JP2008531552A - 熟地黄と五加皮の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】熟地黄と五加皮の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物の提供。
【解決手段】本発明は、熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)と五加皮(Acanthopanacis Cortex)の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物に関するものである。
本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞を増殖させて、破骨細胞の形成及び活性を効果的に抑制するので、骨粗鬆症予防及び治療に有用に使用することができる。
【選択図】図1
【解決手段】本発明は、熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)と五加皮(Acanthopanacis Cortex)の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物に関するものである。
本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞を増殖させて、破骨細胞の形成及び活性を効果的に抑制するので、骨粗鬆症予防及び治療に有用に使用することができる。
【選択図】図1
Description
本発明は、熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)と五加皮(Acanthopanacis Cortex)の混合生薬材抽出物、及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物に関するものである。
骨は、筋肉と連合している石灰化した結体組織で、表面は厚くて堅い石灰化組織であり、身体均衡を成す支柱の役割をして、臓器を保護している。骨の内側には、骨髄組織があり、 カルシウム代謝の中心になる部位である。骨は、コラーゲン(collagen)、オステオカルシン(osteocalcin)、オステオネクチン(osteonectin)など有機質(organic substance)と、カルシウム、リン、フッ素などの無機質(inorganic substance)及び水分で構成されている。生体ではいつも、骨形成(bone formation)と骨吸収(bone resorption)が起きている。骨形成は、少量の副甲状線ホルモンやアンドロゲン、エストロゲン、フッ素、リンなどによって促進され、骨吸収は、物理的減圧、無重力状態、多量の副甲状線ホルモン、副腎皮質ステロイドなどによって促進される。したがって、骨代謝には、これらの間の均衡が重要である。
骨粗鬆症(osteoporosis)は、骨吸収と骨形成の均衡が崩れて発生するもので、骨形成より骨吸収が過多に進行することに起因した疾患である。骨粗鬆症は、骨組織の石灰が減少して骨の緻密質が薄くなって、それによって骨髄腔が広くなって、症状が進むにつれて骨が弱くなるため、小さな衝撃にも骨折しやすくなる。骨組織は、造骨細胞によって形成され、破骨細胞によって破壊吸収が絶えず繰り返される動的な組織である。
骨吸収は、破骨細胞によって起き、破骨細胞の生成及び活性には、NF−κB受容体の受容体活性剤(receptor activator of NF−κB receptor、RANKL)が必ず必要である。RANKLは、造骨細胞及び肝葉細胞に存在して、破骨細胞前駆細胞及び破骨細胞のNF−κBの受容体活性剤(receptor activator of NF−κB,RANK)に結合する(非特許文献1)。造骨細胞で生産されるタンパク質であるオステオプロテゲリン(osteiprotegerin,OPG)は、RANKLの誘引基(decoy)受容基としてRANKLとRANKの結合を邪魔することで、破骨細胞前駆細胞が破骨細胞に分化することを抑制して、破骨細胞の活性も抑制する(非特許文献2)。
骨粗鬆症の原因は、原発性(primary)と続発性(secondary)に分けられ、原発性骨粗鬆症は主に、老年期骨粗鬆症と閉経期後の骨粗鬆症で、続発性骨粗鬆症は、甲状腺機能亢進、副甲状線機能亢進、副腎皮質機能亢進、妊娠、長期間の固定(例、石膏包帯固定など)、栄養不足、薬物、腫瘍とその外の慢性疾患の合併症として発生し得る。
原発性骨粗鬆症は、その原因が明らかではないが、多くの因子が関与すると認識されてきた。老化による骨代謝の平衡の崩壊と共にカルシウム不足、副甲状線ホルモンの過剰、カルシトニン(calcitonine)の欠乏、活性型ビタミンDの不足、女性ホルモンの欠乏、運動不足などの様々な要因が複合的に関与して発生すると考えられている。カルシウム代謝に強い影響を及ぼす因子としては、副甲状線ホルモン(PTH)、カルシトニン(CT)、1,25−(OH)2D3等がある。カルシウムの代謝に関与する副甲状線ホルモンと甲状腺の傍濾胞上皮細胞とも呼ばれるC細胞で分泌するカルシトニンは、お互いに拮抗的に作用する。カルシトニンは、ポリペプチドで分子量が3500〜4000程度で骨に作用してカルシウム塩が骨に沈着するのを手伝う作用をする。その結果、血中カルシウムとマグネシウムが減少して、小便内のリン酸とハイドロキシプロリン(Hydroxyproline)も減少する。副甲状線ホルモン(Parathyroid hormone;PTH)もポリペプチドで、分子量は8447程度である。副甲状線ホルモンは、骨に作用して破骨細胞(Osteoclast)を活性化して骨吸収を増加させ、小腸粘膜でビタミンD3の作用を上昇させる。したがって、血中カルシウムとマグネシウムが増加して、小便内のハイドロキシプロリン(Hydroxyproline)とリン酸(PO4 3−)も増加する。卵巣で分泌するステロイドであるエストラジオールは、骨で造骨細胞(Osteoblast)を活性化させて骨吸収を防ぐ。
