KR20120078898A

KR20120078898A - 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 ｇａｂａａ-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물 및 수면 증진용 조성물

Info

Publication number: KR20120078898A
Application number: KR1020110000197A
Authority: KR
Inventors: 조승목; 이창준; 우준성; 백남인; 박지해; 한대석; 양혜진; 용혜임; 윤민석
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2011-01-03
Filing date: 2011-01-03
Publication date: 2012-07-11
Also published as: KR101287821B1

Abstract

본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 포함하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물에 관한 것으로서, GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 사이트에 결합하여 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지고, 억제성 신경후전류 반응을 증진하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따른 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 조성물은 수면 증진, 진정, 항불안 및 항경련에 효과적이고 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않고, 안전성을 확보할 수 있으며, 수면 증진, 진정, 항불안 및 항경련을 위한 기능성 식품으로도 매우 유용하다.
[화학식 1]

Description

아이소리퀴리티제닌을 포함하는 ＧＡＢＡＡ-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물 및 수면 증진용 조성물 {Composition for invigorating GABAA-benzodiazepine receptor and composition for improving hypnotic effects comprising Isoliquiritigenin}

본 발명은 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 사이트에 결합하여 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지고, 억제성 신경후전류 반응을 증진하여 수면 증진, 진정, 항불안 및 항경련에 효과적인 조성물, 기능성 식품에 관한 것이다.

현대 사회에서 많은 사람들은 스트레스와 불안, 초조 때문에 수면장애를 겪고 있다. 통계에 의하면 성인의 약 15%가 불안증상에 의한 불면증 때문에 약물치료가 필요하다고 알려저 있으며, 불면의 원인으로는 스트레스, 긴장, 공포 등 다양하며, 치료 약물로는 벤조다이아제핀 계열의 약물과 세로토닌 효능약 등이 사용되고 있으나, 이러한 약물들은 장기간 사용하였을 때 내성 및 의존성이 형성되는 부작용이 심한 문제점이 있다.

따라서, 수면제 장기복용자 및 제한자의 경우 이를 대체할 수 있는 수단으로 천연 보조제의 필요성이 높아지고 있으며, 수면 증진 건강기능식품에 대한 수요가 증대되고 있는 실정이다.

또한, GABA_A 수용체는 멤브레인 이온 채널을 형성하는 팬타머릭 단백질로서, 진정, 수면불안, 근육긴장, 경련, 기억 상실 등의 조절과 밀접한 관련이 있고, 이를 통하여 GABA(-아미노부티르산)이 작용하게 된다. 불안 치료제, 진정제 또는 수면증진제로서 벤조다이아제핀을 포함하여 많은 약물들이 이 수용체에 결합하여 약리작용을 행하고 있고, 벤조다이아제핀 부위에 약물 또는 보조제가 결합하면 GABA에 대한 GABA_A 수용체 친화도를 변경시키고 작용하여 항불안, 진정, 항경련 및 수면 효과를 보인다. 그러나, 여전히 약물 의존성을 보이고, 근육완화 및 건망증 등의 심각한 문제를 초래하기도 한다.

따라서, GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 리간드로 작용하여 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지면서 부작용의 위험이 없고 안전한 천연물로부터 얻어진 물질을 이용한 진정-수면 효과의 보조제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

또한, 아이소리퀴리티제닌이 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 리간드로 작용하여 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체를 활성화시켜서 진정, 수면 증진 효과를 갖는 것에 대한 보고는 없었다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성화시키고 억제성 신경후전류 반응을 증진시켜서 수면증진, 진정, 항불안 또는 항경련 효과를 가지는 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 수면증진, 진정, 항불안 또는 항경련 효과를 가지는 감초 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 수면증진, 진정, 항불안 또는 항경련 효과를 가지는 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 기능성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,

하기 [화학식 1]의 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체를 활성용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 상기 [화학식 1]의 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 억제성 신경후전류 반응 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 [화학식 1]의 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 수면 증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여,

하기 [화학식 1]로 표시되는 GABA_A-벤조디아제핀 수용체 활성용 감초 추출물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 억제성 신경후전류 반응 증진용 감초 추출물을 제공한다.

