KR101306199B1 - 포스포리파아제 ｄ 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포스포리파아제 D 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 포스포리파아제 D 억제제는 파골세포의 분화를 억제하고 골흡수 억제하며, 골다공증 증상을 완화하는 효능을 가지므로, 이를 포함하는 조성물은 골다공증 예방 또는 치료에 효과적인 의약품으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

포스포리파아제 Ｄ 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 {Composition for prevention or treatment of osteoporosis comprising the phospholipase D inhibitor}
본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 포스포리파아제 D 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
골다공증은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지는 상태로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골량은 유전적 요인, 영양섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14-18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다.
이와 같이 골다공증은 정도에 차이는 있으나, 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며, 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.
뼈는 손상되었거나 오래된 뼈를 새로운 뼈로 대체하는 골의 재형성 과정을 통해 건강한 상태로 유지된다. 골의 재형성 과정은 조골세포와 파골세포에 의해 이루어진다. 조골세포는 새로운 뼈를 생성하는 골형성 과정에, 파골세포는 낡은 뼈를 파괴하는 골흡수에 관여한다. 그러나 폐경에 의해 여성호르몬의 결핍이 나타나면 이런 골의 재형성과정에 관여하는 조골세포와 파골세포에 직접, 간접적으로 영향을 미쳐 골손실이 유발된다. 즉, 폐경 후 골의 재형성이 활발해지고 골흡수 정도가 골생성 정도보다 많아져 골손실을 유발하게 된다.
골다공증의 치료는 일반적인 요법과 약물요법이 있다. 일반적인 요법에는 칼슘과 비타민 D의 섭취, 운동 및 생활습관의 변화를 요구하고 있으며, 악물요법에는 호르몬 보충요법, 알렌드로네이트, 칼시토닌, 라톡시펜, Na-F, 칼시트리올, 비스포스포네이트 제제를 투여한다. 골다공증 치료는 장기적인 치료기간을 요구하여, 종래의 약물을 장기 복용하는 경우 요로결석, 자궁내막암, 유방암 등과 같은 부작용이 초래되어 인체에 부작용이 없는 새로운 골다공증 치료제를 개발하는 것이 필요하다.
현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로젠, 앤드로제닉 아나볼릭 스테로이드, 칼슘제제, 인산염, 불소제제, 이프리플라본, 비타민 D3 등이 있다. 또한 1995년 미국 머크사에서는 아미노비스포스포네이트를 1997년 미국 릴리사에서는 선택적인 에스트로겐 수용체 조절기로서의 역할을 하는 랄록시펜을 골다공증에 대한 신약으로 개발한 바 있다.
한편, 종래 골다공증 치료제는 대부분 에스트로겐 계통의 물질로서, 에스트로겐 계통의 물질은 장기 투여할 경우 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다. 그러나, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이므로, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고, 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질을 개발이 절실히 필요한 상황이다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 출원의 발명자들은 효과적인 골다공증 예방 및 치료가 가능한 약물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, 포스포리파아제 D 억제제가 파골세포를 효과적으로 억제하고 골다공증 동물모델에 대한 뛰어난 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포스포리파아제 D 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기의 포스포리파아제 D 억제제는 파골세포의 분화 억제, 골흡수 억제, 골파괴 억제 또는 지주골소실을 억제할 수 있으며, 바람직하게는 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며, 전체 조성물 100 중량%에서 0.001 내지 50 중량% 포함된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 포스포리파아제 D 억제제를 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 상기의 포스포리파아제 D 억제제는 바람직하게는 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide일 수 있다.
본 발명의 포스포리파아제 D 억제제는 파골세포의 분화를 억제하고 골흡수를 억제하며, 골다공증 증상을 완화하는 효능을 가지므로, 이를 포함하는 조성물은 골다공증 예방 또는 치료에 효과적인 의약품과 식품으로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 포스포리파아제 D 억제제 중 하나인 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 마우스 골수로부터 얻은 대식세포에 파골세포 분화제 (M-CSF와 RANKL)와 함께 FIPI를 농도별로 처리하여 9일 동안 배양한 후 분화된 파골세포의 수를 TRAP 염색으로 확인한 현미경 사진이다.
