KR100738230B1

KR100738230B1 - 메톡시아크릴레이트계 화합물을 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100738230B1
Application number: KR1020030043425A
Authority: KR
Inventors: 김정근; 김세원; 오귀옥; 고선일; 김종여; 이병의; 김호순; 김범태; 이연수; 민용기; 박노균
Original assignee: 주식회사 오스코텍; 한국화학연구원
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2007-07-12
Also published as: KR20050002109A

Abstract

본 발명은 활성 성분으로서 메톡시아크릴레이트계 화합물을 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 세포독성을 나타내지 않으면서 파골세포의 생성 및 골 흡수를 강력하게 억제하여 골다공증의 예방 또는 치료에 보다 간편하게 효율적으로 사용될 수 있다.

Description

메톡시아크릴레이트계 화합물을 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OSTEOPOROSIS COMPRISING METHOXYACRYLATE-BASED COMPOUND}

도 1은 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물(KO-200993)을 여러 농도로 파골세포의 전구세포에 처리하였을 때의 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 양성 다핵세포의 수의 변화를 나타낸 그래프이고,

도 2는 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물을 여러 농도로 파골세포의 전구세포에 처리하였을 때의 흡수와(resorption pit)의 면적(골 흡수율(%))을 나타낸 그래프이고,

도 3은 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물을 여러 농도로 파골세포 전구세포에 처리하였을 때의 세포증식 억제율(%)을 나타낸 그래프이고,

도 4는 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물을 여러 농도로 조골세포주 MG63 세포에 처리하였을 때의 세포증식 억제율(%)을 나타낸 그래프이고,

도 5는 2산(産)한 백서를 난소절제한 후, 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물을 4주간 피하로 1 ㎎/일 투여하였을 때의 골밀도의 변화를 나타낸 그래프이고,

도 6은 4산(産)한 백서를 난소절제한 후, 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물 을 12주간 피하로 1 ㎎/일 투여하였을 때의 골밀도의 변화를 나타낸 그래프이고,

도 7은 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물의 정맥내 투여 후 시간에 따른 혈청중 농도변화를 나타낸 그래프이고,

도 8은 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물의 투여용량에 따른 마우스의 사망률을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 활성 성분으로서 메톡시아크릴레이트계 화합물을 포함하는, 보다 간편하고 효율적으로 골다공증을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

골다공증이라 함은 골 조직의 물리적 강도를 결정하는 칼슘이 여러 가지 이유 (유전적 요인, 영양섭취, 호르몬의 변화, 운동, 생활습관)로 감소되어 골수강이 넓어지는 상태로 약한 충격에도 골절이 일어나는 결과를 초래하여 삶의 질을 현저히 저하시키는 증상이다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골밀도가 지속적으로 감소되며, 폐경기에 이르면 호르몬인 에스트로젠이 급격히 감소하여 인터루킨-7에 의한 것처럼 B-임파구가 다량 생성되어 골수에 B 세포 전구체가 축적되고 이로 인해 인터루킨-6의 양이 증가하여 파골세포의 활성을 증가시켜 골밀도가 감소하게 된다.

현재 사용되는 골다공증 치료제로는 비스포스포네이트 제제, 호르몬 제제, 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제, 칼슘 제제 등이 있다.

골다공증 치료제 시장에서 가장 큰 비중을 차지하고 있는 비스포스포네이트 제제로는 에티드로네이트, 파미드로네이트, 알렌드로네이트(머크사), 리세드로네이트(호프만 라록사), 졸레드로네이트(노바티스사, EP 특허 제275821호), 이반드로네이트(호프만 라록사, 미국 특허 제4942157호), 미노드로네이트(YM-529, EP 특허 제354806호) 등이 시판 중이거나 임상시험 중에 있으나, 이 비스포스포네이트계 골다공증 치료제는 식전 공복에 복용해야 하고 복용시 식도염 등의 부작용이 발생하는 단점을 갖는다.

호르몬 제제로서는 라록시펜(엘리 릴리(Eli Lilly)사), 드롤록시펜(화이자사, EP 특허 제54168호), 라소폭시펜(화이자사, WO 제97-16434호), FC-1271(호모스 메디칼 오리온(Hormos Medical Orion)사, WO 제96-7402호), TSE-424(리간드 아메리칸 홈 프러덕츠(Ligand American Home products)사, 미국 특허 제5948775호) 등이 시판 중이거나 임상시험 중에 있으나, 이 호르몬 제제는 질분비, 유방암 및 자궁암 유발 위험성을 증가시키는 부작용을 갖는다.

