KR20150131476A - 설포라판 유도체를 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 설포라판(sulforaphane, SFN) 을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 설포라판(sulforaphane, SFN) 은 HFD-유도 간 지방증에 대한 시료의 예방효과실험에서 보다 적은 지방 축적을 나타냈고, 혈장 TG, FFA, 및 TC 수준 및 혈장 ALT 및 AST 활성을 감소시켰으며, 총 내장 지방-패드(visceral fat-pad), 체중 (50%), 체중증가 (-47%), 및 식이효율비 (-34%) 면에서 유의적인 감소시켰으며(실험예 1), 지방증 관련 유전자 발현에 미치는 효과실험에서, 순환 아디포넥틴(adiponectin) 수준 및 아디포넥틴(adiponectin)의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시키고, 간 조직에서 adipoR2의 발현을 자극함을 확인함으로서(실험예 2), 간질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

설포라판 유도체를 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising sulforaphane derivatives as active ingredient for preventing and treating hepatic disease}

본 발명은 설포라판 유도체를 유효성분으로 함유하는 간질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

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우리나라 간질환 사망률은 인구 십만명 당 23.5명(남자 37.8명, 여자 9.0명)으로 매우 높으며, 40대 사망원인 1위(41.1명/10만명), 50대 사망원인 2위(72.4명/10만명), 30대 사망원인 3위(10명/10만명)를 차지하는 등 간질환은 한국 중년층 인구의 주요 사망원인이다. 특히 알콜성 간질환은 만성과다 음주자의 대부분에서 나타날 수 있는 질환이다.

상기 알콜성 간질환으로는 지방간, 급성간염, 만성간염, 간경변증과 간암이 있는데 이중 지방간은 가장 가벼운 증상을 보이는 동시에 가장 높은 발생빈도를 나타낸다.

알콜성 지방간이란, 간세포 속에 지방이 축적된 상태인데, 지방자체는 간세포에 큰 독성이 없어 심하지 않은 경우에는 증상이 없는 경우가 많고 간기능검사를 해 보아도 간기능이 정상이거나 조금 저하되는 경우가 대부분이다. 그러나, 지방간이 심하거나 간염 또는 간경변증에 지방간이 겹치면 간기능이 심히 저하되어 치명적인 상태가 되기도 한다.

구체적으로, 지방간이 악화되어 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세혈관과 임파선을 압박하여 간내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 된다. 이렇게 되면 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간기능이 저하되는 것이다.

상기 지방간은 만성적인 음주벽, 과식에 의한 비만증과 당뇨병이 주요 원인으로 꼽히며, 그밖에 독성이 강한 약제의 복용, 임신중에 항생제를 잘못 복용하였을 경우, 어린아이에게서의 발열성 감염질환이 있을 경우에 해열목적으로 아스피린을 함부로 남용하였을 경우에도 지방간은 생길 수 있다.

비알콜성 지방간(Non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 및 비알콜성 지방간증 (non-alcoholic steatohepatitis; NASH) 은 전신적 및 간성 염증(metainflammtion)과 종종 동반한다 (Tarantino G, Savastano S, Colao A. Hepatic steatosis, low-grade chronic inflammation and hormone/growth factor/adipokine imbalance. World journal of gastroenterology : WJG 2010; 16(38): 4773; Asrih M, Jornayvaz FR. Inflammation as a potential link between nonalcoholic fatty liver disease and insulin resistance. Journal of Endocrinology 2013; 218(3): R25-R36).

NAFLD에 대한 몇몇 치료학적 접근법이 제시되었다. 운동, 절식, 생활 양식 변화 및 약물학적 간섭 등을 통한 간성 염증 개선방법이 NAFLD 및 인슐린 내성 치료에 도움이 될 것이다(Current and emerging therapies in nonalcoholic fatty liver disease. Seminars in liver disease, 2008; Torres DM, Harrison SA. Diagnosis and therapy of nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology 2008; 134(6): 1682-1698; Chuthan SA, Pagadala M, Kirwan J. Management of non-alcoholic fatty liver disease. Minerva gastroenterologica e dietologica 2013; 59(1): 69-87).

