KR20080046543A - 연근 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연근 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품에 관한 것으로서, 구체적으로 조골세포 생성과 파골세포 억제능이 우수하여 골다공증 예방효과를 갖는 연근 추출물을 유효성분으로 포함하여 골다공증의 예방 및 개선을 위해 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
연근, 골다공증, 파골세포, 조골세포, 골밀도
Description
도 1A는 본 발명에 사용한 연근을 추출 용매별로 추출하여 조골세포에 처리하였을 때 세포가 증식된 정도를 나타낸 그래프이고,
도 1B는 본 발명에 사용된 연근을 추출 용매별로 추출하여 조골세포에 처리하였을 때 염기성 인산분해효소의 활성을 나타낸 그래프이고,
도 2A는 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 조골세포에 처리 후, 3일 배양하였을 때 조골세포의 증식에 미치는 영향을 MTT법으로 분석한 결과이고,
도 2B는 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 조골세포에 처리 후, 7일 배양하였을 때 조골세포의 증식에 미치는 영향을 MTT법으로 분석한 결과이고,
도 2C는 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 조골세포에 처리 후, 14일 배양하였을 때 조골세포의 증식에 미치는 영향을 MTT법으로 분석한 결과이고,
도 3A은 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 조골세포에 처리 후, 3일 배양하였을 때 염기성 인산분해효소의 활성을 나타낸 그래프이고,
도 3B은 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 조골세포에 처리 후, 7일 배양하였을 때 염기성 인산분해효소의 활성을 나타낸 그래프이고,
도 3C은 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 조골세포에 처리 후, 14일 배양하였을 때 염기성 인산분해효소의 활성을 나타낸 그래프이고,
* 도 4는 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 여러농도로 파골세포에 처리하였을 때 파골세포의 형성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고,
도 5는 본 발명의 연근추출물(30%에탄올 추출물)을 여러농도로 파골세포에 처리하였을 때 파골세포의 TRAP 활성에 미치는 영향을 영향을 나타낸 그래프이고 (TRAP 활성은 타르트레이트에 대해 저항성을 나타내는 산성 포스파타제 활성을 의미한다).
도 6은 본 발명의 연근 추출물(30%에탄올 추출물)에 의한 파골세포의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 골다공증 예방 및 치료에 효과를 갖는 연근 추출물(lotus root)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 조골세포 생성과 파골세포 억제능이 우수하여 골다공증 예방 및 치료효과를 갖는 연근 추출물에 관한 것이다.
골다공증(Osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지 고 그로 인해 골수강이 넓어지는 상태로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골량은 유전적 요인, 영양섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활습관의 차이 등 여러 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준 (bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14~18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에, 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.
골다공증과 관련하여 과거에는 주로 골의 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사이상을 중심으로 그 연구가 진행되어 왔으며, 이의 발병기전 규명에는 진전을 보지 못하였다 그러나, 최근 골형성에 중요한 무기질 뿐만 아니라 골기질 단백질의 대사에 관한 연구의 중요성이 새로이 부각되고 있다. 현재 이용되는 골다공증의 치료 및 예방법으로는 대개 칼슘이 함유된 식이요법, 폐경기의 여성들에게는 에스트로젠 (estrogen)을 투여하거나 비타민 D를 투여하여 골다공증의 진행을 완화시키는 방법이다. 골다공증 치료제로 널리 사용되는 칼슘 보강제재는 부갑상선 호르몬의 분비를 억제하며 골흡수에 의한 골량 감소를 방지하지만, 골량 유지의 개인 차이가 심하다고 알려져 있다 (Heaney, R.P., Princeples of Bone Biology, Academic press, 1007-1017, 1996). 에스트로젠이나 칼시토닌을 이용한 호르몬 요법의 경우 골밀도를 증가시키고, 직장암의 발생을 감소시킨다는 보고도 있으나, 유방암, 심근경색, 정맥 혈전증 등의 부작용이 보고된 바 있다 (Nelson, H.D. et al., JAMA, 288: 872-881, 2002; Lemay, A., J. Ostet. Bynaecol. Can., 24: 711-715). 비스포스포네이트는 파골세포를 억제하는 골흡수 억제제로써 새로운 대체 치료제로 주목받고 있으나, 올바르지 않은 경구 투여시 상기도에 병소가 관찰되기도 한다(Fleisch, H., Principles of Bone Biology, Academic press, 1007-1017, 1996; Cryer, R. and Bauer, D.C., Mayo. Clin. Proc., 77: 1031-1043, 2002).
