CN110051661A - 辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用，辛夷脂素能通过抑制分选酶A活性降低无乳链球菌的粘附作用，从而降低无乳链球菌对罗非鱼的致病力，实验动物模型实验进一步证实辛夷脂素可以对罗非鱼无乳链球菌感染起到治疗作用，辛夷脂素为中药辛夷的主要化学成分，无毒副作用和残留，可以作为药物制剂和饲料添加剂用于水产动物无乳链球菌病的预防和治疗。

Description

辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用。

背景技术

辛夷又名房木、辛雉、姜朴花等，为木兰科木兰属植物望春玉兰、玉兰、武当玉兰等的干燥花蕾，是我国有上千年历史的传统花卉和中药。辛夷性温味辛，无毒，归肺、胃经，具有发散风寒通鼻窍的功效，主要用来治疗风寒头痛、鼻塞、鼻流浊涕等。现代医学研究发现辛夷具有抗过敏、抗炎、降压和抗血小板等功能，临床用于治疗鼻炎及鼻窦炎有较好的效果。辛夷脂素是辛夷的有效成分之一，属于双环氧木质素类化合物，具有抗炎、抗过敏、保肝等作用。

无乳链球菌属于B族链球菌，在世界范围内有广泛分布，是一种常见的人兽共患致病菌。无乳链球菌在包括美国、日本、以色列、中国、泰国、巴西等多个国家被报道与鱼类感染密切相关。给淡水养殖业造成了严重的经济损失，是我国罗非鱼养殖的重要病原之一。此外，无乳链球菌也可以导致动物和人的多种疾病的发生，已经成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。近年来随着人们对水产品消费的不断增加，其作为致病菌的地位引起了人们更多的重视，成为当前食品卫生领域关注的重点研究对象，因此加强对无乳链球菌防控药物的研究对水产养殖业的健康发展和水产品质量安全具有重要的意义。抗菌药物是治疗罗非鱼感染包括无乳链球菌在内的细菌性疾病的首要选择，由于长期不合理用药导致其耐药性问题日益严重，甚至有多重耐药菌株的出现，给水产养殖业无乳链球菌感染的治疗带来了极大的困难。而另一方面，由于耐药性产生导致抗菌药物用药剂量的增加，不可避免的提高了药物在动物体内的蓄积和残留的程度和风险。药物在动物可食性组织中的残留不仅会对动物性食品的品质产生影响，而且会对食用的人群产生安全隐患；同时药物残留也是影响我国动物性食品出口的主要原因之一。因此寻找新的抗菌机制对于水产养殖药物研发刻不容缓。

分选酶是革兰氏阳性细菌将表面致病性蛋白锚定到细胞壁上的关键酶，研究发现几乎所有的革兰氏阳性菌中都存在分选酶基因。无乳链球菌敲除分选酶A基因后细菌无法将表面蛋白锚定到细胞壁上，从而在很大程度上降低了病原菌对实验动物的致病力。因此，开展以分选酶A为靶标的药物筛选对于控制水产养殖动物无乳链球菌感染具有广阔的前景和重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用，辛夷脂素通过抑制分选酶A活性降低无乳链球菌的粘附作用，从而降低无乳链球菌对水产动物的致病力。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用：经实验证实，当辛夷脂素浓度达到2μg/mL以上时其对分选酶A的催化活性具有极显著的抑制作用；当辛夷脂素浓度达到1μg/mL以上时，可以极显著的抑制无乳链球菌对纤维蛋白原和纤连蛋白的粘附；已感染无乳链球菌的罗非鱼灌服20mg/kg剂量辛夷脂素，每12h使用一次，连续使用3天，可达到最佳治愈率。

辛夷脂素为中药辛夷的主要化学成分，无毒副作用和残留，可以作为药物制剂和饲料添加剂用于水产动物无乳链球菌病的预防和治疗。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：使用剂量低，治疗效果好，不容易使病原菌产生耐药性，主要成分为中药来源的天然化合物，对鱼体、人及环境没有毒性作用，没有药物残留的风险。

附图说明

图1为辛夷脂素对分选酶A催化活性的影响

图2为辛夷脂素对无乳链球菌粘附的影响

具体实施方式

生物材料说明：

分选酶A由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存，可参照文献《Preliminary crystallographic study of the Streptococcus agalactiaesortases,sortase A and sortase C1》(Khare,B.,et al.,Acta Crystallogr Sect FStruct Biol Cryst Commun,2010.66(Pt 9):p.1096-100.)报道的方法制备。