도 3은 마우스 골수로부터 얻은 대식세포에 파골세포 분화제 (M-CSF와 RANKL)와 함께 FIPI를 농도별로 처리하여 9일 동안 배양한 후 분화된 파골세포로의 분화정도를 나타낸 그래프이다. A는 파골세포수 B는 TRAP 활성도측정을 통해 정량화한 그래프이다.
도 4는 마우스 골수로부터 얻은 대식세포에 파골세포 분화제 (M-CSF와 RANKL)와 함께 FIPI를 농도별로 처리하여 9일 동안 hydroxyapatite가 코팅된 웰 플레이트에서 배양한 후 골흡수된 면적을 확인한 결과이다. A는 현미경 사진, B는 pit area, C는 흡수된 pit number를 나타낸 그래프이다.
도 5는 마우스 골수로부터 얻은 대식세포에 파골세포 분화제 (M-CSF와 RANKL)와 함께 FIPI를 농도별로 처리하여 9일 동안 배양한 후 얻은 세포의 파골세포분화 관련 유전자의 mRNA 발현을 분석한 그래프이다. A는 TRAP, B는 칼시토닌 수용체 (calcitonin receptor), C는 MMP-9, D는 카텝신 K (cathepsin K)의 mRNA 발현을 분석한 그래프이다.
도 6은 마우스 골수로부터 얻은 대식세포에 파골세포 분화제 (M-CSF와 RANKL)와 함께 FIPI를 농도별로 처리하여 9일 동안 배양한 후 얻은 세포의 PLD1 (A)과 PLD2 (B)의 mRNA 발현을 분석한 그래프이다.
도 7은 LPS-유도 골흡수 동물모델에서 FIPI를 10 mg/kg 로 6일 동안 매일 주사한 후 얻은 두개골을 마이크로 전산화 단층 촬영(micro-computed tomography scan)하고 3차원적으로 재구성한 이미지 사진이다.
도 8은 LPS-유도 골흡수 동물모델에서 FIPI를 10 mg/kg로 6일동안 매일 주사한 후 얻은 두개골의 단면을 TRAP 염색한 사진(A)과 파골세포염색부위의 면적을 정량화한 그래프 (B)이다.
도 9는 난소적출동물모델에서 FIPI를 10 mg/kg로 2일 간격으로 복강에 24회 주사한 후 얻은 대퇴골의 골분석 그래프이다. A는 지주골량, B는 지주골두께, C는 지주골수, D는 지주공간면적 나타내는 그래프이다.
본 발명은 포스포리파아제 D 억제제를 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 포스포리파아제 D (phospholipase D: PLD)는 포스파티딜콜린 (phosphatidyl choline: PC)을 분해하여 이차산물로 포스파티드산 (phosphatidic acid, PA)와 콜린을 생성시키는 효소로서, 생성물인 PA는 다시 posphatidic acid phosphohydrolase (PPH)에 의해서 분해되어, 디아실글리세롤 (diacylglycerol: DAG)을 생성한다. 포스파티드산 전구체는 세포 신호전달과 대사경로에 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 포스파티드산은 휴지기의 세포에는 낮은 수준으로 존재하고, 포스포리파아제 D 활성은 세포의 소포상 이동, 세포의 물질분비, 세포이동, 세포생존과 증식을 조절하는 기전에 의해 조절된다고 알려져 있다. 포스포리파아제 D는 포유동물세포에는 PLD1과 PLD2의 두가지 동위효소로 존재하며, 본 발명에서의 포스포리파아제 D 억제제는 상기 PLD1과 PLD2 모두에 작용될 수 있다.
본 발명자는 상기의 포스포리파아제 D 억제제가 파골세포의 형성 또는 증식을 억제하여 파골세포의 수를 감소시키며, 다양한 골다공증 동물 모델에서 질환이 효과적으로 완화한다는 것을 밝혔다.
본 발명의 일 실시예에서는 포스포리파아제 D 억제제 중 하나인 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)가 대식세포에 파골세포 분화제인 M-CSF와 RANKL를 처리한 대식세포의 분화를 억제하며 (도 2 및 3참조), 골흡수를 억제하고 (도 4참조), 파골세포 분화 관련 유전자의 발현을 감소시키는 것을 확인 할 수 있었다 (도 5참조).
