KR101260697B1

KR101260697B1 - 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 포함하는 가바 ａ형-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물 및 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101260697B1
Application number: KR1020110113355A
Authority: KR
Inventors: 조승목; 한대석; 백남인; 한진규; 진영호; 양혜진; 박지해; 이창호
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2011-01-03
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2013-05-10
Also published as: KR20120079003A; JP2016006077A; KR101260696B1; KR20120091995A; JP6014731B2; KR20130020701A; JP2014505683A

Abstract

본 발명은 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 유효성분으로 하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물로서, 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌은 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지는 것으로, 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않고 안전성을 확보할 수 있으며, 갈조류 추출물을 유효성분으로 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물이나 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물으로 활용될 수 있다.

Description

플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 포함하는 가바 Ａ형-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물 및 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 조성물 {Composition for invigorating GABAA-benzodiazepine receptor and composition having anxiolitic, anti-convulsant, anti-depressant and sleep-improving effect containing phloroglucinol or phlorotannins}

본 발명은 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 유효성분으로 포함하는 GABA_A-벤조다이아제핀(benzodiazepine) 수용체 활성용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가져서 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에서 많은 사람들은 스트레스와 불안, 초조 때문에 수면장애를 겪고 있다. 통계에 의하면 성인의 약 15%가 불안증상에 의한 불면증 때문에 약물치료가 필요하다고 알려져 있으며, 불면의 원인으로는 스트레스, 긴장, 공포 등 다양하며, 치료 약물로는 벤조다이아제핀 계열의 약물과 세로토닌 효능약 등이 사용되고 있으나, 이러한 약물들은 장기간 사용하였을 때 내성 및 의존성이 형성되는 부작용이 심한 문제점이 있다.

따라서, 수면제 장기복용자 및 제한자의 경우 이를 대체할 수 있는 수단으로 천연 보조제의 필요성이 높아지고 있으며, 수면 증진 건강기능식품에 대한 수요가 증대되고 있는 실정이다.

또한, GABA_A수용체는 멤브레인 이온 채널을 형성하는 팬타머릭 단백질로서, 진정, 수면, 불안, 근육긴장, 경련, 기억 상실 등의 조절과 밀접한 관련이 있고, 이를 통하여 GABA(감마-아미노부티르산)이 작용하게 된다. 불안 치료제, 진정제 또는 수면유도제로서 벤조다이아제핀을 포함하여 많은 약물들이 이 수용체에 결합하여 약리작용을 행하고 있고, 벤조다이아제핀 부위에 약물 또는 보조제가 결합하면 GABA에 대한 GABA_A수용체 친화도를 증진시키고 염소 이온의 세포 내 유입을 증가시켜 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 보인다. 그러나, 여전히 약물 의존성을 보이고, 근육완화 및 건망증 등의 심각한 문제를 초래하기도 한다.

따라서, GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 사이트에 결합 작용하여 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지면서 부작용의 위험이 없고 안전한 천연물로부터 얻어진 물질을 이용한 진정-수면 효과의 보조제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 부위에 작용하여 GABA_A 수용체가 GABA에 반응하여 염소이온 채널을 활성화시키고, 염소가 세포내로 유입되어 세포막 전위의 과다 분극을 통해서 신경세포성(neuronal) 활동을 늦추는 육상의 허브 및 식물 추출물에 대한 연구가 있으나, 해조류인 갈조류 추출물 또는 갈조류에 특이적으로 존재하는 페놀성 화합물인 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌에 대한 보고는 세계적으로 그 사례가 없었다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 사이트에 결합하여 친화력을 가지는 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 포함하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 포함하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,

플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 유효성분으로 하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 플로로탄닌은 엑콜류, 퓨콜류, 플러레톨류, 퓨할롤류 및 엑스톨로놀 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 플로로탄닌은 엑스톨로놀, 트리플로레톨 A, 퓨코디플로레톨 G, 엑콜 및 6,6'-비엑콜 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있다.

본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여,

플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 유효성분으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 플로로탄닌은 엑스톨로놀, 트리플로레톨 A, 퓨코디플로레톨 G, 엑콜 및 6,6'-비엑콜 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 정제, 산제, 과립제 및 캅셀제 중에서 어느 하나의 형태로 제제화 된 건강기능식품일 수 있다.

본 발명에 따른 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌은 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가져 이를 포함하는 조성물은 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선에 효과적이고, 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않고 안전성을 확보할 수 있으며, 약학 조성물이나 건강기능식품 등의 식품 조성물로도 매우 유용하다.