女性の閉経期以後には、エストロゲンの分泌が低下してその結果、血中カルシトニンが減少して腎臓での1,25−(OH)2D3合成が減少して、副甲状線ホルモンの分泌が増加する。それによって、インターロイキン6(IL−6)とプロスタグランジン(Prostaglandin)の生成が増加し、小腸内でのカルシウム吸収率が低下して、破骨細胞が活性化することにより骨吸収が増加して、骨消失率が亢進されるので、骨粗鬆症の発生率が高くなる。一般的に骨吸収が骨形成より活発になると、関節機能に障害が生じて、脊椎が漸進的に奇形になって、脊椎とその他の部位に微細な骨折が誘発され、痛症(特に腰背痛)がひどくなって運動性が低下し、脊椎後湾が起きて腎臓が小さくなる。
骨粗鬆症は、その症状自体よりは、骨の弱化によって容易に招来される各種骨折、特に大腿骨骨折または脊椎骨折などが、長期間活動を制限して健康な生活を営むことができなくして、結果的に、老人層死亡の15%にあたる原因提供をすると知られている。骨の量は、遺伝的要因、栄養摂取、ホルモンの変化、運動及び生活習慣の差など様々な要因によって影響を受け、骨粗鬆症の原因としては、老齢、運動不足、低体重、喫煙、低カルシウム食餌、閉経、卵巣切除などが知られている。
一方、個人差はあるけれど、白人よりは黒人が骨再吸収水準(bone resorption level)が低くて骨量がもっと高く、たいてい骨量は、14〜18歳のときに一番高くて老後には、1年に約1%ずつ減少する。特に、女性の場合、30歳以後から骨減少が持続的に進行して、閉経期に至るとホルモン変化によって骨減少が急激に進行する。
このように、骨粗鬆症は程度の差はあるが、老年層、特に閉経期以後の女性においては避けることができない症状で、先進国では人口が老令化するにつれて骨粗鬆症及びその治療剤に対する関心が徐徐に増加している。
また、全世界的に骨疾患治療と関連して、約1,300億ドルの市場が形成されていることが知られていて、これからさらに増加することが予想されるため、世界的な各研究機関や製薬会社では、骨疾患治療剤開発に多額の投資をしていて、現在、骨吸収抑制剤の開発が活発に進行されている。
骨粗鬆症と関連して過去には主に、骨の無機質、すなわちカルシウムとリンの代謝異常を中心にその研究が進行されてきたが、その発病機序解明には大きな進展が見られなかった。
現在、骨粗鬆症治療剤として使用されている物質としては、ビスホスホネート製剤(アレンドロネート、エチドロネート)、ホルモン製剤(ラロキシフェン)、ビタミンD製剤、カルシトニン製剤、カルシウム製剤などがある。しかし、ビスホスホネート製剤は、吸収率が落ちて服用方法が複雑で食道炎を誘発し、ホルモン製剤は一生服用しなければならないので長期投与する場合、乳房癌、子宮癌、胆石及び血栓症などの副作用が現われ、ビタミンD製剤は高価で効果が確かではなく、カルシトニン製剤は高価で投与方法が難しく、カルシウム製剤は副作用が少ないけれど治療よりは予防効果に限られる短所がある。
骨粗鬆症は、薬物の短期投与だけでは治療することができないので、薬物の長期投与が必須である。したがって、薬物を長期投与する時に前記のような副作用がなく、優秀な薬効を有する新しい物質が求められている。
以上のことに鑑みて、本発明者等は、熟地黄と五加皮の多様な生理活性研究を進行中、熟地黄と五加皮の混合生薬材抽出物が、毒性がないだけではなく、造骨細胞から破骨細胞の生成と活性化を防ぐタンパク質であるオステオプロテゲリンの発現を増殖させて、破骨細胞の増殖を抑制する活性を示し、副作用なしに骨粗鬆症を予防して治療するのに効果的であることを明らかにすることにより本発明を完成した。
Hofbauer L. C.,Khosla S.,Dunstan C.R.,Lacey D.L.,Boyle W.J.,Riggs B.L.,The roles of osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand in the paracrine regulation of bone resorption.J Bone Miner Res.,2000年,第15(1)巻,2−12頁 Kong Y.Y.,Feige U.,Sarosi I.,Bolon B.,Tafuri A.,Morony S.,Capparelli C.,Li J.,Elliott R.,McCabe S.,Wong T.,Campagnuolo G.,Moran E.,Bogoch E.R.,Van G.,Nguyen L.T.,Ohashi P.S.,Lacey D.L.,Fish E.,Boyle W.J.,Penninger J.M.:Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand.Nature,1999年,第402巻,304−309頁 Yasuda H.,Shima N.,Nakagawa N.,Yamaguchi K.,Kinosaki M.,Goto M.,Mochizuki S.I.,Tsuda E.,Morinaga T.,Udagawa N.,Takahashi N.,Suda T.,Higashio K.:A novel molecular mechanism modulating osteoclast differentiation and function.,Bone,1999年,第25(1)巻,109−113頁 Suda T.,Takahashi N.,Udagawa N.,Jimi E.,Gillespie M.T.,Martin T.J.:Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families.Endocr Rev,1999年,第20(3)巻,345−357頁 Aubin J.E.,Bonnelye E.:Osteoprotegerin and its ligand:a new paradigm for regulation of osteoclastogenesis and bone resorption.,Osteoporos Int,2000年,第11(11)巻,905−913頁