따라서, 새로운 작용 및 골격구조를 가지면서 독성 및 부작용이 적어 골다공증의 예방 및 치료에 효과적인 신물질의 개발이 절실히 요구되고 있다. 또한, 이러한 신물질은 민간요법으로 예로부터 적용되어 온 천연물에서 발견될 가능성이 매우 높기 때문에 천연물, 특히 생약으로부터 신약을 제조하려는 시도가 활발히 진행되고 있다.
한편, 연근(lotus root)은 수련과에 속하는 다년생 초본인 연꽃(학명 Nelumbo nucifera Gaertn)의 뿌리줄기로, 재배는 표토(表土)가 깊고 유기질이 많은 양토(壤土)나 점질양토(粘質壤土)가 적당하며, 유기질 비료를 주로 사용한다. 주성 분은 당질로서 대부분이 녹말이다. 아미노산으로는 아스파라긴산, 이르기닌, 티로신이 함유되어 있으며 레시틴, 펙틴도 많다. 또한 일반 식물에는 적은 비타민B12가 함유되어 있는 것이 특색이다.
효능으로는 정력강장, 피로회복, 정신안정에 도움을 주며, 폐병, 빈혈, 하혈, 각기, 출혈성 위궤양이나 위염에 좋은 것으로 알려져 있으며, 니코틴 (담배의 독) 등 각종 독성물질에 대한 중화, 해독작용 또한 알려져 있다. 그러나, 현재까지 상기 연근과 골다공증과의 상관 관계에 대한 보고는 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 연근 추출물이 골다공증 유발 억제작용이 뛰어남을 발견하여 연근 추출물을 골다공증 치료제 또는 예방제 및 건강식품으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 골다공증 예방 및 치료효과를 갖는 연근 추출물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 조골세포의 증식 활성과 파골세포의 증식 억제활성 및 골밀도 증가효능을 갖는 연근 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 연근 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 연근 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 건강식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 조골세포의 증식 활성 및 파골세포의 증식 억제활성을 갖는 연근 추출물을 제공한다.
추출을 위한 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물이고 알코올은 C1 내지 C4의 저급 알코올이고 바람직하게는 5 내지 100%, 보다 바람직하게는 20 내지 80%, 보다 더 바람직하게는 20 내지 50%의 에틸알콜(ethyl alcohol) 또는 바람직하게는 5 내지 100%, 보다 바람직하게는 20 내지 80%, 보다 더 바람직하게는 20 내지 50%의 메틸알콜(methyl alcohol)이다. 물 추출은 열수추출일 수 있다.
본 발명자들은 연근에 각각 70% 에탄올, 30% 에탄올 및 증류수를 첨가하여 환류 추출 및 동결건조하여 연근 추출물을 수득한 후, 이를 조골세포에 첨가하여 조골세포 증식효과를 알아보았다(도 1A 참조). 특히, 30% 에탄올 연근 추출물은 대조군 보다 높은 증식효과가 나타남을 확인하였다(도 2 참조).
연근 추출물 첨가 후 조골세포의 특징 중 하나인 ALP(Alkaline phosphatase) 활성이 어떻게 변화하는지 알아본 결과, 연근 추출물 첨가군이 대조군에 비해 ALP 활성이 증가하였다(도 1B 참조). 특히, 30% 에탄올 연근 추출물은 대조군에 비해 ALP 활성이 농도의존적으로 증가함을 확인하였다(도 3 참조).
