KR101491595B1 - ａｘｉａｌ―ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ａｒｙｌ배향의 ｆｕｒｏｆｕｒａｎ형 리그난을 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품 - Google Patents

ａｘｉａｌ―ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ａｒｙｌ배향의 ｆｕｒｏｆｕｒａｎ형 리그난을 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품 Download PDF

Info

Publication number
KR101491595B1
KR101491595B1 KR1020137003498A KR20137003498A KR101491595B1 KR 101491595 B1 KR101491595 B1 KR 101491595B1 KR 1020137003498 A KR1020137003498 A KR 1020137003498A KR 20137003498 A KR20137003498 A KR 20137003498A KR 101491595 B1 KR101491595 B1 KR 101491595B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bone
group
composition
density
osteopenia
Prior art date
Application number
KR1020137003498A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130050967A (ko
Inventor
미도리 아사이
이영실
나오미 마세
최봉근
차병윤
타카유키 요네자와
토시아키 테루야
카즈오 나가이
우제태
Original Assignee
가부시키가이샤 에리나
주식회사 바이오러넥스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 에리나, 주식회사 바이오러넥스 filed Critical 가부시키가이샤 에리나
Publication of KR20130050967A publication Critical patent/KR20130050967A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101491595B1 publication Critical patent/KR101491595B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A61K31/36—Compounds containing methylenedioxyphenyl groups, e.g. sesamin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A23C9/1307—Milk products or derivatives; Fruit or vegetable juices; Sugars, sugar alcohols, sweeteners; Oligosaccharides; Organic acids or salts thereof or acidifying agents; Flavours, dyes or pigments; Inert or aerosol gases; Carbonation methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
    • A23F5/00—Coffee; Coffee substitutes; Preparations thereof
    • A23F5/24—Extraction of coffee; Coffee extracts; Making instant coffee
    • A23F5/243—Liquid, semi-liquid or non-dried semi-solid coffee extract preparations; Coffee gels; Liquid coffee in solid capsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
    • A23F5/00—Coffee; Coffee substitutes; Preparations thereof
    • A23F5/24—Extraction of coffee; Coffee extracts; Making instant coffee
    • A23F5/36—Further treatment of dried coffee extract; Preparations produced thereby, e.g. instant coffee
    • A23F5/40—Further treatment of dried coffee extract; Preparations produced thereby, e.g. instant coffee using organic additives, e.g. milk, sugar
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G1/00—Cocoa; Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/30—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/32—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G1/00—Cocoa; Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/30—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/32—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G1/48—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing plants or parts thereof, e.g. fruits, seeds, extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G3/00—Sweetmeats; Confectionery; Marzipan; Coated or filled products
    • A23G3/34—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof
    • A23G3/36—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G3/48—Sweetmeats, confectionery or marzipan; Processes for the preparation thereof characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing plants or parts thereof, e.g. fruits, seeds, extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/57—Magnoliaceae (Magnolia family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/109—Types of pasta, e.g. macaroni or noodles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/306—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on bone mass, e.g. osteoporosis prevention

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

본 발명은 미량에서도 골밀도를 상승시키는 것과 동시에 골의 성장을 촉진하는 작용을 하고 있으며, 부작용이 적은 조성물, 이의 조성물을 유효 성분으로 함유하는 골 형성 촉진용 약학용 제제, 기능성 식품 및 건강 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 조성물은 목련과 식물은 꽃봉오리, 잎, 수피 또는 목부에서 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 기관으로부터 얻을 수 있다. 그리고, 상기 조성물은 파르게신, 이의 생리적으로 허용되는 염, 수화물 및 배당체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 것을 적어도 1 종 이상 함유한다. 이러한 조성물을 유효 성분으로 함유하는 상기 약학용 제제, 기능성 식품 및 건강 식품은 미량이라도 충분히 골밀도를 향상시키고 골의 성장을 촉진시키기 위하여, 골조로증을 비롯한 골질환 등을 예방 및/또는 치료하는 효과를 발휘한다.