Hofbauer L. C.,Khosla S.,Dunstan C.R.,Lacey D.L.,Boyle W.J.,Riggs B.L.,The roles of osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand in the paracrine regulation of bone resorption.J Bone Miner Res.,2000年,第15(1)巻,2−12頁 Kong Y.Y.,Feige U.,Sarosi I.,Bolon B.,Tafuri A.,Morony S.,Capparelli C.,Li J.,Elliott R.,McCabe S.,Wong T.,Campagnuolo G.,Moran E.,Bogoch E.R.,Van G.,Nguyen L.T.,Ohashi P.S.,Lacey D.L.,Fish E.,Boyle W.J.,Penninger J.M.:Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand.Nature,1999年,第402巻,304−309頁 Yasuda H.,Shima N.,Nakagawa N.,Yamaguchi K.,Kinosaki M.,Goto M.,Mochizuki S.I.,Tsuda E.,Morinaga T.,Udagawa N.,Takahashi N.,Suda T.,Higashio K.:A novel molecular mechanism modulating osteoclast differentiation and function.,Bone,1999年,第25(1)巻,109−113頁 Suda T.,Takahashi N.,Udagawa N.,Jimi E.,Gillespie M.T.,Martin T.J.:Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families.Endocr Rev,1999年,第20(3)巻,345−357頁 Aubin J.E.,Bonnelye E.:Osteoprotegerin and its ligand:a new paradigm for regulation of osteoclastogenesis and bone resorption.,Osteoporos Int,2000年,第11(11)巻,905−913頁
本発明は、造骨細胞からオステオプロテゲリン発現増殖及び破骨細胞増殖抑制活性を有する熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)と五加皮(Acanthopanacis Cortex)の混合生薬材抽出物を提供する。
また本発明は、前記混合生薬材抽出物を有効成分とする、骨粗鬆症予防及び治療用組成物を提供する。
前記の目的を達成するために、本発明は造骨細胞からオステオプロテゲリン(osteoprotegerin;OPG)発現増殖及び破骨細胞増殖抑制活性を有する熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)と五加皮(Acanthopanacis Cortex)の混合生薬材抽出物を提供する。
熟地黄(Rehmanniae Radix Preparata)は、ゴマノハグサ科に属する薬用植物の根を蒸して乾かしたもので、漢方で薬剤に使用している。生のものを生地黄、乾かしたものを乾地黄と言って、熟地黄の中で特にお酒に浸してから蒸して乾かすことを9回繰り返して作ったものは、九地黄と言ってその薬効は最高を示す。味は甘いながらも苦みがあり、暖かい性質があり、血液を補い、精(生命が発生して活動するのに基本になる物質)を補い、腰や膝が冷えて痛い症状や月経異常、目眩などを治療し、髪を黒くする効能がある。熟地黄は、四物湯の主要薬剤で各種慢性病の中で体が虚弱のため現われる内熱、咽喉乾燥、喉の渇きなどの症状に使用される。民間療法では、豚肉を煮た汁とともに服用すれば習慣性便秘に効果があると知られている。
五加皮(Acanthopanacis Cortex)は、ウコギ科(Araliaceae)に属する潅木植物で、北半球の極東アジアにのみ分布し、韓国南部では絶滅危機にある野生保護植物である。五加皮の種類には、刺五加皮、一般五加皮および香五加皮があって、漢方では毒性も副作用もない上薬に分類され、根と皮を薬剤に使用する。葉には、チイサノサイド(Chiisanoside)が含まれていて、薬理的機能を有し、根には五加皮配糖体だけではなく、シリンギン(Syringin)、クマリン配糖体などが含まれている。五加皮には、五加皮配糖体であるアカントサイド(Acanthoside)B、Dと免疫性を高める水溶性多糖体とがある。五加皮は、味は辛くて苦く、暖かい性質を持っていて、肝経、神経に作用して風湿を無くし、益気昇精を助けると知られている。また、五労(五臓が虚弱で生ずる虚労病)と七傷(男性が虚弱のために生じる七種の症状)を補い、足が不自由な場合に使用され、これを長く服用すると、身体の気を高め、胃を保護し、精力を増強し、精神をすっきりさせ、意志力を高めて身を軽くし、老化を防止して、体内の汚れた血を清くきれいにしてくれると知られている、腰や脊椎の痛症、男性陰萎症、嚢湿および女性の陰痒症などの様々な症状を治療すると知られている。
本発明の混合生薬材抽出物は、熟地黄及び五加皮を、水、C1〜C4アルコールまたは水とC1〜C4アルコールの混合溶液で抽出したもの、より好ましくは水で抽出したものを意味し、前記混合生薬材抽出物は、下記のように製造することができる。
熟地黄及び五加皮各々を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥する。それらを抽出容器に入れて、溶媒を加えて抽出する。抽出物を室温で冷やした後、ろ紙でろ過する。前記抽出液を真空回転蒸発器を使用して減圧濃縮して、凍結乾燥して粉末状態の熟地黄抽出物及び五加皮抽出物を各々製造する。前記の過程で得た熟地黄抽出物及び五加皮抽出物を混合して、混合生薬材抽出物を製造する。