본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 감초 추출물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 감초 추출물은 감초 에탄올 추출물의 클로로포름 분획에서 추출할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 감초 에탄올 추출물은 감초를 28 ~ 32%의 에탄올로 38 ~ 42℃에서 10 ~ 14 시간 동안 추출하여 수득할 수 있고, 바람직하게는 30%의 에탄올로 40℃에서 12시간 동안 추출하여 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 감초 추출물은 상기 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체의 결합 측정에서 IC₅₀값이 0.73 ~ 0.84 ㎛일 수 있다.

본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위하여,

하기 [화학식 1]의 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 감초 추출물을 포함하는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 [화학식 1]의 아이소리퀴리티제닌은 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지고, 억제성 신경후전류 반응을 증진시키므로 이를 포함하는 조성물은 수면 증진, 진정, 항불안 및 항경련에 효과적이고 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않고, 안전성을 확보할 수 있으며, 수면 증진, 진정, 항불안 및 항경련을 위한 기능성 식품으로도 매우 유용하다.

도 1은 감초 에탄올 추출물에서 분획하여 아이소리퀴리티제닌을 분리동정하는 공정을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명에 따른 아이소리퀴리티제닌의 NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 3은 아이소리퀴리티제닌이 방사성 표지된 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합억제 효과를 나타낸 그래프이다. 아이소리퀴리티제닌의 GABAA-벤조다이아제핀 수용체에 대한 친화력을 알 수 있으며, IC₅₀값이 0.737 ㎛이다.
도 4는 아이소리퀴리티제닌(Isoliquiritigenin)의 자발적 억제성신경후전류(spontaneous inhibitory post synaptic currents, sIPSCs)에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
A, B, C는 각각 기준값, 아이소리퀴리티제닌 1 ㎛ (Isoliquiritigenin), 아이소리퀴리티제닌 1 ㎛ (Isoliquiritigenin)+플루마제닐 1 ㎛ (flumazenil)인 경우의 자발적 억제성 신경후전류를 나타낸 그래프이고,
D는 상기 A, B, C 각각의 자발적 억제성 신경후전류에 대한 결과를 평균화하여 나타낸 그래프이며,
E는 기준값, 아이소리퀴리티제닌 1 ㎛ (Isoliquiritigenin), 아이소리퀴리티제닌 1 ㎛ (Isoliquiritigenin)+플루마제닐 1 ㎛ (flumazenil)인 경우의 감쇠시간을 나타낸 그래프이다. 왼쪽은 N=6, 기준값 18.3±1.9, 아이소리퀴리티제닌 1 ㎛ 23.5±2.1, 아이소리퀴리티제닌 1 ㎛ + 플루마제닐 1 ㎛ 19.1±1.7이고, 오른쪽은 N=7, 기준값 19.2±1.3, 다이아제팜 1 ㎛ 24.9±1.6이다.
도 5는 아이소리퀴리니제닌(Isoliquiritigenin)의 마우스의 입면시간 및 수면시간에 미치는 영향을 나타내는 그래프로서,
수면제 다이아제팜은 유의적으로 입면시간을 감소시키고 수면시간을 증가시키고, 아이소리퀴리티제닌은 10 mg/kg의 농도에서는 유의적인 효과가 나타나지 않았으나 25, 50mg/kg의 농도에서는 유의적인 효과를 나타난다.
*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있고, **은 대조구와 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있다(Dunnet's test).
CON : 대조구 (0.5% CMC-saline 10 ml/kg)을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여
DZP : 다이아제팜(diazepam) 2 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여
ISL : 아이소리퀴리니제닌(isoliquiritigenin) 10, 25, 50 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여
도 6은 GABA_A-벤조다이아제핀 길항제인 플루마제닐(flumazenil)이 아이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)의 수면유도 효과에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있다(Dunnet's test)
##은 플루마제닐을 처리한 그룹과 처리하지 않는 그룹 사이의 유의적인 차이가 있다는 것을 의미한다(Unpaired Student's t-test) 그리고 NS는 유의적인 차이가 없다는 것을 의미한다.
CON : 대조구 (0.5% CMC-saline 10 ml/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여)
DZP : 다이아제팜(diazepam) 2 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여
ISL : 아이소리퀴리니제닌(isoliquiritigenin) 50 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여
FLU : 플루마제닐(flumazenil) 5 mg/kg을 경구투여 15분 전 주사