또한, 비타민 D 제제는 고가이며 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 고가이며 투여방법이 어렵고, 칼슘 제제는 부작용은 적지만 골다공증의 치료보다는 예방에 국한된다는 단점을 갖는다.

이외에도, 파골세포가 뼈에 부착하는 것을 방지하기 위한, 인테그린(integrin) 수용체 길항제가 WO 제98-18401호(머크사) 및 WO 제99-6049호(스미스클라인 비첨(SmithKline Beecham)사)에; 골흡수를 저해하기 위한, 카텝신(cathepsin) 저해제가 WO 제98-5336호, WO 제2001-34158호(스미스클라인 비첨사), WO 제2001-47930호(아벤티스(Aventis)사) 및 WO 제99-24460호(노바티스(Novatis)사)에 개시되어 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 골다공증 치료제가 가지는 문제점을 나타내지 않으면서 보다 간편하게 골다공증 증세를 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는,

활성 성분으로서 하기 화학식 1의 메톡시아크릴레이트계 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

상기 식에서,

X는 CH 또는 N이고,

Y는 O 또는 S이고,

Z는 O 또는 NH이고,

A는

,

,

또는

이고(이때, R³은 수소; C_1-4 알킬; 또는 하나 이상의 할로겐 치환체를 갖는 C_1-4 알킬이다),

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소; C_1-4 알킬; 하나 이상의 할로겐 치환체를 갖는 C_1-4 알킬; 페닐; 할로겐, C_1-4 알킬, C_1-4 할로알킬, C_1-4 알콕시, 페녹시 및 메틸렌디옥시로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 갖는 페닐; 또는 나프틸이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 사용되는 상기 화학식 1의 메톡시아크릴레이트계 화합물은 농업용 살균제로서 알려져 있는 화합물로서 국내 특허 제229440호, 제240198호, 제31195호, 제31196호 및 제379761호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 파골세포의 생성 및 골 흡수를 강력하게 억제할 뿐만 아니라 파골세포 전구세포와 조골세포에 세포독성을 나타내지 않고 간을 비롯한 장기의 기능에 어떠한 부작용도 나타내지 않으므로, 골다공증의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 활성을 나타내는 화합물에 있어서, 바람직하게는, Y는 O이 고, A는

또는

이고, R¹ 및 R²는 둘 중 하나가 수소; CH₃; 또는 CF₃이고, 다른 하나가 페닐; F, Cl, 메틸, 에틸, 부틸, CF₃, 메톡시, 에톡시, 페녹시 및 디옥시메틸렌으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 갖는 페닐; 또는 나프틸이다.