파골세포는 골수내의 단핵구/대식세포 계통의 세포로부터 유래하고, 이 단핵전구세포는 혈액내로 순환되며 골내막층에서 전구세포들이 증식되어 다핵세포를 형성하기 위해 융합된다고 알려져 있으며 (Scheven, B.A.A. etal., Nature, 321:79-81, 1986), 파골세포에는 특징적으로 타르트레이트 (tartrate)에 대해 저항성을 나타내는 산성 포스파타제 (acid phosphatase)인 TRAP을 가지며 이는 다른 골조직 세포와 구별할 수 있는 파골세포의 세포화학적 표지효소로 이용된다고 알려져 있다(Minkin, C., Calcif. Tissue Int., 34: 285-290, 1982). 본 발명자들은 연근 추출물에 의한 파골세포의 생성 억제와 세포 활성도 감소 확인을 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.
구체적으로, ICR 마우스의 대퇴골과 경골을 적출하고 골수를 모아 파골세포의 전구세포가 되는 미부착세포를 수득하였다. 이에, 실시예에서 제조한 연근 추출물을 처리한 뒤, 파골세포의 생성을 검사하기 위하여, TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 실시하였다. TRAP에 양성(+)이며 다핵(3개 이상의 핵)을 갖는 TRAP-양성 다핵세포들을 파골세포로 측정하고 다핵세포수의 변화를 측정하였다. 그 결과, 연근 추출물을 처리한 군은 대조군에 비해 TRAP(+) 다핵세포의 수가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. TRAP 활성도도 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 연근 추출물이 농도 의존적으로 파골세포의 생성 억제 작용을 한다는 것을 확인하였다(도 4 및 5 참조).
또한, 본 발명은 연근 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 연근 추출물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 투여시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 실제로 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 담체와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 내 추출물의 유효용량은 10 내지 5000 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 30 내지 3000 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 연근 추출물을 유효성분으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 연근 추출물을 식품으로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 연근 추출물을 식품 또는 음료의 제조 시에 원료에 대하여 0.001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 40 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 연근 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 연근 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.
<
실시예
1> 연근추출물의 제조 1
연근(lotus root, 구입처 : 경기도 부천 소재 대영제약) 10.4g을 플라스크에 넣고 300ml 70% 에탄올을 첨가하여 2시간동안 2회 환류추출하였다. 얻어진 추출액을 거름종이로 여과하여 진공감압하여 농축시킨 후, 동결건조하여 연근 추출물 50.9mg을 얻었다.
<
실시예
2> 연근 추출물의 제조 2
연근 10.3g을 플라스크에 넣고 300ml 30% 에탄올을 첨가하여 2시간동안 2회 환류추출하였다. 얻어진 추출액을 거름종이로 여과하여 진공감압하여 농축시킨 후, 동결건조하여 연근 추출물 128mg을 얻었다.
<
실시예
3> 연근 추출물의 제조 3
연근 10g을 플라스크에 넣고 300ml 증류수를 첨가하여 2시간동안 2회 환류추출하였다. 얻어진 추출액을 거름종이로 여과하여 진공감압하여 농축시킨 후, 동결건조하여 연근 추출물 299mg을 얻었다.
<
실험예
1> 조골세포에서 연근 추출물의 골다공증 치료효과 확인
<1-1> 조골세포의 배양
Saos-2 세포는 한국세포주은행에서 구입하였으며, 10% FBS, 페니실린 100 Unit/ml, 스트렙토마이신 100ug/ml을 포함하는 RPMI 1640 배지(Gibco BRL, 미국)를 사용하여 습식조건, 37℃로 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
<1-2> 연근 추출물 처리에 따른 조골세포의
증식정도
측정
상기 세포주를 96 웰 플레이트에 1x104 세포주/웰로 접종하고 상기 실시예 1, 2, 3에서 수득한 연근 추출물을 DMSO(Dimethylsulfoxide)에 용해시켜(배지내 최종 DMSO 농도 1%) 20 ug/ml의 농도가 되도록 웰에 첨가하였다. 대조군으로는 연근 추출물을 첨가하지 않은 것을 사용하였다.