도 1은 감태 물 추출물(ECK-W), 감태 메탄올 추출물(ECK-M), 감태 에탄올 추출물(ECK-E) 각각에서, 방사성 표지된 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 각각의 샘플을 쥐에게 경구투여하고 45분 후 hypnotic(45 mg/kg) 농도의 펜토바비탈을 복강주사로 투여하고 입면시간(sleep latency)을 나타낸 그래프이고, 도 2b는 수면시간(sleep duration)을 나타낸 그래프이다.
*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있고, **은 대조구와 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있다.(Dunnet's test)
CON : 대조구(0.5% CMC-saline 10 mL/kg)을 경구투여 후 펜토바비탈 투여
DZP : 디아제팜(diazepamP) 2 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈 투여
ECK-E : 감태 에탄올 추출물을 각각 100, 250, 500, 1000 mg/kg 투여 후 펜토바비탈 투여
ECK-W : 감태 물 추출물을 각각 100, 250, 500, 1000 mg/kg 투여 후 펜토바비탈 투여
도 3은 감태 에탄올 추출물로부터 용매 분획을 제조하는 과정을 나타낸 개요도이다.
도 4a는 감태 추출물 분획의 방사성 표지된 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합억제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 4b는 각각의 감태 추출물 분획을 쥐에게 경구투여하고 45분 후 hypnotic(45 mg/kg) 농도의 펜토바비탈을 복강주사로 투여하고 수면시간(sleep duration)을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 감태 추출물 분획의 총페놀함량(TPC)와 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합에 대한 IC₅₀의 상관관계를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 각 감태 추출물 분획의 총페놀함량(TPC)와 수면시간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 6은 감태 추출물 분획에서 분리된 플로로탄닌 화합물인 플로로글루시놀, 엑콜, 엑스톨로놀, 트리플로레톨-A 및 디엑콜의 구조이다.
도 7a 및 도 7b는 플로로글루시놀(phloroglucinol, PG)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 7c 및 도 7d는 플로로글루시놀의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 엑스톨로놀(ekstolonol, ETN)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 8c 및 도 8d는 엑스톨로놀의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.
도 9a 및 도 9b는 트리플로레톨 A(triphlorethol, TPE-A)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 9c 및 도 9d는 트리플로레톨 A의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.
도 10a 및 도 10b는 퓨코디플로레톨 G(fucodiphlorethol G, FDE-G)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 10c 및 도 10d는 퓨코디플로레톨 G의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.
도 11a 및 도 11b는 엑콜(eckol)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 11c 및 도 11d는 엑콜의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 6,6'-비엑콜(6,6'-bieckol)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 12c 및 도 12d는 6,6'-비엑콜의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.
도 13a 및 도 13b는 상기 수면 유도 효과 확인시험에서 양성 대조군으로 사용된 디아제팜(DZP)와 졸피뎀(ZPD)의 유효 농도를 확인하기 위해 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

GABA_A 수용체는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과와 관련되어 있으며, GABA_A 수용체에 작용하는 약물로는 작용제(agonist)로서는 벤조다이아제핀, 디아제팜(diazepam, DZP), 졸피뎀(zolpidem) 등이 있고, 길항제(antagonist)로는 플루마제닐(flumazenil, FLU)이 있다. 상기에서 언급하였듯이 GABA_A수용체에 작용하는 약물의 경우 의존성 및 부작용을 초래하는 문제점이 있다.

갈조류 추출물은 녹조류나 홍조류와 달리 GABA_A-benzodiazepine(벤조다이아제핀) 수용체에 작용하여 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다. 상기 수면 개선은 입면시간(sleep latency)가 감소하고, 수면시간(sleep duration)이 증가하는 효과일 수 있으나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 아니한다.

상기 갈조류 추출물에서 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 작용하여 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 나타내는 유효성분은 갈조류에만 특이적으로 존재하는 폴리페놀 화합물인 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌임을 확인하였다.

상기 플로로탄닌은 플로로글루시놀의 올리고머이다. 플로로탄닌은 예를 들어 엑콜류, 퓨콜류, 플러레톨류, 퓨할롤류 및 엑스톨로놀 중에서 선택될 수 있다.

상기 엑콜류는 엑콜, 디엑콜, 비엑콜, 플로로엑콜, 퓨로엑콜, 퓨코퓨로엑콜, 플로로퓨코퓨로엑콜 등이 있고, 퓨콜류는 2 내지 10 개의 플로로글루시놀이 아릴-아릴 결합된 올리고머이고, 플러레톨류는 2 내지 10 개의 플로로글루시놀이 아릴-에테르 결합된 올리고머이며, 퓨할롤류는 3 내지 10 개의 플로로글루시놀이 파라 또는 오르쏘 위치에서 에테르 결합되고, 3번째 환마다 수산기를 더 포함하는 올리고머이다. GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 작용하여 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과가 뛰어난 플로로탄닌으로는 엑스톨로놀, 트리플로레톨 A, 퓨코디플로레톨 G, 엑콜 및 5,6'-비엑콜이 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌은 갈조류에서 개별 화합물로 분리된 것을 사용하거나, 하나 이상의 플로로탄닌이 혼합되어 있는 상태로 추출된 추출물, 그 추출물을 다시 분획한 농축물을 사용할 수 있고, 또는 인공적으로 합성 또는 반합성된 것을 사용할 수도 있다.