Description

ａｘｉａｌ―ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ａｒｙｌ배향의 ｆｕｒｏｆｕｒａｎ형 리그난을 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PROMOTING OSTEOGENESIS CONTAINING AXIAL-EQUATORIAL ARYL-ORIENTED FUROFURAN-TYPE LIGNAN, AND PHARMACEUTICAL PREPARATION, FUNCTIONAL FOOD PRODUCT, AND HEALTH FOOD PRODUCT COMPRISING COMPOSITION}
본 발명은 axial-equatorial aryl배향의 furofuran형 리그난을 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 파르게신 및 이의 유도체를 포함하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 유효성분으로 함유하는 약학적제제 기능성 식품 및 건강 식품에 관한 것이다.
최근 평균 연령의 상승에 따라, 노인의 골질환이 증가하고 있다. 여기서 "골질환"은 골절 등의 비대사성 골질환과 골다공증, 골파제트병, 골연화증 등의 대사성 골질환을 포함한다. 골질환은 변형성 관절증, 류마티스 관절염 및 기타 염증성 관절염, 관절의 감염증 등의 관절 질환으로 인한 경우도 있고, 류마티스 관절염이 관절 주변부의 골다공증의 원인이 되는 경우도 있다.
대사성 골질환인 골다공증은 다른 질환에 기인하지 않는 원발성 골다공증과 악성 종양이나 류머티즘 등의 질환으로 인한 속발성 골다공증으로 크게 나뉘며 원발성 골다공증이 약 95 %를 차지한다. 그리고 골다공증 중에는 여성의 발병률이 남성보다 6배 높은 I형과 일반적으로 60세 이상 환자에 발병하는 II형이 있다.
I형 골다공증은 골 대사를 담당하는 파골세포가 활성화되고, 그 결과 골흡수가 촉진되므로 골밀도가 저하된다. 이것은 난소에서 에스트로겐 분비의 저하에 의해 사이토카인의 농도가 상승하는 것에 기인하기 때문에 에스트로겐의 일종인 β-에스트라 디올이 골다공증의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
또한, 비대사성 골질환인 골절은 정상인의 경우, 정상적인 강도를 가지는 골에 대해서 큰 힘이 한번 정도 가해진 결과로 생긴다. 이것에 대해 비정상인의 경우, 암이나 골다공증 등으로 약화된 골에 대해서, 건강한 사람이라면 골절되지 않을 정도의 힘이 가해진 결과 골절이 생긴다. 이것을 병적 골절이라고 한다.
또한, 운동 등을 통해 반복적으로 동일한 부분에 부하가 걸려 골절이 생길 수 있다. 이것을 피로 골절이라고 한다. 피로 골절은 중족골에 일어나기 쉽다고 알려져 있으며, 운동 선수의 성별로 비교하면 여자 운동 선수가 남자 선수보다 피로 골절을 일으키기 쉽다. 그 원인은 여자 선수의 골다공증 발병률이 남자 선수보다 높은 것을 들 수 있다.
상기와 같은 대사성 골질환의 지표로는 혈중 칼슘 농도 이상이 이용된다. 골다공증의 발병에 따라 혈액에 칼슘 방출이 증가하는데 따른 것이다.
상기에서 언급한 바와 같이 골질환 중 골절 이외의 대사성 골질환의 치료는 기존 칼슘 대사에 중요한 역할을 하는 비타민 D의 유도체인 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 이의 유도체, 상기 β- 에스트라 디올을 비롯한 호르몬제, 및 각종 칼슘 제제 등이 임상적으로 사용되어왔다. 그 중에서도 비타민 D3는 파골세포와 조골세포 또는 그 전에 세포 및 전구 세포에 작용하여 이러한 세포의 분화 또는 활성화를 촉진하는 것으로 알려져 있다.
치료제는 아니지만, 하기의 구조를 갖는 파르게신(Fargesin; MW = 370.4)이 배양중인 RANKL 자극하에서 마우스 단구 마크로파지계 세포 및 배양중인 골수 단핵구 세포 각각의 주석산염 내성산성 인산가수분해효소의 활성을 농도 의존적으로 억제하고 또한 RANKL 자극에 의한 p38 및 I-κB의 인산화를 억제하는 것으로 알려져 있다(비 특허 문헌 1). 파르게신은 리그난의 일종이며, 이의 구조로부터 axial-equatorial aryl배향의 furofuran형 리그난으로 분류된다(비 특허 문헌 2). 이들 문헌에 기재되어있는 파르게신은 목련과의 M. fargesii이나 키타코부시(Magnolia kobus DC. Var. borealis Sarg.)에서 추출된 것이다.
Figure 112013012219744-pct00001
[특허문헌 1] 국제 공개 공보 WO 1990 / 013299 A1 [특허문헌 2] 특개 2003-522787
[비특허문헌 1] 일본생약학회 연간강연 요지집 제55권 212페이지 파골세포분화를 저해하는 목련유래의 화합물 마세 나오미 최봉근 하세가와 모리이치 테루야 토시아키 요네자와 타카유키 차병윤 나가이 카즈오 우제태 [비특허문헌 2] 홋카이도대학 농학부 연습림연구보고 = RESERCH BULLETIN OF HOKKAIDO UNIVERSITY FORESTS, 53(1): 1-28 홋카이도 목련 Magnolia kobus DC. Var. borealis Sarg.의 추출성분(제 1보) 김윤근; 오자와 ?지 ; 사노 요시히로 ; 사사야 타카시
상기에서 언급한 골질환의 치료에는 칼시토닌 및 이의 유도체, 상기 β-에스트라 디올을 비롯한 호르몬제 등이 사용되고 있지만, 이러한 약물은 체내에서 흡수 및 대사의 관계에서 투여할 수 없는 경우도 있다. 또한, 수용체 수준의 개인차가 크기 때문에 효과의 예측 가능성이 떨어지는 등의 문제도 있었다.
따라서, 골질환 치료를 위한 처방에서 이것을 보완하는 새로운 치료제가 요구되고 있으며, 이러한 치료제를 사용하는 치료법이 요구되고 있다. 또한, 골다공증의 진행을 막기 위한 예방제도 필요로 하고 있다.
골강도는 운동부하에 의해 강화되기 때문에 골다공증의 예방에는 일상의 운동이 효과적이다. 그러나, 노인이나 평소 운동을 하지 않는 사람이 급격한 운동을하면 다칠 위험이 있다. 따라서 완만한 운동과 병행하여 기능성 식품 및 건강 식품을 섭취하는 것이 효과적이다. 그런 식품류에서는 효능은 물론 약학적 제제 보다 높은 안전을 확보해야하는 사정으로 부작용이 발생하지 않는 것이 더 중요하기 때문에, 그것에 함유되는 성분은 미량으로도 충분히 예방 효과를 발휘하는 조성물인 것이 바람직하다.
또한, 골절의 치료는, 진통제를 투여하는 것 외에는 원칙적으로 외과 수술 또는 재배치에 의한다. 골다공증은 골절의 원인이 되기 때문에, 골절의 예방에는 상기와 같은 골다공증의 치료와 예방이 필요하다.
골절 중에서도 운동에 의한 피로 골절의 예방에는 적절한 식사 관리와 트레이닝 및 휴양의 계획적인 실시가 필요하다. 이를 보완하는 기능성 식품 및 건강 식품을 섭취하는 것이 상기 피로 골절의 예방에 효과적이다. 그런 식품류에서도 상기와 같은 부작용이 일어나지 않는 것이 중요하기 때문에, 미량으로도 충분히 예방 효과를 발휘하는 조성물인 것이 바람직하다.
따라서, 효과의 예측 가능성이 높은 골아 세포 분화 촉진용 약학적 조성물, 특히 해면골 형성 촉진 작용이 높은 약학적 조성물에 대한 강한 사회적 요구가 있었다. 또한, 예방 의학의 관점에서는 이러한 성분을 함유한 식품에 대한 강한 사회적 요구가 있었다.
본 발명의 제 1 형태는, 적어도 1 종 이상의 하기의 화학식(I)로 표시되는 axial-equatorial aryl배향의 furofuran형 리그난 화합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 수화물, 및 배당체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종 이상을 함유하는 골아 세포 분화 촉진용 약학적 조성물이다.
Figure 112013012219744-pct00002
(화학식(I) 중, R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 탄소수 1 ~ 3의 알킬기, 하이드록시기, 및 탄소수 1 ~ 3의 알콕시기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 관능기이고; R2 및 R3는 각각 독립적으로 탄소수 1 ~ 3의 알킬기로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 관능기이다.).
상기 약학적 조성물은 하기의 화학식(II)로 표시되는 화합물(파르게신), 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염, 수화물 및 배당체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종 이상을 함유하는 것이 바람직하다.
Figure 112013012219744-pct00003
상기 약학적 조성물은 골로송증, 골다공증, 고칼슘혈증, 고PTH혈증, 골파제트병, 관절염, 류마티스 관절염, 유방암의 골 전이, 골연화증, 악성 종양 및 영양 장애, 외상성 골절 또는 피로 골절 등에 적합하게 사용할 수 있고 특히 골로송증에 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제 2 형태는 상기 화학식(II)로 표시되는 화합물을 함유하는 목련과 식물의 꽃봉오리, 잎, 수피 또는 목부에서 이루어진 군에서 선택되는 하나의 기관에서 유래된 추출 분획을 포함하는 골아 세포 분화 촉진용 약학적 조성물이다.
상기 목련과 식물의 꽃봉오리, 잎, 수피 또는 목부에서 이루어진 군에서 선택되는 하나의 기관은 타무시바(Magnolia salicifolia Maximowicz), 코브시(Magnolia kobus De Candolle, Magnolia biondii Pampanini, Magnolia sprengeri Pampanini) 하쿠모쿠렌(Magnolia heptapeta Dandy (Magnolia denudata Desrousseaux) (Magnoli-aceae)) 및 키타코부시(Magnolia praecocissima var. borealis)로 이루어진 군에서 선택되는 식물에서 얻어지는 것이 바람직하며, 코브시의 꽃봉오리를 사용하면 얻어지는 분획의 파르게신 함유량이 높은 장점이 있다.
본 발명의 제 3의 형태은 상기 제 1 또는 제 2 형태의 약학적 조성물을 유효성분으로, 소정의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 골아 세포 분화 촉진용 약학적 제제이다. 상기 약학적 제제는 상기 소정의 용량으로, 상기 화합물로 환산하여 10 ~ 350 mg/일인 것이 바람직하고, 20 ~ 175 mg/일인 것이 보다 바람직하다. 상기 약학적 조성물은 골로송증, 골다공증, 고칼슘혈증, 고PTH혈증, 골파제트병, 관절염, 류마티스 관절염, 유방암의 골 전이, 골연화증, 악성 종양 및 영양 장애, 외상성 골절 또는 피로 골절 등에 적합하게 사용할 수 있고 특히 골다공증에 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제 4의 형태은 상기 제 1 및/또는 제 2 형태의 조성물을 소정의 함유량으로 함유하는 기능성 식품이며, 본 발명의 제 5의 형태은 상기 제 1 및/또는 제 2 형태의 조성물을 소정의 함유량으로 함유하는 건강 식품이다.
상기 식품은 골아 세포 분화 촉진을 위한 기능성 식품이나 건강 식품인 것이 더 바람직하다. 상기 소정의 함량은 1 ~ 1,000 mg/100g인 것이 바람직하다. 상기 기능성 식품 또는 건강 식품의 섭취량은 상기 화합물로 환산하여 10 ~ 350 mg/일인 것이 바람직하고, 20 ~ 175 mg/일인 것이 보다 바람직하다. 상기 기능성 식품 또는 건강 식품은 골다공증 및 기타 골질환에 적합하게 사용할 수 있으며, 특히 골로송증에 적합하게 사용할 수 있다.
여기서 상기 기능성 식품은 비스킷, 쌀밥 첨가용 밀과 잡곡, 메밀, 파스타 및 기타 면류, 치즈, 요구르트 및 기타 유제품, 잼, 마요네즈, 간장 및 기타 대두 제품, 차, 커피와 코코아 및 기타 비알콜 음료, 약용주 및 기타 알콜 음료, 캔디, 초콜릿과 기타 스낵, 센베이, 양갱 및 기타 콩을 원료로 하는 과자로 이루어진 군에서 선택되는 기능성 식품일 수 있다.
본 발명의 제 6의 측면은 상기 제 1 및/또는 제 2 형태의 조성물 및 상기 약학적 제제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 것을 피질골 또는 해면골 형성 촉진이 필요한 환자에 대해 경구적 또는 비경구적으로 투여하는 단계을 포함하는 골 형성 촉진을 위한 치료 방법이다.
여기서 상기 조성물 또는 약학적 제제는 경구적으로 섭취하는 것이 바람직하며, 운동 요법과 결합하면 칼슘이 골에 보유되는 비율이 향상되는데 더 바람직하다.
상기 조성물, 제조 또는 식품, 또는 상기 치료 방법에 사용되는 이의 함유 된 유효성분 또는 조성물은 미량으로도 충분히 골 밀도의 향상 또는 골 성장을 촉진하는 작용을 하며 상기 골질환 등의 예방 및/또는 치료 효과를 발휘하기 때문에 인체 또는 생체에 부작용이 적다.
도 1은 파르게신의 1H NMR 스펙트럼(400MHz, CDCL3)를 나타내는 그래프이다.
도 2는 파르게신의 13C NMR 스펙트럼(400MHz, CDCL3)를 나타내는 그래프이다.
도 3A는 대퇴골의 측정 부위를 나타내는 그림이다.
도 3B는 대퇴골의 측정 부위의 단면을 보여주는 그림이다.
도 4는 난소 적출 마우스에 시험 물질을 투여했을 때의 조골의 골밀도 (mg/cm3)를 나타내는 그래프이다.
도 5는 난소 적출 마우스에 시험 물질을 투여했을 때의 해면골의 골밀도 (mg/cm3)를 나타내는 그래프이다.
도 6은 난소 적출 마우스에 시험 물질을 투여했을 때의 피질골 밀도 (mg/cm3)를 나타내는 그래프이다.
도 7은 보통 마우스 태아의 종족골 배양 배지에 시험 물질을 첨가했을 때, 골의 투과광 관찰상(왼쪽 열)과 칼세인 형광 염색상(오른쪽 열)이다.
도 8A는 공존배양세포에 시험 물질을 작용시켰을 때의 ALP 활성 및 TRAP 활성을 음성 대조군의 비례(%)로 나타낸 그래프이다.
도 8B는 공존배양세포에 시험 물질을 작용시켰을 때의 ALP · TRAP 이중 염색상이다.