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

GABA_A 수용체는 진정, 수면, 항불안 또는 항경련 효과와 관련되어 있으며, GABA_A수용체에 작용하는 약물로는 작용제(agonist)로서는 벤조다이아제핀(BZD), 다이아제팜(diazepam), 졸피뎀(zolpidem) 등이 있고, 길항제(antagonist)로는 플루마제닐(flumazenil)이 있다. 상기에서 언급하였듯이 GABA_A-수용체에 작용하는 약물의 경우 의존성 및 부작용을 초래하는 문제점이 있다.

플라보노이드(flavonoid), 사포닌(saponin) 등을 다양한 생물학적 성분을 가지고 있고, 항염증, 항산화 및 중추 신경 조절에 효능이 있는 천연물인 감초(licorice)로부터 아이소리퀴리티제닌(Isoliquiritigenin)을 추출하였고, 아이소리퀴리티제닌은 감초의 성분으로서 플라보노이드 타입의 칼콘 계열에 해당하는 화합물로서 중추 신경 조절과 관련되어 있고, 특히 GABA_A-수용체에 작용하여 진정, 수면 유도의 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다.

이에 따라 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물이고, GABA_A-벤조다이아제핀 수용체를 활성화시키고, 억제성 신경후전류 반응을 증진시키며, 수면증진, 진정, 항불안 또는 항경련의 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

또한, 상기 [화학식 1]로 표시되고, GABA_A-벤조다이아제핀 수용체를 활성화시키고, 억제성 신경후전류 반응을 증진시키며, 수면증진, 진정, 항불안 또는 항경련의 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

상기 감초 추출물은 감초 에탄올 추출물의 클로로포름 분획에서 추출하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 감초 에탄올 추출물은 감초를 28~32%의 에탄올로 38~42℃에서 10~14시간 동안 추출하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 30%의 에탄올로 40℃에서 추출하여 제조할 수 있다.

상기 감초 에탄올 추출물은 5가지 용매(클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물)를 사용하여 분획할 수 있다. 그 중 GABA_A-BZD receptor에 대한 binding activity가 가장 뛰어난 클로로포름 분획물을 다시 23개의 하위 분획물(GUC)로 나눌 수 있고, 이 중 22번 획분(GUC-22)에서 GUC-22-5 획분을 분리하여, 최종적으로 GUC-22-5-1 획분에서 단일성분인 아이소리퀴리티제닌을 분리동정할 수 있다. 하기 도 1은 감초 에탄올 추출물에서 분획하여 아이소리퀴리티제닌을 분리동정하는 흐름도를 나타낸다.

상기 아이소리퀴리티제닌은 GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 사이트에 결합하여 친화력을 가지는데 상기 아이소리퀴리티제닌과 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체의 결합 측정에서 IC₅₀의 값이 0.7 ~ 0.8 ㎛일 수 있고, 바람직하게는 0.737㎛일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 의하면, 상기 [화학식 1]로 표시되는 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물일 수 있다.

상기 수면 증진은 예를들면, 일차성 불면증, 하루주기 수면장애, 악몽장애 등을 포함하는 정신 장애 속발 수면장애 등을 개선하는 것이고, 특히 입면시간(sleep latency)이 감소하고, 수면시간(sleep duration)이 증가하는 효과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 단독으로 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합의 형태로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 저제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 표시되는 아이소리퀴리티제닌을 포함하는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 기능성 식품일 수 있다.