抽出方法は、前記溶媒を使用して冷浸、温浸、加熱など通常の抽出方法が可能であり、熱水抽出の場合、100℃で4時間抽出することが好ましい。
また、前記熟地黄抽出物と五加皮抽出物の混合抽出物は、熟地黄抽出物:五加皮抽出物の重量比が、15.0:0.5〜0.15:5.0で混合することが好ましく、8:1〜1:4で混合することがより好ましく、熟地黄抽出物:五加皮抽出物の重量比を4:1〜1:1で混合することが最も好ましい。
本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞から破骨細胞の生成及び活性を抑制するオステオプロテゲリンタンパク質の発現を促進させる(図1)。
また、本発明の混合生薬材抽出物は、破骨細胞の増殖を抑制する効果を有する(図2)。
特に、熟地黄抽出物:五加皮抽出物の重量比を、8:1〜1:4で混合した場合、より好ましくは熟地黄抽出物:五加皮抽出物の重量比を4:1〜1:1で混合した場合に、造骨細胞からオステオプロテゲリンタンパク質発現を促進する効果及び破骨細胞の増殖を抑制する効果が、全て顕著に現われて、各々の生薬抽出物を単独で使用する場合より、二成分の相乗作用によって、効果が顕著に向上する。
したがって、本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞から破骨細胞の生成及び活性を抑制するオステオプロテゲリンタンパク質の発現を促進させて、破骨細胞の増殖を抑制するので、骨粗鬆症予防及び治療に効果的で、骨粗鬆症予防及び治療用組成物で有用に使用することができる。
本発明の混合生薬材抽出物をラットに経口投与して毒性実験を行った結果、経口投与毒性試験による50%致死量(LD50)は、少なくとも1g/kg以上の安全な物質であると判断される。
また、本発明は、前記混合生薬材抽出物を有効成分とする、骨粗鬆症予防及び治療用組成物を提供する。
本発明の組成物は、前記混合生薬材抽出物に同一または類似の機能を示す有効成分を1種以上さらに含むことができる。
前記混合生薬材抽出物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。
すなわち、本発明の混合生薬材抽出物は、実際臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与することができ、製剤化する場合には普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤は、三七根抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム(Calcium carbonate)、スクロース(Sucrose)またはラクトース(Lactose)、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存料などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤では、プロピレングリコール(Propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基材では、ハードファット(witepsol)、マクロゴ−ル、ツイーン(tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。また、関節炎予防または治療剤としての効能増進のためにカルシウムやビタミンD3を添加することができる。
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様であり、一日投与量は、混合生薬材抽出物の量を基準に1〜1000mg/kgで、好ましくは300〜700mg/kgで、さらに好ましくは150〜450mg/kgであり、一日に1〜6回投与することができる。
本発明の組成物は、骨粗鬆症の予防及び治療のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
本発明の組成物は、骨粗鬆症改善を目的に健康食品に添加することができる。本発明の混合生薬材抽出物を食品添加物に使用する場合、前記混合生薬材抽出物をそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用したりすることができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、その使用目的(予防、健康または治療的処置)によって適合するように決定することができる。しかし、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的にしたりする長期間摂取の場合には、前記量は前記範囲以下があり得るが、安全性面で何らの問題がないので有効成分は、前記範囲以上の量でも使用することができることは明確である。
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられ、通常的な意味での健康食品をすべて含む。
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、サイクロデキストリンのようなポリサッカライド、キリシトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物100ml当り一般的に約0.01〜0.04g、好ましくは約0.02〜0.03gである。
前記の外に本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色料、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは混合して使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが本発明の組成物100重量部当り0.01〜0.1重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例及び実験例を提示する。しかし、下記の実施例及び実験例は、本発明をより易しく理解するために提供するだけのものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
