KR20190091222A

KR20190091222A - 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20190091222A
Application number: KR1020190010544A
Authority: KR
Inventors: 민상현; 김준우; 이희진; 유지훈; 최동규; 송영우; 최재헌; 김재호
Original assignee: 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단; 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2019-01-28
Publication date: 2019-08-05
Also published as: WO2019147089A1; KR102217010B1

Abstract

칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시된다. 상기 약학적 조성물은 단독으로 사용하여도 암 줄기세포의 성장 및 증식을 저해하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 종래 항암제와 병용 투여할 경우, 보다 우수한 약리 효과를 나타내는 바, 암의 재발, 전이, 진행을 억제시킬 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 병용 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for use in preventing or treating cancer containing calcium channel blocker or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient}

칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

줄기세포는 자가재생(self-renewal)을 할 수 있고, 각 기관의 세포로 분화(differentiation)하여 기관형성(organogenesis)을 이룰 수 있는 미성숙(immature) 세포를 말한다. 줄기세포는 크게 두 종류로 분류할 수 있다. 배아줄기세포(embryonic stem cell)는 신체의 어느 기관으로도 분화할 수 있고, 주머니배(blastocyst)에서 기원한다. 연구목적의 줄기세포는 수정 후 6일경에 세포 수가 대략 200개인 주머니배의 내세포괴(inner cell mass)에서 채취한다. 다른 종류의 줄기세포는 성인줄기세포(adult stem cell)이다. 성인줄기세포는 자가재생과 분화를 할 수 있다는 점에서는 배아줄기세포와 동일하지만 분화가 주로 특정 기관 내 세포로 이루어진다는 점에서 배아줄기세포와 구분된다. 성인줄기세포의 대표적인 예로 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)을 들 수 있다.

암줄기세포(cancer stem cell)는 줄기세포와 같이 비대칭적 분열을 통해 자가재생과 분화를 할 수 있으나, 정상 줄기세포와 달리 분열조절능력에 장애가 생겨 종양을 생성하는 세포이다. 최근 연구를 통해 정상 줄기세포에서 발견되는 Notch, Sonic hedgehog (SHH), Wnt, β-catenin, phosphatase and tensin homolog [HONG7](PTEN), transforming growth factor (TGF)-β, Bmi-1 등의 신호경로가 악성종양에서 변형되어 있음이 밝혀졌다. 암줄기세포는 정상줄기세포와 높은 운동성, 자손(progeny)의 다양성, 강한 증식 잠재력, 혈관계(vasculature), 미성숙한 발현양상, nestin, epidermal growth factor (EGF)-receptor, PTEN의 발현, Hedgehog 신호경로 활성도, telomerase 활성도, Wnt 신호경로 활성도 등에서 공통된 특징을 보인다.

상기와 같은 이유로 암줄기세포를 타겟으로 한 항암제 개발이 활발히 이루어지고 있다.

대한민국공개특허 1020160094861

J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37:97-108

본 발명의 일 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 병용 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따라, 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따라, 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 항암제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용 제제가 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따라, 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 병용 제제 또는 건강기능식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따라, 암의 예방 또는 치료에 있어서의, 상기 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 병용 제제 또는 건강기능식품 조성물의 용도가 제공된다.

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 단독으로 사용하여도 암 줄기세포의 성장 및 증식을 저해하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 종래 항암제와 병용 투여할 경우, 보다 우수한 약리 효과를 나타내는 바, 암의 재발, 전이, 진행을 억제시킬 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 병용 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell) 생존능의 용량-반응(Dose-response) 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780 세포(ovarian cancer cell) 생존능의 용량-반응(Dose-response) 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)의 구체 형성을 분석한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)의 구체 형성을 분석하여 A2780-SP 세포의 증식을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness)과 관련된 마커들의 발현 변화를 관찰한 이미지이다.
도 6은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness)과 관련된 마커들의 발현 변화를 정량화한 그래프이다.
도 7은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포 생존 및 증식과 관련된 단백질의 활성 변화를 관찰한 이미지이다.
도 8은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포 생존 및 증식과 관련된 단백질의 활성 변화를 정량화한 그래프이다.
도 9는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 주기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 사멸을 측정한 그래프이다.
도 11은 A2780-SP 세포 및 A2780세포에서 칼슘 채널 서브유닛(Cacna1d, Cacna1f, Cacna1h) mRNA의 발현 수준을 Quantitative RT-PCR로 정량화 하여 나타낸 것이다.
도 12는 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, 각 칼슘 채널 서브유닛(Cacna1d, Cacna1f, Cacna1h)의 mRNA발현 수준을 Quantitative RT-PCR로 정량화 하여 넉다운을 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 13은 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, 암 줄기세포와 관련된 마커(OCT3/4, NANOG, SOX2, ALDH1, CD133)의 mRNA 발현 수준을 Quantitative RT-PCR로 정량화한 것을 나타낸 것이다.
도 14는 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness) 관련 마커와 암 줄기세포의 생존 및 증식과 관련된 단백질의 발현 변화를 관찰한 이미지이다.
도 15는 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness) 관련 마커와 암 줄기세포의 생존 및 증식과 관련된 단백질의 발현 변화를 정량화한 그래프이다.
도 16은 A2780-SP 세포에 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, 칼슘 전류 진폭이 줄어듦을 나타낸 그래프이다.
도 17은 실시예 약학적 조성물과 시스플라틴을 병용 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 생존율을 측정하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 실시예 약학적 조성물과 시스플라틴을 병용 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 증식을 분석하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 난소암 세포 종양 동물 모델(A2780-AD) 및 난소암 암 줄기세포 종양 동물모델(A2780-SP)에서, 실시예 약학적 조성물 단독처리 및 파클리탁셀(Paclitaxel)을 병용 처리하였을 때의 종양 형성 억제 효과를 평가하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 칼슘 채널 억제제는 하기 화학식 A 내지 화학식 D로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

[화학식 A(베니디핀, Benidipine)]

;

[화학식 B(라시디핀, Lacidipine)]

;

[화학식 C(마니디핀, Manidipine)]

;

[화학식 D(로메리진, Lomerizine)]

.