본 발명에 따른 아이소리퀴리티제닌을 기능성 식품의 유효성분 첨가물로 사용하는 경우 본 발명에 따른 아이소리퀴리티제닌을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명에 따른 아이소리퀴리티제닌은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 추출물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 식품 중 음료 식품은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 기능성 식품 100당 약 0.01 ~ 0.04g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03g일 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 수면증진용, 진정, 항불안 또는 항경련 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 수면증진용, 진정, 항불안 또는 항경련 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 조성물 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

실시예 1. 실험 재료 및 실험 방법

(1) 아이소리퀴리티제닌의 추출 분리

최적조건에서 제조된 감초 에탄올 추출물(300g)로부터 계통분획법에 의해 순차적으로 클로로포름, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물을 제조하였다. 용매분획을 통해 얻어진 분획물들은 GABA_A-BZD receptor binding assay를 이용한 활성추적분획법(activity-guided fractionation)을 통해 분리하였다. 활성분획으로부터 silica gel, RP-silica gel 등의 각종 matrix를 적절히 이용하였고, 다양한 용출용매로 column chromatography를 실시하였다. TLC pattern 및 10% H₂SO₄에 의한 발색양상에 따라 소분획 및 활성물질로 나누고, 각 분획물 및 활성물질의 receptor binding activity를 확인하는 과정을 반복하였다.

최종적으로 분리된 유효 단일물질은 NMR spectrum 분석을 통해 구조가 분석되었다. ¹H-NMR spectrum상의 chemical shift로부터 수소관련 화학적 환경해석과 coupling constant로부터 인접 수소와의 입체배열을 해석하였으며 integration으로부터 수소 signal의 개수를 확인하였다. H₂SO₄ ¹³C-NMR spectrum으로부터 화합물을 구성하는 탄소수 및 탄소의 주위 환경을 해석하였고, DEPT NMR data로부터 탄소의 다중도를 확인하였다. H₂SO₄ ¹H-¹H COSY spectrum으로부터 인접 수소의 환경을 해석하였고, 부분구조와 ¹H-¹³C COSY spectrum으로부터 수소와 탄소의 직접적인 연결을 확인하였으며, HMBC spectrum으로부터 부분 구조를 포함한 전체적인 화학구조를 확인하였다. H₂SO₄ NOE spectrum으로부터 공간적 입체적 상대구조를 해석하였고, NOESY spectrum으로부터 더 확실한 상대적 입체구조를 확인하였고, 하기 도 2는 아이소리퀴리티제닌의 NMR spectrum을 나타낸다.

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD, δH) 7.98 (1H, d, J=8.8 Hz, H-6'), 7.76 (1H, d, J=15.2 Hz, H-α), 7.63 (1H, d, J=15.2 Hz, H-β, 7.61 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2,6), 6.83 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3,5), 6.42 (1H, dd, J=8.8, 2.4 Hz, H-5'), 6.27 (1H, d, J=2.4 Hz, H-3'); ¹³C-NMR (100 MHz, CD3OD, δ_H) 193.26 (C=O), 167.36 (C-4'), 166.34 (C-2'), 161.42 (C-4), 145.48 (C-β, 133.24 (C-6'), 131.71 (C-2,6), 127.71 (C-1), 118.22 (C-α), 116.81 (C-3,5), 114.55 (C-1'), 109.09 (C-5'), 103.72 (C-3').

(2) 약물 및 화학약품

펜토바비탈(Pentobarbital)은 한림 제약회사로부터 구입하였다. 디아제팜(DZP)은 명인 제약 회사로부터 구입하였고 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체의 길항제로서 진정-수면제의 비교예 실험에 사용하였다.

(3) 실험 동물

무게 18~22g의 수컷 ICR 생쥐(Koatech Animal사)를 온도 24℃, 습도 55%, 형광등 명암 12시간 사이클(조명 오전 8시)의 조건하에서 시료 및 음수는 자유롭게 섭취하게 하고, 새로운 환경에 적응시키기 위하여 실험 전 1주일간 사육하였다. 또한, GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 평가를 위한 멤브레인 준비를 위하여 무게 200~250g의 SD 쥐를 사용하였다. 동물 실험과 관련된 모든 절차는 KFRI-IACUC(Korea Food Research Institutional Animal Care and Use Committee)의 실험동물 사용 지침에 의거 수행하였다.