본 발명의 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 유효성분으로 하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물은 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물일 수 있다.

상기 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 단독으로 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합의 형태로 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 저제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 유효성분으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 건강기능식품 또는 일반 식품의 유효성분 첨가물로 사용하는 경우 본 발명에 따른 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명에 따른 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 유래된 성분인 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료 식품은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 기능성 식품 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 수면 개선용 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 조성물 100중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실험예 1: 해조류 추출물에서의 GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 탐색

불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 갖는 해조류를 탐색하기 위하여 5종의 녹조류, 7종의 홍조류 및 6종의 갈조류, 총 18종의 해조류의 메탄올 추출물을 제주테크노파크의 제주 생물자원 추출물 은행에서 구입하여 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합력을 측정하였다. 증거 견본(Voucher specimen)은 제주 생물자원 추출물 은행에 기탁하였다.

GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 측정은 SD rat의 대뇌피질을 적출한 후 즉시 30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, keep at 4) 20 mL에 넣어 균질화시키고 10초 동안 초음파를 처리하였다. 이 후 27,000×g 및 4℃의 조건에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 다시 buffer 20 mL을 취하여 원심분리하였으며, 이 과정을 3번 반복하였다. 뇌 조직 안의 GABA를 제거하기 위하여 37℃의 water bath에서 30분간 incubation 시키고 원심분리한 후 pellet을 수집하여 -80℃에서 동결보관하여 사용하였다. 동결된 membrane을 해동시킨 후 27,000×g 및 4℃의 조건에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 50 mM Tris-citrate buffer (binding buffer, pH 7.1, keep at 4℃) 20 mL을 넣고 원심분리하였다. 이 과정을 3번 반복한 후 membrane을 binding buffer에 500 mL buffer/original tissue g의 농도로 현탁시켜 결합력 평가 시험에 사용하였다. 96-well plate에 membrane suspension 180 ㎕, 각각의 추출물 시료 10 ㎕ 및 [3H] flumazenil (1 nM, final concentration) (Ro 15-1788; PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) 10 ㎕을 넣고 ice-bath에서 40분간 incubation 하였다. 이 후 glass fiber filter (GF/C, Whatman)을 이용하여 수집하였다. 샘플의 radioactivity는 Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzers (Perkin-Elmer, Shelton, CT, USA)를 통해 측정되었다. 비특이적 결합 (nonspecific binding, NSB)은 clonazepam (1 uM, final concentration)을 이용하여 그 값을 결정하였고, Binding displacement 값 (%)은 아래 식(1)과 같이 계산하였다.

식(1)

Binding displacement(%)=[1 - ((시료의 DPM - NSB DPM)/(TB DPM - NSB DPM))]×100

(DPM: disintegrations per minute, TB: total binding, NSB: nonspecific binding)

추출물의 농도를 각각 0.1 mg/mL, 1 mg/mL 및 10 mg/mL로 달리하여 녹조류 메탄올 추출물의 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 결과는 [표 1]에 나타내었고, 홍조류 메탄올 추출물의 결과는 [표 2]에 나타내었으며, 갈조류 메탄올 추출물의 결과는 [표 3]에 나타내었다.

Family	Species	Displacement (%) of [³H]-flumazenil binding to the GABA_A-BZD receptor
Family	Species	0.1 mg/mL	1 mg/mL	10 mg/mL
Codiaceae	Codium coactum Okamura	18.1±2.3	26.3±1.8	46.5±4.5
	Codium contractum Kjellman	12.3±5.2	23.5±4.5	42.3±2.0
	Codium latum Suringa	7.6±5.6	19.0±3.8	48.0±4.0
	Codium minus Silva	15.4±5.2	17.9±2.0	39.2±1.8
Ulvaceae	Ulva conglobata Kjellman	8.5±4.7	30.8±3.7	86.2±1.9

Family	Species	Displacement (%) of [³H]-flumazenil binding to the GABA_A-BZD receptor
Family	Species	0.1 mg/mL	1 mg/mL	10 mg/mL
Champiaceae	Champia parvula Harvey	6.1±3.0	7.6±2.6	10.4±3.7
Gigartinaceae	Chondracanthus tenellus Hommersand	11.8±6.4	16.3±5.1	21.7±3.3
Gigartinaceae	Gracilaria verrucosa Papenfuss	13.9±3.1	20.7±2.3	80.6±4.8
Grateloupiaceae	Grateloupia filicina C.Agardh	-2.4±1.9	21.8±5.1	16.9±9.2
Grateloupiaceae	Polyopes lancifolius	10.1±3.6	15.7±2.6	35.3±3.0
Halymeniaceae	Polyopes affinis	8.0±3.9	13.8±6.9	7.4±7.4
Rhodomelaceae	Chondria crassicaulis Harvey	-6.1±4.0	7.2±2.1	43.6±0.9