도 9A는 조골모양세포에 시험 물질을 작용시켰을 때의 MTT 분석 결과 및 ALP 활성을 음성 대조군의 비례(%)로 나타낸 그래프이다.
도 9B는 조골모양세포에 시험 물질을 작용시켰을 때의 ALP 염색상이다.
도 10A는 석회화를 유도한 조골모양세포에 시험 물질을 작용시켰을 때의 ALP 활성을 음성 대조군의 비례(%)로 나타낸 그래프이다.
도 10B는 석회화를 유도한 조골모양세포에 시험 물질을 작용시켰을 때의 ALP 염색상이다.
도 10C는 석회화를 유도한 조골모양세포에 시험 물질을 작용시켰을 때의 미네랄 침착의 염색상이다.
도 11A는 위(僞)수술 마우스(Sham), 난소 적출 마우스(OVX)에 각 시료를 투여했을 때의 각 투여군 마우스의 투여 3개월 후 전체 골밀도를 나타내는 그래프이다.
도 11B는 도 11A에 표시된 각 군의 마우스 해면골 밀도를 나타내는 그림이다.
도 12는 도 11A에 표시된 각 군의 마우스 대퇴골의 극좌표 강도를 나타내는 그림이다.
도 13은 도 11A에 표시된 각 군의 마우스 혈청 TRACP5b 값을 나타내는 그림이다.
도 14A는 sRNAKL 투여 마우스 및 각 시료를 투여했을 때의 각 투여군 마우스의 투여 13일 이후의 조골 밀도를 나타내는 그림이다.
도 14B는 도 14A에 표시된 각 군의 마우스 해면골 밀도를 나타내는 그림이다.
도 15는 도 14A에 표시된 마우스 대퇴골의 극좌표 강도를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 제 1 형태는 화학식(I)로 표시되는 axial-equatorial aryl배향의 furofuran형 리그난 화합물 및 이의 유사체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물이다.
Figure 112013012219744-pct00004
화학식(I) 중, R1 및 R4는 각각 독립적으로 수소 원자, 탄소수 1 ~ 3의 알킬기, 하이드록시기, 및 탄소수 1 ~ 3의 알콕시기로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 관능기이고; R2 및 R3는 각각 독립적으로 탄소수 1 ~ 3의 알킬기로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 관능기이다.
또한, 상기 화학식(I)로 표시되는 화합물은 골 밀도의 향상, 골의 성장, 피질골 또는 해면골의 형성을 촉진하는 활성이 높기 때문에, 하기의 화학식(II)로 표시되는 화합물인 것이 바람직하다.
Figure 112013012219744-pct00005
여기서, 상기 유사체에는 이러한 화합물을 생리학적으로 허용되는 염, 수화물과 배당체, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 생리학적으로 허용되는 염으로는 나트륨염, 칼륨염, 염산염 등을 꼽을 수 있다. 또한, 수화물로는 1수화물, 2수화물 등을 꼽을 수 있다.
상기에서 언급한 화학식(I) ~ (II)로 표시되는 화합물 및 이의 유사체, 및 염, 수화물과 배당체, 및 이들의 혼합물은 공지의 방법 또는 이에 준하는 방법으로 제조하고, 입수해도 좋고, 시판품을 구입하여 사용해도 좋다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 다음과 같이하여 제조할 수 있다.
우선 목련과 식물에서 꽃봉오리, 잎, 수피 또는 목부에서 이루어진 군에서 선택되는 하나의 기관을 채취하고 이것을 건조시켜 건조체로 사용한다.
구체적으로, 예를 들어, 보우?카의 말린 꽃봉오리를 준비한다. 말린 꽃봉오리는 이러한 식물의 꽃봉오리를 채취하여 바람에 의해 건조시킨것으로 생약의 목련으로서 시판되고 있는 제품을 구입하여 사용할 수 있다. 또한, 꽃봉오리의 대신에, 잎, 수피 또는 목부를 이용하는 것도 가능하다.
상기 건조체을 소정의 양으로 측정하고, 측정한 건조체의 무게의 약 1.7 ~ 7배 용량의 메탄올을 첨가하여 소정의 온도에서 추출한다. 추출액에서 고형분을 정제하고 메탄올을 제거하여 잔여물 무게를 측정한다. 여기에, 잔여 무게의 2 ~ 5 배 용량의 물/에틸아세테이트 혼합액을 추가하여 소정의 온도로 분별 추출한다.
말린 꽃봉오리를 사용하는 경우에는 이 무게 1 kg에 약 1.7 ~ 7.0 L의 물 또는 비수용성 알코올, 예를 들어, 0.05 ~ 10 kg의 말린 꽃봉오리에 0.085 ~ 70 L의 약 100 % 메탄올을 추가하여, 2 - 6 ℃에서 3 ~ 14일간 추출을 한다.
얻은 추출액을 부흐너깔때기 등의 장치를 이용하여 고체를 정제한다. 이어 회전식 감압 농축기, 플래시 증발기 등을 이용하여 용매를 증발시킨다. 남은 양을 측정하여 예를 들면 약 2 ~ 5 배 용량의 물/및 유기 용매와의 혼합액을 넣어 분별깔때기에 옮겨 실온에서 분별추출한다.
상기의 분별 추출에는 분별깔때기 외에 액체-액체 추출 장치, 역류 추출 장치 등을 사용할 수 있으며, 사용된 말린 꽃봉오리 및 기타 건조체의 양에 따라 적절히 선택하면 된다. 또한, 상기 분별 추출은 물/에틸아세테이트, 물/아세톤, 물/부탄올 등의 용매 시스템을 사용할 수 있다. 이들 중, 물/에틸아세테이트을 사용하는 것이고, 유기상에서 용매 유출이 용이하게 하기 위해 바람직하고, 물/에틸아세테이트의 비율을 0.5/2 ~ 2/0.5로 하는 것이 효율 측면에서 바람직하며, 1/1로 하는 것이 보다 바람직하다.
분별 추출 후 유기상을 수상 분리하고 얻어진 유기상의 유기 용매를, 증발기 등을 이용하여 증발시키고 제1 농축액으로 한다. 유기상에 추출되는 성분이 많은 경우에는 유기상을 분리 한 후 수상에 같은 유기 용매 등의 물질을 새롭게 추가하여 상기 단계를 반복한다. 따라서, 원하는 화합물을 더 많이 추출할 수 있고, 고수득율로 원하는 화합물을 얻을 수 있다.
이어 다른 용매계를 사용하여, 상기 농축액에 제 2 회 분별 추출한다. 구체적으로는, 첫째 농축액의 약 2 ~ 5 배 용량의 유기 용매의 혼합액을 추가하여 소정의 온도에서 두 번째 분별 추출한다. 지용성 성분을 제거하기 위해, n-헥산/물, n-헥산/메탄올 등을 포함한 용매계를 사용하는 것이 바람직하다. n-헥산/메탄올을 사용하는 경우에는 메탄올로 10 % 정도의 물을 함유한 수분 메탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 필요에 따라, n-헥산에 의한 추출을 반복하여 지용성 성분을 더 제거 할 수 있어 이후에 정제가 쉽게 되는 장점이 있다. 이후 얻은 90 % 메탄올 상을 상기와 같이 분리, 농축하여 둘째 농축액으로 한다.
또한, 상기 제 1 또는 제 2 농축액에서 통상의 방법에 따라 메탄올을 제거하거나 하기의 방법으로 결정화하여, 본 발명의 골질환의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물일 수도 있다.
그런 다음 하기와 같은 절차에 따라 90 % MeOH 분획을 컬럼크로마토그래피에 의해 추가 정제하면 원하는 화합물의 하나인 파르게신를 얻을 수 있다.
첫째로, 예를 들어, 직경 5 ~ 20cm × 길이 12.5 ~ 75 cm의 유리 오픈 컬럼을 준비하여 200 ~ 800 g의 실리카겔을 넣어 먼저 용출 용매를 첨가하여 겔을 팽창시킨다. 겔이 팽윤 후, 두번째 농축액 겔에 적용하고, 단계식 구배 방법에 의해서 분획해, 첫번째 분획물을 얻는다. 각각의 분획물의 용량을 적절히 결정할 수 있으나, 0.75 ~ 1.5 L가 작업 효율면에서 바람직하다.
여기에서 사용하는 단계식 구배 방법에서는, 예를 들면, 용출 용매를, 에틸아세테이트:n-헥산 = 1:9에서 10:0까지 순차적으로 변화시키고, 마지막으로, 100 % 메탄올을 이용하여 실리카겔에 흡착된 성분을 용출하게 할 수 있다. 각각의 분획물에서 원하는 성분의 함량은 박층크로마토그래피 등으로 확인할 수 있다.
본 발명의 목적 화합물 또는 조성물을 얻기 위한 용출 용매의 혼합 비율은 에틸아세테이트 : n-헥산 = 1:9 ~ 7:3인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2:8 ~ 5:5 이며, 더욱 바람직하게는 3:7이다. 상기 말린 꽃봉오리의 양, 성질, 이의 추출 과정시 사용하는 추출 용매양의 추출 온도 등에 의존하여 가장 수득율이 좋은 상기 추출 용매의 혼합 비율이 변화한다. 따라서, 위와 같이 박막크로마토그래피 등으로 각각의 분획의 수득율을 확인하는 것이 바람직하다.
또한, 목적 화합물의 함유량이 많은 경우에는 결정이 침전될 수 있다. 이의 경우에는 침전된 결정을 정제하고 통상의 방법에 따라 재결정시키면 순도 높은 결정이 될 수 있다.
상기의 다른 분획물에 대해서도 상술한 농축액의 경우와 동일하게 취급하여 본 발명의 골아 세포 분화 촉진용 약학적 조성물로 사용할 수 있다. 또한, 이러한 제 1회 분획물을 각각 상기와 마찬가지로 농축하고 다시 분취크로마토그래피에 의해 다음과 순서로 정제를 할 수도 있다.
예를 들면, 상기의 첫번째 분획물의 농축액을 내경 2 cm × 길이 20 cm의 옥타 데실 실리카 컬럼(C18-ODS)를 이용한 역상컬럼크로마토그래피에 걸쳐 분취크로마토그래피로 분획을 한다. 용출 용매의 예로는 혼합 비율을 20 % 간격으로 바꾼 물/메탄올을 사용할 수 있다. 상기의 경우에는 오픈 컬럼과 마찬가지로 단계식 구배 방법에 의해 정제를 할 수 있다.
각 성분의 용출 용매마다 분획물을 모으고 목적 성분의 함유량을 상기와 같이 확인하면서 농축한다. 80 % 메탄올 분획물에서 목적 성분이 다량으로 존재하고, 농축에 의해 침전물이 결정으로 생기는 경우는 농축한 분획물을 예를 들면 등급 No.2의 여과지를 사용하여 여과함으로써 결정을 얻을 수 있다.
얻어진 결정을 소정의 용매에 용해, 질량 분석(MS), 핵자기공명분석(NMR) 등에 제공하여 각각의 스펙트럼 데이터를 얻고 이것을 문헌 값과 비교함으로써 얻어진 화합물의 구조를 발견할 수 있다.
이렇게 얻어진 화합물 또는 조성물(총 정제 분획)을 이용하여 하기 골아 세포 분화 촉진용 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품을 제조할 수 있다.
또한, 상기 화합물 또는 조성물을 인체에 투여시 적정 용량은 마우스에 투여량의 약 50배로 하는 것이 일반적이다. 예를 들면, 체중 20 g의 마우스에 20 mg/kg 체중/일 투여한 경우와 체중 35 g의 마우스에 100 mg/kg 체중/일 투여한 경우, 인간은 각각 20 mg/일 및 175 mg/일로 환산된다.
본 발명의 제 2 실시 형태는 상기에서 언급한 조성물을 유효성분으로 함유하는 골아 세포 분화 촉진용 약학적 제제이다. 이러한 약학적 제제로는 주사제, 좌제, 에어로졸제, 경피흡수제 기타 비경구제, 정제, 분산제, 캡슐, 환약, 트로치, 액제 및 기타 제형의 제제를 꼽을 수 있다. 여기에 위의 정제는 당의정, 코팅정, 바칼정이 포함되고 캡슐제는 경질 캡슐제, 연질 캡슐제 모두 포함된다. 또한, 과립제는 코팅된 과립제도 포함한다. 또한, 상기의 액제는 현탁제, 유제, 시럽제 및 엘릭서제 등을 포함하고 시럽제에는 드라이 시럽도 포함된다.
기타 제형의 제제에는 상기의 조성물을 액상으로 한 것, 또는 상기의 물약을 아가로스비즈 및 기타 겔에 함류시킨 겔제 등이 포함된다. 상기에서 언급한 각각의 약제는 지효성 약이 되어 있지 않은 것, 지효성 약이 된 것을 모두 포함된다.
이러한 제제는 공지의 약학적 제법에 따라 약제의 제조시 약물으로 허용될 수 있는 일본 약전에 기재된 담체, 부형제, 붕괴제, 윤활제 및 착색제 등을 이용하여 통상의 법에 따라 제조할 수 있다.
상기의 제제에서 사용하는 담체 및 부형제로는 예를 들면 유당, 포도당, 흰설탕, 만니톨, 감자 전분, 옥수수 전분, 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 황산 칼슘, 결정 셀룰로오스, 감초 분말 및 겐치아나 분말 등을 들 수 있다.
부형제로는 예를 들면 전분, 트래거캔스고무, 젤라틴, 시럽, 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스 등을 꼽을 수 있다.
붕괴제로서, 예를 들면, 전분, 한천, 젤라틴 분말, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 결정셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨,및 알긴산나트륨 등의 윤활제로는 예를 들면 스테아린산 마그네슘, 활석, 수소 첨가 식물성 기름 및 매크로골 등을 사용할 수 있다.
착색제는 의약품에 첨가하는 것이 허용되는 것이면 사용할 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 이외에도 교미제, 교취제 등도 필요에 따라 적절히 사용할 수 있다.
정제 또는 과립제로하는 경우에는 필요에 따라, 흰설탕, 젤라틴, 히드록시 프로필셀룰로오스, 정제셜락, 젤라틴, 글리세린, 소르비톨, 에틸 셀룰로오스, 히드 록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 프탈산 셀룰로오스 아세테이트, 히드록시 프로필메틸셀룰로오스프탈레이트, 메틸메타크릴 레이트 및 메타아크릴산중합체 등을 이용하여 코팅하여도 좋고, 여러 층으로 코팅 할 수도 있다.
또한, 과립제와 분제는 에틸셀룰로오스이나 젤라틴과 같은 캡슐에 담아 캡슐로 할 수도 있다.
상기의 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 또는 수화물을 이용하여 주사제를 제조하는 경우 필요에 따라, pH 조정제, 완충제, 안정화제 및 가용화제 등을 첨가할 수도 있다.
상기 약학적 제제를 상기 골질환 등의 환자에 투여할 경우에는 투여량은 환자의 증상의 심함, 나이, 체중 및 건강 상태 등의 조건에 따라 다르다. 일반적으로 성인은 하루 1 mg/kg ~ 2,000 mg/kg, 바람직하게는 1 mg/kg ~ 1,000 mg/kg 정도를 경구 또는 비경구적으로 1일 1회 또는 그 이상의 회수에 걸쳐 투여하면 된다. 본 발명은 상기 화합물로 환산하여 성인 하루 10 ~ 350 mg/일인 것이 바람직하고, 20 ~ 175 mg/일인 것이 보다 바람직하다. 상기와 같은 조건에 따라 투여 횟수와 양을 적절히 증감하면 된다.