상기 암은 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 음경암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암 및 피부암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또한, 상기 암은 난소암일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 OCT3/4, NANOG, SOX2, ALDH1, CD133, pAKT, AKT, p-ERK, ERK, p-p38 및 p38로 이루어지는 단백질 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 억제할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 암 줄기세포의 증식을 억제할 수 있다.

다양한 in vitro 실험을 통하여 상기 약학적 조성물의 항암 효과를 측정한 결과, 상기 약학적 조성물은 암 세포 및 암 줄기세포의 생존능을 감소시키고, 증식을 억제하며, 암 줄기세포의 구체 형성 및 증식을 억제하고, 암 줄기세포와 관련된 마커 및 증식과 관련된 단백질의 발현을 억제하는 효과가 우수하고, 암 줄기세포의 세포 사멸을 증가시키므로, 항암 효과가 우수함을 확인하였다(실험예 2 내지 5 및 도 1 내지 10 참조).

따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

칼슘 채널 억제제는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

상기 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 칼슘 채널 억제제를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 상기 칼슘 채널 억제제는 이의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 광학 이성질체, 수화물 등의 형태로 사용될 수 있다.

상기 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등 이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.

상기 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 항암제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용 제제를 제공한다.

[화학식 A(베니디핀, Benidipine)]

;

[화학식 B(라시디핀, Lacidipine)]

;

[화학식 C(마니디핀, Manidipine)]

;

[화학식 D(로메리진, Lomerizine)]

.

또한, 상기 암은 난소암일 수 있다.

상기 병용 제제는 OCT3/4, NANOG, SOX2, ALDH1, CD133, pAKT, AKT, p-ERK, ERK, p-p38 및 p38로 이루어지는 단백질 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 억제할 수 있다.

상기 병용 제제는 암 줄기세포의 증식을 억제할 수 있다.

용어 "항암제"란 암세포의 각종 대사경로에 작용하여 암세포에 대하여 세포독성(cytotoxicity)이나 성장억제효과(cytostatic effects)를 나타내는 기존의 암 치료에 사용되는 공지의 약제를 총칭하는 것이며, 지금까지 개발된 대사길항제, 식물성 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제(topoisomerase inhibitor), 알킬화제, 항암성 항생물질, 호르몬제 및 기타 약제를 모두 포함하는 것이다.

본 발명의 일 측면에서, 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 항암제는 시스플라틴 또는 파클리탁셀일 수 있다.

상기 병용 제제를 항암제와 함께 투여하였을 때의 항암 효과를 측정한 결과, 상기 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 단독으로 투여하였을 때도 우수한 세포 증식 억제 효과를 나타내나, 항암제와 병용투여 하였을 때 암 줄기세포의 세포 증식이 보다 더 억제되는 것을 알 수 있다(실험예 7 및 도 17 및 18 참조).

따라서, 본 발명의 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 단독으로 사용하여도 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 기존 항암제와 병용으로 사용하여 보다 더 높은 시너지 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 병용 제제는 종래 항암제와 병용 투여함으로써 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 항암제를 병용투여하여 사용하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 요법을 제공한다.

이때, 상기 병용 투여는 동시에, 별도로 또는 순차적으로 병용할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

[화학식 A(베니디핀, Benidipine)]

;

[화학식 B(라시디핀, Lacidipine)]

;

[화학식 C(마니디핀, Manidipine)]

;

[화학식 D(로메리진, Lomerizine)]

.

또한, 상기 암은 난소암일 수 있다.

본 명세서에서 '건강기능식품'이란, 상기 칼슘 채널 억제제를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 피부 미백 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.

칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 측면에 따른 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 칼슘 채널 억제제를 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 제조 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

나아가, 상기 외에 본 발명의 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 제조 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은, 상기 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 병용 제제 또는 건강기능식품 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은, 암의 예방 또는 치료에 있어서의, 상기 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 병용 제제 또는 건강기능식품 조성물의 용도를 제공한다.

이하, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예> 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물

칼슘 채널 억제제로서 하기 3종의 시험물질을 사용하여 실시예 1 내지 3의 약학적 조성물이 제조되었다.

사용된 시험물질의 물질명 화학구조 및 구입처를 하기 표 1에 나타내었다.

실시예	물질명	화학구조	구입처
1	베니디핀 (Benidipine)		Tocris
2	라시디핀 (Lacidipine)		Sigma
3	마니디핀 (Manidipine)		Selleckchem
4	로메리진 (Lomerizine)		Selleckchem

<실험예 1> 칼슘 채널 억제제에 대한 약리 활성 스크리닝

모든 칼슘 채널 억제제가 항암 효과가 있는 것은 아니라는 것을 증명하기 위하여, 종래 알려진 칼슘 채널 억제제에 대하여 하기와 같은 약리 활성 스크리닝을 수행하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

구체적으로, 본 발명의 실시예 1 내지 4의 칼슘 채널 억제제를 포함하여 총 20종의 칼슘 채널 억제제에 대하여 스크리닝을 수행하였으며, 하기 표 2에서 area는 암 줄기 세포의 특징인 구체(sphere)형성을 저해하는지를 나타낸 값이며, area는 sphere 크기를 측정하여 나타낸 것이다. area의 값이 작을수록 암 줄기세포의 증식을 저해하는 것이다. 또한, ATP는 일반적인 화합물의 독성을 확인하는 것으로, 세포 내 ATP의 양을 측정하여 나타낸 것으로, ATP 값이 작을수록 세포 독성이 낮은 것이다.

구체적인 실험 방법은 하기와 같다.