Family	Species	Displacement (%) of [³H]-flumazenil binding to the GABA_A-BZD receptor
Family	Species	0.1 mg/mL	1 mg/mL	10 mg/mL
Alariaceae	Ecklonia cava Kjellman	5.2±6.4	43.1±6.2	91.3±2.3
Dictyotaceae	Dictyopteris prolifera Okamura	18.5±1.0	31.5±4.9	63.8±4.9
Sargassaceae	Dictyota coriacea	16.2±1.7	16.2±5.6	42.1±2.0
Sargassaceae	Dictyota dichotoma Lamouroux	26.3±14.7	25.7±9.3	72.6±1.6
Sargassacea	Sargassum horneri C.Agardh	4.4±3.6	18.8±1.3	70.4±2.4
Sargassacea	Sargassum patens C.Agardh	3.9±2.8	15.9±4.7	55.7±1.5
Shigeaceae	Ishige okamurae Yendo	-8.3±4.1	20.0±2.3	73.8±1.8

녹조류에서 모란갈파래(Ulva conglobata Kjellman)와 홍조류에서 꼬시래기(Gracilaria verrucosa Papenfuss)가 10 mg/mL 농도에서 80% 이상의 [³H]-플루마제닐의 결합을 치환하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성을 나타내었으나, 나머지 대부분의 녹조류와 홍조류에서는 효과적인 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성을 나타내지 못하였다. 그러나 갈조류에서는 참가죽그물바탕말(Dictyota coriacea) 및 쌍발이모자반(Sargassum patens C.Agardh)을 제외하고는 대부분 결합 활성을 10 mg/mL 농도에서 55% 이상의 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성을 나타내었고, 특히 감태(Ecklonia cava Kjellman)는 90% 이상의GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성을 나타내었다.

실험예 2: 추출용매에 따른 감태 추출물의 GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성

실험예 1에서 90% 이상의GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성이 가장 뛰어났던 감태(Ecklonia cava Kjellman, ECK)에서 추출용매를 달리 했을 때 활성의 차이가 있는지 확인하기 위하여 추출용매를 달리한 감태 추출물을 제조하였다.

감태 에탄올 추출물은 70% 에탄올로 50℃에서 3시간 동안 추출하였고, 감태 물 추출물은 효소(비스코자임, 알칼라아제, 펙신)를 첨가하여 45℃에서 3시간 동안 추출하였으며, 감태 메탄올 추출물은 80% 메탄올로 상온에서 24시간 추출하였다. 모든 추출물들은 추출 후 여과 및 농축과정을 거친 후 동결건조하여 분말화하였다.

도 1은 감태 물, 에탄올, 메탄올 추출물의 방사성 표지된 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐의 결합 치환 효과를 나타낸 그래프이다. 이는 수면효과를 나타내는 성분들을 탐색하기 위하여 일반적으로 사용되는 방법으로 [³H] 플루마제닐의 치환 효과가 높을수록 그 물질의 결합 활성이 높은 것을 의미한다.

감태의 3가지 추출물 모두 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 대한 친화력이 농도의존적으로 높아졌으며, IC₅₀ 값은 ECK-W(물 추출물)=1.026, ECK-M(메탄올 추출물)=1.256, ECK-E(에탄올 추출물)=0.456 mg/mL을 나타내었다.

실험예 3: 추출용매 및 농도에 따른 에 따른 감태 추출물의 수면 유도 효과

1) 실험재료

펜토바비탈(Pentobarbital)은 한림 제약회사에서 구입하였고, GABA_A-벤조다이아제핀 수용체의 길항제인 디아제팜(diazepam, DZP)은 잘 알려진 수면제 중의 하나로서 진정 및 수면 유도 효과의 양성 대조군으로 사용하였다.

실험동물로 무게 18 ~ 22g의 수컷 ICR 생쥐(Koatech Animal사)를 온도 24℃, 습도 55%, 형광등 명암 12시간 사이클(조명 오전 8시)의 조건하에서 시료 및 음수는 자유롭게 섭취하게 하고, 새로운 환경에 적응시키기 위하여 실험 전 1주일간 사육하였다. 또한, GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 평가를 위한 멤브레인 준비를 위하여 무게 200~250g의 SD 쥐를 사용하였다. 동물 실험과 관련된 모든 절차는 한국식품연구원 동물관리위원회(KFRI-IACUC, Korea Food Research Institutional Animal Care and Use Committee)의 실험동물 사용 지침에 의거 수행하였다.