본 발명에 따른 바람직한 화합물의 보다 구체적인 예로서, 하기 실시예에서 제조되는, 실시예 I-5(KT-15019), I-6(KT-15017), I-13(KT-16048), I-17(KT-16047), I-32(KT-15144), I-37(KT-16045), II-5(KT-16037), II-7(KT-16118), II-8(KT-16135), II-9(KT-16039), II-12(KT-16137), II-14(KT-16036), II-18(KT-16125), II-19(KT-16044), II-21(KT-16103), II-22(KT-16138), II-23(KT-16038), II-25(KT-16102), II-26(KT-16147), II-27(KT-16035), II-30(KT-16144), II-40(KT-16041), II-42(KT-16097), III-1(KT-17073), III-2(KT-17032), III-6(KT-17042), III-7(KT-17128), III-8(KT-17129), III-9(KT-17075), III-10(KT-17130), III-12(KT-17041), III-13(KT-17040), III-14(KT-17076), III-32(KT-19120), III-42(KT-17023), III-43(KT-17111), III-44(KT-17025), III-45(KT-17030), III-46(KT-17112), III-47(KT-17113), III-48(KT-17024), III-50(KT-17115), III-52(KT-17029), III-53(KT-17028), III-55(KT-17116), III-56(KT-17026), III-85(KT-17063), 1III-89(KT-7066), III-91(KT-17057), IV-1(KT-17117), IV-2(KT-17077), IV-3(KT-17034), IV-4(KT-17121), IV-5(KT-17036), IV-6(KT-17118), IV- 7(KT-17119), IV-9(KT-17035), IV-10(KT-17122), IV-11(KT-17037), IV-14(KT-17038), IV-16(KT-17039), IV-17(KT-17126), IV-39(KT-19068), IV-49(KT-17015), IV-50(KT-17017), IV-51(KT-17050), IV-52(KT-17019), IV-54(KT-17047). IV-55(KT-17049), IV-57(KT-17048), IV-58(KT-17043), IV-59(KT-17109), IV-60(KT-17108), IV-61(KT-17016), IV-62(KT-17046), IV-63(KT-17045), IV-64(KT-17110), IV-92(KT-19081), IV-94(KT-200993), IV-101(KT-16091), IV-105(KT-17053), IV-109(KT-17058), IV-110 (KT-17052), IV-115(KT-17055) 및 IV-116(KT-17054)의 화합물을 들 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조할 수 있다. 이 약학 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활탁제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 및 현탁제, 유제 또는 시럽제와 같은 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시는 하루에 체중 1 ㎏당 0.5 내지 5 mg, 바람직하게는 1 내지 4 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여시는 하루에 체중 1 ㎏당 5 내지 50 mg, 바람직하게는 10 내지 40 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 화학식 1의 화합물을 포함하는, 골다공증을 예방 또는 치료하기 위한 기능성 식품 또는 음료 조성물을 제공한다. 상기 효과를 나타내기 위하여 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종 식품류, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제 및 그밖의 건강보조식품류 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화학식 1의 화합물을 식품 제조시 원료 물질에 첨가하거나 조리된 식품에 적절히 혼합하여 상기한 기능성 식품 또는 음료를 제조할 수 있으며, 이 경우 최종적으로 제조된 식품 또는 음료 중에 화학식 1의 화합물의 함량은 0.1 내지 80 중량% 범위이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 한정하지는 않는다.

<실시예 I 내지 VI> 화학식 1a 내지 1f의 화합물의 합성

하기 화학식 1a, 1b, 1c, 1d, 1e 및 1f의 구조를 갖는 화합물 각각을 국내 특허 제229440호, 제240198호, 제31195호, 제31196호, 제379761호 및 제379761호에 기재된 방법에 따라 실시예 I(I-1에서 I-44), 실시예 II(II-1에서 II-45), 실시예 III(III-1에서 III-102), 실시예 IV(IV-1에서 IV-122), 실시예 V(V-1에서 V-55) 및 실시예 VI(VI-1에서 VI-61)로서 제조하였다 . 그의 구체적인 화합물 예는 하기 실험예 1의 결과값(파골세포 생성 억제율)과 함께 하기 표 1 내지 6에 각각 나타내었다.

상기 식에서, X, Y, Z, R¹, R² 및 R³은 상기에서 정의한 바와 같다.

<실험예 1> 파골세포의 생성 억제작용

본 발명의 화합물들이 파골세포의 성장 및 활성에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여, 칼슘-포스페이트로 피막된 플레이트 (OAAS, OCT Inc.)에 파골세포 전구세포를 배양하여 파골세포의 표지효소인 TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) 및 흡수와(resorption pit)의 활성을 관찰하였다.

<1-1> 파골세포 전구세포의 순수 분리 및 성숙한 파골세포로의 분화 유도

마우스 골수세포를 분리하기 위해 7-9주된 웅성 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후, 대퇴골과 경골을 무균적으로 적출하고 연조직을 제거하고 장골의 양끝을 절단한 다음, 26G 주사침을 이용하여 한쪽 끝의 골수강에 0.1% 콜라게네이즈(collagenase) (Gibco), 0.05% 트립신 및 0.5 mM EDTA (Gibco)가 포함된 효소용액 1 ㎖을 주사하여 골수를 꺼냈다. 이를 30분간 교반한 후 골수세포를 모아 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 α-최소필수배지(α-minimum essential medium; α-MEM)에서 24시간동안 전배양한 후 미부착 세포들을 회수하였다. 파골세포의 전구세포가 되는 미부착세포를 웰(well)당 2 × 10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 8일간 배양하였다. 배양하는 동안 20 ng/㎖ 마크로파아지-콜로니 자극 인자(macrophage-colony stimulating factor; M-CSF, Peprotech, USA)와 30 ng/ml RANKL (Peprotech, USA)이 포함된 α-MEM에 각 화합물을 0.5 내지 2μM 농도로 첨가하였다. 대조군으로서 실시예의 화합물을 첨가하지 않고 배양을 수행하였다. 배양이 끝난 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여 세포를 고정하여 TRAP 염색을 시행하였다(하기 <1-2>). 또한, 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 세포를 떼어낸 후 흡수된 부위를 관찰하였다(하기 <1-3>).