그러나, 단일 치료요법이 아직 존재하지 않으나, 다양한 접근법에 의한 체중 감량이 NAFLD에 대한 가장 효과적인 치료법이다 (Dowman JK, Armstrong MJ, Tomlinson JW, Newsome PN. Current therapeutic strategies in non-alcoholic fatty liver disease. Diabetes , Obesity and Metabolism 2011; 13(8): 692-702; Tilg H, Moschen A. Weight loss: cornerstone in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease. Minerva gastroenterologica e dietologica 2010; 56(2): 159-167).

에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechingallate) 및 레스베리트롤(resveratrol)을 포함한 기능성 식품 및 식물성영양소를 이용한 NAFLD 치료 및 간성 염증 개선에 대한 영양학적 접근법으로 제안되었다. (Xiao J, Ho CT, Liong EC, Nanji AA, Leung TM, Lau TYH et al . Epigallocatechin gallate attenuates fibrosis, oxidative stress, and inflammation in non-alcoholic fatty liver disease rat model through TGF/SMAD, PI3 K/Akt/FoxO1, and NF-kappa B pathways. European journal of nutrition 2014; 53(1): 187-199; Yang SJ, Lim Y. Resveratrol ameliorates hepatic metaflammation and inhibits NLRP3 inflammasome activation. Metabolism 2014; 63(5): 693-701)

그러나 상기 기전에 대하여 명백하게 알려진 바는 없다.

아디포넥틴(Adiponectin)은 주로 백색 지방조직에서 분비되는 항염 매개자(anti-inflammatory mediator)이다 기타 시토킨들과 유사하게, 잠재적으로 세라미드 이화작용(ceramide catabolism)을 자극함에도 불구하고 이의 정확한 기능은 알려진 바가 없다 (Holland WL, Miller RA, Wang ZV, Sun K, Barth BM, Bui HH et al . Receptor-mediated activation of ceramidase activity initiates the pleiotropic actions of adiponectin. Nat Med 2011; 17(1): 55-63.). 이들은 세포자살(apoptosis)을 보호하고 인슐린 저항성 진행을 방지할 수 있다. 이러한 가정을 입증하기 위하여, 몇몇 연구진들이 아포넥틴 수준 및 인슐린 저항성뿐만 아니라 지방 량(fat mass)과의 밀접한 상관관계를 발견하였다 (Arita Y. Reprint of "Paradoxical Decrease of an Adipose-Specific Protein, Adiponectin, in Obesity". Biochemical and Biophysical Research Communications 2012; 425(3): 560-564; Hotta K, Funahashi T, Arita Y, Takahashi M, Matsuda M, Okamoto Y et al . Plasma concentrations of a novel, adipose-specific protein, adiponectin, in type 2 diabetic patients. Arteriosclerosis , thrombosis , and vascular biology 2000; 20(6): 1595-1599).

몇몇 보고서에서 아디포넥틴이 IL10 유도를 통하여 항염 활성을 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (Kumada M, Kihara S, Ouchi N, Kobayashi H, Okamoto Y, Ohashi K et al . Adiponectin specifically increased tissue inhibitor of metalloproteinase-1 through interleukin-10 expression in human macrophages. Circulation 2004; 109(17): 2046-2049; Wolf AM, Wolf D, Rumpold H, Enrich B, Tilg H. Adiponectin induces the anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-1RA in human leukocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004; 323(2): 630-635).

더군다나, 아디포넥틴은 IKK 신호 염증 경로(signaling inflammatory pathway)를 저해하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과를 토대로, 인슐린 저항에 대한 역할뿐만 아니라 아디포넥틴은 NAFLD과 같은 인슐린 저항성 및 염증을 수반한 간질환과 관련됨을 보고하였다. 사실상, 후이 등(Hui JM, Hodge A, Farrell GC, Kench JG, Kriketos A, George J. Beyond insulin resistance in NASH: TNF-α or adiponectin? Hepatology 2004; 40(1): 46-54.)은 대조용 객체에 비하여 지방증 환자에서 보다 낮은 아디포넥틴 수준을 발견하였다. 따라서, 아디포넥틴은 NAFLD 진행 및 간경화증을 차단하는 잠재적 치료학적 접근법일 수 있수 있으며, NAFLD 진행 및 간 인슐린 저항성 (hepatic insulin resistance)을 차단하는 잠재적 치료학적 접근법일 수 있다.

