DE69733834T2 - Thyroxin-analoge mit keiner signifikanten hormonellen aktivität zur behandlung von bösartigen tumoren - Google Patents

Thyroxin-analoge mit keiner signifikanten hormonellen aktivität zur behandlung von bösartigen tumoren Download PDF

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Description

  • QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung ist eine Teilfortführungsanmeldung der ebenfalls anhängigen US-Anmeldung Serien-Nr. 08/655,267, eingereicht am 4. Juni 1996, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Krebstherapeutika. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung spezielle Thyroxinanaloge, die keine signifikante hormonelle Wirksamkeit aufweisen, insbesondere Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat, als starke, selektive und ungiftige Antitumor-Mittel.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Maligne kanzeröse Wucherungen stellen aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften ernsthafte Herausforderungen für die moderne Medizin dar. Diese Eigenschaften schließen unkontrollierbare Zellproliferation, die zu einer ungeregelten Wucherung malignen Gewebes führt, die Fähigkeit, in lokale und sogar entfernt liegende Gewebe einzudringen, das Fehlen von Differenzierung, das Fehlen feststellbarer Symptome und am bedeutsamsten das Fehlen einer wirksamen Therapie und Vorbeugung ein.
  • Krebs kann sich in einem beliebigen Gewebe eines beliebigen Organs in einem beliebigen Alter entwickeln, Die Ätiologie von Krebs ist nicht klar definiert, aber Mechanismen, wie genetische Empfänglichkeit, Chromosomenbruchstörungen, Viren, Umweltfaktoren und immunologische Störungen, sind alle mit einer malignen Zellwucherung und Zelltransformation in Verbindung gebracht worden.
  • Die antineoplastische Chemotherapie umfasst gegenwärtig verschiedene Gruppen von Arzneistoffen, die Alkylierungsmittel, Purin-Antagonisten und Antitumor-Antibiotika einschließen. Alkylierungsmittel alkylieren Zellproteine und Nukleinsäuren, was die Zellreplikation verhindert, den Zellstoffwechsel unterbricht und schließlich zum Zelltod führt. Typische Alkylierungsmittel sind Stickstofflost, Cyclophosphamid und Chlorambucil. Die mit einer Alkylierungsmittelbehandlung verbundenen Toxizitäten schließen Übelkeit, Erbrechen, Haarausfall, hämorrhagische Zystitis, Lungenfibrose und ein erhöhtes Risiko ein, eine akute Leukämie zu entwickeln.
  • Purin-, Pyrimidin- und Folat-Antagonisten sind zellzyklus- und phasenspezifisch und, um eine Antitumor-Wirkung zu fördern, erfordern sie, dass sich die Zellen im Zellreplikationszyklus und in der DNA-Synthesephase der Replikation befinden. Die Purin-Antagonisten, wie 6-Mercaptopurin oder 6-Thioguanidin, hemmen die de novo-Purin-Synthese und Interkonversion von Purinen. Die Pyrimidin-Antagonisten, wie Cytarabin, 5-Fluoruracil oder Floxuridin, hemmen die DNA-Synthese durch Hemmen von Desoxycytidylatkinase und DNA-Polymerase.
  • Folat-Antagonisten, z.B. Methotrexate, binden sich fest an das intrazelluläre Enzym Dihydrofolat-Reduktase, was letztlich zum Zelltod führt, was aus einer Unfähigkeit resultiert, Pyrimidine zu synthetisieren. Die mit der Verwendung dieser Verbindungen verbundenen Toxizitäten schließen unter anderen Haarausfall, Myelosuppression, Erbrechen, Übelkeit und zerebelläre Ataxie ein.
  • Pflanzenalkaloide, wie Vincristin und Vinblastin, oder die Podophyllotoxine Etoposid und Teniposid hemmen im Allgemeinen die Mitose und DNA-Synthese und RNA-abhängige Proteinsynthese. Die Toxizitäten dieser Arzneistoffe sind denjenigen, die vorstehend beschrieben werden, ähnlich und schließen Myopathie, Myelosuppression, periphere Neuropathie, Erbrechen, Übelkeit und Haarausfall ein.
  • Antitumor-Antibiotika, wie Doxorubicin, Daunorubicin und Actinomycin, wirken als Interkalatoren der DNA, was die Zellreplikation verhindert, die Synthese der DNA-abhängigen RNA hemmt und die DNA-Polymerase hemmt. Bleomycin verursacht Spaltung der DNA und Mitomycin wirkt als Hemmer der DNA-Synthese durch bifunktionelle Alkylierung. Die Toxizitäten dieser Antibiotika sind zahlreich und ernst und schließen Nekrose, Myelosuppression, anaphylaktische Reaktionen, Appetitlosigkeit, dosisabhängige Kardiotoxizität und Lungenfibrose ein.
  • Andere zur chemotherapeutischen Behandlung von Krebs verwendete Verbindungen sind anorganische Ionen, wie Cisplatin, Modifikatoren der biologischen Reaktion, wie Interferon, Enzyme und Hormone. Alle diese Verbindungen werden ähnlich denjenigen, die vorstehend erwähnt sind, von toxischen Nebenwirkungen begleitet.
  • US 4,724,234 soll ein Verfahren zum Erzeugen von Onkolyse und Rückbildung maligner Tumoren und anderer maligner Zustände ohne Nebenwirkungen auf normale Körperzellen beschreiben. Und zwar wird eine kalorisch und in der Zusammensetzung definierte Ernährungskur beschrieben, die gleichzeitig mit einer Arzneistoffkur eines Mittels oder von Mitteln zu verabreichen ist, die die oxidative Phosphorylierung entkoppeln, am stärksten bevorzugt 2,4-Dinitrophenol. Auch Thyroxin wird als eines der Entkopplungsmittel aufgeführt.
  • Folglich würde es äußerst vorteilhaft sein, sichere und ungiftige chemotherapeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die Tumorzellproliferation und/oder neoplastisches Wachstum wirksam hemmen und/oder unterdrücken würden. Außerdem würde es äußerst vorteilhaft sein, sichere, wirksame und ungiftige chemotherapeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die leicht zu verabreichen sind.
  • Die Identifikation sicherer, wirksamer, ungiftiger und oral verabreichbarer organischer Verbindungen, die malignes Tumorwachstum bei Säugern herabsetzen oder zurückbilden können, und die Verwendung solcher Verbindungen zum Behandeln von Krebs ist deshalb wünschenswert und die Aufgabe dieser Erfindung.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft spezielle Thyroxinanaloge, die keine signifikante hormonelle Wirksamkeit aufweisen, insbesondere Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat ("DIME"), um malignes Tumorwachstum herabzusetzen oder zurückzubilden und um Krebs zu behandeln. Die Thyroxinanaloge sind typischerweise dadurch gekennzeichnet, dass ihnen eine signifikante hormonelle Wirksamkeit fehlt.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Medikament zur Behandlung eines malignen Tumors bei einem Säuger, das eine Menge des Thyroxinanalogs umfasst, die ausreicht, um das Wachstum des malignen Tumors herabzusetzen, wobei das Thyroxinanalog dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Verbindung ist, die eine etwa 35%ige oder höhere Hemmung der Anfangsgeschwindigkeit der Mikrotubulus-Protein-Zusammenlagerung in vitro, vorzugsweise eine etwa 45%ige oder höhere, stärker bevorzugt etwa 70%ige oder höhere und am stärksten bevorzugt etwa 90%ige oder höhere Hemmung der Anfangsgeschwindigkeit der Mikrotubulus-Protein-Zusammenlagerung in vitro bewirken kann.
  • Thyroxinanaloge, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind Verbindungen mit der Strukturformel:
    Figure 00040001
    und pharmazeutisch verträglicher Salze davon, wobei:
    X = O, S, CH2, Carboxy oder abwesend;
    Y = O oder S;
    R1 = Methyl oder Ethyl;
    R2, R3, R4 und R5 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy und Halogen ausgewählt sind; und
    R6, R7, R8 und R9 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen, NO2 und NH2 ausgewählt sind.
  • In einer anderen veranschaulichenden Ausführungsform sind Thyroxinanaloge, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, Verbindungen mit der Strukturformel:
    Figure 00050001
    und pharmazeutisch verträglicher Salze davon, wobei:
    X = O, S, CH2, Carboxy oder abwesend;
    Y = O oder S;
    R1 = Methyl oder Ethyl;
    R2, R3, R4 und R5 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy und Halogen ausgewählt sind; und
    R7 und R8 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxy, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen, NO2 und NH2 ausgewählt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Thyroxinanalog Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat ("DIME").
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 veranschaulicht die Wirkungen auf die Zellmorphologie nach 18–24 stündiger Inkubation von E-ras 20 Zellen mit 4 μM DIME. Feld A: nicht arzneistoffbehandelt (Kontrolle); Feld B: arzneistoffbehandelt; Feld C: arzneistoffbehandelt. Felder A und B sind 150-fach vergrößert; Feld C ist 300-fach vergrößert.
  • 2 ist eine graphische Darstellung, die den Rückgang an tumorerzeugender Wirkung DIMEbehandelter E-ras transformierter Rinderendothelzellen veranschaulicht; und
  • 3 ist eine graphische Darstellung, die die Serumhalbwertszeit (t½) und die orale Bioverfügbarkeit von DIME bei Mäusen veranschaulicht.
  • 4 zeigt die tumorerzeugende Wirkung einer DIME-Vorbehandlung (10 μM für 4 Tage) auf die Tumorbildung von 105 oder 106 E-ras 20 Zellen je Inokulum.
  • 5 zeigt die Wirkung der DIME-Konzentration auf die Raten der Koloniebildung durch MDA-MB-231 Zellen.
  • 6 zeigt die Induktion von DNA-Brüchen durch 0,0 μM (a), 2,0 μM (b), 5 μM (c) und 10 μM (d). E-ras Zellen (2 × 104 Zellen/cm2) wurden 18 Stunden vor dem TUNEL-Assay mit DIME behandelt.
  • 7 zeigt die dünnschichtchromatographische Trennung von DIME (D) und seinem Carbonsäure-Abbauprodukt (A) durch A-549 (Lungenkrebs) Zellextrakte (äquivalent zu 2 × 106 Zellen). Im gezeigten Experiment tritt in den Spuren 1 und 2 die Esterase-Aktivität des Extrakts während 4 Stunden Inkubation mit 1 μM DIME auf. Spur 2 veranschaulicht die Esterase-Hemmung durch 125 μM BNPP. Die Spuren 3 und 4 stellen die gleichen Experimente wie in den Spuren 1 und 2 dar, nur dass die Zellextrakte aus intakten Zellen hergestellt wurden, die 24 Stunden mit 1 μM DIME vorinkubiert, dann gewaschen und extrahiert wurden. Dieses Experiment veranschaulicht, dass die Esterase nicht durch DIME induziert wird.
  • 8 zeigt die Zunahme der hemmenden Wirkung von DIME auf das Wachstum von A-59 Zellen durch BNPP.
  • 9 stellt die Wirkung von DIME auf MDA-MB 231 Zellen graphisch dar. Die anfängliche Aussaatdichte war 0,05 × 106 pro 2 cm2.
  • 11 stellt die an menschlichen MDA-MB 231 Mammakarzinomzellkernen durchgeführte durchflusszytometrische Analyse bereit, die zeigt, dass sich durch 18 stündige Einwirkung von Arzneistoff Kerne mit einem G2-Gehalt von DNA angesammelt hatten, was eine Blockierung der M-Phase anzeigt.
  • 12 zeigt Bilder, die eine 13 stündige Verzögerung der Mitose, gefolgt von einer unregelmäßigen Teilung in sechs Tochterzellen veranschaulichen. Rahmen 1: 0 Stdn.:0 Min.; Rahmen 2: 10:55; Rahmen 3: 24:20; Rahmen 4: 24:40; Rahmen 5: 24:55; Rahmen 6: 25:10; Rahmen 7: 26:35; Rahmen 8: 28:20.
  • 13 zeigt die Wirkung von DIME auf die Verweilzeit in der M-Phase von MDA-MB-231 Zellen.
  • 14 zeigt die quantitative Analyse der anormalen Zellteilung, die durch DIME induziert wird.
  • 15 zeigt die Wirkung von DIME auf die Rate des Eintritts in die M-Phase von MDA-MB-231 Zellen.
  • 16 (A, B und C) zeigen die Hybridisierung von Chromosomen 19 DNA in DIMEbehandelten MDA-MB-231 Zellen (Metaphase gespreizt). 16A ist die Kontrolle, 16B ist das DNA-angefärbte Bild, 16C ist die Hybridisierung des Chromosoms 19 der 5 tägigen Behandlung mit 1 μM DIME (Metaphase).
  • 17 (A, B und C) zeigen die Wirkung der DIME-Behandlung auf die Mitosespindel von MDA-MB-231 Zellen. Platte A: Kontrolle (kein Arzneistoff); Platte B: 1 μM DIME für 18 Stdn.; Platte C: 1 μM DIME für 5 Tage.
  • 18 zeigt einen optischen Test für den Mikrotubuluszusammenbau (MTP-Polymerisation). Die Konzentration an GTP war 1 μM (rechte Kurve) und die Wirkung von 4 μM DIME ist in der linken Kurve veranschaulicht. Andere Bedingungen waren die gleichen, wie sie in der Legende der Tabelle 13 beschrieben sind.
  • 19 zeigt die Wirkung der zunehmenden Konzentration an DIME auf die anfänglich lineare Geschwindigkeit der MTP-Polymerisation. Die Konzentration an GTP war 1 mM, andere Bedingungen waren mit denjenigen identisch, die in der Legende der Tabelle 13 angegeben sind.
  • 20 zeigt die Michaelis-Menten-Analyse der Wirkung von 1 μM DIME (geschlossene Kreise) auf die anfänglich lineare Geschwindigkeit der MTP-Polymerisation als Funktion der GTP-Konzentration (offene Kreise, kein Arzneistoff). Andere Bedingungen waren die gleichen, wie sie in der Legende in Tabelle 13 beschrieben sind.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Wie hier verwendet:
    betrifft "Alkyl" einen gesättigten verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest. Typische Alkylreste schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Cyclopropyl, Butyl, Isobutyl, Cyclobutyl, tert.-Butyl, Pentyl und Hexyl ein.
    betrifft "Alkenyl" einen ungesättigten verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung. Der Rest kann entweder in der cis- oder trans- Konformation an der/den Doppelbindungen) vorliegen. Typische Alkenylreste schließen Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, Cyclopropenyl, Butenyl, Isobutenyl, Cyclobutenyl, tert.-Butenyl, Pentenyl und Hexenyl ein.
    betrifft "Alkinyl" einen ungesättigten verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung. Typische Alkinylreste schließen Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Isobutinyl, Pentinyl und Hexinyl ein.
    betrifft "Alkoxy" einen Rest -OR, wobei R Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist, wie vorstehend definiert.
    betrifft "Halogen" Fluor-, Chlor-, Brom- und Iodsubstituenten.
    betrifft "Säuger" Tiere oder Menschen.
    betrifft "pharmazeutisch verträgliches Salz" diejenigen Salze von Verbindungen, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen behalten und die durch Umsetzung mit anorganischen Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure erhalten werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen zum Beispiel Alkalimetallsalze, wie Natrium und Kalium, Erdalkalimetallsalze und Ammoniumsalze ein.
    betrifft "Pharmakophor" die entscheidende dreidimensionale Anordnung molekularer Einheiten oder Fragmente (oder die Elektronendichteverteilung), die von einem Rezeptor erkannt wird (Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery Bd.I: Principles and Practice 619, 5. Auflage, John Wiley & Sons, New York).
    betrifft "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung, die wirksam ist, um malignes Zellwachstum herabzusetzen, zu unterdrücken oder zurückzubilden, oder zu einer Besserung der mit Krebserkrankungen verbundenen Symptome führt.
  • Beschreibung, spezieller Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Medikamente zum Behandeln von malignen Tumoren und Krebs bei Säugern mit Analogen von Thyroxin, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie keine signifikante hormonelle Wirksamkeit aufweisen. Vorzugsweise basiert die vorliegende Erfindung teilweise auf dem überraschenden Befund, dass bestimmte Analoge von Thyroxin, die keine hormonelle Wirksamkeit zeigen, starke, selektive und ungiftige Hemmstoffe malignen Tumorwachstums sind. Das bevorzugte Thyroxinanalog wird hier als DIME bezeichnet.
  • Thyroxin, eine Aminosäure der Schilddrüse (Merck Index, 1989, 9348: 1483), und Thyroxinanaloge sind im Fachgebiet gut bekannt. Es ist in der Literatur gut eingeführt, dass Schilddrüsenhormone, speziell die Thyroxine T3 und T4, zwei verschiedene Arten biologischer Wirkungen aufweisen: eine auf den Zellstoffwechsel, die zweite auf Zelldifferenzierung und -entwicklung (Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and Analogues II. Structure-Activity Relationships," In: Hormonal Proteins and Peptides, Bd. VI, S. 107–204, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, NY). Zum Beispiel unterdrückt Thyroxin die Aufnahme von Iod durch die Schilddrüse (Money et al., 1959, "The Effect of Various Thyroxine Analogues on Suppression of Iodine-131 Uptake by the Rat Thyroid," Endocrinology 64: 123–125) und induziert Zelldifferenzierung, wie es durch Kaulquappenmetamorphose untersucht wurde (Money et al., 1958, "The Effect of Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on the Metamorphosis of Rana Pipiens Tadpoles," Endocrinology 63: 20–28). Außerdem unterdrücken Thyroxin und bestimmte Thyroxinanaloge das Wachstum nicht maligner thyreotroper Tumoren der Maushypophyse (Kumaoka et al., 1960, "The Effect of Thyroxine Analogues on a Transplantable Mouse Pituitary Tumor," Endocrinology 66: 32–38; Grinberg et al., 1962, "Studies with Mouse Pituitary Thyrotropic Tumors. V. Effect of Various Thyroxine Analogs on Growth and Secretion," Cancer Research 22: 835–841). Die strukturellen Anforderungen von Thyroxin und Thyroxinanalogen für eine metabolische Stimulation und Induktion der Zelldifferenzierung sind nicht identisch (siehe Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and Analogues II. Structure-Activity Relationships," In: Hormonal Proteins and Peptides, Bd. VI, S. 150, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, NY). Zum Beispiel haben Money et al. gefunden, dass es keine Korrelation zwischen Unterdrückung der Schilddrüseniodaufnahme und Induktion der Kaulquappenmetamorphose gibt (Money et al., 1958, "The Effect of Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on the Metamorphosis of Rana Pipiens Tadpoles," Endocrinology 63: 20–28).
  • Basierend auf diesen Beobachtungen wurde konzipiert, dass bisher unbekannte Zellreaktionen durch bestimmte Thyroxinanaloge, die keine von beiden Wirkungsweisen (metabolisch oder differenzierend), die von Thyroxin T3 und T4 gezeigt werden, zeigen, verändert oder induziert werden können.