상기에서 준비된 것을 37℃ 배양기에서 7일간 배양하고 여기에 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)을 0.05mg/ml 농도로 가하여 같은 조건에서 3시간 더 배양하였다. 생성된 포르마잔(Formazan)결정을 DMSO로 용해시켜 엘리자 판독시(ELISA reader)로 570nm에서의 흡광도를 측정하여 세포증식률(%)을 알아보았다. 비교군으로는 현재 골다공증 치료제로 주로 사용되고 있는 NaF를 사용하였다.
세포증식율(%)=추출물 첨가 웰의 흡광도/대조군 웰의 흡광도
그 결과, 실시예 1의 70% 에탄올 추출물, 실시예 2의 30% 에탄올 추출물, 실시예 3의 열수 추출물을 20ug/ml 농도로 처리한 경우에 모두 증식효과가 나타고, 70% 에탄올 추출물 39.12 ± 3.21% 증가, 열수추출물 41.21 ± 2.14% 증가, 30% 에 탄올 추출물 52.84 ± 0.59% 증가로 30% 에탄올 추출물에서 세포 증식효과가 가장 뛰어남을 확인할 수 있었다(도 1A).
<1-3> 연근 추출물 처리에 따른 ALP 활성 측정
조골세포의 특징 중 하나는 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 나타낸다는 것이므로 연근 추출물이 조골세포인 Saos-2 세포에서 ALP 활성에 어떤 변화를 가져오는지 알아보았다.
실시예 <1-2>의 MTT 실험에서와 동일한 세포수의 Saos-2 세포주에 연근 추출물을 20ug/ml 농도로 처리하고 동일한 조건에서 7일동안 배양하였다. 한편 ALP는 p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenylphosphate)를 p-니트로페놀(p-nitrophenol)과 포스페이트(phosphate)로 분해시키는 것을 이용하여 405nm에서의 흡광도의 변화로 ALP 활성을 측정하였다. 비교군으로는 현재 골다공증 치료제로 주로 사용되고 있는 NaF(0.001ug/ml)을 첨가한 군을 사용하였다.
그 결과, 실시예 1의 70% 에탄올 추출물, 실시예 2의 30% 에탄올 추출물, 실시예 3의 열수추출물을 20ug/ml농도로 처리한 경우에 모두 대조군에 비해 ALP의 활성이 증가함을 확인하였고 70% 에탄올 추출물 40.32 ± 1.33% 증가, 열수추출물 46.52 ± 3.14% 증가, 30% 에탄올 추출물 87.62 ± 1.2% 증가로 30% 에탄올 추출물에서의 활성이 약 두 배 정도 탁월함을 확인하였다(도 1B)
<1-4> 연근 추출물(30% 에탄올) 처리에 따른 조골세포의
증식정도
측정
상기 세포주를 96 웰 플레이트에 1X104 세포주/웰로 접종하고 실험예 <1-2>와 <1-3>의 실험을 통해 가장 뛰어난 활성을 나타낸 실시에 2의 30% 에탄올 추출물을 0.2,1,5,20 ug/ml의 농도가 되도록 각 농도별로 웰에 첨가하였다. 연근 추출물은 DMSO(Dimethylsulfoxide)에 용해시켜 사용하였으며 배양조건에서 DMSO의 최종농도는 1% 이하가 되도록 하였다. 한편 대조군으로는 연근 추출물을 첨가하지 않은 것을 사용하였고 비교군으로는 NaF를 사용하였다.