브라시카(Brassica) 과(family), 특히 브로컬리(broccoli) 및 기타 십자화 채소와 같은 다량의 야채를 섭생하는 사람들은 암과 같은 질환에 대한 적은 경향을 나타냄을 확인하는 지역적 및 임상적 근거가 발견되었다(Beecher CW. Cancer preventive properties of varieties of Brassica oleracea: a review. The American journal of clinical nutrition 1994; 59(5): 1166S-1170S). 화학적 발암과정의 제어 및 이러한 유익한 식물의 화학요법적 효과는 브라시카 식물에 존재하는 고함량의 비타민 및 섬유소보다는 이소티아네이트 기능기를 포함하는 식물성성분 군의 존재로 기인하는 것 같다(Lampe JW, Peterson S. Brassica, biotransformation and cancer risk: genetic polymorphisms alter the preventive effects of cruciferous vegetables. The Journal of nutrition 2002; 132(10): 2991-2994).

유기성 이소티아네이트(The organic isothiocyanates)기는 상기 식물에서 생성되지 않고 글루코파린(glucopharin)과 같은 자연적 글루코시놀레이트(glucosinolates; β-thioglucosideN-hydroxysulfates)에 대한 미로시나아제(myrosinase)의 효소작용에 의하여 생성된다(Khiar N, Werner S, Mallouk S, Lieder F, Alcudia A, FernI. Enantiopure Sulforaphane Analogues with Various Substituents at the Sulfinyl Sulfur: Asymmetric Synthesis and Biological Activities. The Journal of Organic Chemistry 2009; 74(16): 6002-6009). 식물이 분쇄되고 저작시에, 글루코시놀레이트가 미로시나아제에 의하여 가수분해되어 설포라판(sulforaphane; 1 4-isothiocyanatobutyl methyl sulfoxide)과 같은 상응하는 이소시아네이트를 생성한다 (Halkier BA, Gershenzon J. BIOLOGY AND BIOCHEMISTRY OF GLUCOSINOLATES. Annual Review of Plant Biology 2006; 57(1): 303-333). 이러한 자연발생적 이소티오시아네이트는 대학 연구소(Johns Hopkins University) 에서 1992년에 처음 분리되었다 (Zhang Y, Talalay P, Cho CG, Posner GH. A major inducer of anticarcinogenic protective enzymes from broccoli: isolation and elucidation of structure. Proceedings of the National Academy of Sciences 1992; 89(6): 2399-2403).

이에 본 발명자들은 섭취가 용이하고 인체에 안전하며 지방간을 치료할 수 있는 물질을 찾고자 연구 노력한 결과, 본 발명의 설포라판 (1-isothiocyanato-4-methylsulfinylbutane; SFN) 시료들을 대상으로 수행한 HFD-유도 간 지방증에 대한 시료의 예방효과실험에서 보다 적은 지방 축적을 나타냈고, 혈장 TG, FFA, 및 TC 수준 및 혈장 ALT 및 AST 활성을 감소시켰으며, 총 내장 지방-패드(visceral fat-pad), 체중 (50%), 체중증가 (-47%), 및 식이효율비 (-34%) 면에서 유의적인 감소시켰으며(실험예 1), 지방증 관련 유전자 발현 실험에서, 순환 아디포넥틴(adiponectin) 수준 및 아디포넥틴(adiponectin)의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시키고, 간 조직에서 adipoR2의 발현을 자극함을 확인함으로서(실험예 2), 간 질환의 치료효과가 탁월함을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 간질환의 예방 및 치료에 특히 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설포라판(sulforaphane, SFN) 을 유효성분으로 함유하는 간 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 설포라판(sulforaphane, SFN) 을 유효성분으로 함유하는 간 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 설포라판(sulforaphane, SFN) 은 화합물 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물을 포함한다.

본원에서 정의되는 “간 질환”은 급성 간염, 만성 간염, 지방간, 또는 간경변증, 바람직하게는 지방간 질환을 포함한다.

본원에서 정의되는 “지방간 질환”은 알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 지방간염 등과 같은 지방간 질환, 바람직하게는 비알콜성 지방간 질환을 포함한다.