  • Die Verbindungen
  • Thyroxinanaloge, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind Verbindungen mit der Strukturformel:
    Figure 00110001
    und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, wobei:
    X = O, S, CH2, Carboxy oder abwesend;
    Y = 0 oder S;
    R1 = Methyl oder Ethyl;
    R2, R3, R4 und R5 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy und Halogen ausgewählt sind; und
    R6, R7, R8 und R9 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen, NO2 und NH2 ausgewählt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind Thyroxinanaloge, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, Verbindungen mit der Strukturformel:
    Figure 00110002
    und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, wobei:
    X = O, S, CH2, Carboxy oder abwesend;
    Y = O oder S;
    R1 = Methyl oder Ethyl;
    R2, R3, R4 und R5 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy und Halogen ausgewählt sind; und
    R7 und R8 jeweils unabhängig aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C1-C4)-Alkenyl, (C1-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen, NO2 und NH2 ausgewählt sind.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Thyroxinanalog Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat ("DIME").
  • Thyroxinanaloge wie DIME sind in der Literatur beschrieben worden. Jedoch wurde berichtet, dass DIME im Gegensatz zu Thyroxin keine signifikante metabolische oder zelldifferenzierende Wirksamkeit (wie sie durch Kaulquappenmetamorphose bestimmt wird) aufweist (Money et al., 1958, "The Effect of Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on the Metamorphosis of Rana Pipiens Tadpoles," Endocrinology 63: 20–28; Stasilli et al., 1959, "Antigoitrogenic and Calorigenic Activities of Thyroxine Analogues in Rats," Endocrinology 64: 62–82). Zum Beispiel wird die Aufnahme von Iod in die Schilddrüse von Ratten durch DIME im Vergleich zu Thyroxin nur geringfügig (15%) gehemmt (Money et al., 1959, "The Effect of Various Thyroxine Analogues on Suppression of Iodine-131 Uptake by the Rat Thyroid," Endocrinology 64: 123–125). Außerdem wurde berichtet, dass DIME keine hemmende Wirksamkeit gegen das Wachstum eines nicht-malignen Maushypophysenadenoms aufweist (Kumaoka et al., 1960, "The Effect of Thyroxine Analogues on a Transplantable Mouse Pituitary Tumor," Endocrinology 66: 32–38; Grinberg et al., 1962, "Studies with Mouse Pituitary Thyrotropic Tumors. V. Effect of Various Thyroxine Analogs on Growth and Secretion," Cancer Research 22: 835–841). Keine Untersuchungen mit malignen Zellen sind berichtet worden.
  • Es ist jetzt herausgefunden worden, dass bestimmte Thyroxinanaloge, die keine signifikante hormonelle Wirksamkeit aufweisen, insbesondere DIME, nicht nur das Wachstum einer Vielfalt an malignen Zelltypen (siehe Tabelle 3) hemmen, sondern auch eine Tumorzellapoptose, der eine Mikrokernbildung vorausgegangen ist, induzieren. Diese zytostatischen und zytoziden Wirkungen sind strukturempfindlich. Die Prüfung von dreizehn Strukturanalogen und Homologen von DIME zeigt, dass sogar geringfügige Änderungen der Methylester- und 4'-Methoxysubstituenten das Molekül völlig unwirksam machen. Während DIME sowohl in Zell-Assays als auch in vivo hochwirksam ist, sind die 4'-Propoxy- und Ethylesterhomologen völlig unwirksam. Folglich definiert DIME eine entscheidende Anordnung molekularer Einheiten oder ein Pharmakophor mit spezieller zytostatischer und zytozider Wirkung und infolgedessen einem signifikanten chemotherapeutischen Potential.
  • Obwohl nicht beabsichtigt ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, glaubt man, dass die wahrscheinlichste molekulare Wirkungsweise der hier beschriebenen Thyroxinanaloge Zellzyklushemmung und Induktion der Apoptose ist.
  • Die Progression eukaryoter Zellen den Zellteilungszyklus hindurch wird hauptsächlich durch die Wirksamkeit Cyclin-abhängiger Proteinkinasen gesteuert. Das am besten untersuchte Ereignis ist der Übergang von G2 zur M-Phase, der durch cdc2-Kinase, komplexiert mit Cyclin B, gesteuert wird (für einen Überblick siehe Dunphy, 1994, Trends Cell. Biol. 4: 202–207). cdc2-Kinase-Aktivierung erfordert eine Phosphorylierung, ein Vorgang, der durch Proteinphosphatase 2A reguliert wird (für einen Überblick siehe Wera & Hennings, 1995, Biochem. J. 311: 17–29).
  • Es ist herausgefunden worden, dass die hier beschriebenen Thyroxinanaloge eine spezifische Aktivierung der Proteinphosphatase 2A sowohl in vitro als auch in vivo ausüben. In vivo fällt die Aktivierung der Proteinphosphatase 2A mit einer Hemmung der cdc2-Kinase und Entphosphorylierung der MAP-Kinase und Topoisomerase II zusammen, was die beiden letzteren Enzyme unwirksam macht. DIME weist keine metabolische Wirkung auf, es hemmt auch nicht die Biosynthesewege von DNA, RNA oder Proteinen. Somit ist die wahrscheinlichste Wirkungsweise Zellzyklushemmung und Induktion der Apoptose über Entphosphorylierung dieser entscheidenden regulatorischen Proteine. Folglich ist die Aktivierung der Phosphatase 2A und begleitende Hemmung der cdc2-Kinase ein wichtiges und gewaltiges therapeutisches Ziel für die Behandlung von Krebs.
  • Obwohl Änderungen an den Ester- und 4'-Positionen die Wirksamkeit von DIME signifikant zu beeinflussen scheinen, sind Thyroxinanaloge, die zum Herabsetzen malignen Tumorwachstums und Behandeln von Krebs verwendbar sind, nicht auf DIME beschränkt. Zum Beispiel zeigt das 4'-Ethoxyhomologe etwa 25–30% maximal zytozide Wirkung auf menschliche Krebszellen im Vergleich zu DIME (Beispiel 4). Es wird auch erwartet, dass DIME an den aromatischen Ringpositionen oder am Brückensauerstoff ohne signifikanten Wirksamkeitsverlust substituiert sein kann.
  • Es ist bekannt, dass die aromatischen Ringe des Thyroxins nicht innerhalb derselben Ebene enthalten sind (Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and Analogues II. Structure-Activity Relationships," In: Hormonal Proteins and Peptides, Bd. VI, S. 107–204, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, NY). Es ist auch bekannt, dass die Ringpositionen beider aromatischen Ringe in Thyroxin mit einer Vielfalt an Substituenten, die Alkyl-, Halogen-, Nitro- und Aminoreste einschließen, mit unterschiedlichen Ausmaßen an Aufrechterhaltung der hormonellen Wirksamkeit (ebd.) substituiert sein können. Außerdem kann der die Ringe verbindende Ethersauerstoff fehlen oder mit einer Vielfalt an Resten oder Atomen, die die aromatischen Ringe nicht auf dieselbe Ebene beschränken, wie zum Beispiel eine Methylengruppe, eine Carboxygruppe oder Schwefel, ersetzt sein ohne einen signifikanten Verlust an hormoneller Wirksamkeit (ebd.). Folglich wird erwartet und ist vorhersehbar, dass ähnliche Substitutionen an DIME keinen signifikanten Verlust an Wirksamkeit gegen Krebs bewirken werden. Bezeichnenderweise zeigte das 2'-Chloranalog von DIME etwa 25% maximal hemmende Wirkung auf das Wachstum menschlicher Krebszellen im Vergleich zu DIME (Beispiel 5).
  • Aufgrund der strikten Korrelation zwischen in vitro- und in vivo-Wirksamkeit (siehe Beispiele 2–7) können wirksame Verbindungen, die in den Verfahren der Erfindung verwendbar sind, zweckmäßigerweise in in vitro-Assay-Screeningtests identifiziert werden. Solche Tests können auf die Fähigkeit einer bestimmten Verbindung, Proteinphosphatase 2A zu aktivieren, prüfen, wie es in den Beispielen 2–3 beschrieben ist. Typischerweise werden Verbindungen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, die Proteinphosphatase 2A-Wirksamkeit um einen Faktor von etwa zwei bis drei steigern, wie es durch den in Beispiel 2 oder 3 beschriebenen Assay gemessen wird.
  • Solche Tests können auch auf die Fähigkeit einer bestimmten Verbindung prüfen, malignes Tumorzellwachstum in vitro oder in vivo zu hemmen oder die tumorerzeugende Wirkung maligner Zellen aufzuheben, wie es in den Beispielen 4–6 beschrieben ist. Im Allgemeinen werden wirksame Verbindungen, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, einen I50-Wert (Konzentration der Verbindung, die für 50% einer Zellkultur im Vergleich zu einer Kontrollkultur tödlich ist) im Bereich von etwa 0,5 μm bis 5,0 μm zeigen, wie es durch den in Beispiel 4 beschriebenen Assay gemessen wird.
  • Wie es einem Fachmann selbstverständlich sein wird, können viele Arten von malignen Tumorzellkulturen und -zelllinien verwendet werden, um auf Wirksamkeit zu prüfen, die HL-60, HT-144, E-ras-20, DU-145, MDA-168, MCF-7, 855-2 und MDA-MB-231 einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Natürlich können auch, wie es dem Fachmann selbstverständlich sein wird, andere in vitro- und/oder in vivo-Assays, um auf Wirksamkeit gegen Tumoren und/oder gegen Krebs zu prüfen, eingesetzt werden, um wirksame Thyroxinanaloge zu identifizieren, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
  • Die hier genannten chemischen Formeln können die Phänomene der Tautomerie oder Konformationsisomerie zeigen. Da die Formelzeichnungen innerhalb dieser Beschreibung nur eine der möglichen tautomeren oder konformationsisomeren Formen darstellen können, sollte selbstverständlich sein, dass die Erfindung beliebige tautomere oder konformationsisomere Formen umfasst, die ähnliche biologische oder pharmakologische Wirksamkeiten wie DIME zeigen, wie sie hier beschrieben sind.
  • Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Verbindungen und ihren pharmazeutisch verträglichen Salzen kann die Erfindung gegebenenfalls solvatisierte sowie unsolvatisierte Formen der Verbindungen (z.B. hydratisierte Formen) einsetzen.
  • Die hier beschriebenen Verbindungen können durch ein beliebiges Verfahren hergestellt werden, das als zur Herstellung chemischer Verbindungen anwendbar bekannt ist. Geeignete Verfahren werden durch die repräsentativen Beispiele veranschaulicht. Notwendige Ausgangsmaterialien können durch Standardverfahren der organischen Chemie erhalten werden.
  • Krebsgeschwüre
  • Die hier beschriebenen Thyroxinanaloge sind zur Behandlung einer breiten Vielfalt von Krebsgeschwüren verwendbar. Solche Krebsgeschwüre schließen als Beispiel und nicht als Beschränkung Karzinome wie Rachen-, Kolon-, Mastdarm-, Bauchspeicheldrüsen-, Magen-, Leber-, Lungen-, Brust-, Haut-, Prostata-, Eierstock-, Gebärmutterhals-, Gebärmutter- und Blasenkrebsgeschwüre, Leukämien, Lymphome, Gliome, Retinoblastome und Sarkome ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Krebs mit der Bildung solider Tumoren verbunden, die als Beispiel und nicht als Beschränkung Brustdrüsen- und Prostatakrebsgeschwüre einschließen.
  • Pharmazeutische Formulierungen und Verabreichungswege
  • Ein in der vorliegenden Erfindung verwendbares Thyroxinanalog kann einem Menschenpatienten an sich in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes oder in Form eines Arzneimittels verabreicht werden, wobei die Verbindung mit geeigneten Trägern oder Excipientien in einer therapeutisch wirksamen Menge, d.h. in Dosen, die wirksam sind, um malignes Zellwachstum herabzusetzen oder zu unterdrücken oder zu einer Besserung der mit Krebserkrankungen verbundenen Symptome zu führen, gemischt wird.
  • Verabreichungswege
  • Die hier beschriebenen Thyroxinanaloge und Arzneimittel können durch eine Vielfalt an Wegen verabreicht werden. Geeignete Verabreichungswege können zum Beispiel orale, rektale, transmukosale oder intestinale Verabreichung, parenterale Abgabe, einschließlich intramuskukärer, subkutaner, intramedullärer Injektionen, sowie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen einschließen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann man die Verbindung eher in einer lokalen als in einer systemischen Weise, zum Beispiel über Injektion der Verbindung direkt in einen soliden Tumor, häufig in einer Depotformulierung oder in einer Formulierung mit verlängerter Freisetzung verabreichen.
  • Außerdem kann man die Verbindung in einem zielorientierten Arzneistoffabgabesystem, zum Beispiel in einem mit tumorspezifischem Antikörper beschichteten Liposom, verabreichen. Die Liposomen werden auf den Tumor abgezielt sein und selektiv von ihm aufgenommen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hier beschriebenen Thyroxinanaloge und Arzneimittel oral verabreicht.
  • Zusammensetzung/Formulierung
  • Die hier beschriebenen Arzneimittel können in einer Weise, die an sich bekannt ist, z.B. mittels herkömmlicher Misch-, Lösungs-, Granulier-, Drageeherstellungs-, Pulverisier-, Emulgier-, Verkapselungs-, Einschluß- oder Gefriertrocknungsverfahren, hergestellt werden.
  • Arzneimittel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können somit in herkömmlicher Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch verträglicher Träger formuliert werden, die Excipientien und Hilfsstoffe umfassen, die das Verarbeiten der wirksamen Verbindungen in Zubereitungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die richtige Formulierung ist vom gewählten Verabreichungsweg abhängig.
  • Zur Injektion können die Mittel der Erfindung in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischem Kochsalzpuffer, formuliert werden. Zur transmukosalen Verabreichung werden Eindringmittel, die für die zu durchdringende Barriere geeignet sind, in der Formulierung verwendet. Solche Eindringmittel sind im Allgemeinen im Fachgebiet bekannt.
  • Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen leicht durch Kombinieren mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, die im Fachgebiet bekannt sind, formuliert werden. Solche Träger ermöglichen den Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen zur oralen Aufnahme durch einen Patienten, der zu behandeln ist, formuliert zu werden. Pharmazeutische Zubereitungen zur oralen Verwendung können durch Mischen der Verbindungen mit einem festen Excipiens, gegebenenfalls Mahlen eines erhaltenen Gemischs und Verarbeiten des Gemischs aus Granulatkörnern nach Zugeben geeigneter Hilfsstoffe, falls gewünscht, zum Erhalten von Tabletten oder Drageekernen erhalten werden. Geeignete Excipientien sind insbesondere Füllstoffe, wie Zucker, einschließlich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit, Cellulosepräparate, wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, können Sprengmittel, wie das vernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat, zugefügt werden.
  • Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Kennzeichnung oder zum Charakterisieren verschiedener Kombinationen von Dosen der Wirkstoffe zugefügt werden.
  • Pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, schließen Steckkapseln, die aus Gelatine hergestellt sind, sowie versiegelte Weichkapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glycerin oder Sorbit, hergestellt sind, ein. Die Steckkapseln können die wirksamen Bestandteile im Gemisch mit einem Füllstoff, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärken, und/oder Gleitmitteln, wie Talk oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In Weichkapseln können die wirksamen Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie fetten Ölen, Paraffinöl oder flüssigen Polyethylenglycolen gelöst oder suspendiert sein. Außerdem können Stabilisatoren zugesetzt werden. Alle Formulierungen zur oralen Verabreichung sollten in Dosierungen vorliegen, die für eine solche Verabreichung geeignet sind.
  • Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Lutschtabletten einnehmen, die in herkömmlicher Weise formuliert sind.
  • Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zweckmäßigerweise in Form einer Aerosolsprühdarreichung aus Druckpackungen oder einem Zerstäuber unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder eines anderen geeigneten Gases, abgegeben. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zum Abgeben einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus z.B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage, wie Lactose oder Stärke, enthaltend formuliert werden.
  • Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, z.B. durch Bolusinjektion, oder kontinuierliche Infusion formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Dosierungseinheiten, z.B. in Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern, mit einem zugefügten Konservierungsmittel vorgelegt werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln einnehmen und können Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel, enthalten.
  • Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässrige Lösungen der wirksamen Verbindungen in wasserlöslicher Form ein. Außerdem können Suspensionen der wirksamen Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen fette Öle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen ein. Wässige Injektionssuspensionen können Stoffe, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran, enthalten. Gegebenenfalls kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung hochkonzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann der Wirkstoff in Pulverform zur Herstellung mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor Verwendung vorliegen.
  • Die Verbindungen können auch in rektale Zusammensetzungen, wie Zäpfchen oder Retentionsklistiere, die z.B. herkömmliche Zäpfchengrundlagen, wie Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten, formuliert werden.
  • Zusätzlich zu den vorher beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparat formuliert werden. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskukär) oder durch intramuskukäre Injektion verabreicht werden. So können die Verbindungen zum Beispiel mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel wie eine Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauscherharzen oder als schwer lösliche Derivate, zum Beispiel als schwer lösliches Salz, formuliert werden.
  • Ein geeigneter pharmazeutischer Träger für hydrophobe Verbindungen der Erfindung ist ein Kolösungsmittelsystem, das Benzylalkohol, einen unpolaren oberflächenaktiven Stoff, ein mit Wasser mischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase umfasst. Das Kolösungsmittelsystem kann das VPD-Kolösungsmittelsystem sein. VPD ist eine Lösung aus 3% (Gew./Vol.) Benzylalkohol, 8% (Gew./Vol.) des unpolaren oberflächenaktiven Stoffs Polysorbat 80 und 65% (Gew.-Vol.) Polyethylenglycol 300, die in absolutem Ethanol zum Volumen hergestellt wird. Das VPD-Kolösungsmittelsystem (VPD:5W) besteht aus VPD, 1:1 mit einer 5%igen (Gew./Vol.) Lösung aus Dextrose in Wasser verdünnt. Dieses Kolösungsmittelsystem löst hydrophobe Verbindungen gut, und erzeugt selbst geringe Toxizität nach systemischer Verabreichung. Natürlich können die Verhältnisse eines Kolösungsmittelsystem beträchtlich verändert werden, ohne seine Löslichkeits- und Toxizitätseigenschaften zu zerstören. Außerdem kann die Identität der Kolösungsmittelkomponenten verändert werden: zum Beispiel können andere unpolare oberflächenaktive Stoffe mit geringer Toxizität an Stelle von Polysorbat 80 verwendet werden; der Fraktionsbereich des Polyethylenglycols kann verändert werden; andere biologisch verträgliche Polymere können Polyethylenglycol ersetzen, z.B. Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
  • In einer anderen Ausführungsform können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposomen und Emulsionen sind gut bekannte Beispiele von Abgabevehikeln oder -trägern für hydrophobe Arzneistoffe. Bestimmte organische Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, können auch verwendet werden, obgleich dies normalerweise auf Kosten größerer Toxizität geht. Außerdem können die Verbindungen unter Verwendung eines Systems mit verlängerter Freisetzung, wie semipermeable Matrices aus festen hydrophoben Polymeren, die das therapeutische Mittel enthalten, abgegeben werden. Verschiedene Typen von Materialien mit verlängerter Freisetzung sind eingeführt worden und sind Fachleuten bekannt. Kapseln mit verlängerter Freisetzung können in Abhängigkeit von ihrer chemischen Beschaffenheit, die Verbindungen ein paar Wochen bis zu über 100 Tage lang freisetzen.
  • Die Arzneimittel können auch geeignete Fest- oder Gelphasenträger oder -excipientien umfassen. Beispiele solcher Träger oder Excipientien schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie Polyethylenglycole, ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
  • Andere Formulierungen, die zum Verabreichen der hier beschriebenen Thyroxinanaloge geeignet sind, werden Fachleuten selbstverständlich sein und können zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Auflage gefunden werden.
