 1일 0.01 mg 내지 5000 mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 소양증의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112017122515211-pat00004
이때, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알콕시, -NO2, -NR4R5 또는 비치환 또는 치환된 C6-C12 아릴일 수 있고, 상기 치환된 C6-C12 아릴은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알콕시, -NO2 및 -NR4R5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 이때, 상기 R4 및 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬일 수 있고;
R3는 수소, -(C=O)OR6 또는 비치환 또는 치환된 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 3 내지 10 각 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐일 수 있고, 이때, 상기 R6는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬일 수 있고, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알킬 및 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C6 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A는 -NH-, -O-, -S-, -(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-8의 정수일 수 있다.
또한, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시, -NO2, -NR4R5 또는 비치환 또는 치환된 C6-C10 아릴일 수 있고, 상기 치환된 C6-C10 아릴은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시, -NO2 및 -NR4R5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고, 이때, 상기 R4 및 R5는 서로 독립적으로 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고;
R3는 수소, -(C=O)OR6 또는 비치환 또는 치환된 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 3 내지 8 각 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐일 수 있고, 이때, 상기 R6는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알케닐은 할로겐, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬 및 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
A는 -NH-, -O-, -S-, -(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-6의 정수일 수 있다.
나아가, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, -NO2 또는 비치환 또는 치환된 페닐일 수 있고, 상기 치환된 페닐은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬, 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알콕시 및 -NO2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
R3는 수소, -(C=O)OR6 또는 비치환 또는 치환된 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 하나 이상 포함하는 5 내지 7 각 헤테로사이클로알킬일 수 있고, 이때, R6는 수소 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬일 수 있고, 상기 치환된 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 직쇄 또는 분지쇄의 C1-C3 알킬로 치환될 수 있고;
A는 -(C=O)NH-, -NH(C=O)-, -(C=O)O- 또는 -O(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-5의 정수일 수 있다.
더 나아가, 상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 서로 독립적으로 메틸 또는 비치환 또는 치환된 페닐일 수 있고, 상기 치환된 페닐은 메틸, 메톡시 및 -NO2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있고;
R3는 -(C=O)OH 또는 하나 이상의 메틸기로 치환된 피페리디닐일 수 있고;
A는 -(C=O)NH- 또는 -NH(C=O)-일 수 있고; 및
m 및 n은 서로 독립적으로 0-3의 정수일 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능성 식품 조성물은 소양증의 예방 또는 개선을 목적으로 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품, 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 g 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 화학식 1의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 피라졸 유도체는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 중요하지 않지만 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 피라졸 유도체를 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
나아가, 본 발명은 MRGPR(Mas-related G protein-coupled receptor) X1을 발현하는 세포에 소양증 유발 물질을 처리하여 배양시키는 단계(단계 1); 및
상기 소양증이 유발된 세포에 후보 물질을 처리한 후 MRGPR X1의 활성 억제를 측정하는 단계(단계 2);를 포함하는 소양증 예방 또는 치료용 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
이때, 상기 단계 1의 소양증 유발 물질은 클로로퀸일 수 있으며, 히스타민을 매개로 하지 않는 히스타민 비의존성 소양증 유발물질이라면 종류에 구애받지 않고 모두 사용할 수 있다. 한편, 상기 소양증 유발 물질은 급성 소양증 유발 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은 hH1R(human Histamine 1 Receptor)을 발현하는 세포에 소양증 유발 물질을 처리하여 배양시키는 단계(단계 1); 및
상기 소양증이 유발된 세포에 후보 물질을 처리한 후 hH1R의 활성 억제를 측정하는 단계(단계 2);를 포함하는 소양증 치료 또는 예방용 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이때, 상기 단계 1의 소양증 유발 물질은 히스타민, 인터류킨-1(interleukin-1), 싸이토카인(cytokine), 세로토닌(serotonin), 아세티콜린(scethycholine), 서브스턴스 P(substance P), 류코트린(leukotrine) 및 프로스타글란딘(prostaglandin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 히스타민 의존성 소양증 유발 물질이라면 상기 종류에 한정되지 않고 모두 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법에 있어서 상기 단계 2의 측정은 형광 분석법, 형광 공명에너지 전달 분석법, 생물발광 공명에너지 전달 분석법, 형광 편광도분석법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation assay), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 사용할 수 있으며, 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 측정방법이라면 이에 제한받지않고 모두 사용할 수 있다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
하기 실험예 1로부터 화학식 2로 표시되는 피라졸 유도체 화합물을 포함하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 도출하였으며, 화학식 2로 표시되는 피라졸 유도체 화합물은 Com Genex사로부터 구입하여 준비하였다(CAS Number. 1023449-28-6).