본 발명에 따른 설포라판(sulforaphane, SFN) 은 본 발명 기술 분야에서 널리 알려진 방법에 의하여 브라시카(Brassica) 과(family), 특히 브로컬리(broccoli) 및 기타 십자화 채소와 같은 식물로부터 분리 또는 상업적으로 구입한 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 그 방법 또는 물질은 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 조성물은 알콜성 지방간 질환 또는 지방간염의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 시료들을 대상으로 수행한 HFD-유도 간 지방증에 대한 시료의 예방효과실험에서 보다 적은 지방 축적을 나타냈고, 혈장 TG, FFA, 및 TC 수준 및 혈장 ALT 및 AST 활성을 감소시켰으며, 총 내장 지방-패드(visceral fat-pad), 체중 (50%), 체중증가 (-47%), 및 식이효율비 (-34%) 면에서 유의적인 감소시켰으며(실험예 1), 지방증 관련 유전자 발현 실험에서, 순환 아디포넥틴(adiponectin) 수준 및 아디포넥틴(adiponectin)의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시키고, 간 조직에서 adipoR2의 발현을 자극함을 확인함으로서(실험예 2), 간 질환의 치료효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 간질환의 예방 및 치료에 특히 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 설포라판(sulforaphane, SFN) 은 조성물 총 중량에 대하여 0.1~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 따른 설포라판(sulforaphane, SFN) 의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 지방간 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 설포라판(sulforaphane, SFN)을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 간질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 간질환의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 간질환의 예방 및 개선효과를 갖는 설포라판(sulforaphane, SFN)을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 간질환의 예방 및 개선효과를 갖는 설포라판(sulforaphane, SFN)을 주성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가물을 제공한다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 화합물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 화합물은 목적 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖ 을 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g 의 비율로 가할 수 있다.

상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 화합물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

본 발명에 따른 설포라판(sulforaphane, SFN) 은 HFD-유도 간 지방증에 대한 시료의 예방효과실험에서 보다 적은 지방 축적을 나타냈고, 혈장 TG, FFA, 및 TC 수준 및 혈장 ALT 및 AST 활성을 감소시켰으며, 총 내장 지방-패드(visceral fat-pad), 체중 (50%), 체중증가 (-47%), 및 식이효율비 (-34%) 면에서 유의적인 감소시켰으며(실험예 1), 지방증 관련 유전자 발현 및 내당성에 미치는 효과실험에서, 순환 아디포넥틴(adiponectin) 수준 및 아디포넥틴(adiponectin)의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시키고, 간 조직에서 adipoR2의 발현을 자극함을 확인함으로서(실험예 2), 간질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 SFN의 HFD-유도 간 지방증에 미치는 영향을 나타낸 도이며(여기에서 헤마톡실림 및 에오신-염색 간 절편 사진이며 (×100 배) (A); 지방증 점수 (B). 간 중량 (C). 혈장 AST (D) 및ALT (E) 활성도를 각각 나타내며, 간 콜레스테롤 (F), TGs (G) 및 FFAs (H) 농도를 각각 나타내며, Plasma levels of 총 콜레스테롤 (I), 중성 지방 (J) 및 유리 지방산 (K) 혈장수준를 각각 나타내며, 값은 평균EM; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001으로 표시함);
도 2는 본 발명의 SFN의 HF 식이 유도 체중 및 식이섭취량에 미치는 여향을 나타낸 도이며(여기에서 총 체중 (A), 내장 지방-패드 중량 (B), 체중 증가량 (C), 식이 섭취량 (D), 식이효울비 (FER:실험기간중 채중증가량 [g] ÷ 실험기간중 식이 섭취량 [g]) (E), 내장 백색 지방조직 및 간세포 사진이며 (F). 값은 평균EM; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001으로 표시함);
도 3은 본 발명의 SFN의 아디포넥틴, AMPK에 미치는 영향을 나타낸 도이다 (실험 말일의 혈장 아디포넥틴 농도 (A), qRT-PCR로 측정된 아디포넥틴 및 AdipoR2 mRNA 발현실험 결과이며(B), AMPK 및 AMPK 인산화의 웨스턴 블롯법 사진이며 (C), 복강내 포도당 주사후(2 g/kg body weight) 시간 별 혈장 포도당 수준에 대한 변화를 나타낸 도이며, 값은 평균±SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001으로 표시함).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 설포라판(sulforaphane, 이하, SFN라 함)의 준비

본 실험에 사용한 설포라판(sulforaphane, SFN) 은 시그마케미칼사 (Sigma, S6317)로부터 구입하였다.

