KR101646923B1

KR101646923B1 - 한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물

Info

Publication number: KR101646923B1
Application number: KR1020160010428A
Authority: KR
Inventors: 류홍선; 류원형; 최진옥
Original assignee: 류홍선; 류원형; 최진옥
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2016-08-23
Also published as: CN107006681A

Abstract

본 발명은 한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물은 말린 식용 개구리, 여정자 및 숙지황을 포함하는 한약재 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

Description

한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물{ANIMAL FEED COMPOSITION COMPRISING MEDICINAL HERBS EXTRACTS}

본 발명은 동물사료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물에 관한 것이다.

현대시대에 들어서서 인간이나 동물이 먹는 채소나 사료는 연작 피해로 인한 미량원소의 부족과 환경오염으로 인한 질병의 증가 때문에 직, 간접적으로 항생제등의 약물을 과다복용 하고 있는 실정이며 항생제에 내성이 생긴 바이러스 및 세균은 인간과 동물에 더 많은 피해를 입히고 있다.

특히 가축의 경우 미량원소의 부족으로 생식장애를 일으켜 정상적인 번식이 되지 않는 등 미량원소가 부족할 경우 인간이나 동물의 건강에 해를 끼치는 것으로 밝혀지고 있다. 그래서, 최근에는 이러한 여러 가지점들을 고려하여 동물사료가 개발되어 가축들에게 공급하고 있다. 관련 선행문헌으로 대한민국 등록특허 제10-0863607호가 있다.

한편, 최근 고령화에 따른 골다공증, 골절, 관절염과 같은 골 질환이 급격히 증가 하는 추세에 있다. 생체에서는 항상 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골 흡수가 균형을 이루며 항상성을 유지하고 있다. 골다공증은 조골세포와 파골세포의 균형이 무너져 조골세포의 작용으로 인한 골의 형성보다 파골세포의 작용으로 인한 골의 흡수가 우세하여 나타나는 질병으로, 골다공증의 원인으로 폐경과 같은 여성의 난소기능 저하로 인한 에스트로겐 결핍, 노화 및 운동부족, 스테로이드 계열의 약물의 부작용 등이 알려져 있다. 따라서, 골다공증을 효과적으로 치료 또는 예방하기 위해서는 조골세포의 활성을 증가시키거나 골흡수를 유발하는 파골세포의 활성을 억제할 필요가 있다

따라서 인간이나 동물에게 부족한 영양소가 포함된 물질 또는 인간 또는 동물에게 발생될 수 있는 질병을 예방할 수 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 뼈 관련 질병의 예방 또는 치료에 효과적인 한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일실시예에 의하면, 말린 식용 개구리, 여정자 및 숙지황을 포함하는 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 동물사료 조성물이 개시된다.

본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 동물사료 조성물은 골다공증, 관절염, 골절, 골연화증 등 뼈 관련 질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에 의하 조성물은 골 흡수를 담당하는 파골세포의 분화를 억제하여 골다공증과 같은 골질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 동물용 사료의 첨가제로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 RANKL유도 파골세포 분화에 대한 효과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 생성 억제 효과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 골흡수 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 TRAP 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 MMP-9 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 Cathepsin K 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 NFATc1 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 c-fos 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 세포독성 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명의 일실시예와 관련된 한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물 및 그 제조 방법에 대해 설명하도록 하겠다.

본 명세서에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 일실시예에 의한 동물사료 조성물에 포함된 한약재는 다양한 방법으로 추출될 수 있다.

구체적으로, 개구리를 포함하여 다양한 성분이 함유된 한약재를 냉수추출, 열수추출, 유기용매추출 또는 증류 등의 방법으로 추출할 수 있다. 상기 추출된 추출액이 상기 한약재 추출물로 그대로 사용될 수도 있고, 상기 추출된 추출액을 감압 농축 또는 동결 건조함으로써 한약재 추출물이 제조될 수도 있다.

예컨대, 한약재를 물, 저급 알콜 및 이들의 혼합 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 추출하여 수득한다. 본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물은 한약재로부터 물 또는 특정 용매를 사용하여 추출하여 수득한 물질 그 자체를 의미할 뿐만 아니라, 때때로 상기 추출하여 수득된 물질을 균주를 통하여 발효시키거나, 에테르 등의 유기 용매로 더욱 분별 추출하거나, 컬럼(column)을 통하여 분획하는 등의 가공 처리를 거친 추출 가공물 등을 의미할 수 있다.