(4) 통계 분석

50% 억제농도(IC₅₀) 값은 Prism 5.0 프로그램을 이용하여 one-site competition binding model을 적용시켜 산출하였다. 모든 실험의 결과는 평균과 표준오차(means±SEM)으로 나타내었고, 각 군과 대조구의 통계적인 비교는 Dunnet's test에 의한 One-way-analysis od variance(ANOVA)를 통해서 평가하였다. 유의 수준의 표시는 p<0.05(*), P<0.01(**), p<0.001(***) 수준에서 유의성을 보이는 결과를 별표로 표시하였다. 두 그룹간의 데이터 비교는 Unpaired Student's t-test에 의해서 분석하였고, p<0.05(#), p<0.01(##), p<0.001(###) 수준에서 두 그룹간의에 통계적으로 유의적 차이가 있음을 표시하였다. 통계분석 프로그램은 Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

실험예 1. 아이소리퀴리티제닌의 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 대한 친화력

SD rat의 대뇌피질을 적출한 후 즉시 30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, keep at 4) 20 mL에 넣어 균질화시키고 10초 동안 초음파를 처리하였다. 이 후 27,000×g 및 4℃의 조건에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 다시 buffer 20 mL을 취하여 원심분리하였으며, 이 과정을 3번 반복하였다. 뇌 조직 안의 GABA를 제거하기 위하여 37℃의 water bath에서 30분간 incubation 시키고 원심분리한 후 pellet을 수집하여 -80℃에서 동결보관하여 사용하였다. 동결된 membrane을 해동시킨 후 27,000×g 및 4℃의 조건에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 50 mM Tris-citrate buffer (binding buffer, pH 7.1, keep at 4) 20 mL을 넣고 원심분리하였다. 이 과정을 3번 반복한 후 membrane을 binding buffer에 500 mL buffer/original tissue g의 농도로 현탁시켜 결합력 평가 시험에 사용하였다. 96-well plate에 membrane suspension 180 uL, 추출물 10 uL 및 [³H] flumazenil (1 nM, final concentration) (Ro 15-1788; PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) 10 ㎕을 넣고 ice-bath에서 40분간 incubation 하였다. 이 후 glass fiber filter (GF/C, Whatman)을 이용하여 수집하였다. 샘플의 radioactivity는 Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzers (Perkin-Elmer, Shelton, CT, USA)를 통해 측정되었다. 비특이적 결합 (nonspecific binding, NSB)은 clonazepam (1 ㎛, final concentration)을 이용하여 그 값을 결정하였고, Binding inhibition 값 (%)은 아래와 식(1)과 같이 계산하였다.

식(1)

Binding inhibition(%)=100-((Extract DPM-NSB DPM)/(TB DPM-NSB DPM))×100

(DPM: disintegrations per minute, TB: total binding, NSB: nonspecific binding)

도 3은 아이소리퀴리티제닌의 방사성 표지된 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합억제 효과를 나타낸 그래프이다.

이는 수면효과를 나타내는 성분들을 탐색하기 위하여 일반적으로 사용되는 방법으로 [³H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합억제 효과가 높을수록 그 물질의 결합 활성이 높은 것을 의미한다.

하기 도 3은 아이소리퀴리티제닌이 방사성 표지된 GABA_A-벤조다이아제핀 리간드 [3H] 플루마제닐(flumazenil)의 결합억제 효과를 나타낸 것으로서, 이를 통해 아이소리퀴리티제닌의 GABAA-벤조다이아제핀 수용체에 대한 친화력을 알 수 있으며, IC₅₀ 값이 0.737 ㎛인 것을 확인할 수 있다.