<1-2> TRAP(+)인 다핵세포 형성 측정

세포배양 후, 부착세포를 PBS로 세척한 다음 시트레이트-아세테이트-포름알데히드로 5분간 고정시키고, 나프톨 AS-BI 포스페이트, 패스트 가닛(fast Garnet) GBC 용액과 7 mM 타르트레이트 완충액(tartrate buffer, pH 5)를 함유하는 37℃ 아세테이트 완충액(pH 5.0)에서 1시간 동안 배양하여 TRAP 염색을 하였다. 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP(+) 다핵세포들을 파골세포로 간주하였다.

파골세포는 골수내의 단핵구/대식세포 계통의 세포로부터 유래하고, 이 단핵 전구세포는 혈액내로 순환되며 골내막층에서 전구세포들이 증식되어 다핵세포를 형성하기 위해 융합된다고 알려져 있으며 (Scheven et al., Nature 321:79-81, 1986), 파골세포는 특징적으로 타르트레이트에 대해 저항성을 나타내는 산 포스파타아제(acid phosphatase)인 TRAP을 가지며 이는 다른 골조직 세포와 구별할 수 있는 파골세포의 세포화학적 표지효소로 이용된다 (Minkin, C., Calcif. Tissue Int. 34:285-290, 1982). 본 발명에서는 파골세포의 분화를 유도하기 위하여 파골세포의 전구세포가 있다고 알려진 골수를 이용하였으며, TRAP에 양성이며 다핵인 세포를 파골세포로 확인하였고, 파골세포 전구세포를 배양하면서 실시예의 화합물을 처리하여 8일 동안 배양한 후 처리하지 않은 대조군에 비하여 TRAP 양성 다핵세포의 수가 감소하는 것을 확인하고자 하였다.

그 결과, 실시예 IV-94의 화합물을 첨가하였을 때 0.1 μM 농도에서 대조군에 비해 TRAP(+) 다핵세포의 수가 122개에서 72개로 현저히 감소하고, 0.5 μM 이상의 농도에서 TRAP(+) 다핵세포의 형성이 완전히 억제되는 것으로 나타났다 (도 1). 상기 결과로부터, 본 발명의 메톡시아크릴레이트계 화합물이 파골세포의 생성을 억제함을 확인하였다.

하기 표 1 내지 6에 상기 실시예 I 내지 VI에서 제조된 메톡시아크릴레이트계 화합물의 파골세포 생성 억제율(%)을 나타내었다. 단, 하기 표 1 내지 6에서 실시예 III-31, III-34, III-35, III-39, III-39, IV-35, IV-92 및 IV-94의 화합물의 파골세포 생성 억제율(%)은 0.1, 1 및 10μM의 농도로 처리한 것이다.

<1-3> 파골세포의 흡수와 관찰

분화된 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 칼슘-포스페이트로 피막된 플레이트(OAAS^TM, OCT, Korea)에서 세포배양 후 배양액을 제거하였다. 세포배양 후 붙어있는 세포를 제거하기 위하여 배양 플레이트를 증류수로 세척한 후 5% 하이포아염소산나트륨 용액을 넣어 5분간 방치하고, 다시 증류수로 깨끗이 세척하여 말린 다음 흡수된 부위를 이미지 프로플러스(Image pro plus)를 이용하여 관찰하였다.

골조직내에서 골흡수를 주로 담당하는 파골세포의 활성을 검사하기 위하여 골조직의 무기질 부분과 유사하게 제작한 칼슘과 포스페이트가 피막된 플레이트를 사용하여 (Choi et al., Eur. J. Immunol. 31:2179-2188, 2001) 파골세포의 전구세포를 배양하면서 실시예 IV-94의 화합물을 처리하여 대조군에 비하여 흡수 면적이 감소됨을 관찰하고자 하였다.