実施例1:混合生薬材抽出物の製造
熟地黄及び五加皮は、漢方薬材の卸商から購入して使用した。
熟地黄及び五加皮は、漢方薬材の卸商から購入して使用した。
<1−1>熟地黄抽出物の製造
熟地黄を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥した。乾燥した熟地黄100gを3l抽出容器に入れて蒸留水1lを加えて100℃で4時間熱水抽出した。前記過程を3回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やした後、ろ紙でろ過した。前記抽出液は、真空回転蒸発器を使用して40℃以下で減圧濃縮して熟地黄抽出物を得た(収率:42%)。
熟地黄を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥した。乾燥した熟地黄100gを3l抽出容器に入れて蒸留水1lを加えて100℃で4時間熱水抽出した。前記過程を3回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やした後、ろ紙でろ過した。前記抽出液は、真空回転蒸発器を使用して40℃以下で減圧濃縮して熟地黄抽出物を得た(収率:42%)。
<1−2>五加皮抽出物の製造
五加皮を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥した。乾燥した五加皮100gを3l抽出容器に入れて蒸留水1lを加えて100℃で4時間熱水抽出した。前記過程を3回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やした後、ろ紙でろ過した。前記抽出液は、真空回転蒸発器を使用して40℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して粉末状の五加皮抽出物を得た(収率:5.8%)。
五加皮を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥した。乾燥した五加皮100gを3l抽出容器に入れて蒸留水1lを加えて100℃で4時間熱水抽出した。前記過程を3回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やした後、ろ紙でろ過した。前記抽出液は、真空回転蒸発器を使用して40℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して粉末状の五加皮抽出物を得た(収率:5.8%)。
<1−3>混合生薬材抽出物の製造
前記1−1で得た熟地黄抽出物0.15〜15.0重量部と、前記1−2で得た五加皮抽出物0.5〜5.0重量部を適切な組成比で混合し、混合生薬材抽出物を細胞培養液に希釈して、下記実験に使用した。
前記1−1で得た熟地黄抽出物0.15〜15.0重量部と、前記1−2で得た五加皮抽出物0.5〜5.0重量部を適切な組成比で混合し、混合生薬材抽出物を細胞培養液に希釈して、下記実験に使用した。
実験例1:本発明の混合生薬材抽出物による造骨細胞からオステオプロテゲリン分泌に及ぼす影響分析
本発明の混合生薬材抽出物が造骨細胞からオステオプロテゲリン分泌に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を遂行した。
本発明の混合生薬材抽出物が造骨細胞からオステオプロテゲリン分泌に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を遂行した。
<1−1>造骨細胞の培養
本発明の混合生薬材抽出物が、造骨細胞のオステオプロテゲリンの発現に及ぼす影響を評価するために、ヒト骨肉腫由来の細胞株であるMG−63細胞株とHOS細胞株を、ATCC(American Type Culture Collection、Rockville,米国)から購入して使用し、10%FBS(fetal bovine serum)を含むDMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培地で37℃、湿度95%、CO2 5%の培養器で培養して使用した。
本発明の混合生薬材抽出物が、造骨細胞のオステオプロテゲリンの発現に及ぼす影響を評価するために、ヒト骨肉腫由来の細胞株であるMG−63細胞株とHOS細胞株を、ATCC(American Type Culture Collection、Rockville,米国)から購入して使用し、10%FBS(fetal bovine serum)を含むDMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培地で37℃、湿度95%、CO2 5%の培養器で培養して使用した。
<1−2>破骨細胞生成を抑制するオステオプロテゲリンの発現測定
本発明では、造骨細胞を培養しながら実施例1で得た抽出物を処理して、OPGの分泌量が増加することを観察しようとした。
前記実験例1−1で記述したMG−63細胞株を96ウェルプレートに飽和状態になるように培養した後、色々な濃度の生薬材抽出物が含まれた血清不在(serum free)DMEM培養液2mlを添加して、16時間培養した後、上澄み液を回収した。OPG酵素免疫測定法(ELISA)を使用して、OPGが遊離した量を測定した。酵素免疫測定時の吸光度は、ダイナテックMR−7000(Dynatech Laboratorie社)機器を使用して、450nmで測定し、下記数式1を使って、培地のみ添加した対照群に対する百分率でOPG遊離量を計算した。
本発明では、造骨細胞を培養しながら実施例1で得た抽出物を処理して、OPGの分泌量が増加することを観察しようとした。
