DE112007003375B4

DE112007003375B4 - Imidazolderivate, die Apoptose induzieren, und deren therapeutische Anwendung

Info

Publication number: DE112007003375B4
Application number: DE112007003375T
Authority: DE
Inventors: In-Jae Shin; Myung-Ryul Lee; Darren Williams
Original assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
Current assignee: Industry Academic Cooperation Foundation of Yonsei University
Priority date: 2007-02-26
Filing date: 2007-02-26
Publication date: 2013-11-07
Anticipated expiration: 2027-02-27
Also published as: KR20100004977A; GB0914199D0; US8163791B2; JP2010521421A; GB2462715A; KR101090850B1; GB2462715A8; JP5128615B2; US20100105726A1; GB2462715B; WO2008105565A1; DE112007003375T5

Abstract

Verbindung, welche ein Element ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Strukturen:

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Verbindungen, die Apoptose induzieren, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die diese Verbindungen enthält. Insbesondere betrifft sie Verbindungen, die ein Imidazolgerüst aufweisen und Apoptose induzieren. In manchen Ausführungsformen wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Imidazolderivate enthält, bereitgestellt. Ferner betrifft sie die Verwendung der Verbindungen als Therapeutika zur Behandlung verschiedener medizinischer Fehlfunktionen und Erkrankungen, insbesondere von Krebs, Immunerkrankungen und cystischer Fibrose.
Stand der Technik
Die Apoptose oder der programmierte Zelltod ist ein Schlüsselprozess der normalen Entwicklung und Funktion multizellulärer Organismen. Beschädigte oder unerwünschte Zellen in Organismen werden sowohl über den intrinsischen apoptotischen Weg, der in Mitochondrien abläuft, als auch über den extrinsischen apoptotischen Weg, der durch Binden von Todesliganden (z. B. Fas-Ligand) an die entsprechenden Rezeptoren (z. B. Fas-Rezeptor) ausgelöst wird, entfernt (Cell, 2003, 112, 481–490, Science 1998, 281, 1305–1308 Cell, 1999, 96, 245–254). Der physiologische Zelltod spielt bei einer Vielzahl normaler Prozesse eine wesentliche Rolle, eine anomale Apoptose verursacht jedoch verschiedenartige Erkrankungen beim Menschen (Science 1995, 267, 1456–1462 Nat. Rev. Drug Dis. 2002, 1, 111–121 Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000, 1, 120–129). Zum Beispiel trägt eine verzögerte Apoptose zu verschiedenen humanen Tumoren und dem Versagen, autoreaktive Lymphozyten zu eliminieren (Autoimmunität) bei. Eine übermäßige Apoptose führt hingegen zu neurodegenerativen Erkrankungen und kardiovaskulären Erkrankungen. Da die Apoptose an einer Vielzahl der vorstehend angegebenen Erkrankungen beteiligt ist, wurde die Forschung bezüglich Apoptose zu einem der zentralen Bereiche biomedizinischer Anwendungen. Kleine Moleküle, die den apoptotischen Zelltod entweder induzieren oder verhindern, sind sehr nützlich, um die Wirkmechanismen der regulatorischen Proteine der Apoptose zu verstehen. Daneben können diese kleinen Moleküle als neuartige Therapeutika zur Behandlung von mit Apoptose verbundenen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs und Autoimmunerkrankungen, eingesetzt werden (Science 1995, 267, 1456–1462 Nat. Rev. Drug Dis. 2002, 1, 111–121 Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000, 1, 120–129 Chem. Biol. 2002, 9, 1059–1072 Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 543–550).