실험예 2. 아이소리퀴리티제닌의 자발적 억제성신경후전류에 대한 영향

수면증진의 효과를 전기생리학적인 방법으로 측정하기위해, 생쥐의 해마부위 뇌 절편에서의 패치클램프 실험을 통해 자발적 억제성신경후전류 (spontaneous IPSC) 반응을 측정하였다.

전기생리학적 방법으로 쥐의 뇌절편 해마부위에서 자발적 억제성신경후전류의 측정을 위해, 신경세포를 글라스피펫으로 패치한 뒤, -70mV로 전압을 유지하였다. 자발적 억제성신경후전류만을 측정하기 위해, 흥분성신경후수용체 억제제가 있는 가운데, 아이소리퀴리티제닌과 디아제팜을 처리하며, 자발적 억제성신경후전류를 측정하였다.

하기 도 4는 아이소리퀴리티제닌(Isoliquiritigenin)의 자발적 억제성신경후전류(spontaneous inhibitory post synaptic currents, sIPSCs)에 대한 영향을 나타낸 것으로서, 대조군과 비교했을 때, 1㎛ 농도의 아이소리퀴리티제닌 (Isoliquiritigenin)은 자발적 억제성신경후전류의 감쇠시간 (decay t)을 35.8% 증가시켰음을 알 수 있다.

이는 억제성신경후전류의 반응시간이 길어진 것을 의미하는 것이고, 수면 증진제로 널리 쓰이고 있는 동일 농도(1㎛)의 다이아제팜 (Diazepam) 약물의 35.7% 효과와 비슷함을 확인할 수 있다.

아이소리퀴리티제닌의 억제성신경후전류 반응의 감쇠 시간을 증가시킨 효과는 다이아제팜의 작용부위로 알려진 벤조다이아제핀 (Benzodiazepine) 결합부위의 길항제 플루마제닐 (Flumazenil)에 의해서 억제되는데, 본 발명에 따른 아이소리퀴리티제닌은 수면증진제인 다이아제팜과 같이 가바수용체 (GABA receptor)의 벤조다이아제핀 결합부위에서 작용하여, 동일 농도에서 비슷한 정도의 억제성신경후전류 반응의 증진 효과를 보임을 알 수 있다.

실험예 3. 아이소리퀴리티제닌의 마우스의 입면시간 및 수면시간에 미치는 영향

각각의 샘플과 아이소리퀴리니제닌을 농도별(10, 25, 50 mg/kg)로 마우스에 경구투여하고 45분 후 hyopnotic(45 mg/kg) 농도의 펜토바비탈(pentobarbital)을 쥐에게 복강주사로 투여한 이후, 입면시간(sleep latency)과 수면기간(sleep duration)을 조사하였다.

*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있고, **은 대조구와 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있다(Dunnet's test).

CON : 대조구 (0.5% CMC-saline 10 ml/kg)을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여

DZP : 다이아제팜(diazepam) 2 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여

ISL : 아이소리퀴리니제닌(isoliquiritigenin) 10, 25, 50 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여

하기 도 5는 아이소리퀴리니제닌(Isoliquiritigenin)의 마우스의 입면시간 및 수면시간에 미치는 영향을 나타내는 것으로서, 수면제 다이아제팜은 유의적으로 입면시간을 감소시키고 수면시간을 증가시켰다. 아이소리퀴리티제닌은 10 mg/kg의 농도에서는 유의적인 효과가 나타나지 않았으나 25, 50mg/kg의 농도에서는 유의적인 효과를 나타내 농도의존적인 수면유도 효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 4. GABA_A-벤조다이아제핀 길항제인 플루마제닐(flumazenil)이 아이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)의 수면유도 효과에 미치는 영향

수면 효과를 나타내는 농도의 다이아제팜(2 mg/kg)과 아이소리퀴리니제닌(50 mg/kg)을 마우스에 경구투여하였다. GABAA-벤조다이아제핀 길항제인 플루마제닐을 경구투여 15분 전에 미리 주사하였다. 경구투여 45분 후 hyopnotic(45 mg/kg) 농도의 펜토바비탈(pentobarbital)을 쥐에게 복강주사로 투여하였다. 이후 입면시간(sleep latency)와 수면기간(sleep duration)을 조사하였다.