그 결과, 실시예 IV-94의 화합물을 첨가하였을 때 대조군에 비하여 흡수와(resorption pit)의 면적이 감소되는 것으로 나타났으며, 0.1 uM 이상의 농도에서는 흡수와를 완전히 억제하는 것으로 나타났다 (도 2). 따라서, 본 발명의 메톡시아크릴레이트계 화합물이 파골세포의 활성을 억제함을 확인하였다.

<1-4> 파골세포 전구세포에 대한 세포 독성 측정

실시예 IV-94의 화합물의 파골세포 전구세포에 대한 독성을 알아보기 위하여, 실시예 IV-94의 화합물 처리 후 48시간 배양한 후 배양이 끝나기 3시간 전에 배양액에 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (50 ㎍/웰) 용액을 첨가하였다. 이어, 상층액을 제거하고 0.04 N HCl 이소프로판올로 30분 동안 염색제를 녹인 후 550 ㎚에서 비색 정량하였다. 측정된 흡광도는 대조군에 대한 백분율로 표시하였다. 이 방법은 세포의 미토콘드리아 디하이드로게네이즈(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 MTT가 환원되어 파란색 포르마잔(blue formazan) 결정이 생성되는 것을 이용하는 방법으로, 독성이 있으면 세포의 성장이 억제되어 포르마잔 생성이 저하되므로, 분광기로 흡광도를 측정하여 간접적으로 살아있는 세포수를 측정하는 방법이다.

그 결과, 실시예 IV-94의 화합물을 첨가하였을 때 대조군에 비하여 흡광도가 감소되지 않는 것으로 나타났다 (도 3). 따라서, 본 발명의 메톡시아크릴레이트계 화합물은 파골세포로 분화될 미분화 골수세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

<실험예 2>

<2-1> 조골세포에 대한 세포 독성 확인

실시예 IV-94의 화합물이 조골세포에 독성을 나타내는지 확인하기 위하여, 사람 골육종에서 유래된 세포주인 MG-63 (ATCC No. CRL-1427) 세포를 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, USA)에서 구입하여, 둘벡코의 개량된 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 10% FBS을 첨가한 배지에 배양하여 사용하였다.

세포독성의 측정은 파골세포 전구세포에 대한 독성을 검사하는 방법과 동일한 방법을 사용하였다. 그 결과, 실시예 IV-94의 화합물을 첨가하였을 때 대조군에 비하여 흡광도가 감소되지 않는 것으로 나타났다 (도 4). 따라서, 본 발명의 메톡시아크릴레이트계 화합물은 조골세포에 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

<실험예 3> 임상적 효능시험

난소절제술 (Ovariectomy)을 시행하여 골다공증이 유도된 자성 백서를 실험모델로 이용하여 본 발명의 실시예 IV-94의 화합물이 골다공증의 치료에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 난소절제 백서에 실시예 IV-94의 화합물을 투여한 후 경골의 골밀도를 측정하였다.

난소절제시, 케이지 안에 사육중인 백서의 복강에 케타민(Ketamin) HCl (케타라(Ketara) 10 ㎎/㎏)과 2% 자일라진(xylazine) HCl (루푼(Roupun) 0.15 ㎖/㎏) 혼합액을 투여하여 전신 마취시킨 후, 통상의 방법에 따라 제모 및 시술전 무균처리 (10% povidone-iodine scrub followed by a 70% alcohol wipe)를 수행하였다. 백서 복측 중앙에 1 ㎝ 가량의 절개를 시행한 뒤 횡격막이나 간 등 주요 장기에 손상이 가해지지 않도록 주의를 하며 자궁을 따라 난소를 확인하였다. 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 난소 절제를 양측으로 시행하였다. 난소 절제 후 각 장기를 복강 내로 재위치시킨 후 봉합용 실로 층별 봉합을 시행하였다. 수술 후 감염방지를 위해 항생제 세파졸린 (cefazolin 50 ㎎/㎎)을 주사하였다.