A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)를 Ultra-Low Attachment 둥근 바닥96-웰 플레이트 (corning)에 각 웰당 500개의 생존가능한 세포밀도로 도말하고 암줄기세포(Cancer stem cell) 배지에서 배양하였다. 암 줄기세포 배지는 bFGF 20ng/ml, EGF 10ng/ml, Amphotericin B 2.5ng/ml, HEPES, Glutamax 및 B27이 보충된 신경세포 배양용 배지(neurobasal medium)로 구성된다. 가볍게 centrifuge하여 세포가 가운데 모이게 한 후 배양하였다. 배양 다음날, 세포에 20종의 칼슘 채널 억제제를 포함한 FDA 승인 화합물 1018개를 각각 10νM 단일 농도로 처리하고, 각 플레이트마다 양성 대조군으로 Apigenin 40 νM, 음성 대조군으로 DMSO 0.1% 처리하였다. 처리 4일째 화합물이 함유된 배지를 다시 한번 추가하였다. 처리 8일 후 구형세포(sphere cell)의 크기를 확인하기 위해 현미경을 이용하여 사진을 찍어 Image J software (NIH image)를 사용하여 분석하였다. 또한 사진 찍은 후 구형세포(sphere cell) 생존능(viability)을 비교하기 위해 Cell-titer Glo (Promega, WC, USA)에 의해 평가하였으며, 루시퍼라제 활성(luciferase activity)은 Tecan plate reader (Biocompare, USA)를 사용하여 검출하였다. 구형세포의 구체 형성능 분석과 생존능 분석을 위해 Apigenin을 처리한 대조군을 0%, DMSO를 처리한 대조군을 100%로 두어 분석하였다. 분석 결과 구형세포의 크기와 생존능 동시에 DMSO처리 대비 10% 이하로 감소시킨 화합물을 선별하었다.

이 화합물들이 일반적으로 세포독성을 보이는지 확인하기 위해 정상섬유아세포(normal fibroblast cell)인 BJ6와 NIH-3T3를 96-웰 일반 세포 배양 플레이트에 각 웰당 3000개의 생존가능한 세포밀도로 도말하고 암줄기세포(Cancer stem cell) 배지에서 배양하였다. 24시간 배양 후 선별된 화합물들을 10νM 단일 농도로 처리하고 72시간 배양 후, 생존능을 비교하기 위해 Cell-titer Glo (Promega, WC, USA)를 처리하고, 루시퍼라제 활성(luciferase activity)을 분석하였다. 루시퍼라제 활성(luciferase activity)은 Tecan plate reader (Biocompare, USA)를 사용하여 검출하였으며, DMSO를 처리한 대조군을 100%, 세포를 도말하지 않은 군을 0%로 두어 분석하였다.

번호	칼슘 채널 억제제	area	ATP
1(실시예1)	Benidipine hydrochloride	5	0
2(실시예2)	Lacidipine (Lacipil, Motens)	5	0
3(실시예3)	Manidipine (Manyper)	2	0
4(실시예4)	Lomerizine HCl	2	0
5	Cilnidipine	18	14
6	Ranolazine dihydrochloride	86	87
7	Isradipine (Dynacirc)	48	20
8	Amlodipine (Norvasc)	21	4
9	Flunarizine 2HCl	12	0
10	Cleviprex (Clevidipine)	96	64
11	Nitrendipine	95	89
12	Tetracaine hydrochloride (Pontocaine)	46	17
13	Nilvadipine (ARC029)	28	32
14	Azelnidipine	98	0
15	Nicardipine HCl	29	57
16	Nimodipine (Nimotop)	78	64
17	Nisoldipine (Sular)	78	52
18	Nifedipine (Adalat)	83	84
19	Diltiazem HCl (Tiazac)	53	73
20	Felodipine (Plendil)	30	65

상기 표 2에 나타난 바와 같이,

총 20종의 칼슘 채널 억제제에 대하여 스크리닝을 수행하였으나, 본 발명 실시예의 4종류 화합물만이 5 이하의 area값을 나타내며, 동시에 ATP 측정값이 0임을 알 수 있다.

즉, 상기 결과는 칼슘 채널 억제제라고 하여 모두 항암 효과를 나타내는 것은 아니며, 본 발명의 4종 화합물이 특이적으로 우수한 항암 효과를 나타내는 것을 입증한다.

본 명세서의 실험예 2 내지 9는 하기 실험 프로토콜을 사용하여 수행하였으며, 구체적인 실험방법은 하기와 같다.

<실험 프로토콜(protocol)>

1. 세포 생존능 분석(cell viability assay)

A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)를 Ultra-Low Attachment 둥근 바닥 96- 웰 플레이트 (corning)에 각 웰당 500개의 생존가능한 세포밀도로 도말하고 암 줄기세포(Cancer stem cell) 배지에서 배양하였다. 암 줄기세포 배지는 bFGF 20ng/ml, EGF 10ng/ml, Amphotericin B 2.5ng/ml, HEPES, Glutamax 및 B27가 보충된 신경세포 배양용 배지(neurobasal medium)로 구성된다. 배양 다음날, 세포에 실시예 1 내지 4의 화합물을 각각 30μM, 10μM, 2μM, 0.4μM 및 0.08μM로 처리하고 8일간 배양하였다. 화합물이 함유된 배지를 4일째에 다시 한번 추가하였다. 구형 세포(sphere cell) 생존능(viability)은 Cell-titer Glo (Promega, WC, USA)에 의해 평가하였으며, 루시퍼라제 활성(luciferase activity)은 Tecan plate reader (Biocompare, USA)를 사용하여 검출하였다. A2780 세포(ovarian cancer cell)를 96 웰 플레이트에 각 웰 당 3000개의 생존 가능한 세포의 밀도로 도말하고, 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 보충한 RPMI-1640 배지에서 배양 하였다. 배양 다음날, 세포에 실시예 1 내지 4의 화합물을 각각 100μM, 30μM, 10μM, 3μM 및 0.3μM 로 처리하고 3일간 배양하였다. 세포 생존능은 Cell-titer Glo (Promega, WC, USA)에 의해 평가하였으며, 루시퍼라제 활성은 Tecan plate reader (Biocompare, USA)를 사용하여 검출하였다.