< 참고예 1> 실험 준비

<1-1>재료 및 방법

40 마리 수컷 C57BL/6J 마우스 (5-주령, 18-20 g) 을 회사(Orient Bio, Gyeonggi-do, South Korea)에서 구입하고 12:12-시간 주야 명/암 주기의 케이지에서 20-25℃ 온도, 45-55% 상대 습도 조절하에서 사육하였다. 모든 마우스는 실험 중에 사료 및 식수에 자유롭게 접근가능하게 하였으며 사료에 대한 순화 1주일 후에, 마우스를 각각 체중 별로 10마리씩(n=10) 3개 군, 즉 (a) 정상 식이군(normal diet; NOR), (b) 고지방식이군(high-fat diet; HF) 및 양성대조군인 오를리스타트 (Orlistat, Sigma O4139) 처치군, (b) 고지방식이군(high-fat diet; HF) 및 시료처치군 (sulforphane-treated (SFN) group)으로 나누었다. 마우스들을 무작위로 10마리씩 4개군, 즉, (a) 정상 식이군(normal diet (CON) group), (b) 고지방식이군(high-fat diet (HF) group), 및 (c) 고지방식이 및 오를리스타트(Orlistat, 10mg/kg, p.o, 매일) 동시 처치군, (d), 고지방식이 및 시료 (sulforaphane, 30mg/kg, p.o, 매일) 동시 처치군으로 나누었다. 정상 식이(Normal diet, Research Diets D12450B) 및 45%/Kcal 고지방식이(HFD D12451)는 회사(Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다. 체중 및 식이량(food intake)를 매주 기록하였다. 10주 실험기간 말일에, 모든 동물을 12기간 동안 절식시키고 다음날, 마우스를 마취시키고(Zoletil, Virbac, CarrosCedex, France), 혈액 시료를 심장천자법(cardiac puncture)으로 회수하였다. 간지방 및 내장 지방 패드(pads)를 절개, 마쇄, 체중 측정 및 추가 분석을 위해 70°C에서 보관하였다.

<1-2>통계 분석

결과는 8개 동물의 평균(mean)±s.e.m으로 표시하였다. 일원 변량 분석법(One-way analysis of variance) 및 던칸 다중 범위 시험법(Duncan’s multiple range test) 을 3군의 비교하는데 사용하였다. P<0.05을 유의적으로 간주하였다. 모든 시험은 소프트에어(SPSS 12.0 software (IBM Co., Chicago, IL, USA)를 이용하여 수행하였다.

< 실험예 1> HFD -유도 간 지방증에 대한 시료의 예방효과

실시예 시료의 HFD-유도 간 지방증에 대한 시료의 예방효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

1.1. 지방간 조직학적 분석 (Histological analysis)

간 조직 표본(liver tissue specimens)을 10% 완충화 포르말린(buffered formalin)으로 고정시키고, 파라핀(paraffin)으로 함침하고, 5-μm 두께로 세절하고 지방 방울의 조직학적 분석을 위하여 헤마톡실린(hematoxylin, Sigma H9267) 및 에오신(eosin, Sigma C4009) 염색하였다. 지방증을 반정량적 병리학적 기준(semiquantitative pathological standards)에 따라 점수화하였다 (D.G. Tiniakos, Ch. Kittas., Pathology of nonalcoholic fatty liver disease. ANNALS OF GASTROENTEROLOGY 2005, 18(2):148-159)