상기 한약재는 다음의 성분을 포함할 수 있다.

상기 한약재는 말린 식용 개구리를 포함할 수 있다. 상기 식용 개구리는 맛은 달고 성질은 차갑다. 그리고 상기 식용 개구리는 열과 독소를 제거하고 허한 것을 보하고 기르며 이뇨를 통해 붓기를 제거하는 효능이 있다. 또한, 상기 식용 개구리는 피로와 체력 저하로 오는 열을 풀어주며, 혈 중의 단단하게 응결된 것을 풀어주고 혈 중 조열을 해소해 주며, 성장이 더딘 동물(예: 돼지)에 효과적이다. 또한 상기 식용 개구리는 급성 복부 팽창, 옹종 및 음부 종기 치료에도 효과적이다.

상기 한약재는 상기 말린 식용 개구리 1 중량부에 대해 여정자, 계혈등, 및 홍화자 중 적어도 하나를 각각 1.5 내지 3.5중량부의 비로 더 포함할 수 있다.

상기 한약재는 상기 말린 식용 개구리 1 중량부에 대해 숙지황, 황기, 백출, 두충, 오가피, 우슬, 진범, 금모구척, 보골지, 골쇄보, 속단, 쇄양, 선모, 및 이당 중 적어도 하나를 각각 0.5 내지 1.5 중량부의 비로 더 포함할 수 있다.

상기 한약재는 상기 말린 식용 개구리 1 중량부에 대해 독활, 및 강활 중 적어도 하나를 각각 0.2 내지 1.5 중량부의 비로 더 포함할 수 있다.

상기 한약재는 상기 말린 식용 개구리 1 중량부에 대해 토사자, 사상자, 공사인, 계지, 및 감초 중 적어도 하나를 각각 0.1 내지 1.3 중량부의 비로 더 포함할 수 있다.

구체적으로 다음과 같이 제조될 수 있다.

먼저, 상기에 기재된 말린 식용 개구리를 포함하여 다양한 한약 성분 중 적어도 일부가 선별되여 적절한 크기로 다듬어질 수 있다. 상기 다듬어진 한약재는 중량 기준으로 약 1 내지 50배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C1내지 C4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매로, 예컨대 5 내지 100에서 약 1 내지 100시간 동안 교반 추출, 열탕 추출, 냉침 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용하여 수득한 추출액을 여과, 농축 또는 건조하여 한약재 추출물을 얻을 수 있다. 필요한 경우, 상기 추출물을 물 또는 저급 알콜, 에테르 등의 유기 용매로 더 추출하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물은 파골세포의 분화를 효과적으로 저해할 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물은 골 흡수를 담당하는 TRAP, MMP-9, cathepsin K 의 발현을 억제하고, 파골세포의 분화와 활성 증가시 나타나는 NFATc1, MITF 등 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물은 침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 또는 기능식품은 통상의 제형화 방법을 통하여 제조할 수 있다. 이때, 한약재 추출물에는 침향 추출물 이외에 필요에 따라 다양한 보조 생약제, 비타민, 미네랄, 식이섬유 및 기타 의약용-식품용 보조제(예컨대, 부형제, 증강제, 코팅제 등)등이 함유될 수 있다.

파골세포(osteoclast)는 조혈 모세포의 단핵구유래 세포로서 골아 세포(osteoblast)와 함께 골성장, 골재형성 및 골절치유에 중요한 역할을 한다. 파골세포의 분화에 필요한 인자로는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand), TNF α(tumor necrosis factor α), NF-kB, ODF(osteoclast differentiation factor)등이 있다.

특히 RANKL는 파골세포 분화에 필수적인 인자이다. 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)에 의해 융합하여 다핵 파골세포(multinucleated osteoclast)로 분화 된다. RANKL은 활성화된 조골세포나 골수기질세포 또는 섬유아세포로부터 분비되며, 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 MAPK 의 활성을 촉진하고, NF-kB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 유전자인 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9 (metalloproteinase-9), cathepsin K 등의 발현을 증가 시킴으로써 골을 흡수시킨다. 또한 분화된 파골세포는 TRAF6 (TNF associated facotr 6) 및 c-Fos 신호전달을 통해 NFATc1 (nuclear factor of activated T cell 1)와 같은 전사인자들이 활성화되어 있다.

이러한 일련의 분화과정을 거쳐 파골 전구세포는 파골세포를 형성하며, 형성된 파골세포는 TRAP, MMP, cathepsin K등의 작용을 통해 골을 흡수하여 골다공증을 유발할 수 있다.