前記実験例1−1で記述したMG−63細胞株を96ウェルプレートに飽和状態になるように培養した後、色々な濃度の生薬材抽出物が含まれた血清不在(serum free)DMEM培養液2mlを添加して、16時間培養した後、上澄み液を回収した。OPG酵素免疫測定法(ELISA)を使用して、OPGが遊離した量を測定した。酵素免疫測定時の吸光度は、ダイナテックMR−7000(Dynatech Laboratorie社)機器を使用して、450nmで測定し、下記数式1を使って、培地のみ添加した対照群に対する百分率でOPG遊離量を計算した。
(数1)
<数式1>
OPG遊離増加率(%)=(1−実験群のO.D.450/対照群のO.D.450)×100
(前記式中、O.D.450は、450nmでの吸光度)
<数式1>
OPG遊離増加率(%)=(1−実験群のO.D.450/対照群のO.D.450)×100
(前記式中、O.D.450は、450nmでの吸光度)
その結果、下記表1に示したように、本発明の実施例1を添加した場合、造骨細胞で破骨細胞の生成を抑制する物質であるOPGタンパク質の発現を、実施例1の熟地黄抽出物の3及び6mg/mlの濃度で各々200%及び221%まで増加させ、五加皮抽出物の1.25mg/mlの濃度で194%まで増加させ、二つの生薬材抽出物は、濃度依存的にOPG発現を増加させる。抽出物を混合した場合、単独で処理した場合に比べて、約120〜130%以上のオステオプロテゲリンタンパク質発現増殖効果を示した(表1、図1)。特に、熟地黄抽出物を6mg/ml入れた場合より、熟地黄抽出物3mg/mlと五加皮抽出物を1.25mg/mlを混合した時、相乗作用によりOPG発現増加効果がさらに顕著に現われた。したがって、生薬材抽出物製造時、熟地黄抽出物に対する五加皮抽出物の適切な混合重量比が、OPG発現増加効果に重要な影響を及ぼすことが分かった。
前記結果から、発明の混合生薬材抽出物が、造骨細胞で破骨細胞の生成を抑制するOPG発現を増加させて破骨細胞の生成を抑制する機能をすることを確認した。
実験例2:本発明の混合生薬材抽出物による破骨細胞(osteoclast)の増殖抑制作用
本発明の混合生薬材抽出物が破骨細胞の成長及び活性にどのような影響を及ぼすのかを調べるために、カルシウムホスファートで被膜されたプレート(OAAS、OCT Inc.)に破骨細胞前駆細胞を培養して、破骨細胞の標識酵素であるTRAP(Tartrate−resistant acid phosphatase,TRAP)活性を分析した。
本発明の混合生薬材抽出物が破骨細胞の成長及び活性にどのような影響を及ぼすのかを調べるために、カルシウムホスファートで被膜されたプレート(OAAS、OCT Inc.)に破骨細胞前駆細胞を培養して、破骨細胞の標識酵素であるTRAP(Tartrate−resistant acid phosphatase,TRAP)活性を分析した。
<2−1>破骨細胞前駆細胞の純粋分離及び成熟した破骨細胞への分化誘導
マウス骨髄細胞を分離するために7〜9週になった雄のマウスを頚部捻転で犠牲にした後、大腿骨と頚骨を無菌的に摘出して軟組織を除去して腸骨の両端を切断した後、26G注射針を使用して一方の端の骨髄腔に、0.1%コラゲナーゼ(Gibco)、0.05%トリプシン及び0.5mM EDTA(Gibco)が含まれた酵素溶液1mlを注射した。骨髄を取り出した後、30分間撹拌して骨髄細胞を集めて、10%FBSが含まれたα−MEM(α−minimum essential medium)で24時間前全培養した後、未付着細胞を集めた。破骨細胞の前駆細胞になる未付着細胞をウェル当り2×105個の細胞になるように分注して培養した。8日間培養する間、20ng/ml大食細胞集落刺激因子(macrophage−colony stimulating factor,M−CSF,Peprotech,米国)と30ng/ml RANKL(Peprotech,米国)を含んだα−MEMに前記実施例の混合生薬材抽出物を処理しながら培養した。培養が終わった後、破骨細胞の生成を検査するために、細胞を固定してTRAP染色を行った。
マウス骨髄細胞を分離するために7〜9週になった雄のマウスを頚部捻転で犠牲にした後、大腿骨と頚骨を無菌的に摘出して軟組織を除去して腸骨の両端を切断した後、26G注射針を使用して一方の端の骨髄腔に、0.1%コラゲナーゼ(Gibco)、0.05%トリプシン及び0.5mM EDTA(Gibco)が含まれた酵素溶液1mlを注射した。骨髄を取り出した後、30分間撹拌して骨髄細胞を集めて、10%FBSが含まれたα−MEM(α−minimum essential medium)で24時間前全培養した後、未付着細胞を集めた。破骨細胞の前駆細胞になる未付着細胞をウェル当り2×105個の細胞になるように分注して培養した。8日間培養する間、20ng/ml大食細胞集落刺激因子(macrophage−colony stimulating factor,M−CSF,Peprotech,米国)と30ng/ml RANKL(Peprotech,米国)を含んだα−MEMに前記実施例の混合生薬材抽出物を処理しながら培養した。培養が終わった後、破骨細胞の生成を検査するために、細胞を固定してTRAP染色を行った。
<2−2>TRAP(+)である多核細胞形成測定
破骨細胞の形成測定は、破骨細胞前駆細胞をカルシウムホスファートでコーティングされたプレート上で培養した後、TRAP(+)を示す多核細胞の数で観察した。具体的に、細胞培養後、付着細胞をPBSで洗浄した後、シトレートアセテートホルムアルデヒド(citrate−acetate−formaldehyde)で5分間固定させてナフトール(naphthol)AS−BIホスファート(phosphate)、ファーストガーネット(fast Garnet)GBC溶液と7mMタルトレート緩衝溶液(tartrate buffer,pH5)を含む、37℃アセテート緩衝溶液(pH5.0)に1時間培養して、TRAP染色をした。3個以上の核を持つTRAP(+)多核細胞を破骨細胞と見なした。実施例1で製造した混合生薬材抽出物及び単一抽出物を処理して、8日間培養した後、TRAP陽性多核細胞の数の変化を測定して下の数式2で生成の抑制率を表記した。