2) 실험방법

모든 실험은 오후 1시에서 5시 사이에 진행되었고, 생쥐들은 실험 전 24시간 전에 절식시켰다. 경구 투여를 위하여 감태 에탄올 추출물을 0.5% carboxymethyl cellulose (Control-0.5%, CMC-saline 10 mL/kg)에 희석시키고, 양성 대조군인 디아제팜(diazepam, DZP)은 역시 0.5% CMC-saline에 희석시켰다. 감태 에탄올 추출물 및 물 추출물(각각 100, 250, 500, 1000 mg/kg)과 디아제팜(diazepam, DZP, 2 mg/kg)을 펜토바비탈 투여 45분 전에 경구 투여하였다. 또한 음성 대조군(Control group, CON)로서는 별도의 약물을 투여하지 않고, 0.5% CMC-saline 10 mL/kg을 투여하였다.

각각 생쥐에게 펜토바비탈(sub-hypnotic dosage 30 mg/kg, hypnotic dosage 45 mg/kg)을 복강 주사한 후 입면시간(sleep latency)과 수면시간(sleep duration)을 측정하였다. 펜토바비탈을 생쥐에게 복강 내에 주사한 뒤로부터 등으로 바닥에 기대어 있다가 두위반사를 상실할 때까지 경과시간을 즉, 펜토바비탈 주사 후 수면개시(sleep onset)까지의 시간을 입면시간(sleep latency)라고 간주하였고, 상자 안의 생쥐 중에서 펜토바비탈 투여 후에 1분 이상 움직임이 없는 경우 잠든 것으로 간주하였다. 수면시간(sleep duration)은 생쥐가 상자가 옮겨진 후 움직임이 없을 때부터 자율행동을 회복하기까지의 시간으로 간주하였다. sub-hypnotic dosage of pentobarbital-treated 실험에서 수면개시 계산 방법은 아래 식(2)와 같다.

식(2)

수면개시(sleep onset, %)=(No.falling asleep)/(Total No.)×100

3) Hypnotic 농도의 펜토바비탈에 의해 유도된 쥐에서 감태 에탄올 및 물 추출물의 수면 유도 효과

감태 에탄올 추출물(ECK-E) 및 물 추출물(ECK-W)을 100, 250, 500, 1,000 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈(45 mg/kg, i.p.)에 의한 수면유도효과에 미치는 영향을 하기 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 각 그래프는 평균값(means±SEM, n=10)을 나타낸다.

*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, ***은 대조구와 비교하여 p<0.001에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미하고, #은 p<0.05에서, ##은 p<0.01에서 병용 투여한 그룹과 단일 투여한 그룹 사이의 유의적인 차이가 있다는 것을 의미한다.

감태 에탄올 추출물(ECK-E)은 용량 의존적으로 입면시간을 감소시켰으며, 100 mg/kg을 제외한 농도에서 용량 의존적으로 수면시간을 증가시켜 수면증진 효과를 나타내었다. 감태 물 추출물(ECK-W)의 경우는 낮은 농도에서는 수면효과가 나타나지 않았지만, 500, 1,000 mg/kg의 농도에서 용량 의존적으로 수면시간(sleep duration)의 유의적인 증가(p<0.01)와 입면시간(sleep latency)의 유의적인 감소(p<0.01)가 나타났다. 특히 감태 물 추출물(ECK-W) 1,000 mg/kg의 농도에서는 감태 에탄올 추출물(ECK-E)과 positive control인 DZP보다 유의적으로 감소(p<0.01)한 입면시간(sleep latency)을 확인할 수 있었다.

4) Sub-hypnotic 농도의 펜토바비탈에 의해 유도된 쥐에서 감태 에탄올 및 물 추출물의 수면 유도 효과

감태 에탄올 및 물추출물이 sub-hypnotic (펜토바비탈 30 mg/kg, 복강주사)농도에서의 입면시간(sleep latency)과 수면시간(sleep duration)을 측정하여 수면유도효과에 미치는 영향을 하기 [표 4]과 [표 5]에 나타내었다. 실험결과, 감태에탄올 추출물은 sub-hypnotic 농도의 펜토바비탈에서 대조 그룹은 수면을 유도하지 못했지만, 다이아제팜(2 mg/kg, 경구투여)은 수면 개시가 100%로 가장 높게 측정되었으며 모두가 수면상태로 들었다. 감태 에탄올 및 물추출물에서는 농도 의존적으로 수면개시(sleep oneset)의 입면시간(sleep latency) 증가와 수면시간(sleep duration)의 증가가 나타났으며, 특히, 1000 mg/kg의 농도에서는 수면개시가 각각 92%와 90%로 높게 나타났다. 수면시간(sleep duration)도 각각 38.7±6.3 분과 39.93±4.7 분으로 유의적인 증가(p<0.05)를 나타냈다.