유효성분인 상기 화학식(I)로 표시되는 화합물 등의 함량이 하한치 미만은 골흡수 형성 촉진 작용이 충분히 발휘되지 않고, 반대로 상한치를 넘어 첨가해도 첨가량에 맞는 효과가 발휘되지 않는다(또한, 최대값을 초과하면 생체에 바람직하지 않은 부작용을 야기할 우려가 있을 수 있다.).
여기에서, 본 발명의 조성물을 분말로 하기 위해서는, 생성 과정에서 얻은 추출물을 농축, 동결 건조, 분무 건조 및 진공 건조 등의 방법을 이용하여 건조 샘플 밀, 블렌더 및 믹서 등으로 건조 고체를 분쇄하면 된다. 또한, 필요에 따라, 옥수수, 감자 전분, 덱스트린, 시클로덱스트린 및 굴껍질 분말 등을 첨가해도 좋다.
또한, 상기와 같이 얻은 분말에 적절하게 상술한 결합제를 함께 정제 제조할 수도 있다. 정제한 후, 상술한 흰설탕 또는 젤라틴 등의 코팅제를 사용하여 당의정으로도 좋고, 다른 코팅제를 사용하여 부용제로 사용할 수도 있다.
또한, 상기에서 언급한 것과 같이하여 얻은 분말을 통상의 방법에 따라 과립으로 하여, 과립제를 제조할 수도 있다. 또한, 상기의 분말 또는 과립을 상술한 캡슐에 적당량 충전하여 캡슐로 할 수도 있다.
상술한 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 빵, 쿠키 및 비스킷, 쌀밥 첨가용 밀과 잡곡, 우동, 소바, 파스타 및 기타 면류, 우유, 우유 대용품, 크림, 버터, 버터 우유, 치즈, 유장, 요구르트 및 기타 유제품, 마가린, 쇼트닝, 잼, 마요네즈, 된장, 간장 및 기타 대두 제품, 차, 커피 및 코코아, 청량 음료, 과실 음료 기타 비알콜성 음료, 약용주 및 기타 알콜성 음료, 사탕, 초콜릿과 기타 스낵, 껌, 얼음 과자, 아이스크림, 센베이, 양갱 및 기타 콩을 원료로하는 당과 또는 과자 등에 첨가하여 제조품으로 기능성 식품으로 할 수 있다.
또한, 상기의 요구르트, 간장 및 음료 등에 첨가하는 경우에는 그 중 본 발명의 조성물이 결정화하여 침전되지 않도록 하기 위하여, 용해 보조제 및 안정화제를 적절히 추가할 수도 있다.
또한, 본 발명의 조성물을 단독으로 또는 2 종 이상을 혼합하고 통상의 방법에 따라 분말제, 과립제, 정제, 캡슐로 하여 건강 식품으로 제조할 수도 있다.
골질환 등의 환자가 상기 각각의 식품을 정해진 기간 소정의 횟수 소정의 분량을 섭취하는 것으로, 해면골 형성이 촉진되어 골조송증 및 기타 골질환을 효과적으로 치료할 수 있다. 골질환 등의 잠재적인 환자에 상기와 같이 실시하여 골조송증 및 기타 골질환 등의 발병 예방을 할 수 있다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] I형 골다공증 모델 동물의 골량 등의 변동 검토
(1) 실험 동물
4주령 암컷 Slc;ddY 계통 마우스(일본에스엘시(주))의 난소 적출 수술을 실시하여, I형 골다공증 모델 동물로 사용했다. 또한, 수술에 의한 수술의 영향을 배제하기 위해 난소를 적출하지 않는 수술(위(僞)수술)만하는 군(Sham군)을 두었다. 상기 동물은 노화에 의한 골다공증의 모델 동물이다.
사육실을 12시간 명암 순환하고, 온도 23 ± 3 ℃, 습도 55 ± 5 %로 유지하고 사육 케이지는 TP-102(동양 이공(주) 제)를 이용해 4 마리/1 케이지로 사육했다. 바닥 깔개의 교환은 주 2회 실시, 항상 깨끗한 바닥 깔개를 사용했다. 사료로 CRF-1(오리엔털 효모공업(주) 제) 사용하고 식수는 이온 교환수를 자유 섭취시켰다. 실험기간 동안 주 2회 체중을 측정했다.
(2) 시험 물질의 제조
(2 - 1) 목련 유래 화합물의 원유 정제
중국 산시성 목련(코부시(M. praecocissima) 유래) 10 kg에 메탄올 35 L를 넣어 담그고, 4 ℃에서 7일간 추출했다. 고형물을 정제하고 정제물을 얻은 후, 증발기를 사용하여 상기 정제물 전체를 농축하고 조추출액을 얻었다.
그런 다음에 조추출액을 5 L의 분별깔때기에 넣고 여기에 2 L의 물/에틸아세테이트(1/1)을 넣고 흔들어 분별추출했다. 얻은 에틸아세테이트 상을 증발기에서 농축하여 다른 5 L의 분별깔때기에 넣어 2 L의 수분 메탄올(함수율 10%)/헥산을 추가하여 다시 분별 추출했다.
여기에서 얻은 수분 메탄올 상을 증발기에서 농축한 다음 조건에서 컬럼크로마토그래피를 실시했다. 용출은 하기의 용리액을 이용한 단계식 구배 방법으로 각각의 조성의 용리액에 해당하는 분획을 얻었다(1 분획 = 2,000 mL). 여기에서 얻은 30 %와 50 % 에틸아세테이트 분획물은 목련 조정제물이다.
컬럼: 400g의 실리카겔(BW-820MH, 후지 시리시아 화학 (주) 제)를 직경 9 cm x 길이 50 cm 오픈 컬럼에 충전한 것이다.
용리액: 에틸아세테이트/헥산(10/90, 20/80, 30/70, 50/50, 70/30)
에틸아세테이트/헥산= 30/70 및 50/50 용출 분획에 침전물(결정)이 석출되기 때문에 결정을 정제했다. 얻은 침전물의 무게는 24.5 g이었다.
(2 - 2) 석출된 결정의 분석
상기와 같이 얻어진 침전물을 LC-NMR에서 공지의 방법으로 분석했다. HPLC의 조건은 다음과 같다. 또한, 화합물의 구조 결정을 위하여, 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼 데이터를 측정했다. 또한, 선광도를 측정하고 구조 분석을 실시했다.
HPLC 장치: LC-8020 (토소(주) 제)
검출기: UV-8011
컬럼: Cholester waters φ4.6 x 250 mm(나카라이 테스쿠(주) 제)
용출 용매: 50 % 아세트니트릴/ 50 % 물
용질 온도: 실온
용질 농도: 1 mg/mL
주입 부피: 2 μL
유속: 1 mL / 분
검출 파장: UV 215 nm
NMR의 조건은 하기와 같다.
NMR 장치: JNM-AL-400 : FT NMR (400 MHz, 일본 전자(주) 제)
용매: 중 클로로포름(CDCL3)
1H NMR 스펙트럼의 결과를 도 1에, 13C NMR 스펙트럼 결과를 도 2에 각각 나타내었다. 상기의 NMR 스펙트럼 데이터 및 선광도 데이터가 공지된 파르게신 스펙트럼 데이터와 일치했기 때문에(비특허문헌 2) 얻어진 화합물을 파르게신로 결정했다. 순도는 98 %였다.
(3) 시험 방법 - 시험 물질의 투여
(3 - 1) 시험 물질의 제조
파르게신의 실험 동물에 투여량이 20 mg/kg 체중/일, 또는 100 mg/kg 체중/ 일이되도록, 4 % 디메틸설폭시드(이하 DMSO 이라 한다) 및 4 % TWEEN80(모두 와코준야쿠(주) 제)를 포함하는 수용액(이하「TD 」용액이라 한다.) 30 mL에 녹여 파르게신 용액으로 했다.
β-에스트라 디올(와코준야쿠(주) 제)의 투여량이 100 μg/kg 체중/일이되도록 2 % DMSO를 포함하는 수용액 30 mL에 용해하여 β-에스트라 디올을 용액으로 했다.
(3 - 2) 투여
상기 수술 후 5일간 순화하여 사육한 다음 Sham군, 음성 대조군, 양성 대조군 및 시험 물질 투여군으로 나누었다(1군 6마리). 음성 대조군, 양성 대조군 및 시험 물질 투여군은 상술한 바와 같이 난소 적출 마우스를 사용했다.
Sham군 및 음성 대조군(이하 NC군이라 한다.)은 4 % DMSO를 포함하는 수용액을 상기 위(僞)수술 마우스에 3 개월 동안 매일 경구 투여했다. 양성 대조군에는 β-에스트라 디올 용액을 100 μg/kg 체중/일(이하「B100군」이라 한다.)에서 상기 난소 적출 마우스에 3 개월 동안 매일 복강내 투여했다. 실험군은 파르게신 용액을 20 mg/kg 체중/일(이하「F20군」이라 한다.) 또는 100 mg/kg 체중/일(이하「F100군」이라 한다)에서 상기 난소 적출 마우스에 3 개월 동안 매일 경구 투여했다.
(4) 골에 대한 영향 검토
(4 - 1) 골 시료의 제조
파르게신이 골에 미치는 영향을 검토하기 위해 큰 장골인 대퇴골을 사용하기로 하였다.
각 군의 마우스를 에테르 마취하에 경추탈구법에 따라 죽인 후 오른쪽 대퇴골 근육별로 적출했다. 적출 후 대퇴골에서 근육을 떼어 적출한 각 군의 마우스 골 길이것을 측정하고 70 % 에탄올에 담가 고정시켰다.
(4 - 2) 골밀도 등의 측정
골의 모식도를 도 3A에 나타낸다. 장골(관모양 골)은 굵고 둥근 양단부(골단)와 가늘고 길어진 중앙부(골격)를 가진다. 골은 골단과 골간과의 사이에 있는 판 모양의 골단 연골(성장판)의 성장에 따라, 장축 방향으로 신장한다. 말초 성장판에서 1 mm 근위 측의 영역(골단)을 측정 부위로 했다.
peripheral quantitative computed tomography(pQCT, XCT Reserch SA +, Stratec Medizintechnik GmbH 제, (주) 머크 코퍼레이션)를 이용하고, 골밀도 등을 측정했다(도 3B). 측정은 diameter 90 mm, voxel size 0.12 mm, CT speed 10 mm/sec, block 수 1의 조건하에서 실시했다. 단층 화상 전체(조골 영역)의 골염량 (mg/mm), 골밀도(mg/cm3), 골단면적(mm2)을 요구했다.
여기서, 「골량」은 골염량과 단백성 기질량과의 합계이다. 상기 골염량을 골의 단면적으로 나눈 값이, 단위 부피당 골염량(골밀도)가 된다.
다음에, 해면골 영역을 추출(peel mode 20)하고, 골염량(mg/mm), 골단면적(mm2), 골밀도(mg/cm3)를 요구했다. 피질골에 대해서는 골염량(mg/mm), 골밀도(mg/cm3), 골단면적(mm2), 골두께(mm), 피질골 외막 주위 길이(mm), 피질골 내막 주위 길이(mm)를 요구했다.
(4 - 3) 골강도의 측정
상기 pQCT를 이용하여 측정한 골의 직경과 골밀도를 바탕으로, SSI를 산출했다. SSI는 Polar SSI(극좌표 비틀림 강도), X-axis SSI(X축 강도, 3점상 굴곡 강도) 및 Y-axis SSI(Y축 강도, 3점 옆굴곡 강도)로 구성되며, 하기에서 일반식으로 나타낸다.
SSI = Z x CBD / ND
여기서 Z는 단면 계수(mm3), CBD는 피질골 밀도(mg/cm3), ND는 생리적 골밀도(1200 mg/cm3)이다. 또한, 단면 계수 Z는 하기의 일반식으로 나타낸다.
Z = (router 4 - rinner 4) / router x π / 4
router; 외경(mm), rinner; 내경(mm)
측정 부위는 상기와 같다. 근위골단으로부터 원위골단에 이르는 방향을 극좌표(Polar) 방향, 몸축으로부터 멀어지는 수평방향을 X축 방향, 연직 아래쪽 방향을 Y축 방향으로 했다(도 3A 및 B). 극좌표 비틀림 강도, X축 강도 및 Y축 강도를 각각 산출했다. 얻어진 측정 데이터의 해석에는 Makejob(Stratec Medizintechnik GmbH., Germany)를 이용했다.
(5) 시험 결과
(5 - 1) 체중 변화
각 군의 마우스 체중은 4주령시 평균 19.8 ~ 21.2g, 8주령시 평균 29.2 ~ 31.5g, 12주령시에는 거의 성숙해 평균 32.1 ~ 36.4g이었다. B100군의 평균 체중은 생육 기간 중 NC군에 비해 낮은 값을 나타냈지만, F20군 및 F100군의 평균 체중은 생육 기간 중 NC군과 같았다.
(5 - 2) 조골에 대한 영향
조골, 해면골, 피질골(치밀골)로 나누어, 골염량, 골단면적 및 골밀도의 변화를 검토했다. 결과를 표 1-2 및 도 4-5에 나타낸다. 표 중 하단의 숫자는 Sham군을 100으로 했을 때의 상대 값이다. Dunnet 양측 t 검정 데이터의 통계 처리를 실시하여, 유의차의 유무를 판정했다. 표의 각 값은 평균 ± 표준 오차(SE)로 나타냈다. 표 3 이후도 마찬가지였다.
조골에 비교하면 Sham군에 비해 NC군의 골밀도가 유의하게 감소하고, 골염량도 Sham군(3.270 ± 0.234 mg/mm)에 비해 감소했다(2.252 ± 0.239 mg/mm). 또한, 골단면적에서는 유의한 차이가 없었지만, Sham군 5.100 ± 0.266 mm2에서 4.558 ± 0.169 mm2으로 약 10 % 작아지고 있었다. 이 때문에 자궁 적출 마우스가 I형 골다공증 모델 동물이 될 수 있는 것으로 나타났다.
한편, B100군은 Sham군에 비해 골염량과 골밀도가 크게 증가하고(골염량 3.325 ± 0.203 mg/mm), 골다공증의 예방 효과를 보였다(표 1 및 도 4 ~ 5).
F20 군에서는 골염량(3.638 ± 0.164 mg/mm) 및 골밀도뿐 아니라 골단면적 (5.643 ± 0.152 mm2)에서도 유의 한 증가를 보였다. F100 군에서도 마찬가지로 골염량(3.660 ± 0.326 mg/mm) 및 골밀도뿐 아니라 골단면적 (5.550 ± 0.351 mm2)에서도 유의한 증가를 볼 수 있어 골의 성장을 촉진하고 있는 것으로 나타났다.
골밀도(mg/cm2) 조골 해면골
Sham 639.450±20.653(100) 350.750±24.892(100)
음성대조군 NC 488.460±32.809##(76.4) 216.080±26.302(61.6)
양성대조군 B100 652.025±28.386*(102.0) 399.050±53.851(113.8)
실험군
 F20 644.367±20.387**(100.8) 431.283±30.506*(123.0)
F100 653.300±29.083**(102.2) 460.500±36.222**(131.3)
# : Sham 대해 p <0.05, # # : Sham 대해 p <0.005
* : NC 대해 p <0.05, ** : NC 대해 p <0.005
다음에 이하에 나타내는 골의 영역에 대한 β-에스트라 디올 및 파르게신의 영향을 검토했다.
(5 - 3) 해면골 영역에 대한 영향
Sham군(골염량 0.633 ± 0.077 mg/mm 골단면적 1.787 ± 0.091 mm2 골밀도 350.750 ± 24.892 mg/cm3)과 비교하면, NC군은 골염량이 0.354 ± 0.057 mg/mm 골단면적 1.606 ± 0.058 mm2 및 골밀도가 216.080 ± 24.892 mg/cm3되어 조골과 같은 경향을 나타냈다. B100군의 골염량은 0.725 ± 0.110 mg/mm 골밀도가 399.050 ± 53.851 mg/cm3와 NC군에 비해 증가하는 경향이 있었지만, 유의차는 없었다.