상기 세포주를 37℃ 배양기에서 3, 7, 14 일간 각각 배양하고 여기에 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)을 0.05mg/ml 농도로 가하여 같은 조건에서 3시간 더 배양하였다. 생성된 포르자마잔(Formazan)결정을 DMSO로 용해시켜 엘리자 판독시(ELISA reader)로 570nm에서의 흡광도를 측정하여 세포증식율(%)을 알아보았다(연근 추출물을 첨가하지 않은 대조군 사용)
세포증식율(%)=추출물 첨가 웰의 흡광도/대조군 웰의 흡광도
그 결과, 본 발명의 30% 에탄올 연근 추출물은 도 2에서와 같이, 대조군 보다 3, 7, 14 일 모든에서 높은 증식효과가 나타남을 알 수 있었다.
상기 실험으로부터 본 발명에 따른 30% 에탄올 연근 추출물의 조골세포 증식효과는 NaF처리군에 비해 고농도에서 나타나기는 하나, 비슷하거나 더 높은 활성을 나타내었으며, 농도의존적으로 조골세포의 증식을 촉진하는 효과가 있음을 확인하였다.
<1-5> 연근 추출물(30% 에탄올) 처리에 따른 ALP 활성 측정
MTT 실험에서와 동일한 세포수의 Saos-2 세포주에 실험예 <1-3>과 같이 처리하고 동일한 조건에서 3, 7, 14일 동안 배양한 후 수확하여 ALP 활성을 측정한 결과, 30% 에탄올 연근 추출물은 도 3에서와 같이, 대조군에 비해 3,7,14 일 모든 측정에서 염기성 인산분해효소의 활성이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.
<
실험예
2> 파골세포에서 연근 추출물의 골다공증 치료효과 확인
연근 추출물에 의한 파골세포의 생성 억제와 세포 활성도 감소 확인을 위하여, 다음과 같은 실험들을 시행하였다.
<2-1> 파골세포 배양
ICR 마우스(중앙실험동물)의 대퇴골(femur)과 경골(tibia)을 무균적으로 적출하고 주위의 근육조직을 깨끗이 제거하여 대퇴골과 경골을 분리하고 양끝을 절단한 후, 30G 주사침을 이용하여 골수가 완전히 빠질 때까지 α-MEM (α-minimum essential medium, Gibco BRL) 배지로 씻어내렸다. 골수를 모아 10% FBS가 포함된 α-MEM에 24시간 전 배양한 후 파골세포의 전구세포가 되는 미부착세포를 수득하여 웰 당 2× 105개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다. 배양하는 동안 30 ng/ml M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)와 50 ng/ml RANKL이 포함된 α-MEM에 실시예 2에서 제조된 연근 추출물을 최종 농도가 5, 10, 20 ug/ml이 되도록 처 리하여 배양하였다. 대조군으로는 연근 추출물을 첨가하지 않은 것을 사용하였고, 비교군으로는 골다공증 예방에 효능이 있는 것으로 알려진 제니스테인(genistein) 30uM을 사용하였다(Ishimi Y. et al., Selective effects of genistein, a soybean isoflavone, on B-lymphopoiesis and bone loss caused by estrogen defficiency. Endocrinol., 140(4): 189301900, 1999).
<2-2> 연근 추출물 처리에 따른 파골세포 생성 억제 확인
추출물을 첨가한 지 6일째에 배양을 완료한 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여, 세포를 고정하여 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 실시하였다. 염색은 시판되는 키트(Acid phosphatase, Sigma)를 사용하였다.
구체적으로 부착세포를 PBS로 세척하고 시트레이트-아세테이트-포름알데히드(citrate-acetate-formaldehyde)로 5분간 고정시키고 나프톨(naphthol) AS-BI 포스페이트, 패스트가넷(fast Garnet) GBC 용액과 7mM 타트레이트(tartrate) 완충용액(pH 5.0)을 함유하는 37℃ 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 1시간 동안 배양하여 염색을 하였다.