  • Wirksame Dosierungen
  • Arzneimittel, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, in denen die wirksamen Bestandteile in einer therapeutisch wirksamen Menge enthalten sind. Die Bestimmung einer wirksamen Menge liegt wohl innerhalb der Fähigkeit von Fachleuten, insbesondere angesichts der hier bereitgestellten ausführlichen Offenbarung. Für eine beliebige Verbindung, die im Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann eine therapeutisch wirksame Dosis anfangs aus Zellkultur-Assays abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis bei Tiermodellen formuliert werden, um einen systemischen Konzentrationsbereich zu erreichen, der den I50-Wert, wie er bei einer Zellkultur bestimmt wird (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die für 50% einer Zellkultur tödlich ist), oder den I100-Wert, wie er bei einer Zellkultur bestimmt wird (d.h. die Konzentration der Verbindung, die für 100% einer Zellkultur tödlich ist) einschließt. Solche Information kann verwendet werden, um die verwendbaren Dosen bei Menschen genauer zu bestimmen. Anfangsdosierungen können auch durch Vergleichen der Wirksamkeit der hier beschriebenen Thyroxinanaloge in Zellkultur-Assays mit der Wirksamkeit bekannter Arzneistoffe gegen Krebs, wie Vincristin, formuliert werden. Bei diesem Verfahren kann eine Anfangsdosierung durch Multiplizieren des Verhältnisses der wirksamen Konzentrationen, die in einem Zellkultur-Assay für das Thyroxinanalog und einen bekannten Arzneistoff gegen Krebs erhalten werden, mit der wirksamen Dosierung des bekannten Arzneistoffs gegen Krebs erhalten werden. Falls zum Beispiel ein Thyroxinanalog in einem Zellkultur-Assay zweimal wirksamer ist als Vincristin (d.h. der I50 DIME-Wert ist ein halbmal so groß wie der I50 Vincristin-Wert in demselben Assay), würde eine anfängliche wirksame Dosierung des Thyroxinanalogs die Hälfte der bekannten Dosierung für Vincristin sein. Unter Verwendung dieser anfänglichen Richtlinien könnte ein Durchschnittsfachmann eine wirksame Dosierung bei Menschen bestimmen.
  • Anfangsdosierungen können auch aus in vivo-Daten abgeschätzt werden. Zum Beispiel ist gefunden worden, dass 250 mg/kg einmal täglich 5 Tage in der Woche 32 Tage mit der Magensonde verabreicht das Wachstum von Brustkrebs-Xenotransplantaten (MDA-MB-231) bei Nacktmäusen signifikant herabsetzten (siehe Beispiel 7.3).
  • Untersuchungen haben auch gezeigt, dass DIME in Serum eine Halbwertszeit (t1/2) von etwa 2–2,5 Stunden aufweist und durch Verabreichung per os zu 87% biologisch verfügbar ist (siehe Beispiel 7.2). Ein Durchschnittsfachmann könnte die Verabreichung an Menschen auf Grundlage dieser Daten leicht optimieren.
  • Dosierungsmenge und -intervall können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der wirksamen Verbindung bereitzustellen, die ausreichen, um eine therapeutische Wirkung aufrechtzuerhalten. Übliche Patientendosierungen zur oralen Verabreichung liegen im Bereich von etwa 50–2000 mg/kg/Tag, allgemein von etwa 250–1000 mg/kg/Tag, vorzugsweise von etwa 500–700 mg/kg/Tag und am stärksten bevorzugt von etwa 350–550 mg/kg/Tag. Vorzugsweise werden therapeutisch wirksame Serumspiegel durch Verabreichen mehrerer Dosen jeden Tag erreicht werden.
  • In Fällen lokaler Verabreichung oder selektiver Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Arzneistoffs nicht mit der Plasmakonzentration in Beziehung gesetzt werden. Ein Fachmann wird fähig sein, die therapeutisch wirksamen lokalen Dosierungen ohne übermäßiges Experimentieren zu optimieren.
  • Die verabreichte Menge der Zusammensetzung wird natürlich von der Person, die behandelt wird, vom Gewicht der Person, der Schwere des Leidens, der Art der Verabreichung und dem Urteil des verschreibenden Arztes abhängig sein.
  • Die Chemotherapie kann mit intermittierend wiederholt werden, solange Tumore feststellbar sind oder sogar wenn sie nicht feststellbar sind. Außerdem kann die Therapie aufgrund ihrer offensichtlichen Ungiftigkeit (nachstehend diskutiert) allein oder in Kombination mit anderen Arzneistoffen gegen Krebs oder anderen Arzneistoffen, wie zum Beispiel AZT, entzündungshemmenden Mitteln, Antibiotika, Corticosteroiden, Vitaminen und dergleichen bereitgestellt werden.
  • Ein möglicher Synergismus zwischen den hier beschriebenen Thyroxinanalogen und anderen Arzneistoffen wird erwartet und ist vorhersehbar. Außerdem wird auch ein möglicher Synergismus zwischen einer Vielzahl der Thyroxinanalogen erwartet und ist vorhersehbar.
  • Toxizität
  • Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der hier beschriebenen Thyroxinanaloge können durch standardmäßige pharmazeutische Verfahren in Zellkulturen oder bei Versuchstieren, z.B. durch Bestimmen der LD50 (der für 50% der Population tödlichen Dosis) und der ED50 (der bei 50% der Population therapeutisch wirksamen Dosis) bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischer und therapeutischer Wirkung ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis zwischen LD50 und ED50 ausgedrückt werden. Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes zeigen, sind bevorzugt. Die Daten, die aus diesen Zellkultur-Assays und Tieruntersuchungen erhalten werden, können beim Formulieren eines Dosierungsbereichs verwendet werden, der zur Verwendung beim Menschen nicht toxisch ist. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs systemischer Konzentrationen, die die ED50 mit geringer oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der eingesetzten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg variieren. Die genaue Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können von dem einzelnen Arzt in Anbetracht des Zustands des Patienten gewählt werden. (Siehe z.B. Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Kap. 1, S. 1).
  • Einer der Vorteile der Verwendung der hier beschriebenen Thyroxinanalogen zum Behandeln von Krebs ist unter anderen ihr Fehlen von Toxizität. Zum Beispiel ist gefunden worden, dass eine tägliche orale Dosis von 1 g/kg, die 12–15 Tage verabreicht wurde, keine schädlichen Wirkungen bei nackten Mäusen erzeugte (siehe Beispiel 7.1). Da die i.v. Serumhalbwertszeit (t1/2) von DIME etwa 2–2,5 Stunden ist, sind wiederholte tägliche Dosierungen der hier beschriebenen Thyroxinanaloge ohne schädliche Wirkungen vorhersehbar.
  • Die Erfindung ist beschrieben worden, die folgenden Beispiele werden angeführt, um den Erfindungsgegenstand als Beispiel zu veranschaulichen.
  • BEISPIEL 1: VERBINDUNGSSYNTHESEN
  • Vierzehn Thyroxinanaloge wurden synthetisiert, gereinigt und charakterisiert. Eine Zusammenfassung der Struktur der jeweiligen synthetisierten Verbindung und ausgewählte physikalische Daten sind in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellt.
  • TABELLE 1 Synthetisierte Thyroxinanaloge
    Figure 00250001
    • Ref.a:
    Verbindung 6 wurde gemäß Borrows et al., J. Chem. Soc. 1949: S185–S190 hergestellt.
    • b: Zersetzungstemperatur
  • 1.1 Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 1)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 1) wurde hergestellt, wie es in Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New Route to Thyroxine," J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Ausgabe Nr. 1): 5185–5190 beschrieben ist, und aus 95%igem Ethanol umkristallisiert. Schmelzpunkt: 153–155°C.
    Massenspektrum: FAB, m/z (relative Intensität): 510 (M+, 100), 479 (4,5), 384 (4,5). Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C15H12I2O4: 509,882513; gefunden: 509,882960 (Abweichung = –0,9 ppm).
    1H-NMR-Spektrum in DMSO-d6 (δ-Werte (ppm) relativ zu TMS): 3,719 (3H, Singulett), 3,876 (3H, Singulett), 6,693 (2H, Dublett, J = 9,45 Hz, plus Feinaufspaltung), 6,845 (2H, Dublett, H = 9,36 Hz, plus Feinaufspaltung), 8,390 (2H, Singulett).
  • 1.2 Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-ethoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 2)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-ethoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 2) wurde unter Verwendung der allgemeinen Methode von Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New Route to Thyroxine," J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Ausgabe Nr. 1): S185–S190, synthetisiert.
  • 1.2.1 Methyl-3,5-dinitro-4-(4'-ethoxyphenoxy)benzoat
  • In einem 50 ml Kolben wurde bei Umgebungstemperatur 4-Ethoxyphenol (Aldrich) (1492 mg, 10,8 mmol) mit 2,0 M wässriger KOH-Lösung (5,50 ml) gerührt, wobei Kalium-4-ethoxyphenolat gebildet wurde. Methyl-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat (Ullmann, 1909, Annalen der Chemie 366: 92–93; Bezugsquelle: Spectrum Chemical Company, Gardena, CA; 2606 mg, 10,0 mmol) wurde zugesetzt, das Gemisch 1 Stunde zum Rückfluss erhitzt und in einem Eisbad abgekühlt, woraufhin sich eine gummiartige Masse des Produkts absetzte. Kalte wässrige 1,0 M KOH-Lösung (20 ml) wurde zugesetzt, und nach fortgesetztem Kühlen verfestigte sich das Produkt. Der gelborangefarbene Feststoff wurde zerbrochen, auf einer Nutsche gesammelt, mit Wasser gespült und getrocknet. Das Material (3,08 g) wurde aus heißem 95%igen Ethanol (50 ml) umkristallisiert, wobei 2,56 g (70,6% Ausbeute) Methyl-3,5-dinitro-4-(4'-ethoxyphenoxy)benzoat erhalten wurden. Schmelzpunkt: 101–103°C.
    Massenspektrum (EI): M+ in Hochauflösung: berechnet für C16H14N2O8: 362,075016; gefunden: 362,074793 (Abweichung = 0,6 ppm).
  • 1.2.2 Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-ethoxyphenoxy)benzoat
  • Ein Teil (724,4 mg, 2,00 mmol) Methyl-3,5-dinitro-4-(4'-ethoxyphenoxy)benzoat wurde in Eisessig (50 ml) gelöst, mit 10% Palladium-auf-Kohle-Katalysator (Aldrich) (200 mg) in einem Parr-Minireaktor Modell 4561 gemischt, mit einer H2-Atmosphäre (43 psi) beschickt und rasch bei Umgebungstemperatur gerührt, bis der Druckabfall aufgrund der Umsetzung aufhörte (6 Minuten, endgültig 16 psi). Das Gemisch wurde sofort durch ein Celite-Bett filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Essigsäurelösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer abgezogen, wobei ein brauner, öliger Rückstand erhalten wurde, der das rohe 3,5-Diaminderivat ausmachte. Das rohe Diamin wurde in Eisessig (6,0 ml) gelöst und dadurch tetrazotiert, dass es tropfenweise über einen Zeitraum von 3 Minuten einer gerührten, eiskalten Lösung aus Natriumnitrit (345 mg, 5 mmol) in konzentrierter Schwefelsäure (3,5 ml) zugesetzt wurde. Nach 30 minütigem Rühren bei Eisbadtemperatur wurde das viskose Gemisch in eine rasch gerührte Lösung aus Kaliumiodid (3,0 g) in destilliertem Wasser (2,5 ml) bei Umgebungstemperatur pipettiert. Das dunkle Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und schließlich 5 Minuten auf 70°C erhitzt. Das Gemisch wurde in Ethylacetat (100 ml) gegossen und Wasser (50 ml) wurde zugesetzt. Das Zweiphasengemisch wurde in einen Scheidetrichter überführt, zusätzliches Ethylacetat (50 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugesetzt, und das Produkt wurde in das Ethylacetat extrahiert. Die organische (Ethylacetat-)Phase wurde mit zwei zusätzlichen Portionen Wasser (jeweils 50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Anschließende Entfernung des Ethylacetats durch Eindampfen lieferte einen dunklen, teerigen Rückstand.
  • Dieses Rohprodukt wurde in Aceton (8 ml) gelöst und durch präparative Dünnschichtchromatographieplatten (fünf) (Whatman, Kieselgel, 1000 μm Schicht, 20 cm × 20 cm, mit Fluoreszenzindikator) gereinigt. Die Platten wurden in n-Hexan:Ethylacetat:Essigsäure (3:1:0,8 Vol./Vol./Vol.) entwickelt. Die Produktbande (Rf = 0,84), unter UV-Licht sichtbar gemacht, wurde von den jeweiligen Platten gesammelt, vereinigt und von dem Kieselgel (in einem Sinterglastrichter gehalten) mit Ethylacetat (3 × 50 ml) eluiert. Entfernen des Ethylacetats lieferte einen cremefarbenen Feststoff, der aus 95%igem Ethanol (10 ml) umkristallisiert wurde. Ausbeute: insgesamt 275 mg aus zwei Ausbeuten weißer Kristalle (26% bezogen auf 2 mmol der Dinitrovorstufe). Schmelzpunkt: 123–125°C.
    Massenspektrum: EI, m/z (relative Intensität): 524 (M+, 100), 496 (16,7), 310 (9,1), 242 (6,1), 211 (7,6), 155 (6,1). Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C16H14I2O4: 523,898163; gefunden: 523,898737 (Abweichung = –1,1 ppm).
    1H-NMR-Spektrum in DMSO-d6 (δ-Werte (ppm) relativ zu TMS): 1,303 (3H, Triplett, J = 6,94 Hz), 3,877 (3H, Singulett), 3,971 (2H, Quartett, J = 6,95 Hz), 6,678 (2H, Dublett, J = 8,98 Hz, plus Feinaufspaltung), 6,879 (2H, Dublett, J = 9,06 Hz, plus Feinaufspaltung), 8,389 (2H, Singulett).
  • 1.3 Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-n-propoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 3)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-n-propoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 3) wurde hergestellt, wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist. Die Dinitrovorstufe wurde durch Behandeln einer wässrigen Lösung aus Kalium-4-n-propoxyphenolat (aus handelsüblichem 4-n-Propoxyphenol hergestellt) mit Methyl-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat synthetisiert. Das Dinitroprodukt wurde durch H2/Pd(C) zum Diaminderivat reduziert, das dann mit NaNO2/H2SO4 tetrazotiert und durch Umsetzung mit Kaliumiodid (Sandmeyer-Reaktion) zum Diiodoprodukt umgewandelt wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative DC und Kristallisation.
  • 1.4 Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-n-butoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 4)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-n-butoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 4) wurde hergestellt, wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist. Die Dinitrovorstufe wurde durch Behandeln einer wässrigen Lösung aus Kalium-4-n-butoxyphenolat (aus handelsüblichem 4-n-Butoxyphenol hergestellt) mit Methyl-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat synthetisiert. Das Dinitroprodukt wurde durch H2/Pd(C) zum Diaminderivat reduziert, das dann mit NaNO2/H2SO4 tetrazotiert und durch Umsetzung mit Kaliumiodid (Sandmeyer-Reaktion) zum Diiodoprodukt umgewandelt wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative DC und Kristallisation.
  • 1.5 Ethyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 5)
  • Ethyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 5) wurde über 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoylchlorid synthetisiert, wobei das letztere in Borrows et al., 1949, 1. Chem. Soc. 1949: S185–S190 beschrieben worden ist. So wurde 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoesäure (99,2 mg, 0,200 mmol) in einem 10 ml Kolben in 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoylchlorid umgewandelt. Nach Entfernen des überschüssigen Thionylchlorids unter Vakuum wurde wasserfreies Ethanol (5,0 ml) unter Rühren zugesetzt und das Gemisch 5 Minuten auf 70°C erhitzt. Überschüssiges Ethanol wurde entfernt und der trockene Rückstand in heißem 95%igen Ethanol (4,0 ml) gelöst, woraus der Produktester im Kühlschrank (3°C) kristallisierte. Ausbeute: 55,8 mg (53%) gelbbraun gefärbter Kristalle.
    Schmelzpunkt: 96–98°C.
    Massenspektrum (EI): Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C16H14I2O4: 523,898163; gefunden: 523,898202 (Abweichung = –0,1 ppm).
    1H-NMR-Spektrum in DMSO-d6 (δ-Werte (ppm) relativ zu TMS): 1,336 (3H, Triplett, J = 7,19 Hz), 3,717 (3H, Singulett), 4,336 (2H, Quartett, J = 7,06 Hz), 6,695 (2H, Dublett, J = 9,34 Hz, plus Feinaufspaltung), 6,895 (2H, Dublett, J = 9,20, plus Feinaufspaltung), 8,389 (2H, Singulett).
  • 1.6 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoesäure (Verbindung 6)
  • 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoesäure (Verbindung 6) wurde synthetisiert, wie es in Borrows et al., 1949, J. Chem. Soc. 1949: S185–S190 beschrieben ist.
  • 1.7 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzamid (Verbindung 7)
  • 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzamid (Verbindung 7) wurde durch Amidieren von Verbindung 1 synthetisiert. In einem 125 ml Kolben wurde Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 1) (100 mg, 0,196 mmol) in wasserfreiem Methanol (60 ml) gelöst. Wasserfreies Ammoniakgas wurde 5 Minuten bei einer mäßigen Geschwindigkeit bei Umgebungstemperatur in die Lösung perlen gelassen. Nach einstündigem Stehen im verschlossenen Kolben wurde die Ammoniakgas-Behandlung wiederholt (5 Minuten) und das Gemisch im verschlossenen Kolben 48 Stunden stehen gelassen. Das Methanol/Ammoniak wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, der trockene Rückstand in Methanol:Wasser (7:3 Vol./Vol.) (30 ml) gelöst und im Kühlschrank (3°C) kristallisiert. Ausbeute: 58,3 mg (60% Ausbeute) gelbbraun gefärbter Kristalle. Schmelzpunkt: 207–209°C.
    Massenspektrum (FAB): Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C14H11I2NO3: 494,882847; gefunden: 494,881880 (Abweichung = 2,0 ppm).
    1H-NMR-Spektrum DMSO-d6 (δ-Werte (ppm) relativ zu TMS): 3,716 (3H, Singulett), 6,682 (2H, Dublett, J = 8,93 Hz), 6,895 (2H, Dublett, J = 8,99 Hz), 7,528 (1H, Singulett), 8,113 (1H, Singulett), 8,402 (2H, Singulett).
  • 1.8 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)-N-methylbenzamid (Verbindung 8)
  • 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)-N-methylbenzamid (Verbindung 8) wurde über 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoylchlorid (siehe Beispiel 1.5) hergestellt. Das Säurechlorid wurde mit überschüssigem Methylamin in Tetrahydrofuran bei Umgebungstemperatur (1 Stunde) umgesetzt, filtriert, um Methylaminhydrochloridniederschlag zu entfernen, das Lösungsmittel abgedampft und das Produkt aus 95 %igem Ethanol kristallisiert.