[화학식 2]
Figure 112017122515211-pat00005
< 실험예 1> 소양증 치료 또는 예방용 활성물질 스크리닝
본 발명에 따른 소양증 치료 또는 예방용 화합물을 찾기 위해 스크리닝 방법을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. MRGPR X1 stable cell line 제조
Human MRGPR X1 gene을 pcDNA5 FRT vector에 부차 클로닝(subcloning)하여 HEK 293T FRT cell 에 형질주입(transfection) 시킨 뒤, 37℃, 5%의 CO2 배양기에서 48시간 동안 배양시켰다.
단일 콜로니(Single colony)가 잘 형성되는 양을 찾기 위해 형질주입한 세포를 계열 희석(serial dilution)하여 100mm dish에 옮겨 골고루 퍼지게 한 뒤 3~4일에 한번씩 50㎍/㎖ 하이그로마이신(hygromycin)이 들어있는 배지를 갈아주며 콜로니가 생길 때까지 키웠다.
콜로니가 형성되었을 때, 단일 콜로니만 24 well plate에 옮겨 배양하였다. 그 중에 잘 자란 것은 6 well plate에 옮겨 배양하였다. 이후 세포를 항생제 선택(antibiotic selection)하였다. 키운 세포들 중 제오신(Zeocin)에서는 죽고, hygromycin에는 잘 자라는 것을 선택하기 위해 6 well plate에 같은 cell을 나눠서 시딩(seeding)하고, 한 plate에는 50㎍/㎖ Zeocin 배지를, 다른 한 plate에는 50㎍/㎖ hygromycin이 들어있는 배지를 넣어주었다. 그 중에 중 Zeocin에서는 죽고, hygromycin에는 잘 자라는 것을 선택하여 PCR과 β-galactosidase assay로 형질주입성공 여부를 확인하였다.
2. MRGPR X1 screening assay
상기 제조된 Mrgpr X1 stable cell line으로 소양증에 효과가 있는 물질을 찾기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, MRGPR X1 stable cell을 8000 cells/well이 되도록 counting한 뒤, Poly-D-Lysine coated plate 384 well black/clear plate에 시딩 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
이후의 과정은 Biomex FX(Beckman)를 이용하여 진행하였다. 배지 제거 후, 최종 농도 2.5μM이 되도록 Na-HEPES 완충 용액(5mM KCl, 2mM MgCl2, 140mM NaCl, 10mM NaOH-HEPES, pH7.2)에 녹인 flo-3 AM dye를 25μl 첨가한 뒤, 37도, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 배양시켰다.
배양하는 시간 동안 화합물 플레이트를 제조하였다. 6mM Original stock plate(96 plate form)를 잘 섞이도록 pre mix를 해준 뒤, Intermediate plate를 만들었다. Multi drop을 이용하여 384 clear V bottom plate에 1mM 클로로퀸(chloroquine)이 녹아있는 Na-HEPES 완충 용액을 49μl씩 분주하였다. 그 다음, Original stock plate (6mM, 100% DMSO)에서 1μl를 취해 intermediate plate에 희석한 뒤(120uM 화합물, 1mM 클로로퀸 2% DMSO), 최종 화합물 plate를 만들었다.
Multi drop을 이용하여 384 clear plate 에 1mM 클로로퀸(chloroquine)이 녹아있는 Na-HEPES 완충 용액을 40μl씩 분주하고, intermediate plate에서 10μl를 취해 최종 화합물 plate에서 희석하였다(24μM화합물, 1mM 클로로퀸, 0.4% DMSO).
Incubation이 끝난 후, dye를 버리고 Na-HEPES 완충 용액 25μl를 넣어 세척을 한번 한 뒤, 다시 완충 용액을 25μl 넣어주었다. 그 다음, 완충 용액 25μl가 들어있는 assay plate에 1차 후보 물질을 25μl 넣고 plate를 reading 하였다(최종 12μM 화합물, 500μM 클로로퀸, 0.2% DMSO). 비히클(vehicle)은 500μM 클로로퀸을 0.2% DMSO에 녹여 처리하였다.
마이크로 플레이트리더 (FlexstaionⅡ384, Molecular Devices)를 이용하여 실험결과를 분석하였다. Ex 488nm, Em 535nm 파장에서 3.2초 간격으로 80초간 형광을 이용하여 분석하였으며, 그 결과 결과값이 양호한 화합물들을 분류하여 910개의 소양증 치료용 2차 후보 물질을 도출하였다.