본 발명의 일 실시예에서는 포스포리파아제 D 억제제 중 하나인 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)를 LPS-유도 골흡수모델과 난소적출 골다공증모델을 이용하여 골다공증에 대한 치료 효과를 시험하여 본 결과, 골다공증 마우스에 비해 FIPI 투여군은 골흡수가 감소하였고, 파골세포의 수도 감소하였다. 또한, 두개골의 조직학적인 소견으로도 골흡수 모델에 비해 뼈손상 정도가 현저히 감소하여 본 발명의 골다공증의 발생 억제 및 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 포스포리파아제 D 억제제는 골다공증의 원인인 파골세포의 발현 및 증식을 억제하며, 골다공증의 증상을 완화하는 효능을 가진다.
본 발명에서, 상기의 포스포리파아제 D 억제제는 바람직하게는 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)는 분자식이 C23H24FN5O2HClxH2O인 화합물로 457.93의 분자량을 갖는다. 본 물질의 화학구조는 도 1에 나타내었다.
도 1로 표시된 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)의 약학적으로 허용 가능한 염은 달리 지시되지 않는 한, 도 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당해 기술분야에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “골다공증 (osteoporosis)”은 골다공증은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 말한다. 상기 “예방”이란 상기 조성물의 투여로 골다공증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 “치료”란 상기 조성물의 투여로 골다공증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)는 전체 약학적 조성물에서 0.001 내지 50중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20중량% 포함될 수 있다. 또한, 상기 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)는 전체 약학적 조성물에서 상기 약학적 조성물이 투여되는 개체의 1kg당 적정량이 투여될 수 있도록 함량을 조절할 수 있다. 예를 들어, 상기 투여되는 개체가 래트 (Rat)인 경우 상기 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)는 50mg/kg 내지 150mg/kg, 바람직하게는 80mg/kg 내지 120mg/kg의 함량으로 투여될 수 있도록 약학적 조성물에 포함되는 함량이 조절될 수 있다. 또한, 상기 투여되는 개체가 인간인 경우 상기 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)는 0.0001 내지 500mg/kg, 바람직하게는 0.001 내지 500mg/kg, 보다 바람직하게는 0.001 내지 300mg/kg의 함량으로 투여될 수 있도록 약학적 조성물에 포함되는 함량이 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나, 약학적 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민 B1, B2, B6, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘 및 이들의 혼합물 등의 무기 또는 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존에 사용된 골다공증에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물을 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 개체에 투여하여 골다공증을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, “개체”는 골다공증 또는 이의 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 개 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있도록 하는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, “약제학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 화합물을 포함하는 조성물의 투여방법은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 골다공증 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 포스포리파아제 D 억제제를 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것일 수 있으며, 상기 포스포리파아제 D 억제제는 바람직하게는 5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI)일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 골다공증 억제를 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
음료의 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 0.001 내지 0.4g, 바람직하게는 약 0.002 내지 0.03g 이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 실험동물모델 선정 및 처치
LPS-유도 골흡수 동물모델용으로 C57BL/6 암컷 20-25g 마우스를 효창사이언스㈜에서 구입하여 실험에 이용하였다. 본 실험은 온도 18-22도, 상대습도 40-60%, 조명시간 12시간 (낮과 밤 주기)로 설정된 사육환경이 갖춰진 부산대학교 약학대학 동물 사육실에서 실시되었다.
난소적출 동물모델은 C57BL/6 암컷 20-25g 마우스를 중앙실험동물(주)에서 구입하여 2주일간 검역과 순화사육을 거쳐 적응성을 나타내는 건강한 동물만을 실험에 이용하였다. 본 실험은 온도 18-22도, 상대습도 40-60%, 조명시간 12시간 (낮과 밤 주기)로 설정된 사육환경이 갖춰진 양산 부산대학교병원 실험동물센터 SPF (specific pathogen free)동물사육실에서 실시되었다. 모든 마우스에 실험동물용 고형사료 및 멸균된 상수도 (음수)를 자유 섭취시켰다.
실시예 2. 골다공증 동물모델의 제작
FIPI의 골다공증 치료효과를 알아보기 위하여, LPS-유도 골흡수 마우스 모델과 난소적출 동물모델을 이용한 실험을 실시하였다.