  • 1.9 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)-N,N-dimethylbenzamid (Verbindung 9)
  • 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)-N,N-dimethylbenzamid (Verbindung 9) wurde über 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoylchlorid (siehe Beispiel 1.5) hergestellt. Das Säurechlorid wurde mit überschüssigem Methylamin in Tetrahydrofuran bei Umgebungstemperatur (1 Stunde) umgesetzt, filtriert, um Methylaminhydrochloridniederschlag zu entfernen, das Lösungsmittel abgedampft und das Produkt aus absolutem Ethanol kristallisiert.
  • 1.10 Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-hydroxyphenoxy)benzoat (Verbindung 10)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-hydroxyphenoxy)benzoat (Verbindung 10) wurde hergestellt, wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist. Die Dinitrovorstufe wurde durch Umsetzen von 4-Chlor-3,5-dinitrobenzoat mit Hydrochinon in Pyridinlösung hergestellt, wie es in Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine Related Substances. Part II. The Preparation of Dinitrodiphenyl Ethers," J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Ausgabe Nr. 1): S190–S199 beschrieben ist.
  • 1.11 Methyl-3,5-diiodo-4-phenoxybenzoat (Verbindung 11)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-phenoxybenzoat (Verbindung 11) wurde hergestellt, wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist. Die Dinitrovorstufe wurde durch Behandeln einer wässrigen Lösung aus Kaliumphenolat (aus handelsüblichem Phenol hergestellt) mit Methyl-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat synthetisiert. Das Dinitroprodukt wurde durch H2/Pd(C) zum Diaminderivat reduziert, das dann mit NaNO2/H2SO4 tetrazotiert und durch Umsetzung mit Kaliumiodid (Sandmeyer-Reaktion) zum Diiodoprodukt umgewandelt wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative DC und Kristallisation.
  • 1.12 Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-iodophenoxy)benzoat (Verbindung 12)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-iodophenoxy)benzoat (Verbindung 12) wurde synthetisiert, wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist. Da der Iodsubstituent in der Dinitrovorstufe hinsichtlich der Reduktion durch H2/Pd(C) selbst labil ist, wurde die Iododinitrovorstufe mit Eisenpulver in Essigsäure/95%igem Ethanol zum Iododiamin reduziert (siehe z.B. Gemmill et al., 1956, "3-Iodo-, 3,3'-Diiodo- and 3,3'-Diiodo-5-bromothyroxine," J. Am. Chem. Soc. 78: 2434–2436). Das Iododiamin wurde dann tetrazotiert und unter Verwendung der Sandmeyer-Reaktion in das Triiodoprodukt umgewandelt. Nach Reinigung durch präparative DC wurde das Produkt (Schmp. 139–141°C) aus Ethanol kristallisiert.
    Massenspektrum (EI): Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C14H9O3I3: 605,768600; gefunden: 605,767839 (Abweichung = 1,3 ppm).
    1H-NMR-Spektrum DMSO-d6 (δ-Werte (ppm) relativ zu TMS): 3,879 (3H, Singulett), 6,628 (2H, Dublett, J = 8,97 Hz plus Feinaufspaltung), 7,670 (2H, Dublett, J = 9,12 Hz plus Feinaufspaltung), 8,396 (2H, Singulett).
  • 1.13 Methyl-3,5-diiodo-4-(3'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 13)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(3'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 13) wurde synthetisiert, wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist. Die Dinitrovorstufe wurde durch Behandeln einer wässrigen Lösung aus Kalium-3-methoxyphenolat (aus handelsüblichem 3-Methoxyphenol hergestellt) mit Methyl-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat synthetisiert. Das Dinitroprodukt wurde durch H2/Pd(C) zum Diaminderivat reduziert, das dann mit NaNO2/H2SO4 tetrazotiert und durch Umsetzung mit Kaliumiodid (Sandmeyer-Reaktion) zum Diiodoprodukt umgewandelt wurde. Die Reinigung erfolgte durch präparative DC und Kristallisation.
  • 1.14 Methyl-3 5-diiodo-4-(2'-chlor-4'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 14)
  • Methyl-3,5-diiodo-4-(2'-chlor-4'-methoxyphenoxy)benzoat (Verbindung 14) wurde durch die allgemeine Methode, die in Beispiel 1.2 beschrieben ist, aber mit einem alternativen Verfahren zur Reduktion der Dinitrovorstufe synthetisiert.
  • 1.14.1 Methyl-3,5-dinitro-4-(2'-chlor-4'-methoxyphenoxy)benzoat
  • Die Dinitrovorstufe wurde durch Umsetzen von 2-Chlor-4-methoxyphenol (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) als Kalium-2-chlor-4-methoxyphenolat mit Methyl-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat hergestellt, wie es in Beispiel 1.2.1 beschrieben ist. Das Methyl-3,5-dinitro-4-(2'-chlor-4'-methoxyphenoxy)benzoatprodukt (66% Ausbeute) wurde aus Ethanol kristallisiert, wobei orangefarbene Kristalle erhalten wurden. Schmelzpunkt: 116–119°C.
    Massenspektrum (EI): M+ bei Hochauflösung: berechnet für C15H11ClN2O8: 382,020393; gefunden: 382,020187 (Abweichung = 0,5 ppm).
  • 1.14.2 Methyl-3,5-diiodo-4-(2'-chlor-4'-methoxyphenoxy)benzoat
  • Da der 2'-Chlorsubstituent in der Dinitrovorstufe hinsichtlich der Reduktion durch H2/Pd(C) labil ist, wurde die Vorstufe mit Eisenpulver in Essigsäure/95%igem Ethanol, ähnlich zu Beispiel 1.12, zum 2'-Chlordiamin reduziert. So wurde in einem 250 ml Kolben Methyl-3,5-dinitro-4-(2'-chlor-4'-methoxyphenoxy)benzoat (765,5 mg, 2,00 mmol) in Eisessig (35 ml) und 95%igem Ethanol (35 ml) gelöst, die Lösung auf 70°C erhitzt und Eisenpulver (2,00 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem Heizbad (70°C) kräftig verwirbelt. Nach 3 minütigem Verwirbeln entwickelte das Gemisch eine braune Farbe. Das Verwirbeln wurde 35 Min. bei 70°C fortgesetzt. Das Gemisch wurde dann in einen Scheidetrichter überführt, Wasser (250 ml) und Ethylacetat (250 ml) wurden zugesetzt, das Produkt wurde in die Ethylacetatphase extrahiert und die Ethylacetatphase sich von der wässrigen Phase abtrennen gelassen (3 Stunden). Der Extrakt wurde über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet, filtriert und das Ethylacetat durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei das rohe 3,5-Diaminoprodukt erhalten wurde, das sich verfestigte.
  • Das rohe Diaminoprodukt wurde sofort in Eisessig (6,0 ml) gelöst, tetrazotiert und über die Sandmeyer-Reaktion zum Methyl-3,5-diiodo-4-(2'-chlor-4'-methoxyphenoxy)benzoat umgewandelt, wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist. Nach Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie (Rf = 0,70), wie es in Beispiel 1.2 beschrieben ist, wurde das Produkt aus 95%igem Ethanol kristallisiert (250,8 mg cremefarbene Kristalle, 23% Ausbeute). Schmelzpunkt: 132–134°C.
    Massenspektrum: EI, m/z (relative Intensität): 546 (34), 545 (16), 544 (M+, 100), 418 (6), 382 (6). Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C15H11ClI2O4: 543,843541; gefunden: 543,843424 (Abweichung = 0,2 ppm).
    1H-NMR-Spektrum in DMSO-d6 (δ-Werte (ppm) relativ zu TMS): 3,747 (3H, Singulett), 3,881 (3H, Singulett), 6,328 (1H, Dublett, J = 8,97 Hz), 6,780 (1H, Dublett von Dubletts, J = 9,10 Hz und J = 2,95 Hz), 7,195 (1H, Dublett, J = 3,02 Hz), 8,400 (2H, Singulett).
  • 1.15 Andere Verbindungen
  • Zusätzliche Thyroxinanaloge, die hier beschrieben sind, können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Synthesen aus entsprechenden Ausgangsmaterialien synthetisiert werden, wie es Fachleuten der organischen Chemie leicht ersichtlich sein wird. Zusätzliche Anleitung kann im Fachgebiet gefunden werden, insbesondere in Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New Route to Thyroxine," J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Ausgabe Nr. 1): S185–S190; Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part II. Preparation of Dinitrophenyl Ethers," J. Chem. Soc. 1949 (Supp. Ausgabe Nr. 1): S190–S199; Clayton et al., 1951, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part VIII. The Preparation of Some Halogeno- and Nitro-diphenyl Ethers," J. Chem. Soc. 1951: 2467–2473; Gemmill et al., 1956, "3-Iodo-, 3,3'-Diiodo- und 3,3'-Diiodo-5-bromothyroxine," J. Am. Chem. Soc. 78: 2434–2436; Meltzer et al., 1957, "Thyroxine Analogs," J. Org. Chem. 22: 1577–1581; Crowder et al., 1958, "Bisbenzylisoquinolines. Part Π. The Synthesis of 5-(2-Aminoethyl)-4'-carboxy-2,3-dimethoxydiphenyl Ether," J. Chem. Soc. 1958: 2142–2149; Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and Analogues, I. Synthesis, Physical Properties and Theoretical Calculations" In: Hormonal Proteins and Peptides Bd. VI, S. 57–105, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, NY (und darin zitierte Literaturangaben); und Jorgensen, 1978, "Thyroid Hormones and Analogues, II. Structure-Activity Relationships," In: Hormonal Proteins and Peptides, Bd. VI, S. 107–204, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, NY (und darin zitierte Literaturangaben).
  • BEISPIEL 2: AKTIVIERUNG GEREINIGTER PROTEINPHOSPHATASE 2A
  • Die Verbindungen 1 und 3, wie sie in Tabelle 1 bezeichnet sind, wurden auf Proteinphosphatase 2A-Aktivierung geprüft.
  • 2.1 Herstellung von 32P-markiertem Histon H1-Substrat
  • Histon H1 wurde mit Proteinkinase C (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY in einem Volumen von 100 μl gemäß Standardprotokollen phosphoryliert. In einer anderen Ausführungsform wurde Histon H1 mit p34cdc2-Kinase phosphoryliert, die aus sich rasch vervielfältigenden Mytilus Edulis-Embryos im Stadium 4 – 8 nach Isolation mit der P13-Suc-Agarose-Technik gereinigt wurde (Smythe und Newport, 1992, "Coupling of Mitosis to the Completion of S Phase in Xenopus Occurs via Modulation of the Tyrosine Kinase that Phosphorylates p34cdc2," Cell 68: 787–797).
  • 2.2 Phosphatase-Assay
  • 125 ng gereinigte Proteinphosphatase 2A (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY; Usui et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 10455–10463) wurde mit Thyroxinanalog (50 μM) in Puffer (20 mM MOPS oder Tris, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 60 μM β-Mercaptoethanol) 10 Min. bei 23°C vorinkubiert. Das Gesamtreaktionsvolumen war 20 μl. 32P-markiertes Histon H1-Substrat (10 μg, 105 cpm) wurde zugesetzt und die Entphosphorylierungsreaktion 5 Min. bei 23°C ablaufen gelassen, und nach der Zeit wurde die Umsetzung durch Zugabe von 2 μl Laemmli-Puffer gequencht. Eine identische Umsetzung, die 125 ng unbehandelte Proteinphosphatase 2A enthielt, wurde als Kontrolle ablaufen gelassen.
  • Phosphoryliertes und dephosphoryliertes Histon H1 wurden durch Gelelektrophorese (12% SDS-PAGE) getrennt, Banden, die phosphoryliertes Histon H1 enthielten, wurden ausgeschnitten und mittels eines Szintillationszählers auf 32P-Aktivität untersucht.
  • 2.3 Ergebnisse
  • Die Geschwindigkeit der Dephosphorylierung in 5 Min. ist ein Anzeichen für die Anfangsgeschwindigkeit (Vinit) der Dephosphorylierungsreaktion. Vinit für die Verbindungen 1 und 3 ist in der nachstehenden Tabelle 2 bereitgestellt. TABELLE 2 Aktivierung der Proteinphosphatase 2A
    Figure 00350001
    Angegebene Werte sind der Mittelwert von drei Proben.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass eine kurze (10 Min.) Vorinkubation der Proteinphosphatase 2A mit DIME (Verbindung 1) Vinit der Histon H1-Dephosphorylierung mehr als verdoppelt. Das 4'-Propoxyhomologe aktivierte Proteinphoshatase 2A nicht. Diese Daten zeigen an, dass sogar kleinere Änderungen in den Enden der DIME-Pharmakophorstruktur (d.h. den Methoxy- und Methylestergruppen) die Aktivität wesentlich beeinflussen. Diese Daten korrelieren stark mit der Proteinphosphatase 2A-Aktivierung, die bei in vitro-Assays maligner Zellen (siehe Beispiel 3) beobachtet wird, und mit der antitumorigenen Wirksamkeit in vivo, wie sie bei Mäusen beobachtet wird (siehe Beispiele 4 und 6).
  • BEISPIEL 3: AKTIVIERUNG DER PROTEINPHOSPHATASE A2 IN TUMORZELLKULTUREN
  • Die Verbindungen 1–13 wurden auf Proteinphosphatase 2A-Aktivierung in malignen Tumorzellkulturen in vitro gemäß dem Protokoll geprüft, das in Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a Ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-Amino-1,2-Benzopyrone (INH2BP), "International J. of Oncology 8: 239–252 beschrieben ist. Die Ergebnisse für die Aktivierung durch DIME (Verbindung 1) sind in Tabelle 3 tabelliert. Alle anderen Verbindungen waren unwirksam. TABELLE 3 Wirkung von DIME auf die Phosphatase-Aktivität von E-ras 20-Zellkernextrakt
    Figure 00360001
    • Pi
    = Anorganisches Phosphat
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass 50 μM DIME Proteinphosphatase 2A sowohl in E-ras transformierten Rinderendothelzellen als auch in DU-145 Zellen um mindestens das Doppelte aktiviert.
  • BEISPIEL 4: ZELLZERSTÖRENDE WIRKUNG AUF MENSCHLICHE KREBSZELLEN
  • Die zytozide Wirkung der Verbindungen 1–13 wurde in vitro an sieben menschlichen Krebszelllinien geprüft. DIME (Verbindung 1) war maximal wirksam, wobei das Ethoxyderivat (Verbindung 2) 25–30% der maximalen Wirksamkeit aufwies.
  • 4.1 Versuchsprotokoll
  • Sieben menschliche Krebszelllinien wurden von der American Tissue Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und in den empfohlenen Wachstumsmedien aufrechterhalten. Die Zellen wurden in Vertiefungen (2 cm2) bei einer Dichte von 2 × 104 Zellen/cm2 ausgesät. Verschiedene Konzentrationen der Verbindungen 1–13 wurden den Medien zum Zeitpunkt der Aussaat zugesetzt.
  • Die Kulturen wurden 72 Stunden bei 37°C (5%ige CO2-Atmosphäre) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit Trypsin abgelöst und in einem Hämozytometer gezählt.
  • 4.2 Ergebnisse
  • DIME (Verbindung 1) war maximal wirksam, wobei das Ethoxyanalog (Verbindung 2) 25–30% der maximalen Wirksamkeit aufwies. Alle anderen geprüften Analogen (Verbindungen 3–13) waren völlig unwirksam.
  • Die Versuchsergebnisse für DIME (Verbindung 1) sind in nachstehender Tabelle 4 tabelliert. I100 bezeichnet die Konzentration, bei der keine lebensfähigen Zellen übrigblieben; I50 die Konzentration, bei der 50% lebensfähige Zellen im Vergleich zu einer Kontrolle übrigblieben.
  • TABELLE 4 Wirkung von DIME auf verschiedene menschliche Krebszelllinien
    Figure 00370001
  • BEISPIEL 5: HEMMUNG DES TUMORZELLWACHSTUMS
  • Die Verbindungen 1 und 14 wurden auf Hemmung des Wachstums von MDA-MD-231 Krebszellen geprüft. Verbindung 14 zeigte etwa 25% hemmende Wirksamkeit im Vergleich zu DIME (Verbindung 1).
  • 5.1 Versuchsprotokoll
  • Menschliche MDA-MD-231 Krebszellen wurden von der American Tissue Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und in den empfohlenen Wachstumsmedien aufrechterhalten. Zellen wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Verbindungen 1 und 14 3 Tage bei 37°C wachsen gelassen.
  • 5.2 Ergebnisse
  • Die Versuchsergebnisse sind in nachstehender Tabelle 5 tabelliert.
  • TABELLE 5 Wachstumsrate von MDA-MD-231 Zellen
    Figure 00380001
  • Das 2'-Chloranalog von DIME (Verbindung 14) zeigte etwa 25% hemmende Wirksamkeit im Vergleich zu DIME (Verbindung 1).
  • BEISPIEL 6: VERLUST DER TUMORERZEUGENDEN WIRKUNG VON E-RAS TRANSFORMIERTEN RINDERENDOTHELZELLEN
  • Die morphologische Wirkung von DIME (Verbindung 1) wurde in einer äußerst tumorigenen E-ras transformierten Rinderendothelzelllinie geprüft.
  • 6.1 Versuchsprotokoll
  • E-ras transformierte Rinderendothelzellen (Bauer et al., 1996, Intl. J. Oncology 8: 239–252) wurden 3 Tage 10 μM DIME ausgesetzt. Die DIME-behandelten Zellen (105 oder 106 Zellen/100 μl) wurden Nacktmäusen subkutan injiziert und die Tumorentwicklung wurde über 25 Tage verfolgt.
  • 6.2 Ergebnisse
  • Wie es in 1 veranschaulicht ist, induzierte die Einwirkung von 10 μM DIME auf E-ras transformierte Endothelzellen für einen Zeitraum von 3 Tagen erhebliche Mikrokernbildung, die mit einem Verlust an tumorerzeugender Wirkung zusammentrifft. Wie es in 2 veranschaulicht ist, zeigten Tiere, die nichtbehandelten Zellen ausgesetzt wurden, Tumorwachstum (obere Kurven), wobei sie den Tumoren nach 25 Tagen erlagen. Die Einwirkung von 10 μM DIME auf Zellen vor der Injektion hob die tumorerzeugende Wirkung fast vollständig auf (untere Kurven). Tumoren traten sogar nach 3 Monaten ohne in vivo-Arzneistoffbehandlung nicht auf.
  • BEISPIEL 7: IN VIVO-VERSUCHE
  • Die folgenden Beispiele zeigen die Ungiftigkeit, biologische Verfügbarkeit, Serumhalbwertszeit (t1/2) und in vivo-Wirksamkeit von DIME beim Behandeln von menschlichen Brustkrebs-Xenotransplantaten bei Mäusen.
  • 7.1 Toxizität
  • Zehn Nacktmäusen wurde eine tägliche orale Dosis von l4C-markiertem DIME (Verbindung 1) (1,0 g/kg, 0,1 ml in Maiskeimöl) über einen Zeitraum von 12–15 Tagen verabreicht. Während der ganzen Behandlungszeit wurden keine schädlichen Wirkungen bei irgendeiner der Mäuse beobachtet.
  • 7.2 Serumhalbwertszeit (t1/2) und Bioverfügbarkeit Mäusen wurde oral eine Dosis mit 126 mg/kg 14C-markiertem DIME (Verbindung 1) verabreicht. Nach Verabreichen der Dosis waren Blutprobenentnahmezeiten 15 und 30 Minuten und 1, 2, 4, 6, 8 und 24 Stunden. Teilmengen (50 μl) von Blut wurden in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler untersucht und die Daten als Mikrogrammäquivalente pro ml ausgedrückt. Die Blutspiegeldaten wurden durch das RSTRIP-Verfahren (Micromath, Salt Lake City, UT).