3. Human Histamine 1 Receptor antagonist assay
상기 MRGPR X1 실험에서 후보군으로 선별된 910개의 2차 화합물을 대상으로 Human Histamine 1 Receptor antagonist assay 실험을 수행하였다.
HEK 293T cell에 2μg human histamine 1 receptor를 일시적 형질주입(transient transfection)하여 4000 cells/well에 시딩한 후, 37도, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.
이후의 과정은 Biomex FX를 이용하여 진행하였다. 배지 제거 후, 비히클(vehicle)과 실험군은 최종 농도 2.5μM이 되도록 Na-HEPES 완충 용액(5mM KCl, 2mM MgCl2, 140mM NaCl, 10mM NaOH-HEPES, pH7.2)을 녹인 flo-3 AM dye를 25μl, 대조군에는 5uM Diphenhydramine이 녹아있는 Na-HEPES 완충에 최종 농도 2.5μM이 되도록 flo-3 AM dye를 녹여 25μl 처리한 뒤, 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 배양하였다.
배양하는 시간 동안 화합물 플레이트를 만들었다. 6mM Original stock plate (96 plate form)를 잘 섞이도록 예비 배합(pre mix)을 해준 뒤, Intermediate plate를 만들었다. Multi drop을 이용하여 384 clear V bottom plate에 2μM Histamine이 녹아있는 Na-HEPES 완충 용액을 49μl씩 분주하였다(대조군 well은 제외). Original stock plate (6mM, 100% DMSO)에서 1μl를 취해 intermediate plate에 희석시킨 뒤(120μM 화합물, 2μM Histamine, 2% DMSO), 최종 화합물 플레이트를 만들었다.
Multi drop을 이용하여 384 clear plate에 2μM Histamine이 녹아있는 Na-HEPES 완충 40μl씩 분주하고, intermediate plate에서 10μl를 취해 최종 화합물을 plate에서 희석시켰다(24μM 화합물, 2μM Histamine, 0.4% DMSO, 대조군 well은 제외).
Incubation이 끝난 후, dye를 버리고 Na-HEPES 완충 용액 25μl를 넣어 한번 세척한 뒤, 다시 완충 용액을 25μl 넣어주었다(대조군 well은 제외). 그리고, 대조군에는 5μM Diphenhydramine, 2μM Histamine이 녹아있는 Na-HEPES 완충 용액 25μl를 넣어주었다. 마지막으로, 완충 용액 25μl가 들어있는 assay plate에 compound 25μl를 넣고 플레이트를 리딩 하였다(최종 12μM 화합물, 1μM Histamine, 0.2% DMSO).
마이크로 플레이트리더 (FlexstaionⅡ384, Molecular Devices)를 이용하여 실험결과를 분석하였다. Ex 488nm, Em 535nm 파장에서 3.2초 간격으로 80초간 형광을 이용하여 분석하였으며, 그 결과 상기 910개의 화합물 중에서 효과가 우수한 25개의 화합물들이 도출되었다. 이들의 유사구조들을 묶은 몇 종의 scaffold를 찾을 수 있었고, 이 중 대표적 구조를 가진 4종의 화합물을 도출할 수 있었다. 4개의 화합물 중에서 소양증 치료 효과가 뛰어남과 동시에 혈액에 대한 용해도가 우수한 화합물 3번을 최종 소양증 치료물질로 선택하였으며, 화합물 3번은 상기 실시예 1의 화학식 2로 표시되는 화합물이다.
3. 실험결과 분석
상기 최종 소양증 치료물질 화합물 3번에 대한 Mrgpr X1 발현 세포 활성 및 hH1R 발현 세포 활성을 평가하기 위하여 상기 실험에서 측정된 데이터를 비교 분석 하였다.
도 1은 Mrgpr X1 세포에 클로로퀸만을 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이고,
도 2는 Mrgpr X1 세포에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 클로로퀸과 함께 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1 및 도 2를 통해 확인할 수 있듯이, 클로로퀸만 처리했을 때 보다 클로로퀸과 본 발명에 따른 약학적 조성물을 같이 처리하였을 때 형광 분석 결과를 약 54% 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 소양증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 세포내의 Mrgpr X1 활성을 억제시킴으로써 소양증 증상을 완화시킬 수 있으므로 히스타민 비의존성 소양증의 예방 또는 치료제로 유용하게 쓰일 수 있다.