LPS-유도 골흡수 마우스 모델과 난소적출 동물모델은 인간의 골다공증 유사한 특징을 지닌 골다공증 모델로서, 하기와 같이 제조하였다.
LPS (lipopolysaccharide)는 PBS에 녹여서 12.5 mg/kg로 마우스의 두정부에 주사하였다.
난소적출모델의 경우, 중앙실험동물(주)에서 정상대조군인 sham 모델과 함께 구입하였다.
Sham군을 제외한, PBS 투여군과 FIPI 투여군의 모든 마우스에서 양측 난소 적출술을 시행하였다. 마취된 마우스의 하복부의 털을 제거하고 수술부위를 소독한 후, 무균조작 하에서 수술을 시행하였다. 피부, 복근 및 복막을 절개하고, 소독된 핀셋으로 난소를 노출시켜 난관을 견사로 결찰한 후 좌우 난소를 적출하였다. 항생제를 복강 내에 주입하여 감염을 방지하였으며, 흡수성 봉합사로 복막, 복근 및 피부를 봉합하였다.
실시예 3. 마우스 복강 투여용 FIPI 주사액 제조
본 발명에 의한 골다공증 치료용 주사액은 FIPI를 전자저울을 이용해 필요한 양만큼 칭량 후 DMSO에 녹이고 10% DMSO가 되도록 멸균된 PBS에 희석하여 제조한다. 이 주사액을 LPS-유도 골파괴 동물모델의 머리덮개뼈 부위에 10mg/kg씩 1일에 1회 간격으로 6일간 총 6회 주사, 난소절제 동물모델의 복강에 10mg/kg씩 2일에 1회 간격으로 8주간 총 24회 주사하였다.
실험예 1. FIPI 의 파골세포 형성 억제 실험
본 발명에 의한 FIPI 가 파골세포의 형성 또는 증식 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
1) 골수세포의 배양 및 파골세포 분화
골수세포는 6-8주령의 Balb/c 마우스의 다리뼈 (대퇴골, 정강이골) 주위의 근육 조직을 깨끗이 떼어내어 클린 벤치로 옮기고, 대퇴골의 양끝을 자르고, 주사기 바늘을 꽂은 뒤 골수가 완전히 빠질 때까지 배지로 씻어 내렸다. 골수를 모아 2000 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 얻고, 이것을 10% FBS가 포함된 alpha-MEM 배지에 재현탁시켜 배양접시에 분주한 후 37℃, 습식조건인 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 24시간 뒤 부착되지 않은 세포들을 수집하여 2000 rpm, 5분간 원심분리하여 세포를 모으고, 이것을 M-CSF (50 ng/ml), 10% FBS가 포함된 alpha-MEM 배지에서 3일동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다. 3일후 부착세포들을 모아서 M-CSF (50 ng/ml), RANKL (50 ng/ml), 10% FBS가 포함된 alpha-MEM 배지에서 배양하여 파골세포로의 분화를 유도하였다.
2) 파골세포의 형성에 미치는 영향 확인
상기 배양방법으로 수득한 대식세포를 48-웰 플레이트에 접종하고 FIPI를 각 농도별로 웰에 첨가한 후 9일간 배양하였다. 세포를 10% 포름알데히드로 고정하고 파골세포를 확인할 수 있는 세포 화학적 표지효소인 TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 실시하였다. 파골세포의 수는 TRAP을 발현하는 다핵세포의 수를 세어 측정하였다 (도 2). 염색은 시판되는 kit (Sigma사, 미국)를 사용하였으며, 3개 이상의 핵을 같은 TRAP-양성 세포수와 TRAP 활성도를 측정하였다 (도 3). 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, FIPI의 처리에 의해 농도 의존적으로 파골세포의 형성이 감소됨을 확인할 수 있었다.
3) 골흡수(피트 형성)에 미치는 영향 확인
상기 배양방법으로 수득한 대식세포를 hydroxyapatite가 코팅되어있는 웰 플레이트 (Biologic, BD) 접종하고 FIPI를 각 농도별로 웰에 첨가한 후 9일간 배양하였다. 상기 hydroxyapatite슬라이드 상에 형성된 pit의 면적을 측정하여, 대조군과 비교하였다 (도 4). 도 4에 나타난 바와 같이, FIPI처리에 의해 골흡수가 감소함을 확인할 수 있었다.