1.2. 생화학적 분석

혈장 트리글리세리드(triglycerides; TGs), 총 콜레스테롤 (cholesterol; TC), 및 FFAs 농도를 측정용 키트(Bio-Clinical System, Gyeonggi-do, Korea)를 이용하여 측정하였다. (ALT;alanine aminotransferase) 및 (AST; aspartate aminotransferase) 의 혈장 활성을 분석용 기기(Express Plus, Chiron Diagnostics, MA)로 분석하였다. 간 지질을 용매(chloroformmethanol mixture; 2:1 v/v)를 이용하여 문헌(Folch et al.)에 기재된 바대로 추출하고 건조 지질 잔사를 2 ml 에탄올에 용해시켰다. 간 지질 추출물중 콜레스테롤, TG, 및 FFAs 농도를 상용 키트(Bio-Clinical System)를 이용하여 측정하였다. 인슐린 및 아디포넥틴 (adiponectin) 혈장 수준을 키트(MAGPIX, ELISA kits, Millipore MADPNMAG-70K-01)를 이용하여 분석하였다.

본 실험 결과, HFD 군 보다 SFN 군의 간에서 보다 적은 지방 축적을 확인하였다 (도 1A). 조직병리학적 결과와 일치하게, SFN 군은 HF 군보다 낮은 간 지방증 점수 (hepatic steatosis scores)를 나타냈다 (NOR, 1.0; HF, 3.2 Orlistat, 2.4; SFN, 1.3) (도 1B). SFN 은 HFD 군과 비교시 간무게가 33% 낮은 감소하였다. (도 1C). 추가적으로, 혈장 ALT 및 AST 활성은 HFD 군보다 SFN에서 유의적으로 더 낮은 활성을 나타냈다. (도 1D,E). 게다가, SFN 군은 군보다 유의적으로 더 낮은 간 TC (74%), TG (25%), 및 FFA (52%) 농도들을 나타냈다 (도 1F-H). HF 군은 NOR군보다 유의적으로 높은 혈장 TG, FFA, 및 TC 수준을 나타냈다. SFN는 HF 식이-유도된 혈장 TC 수준 (22%) ,TG (29%), 및 FFA (44%) 상승현상을 유의적으로 경감시켰다 (도 1I-K).

또한, 8주간 SFN을 유지시킨 마우스는 HF 식이 마우스와 비교시에 식이섭취량의 변화가 없이 체중 (20%), 및 부고환(epididymal), 장간막(mesenteric), 복막후(retroperitoneal) 및 신장주위(perirenal) 지방-패드(fat-pads)를 포함한 총 내장 지방-패드(visceral fat-pad), 체중 (50%), 체중증가 (-47%), 및 식이효율비 (-34%) 면에서 유의적인 감소를 나타냈다(도 2A-E). 내장 지방은 대사증후군 및 간 지방증의 중요한 지시자이다. 내장지방에 대한 SFN의 영향을 살펴보기 위하여, 개개 마우스의 간, 부고환 및 신장주위 기관을 상호 비교하였다 (도 2F).

<실험예 2> 지방증 관련 유전자 발현에 미치는 효과

실시예 시료의 지방증 관련 유전자 발현에 미치는 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

2.1. RNA 추출 및 정량적역 전사- PCR 분석

마우스 간 또는 배양 세포로부터 총 RNA를 공급자의 지시에 따라 시약(Trizol reagent, 15596018 , Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 추출하였다. 유전자 발현을 정량적 역전사 (quantitaive reverse transcription)-PCR 분석법을 이용하여 정량하였다. 프라이머(Primers), 아닐링 온도(annealing temperatures) 및 관련된 유전자의 생성 길이 세트(production lengths set)를 표 1에 나타냈다.

프라이머 서열 및 PCR 조건

Gene name	Tm (C)	Size(bp)	Sequence 5’-3’ Sequence 3’-5’	Accession number
Adiponectin receptor 1 (AdipoR1)	54.76 54.82	197 bp	CTGCTTGGTTTTGTGCTATT AGTTTGGAAAAAGTCCGAGA	NM_028320.3
Adiponectin receptor 2 (AdipoR2)	54.99 55.00	330 bp	ATTGGGTTGTGGATAAGGTC TTCGGTTCCCTAAGAGTTTG	NM_197985.3
adiponectin	55.00 54.99	211 bp	TCTTCACCTACGACCAGTAT GTATGGGCTATGGGTAGTTG	NM_009605.4

2.2. 웨스턴 블럿 분석법 ( Western blot analysis )