2. 구체 형성 분석(Sphere formation assay)

A2780-SP 세포를 Ultra-Low Attachment 둥근 바닥 96- 웰 플레이트 (corning)에 각 웰당 500개의 생존가능한 세포밀도로 도말하고 암 줄기세포(Cancer stem cell) 배지에서 배양하였다. 배양 다음날, 세포에 실시예 1 내지 4의 화합물을 각각 10μM, 2μM, 0.4μM 로 처리하고 8일간 37℃, 5% CO2,95%습도 조건에서 배양하였다. 구체 크기는 Image J software (NIH image)를 사용하여 분석하였다.

3. 구체 증식 분석(Sphere proliferation assay)

A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)를 Ultra-Low Attachment 평평한 바닥 96- 웰 플레이트(corning)에 각 웰 당 6000개의 생존가능한 세포밀도로 도말하고 암 줄기세포(Cancer stem cell) 배지에서 성장시켰다. 다음날, 세포에 실시예 1 내지 4의 화합물을 10μM로 처리하고 60시간동안 37℃, 5% CO2,95%습도 조건에서 배양하였다. 구체 형성 융합(sphere forming confluence)은 Incucyte (BioTek, VT, USA)를 사용하여 분석하였다.

4. 웨스턴 블랏(Western blotting)

A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)를 Ultra-Low Attachment 6- 웰 플레이트(corning)에 각 웰 당 4x10⁵개의 생존가능한 세포밀도로 도말하고 암 줄기세포(Cancer stem cell) 배지에서 배양시켰다. 다음날, 배지를 신경세포 배양용 배지(Neuro Basal Medium, NBM)로 교체하고, 기아 상태(in starvation)에서 16 시간 동안 배양 한 다음 실시예 1 내지 4의 화합물을 10μM로 1시간 동안 처리 하였다. 배지를 화합물을 함유하는 암 줄기 세포 배지로 교환하고, 세포를 수확하고 RiPA 완충액에 용해시키기 전에 30 분 동안 더 배양하였다. 추출된 단백질을 SDS-PAGE 겔로 분리하고 Western Blot 분석을 위해 PVDF 멤브레인(membranes)으로 옮겼다. 5% 스킴밀크(skim milk)로 블로킹(blocking)한 후, 멤브레인을 4 ℃에서 블로킹 완충액에서 일차 항체(primary antibodies)로 밤샘 배양한 다음, 상온에서 2 시간 동안 HRP-컨쥬게이티드 2차 항체(HRP-conjugated secondary antibodies)로 배양 하였다.

사용된 일차 항체는 다음과 같다:

anti-phospho-AKT (Ser473)(clone 193H12, Cell Signaling), anti-AKT (rabbit polyclonal, Cell Signaling), anti-phospho-ERK (Thr202/Tyr204) (clone 20G11, Cell Signaling), anti-ERK (rabbit monoclonal, Cell Signaling), anti-phospho-p38 (rabbit monoclonal, Cell Signaling), anti-p38 (rabbit monoclonal, Cell Signaling), anti-OCT3/4 (mouse monoclonal, Santa Cruz), anti-NANOG (rabbit monoclonal, Cell Signaling), anti-SOX2 (rabbit monoclonal, Cell signaling), anti-ALDH1 (mouse monoclonal, BD), anti-CD133 (rabbit monoclonal, Abcam), anti-GAPDH (mouse monoclonal, Santa Cruz).

사용된 2차 항체는 다음과 같다:

Goat anti-mouse IgG-HRP (Bioss), Goat anti-rabbit IgG-HRP (Bioss).

시그널(Signals)은 강화된 화학발광(chemiluminescence) HRP 기판 (Bio-Rad)으로 현상되었고 LAS-3000 mini (Fuji film)를 사용하여 검출시켰다. 상기 시그널은 Image J software (NIH Image)를 사용하여 정량화시켰다.

5. PI 염색(PI staining)

A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)를 Ultra-Low Attachment 6- 웰 플레이트(corning)에 각 웰 당 1x10⁶개의 생존가능한 세포밀도로 도말하고 암 줄기세포(Cancer stem cell) 배지에서 배양시켰다. 다음날, A2780-SP 세포에 실시예 1 내지 4의 화합물을 10μM로 처리하고, 37℃, 5% CO2,95%습도 조건에서 24시간 동안 배양시킨 후, 원심분리기(centrifuge)로 수확하였다. PBS로 한번 세척한 후, 세포를 PBS 0.3 ml에 재현탁시켰다. 세포를 고정시키기 위하여 차가운 에탄올 0.7 ml를 천천히 적가첨가하고, 세포를 1시간동안 얼음위에서 배양시켰다. 고정된 세포를 차가운 PBS로 한번 헹구고, 0.1 ml PBS에 재현탁시킨 후, 2μl의 10mg/ml RNase A을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 배양시킨 후, 상기 세포에 5μl의 PI 용액(BD science)을 보충하고, 부드럽게 와류시킨(vortexed) 후, 어두운 곳에서 상온에서 15분간 더 배양하였다. 세포에 차가운 PBS 400 μl를 첨가한 후, 1시간 이내에 유동세포계수법(flow cytometry)을 수행하였다.

6. 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative Real-time polymerase chain reaction, Quantitative RT-PCR)

Trizol RNA 추출 키트 (Trizol RNA extraction kit, Invitrogen)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 시료의 총 RNA를 추출했다. 2μg의 RNA를 GoScriptTM cDNA 합성 시스템 (GoScriptTM cDNA synthesis system,Promega)을 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 합성된 cDNA를 표시된 프라이머(indicated primers)가 있는 FastStart SYBR green Master (Roche) 및 Bio-Rad S1000 Thermal cycler를 사용하여 Quantitative RT-PCR에 적용했다. GAPDH를 표준 유전자(reference gene)로 사용하였으며, 결과는 ddCt method를 사용하여 대조군에 대한 상대적인 발현으로 나타내었다.