TRAP에 양성(+)이며 다핵(3개 이상의 핵)을 갖는 TRAP-양성 다핵세포들을 파골세포로 측정하고 6일 동안 배양한 후 TRAP 양성 다핵세포수의 변화를 측정하였다. 그 결과, 연근 추출물을 처리한 군은 대조군 100%에 비해 TRAP(+) 다핵세포의 수가 5, 10, 20 ug/ml에서 각각 17.58%, 15.45%, 13.58%로 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 연근 추출물이 농도 의존적으로 파골세 포의 생성 억제 작용을 한다는 것을 확인하였다(도 4).
<2-3> 연근 추출물 처리에 따른 TRAP 활성 억제 확인
추출물을 첨가한 지 4일째에 TRAP 활성을 측정하였다. 구체적으로, 부착세포의 배지를 제거하여 PBS로 세척하고 10% 포름알데히드로 고정한 세포에 기질 용액(1.35 mg/ml 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, 10 mM tartarate, 50 mM citrate buffer)을 가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 0.1N NaOH로 반응을 중지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. TRAP 활성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 표시하였다.
그 결과, 연근 추출물을 처리한 군은 대조군에 비해 TRAP 활성도가 5, 10, 20 ug/ml에서 각각 13.84%, 12.39%, 11.84%로 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 연근 30% 에탄올 추출물이 파골세포의 TRAP 활성 억제 작용을 한다는 것을 확인하였다(도 5).
<2-4> 연근 추출물에 의한 세포독성 측정
연근 추출물에 의한 세포독성을 측정하기 위해 파골세포의 전구세포를 연근 추출물과 함께 배양하고, MTT 실험을 실시하여 세포 증식을 측정하였다. 추출물을 가한지 4일째에 0.05% MTT(3-〔4,5-dimethylthiazol-2-yl〕-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Triazolyl Blue)를 가하여 3시간 더 배양하여 생성된 포르마잔(formazan) 결정을 DMSO로 용해시켜 570 nm에서의 흡광도를 측정하였 다.
세포 증식율을 측정한 결과, 연근 추출물을 처리한 군은 대조군에 비해 5, 10, 20 ug/ml에서 각각 108%, 106.66%, 107.43%로 대조군과 크게 차이가 없는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 연근 추출물이 파골 전구세포에 독성이 없는 것을 확인하였다(도 6).
<
실험예
3> 동물모델을
이용한 이용한
임상적 효능시험
250g 내외의 백서의 암컷을 대상으로 하여 본 발명의 연근 추출물이 골다공증의 치료 및 예방에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 난소절제 백서에 추출물을 투여한 후, 골밀도 측정을 실시하였다.
<3-1> 난소 절제술
100mg/Kg의 케타민(Ketamine, Ketara)과 2% 자이라진(Xylazine, Rompun0.15ml/Kg)으로 전신마취 후 통상의 방법에 따라 제모 및 술전 무균처리(10% povidone-iodine scrub followed by 70% alcohol wipe)를 수행하였다.
백서 복측 중앙에 1cm 가량의 절개를 시행한 뒤 횡격막이나 간 등 주용 장기에 손상이 가해지지 않도록 주의를 하며 자궁을 따라 난소를 확인하였다. 봉합용 실로 난소를 결찰한 뒤 난소 절제를 양측으로 시행하였다. 난소 절제 후 각 장기를 복강 내로 재위치 시킨 후 봉합용 실로 층별 봉합을 시행하였다. 수술 후 감염방지를 위해 항생제 세파졸린(cefazolin 50mg/Kg)을 주사하였다.
<3-2> 골 밀도 측정기(Bone mineral densitometer ; BMD )를 이용한 골다공증 예방 및 치료효능 시험
250g 내외의 백서를 선택하여 실험군(군당 7마리)과 대조군(7마리)으로 나누어 난소 절개를 하고, 물에 녹인 약물을 8주간 마리당 400mg 약물을 경구 투여하였다. 난소절개 전 골밀도 측정을 시행한 후 2주, 4주, 8주 후에 반복하여 골밀도(BMD) 측정을 시행하였다. BMD 측정은 독일에서 제조한 XCT 540 Research SA를 이용하였다.