골밀도 측정시, voxel 크기 0.1 ㎜ × 0.1㎜, 골밀도 산출을 위한 역치(threshold)값은 280 ㎎/㎠ (해면골 측정), 500 ㎎/㎠ (치밀골 측정)으로 설정하였다. 스카우트 스캔(Scout scan) (10 ㎜/sec)을 통하여 경골(Proximal tibia)의 측정위치를 정하고, CT 스캔 (7 ㎜/sec)을 통해 정해진 위치에서 3개의 슬라이스(slice)에서 골밀도 값을 측정하였으며, 동일 위치에서 2회 이상 촬영하였다. 골밀도 측정기로서 독일에서 제조한 XCT 540 리서치(Research) SA를 사용하였다.

<3-1> 2산(産)한 백서의 골밀도 측정

250 g 내외의 2산(産)모의 백서를 골라 난소절제 전 골밀도 측정을 시행하였고, 난소 절제를 한 후 3일 후부터 4주간 1일 1회로 마리당 1 ㎎의 실시예 IV-94의 화합물을 피하 주사하였다. 1주 간격으로 4주간 골밀도를 측정하였다.

그 결과, 난소절제를 시행한 대조군에서는 시간이 경과함에 따라 골밀도가 평균 13% 정도 감소하였으나, 실시예 IV-94의 화합물을 피하 주사한 실험군에서는 난소절제 전보다 골밀도가 증가하는 경향을 보이다가 감소하여, 4주 후에는 난소절제 전과 비슷한 상태를 계속 유지하였다 (도 5). 따라서, 본 발명의 메톡시아크릴레이트계 화합물이 골다공증 예방에 효과가 있음을 확인하였다.

<3-2> 4산(産)한 백서의 골밀도 측정

250 g 내외의 4산(産)모의 백서를 골라 난소절제 전 골밀도(BMD) 측정을 시행하였고, 난소 절제를 한 후 3일 후부터 12주간 1일 1회로 마리당 1 ㎎의 실시예 IV-94의 화합물을 피하 주사하였다. 2주 간격으로 12주간 골밀도를 측정하였다.

그 결과, 난소가 제거된 대조군 백서는 약 5.9%의 골밀도 감소를 관찰할 수 있었으나, 실시예 IV-94의 화합물을 투여한 백서는 7.8%의 골밀도 증가를 보였다 ( 도 6). 따라서, 본 발명의 메톡시아크릴레이트계 화합물이 골밀도 변화, 즉 골 형성에 영향을 미치며 골다공증 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.

<실험예 4> 약동력학 연구

시험관내(in vitro)에서 사람 간의 마이크로좀(microsome)을 이용하여 실시예 III-43(KT-17111), IV-92(KT-19081), IV-94(KO-200993) 및 V-51(KT-200040)의 화합물의 대사안정성 시험을 수행하였고(하기 <4-1>), 250 g의 자성 백서에 실시예 IV-94의 화합물을 정맥주사하여 약동력학 파라메터를 산출하였다(하기 <4-2>).

<4-1> 대사안정성 시험

사람의 간 마이크로좀(1 ㎎/㎖)에서 안정성을 검사하기 위하여 10μM의 실시예 III-43, IV-92, IV-94 및 V-51의 화합물을 각각 2시간 동안 반응시킨 결과, 이들의 안정성이 49 내지 89%로 나타났다 (하기 표 7). 이때, 표 7의 E- 및 Z-이성체는 불소가 치환된 이중결합의 기하이성질체를 의미한다. 따라서, 본 발명의 메톡시아크릴레이트계 화합물은 대사안정성이 높은 물질임이 확인되었다.

구분		소실반감기(half-life)	2시간 안전성
실시예 III-43 (KT-17111)	E-이성체	>2시간	82%
실시예 III-43 (KT-17111)	Z-이성체	≒2시간	58%
실시예 IV-92 (KT-19081)	E-이성체	>2시간	75%
실시예 IV-92 (KT-19081)	Z-이성체	≒2시간	49%
실시예 IV-94 (KO-200993)	E-이성체	>2시간	89%
실시예 IV-94 (KO-200993)	Z-이성체	>2시간	62%
실시예 V-51 (KT-200040)	E-이성체	>2시간	67%
실시예 V-51 (KT-200040)	Z-이성체	>2시간	85%

<4-2> 자성백서에서의 약물동력학 파라메터 산출

(4-2-1) 동물시험

250 g 내외의 자성백서를 에테르 (ether)로 마취한 후 대퇴 정맥과 동맥에 카테터를 삽입한 후 실시예 IV-94의 화합물을 5 ㎎/㎏으로 1분간에 걸쳐 정맥 주사하였다. 혈청중의 실시예 IV-94의 화합물의 농도를 측정하기 위해 0, 5, 10, 15 및 30분과 1, 2, 4, 6, 9 및 12시간에 대퇴동맥을 통해 혈액을 각각 0.3 ㎖씩 취하였다. 취한 혈액은 바로 얼음물 통(ice bath)에 30분간 방치한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층인 혈청을 취하여 분석하기 전까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.