7. 병용 투여 효과 실험(Combination effect test)

상기 실시예의 마니디핀 4μM, 라시디핀 8μM, 로메리진 HCl 10μM 또는 베니시핀 HCl 10μM을 각각 8μM의 시스플라틴(cisplatin)와 함께 A2780-SP 난소 암 줄기 세포에 동시 처리(co-treated)하였다. 상기 구체 형성 분석 및 구체 증식 분석법을 사용하여 실시예 화합물과 시스플라틴의 병용 효과를 확인 하였다.

8. 전세포 패치 클램프 레코딩 실험(whole cell patch clamp recording)

커버글라스에 미리 준비된 세포(난소암세포(A2780) 및 난소암줄기세포(A2780-SP))를 기록용 챔버(chamber)로 옮기고 외부 용액(external solution)을 계속해서 순환시켰다. 외부 용액의 조성은 143 mM NaCl, 5.6 mM KCl,10mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 5mM 글루코스(glucose), 1nM 테트로도톡신(tetrodotoxin), 10 mM 테트라에틸암모늄(tetraethylammonium)이며, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 보정하였다. 전세포 패치(Whole cell patch)를 위한 내부 피펫 용액(internal pipette solution)의 조성은 140 mM CsCl, 2mM MgCl₂, 3 mM Mg-ATP, 5mM HEPES, 1.1 mM EGTA이며, CsOH를 사용하여 pH를 7.2로 보정하였다.

Ca²⁺ 전류는 전압 클램프 모드(voltage clamp mode)에서 Axopatch 700B, DigiData 1440A, pClamp10.4를 이용하여 측정하였고, -70 mV에서 기본 막전위를 홀딩 후, -70 mV를 시작으로 +10 mV 씩 막 전압을 증가시키면서 나타나는 전류의 양을 측정하였다. 앞의 정상 전류(normal current) 측정한 후 실시예 3의 마니디핀(Manidipine) 10 μM을 5분간 처리하고, 동일한 전압의 변화를 가하여 이에 의해 나타나는 전류 양의 변화를 측정하였다. 전세포 패치 클램프의 저항(access Resistance) (Ra) 값은 10~20 MΩ으로 사용하였다.

9. 동물 실험

난소암 및 난소암 암 줄기세포 종양모델에서 Manidipine의 저해 영향을 확인하기 위하여, 난소암 암 줄기세포주 A2780-SP 세포와 난소암 세포주 A2780-AD 세포를 각각 1x10^5개씩 누드 마우스에 피하에 접종하였다. 이 때 누드 마우스의 왼쪽에는 난소암 세포를, 오른쪽에는 난소암 암 줄기세포를 각각 8마리씩 접종하였다. 접종 이 후, 14일차부터 종양 형성 크기를 측정하기 시작하였으며, 동일 시점부터 약물의 영향을 확인하기 위하여 대조군 그룹 (3마리-PBS treatment)과 Manidipine 처리 그룹 (3마리-1mpk treatment), 항암제-Pacritaxel 처리 그룹 (3마리-5mpk treatment), Manidipine과 항암제(Pacritaxel) 병용 처리 그룹으로 나누어 약물을 투여하였다. 이 후, 3일에서 4일 간격으로 약물 투여 및 종양의 크기를 측정하였다. 이 후, 31일차에 안락사 시켰고, 최종적으로 종양의 무게 및 크기를 측정하였다.

10. 통계(Statistics)

각 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험의 평균±표준 편차(mean ± standard deviation, SD)로 표시하였다. 통계적으로 유의한 차이는 GraphPad Prism 5 (CA, USA)를 사용하여 1-way ANOVA를 사용하여 결정되었다. 0.05 이하의 p 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

<실험예 2> 암 세포 및 암 줄기세포의 생존능 분석

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 암 세포 및 암 줄기세포의 생존능을 분석하기 위하여, 실시예 1 내지 4 약학적 조성물을 사용하여 세포 생존능 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 또한, 세포별로 각 화합물의 GI₅₀값을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 1. 세포 생존능 분석과 같다.

실시예	GI₅₀(μM) A2780-SP	GI₅₀(μM) A2780
1	5.345	10.69
2	2.844	11.36
3	1.892	9.666
4	5.949	11.40

도 1은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell) 생존능의 용량-반응(Dose-response) 곡선을 나타낸 것이다.

도 2는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780 세포(ovarian cancer cell) 생존능의 용량-반응(Dose-response) 곡선을 나타낸 것이다.

도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 투여량 의존적(dose-dependent manner)으로 난소암줄기세포인 A2780-SP 세포의 생존능을 감소시키는 것을 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 투여량 의존적(dose-dependent manner)으로 난소암세포인 A2780 세포의 생존능을 감소시키는 것을 확인하였다.

또한, 도 1의 결과 및 도 2의 결과를 비교하였을 때, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 난소암줄기세포에 대하여 보다 우수한 세포 성장 저해 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

상기 표 3에 나타난 바와 같이,

난소암 줄기세포 A2780-SP 및 난소암세포 A2780 세포에서 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 15 μM 이하의 GI50값을 나타냄으로써, 세포 성장 저해효과가 우수함을 확인하였다. 한편, 줄기세포의 경우가 더 낮은 값을 나타냄으로써, 줄기세포에서 선택적으로 우수한 성장 저해 효과를 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 암 줄기세포의 성장 저해 효과를 나타내는 바, 항암 효과가 있음을 알 수 있다.

<실험예 3> 암 줄기세포의 성장 억제 평가

3-1. 구체 형성 분석

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 암 줄기세포의 성장 정도를 분석하기 위하여, 실시예 1 내지 4 약학적 조성물을 사용하여 암줄기세포의 세포 구체 형성을 분석하였으며, 실험 결과를 도 3에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 상기 실험 프로토콜의 2. 구체 형성 분석과 같다.