본 발명의 일실시에 의한 동물사료 조성물은 한약재 추출물 등을 함유함으로써, 파골세포 분화를 효과적으로 억제하여 골다공증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 동물사료 조성물은 한약재 추출물을 그 유효성분으로 포함할 수 있고, 당업계에 공지된 의약품 제조 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체가 첨가될 수도 있다.

상기 사용 가능한 담체의 예로는, 락토오스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 리파아제 억제제는 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가로 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 의한 동물사료 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다.

본 발명의 한약재 추출물을 함유하는 상기 동물사료 조성물은 골다공증, 골관절염의 예방 또는 치료를 위하여 치료를 위하여 임상적으로 이용될 수도 있다. 상기 한약재 추출물의 환자 투여량, 투여 횟수 및 투여시간 등은 환자의 성별, 나이, 상태, 체중, 환경 등의 조건에 따라 선택적으로 가감하고 조절할 수 있지만, 일반적으로는 1일 3회 식간에 투여하며, 0.1 mg 내지 2000 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 의한 기능성 식품은 한약재 추출물 등을 함유함으로써, 골다공증, 골관절염, 등에 대한 개선 효과를 발휘할 수 있다. 본 명세서에서 식품이란 직접 섭취 가능한 상태의 것뿐 아니라, 식료품, 식품첨가물, 식품재료 등을 포함하는 총괄적인 개념이다. 상기 기능성 식품은 상기 한약재 추출물을 단독으로 직접 첨가하여 사용할 수도 있으나, 골다공증을 예방, 치료하는데 사용되는 공지의 물질 또는 새로운 물질 및 뼈의 건강에 도움이 되는 공지의 물질 또는 새로운 물질을 첨가하여 상승 작용을 나타낼 수도 있다. 또한, 식용색소, 식용향료, 생약초, 과일, 올리고당, 키토산, 구연산 등의 일반적인 첨가제를 사용하여, 좋은 맛과 향을 내도록 할 수도 있다.

상기 한약재 추출물이 포함된 기능성 식품으로는 과자류, 아이스크림 제품류, 유가공품류, 식육제품류, 어육제품류, 면류, 음료, 조미식품, 마가린, 쇼트닝, 피자 등을 포함할 수 있다.

상기 과자류는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류 등을 포함하고, 상기 아이스크림 제품류는 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류 등을 포함할 수 있다.

상기 유가공품류는 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류 등을 포함할 수 있다.

상기 식육제품류는 식육가공품, 알가공품, 햄버거 등을 포함하고, 어육제품류 는 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등을 포함할 수 있다.

상기 면류는 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류 등을 포함하고, 상기 음료는 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 조미식품은 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예와 관련된 한약재 추출물이 포함된 동물용 조성물은 고형 펠렛, 액상 사료, 반 고형의 페이스트 형태로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 일실시예와 관련된 실험예에 대해 구체적으로 설명하기로 한다. 이하에서의 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 이하, 실험예에서는 한약재 추출물을 DBT로 표기하기로 한다.

1. 한약재 추출물(DBT)의 제조

말린 식용 개구리가 함유된 한약재를 잘게 부순후 30% 에탄올 5 L에 3시간 동안 환류 추출하는 조작을 3회 반복한 후, 추출액을 농축하여 한약재 추출물(DBT)을 수득하였다. 수득율은 17.3% 였다.

2. 파골세포 분화 실험

1) RAW 264.7 Cell 배양

RAW 264.7 세포는 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)/10% FBS(fetal bovine serum)/PC-SM 배지를 이용하여 CO2세포배양기에서 배양하였으며, 세포수는 5x103cells/well로 96 well plate를 이용하여 배양하였다. 24시간 배양 후 배양액을 버린 후, 10 % FBS, 50 ng/ml RANKL, 1 ng/ml TGFb 가 첨가된 a-MEM 으로 교환하여 세포를 배양했다. 배양액에 여러 농도의 한약재 추출물(DBT)을 첨가해 주었다. 2일에 한번씩 동일한 배지로 교환해 주면서 배양하였다.