반면 F20군에서는 골염량은 0.855 ± 0.067 mg/mm 골밀도가 431.283 ± 30.506 mg/cm3, F100 군에서는 골염량은 0.920 ± 0.102 mg/mm 골밀도가 460.500 ± 36.222 mg/cm3 하면 NC군에 비해 골밀도와 골단면적 값이 유의하게 상승하고 있어(표 2 및 도 4-5), 파르게신이 난소 적출에 의해 감소할 해면골의 골염량을 유지해 골밀도를 높일 것으로 나타났다.
(5 - 4) 피질골 영역에 대한 영향
Sham군에서는 골염량이 2.192 ± 0.180 mg/mm 골단면적이 2.477 ± 0.182 mm2 골밀도가 882.083 ± 12.665 mg/cm3 골두께가 0.361 ± 0.023 mm였다. 이에 대해 NC군은 골염량이 1.150 ± 0.246 mg/mm, 골단면적이 1.390 ± 0.277 mm2 골밀도가 826.540 ± 11.518 mg/cm3, 골두께가 0.206 ± 0.040 mm로 어느 값도 유의하게 감소했다. 특히, 골염량, 골단면적 및 골두께가 크게 감소하고, 피질골 얇으며, 취성이있는 것으로 나타났다.
반면 B100군에서는 골염량이 2.163 ± 0.230 mg/mm 골단면적이 2.4825 ± 0.230 mm2, 골밀도가 867.475 ± 13.724 mg/cm3, 골두께가 0.365 ± 0.038 mm로 NC군에 비해 어느 값도 크게 상승하고 있어, β-에스트라 디올은 피질골 약화의 예방 효과가 높은것으로 나타났다.
한편, F20군에서는 골염량이 2.087 ± 0.160 mg/mm, 골단면적이 2.427 ± 0.185 mm2, 골밀도가 859.483 ± 2.479 mg/cm3, 골두께가 0.329 ± 0.026이고, NC군에 비해, 골염량, 골밀도 및 골단면적 값이 유의하게 상승했다. 또한, F100군에서도 골염량이 2.240 ± 0.320 mg/mm, 골단면적이 2.640 ± 0.361 mm2, 골밀도가 843.55 ± 8.714 mg/cm3 골두께가 0.370 ± 0.051이고, NC군에 비해, 골염량, 골밀도 및 골단면적 값이 유의하게 상승했다.
이것으로부터, 파르게신이 β-에스트라 디올과 동일한 정도의 피질골 약화의 예방 효과를 가지는 것이 밝혀졌다. 또한, 피질골 외막 주위 길이 및 피질골 내막 주위 길이에 대해서는 β-에스트라 디올보다도 파르게신의 효과가 높은 경향을 나타났다(표 2).
피질골
 골밀도(mg/cm2) 골두께(mm) 피질골
외막주위 길이(mm)		 피질골
내막주위 길이(mm)
Sham 882.083±12.665(100) 0.361±0.207
(100)		 7.9930±0.207
(100)		 5.727±0.181
(100)
음성
대조군		 NC 826.540±11.518##(93.7) 0.206±0.040#
(57.1)		 7.5608±0.139
(94.6)		 6.301±0.119
(110.0)
양성
대조군		 B100 867.475±13.724*(98.3) 0.365±0.038*
(101.1)		 7.9895±0.096
(100)		 5.699±0.229
(99.5)
실험군 F20 859.483±2.479*(97.4) 0.329±0.026
(91.1)		 8.4160±0.116*
(105.3)		 6.347±0.160
(110.8)
F100 843.55±8.714*(95.6) 0.370±0.051*
(102.5)		 8.3300±0.278*
(104.2)		 6.010±0.313
(104.9)
# : Sham 대해 p <0.05, # # : Sham 대해 p <0.005
* : NC 대해 p <0.05
(5 - 5) 골강도
Sham군에서는 극축 강도(극좌표 강도)가 1.599 ± 0.143 mm3인 것인 반면, NC 군에서는 1.145 ± 0.129 mm3이며, 골강도 지수가 하락했다. 한편, B100군에서는 1.376 ± 0.088 mm3이며, NC군보다 낮은 경향이 있었지만 유의차는 없었다.
이것에 대해, F20군에서는 1.615 ± 0.090 mm3, F100군에서는 1.666 ± 0.087mm3이며, NC군에 골강도 지수의 값이 유의하게 상승했다(표 3).
이상에서, 파르게신은 β-에스트라 디올보다도 골강도 지수를 크게 증가 시키는 것으로 나타났다. 이것은 난소 적출로 인한 골의 약화를 파르게신이 효과적으로 예방하는 것을 나타낸 것이다.
극축골강도(mm5)
음성대조군 Sham 1.265±0.147(71.6)#
NC 1.601±0.107(86.1)
양성대조군 B100 1.946±0.107(101.0)*
실험군
 F20 2.005±0.154(104.2)**
F100 1.265±0.147(71.6)#
# : Sham에 대해 p <0.05
* : NC에 대해 p <0.05, ** : NC에 대해 p <0.005
[실시예 2] 기관 배양 시험
(1) 골의 기관 배양
이글 최소 필수 배지(MEM, 라이프 테크놀로지스 재팬(주)(인비토로젠)), 1 % 페니실린/스트렙토 마이신(라이프 테크놀로지스 재팬(주)(기브코)), 0.25 % 소 태아 혈청(시그마 알드리치 재팬(주)), 50 μg/ml 아스코르빈산 (와코 순약공업(주)), 1 mMβ-글리세로 인산(시그마 알드리치 재팬(주)) 및 1 μg/ml 칼세인(시그마 알드리치 재팬(주))을 첨가한 배지를 제조하고, 기관 배양용 배지로 했다. 이 기관 배양용 배지에 시험 물질로, 0.3 μM의 파르게신 또는 대조군으로 DMSO(와코 순약공업(주))을 최종 농도가 0.3 %가 되도록 첨가했다. 파르게신 실시예 1에서 제조한 것을 사용하고, 최종 농도로 0.3 %의 DMSO를 포함한다.
임신 15일째의 여성 ICR 마우스(일본 에스엘시(주)에서 구입)에서 제왕 절개하여 태아를 꺼냈다(E15.5). 꺼낸 태아의 좌우의 종족골를 적출하여 상기의 기관 배양용 배지에 넣었다. 5 % CO2, 온도 37 ℃의 조건에서 7일간의 기관 배양을 실시하고, 골의 타원에 있어 가장 긴 직경 방향의 신장에 대한 영향을 관찰했다.
(2) 관찰 방법 및 시험 결과
골의 장축은 골단과 골간 사이에 있는 판 모양의 골단 연골의 성장에 따라 신장한다. 그리고 골단 연골의 성장이 정지하면, 연골 세포의 주위 기질에 칼슘염이 침착하고 연골 중의 골원기에 있는 골화 중심으로부터 석회화가 발생한다(골화). 이 석회화 부위를 칼세인으로 형광 염색하고 현미경으로 관찰했다. 관찰상을 도 7에 나타낸다.
중족골이, 상기의 배지 중에서 골의 장축방향으로 신장하고 있는 것이, 칼세인의 형광에 의해, 석회화 부위의 증가로 관찰되었다. 파르게신 무첨가 음성 대조(0.3 % DMSO 첨가)에 비해 0.3 μM의 파르게신을 첨가한 경우, 중족골은 세로 방향에 의해 길게 신장하고 있었다. 이상의 결과로부터 파르게신은 조직 중 농도로 0.3 μM 정도 있으면 골신장을 촉진하는데 충분한 것으로 나타났다.
[실시예 3] 공존 배양에 의한 조골세포의 분화 및 파골세포의 분화에 미치는 영향
(1) 실험세포의 제조
4주령의 수컷 ddY 마우스(일본 에스엘시(주))를 경추 탈구에 의해 죽인 후 좌우 하지 장골을 근육마다 적출했다. 적출한 골에 붙어 있던 근육을 제거하고, 대퇴골 및 경골을 얻었다. 얻은 대퇴골 및 경골의 양골단을 조금씩 잘라 떨어뜨려, 바늘이 있는 2.5 ml 주사기(22G × 1 1/4; 데루모(주))를 사용하여 골수중의 세포를 하기에서 설명하는 배지의 안으로 밀어 넣었다. 그리고 필터(70μm Nylon Cell Strainer; 일본 벡톤 디킨슨(주))를 통해 이물질을 제거하고 2 x 108 cells 이상의 BMCs을 얻었다. 골아 모양 세포인 UAMS-32 세포는 이화학 연구소(일본)에서 구입했다.
(2) 배지의 제조
10.2g의 α-MEM(분말, 라이프 테크놀로지스 재팬 (주)(GIBCO) 제)를 1 L의 증류수에 용해하여 탄산수소나트륨 2.2 g/l (w/v)를 추가하여, 구멍의 지름 0.22μm의 멸균 필터(일본 미리포아(주))를 사용하여 여과했다. 또한, 10 %(v/v)의 소태아혈청(FBS)(Sigma, 56 ℃에서 30 분간 가열비동화제)를 추가하여, 이것을 기본 배지로 했다.
본 실시예에서는 상기 배지에 1 μM의 PGE2 및 10 nM의 비타민 D3(모두 와코 순약공업(주) 제)을 더해 공존 배양용 배지를 제조했다. 공존 배양용 배지를 사용하여 상기와 같이 얻은 BMCs과 UAMS-32의 현탁액을 제조했다. 실험군은 2 ~ 80 μM의 파르게신을 음성 대조군에는 최종 농도 0.3 %이 되도록 DMSO를 더했다.
(3) 배양
BMCs는 2 x 106 cells/well, UAMS-32 세포는 1 x 105 cells/well로 96 웰 플레이트의 각 웰에 파종하여 상기의 공존 배양용 배지에서, CO2 농도 5 %, 온도 37 ℃의 조건에서 5일간 공존 배양했다. 배지 교환은 배양 3 일째에 갈았다. 아래와 같이 세포를 고정한 후, 골아세포의 분화 지표로서 알칼리포스파타제(ALP; Alkaline phosphatase)의 활성을 측정하고 파골세포의 분화 지표로서 주석산염 내성산성 인산가수분해효소(TRAP; Tartrate- resistant acid phosphatase)의 활성을 측정했다.
(4) 파골세포의 분화에 미치는 영향 검토
상기의 조건에서 세포를 배양하고, 각 웰에 10 % 포르말린 수용액을 넣어 10 분간두고, 그 다음에 에탄올을 첨가하여 1 분간 방치하고 세포를 고정했다. TRAP 활성을 측정하기 위해서, 1.36 mg/ml p-니트로 페닐인산2나트륨(시그마 알드리치 재팬(주) 제)을 포함한 10 mM 주석산 나트륨/ 50 mM 구연산 완충액(pH 4.6)을 TRAP 기질 용액으로 제조하였다.
상기의 TRAP 기질 용액을 100 μl/웰에 더해 15 ~ 20 분 동안 실온에서 반응시켰다. 미리 100 μl/웰에서 0.1N NaOH를 추가해둔 다른 96 웰 플레이트에 반응 액을 옮기고 반응을 중지하여, 405 nm의 흡광도를 측정했다.
또한, 0.1 mg/ml Naphthol AS-MX phosphate(sigma N-4875) 및 0.6 mg/ml Fast red violet LB salt(모두 시그마알드리치재팬(주) 제)를 포함하는 50 mM 주석산 나트륨/ 0.1M 초산나트륨 완충액(pH 5.0)을 제조하고 TRAP을 염색액으로 했다. 이 TRAP 염색액을 첨가하여 실온에서 음성 대조군의 세포가 적색이 될 때까지 반응시킨 후, 증류수로 세척했다. 염색에 의해 붉게 물들었고, 핵이 3 개 이상 존재하는 세포를 다핵파골세포로 판정하고, 그 세포 수를 현미경으로 계산했다.
(5) 골아세포 분화 시험
상기의 조건에서 세포를 배양한 후 -20 ℃의 메탄올을 100 μL/웰에 넣고 1 분간 정치하여 세포를 고정했다. 2.47 mg/ml 4-니트로페닐인산나트륨염6수화물 시그마알드리치재팬(주) 제), 2 mM MgCl2, 0.1M Tris-HCl(pH 8.5)를 포함한 ALP 기질 용액을 제조했다.
ALP 기질 용액을 100 μL/웰에 더해 15 ~ 20 분, 실온에서 반응시켰다. 다음 100 μL/웰에서 0.1 N NaOH를 추가해 둔 다른 96 웰 플레이트에 반응액을 옮겨 반응을 중지하고 405 nm에서 측정한 흡광도를 ALP 활성의 지표로 했다.
또한, 0.1 mg/ml Naphthol AS-MX phosphate 0.02 %(v/v) N,N-디메틸 포름 아미드 0.6 mg/ml Fast blue BB salt(sigma F-3378, 시그마 알드리치 재팬(주) 제), 2 mM MgCl2를 포함하는 0.1 M Tris-HCl(pH 8.5)을 제조하고 ALP 염색액으로 했다.
이 ALP 염색액을 첨가하여 실온에서 음성 대조군의 세포가 청자색을 나타낼때까지 반응시킨 후, 세척을 실시했다. 염색의 강도를 육안으로 판별하여, ALP의 활성화를 판정했다.
(6) 통계 처리
모든 데이터는 SPSS(등록 상표) Statistics 17.0 + Amos 17.0 (에스·피· 에스·에스(주) 제)를 사용하여 통계 분석하고, 평균치 ± 표준 오차(SEM)로 표기했다. 검정에는 Dunnet의 양쪽 t검정을 이용하여 위험률은, 실험군과 음성 대조군과의 비교에서 ** : p <0.005, * : p <0.05 했다. 각 군의 측정수는 3 이상이었다.
(7) 결과
(7 - 1) ALP 활성 및 TRAP 활성
상기와 같이하여 얻은 흡광도를 음성 대조 100 %로 했을 때의 활성비로 나타내었다. 음성 대조군에 대해 2 ~ 80 μM의 파르게신을 더한 군에서는 파르게신 농도에 의존하여 ALP 활성은 상승했지만, TRAP 활성은 반대로 감소하였다(표 4 및 도 8A). 특히, 60 ~ 80 μM의 파르게신을 첨가한 군에서는 ALP 활성의 유의한 상승과 TRAP 활성의 유의한 감소를 볼 수 있었다(표 4 및 도 8A). 이것은 조골세포의 분화 촉진 및 파골세포의 분화의 억제가 일어나고 있는 것을 나타낸다.
농도(μM) ALP활성(%) TRAP활성(%)
0 100.0 100.0
2 112.6±15.7 89.5±5.4
6 119.8±10.1 88.7±7.2
20 145.6±14.4 8.57±4.4
60 164.3±14.0** 42.4±7.1**
80 198.9±14.6** 35.7±5.6**
** : 처리되지 않은 세포에 대한 p <0.005
(7 - 2) ALP·TRAP 이중 염색
음성 대조군에서는 붉게 물든 세포(파골세포)와 푸르게 물든 세포(조골세포)의 모두가 관찰된 반면, 60 ~ 80 μM의 파르게신을 첨가한 군에서는 파골세포가 분화한 세포는 거의 볼 수 없었다(도 8B).
이상의 관찰 결과보다, 파르게신은 조골세포를 활성화하는 한편, 조골세포에 의한 파골전구세포에서 파골세포로의 분화 촉진을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 골흡수의 증가와 골 형성의 감소 모두 효과적으로 억제하고 골의 재구성 균형을 개선하는데 파르게신의 뛰어난 기능을 나타내는 것이다.
[실시예 4] 조골세포 활성화에 대한 영향 검토
(1) 실험세포 및 배양 조건
마우스 태아 두개골 세포 유래의 조골세포모양 세포주인 MC3T3-E1 세포((독일) 이화학 연구소에서 입수)를 4,000 cells/well로 96 웰 플레이트에 파종했다. 상기 실시예 3에서 제조한 기본 배지에 상기 실시예 1에서 제조한 파르게신을 최종 농도로서 2 ~ 80 μM에서 첨가한 배지를 사용했다. 5 % CO2, 37 ℃의 조건에서 2 일간 기본 배지만을 사용하여 전 배양 하였다. 이후, 파르게신 첨가 배지와 오래된 배지와 교환하고 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 3 일간 배양하였다. 배양 4 일째에 새로운 파르게신 첨가 배지에 오래된 배지를 교환하고 5 % CO2, 37 ℃의 조건에서 또한 3 일간 더 배양했다. 배양 종료 후 하기와 같이 MTT 시험 및 ALP 활성 측정 및 염색을 실시했다.