도 3은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)의 구체 형성을 분석한 결과를 나타낸 이미지이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 투여량 의존적(dose-dependent manner)으로 난소암줄기세포인 A2780-SP 세포의 구체 형성을 감소시키는 것을 알 수 있다.

구체(sphere)는 암 줄기세포의 특징적인 형태로서, 구체의 성장은 암 줄기세포가 성장함을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 암 줄기 세포의 구체 형성을 억제하므로, 항암 효과가 있음을 알 수 있다.

3-2. 구체 증식 분석

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 암 줄기세포의 성장 정도를 분석하기 위하여, 실시예 1 내지 4 약학적 조성물을 사용하여 암줄기세포의 세포 구체 중식을 분석하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 3. 구체 증식 분석과 같다.

도 4는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)의 구체 형성을 분석하여 A2780-SP 세포의 증식을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 구체 형성 융합을 억제하였으며, 60시간 후에는 대조군(DMSO처리군)과 비교하여 1/3 이하의 융합률을 나타내어 우수한 암 줄기세포 증식 억제효과를 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 암 줄기 세포의 구체 증식을 억제하므로, 항암 효과가 있음을 알 수 있다.

<실험예 4> 암 줄기세포능(stemness), 생존 및 성장 관련 인자의 발현 분석

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 암 줄기세포능(stemness)과 관련된 마커 및 암 줄기세포의 생존 및 증식과 관련된 단백질의 발현 변화를 통해 항암 효과를 확인하기 위하여, 웨스턴블랏을 통해 각종 인자의 발현 정도를 분석하였으며, 그 결과를 도 5-8에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 4. 웨스턴 블랏과 같다.

도 5는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness)과 관련된 마커들의 발현 변화를 관찰한 이미지이다.

도 6은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness)과 관련된 마커들의 발현 변화를 정량화한 그래프이다.

도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1(베니디핀), 실시예 3(마니디핀), 실시예 4(로메리진)의 약학적 조성물을 처리하였을 때, 암 줄기세포능(stemness)과 관련된 마커인 OCT3/4, NANOG, SOX2, ALDH1, CD133의 발현이 감소하는 것을 알 수 있다.

또한, 실시예 2(라시디핀)의 약학적 조성물은 NANOG, SOX2, ALDH1, CD133의 발현을 감소시키는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 기존 항암제에 대한 내성을 유발하는 암 줄기세포의 줄기세포능(stemness)과 관련된 마커의 발현을 감소시켜, 암 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 7은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포 생존 및 증식과 관련된 단백질의 활성 변화를 관찰한 이미지이다.

도 8은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포 생존 및 증식과 관련된 단백질의 활성 변화를 정량화한 그래프이다.

도 7 및 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1(베니디핀), 실시예 3(마니디핀), 실시예 4(로메리진)의 약학적 조성물을 처리하였을 때, 암 줄기세포 생존 및 증식과 관련된 단백질인 AKT, ERK, p38의 활성이 감소하는 것을 알 수 있다.

또한, 실시예 2(라시디핀)의 약학적 조성물은 ERK, p38의 활성을 감소시키는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 암 줄기세포의 줄기세포능(stemness)을 감소시키는 것에 더해 암 줄기세포 생존 및 증식과 관련된 단백질의 발현을 감소시켜, 암의 재발, 전이, 진행을 억제함으로써 암 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

<실험예 5> 암 줄기세포의 세포 주기 및 세포사멸 분석

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 암 줄기세포의 세포 주기 및 세포사멸을 분석하여 항암 효과를 확인하기 위하여, PI 염색 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 9 및 10에 나타내었다. 또한, PI 염색 결과, 세포 주기별, 각 세포 주기에 포함되는 세포 수를 표 4에 정리하였다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 5. PI 염색과 같다.

	DMSO	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예4
사멸 (%) (Apoptotic)	5.2	7.1	14.5	11.9	6.2
사멸 (%) (Apoptotic)	4.3	7.8	15.0	10.5	6.4
G0-G1 기(%) (G0-G1 phase)	50.7	44.2	42.1	45.9	43.8
G0-G1 기(%) (G0-G1 phase)	48.5	43.9	42.6	45.1	45.6
S 기(%) (S phase)	6.3	7.8	8.2	7.1	9.5
S 기(%) (S phase)	7.1	12.3	8.6	7.3	9.9
G2-M 기(%) (G2-M phase)	23.3	29.8	17.7	22.1	25.0
G2-M 기(%) (G2-M phase)	24.9	28.7	18.6	22.7	20.7

도 9는 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 주기 변화를 나타낸 그래프이다.

도 10은 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 사멸을 측정한 그래프이다.

도 9에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 세포 주기에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

도 10에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 암 줄기세포의 세포 사멸을 증가시킴을 알 수 있다.

한편, PI 염색 후, 유세포 분석(Flow cytometry)을 이용한 분석으로 세포의 세포 주기를 분석할 수 있는데, 상기 표 4는 유세포 분석을 통해 각 세포의 세포 주기를 분석하고, 각 주기에 해당하는 세포의 수를 백분율로 나타낸 것이다.

상기 표 4에 나타난 바와 같이,

Sub G1 기(Sub G1 phase)라고도 불리는 사멸된 세포 수(Apoptotic cell number)가 DMSO 대조군에 비해 실시예 1 내지 4를 처리했을 때 증가하는 것을 알 수 있다. 나머지 G0-G1, S, G2-M 기의 세포 수의 변화에는 유의성이 없음을 알 수 있으며, 이를 통하여 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 세포주기에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 암 줄기세포의 세포 주기를 멈추게 하여 증식을 억제하기 보다는 암 줄기세포의 세포 사멸(apoptosis)을 유도하여 증식을 억제하고 이를 통해 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 암 줄기세포의 세포 사멸(apoptosis)을 증가시키므로, 암 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

<실험예 6> 암 줄기세포와 칼슘 채널 활성의 상관관계 분석

6-1. 칼슘 채널 서브유닛 mRNA 발현 분석

암 줄기세포와 칼슘 채널 활성과의 상관 관계를 분석하기 위하여, 암 줄기세포에서의 칼슘 재널 관련 서브유닛의 mRNA의 발현 정도를 분석하였으며, 그 결과를 도 11-13에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프토토콜의 6. 실시간 중합효소연쇄반응과 같다.