2) 파골세포 분화 및 생성 측정

RANKL로 RAW 264.7 cell를 파골 세포로 유도한 후, 성숙한 파골 세포의 발현 marker로 알려진 tartarate-resistance acid phosphatase(TRAP)를 염색하여 TRAP-positive 세포를 확인하였다. 분화시킨 세포를 PBS로 세포를 2회 세척하고, 3.7% formaldehyde-citrate-acetone 용액으로 10분 고정시키고 증류수로 2회 세척하였다. 2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO3 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive 한 다핵세포 (TRAP(+) MNCs)를 계수하여 파골 세포의 생성지표로 하였다.

도 1은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 RANKL유도 파골세포 분화에 대한 효과를 나타낸 도면이다.

도시된 바와 같이, RANKL로 처리한 경우 파골세포 분화가 촉진되었으며, 본 발명의 일실시예 의한 한약재 추출물(DBT)은 TRAP(+) MNCs 형성을 억제하여 파골세포 분화를 현저히 억제하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물(DBT)은 파골 세포의 분화를 억제하여 골흡수를 차단하는 효과가 있는 것으로 나타났다.

3) 파골세포 기능 측정

파골세포의 활성은 TRAP 활성을 측정하여 억제여부를 측정하였다. TRAP 활성은 시그마사로부터 구입한 키트(Sigma-387A)를 사용하였다. TRAP 활성을 흡광도 값을 대조군에 대한 비율로 환산하여 나타내었으며, t-test로 유의성 검증을 하였다.(*p<0.05,**p,0.01,***p,0.001)

도 2는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 생성 억제 효과를 나타낸 도면이다.

도시된 바와 같이, 도2는 한약재 추출물(DBT)이 파골세포의 골 흡수에 관여하는 tartarate-resistant acid phosphatase (TRAP)의 활성을 억제하는 효과를 나타낸 그림이다. 본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물(DBT)은 TRAP의 활성을 현저하게 억제함으로써 파골세포의 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.

4) 파골세포 유전자발현 측정

(1) total RNA 분리

RNA를 분리하기 위하여 배양세포의 배지를 제거한 다음, 4 PBS로 3회 washing 하였다. 세포를 모은 다음, 750 ×g에서 10분간 원심 분리한 다음, ice cold PBS로 2회 씻었다. 침전된 세포에 lysis buffer를 가하여 용해시킨 다음, 12,000 ×g에서 10분간 원심 분리하여 상층을 취하였다. 다시 1M sucrose가 함유된 Tris buffer 위에 loading한 다음, 36,000rpm에서 160분간 원심분리 하였다. Polysome pellet을 취하여 SDS buffer에 녹인 후, 37에서 30분간 incubation 시켰다. Sod. Acetate buffer를 가한 다음, phenol/CsKl3용액으로 추출하였다. NaCl을 0.2M이 되도록 가한 다음, EtOH를 가한 후 -20에서 12시간 보관하였다. 침전물을 75% EtOH로 2회 washing한 다음 건조시켰다. 유전자 발현에 필요한 RNA양을 대조군과 시험군에서 mRNA양이 같도록 조정한 다음, 전기영동으로 확인하여 사용하였다.

(2) cDNA 제조

대조군 및 시험군에서 각각 분리한 total RNA 액 10ul(10 ug RNA 함유)에 oligo dT 1 ㎕ (2ug/ul)을 넣은 후 조심스럽게 혼합한 다음, 90oC에서 5분간 incubation하였다. primer가 annealing 하도록 실온에서 약 10분간 방치한 후 4oC로 유지하며 다음 시약을 가하였다. 5 x cyscript buffer 4ul, 0.1M DTT 2ul, dUTP nucleotide mix 1ul, dUTP Cydye-labelled nucleotide 0.1ul, Cyscript reverse transcriptase 1ul, H2O0.9ul을 첨가하여 20ul로 한 후, 아주 조심스럽게 손으로 tipping 혼합하였다. 이 후, 42oC에서 90분간 incubation 한 후, 얼음 상에 방치하였다. 여기에 2.5M NaOH을 2ul씩 가한 후 37oC에서 15분간 incubation하였으며, 2M HEPES buffer (free acid)를 10ul 가하여 중화시켰다. 각각의 시약은 Amersham Bioscience 에서 구입하였다.