그룹	투여량(mg/kg)	수면상태/전체(수)	수면개시(%)	수면시간(분)
CON		2/12	17	7.3±1.1
DZP	2	12/12	100	55.4±4.8***
ECK-E	100	7/12	58	12.7±2.1
	250	8/12	67	15.1±4.4
	500	10/12	83	19.7±3.4
	1000	11/12	92	38.7±6.3*

그룹	투여량(mg/kg)	수면상태/전체(수)	수면개시(%)	수면시간(분)
CON		1/10	10	11.7±0.0
DZP	2	10/10	100	62.7±4.8***
ECK-W	100	3/10	30	11.7±1.1
	250	5/10	50	16.8±4.8
	500	7/10	70	33.93±2.6
	1000	9/10	90	39.93±4.7*

상기 [표 4]과 [표 5]는 CON(0.5%, CMC-saline 10 mL/kg), 감태 에탄올 추출물(ECK-E, 각각 100, 250, 500, 1000 mg/kg), 감태 물 추출물(ECK-W, 각각 100, 250, 500, 1000 mg/kg)과 DZP(2 mg/kg)를 펜토바비탈 투여 45분 전에 경구 투여한 결과로서,

수면개시(sleep onset, %) = (수면상태 수/전체 수)×100

수면시간(sleep duration)은 평균값(mean±SEM, n=12)

*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있고, **은 대조구와 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있다.(Dunnet's test).

CON : 대조군 (0.5% CMC-saline 10 mL/kg)을 경구투여 후 펜토바비탈 투여

DZP : 다이아제팜(diazepam) 2 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈 투여

ECK-E : 감태 에탄올 추출물 100, 250, 500, 1000 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈 투여

ECK-W : 감태 물 추출물 100, 250, 500, 1000 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈 투여

상기 [표 4] 및 [표 5]에서와 보는 바와 같이, 감태 에탄올 및 물 추출물은 농도 의존적으로 입면시간의 증가와 수면시간의 증가가 있음을 확인할 수 있다.

실험예 4: 감태 추출물 분획의 GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 및 수면 유도 효과

1) 감태 추출물 분획의 제조

GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 결합하여 진정 및 수면 유도 등의 활성을 나타내는 유효성분을 확인하기 위하여 도 3에 나타낸 바와 같이 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물 분획을 제조하였다.

2) GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 및 수면 유도 효과 실험결과

GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합 치환 효과는 실험예 1의 방법으로 확인하여, 각각의 감태 추출물 분획의 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합 치환 효과를 도 4a에 나타내었고, Hypnotic 농도의 펜토바비탈에 의해 유도된 쥐에서 감태 추출물 분획의 수면 유도 효과를 실험예 3의 방법으로 확인하여 도 4b에 나타내었다.

에틸아세테이트(EtOAc) 분획이 가장 낮은 IC₅₀ 값(0.0185 mg/mL)을 나타내었고, n-부탄올, n-헥산 및 물 분획은 IC₅₀ 값이 각각 0.1033, 0.1405 및 0.9607을 나타내었다(도 4a).

수면 유도 효과와 관련해서도 상기 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합 치환 활성과 유사한 경향을 나타내었다. 에틸아세테이트 분획은 100 및 200 mg/mL 모두에서 수면시간이 현저히 증가하였고, 물 분획은 200 mg/mL에서도 의미있는 수면 유도 활성을 나타내지 못하였다(도 4b).

상기 결과로부터 감태 추출물의 에틸아세테이트 분획에 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가져서 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 나타내는 유효성분 함량이 많은 것으로 판단되었다.

실험예 5: 감태 추출물 분획의 총페놀함량과 GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 및 수면 유도 효과의 상관관계

감태 추출물의 에틸아세테이트 분획에는 갈조류 특유의 폴리페놀인 플로로탄닌이 다수 포함되어 있으므로, 상기 에틸아세테이트 분획의 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합 치환 효과 및 수면 유도 효과가 플로로탄닌에 의한 것일 가능성을 확인하기 위하여 상기 각각의 감태 추출물 분획의 총페놀함량을 분석하고, 총페놀함량과 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 및 수면 유도 효과와의 상관관계를 분석하였다.

[표 6]은 감태 추출물 분획의 총페놀함량을 나타낸 것으로, 에틸아세테이트 분획에서 총페놀함량(TPC)가 가장 높고, 물 분획에서 가장 낮은 것을 확인하였다. 감태 에탄올 추출물(ECK-E)의 총페놀함량은 138.5 mgPEG/g으로 에틸아세테이트 분획 및 n-부탄올 분획이 감태 에탄올 추출물에 비해 총페놀함량이 높았다.