도 11은 A2780-SP 세포 및 A2780세포에서 칼슘 채널 서브유닛(Cacna1d, Cacna1f, Cacna1h) mRNA의 발현 수준을 Quantitative RT-PCR로 정량화 하여 나타낸 것이다.

도 12는 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, 각 칼슘 채널 서브유닛(Cacna1d, Cacna1f, Cacna1h)의 mRNA발현 수준을 Quantitative RT-PCR로 정량화 하여 넉다운을 확인한 것을 나타낸 것이다.

도 13은 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, 암 줄기세포와 관련된 마커(OCT3/4, NANOG, SOX2, ALDH1, CD133)의 mRNA 발현 수준을 Quantitative RT-PCR로 정량화한 것을 나타낸 것이다.

도 11에 나타난 바와 같이, 암 세포에서보다 암 줄기세포에서 특이적으로 칼슘 채널 서브유닛의 mRNA발현량이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다.

도 12에 나타난 바와 같이, 암 줄기세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자를 넉다운 시킨 결과, 칼슘 채널 서브유닛의 mRNA발현량이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다.

도 13에 나타난 바와 같이, 암 줄기세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자를 넉다운 시킨 결과, 암 줄기세포와 관련된 마커들의 mRNA 발현 또한 감소하는 것을 알 수 있다.

상기 결과는 암 줄기세포에 특이적으로 존재하는 특정 유형의 칼슘채널의 존재가 암 줄기세포의 특성을 유지하는데 중요한 역할을 하고 있으며, 이를 억제함으로써 줄기세포능(stemness)을 억제할 수 있음을 보여준다.

6-2. 암 줄기 세포 관련 인자의 단백질 발현 분석

암 줄기세포와 칼슘 채널 활성과의 상관 관계를 분석하기 위하여, 암 줄기세포에서의 칼슘 재널 관련 서브유닛의 유전자를 넉다운 시킨 후, 암 줄기 세포능(stemness)과 관련된 마커(OCT 3/4) 와 암 줄기세포의 생존 및 증식과 관련된 단백질 (p-ERK, ERK, p-p38, p38) 발현 변화를 분석하였으며, 그 결과를 도 14 및 15에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프토토콜의 4. 웨스턴 블랏과 같다.

도 14는 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness) 관련 마커와 암 줄기세포의 생존 및 증식과 관련된 단백질의 발현 변화를 관찰한 이미지이다.

도 15는 A2780-SP 세포에서 칼슘 채널과 관련된 유전자(si-Cacna1d, si-Cacna1f, si-Cacna1h)를 넉다운(knockdown)시킨 후, A2780-SP 세포(ovarian cancer stem cell)에서의 암 줄기세포능(stemness) 관련 마커와 암 줄기세포의 생존 및 증식과 관련된 단백질의 발현 변화를 정량화한 그래프이다.

도 14 및 15에 나타난 바와 같이, 암 줄기세포에서 칼슘 채널 관련 유전자를 넉다운 한 결과, 6-1의 mRNA 분석과 유사하게 단백질 수준에서도 암 줄기세포능(stemness) 관련 마커인 OCT3/4의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.

또한, 암 줄기세포에서 칼슘 채널 관련 유전자를 넉다운 한 결과, 세포의 생존 및 증식과 관련된 단백질들인 ERK, P-38의 활성이 감소하는 것을 단백질 수준에서 확인하였다. 이러한 결과는 실험예 4의 칼슘채널 억제제의 결과와 그 궤를 같이 하는 것으로 볼 수 있다.

6-3. 전세포 패치 클램프 레코딩 실험(whole cell patch clamp recording)

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물의 난소암줄기세포(A2780-SP)에서의 칼슘 채널 억제 효과를 평가하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였으며, 그 결과를 그 결과를 도 16에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 8. 전세포 패치 클램프 레코딩 실험과 같다.

도 16은 A2780-SP 세포에 실시예 약학적 조성물을 처리하였을 때, 칼슘 전류 진폭이 줄어듦을 나타낸 그래프이다.

도 16에 나타난 바와 같이,

난소암세포(A2780) 보다 난소암줄기세포(A2780-SP)에서 칼슘 전류(calcium current)의 진폭이 더 크게 나타나며, 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물인 실시예 3(마니디핀)을 A2780-SP에 처리하였을 때, 칼슘 전류의 진폭히 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다.

이는 본 발명의 4종의 약학적 조성물들이 암 줄기세포에 과발현되어 있는 칼슘 채널의 억제를 통해 기존 약물에 내성을 보이는 주요 요인인 암 줄기세포의 암 줄기세포능(stemness)을 억제하고, 세포의 사멸(apoptosis)을 유도할 수 있음을 시사한다.

이를 통해 암의 재발, 전이 및 진행을 억제함으로써 암 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 7> 항암제와의 병용 투여 효과 실험

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물과 종래 사용중인 항암제 시스플라틴(cisplatin)을 병용 투여하였을 때의 효과를 알아보기 위하여 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 7. 병용 투여 효과 실험과 같다.

도 17은 실시예 약학적 조성물과 시스플라틴을 병용 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 생존율을 측정하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.

도 18은 실시예 약학적 조성물과 시스플라틴을 병용 처리하였을 때, A2780-SP 세포의 세포 증식을 분석하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.

도 17에 나타난 바와 같이, 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 단독으로 투여하였을 때도 우수한 세포 생존능 감소 효과를 나타내나, 항암제와 병용투여 하였을 때 암 줄기세포의 세포 생존능이 보다 더 감소하는 것을 알 수 있다.