도 3은 hH1R 세포에 Histamine만을 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이고,
도 4는 hH1R 세포에 Histamine 과 Diphenhydramine를 함께 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이며,
도 5는 hH1R 세포에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 Histamine과 함께 처리했을 때의 형광 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 ~ 5에서도 확인할 수 있듯이 Histamine과 Diphenhydramine(H1 수용체 대항제)를 같이 처리하였을 때 100% 감소 되는 수치를 기준으로 본 발명의 약학적 조성물은 약 94% 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 소양증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 세포 내의 hH1R 활성을 억제시킴으로써 소양증 증상을 완화시킬 수 있으므로 히스타민 매개 소양증의 예방 또는 치료제로 유용하게 쓰일 수 있다.
< 실험예 2> 본 발명에 따른 소양증 치료제의 동물 모델 실험
본 발명에 따른 소양증 치료용 약학적 조성물의 생체내 소양증 치료효과를 확인하기 위하여 히스타민 마우스 소양증평가, 클로로퀸 마우스 소양증평가, 피부 건조증 마우스 모델의 소양증 평가, 건선 마우스 모델의 소양증 평가 및 마우스 운동능력 실험을 수행하였다.
1. 히스타민 마우스 모델의 소양증 평가
상기 실시예 1의 약학적 조성물을 사용하여 히스타민 마우스 모델의 소양증 치료 효과를 평가하는 실험을 수행하였다.
7주령 C57BL6 마우스를 새로운 케이지에 넣어 30분간 적응시킨 후 실험을 시작하였다. 대조군에는 3% DMSO를 생리식염수 (0.9% saline)에 녹인 뒤 50μl 복강주사 하였고, 동물 모델 마우스에는 3% DMSO가 포함된 생리식염수 (0.9% saline)에 실시예 1의 약학적 조성물을 (30mg/kg) 50㎕ 복강주사 한 뒤, 30분간 동일한 케이지에 넣어두었다.
그 뒤, 대조군과 동물모델 마우스에 Histamie을 500㎍/50㎕를 등쪽 피하에 주사한 뒤, 디지털비디오 카메라로 30분동안 행동을 녹화하였다. 그 후, 녹화된 비디오 파일을 컴퓨터에서 재생하면서 긁는 횟수를 기록하였다. 마우스가 뒷발을 바닥에서 떼어 다시 바닥에 내려놓을 때까지 피부를 긁는 연속된 행동을 1회 긁는 것으로 보았으며, 30분 동안 관찰된 긁는 횟수를 소양증 정도의 척도로 사용하였다.
도 6은 히스타민 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, 대조군에서 30분간 누적된 총 긁는 횟수의 평균은 118.38회로 나타났으며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여군에서 긁는 횟수의 평균은 39.90회로 나타났다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물은 히스타민 의존성 소양증(histaminergic pruritus)을 감소시키는 효과가 있으므로, 소양증 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
2. 클로로퀸 마우스 모델의 소양증 평가
상기 실시예 1의 약학적 조성물을 사용하여 클로로퀸 마우스 모델의 소양증 치료 효과를 평가하는 실험을 수행하였다.
7주령 C57BL6 마우스를 새로운 케이지에 넣어 30분간 적응시킨 후 실험을 시작하였다. 대조군에는 3% DMSO를 생리식염수 (0.9% saline)에 녹인 뒤 50㎕ 복강주사 하였고, 동물 모델 마우스에는 3% DMSO가 포함된 생리식염수(0.9% saline)에 실시예 1의 약학적 조성물을 (30mg/kg) 50㎕ 복강주사 한 뒤, 30분간 동일한 케이지에 넣어두었다.
그 뒤 대조군과 동물모델 마우스에 Chloroquine을 200㎍/50㎕를 등쪽 피하에 주사한 뒤, 디지털비디오 카메라로 30분 동안 행동을 녹화하였다. 녹화된 비디오 파일을 컴퓨터에서 재생하면서 긁는 횟수를 기록하였다. 마우스가 뒷발을 바닥에서 떼어 다시 바닥에 내려놓을 때까지 피부를 긁는 연속된 행동을 1회 긁는 것으로 보았으며 30분 동안 관찰된 긁는 횟수를 소양증 정도의 척도로 사용하였다.