Fractions	n-Hexane	EtOAc	n-Butanol	H₂0	ECK-E
TPC (mg PGE/g)	102.9±0.8	685.7±14.6	262.6±12.2	30.4±2.8	138.5±2.4

상기 각 감태 추출물 분획의 총페놀함량(TPC)와 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합에 대한 IC₅₀의 상관관계를 도 5a에 나타내었고, 각 감태 추출물 분획의 총페놀함량(TPC)와 수면시간의 상관관계를 도 5b에 나타내었다.

상기 도 5a 및 도 5b에 따르면 각 추출물 분획의 결합 활성과 수면 유도 효과는 총페놀함량에 비례함을 알 수 있었다. 결합 활성의 비선형회기 분석에 따른 계수(R²)는 0.9544이었고, 수면시간과 총페놀함량 사이에도 100 mg/kg 농도에서는 R²가 0.8396, 200 mg/kg 농도에서는 R²가 0.9051로서 상관관계가 높음을 알 수 있었다.

또한 상기 감태 추출물 분획과 감태 에탄올 추출물에 포함된 플로로탄닌 화합물의 종류 및 함량(mg/g)을 분석하여 [표 7]에 나타내었다.

Constituents	n-Hexane	EtOAc	n-Butanol	H₂0	ECK-E
Phloroglucinol	-	16.14	-	-	7.59
Eckstolonol	-	21.83	-	-	4.06
Eckol	-	33.26	37.55	-	18.11
Triphlorethol-A	11.19	21.46	24.56	9.15	9.79
Dieckol	9.31	274.73	115.00	6.09	53.22
Total	20.49	367.42	177.11	15.24	92.77

상기 각 감태 추출물 분획 및 감태 에탄올 추출물에서 검출된 플로로탄닌 화합물은 플로로글루시놀, 엑콜, 엑스톨로놀, 트리플로레톨-A 및 디엑콜이었다. 각 플로로탄닌 화합물들의 구조는 도 6에 나타내었다.

결합 활성과 수면 유도 효과가 높았던 에틸아세테이트 분획과 n-부탄올 분획에서 총 플로로탄닌 화합물의 함량이 367.42 mg/g 및 177.11 mg/g으로 n-헥산 분획 및 물 분획에 비하여 현저히 높았다.

또한 각각의 분획에서 총 플로로탄닌 화합물의 함량과 수면시간의 상관관계는 100 mg/kg 농도에서는 R²가 0.9682, 200 mg/kg 농도에서는 R²가 0.9434로서 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 플로로탄닌 화합물의 GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성

상기 각 감태 추출물 분획에 존재하는 플로로탄닌 화합물들의 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합 치환 효과를 나타내는 IC₅₀값과 결합 친화도(K_i)를 계산하여 [표 8]에 나타내었다. 결합 친화도(K_i)는 아래 식(3)과 같이 계산하였다.

식(3)

K_i=(IC₅₀)/(1+([L]/K_d))

([L]: the concentration of the radio-ligand ([³H]-flumazenil) used, K_d: the competitor-ligand dissociation equilibrium constant for [³H]-flumazenil. The K_d value is 1.6 nM)

플로로탄닌 화합물의 결합 친화도의 상대적 강도를 확인하기 위하여 양성 대조구으로 디아제팜(DZP)를 사용하였다. 엑콜과 엑스톨로놀은 트리플로레톨-A나 디엑콜에 비해 결합 친화도가 높았고, 플로로탄닌의 기본 골격이 되는 플로로글루시놀의 경우 1000 μM에서 42.25%의 저해를 나타내어 결합 친화도가 다른 플로로탄닌에 비해 높지 않았다.

실험예 7: 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌의 수면 유도 효과 및 플루마제닐이 수면 유도에 미치는 영향

플로로글루시놀(phloroglucinol, PG) 및 플로로탄닌 중에서 엑스톨로놀(ekstolonol, ETN), 트리플로레톨 A(triphlorethol, TPE-A), 퓨코디플로레톨 G(fucodiphlorethol G, FDE-G), 엑콜(eckol) 및 6,6'-비엑콜(6,6'-bieckol)의 농도에 따른 수면 유도 효과 및 플루마제닐이 수면 유도에 미치는 영향을 확인하였다.

플로로글루시놀 또는 플로로탄닌의 농도에 따른 수면 유도 효과를 확인하기 위하여 실험예 3의 방법을 이용하되, 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌을 5, 10, 25, 50 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈(45 mg/kg, i.p.)에 의한 수면 유도 효과를 확인하였다. 음성 대조군(CON)은 0.5%, CMC-saline 10 mL/kg이고, 양성 대조군으로 디아제팜(DZP) 2 mg/kg 과 졸피뎀(zolpidem, ZPD) 10 mg.kg을 펜토바비탈 투여 45분 전에 경구 투여하여 입면시간과 수면시간을 측정하였다.