  • Parallelen Gruppen von Mäusen wurden intravenös eine Dosis mit 24,5 mg/kg 14C-markiertem DIME verabreicht und Blutprobenentnahmezeiten waren 10, 20 und 30 Minuten und 1, 2, 4, 6 und 8 Stunden.
  • 7.2.1 Ergebnisse
  • Die Blutserumspiegel von 14C-markiertem DIME (mg-äq./ml) werden in 3 veranschaulicht. Die Fläche unter der Blutkonzentrations-Zeit-Kurve war 665,28 μg-Stdn./ml für den oralen Weg (Daten durch Kreise dargestellt) und 156 μg-Stdn./ml für den intravenösen Weg (Daten durch Quadrate dargestellt). Die biologische Verfügbarkeit von oral verabreichtem DIME wurde aus diesen Daten unter Verwendung eines standardmäßigen Verhältnis × Dosis-Verfahrens zu 83% berechnet. Die DIME-Halbwertszeit (t1/2) war etwa 2–2,5 Stunden.
  • 7.3 In Vivo-Wirksamkeit
  • Die Fähigkeit menschlicher Tumoren, als Xenotransplantate bei athymischen Mäusen (z.B. Nacktmäusen) zu wachsen, stellt ein brauchbares in vivo-Modell zum Untersuchen der biologischen Reaktion auf . Therapien für menschliche Tumoren bereit. Seit der ersten erfolgreichen Xenotransplantation menschlicher Tumoren in athymische Mäuse (Rygaard und Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 77: 758–760), sind viele verschiedene menschliche Tumorzelllinien (z.B. Brust, Lungen, Urogenital, Gastrointestinal, Kopf und Hals, Glioblastom, Knochen und maligne Melanome) erfolgreich bei Nacktmäusen transplantiert und wachsen gelassen worden. Menschliche Brusttumorzelllinien, die MCF-7, ZR75-1 und MDA-MB-231 einschließen, sind als subkutane Transplantate bei Nacktmäusen eingeführt worden (Warri et al., 1991, Intl. J. Cancer 49: 616–23; Ozzello & Sordat, 1980, "Behaviour of Tumors Produced by Transplantation of Human Mammary Cell Lines in Athymic Nude Mice," Eur. J. Cancer 16: 553–559; Osbourne et al., 1985, Cancer Res. 45: 584–590; Siebert et al., 1983, Cancer Res. 43: 2223–2239).
  • Dieses Experiment zeigt die Hemmung von MDA-MB-231 Xenotransplantaten bei Nacktmäusen.
  • 7.3.1 Versuchsprotokoll
  • MDA-MB-231 (menschliche Brustkrebs-) Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und in den empfohlenen Wachstumsmedien aufrechterhalten. Zwanzig Nacktmäuse wurden jeweils subkutan mit MDA-MB-231 Zellen (106 Zellen/100 μl) beimpft. Einer Gruppe von zehn Mäusen wurde einmal pro Tag, 5 Tage pro Woche, insgesamt 32 Tage DIME mit der Magensonde (250 mg/kg, 10 ml/kg in Maiskeimöl) verabreicht. Der anderen (Kontroll-) Gruppe von zehn Mäusen wurde gemäß dem gleichen Dosierungsplan nur Vehikel gegeben. Tumoren wurden zweimal in der Woche unter Verwendung eines Vernier-Messtasters gemessen, und das durchschnittliche Tumorvolumen wurde an jedem Zeitpunkt bestimmt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung eines unpaarigen, zweiseitigen t-Tests durchgeführt und die Ergebnisse wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse analysiert.
  • 7.3.2 Ergebnisse
  • Die durchschnittliche Tumormasse an den Tagen 14, 21, 28 und 32 nach Beimpfung ist für behandelte und unbehandelte Mäuse in Tabelle 5 tabelliert.
  • TABELLE 6 MDA-MB-231 Tumorvolumen nach DIME-Behandlung
    Figure 00420001
    • aSEM = Standardabweichung des Mittelwerts
  • Diese Daten zeigen, dass DIME eine signifikante Reduktion malignen Tumorwachstums bewirkt, sogar unter einer nicht optimierten Behandlungsvorschrift.
  • 7.4 In Vivo-Wirksamkeit
  • Andere hier beschriebene Thyroxinanaloge werden geprüft, wie es vorstehend beschrieben ist. Gemäß diesen Assays wird erwartet, dass die Analogen Wirksamkeit zeigen.
  • BEISPIEL 8: FORMULIERUNGEN
  • Die folgenden Beispiele stellen beispielhaft nicht beschränkende Formulierungen zum Verabreichen der Thyroxinanalogen der Erfindung an Säuger-, insbesondere Menschenpatienten bereit. Obwohl die Beispiele Formulierungen von DIME zeigen, ist es selbstverständlich, dass beliebige der hier beschriebenen Thyroxinanaloge formuliert werden können, wie es in den folgenden Beispielen vorgesehen ist.
  • 8.1 Tablettenformulierung
  • Tabletten, die jeweils 60 mg Wirkstoff enthalten, sind folgendermaßen zusammengesetzt:
  • Figure 00430001
  • Der Wirkstoff, Stärke und Cellulose werden durch ein Sieb mit Nr. 45 mesh (US) passiert und gründlich gemischt. Die Polyvinylpyrrolidonlösung wird mit den resultierenden Pulvern gemischt, die dann durch ein Sieb mit Nr. 14 mesh (US) passiert werden. Das Granulat wird bei 50°–60°C getrocknet und durch ein Sieb mit Nr. 18 mesh (US) passiert. Die Natriumcarboxymethylstärke, Magnesiumstearat und Talk, vorher durch ein Sieb mit Nr. 60 mesh (US) passiert, werden dann dem Granulat zugesetzt, das nach Mischen durch eine Tablettiermaschine zusammengepresst wird, wobei jeweils 150 mg wiegende Tabletten erhalten werden.
  • Tabletten können aus den in Tabelle 1 aufgelisteten Bestandteilen durch Feuchtgranulierung, gefolgt von Verpressen, hergestellt werden.
  • 8.2 Gelatinekapseln
  • Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt:
  • Figure 00430002
  • Die vorstehenden Bestandteile werden gemischt und in 460 mg Mengen in Hartgelatinekapseln gefüllt.
  • 8.3 Aerosollösung
  • Eine Aerosollösung wird hergestellt, die die folgenden Bestandteile enthält:
  • Figure 00440001
  • Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch einem Teil des Treibgases 22 zugesetzt, auf –30°C abgekühlt und in eine Abfüllvorrichtung überführt. Die erforderliche Menge wird dann einem Edelstahlbehälter eingespeist und mit dem Rest des Treibgases verdünnt. Die Ventileinheiten werden dann an dem Behälter eingebaut.
  • 8.4 Zäpfchen
  • Jeweils 225 mg Wirkstoff enthaltende Zäpfchen werden folgendermaßen hergestellt:
  • Figure 00440002
  • Der Wirkstoff wird durch ein Sieb mit Nr. 60 mesh (US) passiert und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher unter Verwendung der minimal notwendigen Wärme geschmolzen werden. Das Gemisch wird dann in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abkühlen gelassen.
  • 8.5 Suspensionen
  • Jeweils 50 mg Medikament pro 5 ml Dosis enthaltende Suspensionen werden folgendermaßen hergestellt:
  • Figure 00450001
  • Der Wirkstoff wird durch ein Sieb mit Nr. 45 mesh (US) passiert und mit der Natriumcarboxymethylcellulose und dem Sirup gemischt, wobei eine glatte Paste gebildet wird. Die Benzoesäurelösung, Geschmack und etwas Farbstoff werden mit etwas von dem Wasser verdünnt und unter Rühren zugesetzt. Genügend Wasser wird dann zugesetzt, um das erforderliche Volumen herzustellen.
  • BEISPIEL 9:
  • Substitution eines H-Atoms in Position 5 des 6-Amino-l,2-benzopyrens durch ein Iodatom erhöhte signifikant die PADPRT-hemmende Wirksamkeit, die Wirksamkeit gegen HIV und die Antitumorwirkung der Stammverbindung. Cole et al., 1991 "Inhibtion of HIV-1 IIIb Replication in AA-2 Cells in Culture by Two Ligands of Poly (ADP-Ribose) Polymerase: 6-Amino-1,2-benzopyrone and 5-iodo-6-amino-l,2-benzopyrone" Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 504–514; Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH2BP)" Intl. J. Oncol. 8: 239–252. Die Frage trat auf, ob eine Erhöhung der Zahl von Iodsubstitutionen in bestimmten aromatischen Molekülen ihre molekularen pharmakologischen Eigenschaften ändern kann oder nicht. Als Zugang zu dieser Frage analysierten wir zuerst die zelluläre Wirkung bekannter Diiodo-Verbindungen, wie Schilddrüsenhormonanaloge.
  • Es ist festgestellt worden, dass metabolische oder metamorphogene Wirkungen von Schilddrüsenhormonanalogen von ihrer chemischen Struktur abhängen. E. Jorgensen 1978, "Thyroid Hormones and Analogs. II. Structure-Activity Relationships," In: Hormonal Protein and Peptides Bd. VI, C. H. Li (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 108–203. Das hormonell inaktive Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat (DIME) wurde zuerst 1949 synthetisiert (Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New Route to Thyroxine", J. Chem. Soc. Suppl. Ausgabe Nr. 1: S185–S190), aber es ist keine signifikante metabolische oder metamorphogene Wirkung dieses Stoffes berichtet worden, Money et al., 1958, "The Effect of Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on the Metamorphosis of Rana pipiens Tadpoles", Endocrinology 63: 20–28; Stasili et al., 1959, "Antigoitrogenic and Calorigenic Activities of Thyroxine Analogues in Rats", Endocrinology 64: 62–82; Money et al., 1959, "The Effect of Various Thyroxine Analogues on Suppression of 131I Uptake by the Rat Thyroid", Endocrinology 64: 123–125; Kumaoka et al., 1960, "The Effect of Thyroxine Analogues on a Transplantable Mouse Pituitary Tumor", Endocrinology 66: 32–38; Grinberg et al., 1962, "Studies with Mouse Pituitary Thyrotropic Tumors. V. Effect of Various Thyroxine Analogs on Growth and Secretion", Cancer Res. 22: 835–841. In einer von den Erfindern früher begonnenen Arbeit ist DIME sowohl in Zellkulturen als auch in vivo als mögliches tumorizides Mittel gezeigt worden. Kun et al., 1996, "Induction of Tumor Apoptosis by Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr. 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829; Zhen et al., 1997, "Induction of Metaphase Block and Endoreduplication in Human Cancer Cells by 3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoate (DIME)". Zusammenfassung, Amer. Assoc. Cancer Res., Symposium on Cell Signaling and Cancer. Die Synthese und Prüfung strukturell Homologer und Analoger von DIME, die sich nur in den Seitenkettensubstitutionen unterscheiden, wie es in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/655,267, eingereicht am 4. Juni 1996, "Method of Treating Malignant Tumors with Thyroxine Analogs having No Significant Hormonal Activity", gezeigt ist, skizzierte die strukturelle Spezifität von DIME für tumorizide Wirkung.
  • Die folgende Arbeit zeigt den Struktur-Wirkungs-Vergleich von DIME und 17 seiner Analogen, und beschreibt die tumorizide Wirkung von DIME selbst auf einer zellulären Ebene. Arzneistoffinetabolismus und zelluläre Aufnahme-Assays mit DIME zeigten die Gründe für das Fehlen seiner Toxizität bei Tieren in vivo. Die zytometrische Analyse der Wirkungsweise von DIME und biochemische Mechanismen sind die Gegenstände fortlaufender Untersuchungen.
  • Substituierte Phenole für die Synthese der Verbindungen 1–4 und 10–18 in Tabelle 1 wurden von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) erhalten. Methyl-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat, F. Ullmann, 1909, "Die 4-Chlor-3,5-dinitrobenzoesäure", Annalen der Chemie 36: 92–93, wurde aus 4-Chlor-3,5-dinitrobenzoesäure (Aldrich) hergestellt.
  • 9.1 Allgemeine Synthese
  • Jedes substituierte Phenol (als sein Kaliumphenolat) wurde mit Methyi-4-chlor-3,5-dinitrobenzoat umgesetzt, wobei das Methyl-3,5-dinitro-4-(substituiertes Phenoxy)benzoat erhalten wurde, das dann zum entsprechenden 3,5-Diamin reduziert und durch die Sandmeyer-Reaktion zur Ziel-3,5-Diiodoverbindung umgewandelt wurde. Kun et al., 1996, "Induction of Tumor Apoptosis by Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr. 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829. Im Allgemeinen erfolgte die Reduktion durch katalytische Hydrierung, aber für Fälle, in denen R1 oder R3 ein Halogenatom ist, (Verbindungen 12 und 14) erfolgte die Reduktion durch Eisenpulver in Essigsäure/Ethanol, um Dehalogenierung zu vermeiden. Kun et al., 1996, "Induction of Tumor Apoptosis by Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy) Benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr. 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829. Die Reingung erfolgte im Allgemeinen durch präparative Dünnschichtchromatographie und Kristallisation. Für Verbindungen, bei denen R2 in Tabelle 7 etwas anderes als Methoxy ist (d.h. Verbindungen 5–9), wurden zusätzliche Synthesereaktionen verwendet. Verbindung 6 wurde durch Basenhydrolyse der Verbindung 1 hergestellt. Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, und a New Route to Thyroxine", J. Chem. Soc. Suppl. Ausgabe Nr. 1: S185–S190. Verbindungen 5, 8 und 9 wurden durch Umsetzung des Säurechlorids von 6, Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New Route to Thyroxine", J. Chem. Soc. Suppl. Ausgabe Nr. 1: S185–S190, mit wasserfreiem Ethanol, Methylamin bzw. Dimethylamin hergestellt. Kun et al., 1996," Induction of Tumor Apoptosis by Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy) Benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr, 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829. Verbindung 7 wurde durch Umsetzung von 1 mit Ammoniak in wasserfreiem Methanol erhalten. Alle Verbindungen mit Ausnahme der bekannten Carbonsäure 6 wurden durch Schmelzpunkt und Hochauflösungsmassenspektrometrie charakterisiert (Tabelle 7). 1H-NMR-Spektren wurden für Verbindungen 1 – 14 gemessen und waren in allen Fällen zufrieden stellend.
  • Figure 00490001
  • 9.2 Synthese der Verbindung 1
  • Die Synthese der Verbindung 1 (DIME) wurde durchgeführt, wie es früher von Borrows et al., 1949, "The Synthesis of Thyroxine and Related Substances. Part I. The Preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives, and a New Route to Thyroxine", J. Chem. Soc. Suppl. Ausgabe Nr. 1: S185–S190 beschrieben ist, Schmp. 153–155°C. Grundlegende Spektralmessungen, die früher nicht für diese Verbindung angegeben sind, sind folgendermaßen.
  • UV-Absorptionsspektrum in Ethanol, τ max (ε): 289 nm (4,20 × 103), 232 nm (3,08 × 104), 213 nm (2,48 × 104).
    Massenspektrum: FAB, m/z (relative Intensität): 510 (M+, 100), 479 (4,5), 384 (4,5). Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C15H12I2O4: 509,882513; gefunden: 509,882960 (Abweichung = –0,9 ppm).
    1H-NMR-Spektrum in DMSO-d6 (δ-Werte (ppm) relativ zu TMS): 3,719 (3H, Singulett), 3,876 (3H, Singulett), 6,693 (2H, Dublett, J = 9,45 Hz, plus Feinaufspaltung), 6,845 (2H, Dublett, J = 9,36 Hz, plus Feinaufspaltung), 8,390 (2H, Singulett).
  • 9.3 Synthese der Verbindung 7
  • Die Synthese der Verbindung 7 (3,5-Diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzamid) wurde durch 5-minütiges Sprudeln von Ammoniak in eine Lösung der Verbindung 1 (100 mg, 0,196 mmol) in wasserfreiem Methanol (60 ml) bei Umgebungstemperatur erreicht. Nach einstündigem Stehen in einem verschlossenen Kolben wurde das Gemisch wieder mit Ammoniak behandelt und dann 48 Stunden verschlossen stehen gelassen. Das Methanol/Ammoniak wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, der trockene Rückstand in warmem Methanol:Wasser (7:3 Vol./Vol.) (30 ml) gelöst und im Kühlschrank (3°C) kristallisiert. Ausbeute: 58,3 mg (60%) gelbbraun gefärbter Kristalle, Schmp. 207–209°C.
    Massenspektrum (FAB): Hochauflösungsdaten für den M+-Peak: berechnet für C14H11I2NO3: 494,882847; gefunden: 494,881880 (Abweichung = 2,0 ppm).
    1H-NMR-Spektrum in DMSO-d6 (δ-Werte; (ppm) relativ zu TMS): 3,716 (3H, Singulett), 6,682 (2H, Dublett, J = 8,93 Hz, plus Feinaufspaltung), 6,895 (2H, Dublett, J = 8,99 Hz, plus Feinaufspaltung), 7,528 (1H, Singulett), 8,113 (1H, Singulett), 8,402 (2H, Singulett).
  • 9.4 Zellkulturen
  • E-ras 20 Zellen wurden gezüchtet, wie es angegeben ist, Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH2BP)", Intl. J. Oncol. 8: 239–252; HT-144 (Melanom), DU-145 (Prostatakrebs), HeLa (Gebärmutterhalskrebs), HL 60 (Promyelozytenleukämie), MDA-MB-231 (Brustkrebs), SK-Br-3 (Brustkrebs), T47D (duktaler Brustkrebs), A559 (Lungenkrebs) wurden von American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und in vorgeschriebenen Medien gezüchtet. Die Wirkung von DIME wurde in Kulturen mit einer Ausgangszelldichte von 2 × 104 Zellen pro cm2 geprüft und der Vergleich der Wirkung von DIME auf das Zellwachstum (intakte Zellen werden durch Trypanblauausschluß identifiziert) wurde durch direkte Zellzählung nach Trypsinisierung in einem Hämozytometer 72 Stunden nach Arzneistoffzugabe untersucht.
  • 9.5 Tumorerzeugende Wirkung von E-ras 20 Zellen
  • Die tumorerzeugende Wirkung von E-ras 20 Zellen bei athymischen Nacktmäusen wurde untersucht, wie es vorher beschrieben ist. Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH2BP)", Intl. J. Oncol. 8: 239–252. Die antitumorigene Wirkung von DIME in vivo wurde an athymischen Mäusen, die mit 106 MDA-MB-231 Zellen beimpft waren, wie in dem Assay zur tumorerzeugenden Wirkung untersucht. In etwa 10–14 Tagen, wenn subkutane Tumoren auftauchten, wurde die DIME-Behandlung, die aus einer p.o.-Verabreichung einer DIME-Suspension (einmal am Tag) besteht, begonnen und 28–32 Tage fortgesetzt, wie es angegeben ist, Kun et al., 1996, "Induction of tumor apoptosis by methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr. 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829.