케이지 안에 사육중인 백서를 Ketamin HCl(ketara 10mg/Kg)과 2% xylazine HCl(Roupun 0.15ml/Kg) 혼합액을 복강에 투여하여 전신 마취시킨 후 voxel size0.1mm× 0.1mm, BMD 산출을 위한 Threshould값은 280mg/cm2(해면골 측정), 500mg/cm2(치밀골 측정)으로 설정하였다. Scout scan(10mm/sec)를 통하여 경골(Proxima tibia)의 측정위치를 정하고 CT scan(7mm/sec)을 통해 정해진 위치에서 3개의 slice에서 골밀도(BMD)값을 측정하였으며 동일 위치에서 2회 이상 촬영하고 2, 4, 8주간 매회 반복하였다.
그 결과, 난소절제를 시행한 대조군에서는 시간이 경과함에 따라 골밀도가 평균 27%정도 감소하였으나 연근 추출물을 투여한 실험군에서는 난소절제 전과 비슷한 상태를 계속 유지하였으며 4주 후에는 난소절제 전보다 더 증가된 골밀도를 나타내었다. 따라서 본 발명의 연근 30%에탄올 추출물은 골밀도 변화, 즉 골 형성 및 감소에 영향을 주고 있음을 확인할 수 있고 골다공증 예방 및 치료에 효과가 있음을 알 수 있다(표 1).
| 골밀도 변화량 (%) | ||
| (시간) 주 | 대조군 | 실시예 2 |
| 0 | 0.0 | 0.0 |
| 2 | -11.6 | -2.5 |
| 4 | -18.6 | 0.8 |
| 8 | -27.1 | 2.4 |
<
제제예
1> 연질캅셀제의 제조
실시예 2에 따라 조제된 연근 추출물 100.0mg, 콩기름 175.0mg, 황납 45.0 mg, 야자경화유 127.5mg, 대두인지질 21.0mg, 젤라틴 212.0mg, 글리세린(비중 1.24) 50.0mg, 디-소르비톨 76.0mg, 파라옥시안식향산메칠 0.54mg, 파라옥시안식향산프로필 0.90mg, 메칠바닐린 0.56mg, 황색 203호 적량의 성분이 1 캅셀 중에 함유되도록 약전 제제총칙중 연질캅셀의 제법에 따라 제조하였다.
<
제제예
2> 음료의 제조
본 발명자들은 연근 추출물을 유효성분으로 함유하는 음료 조성물을 하기와 같이 제조하였다.
실시예 2에 따라 제조된 연근 추출물 0.48 ∼ 1.28㎎, 꿀 522㎎, 치옥토산아미드 5㎎, 니코틴산아미드 10㎎, 염산리보플라빈나트륨 3㎎, 염산피리독신 2㎎, 이노시톨 30㎎, 오르트산 50㎎ 및 물 200㎖의 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.
본 발명의 연근 추출물은 조골세포의 증식 활성 및 파골세포의 증식 억제활성을 가지므로 본 발명의 연근 추출물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품은 골다공증 등 골 관련 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Claims (5)
- 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 연근(lotus root) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품.
- 제 1항에 있어서, 상기 물은 열수인 것을 특징으로 하는 건강식품.
- 제 1항에 있어서, 상기 혼합용매의 에탄올 농도는 10 내지 40%인 것을 특징으로 하는 건강식품.
- 제 3항에 있어서, 상기 에탄올 농도는 30%인 것을 특징으로 하는 건강식품.
- 제 1항에 있어서, 연근 추출물은 파골세포의 생성 억제 작용을 통해 골다공증을 예방 및 개선하는 것을 특징으로 하는 건강식품.
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| KR1020070059340A KR100910622B1 (ko) | 2007-06-18 | 2007-06-18 | 연근 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품 |
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