플루마제닐이 수면유도 효과에 미치는 영향에 대해서 알아보기 위하여 플로로글루시놀 또는 플로로탄닌은 50 mg/kg, DZP는 2 mg/kg, ZPD는 10 mg/kg을 펜토바비탈 투여(hypnotic dosage 45 mg/kg) 45분 전에 경구투여하였고, FLU는 8 mg/kg을 상기 시료의 경구 투여 10분전에 미리 복강 주사하여 입면시간과 수면시간을 측정하였다.

도 7a 및 도 7b는 플로로글루시놀(phloroglucinol, PG)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 7c 및 도 7d는 플로로글루시놀의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.

도 8a 및 도 8b는 엑스톨로놀(ekstolonol, ETN)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 8c 및 도 8d는 엑스톨로놀의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.

도 9a 및 도 9b는 트리플로레톨 A(triphlorethol, TPE-A)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 9c 및 도 9d는 트리플로레톨 A의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.

도 10a 및 도 10b는 퓨코디플로레톨 G(fucodiphlorethol G, FDE-G)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 10c 및 도 10d는 퓨코디플로레톨 G의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.

도 11a 및 도 11b는 엑콜(eckol)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 11c 및 도 11d는 엑콜의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.

도 12a 및 도 12b는 6,6'-비엑콜(6,6'-bieckol)의 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이고, 도 12c 및 도 12d는 6,6'-비엑콜의 플루마제닐 투여 여부에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 나타낸 그래프이다.

도 13a 및 도 13b는 상기 수면 유도 효과 확인시험에서 양성 대조군으로 사용된 디아제팜(DZP)와 졸피뎀(ZPD)의 유효 농도를 확인하기 위해 농도에 따른 입면시간 및 수면시간을 각각 확인한 그래프이다.

상기 결과에 따르면 본 발명의 플로로글루시놀 및 플로로탄닌은 5 내지 25 mg/kg의 매우 낮은 농도에서 유의적인 입면시간 감소 및 수면시간 증가 효과를 나타내었다.

또한 상기 본 발명의 플로로글루시놀 및 플로로탄닌의 수면 효과는 디아제팜과 마찬가지로 GABA_A-벤조다이아제핀 길항제인 플루마제닐에 의해 억제되었다.

실험예 8: 통계분석

50% 억제농도(IC₅₀) 값은 Prism 5.0 프로그램을 이용하여 one-site competition binding model을 적용시켜 산출하였다. 모든 실험의 결과는 평균과 표준오차(means±SEM)으로 나타내었고, 각 군과 대조구의 통계적인 비교는 Dunnet's test에 의한 One-way-analysis of variance(ANOVA)를 통해서 평가하였다. 유의 수준의 표시는 p<0.05(*), P<0.01(**), p<0.001(***) 수준에서 유의성을 보이는 결과를 별표로 표시하였다. 두 그룹간의 데이터 비교는 Unpaired Student's t-test에 의해서 분석하였고, p<0.05(#), p<0.01(##), p<0.001(###) 수준에서 두 그룹간의에 통계적으로 유의적 차이가 있음을 표시하였다. 통계분석 프로그램은 Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실험예 8의 엑콜 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실험예 8의 엑스톨로놀 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실험예 8의 플로로글루시놀 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실험예 8의 엑콜 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실험예 8의 엑스톨로놀 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강기능식품의 제조

실험예 8의 엑콜 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

실험예 8의 엑스톨로놀 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

엑스톨로놀, 트리플로레톨 A, 퓨코디플로레톨 G, 엑콜, 디엑콜 및 6,6'-비엑콜 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 플로로탄닌, 또는 플로로글루시놀을 유효성분으로 하는 GABA(감마-아미노부티르산) A형-벤조다이아제핀 수용체를 활성화시키는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료용 약학 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 플로로탄닌은 갈조류에서 분리된 플로로탄닌 화합물 또는 상기 플로로탄닌 화합물 함유 갈조류 추출물 분획인 것을 특징으로 하는 GABA(감마-아미노부티르산) A형-벤조다이아제핀 수용체를 활성화시키는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료용 약학 조성물.
삭제
엑스톨로놀, 트리플로레톨 A, 퓨코디플로레톨 G, 엑콜, 디엑콜 및 6,6'-비엑콜 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 플로로탄닌, 또는 플로로글루시놀을 유효성분으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 플로로탄닌은 갈조류에서 분리된 플로로탄닌 화합물 또는 상기 플로로탄닌 화합물 함유 갈조류 추출물 분획인 것을 특징으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.
삭제
제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 산제, 과립제 및 캅셀제 중에서 어느 하나의 형태로 제제화 된 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.