  • 9.6 Assays zur Quantifizierung der Koloniebildung
  • Assays zur Quantifizierung der Koloniebildung wurden durchgeführt, wie es angegeben ist, Vidair et al., 1986 "Evaluation of a Role for Intracellular Na+, K+, Ca2+ and Mg2+ in hyperthermic cell killing" Radiation Res. 105: 187–200.
  • 9.7 DIME-Sepharose-Affinitätssäule
  • EAH-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) (2,0 g nass) wurde mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel gegen 60%iges DMF (wässr.) umgetauscht. Der nasse Kuchen wurde erneut in 60%igem DMF (1,0 ml) suspendiert, welches das Carbonsäurederivat von DIME (Verbindung 6) (60 mg) und einen zehnfachen Überschuss von N,N'-Dicylohexylcarbodiimid (Sigma) enthielt, und die Suspension wurde bei Umgebungstemperatur 16 Stunden vorsichtig gedreht. Die Sepharose-Perlen wurden dann auf einem Sinterglasfilter gesammelt und nacheinander mit DMF, Dioxan, DMF, wässrigem DMF (66%, 50% und 33%) und schließlich mit Wasser gewaschen. Bezogen auf das UV-Absorptionsspektrum der substituierten Perlen war der Gehalt an DIME-Gruppen im Bereich von 1–2 mmol pro ml feuchten Kuchens.
  • 9.8 Metabolismus von [14C]-DIME
  • (a) Mausgewebehomogenisat (Gehirn, Niere, Leber, Lunge), das aus 0,2 g Gewebe in 1,0 ml Homogenisierungspuffer (50 mM Tris (pH 7,4), 400 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM PMSF) besteht, wurde jeweils mit 1,0 ml MES-Puffer (100 mM, pH 6,5), der 20 μM [14C]-DIME (10,55 mCi/mmol) enthielt, vereint und die Gemische wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurden jedem Röhrchen nacheinander Ethylacetat (1,5 ml), Ammoniumsulfat (900 mg) und 60%ige Perchlorsäure (160 μl) zugesetzt, wobei nach jeder Zugabe verwirbelt wurde. Nach zehnminütigem Stehen wurde die Phasentrennung durch Zentrifugation auf dem Labortisch verbessert. Die obere (Ethylacetat) Phase wurde abgezogen, und die untere wässrige Phase und das Phasengrenzflächenmaterial wurden mit einer zweiten Portion Ethylacetat (1,5 ml) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte (vereint) enthielten mehr als 90% der gesamten im ursprünglichen Inkubat (ca. 4 × 105 cpm) vorliegenden cpm. Die Extrakte wurden unter Verwendung eines N2-Stroms zur Trockne eingedampft, die jeweiligen Rückstände in Ethylacetat 100 μl) aufgenommen und Teilmengen (10 μl) auf analytische Kieselgel-DC- Platten (flexible Whatman PE SIL G/UV Platten, 250 μm Dicke, 10 cm × 20 cm) getüpfelt und mit 3:1:0,8 Vol.:Vol.:Vol. n-Hexan/Ethylacetat/Ethanol entwickelt. Analytbanden einschließlich [14C]-DIME als Bezugsstandard wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Zusätzliche Bezugsstandards (nicht radioaktives DIME und sein Carbonsäureanalog) wurden auf den Platten unter UV-Licht sichtbar gemacht. (b) Metabolismus von [14C]-DIME in Zellen in Kultur: Zellen (2–5 × 106 in jedem Versuch) wurden mit [14C]-DIME inkubiert, dann homogenisiert und wie in (a) auf Metaboliten untersucht.
  • 9.9 Intrazelluläre Konzentration von DIME
  • Monolayerkulturen in 9,6 cm2 Vertiefungen (3 ml Medium) wurden 24 Stunden [14C]-DIME (10,55 mCi/mmol) ausgesetzt, dann siebenmal mit 1 ml Medium, das unmarkiertes DIME enthielt gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml 4%iger Na2CO3-Lösung und 0,2 M NaOH gelöst und die Radioaktivität durch Szintillationszählung gemessen. Das Zellvolumen wurde durch Hämatokrit und Zellzählung aus parallelen Vertiefungen, die mit unmarkiertem DIME behandelt waren, bestimmt.
  • 9.10 Assay auf DNA-Schnitte
  • Der Assay auf DNA-Schnitte als Zeichen für Apoptose erfolgte über die Terminale Desoxynucleotidyl-Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)-Reaktion, wie es durch den Hersteller des Assay-Kits spezifiziert ist (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA, Kat.-Nr. 168-4817).
  • 9.11 Ergebnisse
  • Der Carboxylesterase-Hemmer Bis-[p-nitrophenyl]phosphat (BNPP), Heymann et al., 1968, "Inhibition of phenacetin and acetanilide-induced methemoglobinemia in the rat by the carboxyl esterase inhibitor of bis-[p-nitrophenyl]phosphate", Biochem. Pharmacol. 18: 801–811, wurde von Sigma erhalten.
  • Die strukturelle Spezifität von DIME und seinen Homologen und Analogen kann durch Untersuchen von Tabelle 7 und Tabelle 8 bewertet werden. Wir haben 17 neue Strukturanaloge von DIME hergestellt und die Antitumorwirksamkeit von 10 der Verbindungen (Tabelle 8) verglichen, was ausreichend scheint, um einige allgemeine Schlüsse zu ziehen. Der ausgewählte biologische Assay war die Bestimmung der antitumorigenen Wirkung der Arzneistoffe auf die tumorerzeugende Wirkung von E-ras Zellen bei Nacktmäusen in vivo, Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH2BP)", Intl. J. Oncol. 8: 239–252. E-ras 20 Zellen (105 oder 106) wurden 4 Tage mit 10 μM DIME oder Analogen inkubiert, dann wurden 105 und 106 Zellen subkutan in Nacktmäuse (5 pro Versuch) geimpft und die Tumorbildungsraten durch direkte Tumorvolumenmessungen (vgl. 2) quantitativ bestimmt. Wie es für DIME selbst gezeigt ist (4), wurde die Tumorbildung vollständig aufgehoben. Identische antitumorigene Versuche wurden mit neun DIME-Analogen durchgeführt und, wenn man die Wirkung von DIME als 100% nimmt, (Vergleichen von Tumorgrößen an Tag 25) wurde die Wirksamkeit gegen Tumoren als Prozent der DIME-Wirksamkeit berechnet. Es sollte beachtet werden, dass E-ras 20 Zellen relativ weniger empfindlich gegen DIME sind als menschliche Tumoren; deshalb dienen diese Ergebnisse nur als Basis zum Vergleich der DIME-Analogen. Die in Tabelle 8 zusammengefassten Ergebnisse veranschaulichen, dass Substituenten in R1 und R2 die Wirksamkeit gegen Tumoren bestimmen. Diese Wirkung ist besonders auffällig, wenn man CH3O, EtO, n-PrO, nBuO in R1 vergleicht, was darauf hindeutet, dass Seitenkettenparameter, nicht die Bindung der "Thyroxin-artigen" Kernstruktur selbst, die pharmakologische Spezifität zu verleihen scheinen.
  • Diese Schlussfolgerung wird durch vorläufige Proteinbindungsuntersuchungen mit der DIME-Sepharose-Affinitätssäule bekräftigt. In dieser Affinitätssäule wurde DIME kovalent an eine Matrix an R2 gebunden; deshalb würde dieses DIME-Derivat analog zu den Ergebnissen in Tabelle 8 eine significant geringere tumorizide Wirkung als DIME aufweisen (Siehe Kun et al., US-Patentanmeldung. Serien-Nr. 08/655,267, eingereicht am 4. Juni 1996, "Method of treating malignant tumors with thyroxine analogs having no significant hormonal activity", deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Dennoch führte die Perkolation von Zellextrakten durch diese Säule zu Proteinbindung an die Affinitätsmatrix; eines der absorbierten Proteine wurde als Tubulin identifiziert. Die Proteinbindung von DIME wurde durch das Centricon-Verfahren bestimmt, wie es vorher angegeben ist, Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH2BP)", Intl. J. Oncol. 8: 239–252. Berechnet aus Scatchard-Plots wurden kD-Werte von 109 bis 1010 mit in Zellextrakten anwesenden Proteinen, sogar mit BSA, erhalten, was eine vermutlich hydrophobe Assoziation von DIME mit verschiedenen Proteinen anzeigt. Auf Basis der Ergebnisse mit der DIME-Sepharose-Affinitätssäule schreiben wir diese Bindung der "Kern"-Struktur von DIME zu.
  • TABELLE 8 Hemmung der E-ras 20 tumorerzeugenden Wirkung: Wirksamkeit von DIME und einigen Strukturanalogen
    Figure 00550001
  • Die Wirksamkeit von DIME-Analogen auf die tumorerzeugende Wirkung von E- ras 20 Zellen bei athymischen Mäusen in vivo wurde mit der von DIME (Verbindung 1), die als 100 genommen wurde, verglichen, wobei die Größe der Tumorreduktion an Tag 25 bestimmt wurde. Vorbehandlung mit DIME oder seinen Analogen (Tabelle 7) erfolgte mit 10 μM 4 Tage vor der subkutanen Beimpfung. azugeordnet wie in Tabelle 7.
  • Die relativen Wirksamkeiten der DIME-Analogen können aus Tabelle 8 abgeleitet werden, jedoch konzentrierten sich die vorliegenden Versuche in erster Linie auf die zellzerstörende Wirkung von DIME selbst, um Versuchssysteme zu definieren, die für ausführlichere Analysen der DIME-Analogen geeignet sind. Wenn man die antitumotigene Wirkung von DIME (1) auf in vivo-Bedingungen ausdehnt, wird gezeigt, dass Verfüttern von DIME an Nacktmäuse 70–85% Tumorrückbildung in 25–35 Tagen durch tägliche Dosen von 0,25 bis 1,0 g/kg per os erzeugt, Kun et al., 1996, "Induction of tumor apoptosis by methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy) benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr. 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829. Diese großen Dosen erzeugten keine wahrnehmbare Toxizität aus dem wahrscheinlichen Grund, der nachstehend beschrieben ist. Da 0,25 g/kg und 1,0 g/kg DIME die gleiche Antitumorwirkung aufwiesen, war eine Dosis-Wirkungs-Beziehung nicht sichtbar. Dieses Paradoxon kann durch eine selektive Arzneistoffaufnahme in Tumorzellen in vivo, wie diskutiert, erklärt werden.
  • Bei der vorliegenden Untersuchung konzentrierten wir uns auf mikroskopische Analyseverfahren der Zelltötung. Wie es in 5 veranschaulicht ist, wurde die Koloniebildungsfähigkeit von MDA-MB-231 Zellen durch DIME in einem Konzentrationsbereich von 1–2 μM in 10 Tagen hochgradig vermindert. Wenn DIME vor dem Ende der achtstündigen Inkubation mit Zellen entfernt wurde, wurde die Zelltötung verhindert und Arzneistoff-induzierte morphologische Veränderungen wurden vollständig aufgehoben. Erneutes Ausplattieren von Zellen, die bis zu 8 Stunden nach der Vorinkubation mit 1–10 μM DIME frei von DIME gewaschen waren, führte zu einer Wiederaufnahme des normalen Zellwachstums und der Replikation. Die Natur entscheidender Vorgänge, die nach achtstündiger Arzneistoffbehandlung einen irreversiblen Weg, der zum Zelltod führt, erzeugen, ist bisher unbekannt und ist der Gegenstand weiterer Untersuchungen. Jedoch sind eine der leicht festgestellten Ursachen des endgültigen Zelltods, der durch DIME induziert wird, von der Arzneistoffkonzentration abhängige DNA-Brüche, wie es in 6 veranschaulicht ist.
  • Eine auffällige Eigenschaft von DIME ist seine offensichtliche Selektivität für Tumoren in vivo. Wir führten Versuche zum Arzneistoffinetabolismus und zur zellulären DIME-Aufnahme durch, um diese Eigenschaft weiter zu charakterisieren. Die Inkubation von Zellen in Kultur mit [14C]-DIME unter den vorher beschriebenen Bedingungen, Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH2BP)", Intl. J. Oncol.. 8: 239–252, führte zur zellulären Aufnahme des Arzneistoffs in eine Form, die nicht aus Zellen mit PBS ausgewaschen werden kann, die nicht radioaktives DIME enthalten, das in derselben Konzentration vorliegt, die extrazellulär während der Inkubation zugesetzt wird (vgl. 2). Die Arzneistoffaufnahmerate ist signifikant höher in Zellen (z.B. MDA-MP-231), die am leichtesten durch DIME getötet werden, im Vergleich zu weniger DIME-empfindlichen Zellen (Tabelle 9). Wir entwickelten einen transformierten Phänotyp der normalen Nierenzelle, CV-1 Zellen, die einen Verlust an Kontakthemmung und eine rasche Verdopplungszeit (12 Stunden im Vergleich zu 54 Stunden des nichttransformierten Phänotyps) zeigen. Wie in Tabelle 9 gezeigt, nahmen die tumorigenen transformierten Zellen im allgemeinen DIME rascher auf als nichttransformierte Zellen (CV-1) oder Zellen, die weniger empfindlich gegen Töten durch DIME waren (z.B. E-ras 20). Etablierte Zelllinien haben eine Unsterblichkeitskrise durchgemacht, somit sind sie nicht genau physiologisch arbeitende Zellen, und unsere Ergebnisse für die Arzneistoffaufnahme und das offensichtliche Fehlen von DIME-Toxizität in vivo legen nahe, dass normale Zellen im unversehrten Tier kein oder sehr wenig DIME aufnehmen können. Andererseits metabolisieren (entestern) Homogenisate von Organen normaler Mäuse DIME wirksam, wie es in Tabelle 10 veranschaulicht ist. Die höchste Rate von "DIME-Esterase"-Wirksamkeit trat bei Gehirnhomogenisat auf.
  • TABELLE 9 Aufnahme von DIME
    Figure 00570001
  • Zelluläre Konzentration von DIME durch vier Zelltypen nach einer 24-stündigen Inkubation (siehe Verfahren). a μM; b Die Konzentration von DIME wurde gewählt, die 100% Wachstumshemmung verursacht, wobei 20 bis 50 × 104 anhaftende Zellen/cm2 hinterlassen wurden. TABELLE 10 Esterasespaltung von DIME zu seiner Carbonsäurea in verschiedenen Gewebehomogenisaten
    Figure 00580001
    • a Verbindung 6 in Tabelle 7. b In nmol, Isoliert durch Dünnschichtchromatographie, ausgehend von 20,0 mol [14C]-DIME inkubiert in 2,0 ml Homogenisat bei 37°C für 4 Stunden. Die Cpm-Werte weisen eine Streuung von ±2% auf. Die spezifische Radioaktivität des [14C]-DIME war 20470 cpm/nmol.
  • Die Korrelation von Arzneistoffinetabolismus und tumorizider Wirkung von DIME wurde auch in Versuchen mit menschlichen Lungentumorzellen (A-549) gezeigt. Wie es in 4 gezeigt ist, spalten A-549 Zellen leicht die Esterbindung (R2) in DIME, während Hemmung der Esterase-Wirksamkeit mit Bis-[p-nitrophenyl]phosphat, Heymann et al., 1968, "Inhibition of Phenacetin and Acetanilide-Induced Methemoglobinemia in the Rat by the Carboxyl Esterase Inhibitor of bis-[p-Nitrophenyl] Phosphate", Biochem. Pharmacol. 18: 801–811, zu viel wirksamerer Zelltötung durch DIME an A-549 Zellen führte, wie man in V sieht. Ein Vergleich der das Zellwachstum hemmenden Wirkung von DIME auf verschiedene Krebszellen, ausgedrückt in DIME-Konzentration, die 50% Zellhemmung in 3 Tagen verursacht, ist in Tabelle 11 zusammengefasst. Ein Zeitverlauf der Wirkung von DIME bei 0,5, 1,0 und 2,0 μM Endkonzentration auf MDA-MB-231 Zellen ist in 6 veranschaulicht.
  • Tabelle 11 Wirkung von DIME auf verschiedene menschliche Krebszelllinien
    Figure 00590001
  • Für DIME-Einwirkungsversuche wurden Zellen in 2 cm2 Vertiefungen bei einer Dichte von 2 × 104 Zellen/cm2 ausgesät. DIME bei verschiedenen Konzentrationen wurde dem Medium zum Zeitpunkt der Aussaat zugesetzt. Die Zellkulturen wurden dann 3 Tage inkubiert (bei 37°C in 5%iger CO2-Atmosphäre).
  • DIME ist insofern ein einzigartiges tumorizides Molekül, als es keine makroskopisch beobachtete Toxizität in vivo außer bei Tumorzellen, die bei unversehrten Tieren wachsen, aufzuweisen scheint. Aus Arzneistoffaufnahme-Assays erscheint es offensichtlich, dass Zellen, die für Zelltötung durch DIME empfindlich sind, den Arzneistoff am begierigsten aufnehmen. Die Replikation von Nicht-Krebszellen, die in Kulturen wachsen, wird auch in unterschiedlichen Ausmaßen durch DIME gehemmt (nicht gezeigt), während der Arzneistoff in vivo keine Toxizität zeigt. Deshalb scheint es wahrscheinlich, dass sich die Durchlässigkeit der Zellen für DIME in Zellkulturen von in vivo arbeitenden Zellen unterscheidet. Die Gründe für diese offensichtliche Tumorspezifität können wohl von Unterschieden zwischen einer – bisher unbekannten – Zellmembraneigenschaft von in Kultur gewachsenen Zellen und in Geweben von Tieren wachsenden Zellen, einem Gegenstand für weitere Untersuchungen, abhängen. Dieser offensichtliche Permeabilitätsunterschied für DIME zwischen (sowohl Tumor- als auch Nicht-Tumor-) Zellen, die in Zellkulturen gewachsen sind, und in vivo arbeitenden Zellen gilt nicht für in vivo wachsende Tumorzellen, Kun et al., 1996, "Induction of tumor apoptosis by methyl-3,5- diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy) benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr. 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829, da sie in vivo durch DIME-Fütterung getötet werden, Kun et al., 1996, "Induction of tumor apoptosis by methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy) benzoate (DIME)", Zusammenfassung Nr. 102, Int. J. Oncol. 9: Beilage 829. Die in vivo gegebenen DIME-Dosen (0,25–1,0 g/kg) überschreiten außerordentlich die extrazelluläre tumorizide Konzentration, die mit Zellkulturen erhalten wird (0,5–2,0 μM), was veranschaulicht, dass Tumorzellen in vivo einen kleinen Teil des in vivo verabreichten DIME aufnehmen können, und in vivo wachsende Tumorzellen scheinen die gleiche Empfindlichkeit für DIME wie in Zellkulturen behalten zu haben, d.h. Tumorzellen in Kultur und in vivo zeigen eine ähnliche Arzneistoffaufnahme. Die Ähnlichkeit von Tumorzellmembranen in vivo mit in Zellkulturen wachsenden Zelllinien scheint eine neue Neigung von Tumorzellen zu sein, die eine weitere Analyse erfordert. Zusätzlich zu der offensichtlichen in vivo Selektivität für DIME-Eindringen in Tumoren unterscheiden sich Tumorzellen von normalen Zellen, die im Allgemeinen, außer im Fall von A-549 Zellen (Lungenkrebs), keine nachweisbare DIME-Esterasewirksamkeit aufweisen (nicht gezeigt).