개개 마우스로부터 얻은 간조직을 추출 완충액 (100M Tris-HCl, PH 7.4, 5M EDTA, 50m NaCl, 50M sodium pyrophosphate, 50MNaF, 100mMorthovanadate, 1% Triton X-100, 1M phenylmethanosulfonyl fluoride, 2 mg/mLaprotinin, 1 mg/mLpepstatin A 및 1 mg/mLleupeptin)로 4°C에서 균질화하고 4°C에서 15분간 원심분리(3000 × g)를 수행하였다. 단백질 추출물을 10% SDS-polyacrylamide 겔 전기영동법(gel electrophoresis)으로 분리하고 니트로셀룰로스 막 (RPN303D, nitrocellulose membranes, Amersham, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 막을 AMPK, p-AMPK 에 대한 1차 다중클론성 항체(primary polyclonal antibodies)들, 각각 (sc-25792, Santa Cruz, CA, USA) 및 (#2535,Cell Signaling, MA, USA)로 4°C에서 하룻밤동안 배양하였다. 상응하는 2차 항체와 같이 배양한 후에, 신호들을 기기(ChemiDoc XRS, chemiluminescent detection system, Amersham) 및 분석법 (One analysis software, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).을 이용하여 정량화하였다.

상기 실험 결과, SFN 은 HF 식이 마우스의 부고환 지방 조직에서 순환 아디포넥틴(adiponectin) 수준 및 아디포넥틴(adiponectin)의 mRNA 발현을 유의적으로 증가시켰다 (도 3A, B). 또한, SFN 은 간 조직에서 adipoR2의 발현을 자극하였다(도 3B). 웨스턴 블롯 실헙결과, AMPK 의 간 인산화(hepatic phosphorylation)가 HF 식이군보다 SFN 군에서 유의적으로 보다 높게 나타났다 (도 3C).

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 산제의 제조

SFN -------------------------------------------------- 20 mg

유당 ------------------------------------------------ 100 mg

탈크 ------------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

SFN -------------------------------------------------- 10 mg

옥수수전분 ------------------------------------------ 100 mg

유당 ------------------------------------------------ 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

SFN -------------------------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 ------------------------------------- 3 mg

락토오스 ------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 ------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

SFN ------------------------------------------------- 10 mg

만니톨 --------------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 -------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O ----------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

< 제제예 5> 액제의 제조

SFN ------------------------------------------------- 20 mg

이성화당 --------------------------------------------- 10 g

만니톨 ------------------------------------------------ 5 g

정제수 ----------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

< 제제예 6> 건강 식품의 제조

SFN ---------------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 --------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 -------------------------------- 70 ㎍

비타민 E ------------------------------------------ 1.0 ㎎

비타민 B1 ---------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 ---------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ----------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ---------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ------------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 --------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ------------------------------------ 1.7 ㎎

엽산 ---------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ------------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 --------------------------------------- 적량

황산제1철 ---------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ----------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘-------------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ---------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ---------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ----------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ------------------------------------------ 100 ㎎

염화마그네슘 ------------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 제제예 7> 건강 음료의 제조

SFN --------------------------------------------- 1000 ㎎

구연산 ------------------------------------------ 1000 ㎎

올리고당 ----------------------------------------- 100 g

매실농축액 ----------------------------------------- 2 g

타우린 --------------------------------------------- 1 g

정제수 ------------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (9)

1. 설포라판(sulforaphane, SFN)을 유효성분으로 함유하는 간 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 설포라판(sulforaphane, SFN) 은 화합물 자체 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물을 포함하는 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 간 질환은 급성 간염, 만성 간염, 지방간, 또는 간경변증인 약학 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 지방간 질환은 알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환 또는 지방간염인 약학 조성물.
5. 설포라판(sulforaphane, SFN) 을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 제5항에 있어서, 상기 건강기능식품은 음료, 껌, 비타민 복합제 또는 건강음료인 건강기능식품.
7. 간 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 설포라판(sulforaphane, SFN)을 주성분으로 함유하는 건강보조식품.
8. 간 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 설포라판(sulforaphane, SFN)을 주성분으로 함유하는 식품.
9. 간 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 설포라판(sulforaphane, SFN)을 주성분으로 함유하는 식품첨가물.
   

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