4) 파골세포 관련 유전자 및 PLD 의 발현 확인
상기 배양방법으로 수득한 세포에서 RNA를 추출하여 TRAP, calcitonin receptor, MMP-9 와 cathepsin K와 같은 파골세포 target gene과 PLD1 그리고 PLD2의 전사가 억제되는 것을 역전사 효소 PCR법 을 이용하여 관찰하였다(도 5, 6).
실험예 2. LPS -유도 골흡수 마우스 모델을 이용한 골다공증 치료 효과 실험
LPS를 12.5 mg/kg로 두정부에 주사하고, 골흡수 마우스 모델을 제작하였다. FIPI는 PBS 에 10 mg/kg 로 녹여서 마우스 두정부에 매일 1회씩, 6일 동안 총 6회 주사하였다. 한편,비히클 (vehicle) 투여군의 경우는 PBS 만을 두정부에 주사하였다. 6회의 주사 이후 마우스의 두개골을 적출하고 3차원적으로 분석하기 위하여 적출된 두개골을 마이크로 전산화단층 촬영(micro-computed tomography scan) 장치로 촬영한 후, 소프트웨어 프로그램으로 3차원 재구성 하였다. 비히클을 투여한 마우스의 두개골에서 뼈의 소실이 나타나는 전형적인 골다공증 소견을 보였고, FIPI를 처리한 마우스에서는 정상마우스와 유사한 소견이 관찰되어, 골다공증의 치료효과가 육안으로 확인되었다 (도 7).
또한, 마우스 각각의 두개골을 분리하여 10% neutral buffered formalin (NBF) 고정액에 고정하고, 10% EDTA 용액을 이용하여 칼슘제거과정 (decalcification)을 거친 후에 파라핀에 포매하였다. 이후 4 um의 조직 절편을 만들고 TRAP 염색을 수행하였다 (도 8). 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, LPS+FIPI의 경우 골흡수가 억제됨을 알 수 있었다. FIPI는 어떠한 독성 신호도 나타내지 않았으며, 치사율도 관찰되지 않았다.
실험예 3. 난소적출 동물모델을 이용한 골다공증 치료효과 실험 및 골 분석
실험과정은 크게 난소 적출의 시행, 적출 후 회복기 과정, FIPI (10 mg/kg) 24회 복강 투여 후 Sham 마우스, 난소적출 골다공증 유도 마우스와 난소적출 골다공증 유도 후 FIPI를 투여한 마우스 각각의 대퇴골을 분리하고 골분석 (지주골량, 지주골 두께, 지주골 수, 지주공간면적 측정)을 실시하였다 (도 9). 도 9에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 지주골량, 지주골 두께, 지주골 수, 지주공간면적을 측정한 결과 4가지 지표에서 모두 FIPI 투여군의 골다공증 회복효과를 관찰할 수 있었다.
FIPI를 이용한 골다공증의 치료효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 FIPI 를 LPS-유도 골흡수모델과 난소적출 골다공증모델을 이용하여 골다공증에 대한 치료 효과를 시험하여 본 결과 골다공증 마우스에 비해 FIPI 투여군은 골흡수가 감소하였고, 파골세포의 수도 감소하였다. 또한 두개골의 조직학적인 소견으로도 골흡수 모델에 비해 뼈손상 정도가 현저히 감소하여 본 발명의 골다공증의 발생 억제 및 치료에 효과적임을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 5-플루오로-2-인돌릴 데스-클로로할로페마이드(5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 5-플루오로-2-인돌릴 데스-클로로할로페마이드(5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide)는 파골세포의 분화 억제, 골흡수 억제, 골파괴 억제 또는 지주골소실을 억제하는 것을 특징으로 하는 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 5-플루오로-2-인돌릴 데스-클로로할로페마이드(5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide)는 전체 조성물 100 중량%에서 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 5-플루오로-2-인돌릴 데스-클로로할로페마이드(5-fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide)를 포함하는 골다공증 예방 및 개선용 식품 조성물.
  6. 삭제
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