(4-2-2) 혈청중 본 발명의 화합물의 농도 측정

시약으로서 머크사의 HPLC 등급의 메탄올 및 아세토니트릴을 사용하였으며, 기기는 시마쥬(Shimadzu)사의 HPLC 시스템(시마쥬 LC-10AD)을 사용하였다. 약물은 실시예 IV-94의 화합물을 사용하였다.

1) 표준 용액 (Standard solution)

실시예 IV-94의 화합물을 메탄올로 1 ㎎/㎖이 되도록 녹여 표준 저장용액 (stock solution)을 만들었다. 표준 저장용액을 메탄올로 순차적으로 희석하여 40, 20, 10, 2, 1, 0.5 ㎍/㎖의 표준 용액 (standard solution)을 만들었다.

2) 표준 검량 곡선 (Standard calibration curve)

검량(calibration) 농도는 0.05, 0.1, 0.2, 1, 2 및 4 ㎍/㎖로 작성하였다.

공 혈청 100 ㎕에 표준용액 (40, 20, 10, 2, 1 및 0.5 ㎍/㎖) 10 ㎕를 첨가한 후 섞어주었다. 아세토니트릴 250 ㎕를 첨가하고 섞어준 후 10분간 원심분리하여 상층액을 취했다. 이 상층액 300 ㎕를 질소 가스하에서 증발 건조한 후, 메탄올 50 ㎕를 가하여 재구성 (reconstitution)한 다음, 20 ㎕을 HPLC에 주입하여 분석하였다.

3) 추출(extraction)

각 혈청 100 ㎕를 1 ㎖ 마이크로튜브(microtube)에 분주한 후 메탄올 10 ㎕를 첨가하여 섞어주었다. 아세토니트릴 250 ㎕를 첨가하고 섞어준 후, 10분간 원심분리하여 상층액을 취했다. 이 상층액 300 ㎕를 질소 가스하에서 증발 건조한 후, 메탄올 50 ㎕를 가하여 재구성 (reconstitution)한 다음, 20 ㎕을 HPLC에 주입하여 분석하였다. HPLC 분석시, 이동상은 메탄올/물 (90/10 (v/v)), 칼럼은 시미다쥬 ODS2 (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛)를 사용하였으며, 유속은 1.2 ㎖/분, 검출(detection)은 파장 240 ㎚에서 흡광측정하였다.

실시예 IV-94의 화합물의 표준 검량 곡선을 작성한 결과, y=15927x - 127.9 (r²=0.9997)의 좋은 직선성을 나타내었다.

(4-2-3) 약동력학 파라메타의 산출

도 7은 5마리 자성백서에 실시예 IV-94의 화합물을 5 ㎎/㎏으로 정맥투여한 후 시간에 따른 혈청 중 평균농도를 세미로그 스케일(semilog scale)로 플롯(plot)한 것으로, 분포상과 분포후상을 나타내고 있다. 윈논린 프로그램(WinNonlin program)을 이용하여 비구획 오픈 모델(non-compartment open model)로 각각의 약동력학 파라메타를 산출하였다.

그 결과로서, 하기 표 8에 5마리 자성백서 각각의 약동력학 파라메타의 평균값을 나타내었는데, 전체 CL이 1.23 ㎖/분 (약 4.92 ㎖/분/㎏), 소실반감기가 327.9분으로 약물로서는 적절한 크기이다.