破骨細胞の形成測定は、破骨細胞前駆細胞をカルシウムホスファートでコーティングされたプレート上で培養した後、TRAP(+)を示す多核細胞の数で観察した。具体的に、細胞培養後、付着細胞をPBSで洗浄した後、シトレートアセテートホルムアルデヒド(citrate−acetate−formaldehyde)で5分間固定させてナフトール(naphthol)AS−BIホスファート(phosphate)、ファーストガーネット(fast Garnet)GBC溶液と7mMタルトレート緩衝溶液(tartrate buffer,pH5)を含む、37℃アセテート緩衝溶液(pH5.0)に1時間培養して、TRAP染色をした。3個以上の核を持つTRAP(+)多核細胞を破骨細胞と見なした。実施例1で製造した混合生薬材抽出物及び単一抽出物を処理して、8日間培養した後、TRAP陽性多核細胞の数の変化を測定して下の数式2で生成の抑制率を表記した。
(数2)
<数式2>
TRAP(+)である多核細胞生成抑制率(%)=100−{(実験群多核細胞数/対照群多核細胞数)×100}
<数式2>
TRAP(+)である多核細胞生成抑制率(%)=100−{(実験群多核細胞数/対照群多核細胞数)×100}
表2及び図2に示されたように、熟地黄抽出物を単独で処理した時、抽出物を何も処理していない対照群の抑制の割合を0にして、対照群に比べてTRAP陽性多核細胞数の抑制割合が、各々0.125、0.25、0.5、1、2mg/mlの濃度で、12.43、12.68、40.10、49.01、81.75%で、破骨細胞の生成及び活性を抑制した。また、五加皮抽出物を単独で処理した場合、各々0.125、0.25、0.5、1mg/mlの濃度で、12.77、19.28、61.61、99.74%で、破骨細胞の形成及び活性を抑制し、濃度依存的にTRAP(+)である多核細胞生成を抑制することが示された。
特に熟地黄抽出物は、単独で処理した場合には濃度を高めても0.5mg/mlの濃度までは50%の抑制効果を越えない活性を示すだけであるが、五加皮抽出物とともに処理した場合には、低い濃度でも最大100%の抑制効果という大きな活性を示すことが分かる。また、熟地黄抽出物及び五加皮抽出物の濃度を各々0.25mg/ml以上で混合した場合、特に熟地黄抽出物を約20重量%以上含みかつ五加皮抽出物を約10重量%以上含む場合、好ましくは、熟地黄50重量%以上と五加皮抽出物25重量%以上を含む場合に、それ以下の重量%を有する場合に比べて、破骨細胞の生成が顕著に抑制されることが分かった。
したがって、本発明の混合生薬材抽出物は、熟地黄抽出物と五加皮抽出物を各々単独で処理した場合に比べて、破骨細胞の形成及び活性を相乗作用によって顕著に抑制することが分かる。
実験例3:ラットに対する経口投与急性毒性実験
本発明の混合生薬材抽出物の急性毒性を調べるために、下記のような方法で急性毒性実験を行った。
本発明の混合生薬材抽出物の急性毒性を調べるために、下記のような方法で急性毒性実験を行った。
実験動物に6週齢の特定病原体不在(specific pathogen−free,SPF)SD系ラットを使用して、急性毒性実験を実施した。各群2匹ずつの動物に、本発明の混合生薬材抽出物を各々0.5%メチルセルロース溶液に懸濁して1g/kg/mlの用量で1回単回経口投与した。試験物質投与後、動物の斃死の有無、臨床症状、体重変化を観察して血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、部検して肉眼で腹腔臓器と胸腔臓器の異常の有無を観察した。
その結果、試験物質を投与したすべての動物で特記するに値する臨床症状や斃死した動物はなく、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見などでも毒性変化は観察されなかった。
したがって、本発明の混合生薬材抽出物は、全てのラットで1g/kgまで毒性変化を示さなかったので、経口投与最小致死量(LD50)は、抽出物1g/kg以上の安全な物質であると判断された。
下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。
製剤例1:製薬製剤の製造
<1−1>散剤の製造
混合生薬材抽出物 2g
乳糖 1g
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
<1−1>散剤の製造
混合生薬材抽出物 2g
乳糖 1g
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
<1−2>錠剤の製造
混合生薬材抽出物 100mg
とうもろこし澱粉 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
混合生薬材抽出物 100mg
とうもろこし澱粉 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
<1−3>カプセル剤の製造
混合生薬材抽出物 100mg
とうもろこし澱粉 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
混合生薬材抽出物 100mg
とうもろこし澱粉 100mg
乳糖 100mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
製剤例2:食品の製造
本発明の混合生薬材抽出物を含む食品を下記のように製造した。
本発明の混合生薬材抽出物を含む食品を下記のように製造した。
<2−1>小麦粉食品の製造
本発明の混合生薬材抽出物0.5〜5.0重量%を小麦粉に添加して、その混合物を使用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。
本発明の混合生薬材抽出物0.5〜5.0重量%を小麦粉に添加して、その混合物を使用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。
<2−2>乳製品(dairy products)の製造
本発明の混合生薬材抽出物5〜10重量%を牛乳に添加して、該牛乳を使用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