도 7은 클로로퀸 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 대조군에서 30분간 누적된 총 긁는 횟수의 평균은 425.00회로 나타났으며, 본 발명의 약학적 조성물 투여군에서 긁는 횟수의 평균은 150.50회로 나타났다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 피라졸 유도체 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 히스타민 매개 소양증 뿐만 아니라 히스타민 비의존성 소양증(non-histaminergic pruritus)에 대해서도 유의성 있는 개선 효과가 있음을 알 수 있으며, 히스타민 비의존성 소양증 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
3. 피부건조증(Dry skin) 마우스 모델의 소양증 평가
상기 실시예 1의 약학적 조성물을 사용하여 피부건조증 마우스 모델의 소양증 치료 효과를 평가하는 실험을 수행하였다.
먼저, 피부건조증(Dry skin) 마우스 모델을 제작하였다. Jpn J Pharmacol. 2002 Mar;88(3):285-92. 논문에 개시된 피부건조증(Dry skin)모델 마우스를 다음과 같이 준비하였다. 7주령 C57BL6 마우스에 ENTOBAR® 을 생리식염수(0.9% saline)와 1:1의 비율로 섞은 뒤, 20㎕ 복강주사하여 마취를 시켰다. 그 다음, Clipper를 이용하여 마우스 오른쪽 목덜미 부분의 털을 깎았다. 에틸 에테르와 아세톤을 1:1의 비율로 섞은 뒤, 탈지면에 충분히 적신 뒤, 1분 동안 문질렀다. 그 뒤, 물을 충분히 적신 탈지면을 동일한 방법으로 문질렀다. 이 과정을 오전 오후 각 1회씩 5일 동안 진행하였다.
다음으로, 피부건조증(Dry skin) 마우스 모델의 소양증 평가하였다. 5일째 오후 대조군에는 3% DMSO를 생리식염수 (0.9% saline)에 녹인 뒤 50㎕ 복강주사 하였고, 동물 모델 마우스에는 3% DMSO가 포함된 생리식염수 (0.9% saline)에 실시예 1의 약학적 조성물을 (30mg/kg) 50㎕ 복강주사 한 뒤, 30분간 동일한 케이지에 넣어두었다. 30분 뒤, 디지털비디오 카메라로 30분 동안 행동을 녹화하였다. 녹화된 비디오 파일을 컴퓨터에서 재생하면서 긁는 횟수를 기록하였다. 마우스가 뒷발을 바닥에서 떼어 다시 바닥에 내려놓을 때까지 피부를 긁는 연속된 행동을 1회 긁는 것으로 보았으며, 30분 동안 관찰된 긁는 횟수를 소양증 정도의 척도로 사용하였다.
도 8은 피부건조증(Dry skin) 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, 대조군에서 30분간 누적된 총 긁는 횟수의 평균은 130.00회로 나타났으며, 본 발명의 약학적 조성물 투여군에서 누적된 총 긁는 횟수의 평균은 14.00회로 나타났다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물은 피부건조증(Dry skin)에 의한 소양증에 대해서 유의성 있는 개선 효과를 가지므로, 피부건조증에 의한 소양증 치료 또는 피부건조증의 치료제로써 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
4. Rota rod 운동능력(Motor condition )평가
본 발명에 따른 약학적 조성물의 생체내 안정성을 평가하기 위하여 마우스 모델을 대상으로 Rota rod 운동 능력을 평가하였다.
마우스를 Rota rod 기계 위에 올려놓고 속도를 최저 4에서 최고 40까지 맞춰 놓고 떨어질 때까지 올려둔 후, 쥐가 떨어지게 되면 케이지로 옮겼다. 이 과정을 하루에 3번 연속적으로 3일 동안 수행하여 마우스를 Rota rod 기계에 적응 시켰다. 3일 동안 적응실험을 한 뒤, 케이지로 옮겨 안정을 시켰다.
대조군에는 3% DMSO를 생리식염수(0.9% saline)에 녹인 뒤 50㎕ 주사 하였고, 동물 모델 마우스에는 3% DMSO가 포함된 생리식염수 (0.9% saline)에 실시예 1의 약학적 조성물을(30mg/kg) 50㎕주사 한 뒤, 30분간 동일한 케이지에 넣어두었다. 그 뒤, 적응실험 때와 똑같이 3번 반복하여 떨어진 시간의 평균을 구하였다.
도 9는 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 마우스의 Rota rod 운동 능력 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9에서 확인할 수 있듯이, 대조군과 본 발명의 약학적 조성물 투여군에서 운동능력(motor condition)능력을 비교했을 때, 각 군 간에 큰 차이가 없었다.