(2) 세포 생존율 측정
세포 생존율은 MTT 시험에 의해 측정했다. MTT 시약은 50 mg의 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide를 10 ml의 PBS(-)로 용해하여 만들었다. 배양 종료 후, 파르게신을 함유하는 배지의 일부를 각 well에서 제거하여 배지의 액량을 100 μL에 맞췄다. 여기에 10 μl의 MTT 시약을 추가, CO2 인큐베이터 안에서 청자색을 나타낼 때까지 반응시켰다. 반응 종료 후 각 웰에서 배지를 모두 제거하고, 용해 용액으로 DMSO를 각 well에 100 μl 씩 넣고 570 nm의 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 조사했다.
ALP 활성의 측정 및 데이터의 통계 처리 및 분화한 세포의 관찰은 파골세포의 염색을 생략한 것을 제외하고 실시예 3과 같게 하였다.
(3) 시험 결과
ALP 활성 및 세포 생존율은 모두 음성 대조를 100으로 했을 때의 상대값으로 표 8에 나타내었다.
음성 대조군에 대해 2 ~ 80 μM의 파르게신 첨가군에서는 세포 생존율에 유의 한 차이는 보이지 않았다(표 5 및 도 9A). 한편, 60 ~ 80 μM의 파르게신 첨가 군에서는 음성 대조군에 세포 생존율이 감소하는 경향을 보였다. 반대로, ALP 활성은 유의하게 상승했다(표 5 및 도 9A). 또한, 60 ~ 80 μM의 파르게신를 첨가 한 경우, 파랗게 물든 조골세포가 다수 관찰되었다 (도 9B).
농도(μM) ALP활성(%) MTT활성(%)
0 100.0 100.0
2 82.8±8.0 106.1±3.2
6 98.8±9.8 105.4±3.3
20 99.8±13.4 100.0±3.4
60 179.8±31.5* 89.1±3.9
80 167.3±32.7* 92.6±3.7
* : 처리되지 않은 세포에 대해 p <0.005
이상의 관찰 결과보다 파르게신은 조골모양세포의 생존에 영향을 주지 않는 수준의 농도에서도 조골모양세포를 활성화하고 조골세포의 기능을 촉진하는 것이 분명해졌다. 이것은, 파르게신이 생체에 부작용을 주지 않고, 조골세포의 기능을 촉진할 수 있는것 및 파르게신이 골 형성 촉진제로 유용한 것을 나타낸다.
[실시예 5] 조골세포의 석회화에 대한 영향 검토
(1) 실험세포 및 배양 조건
실시예 4와 동일한 MC3T3-E1 세포를 사용했다. 또한, 상기 실시예 3의 기본 배지에 50 μg/ml의 L-아스코르빈산 및 10 mM의 β-Glycerophosphate(모두 시그마 알드리치 재팬 (주) 제)를 더한 것을 사용했다. 실험군에는 실시예 1에서 제조한 파르게신을 2 ~ 80 μM로 첨가했다.
MC3T3-E1을 4,000 cells/well로 96 웰 플레이트의 각 웰에 파종하고 5 % CO2, 37 ℃의 조건에서 2일간 기본 배지만으로 전 배양을 실시했다. 그 후, 상기의 50 μg/ml의 L-아스코르빈산, 10 mM의 β-Glycerophosphate 및 파르게신을 포함 배지로 교체하고, 5 % CO2, 37 ℃의 조건하에서 5 일간 배양했다. 그 후, 새로운 파르게신 첨가 배지로 교체하고 5 % CO2, 37 ℃의 조건에서 더 5 일간 배양했다. 배양 종료 후, 파골세포의 염색을 생략한 점을 제외하고, 실시예 3과 동일하게하여 ALP 활성 측정 및 분화한 세포의 관찰을 실시했다.
또한, 미네랄 침착은 통상의 방법에 따라 1 % 알리자린 레드(와코 순약공업(주))에 의해 염색을 하고 골의 석회화로 관찰했다.
(2) 결과
ALP 활성은 음성 대조군을 100으로 했을 때의 상대 값으로 표 6에 나타냈다.
음성 대조군에 대해 60 ~ 80 μM의 파르게신을 첨가한 군에서 유의하게 ALP 활성이 상승했다(표 6 및 도 10A). 60 ~ 80 μM의 파르게신을 첨가하면 파랗게 물든 조골세포가 다수 관찰되고 ALP 활성도 높았다(도 10B). 또한 60 ~ 80 μM의 파르게신을 첨가한 경우, 붉게 물든 미네랄 침착 부위, 즉 석회화 부위의 증가도 관찰되었다(도 10C).
농도(μM) ALP활성(%)
0 100.0
2 93.3±2.6
6 92.8±1.6
20 107.0±3.8
60 173.3±13.7**
80 171.5±12.2**
** : 처리되지 않은 세포에 대해 p <0.005
이상의 결과로부터 파르게신은 조골세포의 성숙과 석회화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 파르게신이 골의 역학적 구조의 형성을 조골세포의 활성화에 의해 촉진하는 것을 나타낸다. 또한, 실시예 3 ~ 5 관찰 사실은 실시예 1 ~ 2 중에 나타난 파르게신의 생체에 대한 효과가 세포내의 분자 메커니즘에 의해 뒷받침된 결과인 것을 나타낸다.
[실시예 6] 난소 적출 마우스 (OVX 마우스)을 이용한 Fargesin 골 형성 평가
(1) 실험 동물
4주령 여성 Slc; ddY 계통 마우스(일본 에스엘시(주))를 구입하고, 순화 사육을 하지 않고 8군으로 나누어(1 군 6 마리), 솜노펜틸(펜트바르비타르나트리움)을 50 mg/kg로 복강내 투여하여 마취하고, 마취하에서 난소 적출 수술(이하「OVX」라한다) 또는 위(僞)수술(이하 「Sham」이라 한다.)을 실시했다.
순화 사육을 실시하지 않았던 것은, 동물의 성장에 따른 백색 지방조직량 증가에 의한 시술 실수를 방지하기 위한 것이다.
(2) 시험 방법-시험 물질의 투여
각 군은 난소 적출 수술(또는 위(僞)수술)의 2일 후부터, 골흡수를 유도하기 위한 기간으로 2개월 동안 명암 12 시간, 온도 23 ± 3도, 습도 55 ± 5 %의 조건에서 사육을 실시했다. 바닥 깔개의 교환은 주 2회 실시, 항상 깨끗한 바닥 깔개를 사용했다. 사료는 CRF-1(오리엔털 효모공업(주))로, 먹는 물은 이온 교환수를 각각 자유롭게 섭취시켰다.
시험 시작 2개월(유도 기간) 경과 후 3개월 동안 각 군마다 하기 표 7에 표시된 양으로 각 시료를 매일 투여했다.
실시예 1에서 얻은 90 % MeOH 분획(목련)과 파르게신(이하 「Far」라고 생략할 수 있다.)를 TD 용액에 하기 표 7에 나타내는 농도가 되도록 용해하고 경구 투여 했다.
인간 PTH(1-34)(이하 「hPTH(1-34)라고 기재할 수 있다.)은 증류수에 80 μg/kg/day가 되도록 용해하고 피하에 투여했다.
투여군명 투여한 시료
투여 경로 투여 기간
ShamOVX TD 용매만 p.o. 유도 기간 경과 후 3 개월 투여
control OVX TD 용매만 p.o. 전술
인간PTH(1-34) 80 μg/kg/day s.c. 전술
목련 90 % MeOH 분획
40 mg/kg/day 		p.o. 전술, Fargesin 함량은 파르게신 2mg/kg/day 투여군과 동일
Far 2 2 mg/kg/day p.o. 전술
Far 20 20 mg/kg/day p.o. 전술
Far 40 40 mg/kg/day p.o. 전술
(3) 골에 대한 영향 검토
(3 - 1) 골 시료의 제조
투여 3개월째에 전군의 마우스 체중 측정을 실시하여 디에틸 에테르 마취하에 심장 채혈하고 치사시켰다. 이후, 자궁, 백색지방조직(WAT), 갈색지방조직(BAT), 간, 비장 및 좌우의 다리를 적출했다. 좌우의 다리는 대퇴골과 경골로 분리하여, 70 % EtOH 안에 넣고 실온에서 저장했다.
(3 - 2) 골밀도 등의 측정, 조직 무게 측정
얻은 대퇴골(오른쪽)에서 근육을 절제한 후, 실시예 1에서 사용한 pQCT를 사용하여 하기의 조건으로 골밀도 등을 측정했다.
＜pQCT 측정을 위한 측정 조건＞
Voxel size(mm)：0.07
윤곽의 인식(CONTMODE)：2(ROI의 자동 검색)　
PEELMODE：20
해면골의 인식 방법：면적 영역
전체 단면적에 대한 해면골 면적의 비율：35%
CORTBD에 사용한 CORTMODE：1*
CORTBD에 사용한 TH치：690
* 피질골 및 해면골을 구별하는 기준치(임계치:threshold) 이하의 Voxel를 제외했다.
또한, 각각의 조직 무게를 측정했다.
(3 - 3) 혈중 TRACP5b 및 Osteocalcin(골대사 마커)의 측정
해부시, 디에틸 에테르 마취하에 심장 채혈에서 얻은 전혈을 24 시간 4 ℃에서 저장한 후, 3,000 rpm(4,000 × g)에서 15 분간 냉각 원심하여 혈청을 얻었다.
MouseTRAPTM Assay (Immunodiagnostic Systems Ltd, 영국)의 프로토콜에 따라 얻은 혈청 TRACP5b을 정량했다.
pQCT에서 얻은 해면골의 골밀도의 모든 데이터에서 가장 높은 측정값과 가장 낮은값을 삭제하여, 중간값(Median)을 얻었다. 다른 모든 매개 변수도 이것에 따라 N=6에서 그래프를 작성했다. 또한 Dunnet 양쪽 t 검정으로 통계 분석을 실시했다.
(4) 시험 결과
(4 - 1) 체중 및 조직 무게에 대한 영향
각 군의 체중, 자궁, BAT, WAT 간 및 비장의 각 무게를 측정한 결과, 군에 따른 편향은 보이지 않았다. 또한, PTH 투여군과 Fargesin 투여군에서 자궁 무게 증가(위축 억제)는 볼 수 없었던 것에서, 이러한 화합물에는 에스트로겐 양 작용은 없다고 생각했다. 사료 섭취량(중량)도 Sham군이 OVX군에 비해 다소 많아지고 있었지만, 큰 차이는 보이지 않았다.
(4 - 2) 조골 및 해면골에 미치는 영향
골의 성장판에서 -1 mm의 위치에서 조골염량, 조골밀도, 피질골염량을 측정했다. 결과를 표 8 및 도 11A 및 11B에 나타낸다. 실험 시작 5개월 후의 시점에서 Control OVX 군에서는 Sham OVX 군과 비교하여 현저하게 조골염량 및 전 골밀도가 감소했다.
조골의 골밀도
(mg/cm3) 		해면골의 골밀도
(mg/cm3) 		피질골의 골밀도
(mg/cm3)
5M ShamOVX 525.65±59.21(100) 116.65±56.36(100) 983.95±39.93(100)
5M OVX 381.68±37.65(72.6)## 35.77±16.96(30.7)## 931.33±37.78(94.6)
hPTH(1-34) 452.25±49.00(86.0)* 88.83±30.90(76.1)** 906.50±32.19(92.2)
90%MeOH 425.33±38.64(80.9) 74.90±29.38(64.2)* 888.52±20.10(90.3)
Far 2 427.83±36.00(81.4) 64.10±25.48(54.9)* 911.65±30.15(92.7)
Far 20 437.00±49.48(83.1) 68.22±21.67(58.5)* 914.57±43.90(92.9)
Far 40 450.57±33.72(85.7)** 92.37±41.29(79.2)* 889.97±23.31(90.4)
# # : 5M Sham에 대해 p <0.05
* : 5M OVX에 대해 p <0.05, ** : 5M OVX에 대해 p <0.005
hPTH 투여군에서는 전골밀도 및 해면골 밀도가 함께 Control OVX 군에 비해 높아지고 있어, 골량이 상당한 회복이 보였다. 특히 해면골 밀도가 크게 상승했다.
도 11B에 나타내듯이 파르게신 투여군에서는 농도 의존적인 해면골 밀도의 상승을 볼 수 있어 Control OVX 군에 비해 유의하게 증가했다. 또한, 90 % MeOH 분획 투여군의 해면골의 골밀도는 Far2군보다 높고, 이 분획물에 포함된 Fargesin 다른 화합물과의 상승효과의 가능성이 시사되었다.
(4 - 3) 피질골에 대한 영향
피질골염량 및 피질골밀도도, 조골 및 해면골의 경우와 마찬가지로, Sham OVX군에 비교하여 Control OVX 군에서 유의한 감소를 볼 수 있어 피질골염량 감소가 현저했다. 조골 및 해면골의 경우와 달리, PTH를 투여해도 골량의 회복은 보이지 않았다. 또한, 파르게신 투여 및 90 % MeOH 분획의 투여에 따라 유의한 골량 회복은 보이지 않았다(표 9 참조).
피질골단면적
(mm2) 		피질골두께
(mm) 		피질골 외막
주위 길이(mm)		 피질골 내막
주위 길이 (mm)
5M ShamOVX 1.98±0.18 0.27±0.03 8.12±0.19 6.40±0.37
5M OVX 1.36±0.15 0.18±0.03 8.07±0.37 6.93±0.47
PTH 1.69±0.25 0.22±0.03 8.37±0.26 6.98±0.34
90%MeOH 1.40±0.19 0.19±0.03 7.85±0.17 6.64±0.19
Far 2 1.46±0.23 0.20±0.03 8.02±0.26 6.79±0.19
Far 20 1.48±0.18 0.20±0.03 8.04±0.55 6.78±0.68
Far 40 1.56±0.19* 0.21±0.02 8.14±0.39 6.83±0.38
* : 5M OVX에 대해 p <0.05
Sham OVX 군과 비교하여 Control OVX 군에서는 피질골외막주위 길이가 조금 감소했지만, 피질골내막주위 길이는 유의하게 증가했다. 대조적으로, PTH 투여군에서는 피질골외막주위 길이 및 피질골내막주위 길이가 모두 증가했다. 파르게신 투여군에서도 비슷한 경향이 나타났다.
골 성장은 주로 골외막층에서 활발히 행해지고 있어 피질골량의 감소는 하바스 관 확장(피질골 다공화)으로서 나타난다. 따라서 피질골외막주위 길이는 골 형성을 반영하고(생명 공학 vol. 44, No. 4 : 517-521, 2006, 동 vol. 44, No. 4 : 496-502, 2006) 피질골내막주위 길이의 증가는 골흡수를 반영하고 있다. 따라서 OVX 수술을 받은 군에서는 골흡수가 증가하고 골 형성이 감소하는 상태인 것으로 나타났다. 반면 PTH 투여군에서는 골 형성 및 골흡수가 함께 증가하는 경향이 보였지만, 골 형성이 우위이기 위하여, 골량이 증가하는 것으로 생각되었다. 파르게신 투여군에서도 마찬가지로 골 형성 및 골흡수가 함께 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다.