本発明の混合生薬材抽出物5〜10重量%を牛乳に添加して、該牛乳を使用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
<2−3>禅食の製造
玄米、麦、もち米、ハト麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度60メッシュの粉末に製造した。
玄米、麦、もち米、ハト麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度60メッシュの粉末に製造した。
黒豆、黒胡麻、荏胡麻も公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度60メッシュの粉末に製造した。
本発明の混合生薬材抽出物を真空濃縮器で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度60メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
前記で製造した穀物類、種実類及び混合生薬材抽出物の乾燥粉末を次の割合で配合して製造した。
穀物類(玄米30重量%、ハト麦15重量%、麦20重量%)、
種実類(荏胡麻7重量%、黒豆8重量%、黒胡麻7重量%)、
混合生薬材抽出物の乾燥粉末(3重量%)、
霊芝(0.5重量%)、
地黄(0.5重量%)
種実類(荏胡麻7重量%、黒豆8重量%、黒胡麻7重量%)、
混合生薬材抽出物の乾燥粉末(3重量%)、
霊芝(0.5重量%)、
地黄(0.5重量%)
製剤例3:飲料の製造
<3−1>炭酸飲料の製造
砂糖5〜10%、クエン酸0.05〜0.3%、カラメル0.005〜0.02%、ビタミンC0.1〜1%の添加物を混合して、そこに79〜94%の精製水を混ぜてシロップを作る。前記シロップを85〜98℃で20〜180秒間殺菌して、冷却水と1:4の割合で混合した後、0.5〜0.82%の炭酸ガスを注入して、本発明の混合生薬材抽出物を含む炭酸飲料を製造した。
<3−1>炭酸飲料の製造
砂糖5〜10%、クエン酸0.05〜0.3%、カラメル0.005〜0.02%、ビタミンC0.1〜1%の添加物を混合して、そこに79〜94%の精製水を混ぜてシロップを作る。前記シロップを85〜98℃で20〜180秒間殺菌して、冷却水と1:4の割合で混合した後、0.5〜0.82%の炭酸ガスを注入して、本発明の混合生薬材抽出物を含む炭酸飲料を製造した。
<3−2>健康飲料の製造
液状果糖0.5%、オリゴ糖2%、砂糖2%、食塩0.5%、水75%のような副材料と混合生薬材抽出物を均質に配合して瞬間殺菌をした後、それをガラス瓶、PET瓶など小容器に包装して健康飲料を製造した。
液状果糖0.5%、オリゴ糖2%、砂糖2%、食塩0.5%、水75%のような副材料と混合生薬材抽出物を均質に配合して瞬間殺菌をした後、それをガラス瓶、PET瓶など小容器に包装して健康飲料を製造した。
<3−3>野菜ジュースの製造
本発明の混合生薬材抽出物5gをトマトまたはにんじんジュース1,000mlに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。
本発明の混合生薬材抽出物5gをトマトまたはにんじんジュース1,000mlに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。
<3−4>果物ジュースの製造
本発明の混合生薬材抽出物1gをリンゴまたはぶどうジュース1,000mlに加えて健康増進用果物ジュースを製造した。
本発明の混合生薬材抽出物1gをリンゴまたはぶどうジュース1,000mlに加えて健康増進用果物ジュースを製造した。
前記で詳しくみたように、本発明による熟地黄及び五加皮の混合生薬材抽出物は、造骨細胞からオステオプロテゲリンの発現を増加させて、破骨細胞の生成及び活性を効果的に抑制する効果と、破骨細胞の増殖を抑制する効果を同時に示す複合効果を示す。特に、熟地黄抽出物を20重量%以上含み、かつ五加皮抽出物を10重量%以上含む場合、さらに好ましくは、熟地黄50重量%以上と五加皮抽出物25重量%以上とを含む場合、各々の生薬抽出物を単独で使用した場合より、相乗作用によって前記効果が顕著に向上するので、骨粗鬆症予防及び治療に有用な医薬品及び健康食品に広く使用することができる。
Claims (9)
- 造骨細胞からのオステオプロテゲリン分泌促進及び破骨細胞増殖抑制活性を有する熟地黄及び五加皮の混合生薬材抽出物。
- 前記混合生薬材抽出物が、熟地黄抽出物:五加皮抽出物の重量比が15.0:0.5〜0.15:5.0であることを特徴とする、請求項1に記載の混合生薬材抽出物。
- 前記混合生薬材抽出物が、熟地黄抽出物:五加皮抽出物の重量比が8:1〜1:4であることを特徴とする、請求項1に記載の混合生薬材抽出物。
- 前記混合生薬材抽出物が、熟地黄抽出物:五加皮抽出物の重量比が4:1〜1:1であることを特徴とする、請求項1に記載の混合生薬材抽出物。
- 前記熟地黄抽出物が、熟地黄を、水、C1〜C4アルコールまたは水とC1〜C4アルコールの混合溶液で抽出したものであることを特徴とする、請求項2〜4のいずれか一項に記載の混合生薬材抽出物。
- 前記五加皮抽出物が、五加皮を、水、C1〜C4アルコールまたは水とC1〜C4アルコールの混合溶液で抽出したものであることを特徴とする、請求項2〜4のいずれか一項に記載の混合生薬材抽出物。
- 請求項1〜4のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、造骨細胞によるオステオプロテゲリン発現促進剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、破骨細胞増殖抑制剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、骨粗鬆症予防及び治療用組成物。
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