  • Untersuchungen an diesen Zellen (4,5) veranschaulichen auffallend, dass DIME selbst, nicht sein Esterase-erzeugter Metabolit, das tumorizide Molekül ist. Wie man aus Tabelle 8 sieht, stärkt der Ersatz der Methylestergruppe von DIME (R2) durch die längerkettige Ethylestergruppe oder durch Amidgruppen noch beträchtlich die Antitumorwirksamkeit bestimmter DIME-Analoge auf E-ras 20 Zellen. In dieser Studie ist nur DIME in einigen Einzelheiten analysiert worden, aber verschiedene "wirksame" DIME-Analoge verdienen auch weitere Beachtung, da es möglich ist, dass diese zelluläre und in vivo-Wirkungen aufweisen können, die für einen zusätzlichen chemotherapeutischen Verwendungszweck ausgenutzt werden können. Was die Iodatome in DIME und seinen Analogen betrifft, erlegen diese sperrigen Atome zweifellos Konformationsbeschränkungen zwischen den zwei Benzolringen auf und gleichzeitig können entscheidende bestimmende Faktoren im Zelleindringen vorliegen.
  • BEISPIEL 10: Wirkung von DIME auf Zell- und Kernmorphologie
  • Das Folgende stellt weitere Hinweise hinsichtlich des breiteren Konzepts der Verwendung von Thyroxinanalogen beim Behandeln einer großen Auswahl von Krebsgeschwüren bereit. Wir haben berichtet, dass DIME ein starker Auslöser des Zelltods in Tumorzellen in Zellkulturen und in vivo ist. Die selektive tumorizide Wirkung wird höchstwahrscheinlich durch selektives Eindringen dieses Arzneistoffs in Tumorzellen in vivo erklärt, Mendeleyev et al., 1997, "Structural Specificity and Tumoricidal Action of Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Methoxyphenoxy)Benzoate (DIME)," Intl. J. Oncol., in Druck. Wie es hier beschrieben ist, führt die Einwirkung von 1 bis 4 DIME auf Tumorzellen zu zytologischen Änderungen und einer Mitoseblockade, was die Beteiligung verschiedener biochemischer Wirkstellen von DIME vorhersagt. Es war wichtig, vor der Analyse der Stellen auf einem biochemischen Niveau zuerst die zelluläre Wirkungsweise von DIME durch zytometrische Verfahren zu definieren. Das vorliegende Beispiel ist mit der Wirkung von DIME auf Zell- und Kernmorphologie und die Progression durch die Mitose befasst.
  • 10.1 Mikroskopische Morphologie
  • Die mikroskopische Morphologie von E-ras Zellen wurde durch früher berichtete Techniken untersucht, Mendeleyev et al., 1997, "Structural Specificity and Tumoricidal Action of Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Methoxyphenoxy) Benzoate (DIME)," Intl. J. Oncol., in Druck; Bauer et al., 1996, "Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tumorigenicity of a ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-amino-l,2-benzopyrone (INH2BP)".
  • 10.2 Vorbereitung zur Sichtbarmachung der M-Phase
  • Die MDA-MB-231 Zelllinie wurde von ATCC (Rockville, MD, USA) erhalten und die Zellen wurden in T-75 Kolben bei 37°C in Minimum Essential Medium-α, ergänzt mit 10% FCS gezüchtet. Bei Kontrollen, die kein DIME erhielten, wurde den Kulturen 4 Stdn. vor der Sammlung der Metaphase-blockierten Zellen und Vorbereitung von Zellspreizungen 0,1 μg/ml Colcemid zugesetzt. Die Wirkungen von DIME und Colcemid sind hinsichtlich Zellzyklus-Blockade in der M-Phase nicht zu unterscheiden; deshalb wurde, wenn die Wirkungen von DIME auf Metaphasespreizungen geprüft wurden, kein Colcemid zugesetzt. Zellen (107) wurden aus 5 minütiger T-75 Trypsinisierung mit 0,025% Trypsin isoliert und durch Zentrifugation sedimentiert, erneut suspendiert und 10 Min. in 10 ml 75 mM KCl-Lösung bei 37°C gehalten, erneut sedimentiert und in 10 ml Methanol-Essigsäure mit vier aufeinanderfolgenden Wechseln von Methanol-Essigsäure fixiert. Eine Teilmenge der endgültigen Zellsuspension (100 μl) wurde auf mit Ethanol gereinigte Objektträger getropft und luftgetrocknet.
  • 10.3 In Situ-Hybridisierung
  • Proben, die für menschliche Chromosomen spezifisch sind, wurden von ONCOR (Gaithersburg, MD, USA) erzeugt. Die Hybridisierung wurde durch eine Abänderung des Verfahrens durchgeführt, das von Pinkel et al., 1986, "Cytogenetic Analysis Using Quantitative High-Sensitivity Fluorescence Hybridization," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 2934–2938 beschrieben ist. Die auf dem Objektträger befestigten Zellen wurden 10 min mit Pepsin (20 μg/ml in 0,01 N HCl) bei 37°C behandelt und dann in Folge mit 70%igem, 85%igem und 100%igem Ethanol dehydratisiert, dann wurde die DNA durch Eintauchen in 70%iges Formamid, gefolgt von 2 × Standard-Salz-Citrat (1 × SSC ist 0,5 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) für 2 Min. bei 70°C denaturiert, und in Ethanol dehydratisiert, wie es vorstehend beschrieben ist. Das Hybridisierungsgemisch in einem 10 μl Gesamtvolumen bestand aus 50%igem Formamid, 2 × SSC, 10% Dextransulfat, 0,5 μg Heringsperma-DNA und 1–5 μg Proteinase K-behandelter menschlicher Plazenta-DNA. Sowohl Heringsperma-DNA als auch menschliche Plazenta-DNA wurden vorher mit Ultraschall zu 200–600 Basenpaarfragmenten behandelt und 40 ng digoxigeninylierte Proben-DNA (5 Min. bei 70°C denaturiert) zugesetzt und 1 Std. inkubiert bei 37°C. Dieses Gemisch wurde auf Objektträger, die die fixierten Zellen enthielten, gebracht, unter einem Deckglas verschlossen und 2 bis 3 Tage bei 37°C inkubiert. Nach Abschluss der Hybridisierung wurden die Objektträger bei drei Wechseln (3 × 5 Min.) von 50%igem Formamid, 2 × SSC, pH 7,0, und zweimal in PN-Puffer (bestehend aus einem Gemisch aus 0,1 M NaH2PO4 und 0,1 M NaHPO4, 0,1% Nonidet P-40, pH 8,0) bei 45°C gewaschen, dann mit 5 μg/ml Antidigoxigenin FITC, 2 μg/ml Kaninchen-Anti-Schaf FITC (Boehringer Mannheim) in PNM Puffer (der 5%ige fettfreie Trockenmilch, die 0,02% Natriumazid enthält, nach Zentrifugation, um Feststoffe zu entfernen, ist) für 20 Min. bei Raumtemperatur behandelt, nach jeder Inkubation zweimal 3 Min. in PN-Puffer gewaschen und mit 0,4 μM DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindol) in Antifade-Lösung (Vector labs, Burlingame, CA, USA) auf DNA angefärbt. Die Objektträger wurden in einem Zeiss Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Mehrfachbandpassfilter (Chroma Technology, Brattleboro, VT, USA) ausgerüstet war, betrachtet, um die Zahl von FISH-Signalen in jedem Kern zu bestimmen.
  • 10.4 Zeitraffervideomikroskopie
  • Zellen in verschlossenen T-25 Gewebekulturkolben wurden in eine temperaturkontrollierte Inkubationskammer gestellt, die so gebaut ist, dass sie ein umgekehrtes Phasenkontrastmikroskop einschließt. Die Kammer wurde von umgebendem Raumlicht abgeschirmt. Alle 5 Min. wurde das Mikroskoplicht 12 Sek. eingeschaltet, während welcher Zeit ein Bild durch ein Bildgebungssystem, die von Compix, Inc. (Mars, PA, USA) erhalten wurde, festgehalten wurde. Die Bildfolgen wurden mit Software von derselben Firma analysiert.
  • 10.5 Durchflusszytometrie
  • Zellen, die verschiedenen Behandlungen ausgesetzt wurden, wurden zur Konfluenz wachsen gelassen, trypsinisiert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Zur Kernanalyse wurden die Zellen in Vindelov-Citratzellpuffer: Saccharose 250 mM, Trinatriumcitrat·2H2O 40 mM, DMSO 50 ml in 1000 ml Lösung, pH 7,6 fixiert. Normale menschliche Lymphozyten, die aus Blut erhalten wurden, wurden als Kontrollen verwendet. Jede Zellprobe und Kontrolle wurde mit einem Hämozytometer gezählt und die Zellkonzentration wurde auf 2 × 106 Zellen/ml eingestellt. Zwei Millionen Zellen aus jeder Zelllinie in einem Gesamtvolumen von 2 ml wurden zweimal mit frischem PBS gewaschen, 30 Min. mit 200 μg/ml RNAase bei 37°C behandelt und 45 Min. mit 10 μg/ml Propidiumiodid angefärbt. Die durchflusszytometrische Analyse wurde an einem FACScan Labortisch-Durchflusszytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) durchgeführt, das mit einem luftgekühlten Argonlaser ausgerüstet war, der auf 488 nm abgestimmt war. Zwanzigtausend Ereignisse wurden Sechsparameterlistenmodalwertdaten zur Analyse und Archivierung gesammelt. Zwei Streulichtparameter (vorwärts und zur Seite), Propidiumiodidfluoreszenz, gemessen bei 575/26 nm und oberhalb von 620 nm, und Dublettauflösung durch Fluoreszenz-Impulsbreite und Fläche wurden bei 1024 Datenkanalauflösung erfasst. Der Erfassungsgrenzwert wurde auf Propidiumiodid-positive Ereignisse oberhalb von Kanal 100 gesetzt. Ausblenden, um kleine Fremdkörper, große Klumpen und Zelldubletts auszuschließen, wurde nach der Erfassung erledigt.
  • 10.6 Immunozytochemie
  • Zellen wurden in Methanol 5 Min. bei –20°C fixiert. Der primäre Antikörper war monoklonales Anti-β-tubulin der Maus (Amersham) und der sekundäre Antikörper von der Ziege, konjugiert an Fluoresceinisothiocyanat von Cappel (Durham, NC, USA). Die DNA der Kerne wurde durch zehnminütige Inkubation in 0,05 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI angefärbt. Die angefärbten Zellen wurden entweder mit einem Zeiss 40 × Plan-Neofluar- oder einem Nikon 60 × PlanApo-Objektiv betrachtet. Zur Klassifizierung der Zellen in der Mitosephase wurden Prophase und Metaphase in einer einzigen Kategorie zusammgefasst, da es schwierig war, die späte Prophase von der Metaphase zu unterscheiden.
  • 10.7 Ergebnisse
  • Die Wirkungen auf die Zellmorphologie nach einer 18–24-stündigen Inkubation von E-ras 20 Zellen mit 4 μM DIME werden in 10 veranschaulicht. Die Tumorzellen dehnten sich aus und zahlreiche Mikrokerne erschienen, wie besonders bei 300-facher Vergrößerung zu erkennen ist. Die Art dieser zytologischen Veränderungen wurde weiter untersucht. Die durchflusszytometrische Analyse (11), die an menschlichen MDA-MB 231 Mammakarzinomzellkernen durchgeführt wurde, zeigte, dass sich durch 18-stndige Arzneistoffeinwirkung Kerne mit einem G2-Gehalt von DNA angesammelt hatten, was eine Blockierung der M-Phase anzeigt.
  • Die vorstehende Beobachtung veranlasste uns, die Kinetik des Eintritts in die Mitose in Zellen, die DIME ausgesetzt wurden, zu untersuchen. Die Zellen wurden in Medium, das 1 μM DIME enthielt, inkubiert und durch Zeitraffervideomikroskopie beobachtet, wie es in Materialien und Verfahren beschrieben ist. 12 zeigt Bilder, die eine 13-stündige Verzögerung in der Mitose, gefolgt von einer unregelmäßigen Teilung in 6 Tochterzellen veranschaulichen. Im Gegensatz dazu verzögerten sich die Kontrollzellen etwa 0,5 Stdn. in der Mitose (siehe 13) und teilten sich immer, wobei genau 2 Tochterzellen erhalten wurden (Daten sind nicht gezeigt).
  • Die Zeitraffervideomikroskopie ermöglichte es uns auch, das Schicksal der Tochterzellen, die aus der unregelmäßigen Zellteilung resultieren, die vorstehend beschrieben wurde, zu überwachen, Zwanzig Prozent der in Gegenwart von 1 μM DIME gesehenen Mitose lieferte Tochterzellen, die verschmolzen (Tabelle 12), wobei häufig große mehrkernige Zellen des Typs, den man in 10 sieht, erhalten wurden. Kontrollzellen zeigten keine solche Teilung, gefolgt von Verschmelzung. TABELLE 12 DIME löst die Verschmelzung zwischen Tochterzellen nach der Mitose aus
    Figure 00650001
    • aMitosen wurden während kontinuierlicher Einwirkung von DIME auf die Zellen durch Zeitraffervideomikroskopie überwacht; bVerschmelzung der Tochterzellen trat normalerweise innerhalb Minuten nach der Zytokinese auf und beteiligte 2–5 Tochterzellen.
  • Die Zellteilung, die in Gegenwart von 1 μM DIME stattfand, wurde untersucht, um quantitativ die Zahl der Tochterzellen abzuschätzen, die aus jeder Mitose resultiert (14). Die Zahl der Tochterzellen lag im Bereich von 1 bis 6 pro Mitoseereignis. Im Gegensatz dazu teilten sich die Kontrollzellen immer (33/33), wobei 2 Töchter erhalten wurden. So folgte der Arzneistoff-induzierten langen Verzögerung in der Mitose, die vorstehend beschrieben ist, ein höchst unnormales Zellteilungsmuster.
  • 15 zeigt die Geschwindigkeiten, bei denen die in 1 μM DIME inkubierten Zellen und die Kontrollzellen in die Mitose eintraten. Die Kurven sind fast übereinstimmend, was anzeigt, dass DIME nicht die Geschwindigkeit beeinflusste, bei der die Zellen die Interphase durchliefen. Im Gegensatz dazu wurde die durchschnittliche Zeitdauer, die jede Zelle in der Mitose verbrachte, mehr als 20-fach durch den Arzneistoff gesteigert (13). Dass die durch DIME blockierten Zellen in einer runden Konfiguration tatsächlich in der Mitose waren, wurde durch ihr gekürztes und ausgedehntes Chromatin (16) und unnormale Mitosespindeln (17) bestätigt.
  • Chromosomenanalysen durch in situ-Hybridisierung der Metaphasenkerne wurden mit für die Chromosomen 1, 2, 7, 11 und 19 spezifischen Untersuchungen durchgeführt. Sie alle lieferten ähnliche Ergebnisse; deshalb ist nur Chromosom 19 veranschaulicht. Repräsentative Ergebnisse sind für Chromosom 19 in den 16 A, B und C gezeigt. In allen Fällen wurden MDA-MB-231 (menschliche Brustkrebs-) Zellen verwendet. 16A zeigt die in situ-Hybridisierung an Chromosom 19. Die 18-stündige Einwirkung von 1 μM DIME hatte keine nachweisbare Wirkung; deshalb stellen die 16A und 16B sowohl Kontroll- als auch arzneistoffbehandelte Zellen dar. 16B ist die DNA-Anfärbung (DAPI), wobei die Übereinstimmung der DNA-Anfärbung mit Chromatin veranschaulicht wird, während 16A für Chromosom 19 angefärbt ist. Jedoch induziert die 5-tägige Arzneistoffeinwirkung auf die Zellen (1 μM DIME) eine große Akkumulation von Metaphasenchromatin in einigen Zellen mit etwa 40 Chromosom-l9-Signalen und über 100 Chromosomen (16C). Es konnte kein Hinweis auf einen Chromosomenbruch erhalten werden, auch wenn diese Arzneistoffbehandlung letztendlich Zellen tötet, Mendeleyev et al., 1997, "Structural Specificity and Tumoricidal Action of Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Methoxyphenoxy) Benzoate (DIME)," Intl. J. Oncol. 10: 689–695.
  • Die Struktur der Mitosespindel nach 18-stündiger Einwirkung von 1 μM DIME ist in 17 dargestellt. 17A ist die Tubulin-angefärbte Mitosespindel in nicht arzneistoffbehandelten MDA-MB-231 Krebszellen. 17B zeigt die Veränderungen nach 18-stündiger Arzneistoffeinwirkung, die aus auffälligen Abnormitäten der Tubulinverteilung bestanden. Diese vielzentrischen Strukturen wurden nach 5-tägiger Einwirkung von 1 μM DIME (17C) noch mehr ausgeweitet. Die zelluläre vielzentrische Verteilung von Tubulin (17E und 17C) scheint der Kernbildung von Tubulin durch zugesetzte Zentrosomen in vitro ähnlich, wie es von Mitchison et al., 1984, "Microtubule Assembly Nucleated by Isolated Centrosomes", Nature 312: 232–237 gezeigt ist. Jedoch waren wir außerstande, eine unnormale Zahl von Zentrosomen durch Immunofluoreszenz (Daten sind nicht gezeigt) festzustellen; somit kann die sichtbare vielzentrische Kernbildung von Tubulin nach 18-stündiger DIME-Behandlung (1 μM) nicht direkt mit den Zentrosomen in Beziehung gebracht werden. Diese Bilder sagen nicht vorher, ob 1 μM DIME die Tubulindepolymerisation induziert oder die erneute Polymerisation hemmt oder nicht.
  • In vorbereitenden Untersuchungen (Daten sind nicht gezeigt) haben wir auch das Verhalten bestimmter Spindel-assoziierter Proteine mit der immunozytologischen Technik untersucht. Cdc-2 Kinase war in Abwesenheit von 1 μM DIME nicht mit der Spindel assoziiert, aber die 18-stündige Einwirkung des Arzneistoffs auf die Zellen zeigte Induktion der cdc-2-Kinase-Spindelbindung. Die Arzneistoffbehandlung veränderte nicht das Muster der Anfärbung durch Antiserum für das zentrosomale Protein Pericentrin, da nur zwei Foci gesehen wurden. Die Cyclin B-Mikrotubulus-Spindelassoziation blieb auch unverändert. Jedoch induzierte der Arzneistoff eine unnormale Organisation der Spindelpolzentren, die noch an Cyclin B gebunden sind. Die Proteinphosphatase 2a (pp2a)-Spindelassoziation wurde genau wie die von Pericentrin oder Cyclin B nicht durch die Arzneistoff-Behandlung (1 μM für 18 Stdn.) beeinflusst.
  • Diese sondierenden Untersuchungen umfassen die Basis weiterer zellbiologischer Forschung. In vorbereitenden Versuchen wurde auch die mögliche Rolle von Phosphatasen bei den Protein-Spindelassoziationen geprüft. Die 18-stündige Einwirkung von 100 nM extrazellulär zugesetzter Okadainsäure hob nur die cdc-2 Kinase- und pp2a-Spindelassoziation auf, was auf die Beteiligung der Proteinphosphatasen hindeutet (Daten sind nicht gezeigt).