한편, 표 9와 같이 90 % MeOH 분획 투여군에서는 해면골 밀도는 크게 상승하고 있었지만, 골 형성과 골흡수의 증가는 보이지 않았다.
(4 - 4) 골강도(극좌표 강도)
골강도는 Sham OVX군과 비교하여 Control OVX 군에서 현저하게 감소했다. PTH 투여군과 Fargesin 투여군(2 mg 및 40 mg 투여군)에서는 Control OVX군에 비해 골강도가 유의하게 증가했다. 그러나, 90 % MeOH 분획물 투여군에서는 Control OVX군보다 높지만, 유의적 차이는 보이지 않았다 (도 12 참조).
(4 - 5) 골대사 마커
골대사 마커가되는 주석산염 내성산성 인산가수분해효소(TRACP)는 TRACP 5a 및 TRACP 5b 있고, TRACP 5a는 염증성 마크로파지에서, TRACP 5b는 파골세포에서 각각 유도되는 것으로 알려져 있다. 혈청 TRACP 5b 일주기성 변동은 낮고 그 수준은 먹이의 영향을 받지 않기 때문에 분비된 TRACP 5b는 활성보다 오히려 파골세포의 수를 나타내는 것으로 보고되고 있다(문헌명: Alatalo SL, et al, Clin Chem, 46:1751-1754 (2000), Alatalo SL, et al, J Bone Miner Res, 18:134-139 (2003), Chu P, et al, Am J Kidney Dis, 41:1052-1059 (2003), Alatalo SL, et al, Clin Chem, 50:883-890 (2004)).
혈청 중 TRACP 5b는 Sham OVX군과 비교하여 Control OVX군에서 현저하게 높은 수치를 나타냈기 때문에, Control OVX군에서는 파골세포 활성이 높고, 파골세포의 수도 많다고 생각되었다(도 13 참조).
OVX 군과 비교하여 hPTH 투여군에서는 TRACP 5b 값에 큰 변화는 볼 수 없지만, 피질골내막주위 길이와 상관 관계를 나타냈다. 90 % MeOH 분획물 투여군 TRACP 5b 값은 Far2군보다 높지만, 피질골내막주위 길이와 상관 관계를 나타냈다. 파르게신 투여군에서는 혈청 TRACP5b은 농도 의존적으로 감소하며, 40 mg 투여군에서는 유의하게 감소했다. 이것으로부터 RAW264.7를 사용한 경우의 결과와 마찬가지로 파르게신은 파골세포의 활성 및 수를 억제하는 것으로 나타났다(도 13 참조).
이상으로부터, 파르게신은 조골 및 해면골의 골밀도를 증가시키는 것으로 확인되었다. 또한, 피질골외막주위 길이 피질골내막주위 길이 및 혈청 중 TRACP 5b 활성 측정 결과보다 Fargesin은 파골세포의 활성 및 수를 억제하고 이에 따라 골흡수 기능을 저하시켜 골 형성 효과를 발휘하고 있는 것으로 나타내었다.
[실시예 7] 파르게신의 sRANKL 투여 골량 감소증마우스에 대한 유효성 평가
(1) 실험 동물
오리엔털 효모공업(주)보다 C57BL/6NCrlCrlj(6주령, 암컷)를 구매하고 7일 동안 명암 12시간 온도 23 ± 3도, 습도 55 ± 5 %의 조건에서 순화 사육을 실시했다. 2마리/케이지로, 바닥 깔개의 교환은 주 2회 실시하고, 항상 깨끗한 바닥 깔개를 사용했다. 사료는 CRF-1(오리엔털 효모공업 (주)), 먹는 물은 이온 교환수를 각각 자유롭게 섭취시켰다.
(2) 시험 방법 - 시험 물질의 투여
순화 사육 종료 후, 마우스를 무작위로 4군(1군 8마리)으로 나누어 각각 sRANKL 투여군 및 Fargesin군으로 했다. Fargesin 투여군은 0.2 mg/kg/day 투여군(이하「Far 0.2」이라 한다.), 2 mg/kg/day 투여군(이하「Far 2」이라 한다.), 20 mg/kg/day 투여군(이하「Far 20」이라 한.다)으로 했다.
모든 마우스에 시험 시작 1 일째와 2 일째 sRANKL(1mg/kg/day, i.p.)을 투여하여 골량 감소증을 실험적으로 야기시켰다.
시험 시작 4 일째 ~ 13 일째까지 증류수 또는 하기 표 10에 나타내는 실험 화합물을 각 군에 매일 투여했다.
투여군명 군명 투여 한 용액 투여 경로
대조군 RANKL RANKL RANKL 수용액 (1mg/kg/day) p.o.
hPTH 투여군 인간PTH(1-34) hPTH(1-34) 수용액 (80 μg/kg/day)
TD 용액		 s.c.
p.o.
실험물질
투여군
 Far 0.2 Fargesin의 TD 용액 (0.2 mg/kg/day) p.o.
Far 2 Fargesin의 TD 용액 (2 mg/kg/day) p.o.
Far 20 Fargesin의 TD 용액 (20 mg/kg/day) p.o.
(3) 골에 대한 영향 검토
(3 - 1) 골 시료의 제조
투여 기간 종료 후, 시험 후 실시예 6과 동일하게 대퇴골을 적출하고, 골밀도를 평가했다. 시험 동물은 투여 기간 동안 일주일에 두 번, 체중 측정 및 사료 섭취 중량을 측정했다.
실시예 6의 경우와 동일하게 실시하여 얻은 대퇴골 중 오른쪽 대퇴골 골밀도 등의 측정에 사용했다.
(3 - 2) 골밀도, 골강도, 조직 무게 측정
각 군의 체중을 측정한 결과, 군의 편향은 보이지 않았다.
골의 성장판에서 -0.6 mm의 위치에서 전체 골밀도 해면골 밀도, 피질골 밀도, 피질골외막주위 길이, 피질골내막주위 길이 및 골강도을 측정했다(도 3A 참조).
도 14A 및 14B에 나타나듯이, 파르게신의 농도 의존적으로 전체 골밀도가 유의하게 상승했다. 또한, 해면골 밀도는 파르게신의 농도에 따라 상당히 밀도가 상승했다.
골강도는 극좌표 강도(SSI)로 평가했다. 도 15에 나타내듯이, 상술한 골밀도와 마찬가지로 파르게신의 농도에 따라 강도의 향상을 볼 수 있으며 상기에서 언급한 골밀도와 마찬가지로 파르게신의 농도 의존적으로 강도가 상승하는 경향이 보였다.
이상과 같이, 파르게신은 RANKL 투여에 의한 어린 동물의 골 량에 대해서도 농도 의존적으로 골밀도를 올리는 효과를 발휘하는 것이 나타냈다.
조골의 골밀도
(mg/cm3) 		해면골의 골밀도
(mg/cm3) 		피질골의 골밀도
(mg/cm3)
RANKL 486.60±14.10(100.0) 259.91±23.32(100.0) 807.66±5.59(100.0)
Far 2 484.33±11.06(99.5) 261.64±17.92(100.7) 797.40±6.12(98.7)
Far 20 487.30±16.36(99.5) 270.30±20.64(104.0) 798.60±4.56(98.9)
Far 40 532.69±8.06(110)* 336.25±13.50(129.4)* 796.33±3.89(98.6)
*: RANKL에 대해p <0.05
[배합예]
파르게신 또는 90 % MeOH 분획을 함유하는 본 발명의 제제를 이용한 식품의 배합예는 다음과 같다. 각 배합예는 기능성 식품, 건강 식품 중 어느 것으로도 할 수 있다.
배합예 1: 츄잉껌
조성 wt %
설탕 53.0
추잉껌베이스 20.0
포도당 10.0
물엿 16.0
향료 0.5
본 발명의 조성물 0.5
합계 100.0
배합예 2: 구미
조성 wt %
환원 물엿 40.0
그래뉴당 20.0
포도당 20.0
젤라틴 4.6
물 9.7
오렌지 주스 4.0
오렌지 맛 0.7
본 발명의 조성물 1.0
합계 100.0
배합예 3: 캔디
조성 wt %
설탕 50.0
물엿 33.0
물 14.4
유기산 2.0
향료 0.2
본 발명의 조성물 0.4
합계 100.0
배합예 4: 요구르트(하드·소프트)
조성 wt %
우유 41.5
탈지 분유 5.8
설탕 8.0
한천 0.15
젤라틴 0.1
유산균 0.005
본 발명의 조성물 0.4
향료 미량
물 잔류
합계 100.0
배합예 5: 소프트 캡슐
조성 wt %
현미 배아 오일 87.0
유화제 12.0
본 발명의 조성물 1.0
합계 100.0
배합예 6: 커피 음료
조성 wt %
볶은 커피 콩 6.0
설탕 6.0
베이킹 소다 0.2
유화제 0.15
본 발명의 조성물 1.0
물 잔류
합계 100.0
배합예 7: 커피 음료(분말)
조성 wt %
인스턴트 커피 90.0
탈지유 7.0
본 발명의 조성물 3.0
합계 100.0
배합예 8: 청량 음료
조성 wt %
과당 포도당액 30.0
유화제 0.5
향료 적당량
본 발명의 조성물 1.0
정제수 잔여
합계 100.0
배합예 9: 정과
조성 wt %
설탕 76.4
포도당 19.0
자당 지방산 에스테르 0.2
본 발명의 조성물 0.5
정제수 잔여
합계 100.0
(제조예)
다음, 본 발명의 조성물을 함유하는 제조예를 나타내지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
(제조예 1 정제)
성분 사용량(g)
조성물 1 100
마니톨 123
전분 33
크로스포비돈 12
미세 결정성 셀룰로오스 30
스테아린산 마그네슘 2
합계 100.0
상기의 성분을 각각 측정하고 균일하게 혼합한 후 압축 정제 제조하여 무게 300 mg 정제를 제조할 수 있다.
(제조예 2 경질 캡슐)
조성 사용량(g)
조성물 1 40
유당 150
전분 70
폴리비닐피로리돈 5
결정성 셀룰로오스 35
상기의 성분을 각각 측정하고 균일하게 혼합한 후 경도 캡슐 300 mg 씩 충전하면 경질 캡슐을 제조할 수 있다. 여기서 조성물 1은 파르게신 또는 90 % MeOH 분획과 유당을 1:1로 혼합한 것이다. 또한, 제조예 3 ~ 6에서 사용하는 조성물 1 상기와 같은 것이다.
(제조예 3 연질 캡슐)
조성 사용량(g)
조성물 1 100
토코페놀 0.2
상기의 성분을 각각 측정하고 균일하게 혼합한 후, 연질 캡슐 100 mg씩 충전하면 연질 캡슐을 제조할 수 있다.
(제조예 4 과립제)
조성 사용량(g)
조성물 1 2
유당 450
옥수수 전분 300
하이드록시프로필 셀룰로오스 50
결정성 셀룰로오스 35
상기의 성분을 각각 측정하고 균일하게 혼합한 후 통상의 방법에 따라 과립제를 제조할 수 있다.
(제조예 5 시럽제)
조성 사용량(g)
조성물 1 2
당질 0.6
당 30
글리세린 5
조미료 0.1
96 % 에탄올 10.4
정제수 최종 용량을 100 mL로하는 충분한 양
상기의 성분을 각각 측정하고 설탕과 당질을 주사용 증류수 60 mL에 녹인 후, 글리세린과 에탄올에 용해된 조성물 2 및 조미료의 용액을 추가한다. 이의 혼합물에 증류수를 추가하여 최종 용량을 100 mL로 하여 경구 투여용 시럽제를 제조할 수 있다.
(제조예 6 과립제)
조성 사용량(g)
조성물 1 100
규산 칼슘 100
본 발명은 골 형성 촉진을 위한 의약, 기능성 식품, 건강 식품 등의 제조 및 개발 분야에서 유용하다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 하기 화학식(II)로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 함유하는 골감소증 예방 및 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112014083188322-pct00007
    .
  3. 하기 화학식(II)로 표시되는 화합물을 함유하는 목련과 식물의 꽃봉오리, 잎, 수피 또는 목부에서 이루어진 군에서 선택되는 하나의 기관에서 유래된 추출 분획을 포함하는 골감소증 예방 및 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112014083188322-pct00030
    .
  4. 제 3항에 있어서, 상기 목련과 식물은 꽃봉오리, 잎, 수피 또는 목부에서 이루어진 군에서 선택되는 하나의 기관은 타무시바, 코브시, 하쿠모쿠렌 및 키타코부시로 이루어진 군에서 선택되는 식물에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 골감소증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 2항 내지 제 4항에 중 어느 한 항의 상기 약학적 조성물을 유효성분으로 10 내지 350 mg/일으로 투여되는 것을 특징으로 하는 골감소증 예방 및 치료용 약학적 제제.
  6. 삭제
  7. 하기 화학식(II)로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 함유하는 골감소증 예방 또는 개선용 기능성 식품:
    [화학식 2]
    Figure 112014108813077-pct00033
    .
  8. 제 7항에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 함유량은 1 내지 1,000 mg/100 g인 것을 특징으로 하는 골감소증 예방 또는 개선용 기능성 식품.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 기능성 식품은 비스킷, 쌀밥 첨가용 밀과 잡곡, 메밀, 파스타 및 기타 면류, 치즈, 요구르트 및 기타 유제품, 잼, 마요네즈, 간장 및 기타 대두 제품, 차, 커피와 코코아 및 기타 비알콜 음료, 약용주 및 기타 알콜 음료, 캔디, 초콜릿과 기타 스낵, 센베이, 양갱 및 기타 콩을 원료로 하는 과자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골감소증 예방 또는 개선용 기능성 식품.
  10. 하기 화학식(II)로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 함유하는 골감소증 예방 또는 개선용 건강 식품:
    [화학식 2]
    Figure 112014108813077-pct00034
    .
  11. 제 10항에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 및 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 함유량은 1 내지 1,000 mg/100 g인 것을 특징으로 하는 골감소증 예방 또는 개선용 건강 식품.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 건강 식품은 비스킷, 쌀밥 첨가용 밀과 잡곡, 메밀, 파스타 및 기타 면류, 치즈, 요구르트 및 기타 유제품, 잼, 마요네즈, 간장 및 기타 대두 제품, 차, 커피와 코코아 및 기타 비알콜 음료, 약용주 및 기타 알콜 음료, 캔디, 초콜릿과 기타 스낵, 센베이, 양갱 및 기타 콩을 원료로 하는 과자로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골감소증 예방 또는 개선용 건강 식품.