도 18에 나타난 바와 같이, 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 단독으로 투여하였을 때도 우수한 세포 증식 억제 효과를 나타내나, 항암제와 병용투여 하였을 때 암 줄기세포의 세포 증식이 보다 더 억제되는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 단독으로 사용하여도 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 기존 항암제와 병용으로 사용하여 보다 더 높은 시너지 효과를 나타낼 수 있다.

<실험예 8> 정상세포에서의 세포 생존능 평가

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물 처리에 따른 정상세포에서의 생존능을 분석하기 위하여, 실시예 1 내지 4 약학적 조성물을 사용하여 세포 생존능 분석을 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 1. 세포 생존능 분석과 같으며, 정상세포는 정상섬유아세포인 BJ6 및 NIH-3T3를 사용하였다.

실시예	세포 생존능(%), BJ6	세포 생존능(%), NIH-3T3
1(베니디핀)	85	91
2(라시디핀)	87	119
3(마니디핀)	81	96
4(로메리진)	88	120

상기 표 5에 나타난 바와 같이,

정상세포 BJ6 및 NIH-3T3 세포에서, 실시예 1 내지 4의 약학적 조성물은 80% 이상의 세포 생존능을 나타냄으로써, 본 발명의 약학적 조성물은 정상세포에는 영향을 미치지 않고, 암 세포, 특히, 암 줄기 세포에만 특이적으로 세포 독성을 나타내는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 정상세포에는 영향을 미치지 않고, 암 줄기세포의 성장 저해 효과를 나타내는 바, 부작용 이 적은 항암 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.

상기 결과를 통하여 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 단독으로 사용하여도 암 줄기세포의 성장 및 증식을 저해하는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 종래 항암제와 병용 투여할 경우, 보다 우수한 약리 효과를 나타내는 바, 암의 재발, 전이, 진행을 억제시킬 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 병용 제제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 9> 동물 모델 실험

본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물의 난소암 치료 효과를 in vivo 수준에서 확인하기 위하여, 동물 모델 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 구체적인 실험방법은 상기 실험 프로토콜의 9. 동물 실험과 같다.

도 19는 난소암 세포 종양 동물 모델(A2780-AD) 및 난소암 암 줄기세포 종양 동물모델(A2780-SP)에서, 실시예 약학적 조성물 단독처리 및 파클리탁셀(Paclitaxel)을 병용 처리하였을 때의 종양 형성 억제 효과를 평가하여 그 결과를 나타낸 그래프이다.

도 19 에 나타난 바와 같이,

난소암 암 줄기세포에서 특이적으로 종양의 형성을 저해하며, Paclitaxel과 병용투여시 더 좋은 효능을 보임을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 칼슘 채널 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 난소암의 재발, 전이, 진행을 억제시킬 수 있으므로, 난소암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

<제제예 1> 산제의 제조

칼슘 채널 억제제 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

칼슘 채널 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

칼슘 채널 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

칼슘 채널 억제제 100 ㎎

만니톨 180 ㎎

Na₂HPO₄ㆍ2H₂O 26 ㎎

증류수 2974 ㎎

통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

<제제예 5> 연고제의 제조

칼슘 채널 억제제 5 g

세틸팔미테이트 20 g

세탄올 40 g

스테아릴알콜 40 g

미리스탄이소프로필 80 g

폴리솔베이트 60 g

파라옥시안식향산 프로필 1 g

파라옥시안식향산 메틸 1 g

인산 및 정제수 적당량

통상적인 연고제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 연고제를 제조하였다.

<제제예 6> 건강기능식품의 제조

칼슘 채널 억제제 500ng

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70mg

비타민 E 1.0mg

비타민 0.13mg

비타민 B2 0.15mg

비타민 B6 0.5mg

비타민 B12 0.2mg

비타민 C 10mg

비오틴 10mg

니코틴산아미드 1.7mg

엽산 50mg

판토텐산 칼슘 0.5mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75mg

산화아연 0.82mg

탄산마그네슘 25.3mg

제1인산칼륨 15mg

제2인산칼슘 55mg

구연산칼륨 90mg

탄산칼슘 100mg

염화마그네슘 24.8mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제제예 7> 건강기능음료의 제조

칼슘 채널 억제제 500ng

구연산 1000mg

올리고당 100g

매실농축액 2g

타우린 1g

정제수를 가하여 전체 900ml

통상의 건강 기능 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 기능 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 칼슘 채널 억제제는 하기 화학식 A 내지 화학식 D로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
[화학식 A]

;
[화학식 B]

;
[화학식 C]

; 및
[화학식 D]

.
제1항에 있어서,
상기 암은 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 음경암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암 및 피부암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 CT3/4, NANOG, SOX2, ALDH1, CD133, pAKT, AKT, p-ERK, ERK, p-p38 및 p38로 이루어지는 단백질 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 암 줄기세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 항암제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용 제제.
제6항에 있어서,
상기 칼슘 채널 억제제는 하기 화학식 A 내지 화학식 C로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 병용 제제:
[화학식 A]

;
[화학식 B]

;
[화학식 C]

; 및
[화학식 D]

.
제6항에 있어서,
상기 암은 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 음경암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암 및 피부암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 병용 제제.
제6항에 있어서,
상기 병용 제제는 CT3/4, NANOG, SOX2, ALDH1, CD133, pAKT, AKT, p-ERK, ERK, p-p38 및 p38로 이루어지는 단백질 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 병용 제제.
제6항에 있어서,
상기 병용 제제는 암 줄기세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 병용 제제.
제6항에 있어서,
상기 항암제는 독소루비신, 파클리탁셀, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀, 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌 (bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴, 5-플로오로우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란 (melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard) 및 니트로소우레아 (nitrosourea)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 병용 제제.
칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제12항에 있어서,
상기 칼슘 채널 억제제는 하기 화학식 A 내지 화학식 C로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물:
[화학식 A]

;
[화학식 B]

;
[화학식 C]

; 및
[화학식 D]

.