无乳链球菌菌株PBSA0903由海南大学郭伟良博士赠送，由长江水产研究所水产动物药理与药残控制技术实验室保存。

实施例1：

能量转移共振法测定辛夷脂素对无乳链球菌分选酶A的抑制作用

具体试验步骤如下：黑色不透光96孔培养板中加入6mg/mL的分选酶A蛋白储液3μL，200μM荧光底物(Dabcyl-QALPETGEE-Edans)10μL，并依次加入浓度为10240μg/mL的辛夷脂素(购自四川省维克奇生物科技有限公司，货号：wkq-00603)储液使其浓度达到8、4、2、1、0.5、0μg/mL，在每孔中加入缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM CaCl₂，pH 7.5))使反应体系为200μL，每个药物浓度做3个重复孔。避光放入37℃恒温箱中孵育1h后取出，使用酶标仪测定荧光值的变化。激发波长为350nm，记录波长为490nm。通过荧光值变化分析不同浓度辛夷脂素对SrtA蛋白催化活性的影响。结果如图1所示，当辛夷脂素浓度达到1μg/mL时其对分选酶A的催化活性有显著的抑制作用(0.01＜p＜0.05)，当浓度达到2μg/mL以上时其对分选酶A的催化活性具有极显著的抑制作用(p＜0.01)。

实施例2：

辛夷脂素对分选酶A介导的无乳链球菌粘附功能的影响

取纤维蛋白原和纤连蛋白母液用PBS稀释至4μg/mL，向96孔细胞培养板中加入200μL，4℃孵育过夜。次日将板中的液体弃去，用200μL PBS洗涤3次，每孔加入5％BSA在37℃培养箱中封闭2h。然后弃去液体用PBS洗涤3次备用。挑取无乳链球菌PBSA0903菌株的单菌落接种于2mL的BHI培养基中，在37℃培养8h后扩培至100mL培养基中并分别加入2、1、0.5、0.25、0μg/mL的辛夷脂素，继续培养至OD_600nm＝0.5时离心收集菌体。菌体经PBS洗涤3次后调整至OD_600nm为1.0备用。向封闭好的96孔细胞培养板中加入100μL处理好的菌液，在37℃培养箱中孵育2h。弃去板中菌液PBS洗涤3次，50℃烘箱中烘干，加入200μL 0.4％的结晶紫染色20min，PBS洗涤3-5次加入100μL冰醋酸充分溶解结晶紫后测定其在OD_570nm处的吸收值。结果如图2所示，随着药物浓度的增加无乳链球菌PBSA0903对纤维蛋白原和纤连蛋白的粘附作用依次下降，当辛夷脂素浓度达到1μg/mL以上时，辛夷脂素可以极显著的抑制无乳链球菌PBSA0903对纤维蛋白原和纤连蛋白的粘附。

实施例3：

辛夷脂素对罗非鱼无乳链球菌感染模型的治疗作用

试验在100cm×50cm×60cm的水族箱中进行，每天换水并保持水温在30±2℃。100g左右的健康罗非鱼经麻醉后通过腹腔注射无乳链球菌PBSA0903菌株建立人工感染模型。感染后2h开始对感染罗非鱼灌服20mg/kg剂量的辛夷脂素，每12h给药一次，连续给药3d，阳性对照组感染后灌服PBS作为对照。每个实验组使用罗非鱼20尾，感染后即开始记录死亡情况，结果见表1。该结果表明，罗非鱼人工感染无乳链球菌后在5d内全部死亡；给予20mg/kg辛夷脂素治疗的罗非鱼发生了25％的死亡；其存活率远高于阳性对照组。通过以上研究充分表明，当罗非鱼感染无乳链球菌后可通过给予20mg/kg剂量的辛夷脂素进行治疗，且该药物能取得较好的治疗效果。

表1辛夷脂素治疗罗非鱼无乳链球菌感染模型后的死亡率

通过实施例1和实施例2发现，辛夷脂素能在体外抑制无乳链球菌分选酶A的活性，降低对人纤连蛋白的粘附，并呈剂量依赖性。粘附是病原菌入侵宿主的第一步，也是至关重要的步骤。有大量研究表明，通过抑制分选酶A活性或敲除分选酶A基因能降低无乳链球菌对动物感染模型的死亡率。因此，以上研究结果提示辛夷脂素能对无乳链球菌导致的罗非鱼感染有治疗作用。通过实施例3发现，辛夷脂素治疗后罗非鱼无乳链球菌感染模型的死亡率显著下降，提示辛夷脂素可以作为治疗罗非鱼无乳李链球菌感染的药物。此外，无乳链球菌在水产养殖业中除了能感染罗非鱼以外，还可以感染斑点叉尾鮰、虹鳟、牙鲆、大菱鲆、真鲷和齐口裂腹鱼等多种温水鱼类，而分选酶A是包含无乳链球菌在内的革兰氏阳性菌内所包含的一类转肽酶，具有普遍性。由此可以推断辛夷脂素对水产养殖动物无乳链球菌感染均具有治疗作用。

Claims (3)

1.辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用。

2.根据权利要求1所述的辛夷脂素在抑制水产动物无乳链球菌感染中的应用，其特征在于，辛夷脂素的给药剂量大于20 mg/kg。

3.辛夷脂素在制备预防或治疗水产动物无乳链球菌感染药物中的应用。