KR1020137003498A 2010-07-12 2011-07-12 ａｘｉａｌ―ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ａｒｙｌ배향의 ｆｕｒｏｆｕｒａｎ형 리그난을 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품 KR101491595B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010157598 2010-07-12
JPJP-P-2010-157598 2010-07-12
PCT/JP2011/065912 WO2012008467A1 (ja) 2010-07-12 2011-07-12 axial-equatorial aryl配向のfurofuran型リグナンを含有する骨形成促進用医薬組成物、その組成物を含有する医薬製剤、その組成物を含む機能性食品及び健康食品

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130050967A KR20130050967A (ko) 2013-05-16
KR101491595B1 true KR101491595B1 (ko) 2015-02-11

Family

ID=45469464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137003498A KR101491595B1 (ko) 2010-07-12 2011-07-12 ａｘｉａｌ―ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ａｒｙｌ배향의 ｆｕｒｏｆｕｒａｎ형 리그난을 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20130253048A1 (ko)
JP (1) JP6272646B2 (ko)
KR (1) KR101491595B1 (ko)
WO (1) WO2012008467A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103040805B (zh) * 2012-12-28 2014-04-09 上海中医药大学 辛夷脂素的医药用途
KR101826229B1 (ko) * 2015-10-07 2018-02-06 최봉근 신이 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 치주조직 성장 촉진, 및 치주염 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2017061781A1 (ko) * 2015-10-07 2017-04-13 최봉근 신이 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 치주조직 성장 촉진, 및 치주염 예방 및 치료용 약학적 조성물
TWI668008B (zh) * 2017-09-07 2019-08-11 財團法人生物技術開發中心 木蘭萃取物、其製備方法及其用途
CN110051661A (zh) * 2019-05-07 2019-07-26 中国水产科学研究院长江水产研究所 辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990013299A1 (en) 1989-05-05 1990-11-15 Northern Sydney Area Health Service Fertility enhancement

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990013299A1 (en) 1989-05-05 1990-11-15 Northern Sydney Area Health Service Fertility enhancement

Also Published As

Publication number Publication date
JP6272646B2 (ja) 2018-02-07
WO2012008467A1 (ja) 2012-01-19
KR20130050967A (ko) 2013-05-16
US20130253048A1 (en) 2013-09-26
JPWO2012008467A1 (ja) 2013-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100105766A1 (en) Composition for inhibition or prevention of bone density reduction
KR101491595B1 (ko) ａｘｉａｌ―ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ａｒｙｌ배향의 ｆｕｒｏｆｕｒａｎ형 리그난을 함유하는 골 형성 촉진용 약학적 조성물 및 이의 조성물을 포함하는 약학적 제제, 기능성 식품 및 건강 식품
US20130310454A1 (en) Pharmaceutical composition comprising extract of lonicera japonica for prevention and treatment of gastroesophageal reflux disease
WO2007091707A1 (ja) 骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物、その組成物を含有する機能性食品、健康食品及び医薬製剤、並びに歯根－歯周組織形成促進剤
KR100910622B1 (ko) 연근 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품
WO2008016105A1 (fr) Composition pharmaceutique destinée à la prévention et/ou au traitement d&#39;une maladie osseuse, aliment fonctionnel ou aliment diététique contenant la composition, et préparation pharmaceutique contenant la composition en tant que principe actif
KR100727887B1 (ko) 골다공증 예방 및 치료효과를 갖는 애엽 추출물
KR101308144B1 (ko) 아젤라신 ｄ를 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20170054115A (ko) 콩 발아배아 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20160057525A (ko) 우슬 추출물 및 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물
KR101318210B1 (ko) 소회향 종자 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물
KR101305555B1 (ko) 신이 활성 화합물들을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 조성물
KR101898261B1 (ko) 콩 발아배아 추출물을 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물
JP6018800B2 (ja) 経口投与組成物
KR101320975B1 (ko) 신이 활성 화합물들을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 치료용 조성물
KR100752411B1 (ko) 골다공증 예방 및 치료효과를 갖는 연근 추출물
KR102658030B1 (ko) 탈염 함초 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 골 질환 또는 갱년기 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 이의 제조 방법
WO2008084283A2 (en) Andrographis paniculata plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
JP2020070281A (ja) 骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物
KR101320974B1 (ko) 신이 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 및 치료용 조성물
KR102160627B1 (ko) 헛개나무 가지 추출물을 함유하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101401002B1 (ko) Ｈｓ1792 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 골량 저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품
EP2857028A1 (en) Agent containing ascorbic acid derivative, and use for said agent
JP2007145814A (ja) 血小板活性化因子受容体拮抗剤および組成物
AU2006345882A1 (en) Citrus reticulata plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180129

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181224

Year of fee payment: 5