AUC^*1 (㎍·분/ml)	CL^*2 (ml/분)	소실반감기 (분)	Vd^*3 (ml)
398.9±122.3	1.23±0.57	327.8±122.1	605.8±431.2
1 AUC: 시간에 따른 혈중 농도 곡선하 면적 2 CL: 클리어런스(clearance) *3 Vd: 분포용적(volume of distribution)

<실험예 5> 마우스에 대한 경구투여 급성 독성실험

10 주령된 40 g 내외의 특정병원체부재 (specific pathogen-free, SPF) 마우스를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 실시예 IV-94의 화합물을 5% 폴록사머 (poloxamer) 용액에 녹여 20 ㎎/㎖로 만든 후 5% 폴록사머 용액을 이용하여 단계적으로 희석하여 5, 2.5, 1.25 및 0.625 ㎎/㎖의 용액을 만든 다음, 군당 5마리씩 이 용액 0.4 ㎖을 단회 복강주사 하였다. 경구투여는 실시예 IV-94의 화합물을 식용 옥수수유에 녹여 180 ㎎/㎖로 만든 후 식용 옥수수유를 이용하여 단계적으로 희석하여 80, 20 및 5 ㎎/㎖의 용액을 만든 다음, 군당 5마리씩 이 용액 0.4 ㎖을 단회 경구투여 하였다. 실시예 IV-94의 화합물을 투여한 후 2주간 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 시행하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

투여용량에 따른 동물의 사망률을 플롯하여 도 8에 나타내었다. 복강투여시의 LD₅₀이 0.6 ㎎/40 g (15 ㎎/)㎏으로서, 약효를 나타내는 용량인 4 ㎎/㎏에 비해 약 4배 정도로 치료 지수(therapeutic index)가 작은 약물이다.

<제제예> 본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물의 제조

실시예 IV-94의 화합물을 사용하여 하기 성분들을 포함하는 약학 조성물을 제조하였다.

실시예 IV-94의 화합물 200 mg

비타민 C 50 mg

락토스(담체) 150 mg

총 400 mg

상기 성분들을 잘 혼합하여 캅셀당 총 400 mg이 되도록 경질 젤라틴 캅셀에 충전하였다. 상기 조성물들은 비타민 C외에 건강에 유익한 다른 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 일반조제법에 따라 정제, 과립제, 산제, 마이크로캅셀, 드링크제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제 등 각종 경구용 제제로 제조할 수 있다.

상기 실험결과로부터 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 메톡시아크릴레이트계 화합물은 현재 사용중인 골다공증 치료제들이 가지는 문제점을 나타내지 않고 파골세포 전구세포와 조골세포에 세포 독성을 나타내지 않으며, 파골세포의 생성 및 활성을 억제하는 활성을 가지므로, 골다공증과 같은 골질환의 예방 및 치료 뿐만 아니라 성장기 어린이의 키 성장에도 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

활성 성분으로서 하기 화학식 1의 메톡시아크릴레이트계 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물:

화학식 1

상기 식에서,

X는 CH 또는 N이고,

Y는 O 또는 S이고,

Z는 O 또는 NH이고,

A는
,
,
또는
이고(이때, R³은 수소; C_1-4 알킬; 또는 하나 이상의 할로겐 치환체를 갖는 C_1-4 알킬이다),

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소; C_1-4 알킬; 하나 이상의 할로겐 치환체를 갖는 C_1-4 알킬; 페닐; 할로겐, C_1-4 알킬, C_1-4 할로알킬, C_1-4 알콕시, 페녹시 및 메틸렌디옥시로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 갖는 페닐; 또는 나프틸이다.
제 1 항에 있어서,

화학식 1의 화합물이, Y가 O이고, A가
또는
이고, R¹ 및 R²의 둘 중 하나가 수소; CH₃; 또는 CF₃이고, 다른 하나가 페닐; F, Cl, 메틸, 에틸, 부틸, CF₃, 메톡시, 에톡시, 페녹시 및 디옥시메틸렌으로부터 선택된 하나 이상의 치환체를 갖는 페닐; 또는 나프틸인 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

화학식 1의 화합물의 유효량이, 비경구투여시 0.5 내지 5 ㎎/㎏ 체중/일 이고, 경구투여시 5 내지 50 ㎎/㎏ 체중/일 인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

파골세포의 생성 및 골 흡수를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
하기 화학식 1의 메톡시아크릴레이트계 화합물을 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 식품 조성물:

화학식 1

상기 식에서, X, Y, Z, A, R¹ 및 R²는 제1항에서 정의한 바와 같다.