따라서, 본 발명에 따른 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물은 약물 투여시에도 생체내 이상 반응을 일으키지 않고 안정적인 활동능력을 유지할 수 있으므로, 소양증 치료 또는 예방용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
5. 건선(psoriatic) 마우스 모델의 소양증 평가
상기 실시예 1의 약학적 조성물을 사용하여 건선 마우스 모델의 소양증 치료 효과를 평가하는 실험을 수행하였다.
먼저, 건선 마우스 모델을 제작하였다. Pain. 2016 Nov; 2536-2543 논문에 개시된 건선(psoriatic)모델 마우스를 다음과 같이 준비 하였다. 7주령 C57BL6 마우스를 졸레틸 15mg/kg을 saline과 1:1로 희석 한 뒤, 럼푼 5mg/kg을 섞어 복강주사하여 마취 한 뒤, Clipper를 이용하여 마우스 등 부분을 2.5x2cm크기로 1차 제모하고, 2차로 일자 칼날을 이용하여 추가 제모한다. 정상군에는 바세린크림을 면봉을 이용하여 제모한 부위에 7일 동안 문지른다. 대조군과 실험군에는 62.5mg Aldara cream(5% imiquimod)을 면봉을 이용하여 제모한 부위에 7일 동안 문지른다.
다음으로, 건선 마우스 모델의 소양증을 평가하였다. 8일째 정상군과 대조군에는 3% DMSO를 생리식염수 (0.9% saline)에 녹인 뒤 50㎕ 복강주사 하였고, 실험군에는 실시예 1의 약학적 조성물을 0.9% saline에 녹인 뒤(30mg/kg) 50㎕ 복강주사 한 뒤, 30분간 동일한 케이지에 넣어두었다. 30분 뒤, 디지털비디오 카메라로 30분동안 행동을 녹화하였다. 녹화된 비디오 파일을 컴퓨터에서 재생하면서 긁는 횟수를 기록하였다. 마우스가 뒷발을 바닥에서 떼어 다시 바닥에 내려놓을 때까지 피부를 긁는 연속된 행동을 1회 긁는 것으로 보았다. 30분 동안 관찰된 긁는 횟수를 소양증 정도의 척도로 사용하였다.
도 10은 건선(Psoriatic) 마우스 모델에 실시예 1의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 처리 했을 때의 소양증 치료 효과를 평가한 그래프이다.
도 10에 나타난 바와 같이,
정상군(바세린 크림 군)에서 누적된 총 긁는 횟수의 평균은 20.00회로 나타났으며, 대조군(Aldara크림군)에서 누적된 총 긁는 횟수의 평균은 71.00회 였으며, 본 발명의 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물의 투여군에서 누적된 총 긁는 횟수의 평균은 1.00회로 나타나, 긁는 횟수가 현저하게 감소하였다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 피라졸 유도체를 포함하는 약학적 조성물은 건선(psoriatic)에 의한 소양증에 대해서 유의성 있는 개선 효과를 가지므로, 건선에 의한 소양증 치료 또는 건선의 치료제로써 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
< 제제예 1> 산제의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
< 제제예 2> 정제의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
< 제제예 3> 캡슐제의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
< 제제예 4> 주사제의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 100 ㎎
만니톨 180 ㎎
Na2HPO4ㆍ2H2O 26 ㎎
증류수 2974 ㎎
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
< 제제예 5> 연고제의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 5 g
세틸팔미테이트 20 g
세탄올 40 g
스테아릴알콜 40 g
미리스탄이소프로필 80 g
폴리솔베이트 60 g
파라옥시안식향산 프로필 1 g
파라옥시안식향산 메틸 1 g
인산 및 정제수 적당량
통상적인 연고제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 연고제를 제조하였다.
< 제제예 6> 건강기능식품의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 500ng
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70mg
비타민 E 1.0mg
비타민 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2mg
비타민 C 10mg
비오틴 10mg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50mg
판토텐산 칼슘 0.5mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
< 제제예 7> 건강기능음료의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 500ng
구연산 1000mg
올리고당 100g
매실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 900ml
통상의 건강 기능 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 기능 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 건선(Psoriatic)에 의해 유발된 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112018045880299-pat00018

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 건선(Psoriatic)에 의해 유발된 소양증의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112018045880299-pat00019
KR1020170168253A 2017-12-08 2017-12-08 피라졸 유도체를 유효성분으로 함유하는 소양증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 검출하기 위한 스크리닝 방법 KR101867779B1 (ko)

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