  • Diese Ergebnisse scheinen zwischen frühen Wirkungen von 1 μM DIME, die innerhalb von 18–24 Stunden nach der Arzneistoffeinwirkung stattfinden, und späten Folgen zu unterscheiden, die man hier in den Chromosomenzahlen sieht, die sich nach 5 Tagen der Arzneistoffbehandlung entwickeln. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass späte Ereignisse lediglich eine Kaskade zellulärer Reaktionen widerspiegeln, die durch die Bindung von DIME an bestimmte zelluläre Stellen eingeleitet werden. Frühe Ereignisse schließen merkliche zytologische Veränderungen ein, speziell das Erscheinen großer mehrkerniger Zellen. Es ist gut bekannt, dass die Bildung von Mikrokernen nach einem Strahlenschaden auftritt, der aus dem Versagen azentrischer Chromosomenfragmente besteht, eine Kernwanderung zu den Polen während der Anaphase aufgrund des Fehlens von Kinetochoren und Mikrotubulus-Spindel-Befestigung durchzumachen, J. S. Bedford, 1991, "Sublethal Damage, Potentially Lethal Damage, and Chromosomal Aberration in Mammalian Cells exposed to Ionizing Radiation," J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 21: 1457–1469. Zeitrafferuntersuchungen haben gezeigt, dass Vinblastinsulfat auch Metaphase-blockierte mehrkernige Zellen induziert, Kirshan, 1968, "Time Lapse and Ultrastructure Studies on the Reversal of Mitotic Arrest Induces by Vinblastine Sulfate in Earl's L Cells," J. Natl.
  • Cancer Institute 41: 581–595, die an die hier gezeigten Ergebnisse (10) erinnern, doch Vincaalkaloide zeigen auch ernste toxische Wirkungen bei Tieren, während DIME dies nicht tut. Die Überexpression der Proteinphosphatase 2a (pp2a) induziert auch eine Mehrfachkernbildung, Wera et al., 1995, "Deregulation of Transitional Control of the 65 kDa Regulatory Subunit (PR65 Alpha) of Protein Phosphatase 2A leads to Multinucleated Cells," J. Biol. Chem. 270: 21374–21381, was deutlich zeigt, dass der Mechanismus der Entwicklung dieses komplexen Vorgangs (Mehrfachkernbildung) eine Vielfalt wahrscheinlich zusammenhängender enzymatischer Aktivitäten zur Folge haben kann. Diese Ergebnisse zeigen eine Aktivierung von pp2a in DIME-Zellen (l.c.l), eine Wirkung, die wahrscheinlich an einer direkten Wirkung von DIME auf dieses Enzym liegt. Die Beteiligung verschiedener zellulärer Enzyme an der Wirkungsweise von DIME ist der Gegenstand eines gesonderten biochemischen Berichts.
  • Eines der am leichtesten zu beobachtenden zellulären Phänomene, die durch DIME induziert werden, ist eine Blockade in der M-Phase (11 und 13), der Wirkung von Colcemid oder insbesondere Vincaalkaloiden, die durch DIME ersetzt werden können, sehr ähnlich. Späte Wirkungen von DIME (nach 5 Tagen), wie sie durch DNA-Fluoreszenz-Hybridisierung mit Proben auf Chromosomen 1, 2, 7, 11 und 19 veranschaulicht sind, sind das Ergebnis einer Akkumulation von Chromosomen aufgrund des Fehlens der Zellteilung. DIME weist keine sichtbare direkte Wirkung auf DNA auf. Die Schnitte in doppelsträngiger DNA (12 in Mendeleyev et al., 1997, "Structural Specificity and Tumoricidal Action of Methyl-3,5-Diiodo-4-(4'-Methoxyphenoxy) Benzoate (DIME)," Int. J. Oncology 10: 689–695, sind nachgeordnete Folgen der Wechselwirkung von DIME mit Krebszellen und spiegeln höchstwahrscheinlich die Hochregulierung von DNA-Endonucleasen wider, die in DIME-behandelten Zellen auf dem Weg einer indirekten Aktivierung der Poly(ADP-ribose)glycohydrolase (Fußnote I in Ref. 1) de-poly-ADP-ribosyliert werden. Die Endonuclease-Aktivierung mag nicht der einzige einzelne Anlass des programmierten Zelltods durch DIME sein, da bekannt ist, dass verschiedene molekulare Mechanismen zu Apoptose führen können, Wertz et al., 1996, "Diverse Molecular Provocation of Programmed Cell Death," TIBS 21: 359–364. Die Entwicklung einer unnormalen Mitosespindel bei DIME-behandelten Zellen weist auf eine einleitende zelluläre Wirkung von DIME auf das Tubulinsystem hin, von dem gut bekannt ist, dass es eine entscheidende Rolle bei der Zytokinese spielt, Murray et al., 1993, "The Cell Cycle: An Introduction," Oxford University Press, New York.
  • Da DIME ein "hormonell inaktives" Schilddrüsenhormonanalog ist, kommt die faszinierende Frage auf, ob metabolische Vorstufen (oder Kataboliten) von Schilddrüsenhormonen bei der physiologischen Differenzierungserhaltung, wobei sie als „Antimalignitäts"-Korrektur-Regulatoren dienen, eine Rolle spielen können oder nicht. Eine Suche nach Schilddrüsenhormonmetaboliten mit tumorizider Wirkung scheint berechtigt.
  • BEISPIEL 11: Wirkung auf Tubulinpolymerisation
  • In den folgenden Versuchen hemmt das hormonell inaktive Schilddrüsenhormonanalog, DIME, in 1 bis 5 μM Konzentrationen die GTP-abhängige Polymerisation von MTP, wie durch einen optischen Versuch bestimmt wird. Diese Hemmung ist entscheidend von der GTP-Konzentration abhängig. Die quantitative Korrelation zwischen den Konzentrationen von DIME und GTP unter den Bedingungen einer linearen MTP-Polymerisationsrate folgt einer Michaelis-Menten-Kinetik und die Hemmung stellt einen "gemischten" Typ dar, wobei km für GTP und Umax gleichzeitig verändert werden. Chemische Analoge von DIME hemmen die MTP-Polymerisation parallel zu ihrer antitumorigenen Wirkung in vivo. Die MTP-Stelle ist eine der frühen zellulären Ansprechstellen von DIME.
  • Die Einwirkung von 1 μM DIME auf menschliche Brustkrebszellen (MDA-MB-231) induzierte unnormale Spindelstrukturen innerhalb von 18 Stunden Arzneistoffbehandlung; somit scheint eine vermutliche DIME-Mikrotubulus-Protein (MTP)-Wechselwirkung ein Bestandteil früher zellulärer Reaktionen auf den Arzneistoff zu sein, Zhen et al., 1997, "Cellular Analysis of the mode of action of Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoate (DIME) on tumor cells, Intl. J. Oncol.. Unnormale Spindelstrukturen könnten das Ergebnis einer DIME-MTP-Wechselwirkung oder Reaktionen von DIME mit Bestandteilen des Mikrotubulus organisierenden Zentrums oder mit bisher undefinierten Systemen nacheinander oder gemeinsam sein. Da die zeitabhängige quantitative Analyse des MTP-Systems in situ für die Messung der Anfangsgeschwindigkeit ungeeignet ist, passten wir das in vitro Anordnungssystem von Neurotubuli als Modell für eine quantitative Analyse der Wechselwirkung von DIME mit MTP an. Wie von Gaskin et al., 1974, "Turbidimetric studies of the in vitro assembly and disassembly of porcine neurotubules", J. Mol. Biol. 89: 737–758; und Kirschner et al., 1974, "Microtubules from mammalian brain: some properties of their depolymerization products and a proposed mechanism of assembly and disassembly", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71: 1159–1163 gezeigt, ist dieses System zur kinetischen Untersuchung der MTP-Anordnung in vitro geeignet. Der Zeitverlauf der MTP-Anordnung besteht aus Einleitungs-, Ausbreitungs- und Abschlussschritten, Gaskin et al., 1974, "Turbidimetric studies of the in vitro assembly and disassembly of porcine neurotubules", J. Mol. Biol. 89: 737–758. Die Geschwindigkeit der Ausbreitung unter definierten Bedingungen ist ausreichend linear, um eine kinetische Analyse zu erlauben, die hinsichtlich der DIME- und GTP-Konzentrationen ausgewertet werden kann. Wie wir hier zeigen, tritt die Hemmung der MTP-Anordnung durch DIME in demselben Bereich von Arzneistoffkonzentrationen auf, wie er erforderlich ist, um die Tumorentstehung in vivo zu hemmen oder die Zellreplikation zu hemmen oder letztendlich den Zelltod zu induzieren; Mendeleyev et al., 1997, "Structural specificity and tumoricidal action of methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy) benzoate (DIME)" Int. J. Oncol. 10: 689–695 und vorstehende Tabelle 8; deshalb ist die DIME-MTP-Wechselwirkung höchstwahrscheinlich ein Bestandteil des offensichtlich pleiotropen zellulären Wirkungsmechanismus von DIME.
  • 11.1 Isolierung von Mikrotubulus-Proteinen (MTP)
  • Die Präparation von MTP und ein optischer Versuch zur Polymerisation wurde aus veröffentlichten Verfahren übernommen, Gaskin et al., 1974, "Turbidimetric studies of the in vitro assembly and disassembly of porcine neurotubules", J. Mol. Biol. 89: 737–758; Tiwari et al., 1993, "A pH and temperature-dependent cycling method that doubles the yield of microtubule protein", Anal. Biochem. 215: 96–103. Rinder- oder Kaninchengehirn wurde in einem gleichen Volumen von eiskaltem Puffer, der 100 mM Pipes/K+ (pH 7,4), 4 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0,5 mM DTT und 0,1 mM PMSF enthielt, homogenisiert und bei 39000 g 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert. Dem Überstand wurden DMSO (8% Endkonzentration) und GTP (1 mM Endkonzentration) zugesetzt, worauf 30-minütige Inkubation bei 37°C folgte. Die Mikrotubuli wurden bei 100000 g bei 37°C 30 Minuten pelletiert. Die Pellets wurden auf Eis 15 Minuten inkubiert, worauf erneute Suspension in eiskaltem PEM-Puffer (100 mM Pipes/K+ (pH 6,9), 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2) folgte. Dieser Zyklus warmer Polymerisation und kalter Depolymerisation wurde noch einmal wiederholt und das kalte, erneut suspendierte monomere MTP (8–10 mg/ml Protein) wurde für den optischen Versuch zur Polymerisationskinetik verwendet. Sowohl Kaninchen- als auch Rindergehirn lieferte identische MTP-Präparationen.
  • Die Zusammensetzung des optischen Versuchs wird in den Legenden der Figuren und Tabelle 12 beschrieben. Die Polymerisationsreaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl MTP-Lösung (äquivalent zu 0,8–1,0 mg Protein) gestartet und die anfänglichen linearen Steigerungsraten in der Extinktion bei 350 nm verfolgt und bei 37°C (siehe 1) in einem Perkin-Elmer 552 Zweistrahlspektrophotometer, das mit einem thermostatisch gesteuerten Küvettenhalter ausgerüstet war, aufgezeichnet.
  • 11.2 Ergebnisse und Diskussion
  • Die Genauigkeit der optischen Untersuchung zur Polymerisation von MTP ist in 18 veranschaulicht. Die Versuchsbedingungen waren die gleichen, wie sie in der Legende der Tabelle 7 angegeben sind, nur dass die GTP-Konzentration 1 mM war (rechte Kurve) und DIME in 4 μM vorlag (linke Kurve). Es ist offensichtlich, dass die Rate der MTP-Polymerisation in einer linearen Weise verläuft; somit scheinen die Bedingungen für maximale Polymerisationsraten, wie sie von B. Berne, 1974, "Interpretation of light scattering from long rods", J. Mol. Biol. 89: 755–758 definiert sind, erfüllt. Deshalb ist es möglich, die quantitative Korrelation zwischen [DIME] und [GTP] durch Vergleichen der linearen Rate in Gegenwart unterschiedlicher Arzneistoff- und Aktivatorkonzentrationen zu bestimmen. Bei 1 mM GTP-Konzentration hemmen zunehmende DIME-Konzentrationen die MTP-Polymerisation zunehmend (18).
  • Wie es in 20 gezeigt ist, korrelierte die Hemmung von 1 μM DIME quantitativ mit [GTP] und eine doppelt reziproke graphische Darstellung erzeugte eine Hemmung vom "gemischten" Typ, Dixon et al., 1964 Enzymes, S. 234–237, Acad. Press, Inc., New York. Sowohl Vmax als auch km Werte wurden um fast 50% km GTP von 6,7 μM bis 14 μM verändert, während Vmax um nahe bei 50% abnahm. Die einfachste Interpretation einer gemischten Hemmung basierend auf der Briggs-Haldane-Gleichung (vgl. 7) ist, dass k2, d.h. die Dissoziation [ES] zu E und P (Produkt), direkt beeinflusst wird, was dann sowohl km als auch Vmax verändert. Die genaue Natur von k2 ist derzeit unbekannt und ihre Bestimmung erfordert die Analyse der Reaktionprodukte der GTP-Hydrolyse, eine Arbeit, über die an anderer Stelle zu berichten ist. Allosterische Modifikationen können auch ähnliche Ergebnisse erreichen, Dixon et al., 1964 Enzymes, S. 234–237, Acad. Press, Inc., New York. Der Zweck der vorliegenden Versuche ist, die Wirksamkeit von DIME mit einigen seiner Analogen auf die MTP-Polymerisation zu vergleichen (siehe Tabelle 12) und die Ergebnisse mit zytopathologischen Prozessen (z.B. Hemmung der Tumorentstehung in vivo zu korrelieren.
  • Es gibt eine offensichtliche Korrelation zwischen der chemischen Struktur von DIME und 7 seiner Analogen, die auf die MTP-Polymerisation (Tabelle 13) wirken können, und ihrer hemmenden Wirksamkeit auf die Tumorentstehung in vivo (vergleiche mit Tabelle 8 oder Mendeleyev et al. oben). Zum Beispiel vermindert die Substitution in R1 von CH3O nach EtO und n-BuO zunehmend die Hemmung der MTP-Polymerisation, fast genau parallel zur abnehmenden antitumorigenen Wirkung (vergleiche mit Tabelle 8 oder Mendeleyev et al. oben). Andererseits hebt die Substitution in R2 vom Methylester zur Carbonsäure die hemmende Wirkung auf die MTP-Polymerisation vollständig auf, aber halbiert nur die antitumorigene Wirkung, die mit E-ras 20 Zellen untersucht wurde (siehe Tabelle 8 und 5 oder Mendeleyev et al. oben). Es ist möglich, dass solche quantitativen Unterschiede zelltypspezifische Veränderungen widerspiegeln können.
  • TABELLE 13 Wirkung von DIME und einigen Analogen bei der Mikrotubulus-Anordnung in vitro
    Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Das Assaysystem bestand aus 240 μl PEM-Puffer, der 8% DMSO und GTP (Endkonzentration 1 mM) enthielt, 10 μM Endkonzentration an Arzneistoff (zugesetzt in 3 μl), oder Lösungsmittelkontrolle und 0,6 mg MTP (60 μl). Die Mikrotubulusanordnung bei 37°C wurde bei λ = 350 nm überwacht und Anfangsgeschwindigkeiten wurden als mA350/Min. berechnet. Die Kontrolle wies eine Anfangsgeschwindigkeit von 180 mA350/Min. auf. Die Werte sind Mittelwerte zweifacher Untersuchungen.
  • Die Hemmung der MTP-Polymerisation kann höchst komplexe zelluläre Folgen haben. Bei der Zytokinese kann diese Hemmung die Zugkräfte des Tubulins beeinträchtigen und die Bildung einer Teilungsfurche, die für die Zellteilung erforderlich ist, verhindern, Burton et al., 1997, "Traction forces of cytokinesis measured with optically modified elastic Substrate", Nature 385: 450–454. Die Hemmung der MTP-Polymerisation durch DIME sollte mit den biochemischen Stellen dieses Arzneistoffs korreliert werden. Wie gegenüber Mendeleyev et al.; oben, aktiviert DIME direkt pp2-ase; deshalb ist es notwendig, diese Wirkung mit der Mitose zusammenhängenden Phänomenen, die durch DIME induziert werden, zu koordinieren. Zum Beispiel wurde vor kurzem angegeben, Kawabe et al., 1997, "HOXII interacts with protein phosphatase pp2a und pp1 and disrupts G2/M cell cycle check point", Nature 385: 454–458, dass pp2-ase die G2/M-Transition regulieren kann und pp2-ase auch ein potentielles Onkogen ist, dessen Hemmung die Onkogenese fördert. Es ist möglich, dass die Aktivierung der Pp2-ase durch DIME der Onkogenese entgegenwirkt.
  • Auf der Grundlage dieser Versuche kann man sehen, dass Analoge vom Thyroxintyp, wie DIME, die Mitose in Krebszellen blockieren können. Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles Durchmustern auf solche Verbindungen durch Verwendung dieser Techniken und Verwendung von Zellsortierern, Chromosomenblot oder einer anderen DNA-Analyse in Zellen.

Claims (8)

  1. Verwendung eines Thyroxinanalogs, gegebenenfalls in Kombination mit einem physiologisch verträglichen Träger, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines malignen Tumors in einem Säuger, wobei das Thyroxinanalog dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Verbindung ist, die eine 35%ige oder höhere Hemmung der Anfangsgeschwindigkeit der Mikrotubulus-Protein-Zusammenlagerung in vitro bewirken kann und wobei das Thyroxinanalog die Formel
    Figure 00750001
    aufweist, und pharmazeutisch verträglicher Salze davon, wobei: X = O, S, CH2, Carboxy oder abwesend; Y = O oder S; R1 = Methyl oder Ethyl; R2, R3, R4 und R5 unabhängig ausgewählt sind aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy und Halogen; und R6, R7, R8 und R9 unabhängig ausgewählt sind aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen, NO2 und NH2.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Thyroxinanalog die Formel
    Figure 00760001
    aufweist, und pharmazeutisch verträglicher Salze davon, wobei: X = O, S, CH2, Carboxy oder abwesend; Y = O oder S; R1 = Methyl oder Ethyl; R2, R3, R4 und R5 unabhängig ausgewählt sind aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy und Halogen; und R7 und R8 unabhängig ausgewählt sind aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen, NO2 und NH2.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Thyroxinanalog Methyl-3,5-diiodo-4-(4'-methoxyphenoxy)benzoat ist.
  4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Thyroxinanalog in einer Menge vorliegt, welche wirksam ist, eine Rückbildung des malignen Tumors zu bewirken.
  5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der maligne Tumor ein Karzinom oder ein Sarkom ist.
  6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Arzneimittel für die orale Verabreichung bestimmt ist.
  7. Verwendung eines Thyroxinanalogs, gegebenenfalls in Kombination mit einem physiologisch verträglichen Träger, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, wobei das Thyroxinanalog die strukturelle Formel
    Figure 00770001
    aufweist, und pharmazeutisch verträglicher Salze davon, wobei: X = O, S, CH2, Carboxy oder abwesend; Y = O oder S; R1 = Methyl oder Ethyl; R2, R3, R4 und R5 unabhängig ausgewählt sind aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy und Halogen; und R6, R7, R8 und R9 unabhängig ausgewählt sind aus H, (C1-C4)-Alkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, Hydroxyl, (C1-C4)-Alkoxy, Halogen, NO2 und NH2.
  8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei der Krebs ein Karzinom oder Sarkom ist.
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