*은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있다(Dunnet's test)

##은 플루마제닐을 처리한 그룹과 처리하지 않는 그룹 사이의 유의적인 차이가 있다는 것을 의미한다(Unpaired Student's t-test) 그리고 NS는 유의적인 차이가 없다는 것을 의미한다.

CON : 대조구 (0.5% CMC-saline 10 ml/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여)

ISL : 아이소리퀴리니제닌(isoliquiritigenin) 50 mg/kg을 경구투여 후 펜토바비탈(pentobarbital) 투여

FLU : 플루마제닐(flumazenil) 5 mg/kg을 경구투여 15분 전 주사

하기 도 6은 GABA_A-벤조다이아제핀 길항제인 플루마제닐(flumazenil)이 아이소리퀴리티제닌(isoliquiritigenin)의 수면유도 효과에 미치는 영향을 나타낸 것으로서, 대표적인 수면제 중의 하나인 다이아제팜은 잘 알려진 GABA_A-벤조다이아제핀 효능제이다. 다이아제팜의 수면효과는 GABA_A-벤조다이아제핀 길항제인 플루마제닐에 의해 억제된다. 본 발명의 도면에서도 잘 알려진대로 플루마제닐에 의한 다이아제팜의 효과가 감소되었다. 그리고 아이소리퀴리티제닌도 수면제 다이아제팜과 마찬가지로 GABA_A-벤조다이아제핀 길항제인 플루마제닐에 의해 그 효과가 억제되었다.

상기 결과에서, 아이소리퀴리티제닌은 기존의 수면제인 다이아제팜과 마찬가지로 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지며 효능제의 역할을 함을 확인할 수 있다. 그리고, 마우스를 이용한 동물실험에서도 수면유도 효과를 나타내었으며, 다이아제팜과 마찬가지로 GABA_A-벤조다이아제핀 길항제에 의해 그 효과가 감소함을 알 수 있다.

Claims

하기 [화학식 1]의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물.
[화학식 1]
하기 [화학식 1]의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 억제성 신경후전류 반응 증진용 조성물.
[화학식 1]
하기 [화학식 1]의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 조성물.
[화학식 1]
하기 [화학식 1]로 표시되는 GABA_A-벤조디아제핀 수용체 활성용 감초 추출물.
[화학식 1]
하기 [화학식 1]로 표시되는 억제성 신경후전류 반응 증진용 감초 추출물.
[화학식 1]
하기 [화학식 1]로 표시되는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 감초 추출물.
[화학식 1]
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 감초 추출물은 감초 에탄올 추출물의 클로로포름 분획에서 추출된 것을 특징으로 하는 감초 추출물.
제 7 항에 있어서,
상기 감초 에탄올 추출물은 감초를 28 ~ 32%의 에탄올로 38 ~ 42 ℃에서 10 ~ 14 시간 동안 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 감초 추출물.
제 7 항에 있어서,
상기 감초 추출물은 상기 GABA_A-벤조디아제핀 수용체의 결합 측정에서 IC₅₀이 0.73 ~ 0.74 ㎛인 것을 특징으로 하는 감초 추출물.
하기 [화학식 1]의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 기능성 식품.
[화학식 1]
감초 추출물을 포함하는 수면증진용, 진정용, 항불안용 또는 항경련용 기능성 식품.
제 11 항에 있어서,
상기 감초 추출물은 감초 에탄올 추출물의 클로로포름 분획에서 추출된 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
제 12 항에 있어서,
상기 감초 에탄올 추출물은 감초를 28 ~ 32%의 에탄올로 38 ~ 42 ℃에서 10 ~ 14 시간 동안 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 기능성 식품.
제 11 항에 있어서,
상기 감초 추출물은 상기 GABA_A-벤조디아제핀 수용체의 결합 측정에서 IC₅₀이 0.73 ~ 0.74 ㎛인 것을 특징으로 하는 기능성 식품.