(3) Real Time Polymerase Chain Reaction (real time-PCR)

각각의 optical tube (MicroAmp®Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode and Optical Adhesive Films, Applied Biosystems, Cat.No. 4314320)에 3배의 SybrGreen Mix 2.5 ㎕ (Sigma-Aldrich, Cat.No. S9430), 위에서 합성한 cDNA 1 ㎕, 10 pmol/㎕ primer pair mix 1 ㎕, 각각 2.5 mM의 dNTP 2 ㎕, 10xTag polymerase buffer 2.5 ㎕, Tag Polymerase 0.3㎕ 와 14.7 ㎕ H2O를 넣고, 95oC5min1cycle,95oC30sec,45oC30sec,72oC60sec40cycles,95oC20min1cycle로 증폭시켰다. Primer는 RT-PCR에 사용한 것을 이용하였다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ㎕를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정하고, ABI PRISM®7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Cat.No. 4349157)를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.

PCR에 사용한 primer는 아래 표 1에 표시하였다.

Target gene	Foeward (5'-3')	Reverse (5'-3')
TRAP	ACACAGTGATGCTGTGTGGCAACTC	CCAGAGGCTTCCACATATATGATGG
Cathepsin K	AGGCGGCTATATGACCACTG	CCGAGCCAAGAGAGCATATC
MMP-9	CGTCGTGATCCCCACTTACT	AGAGTACTGCTTGCCCAGGA
NFATc1	GGGTCAGTGTGACCGAAGAT	GGAAGTCAGAAGTGGGTGGA
c-fos	CCAGTCAAGAGCATCAGCAA	AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA
b-actin	TCACCCACACTCTGCCCAT	TCCTTAATGTCACGCACCATTT

도 3은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 골흡수 억제 효과를 나타내는 도면이다.

도 3에 도시된 그래프는 한약재 추출물(DBT)이 파골세포의 골 파괴에 관여하는 tartarate-resistant acid phosphatase (TRAP)의 활성을 억제하는 효과를 나타낸다.

도 4는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 TRAP 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.

도 4에 도시된 그래프를 통해 한약재 추출물(DBT)의 양이 증가할수록 파골세포의 TRAP 발현 억제 효과가 증가함을 확인할 수 있다.

도 5는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 MMP-9 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.

도 5에 도시된 그래프를 통해 한약재 추출물(DBT)의 양이 증가할수록 파골세포의 MMP-9 발현 억제 효과가 증가함을 확인할 수 있다.

도 6은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 Cathepsin K 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.

도 6에 도시된 그래프를 통해 한약재 추출물(DBT)의 양이 증가할수록 파골세포의 Cathepsin K 발현 억제 효과가 증가함을 확인할 수 있다.

도 7은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 NFATc1 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.

도 7에 도시된 그래프를 통해, 한약재 추출물(DBT)의 양이 증가할수록 파골세포의 NFATc1 발현 억제 효과가 증가함을 확인할 수 있다.

도 8은 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 파골세포의 c-fos 발현 억제 효과를 나타내는 도면이다.

도 8에 도시된 그래프를 통해, 한약재 추출물(DBT)의 양이 증가할수록 파골세포의 c-fos 발현 억제 효과가 증가함을 확인할 수 있다.

도 9는 본 발명의 일실시예와 관련된 동물사료 조성물에 포함된 한약재 추출물(DBT)의 세포독성 결과를 나타내는 도면이다.

도 9에 도시된 그래프를 통해, 한약재 추출물(DBT)의 양이 증가해도 세포의 독성이 증가하지 않음을 확인할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 동물사료 조성물에 함유된 한약재 조성물은 안전하고 효능이 우수한 천연약재에 식용 개구리를 가미한 한약재로 구성되어 골대사성 질환의 치료 및 예방에 효과적이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 의한 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 동물사료 조성물은 골다공증, 관절염, 골절, 골연화증 등 뼈 관련 질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있다.

상기와 같이 설명된 한약재 추출물을 포함하는 동물사료 조성물 및 그 제조 방법은 상기 설명된 실시예들의 구성과 방법이 한정되게 적용될 수 있는 것이 아니라, 상기 실시예들은 다양한 변형이 이루어질 수 있도록 각 실시예들의 전부 또는 일부가 선택적으로 조합되어 구성될 수도 있다.

Claims

말린 식용 개구리, 여정자, 숙지황, 진범, 보골지, 쇄양, 및 선모를 포함하는 한약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 동물사료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 한약재 추출물은
계혈등 및 홍화자 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물사료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 한약재 추출물은
독활 및 강활 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물사료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 한약재 추출물은
토사자, 사상자, 공사인 및 계지 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물사료 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 한약재 추출물은
상기 말린 식용 개구리 1중량부에 대해 상기 여정자를 1.5 내지 3.5중량부, 상기 숙지황을 0.5 내지 1.5 중량부의 비로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물사료 조성물.