Verschiedene Proteine, die Bcl-2-(B cell lymphoma-2) und IAP-(Apoptose-Inhibitor)Familien einschließen, sind an den Apoptosewegen beteiligt. Meistens sind Caspasen mit Aspartatspezifität die exekutierenden Enzyme beim apoptotischen Zelltod (Science 1998, 281, 1312–1316). Interessanterweise unterdrückt das Chaperon Heat Shock Cognate 70 (Hsc70) den apoptotischen Zelltod, indem es direkt an Apoptose induzierende Faktoren, wie beispielsweise Apaf-1, assoziiert (EMBO J. 1997, 16, 6209–6216 Nat. Cell. Biol. 2001, 3, 839–843). Hsc70 spielt verschiedene Rollen in zellularen Prozessen, wie beispielsweise bei der Proteinfaltung neu synthetisierter cytoplasmatischer Proteine, der erneuten Faltung beschädigter Proteine, dem Abbau fehlgefalteter Proteine und der Translokation cytoplasmatischer Proteine über Membrane von Organellen (Nature 1996, 381, 571–579 Cell 1998, 92, 351–366 Science 1999, 286, 1888–1893). Es ist bekannt, dass Inhibitoren von Hsc70, die Apoptose induzieren, als Antikrebsmittel (Genes Dev. 2005, 19, 570–582 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 7871–7876) und Immunsuppressiva (Pediatr Transplant. 2004, 8, 594–599 J. Clin. Pharmacol. 1998, 38, 981–993) eingesetzt werden können. Daher sind kleine Moleküle, die den apoptotischen Zelltod durch Hemmung von Hsc70 induzieren, sowohl für die biologische Grundlagenforschung im Hinblick auf ein Verständnis der Wirkmechanismen der regulatorischen Proteine der Apoptose als auch für die Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von mit Apoptose verbundenen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs und Erkrankungen, die das Immunsystem betreffen, von Nutzen.
Die US 5,700,826 und die EP 0 812 829 A1 offenbaren Verbindungen, die pharmazeutisch nützlich für die Behandlung von Krebs durch Sensibilisierung von multiresistenten Krebszellen für chemotherapeutische Mittel sind.
Offenbarung der Erfindung
Technisches Problem
In der Wissenschaft besteht daher der Bedarf nach Zusammensetzungen und Verfahren zum Induzieren des apoptotischen Zelltods unter Verwenden kleiner Moleküle. Die entwickelten kleinen Moleküle stellen nicht nur wertvolle Informationen im Hinblick auf eine Erklärung der molekularen Wirkmechanismen der regulatorischen Proteine der Apoptose bereit, sondern können schließlich auch selbst als neuartige Therapeutika zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Apoptose verbunden sind, eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses und weitere Bedürfnisse.
Technische Lösung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen und Zusammensetzungen, und Verfahren zum Induzieren von Apoptose sind beschrieben. Die Verbindungen und Zusammensetzungen können daher zur Behandlung von Krebszellen und Erkrankungen, die das Immunsystem betreffen, eingesetzt werden, wobei sie in den Zellen von Interesse Apoptose induzieren.
Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Verbindungen bereitzustellen, die Apoptose induzieren.
Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, pharmazeutische Zusammensetzungen, die Apoptose induzierende Verbindungen enthalten zur Behandlung verschiedenartiger Erkrankungen, einschließlich Krebs, Erkrankungen, die das Immunsystem betreffen, und cystischer Fibrose, bereitzustellen. Die Verbindungen schließen alle pharmazeutisch annehmbaren Isomere, Salze, Hydrate, Solvate und Pro-Pharmaka derselben ein.
Beschrieben sind darüber hinaus Verfahren zum Induzieren von Apoptose. Wenn die Verbindungen mit humanen Krebszellen inkubiert werden, erfahren die Zellen den Zelltod.
Zudem beschrieben sind Verfahren zum Unterdrücken der Aktivierung von Lymphozyten. Wenn die Verbindungen mit humanen Lymphozyten inkubiert werden, werden diese durch die Verbindungen inaktiviert.
Ebenso sind Verfahren zur Behandlung von cystischer Fibrose beschrieben. Wenn die Verbindungen mit Zellen inkubiert werden, die den mutanten Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CTFR) exprimieren, werden die mutanten Proteine durch die Verbindungen zu den Zellmembranen transloziert.
Weiterhin beschrieben sind Screening-Verfahren zum Identifizieren weiterer Verbindungen, die zum Induzieren von Apoptose nützlich sind.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
Vorteilhafte Effekte
Durch Verwenden der erfindungsgemäßen Verbindungen und Zusammensetzungen ist es möglich, Krebszellen und Erkrankungen, die das Immunsystem betreffen, zu behandeln, wobei in den Zellen von Interesse Apoptose induziert wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Strukturen von Apoptozolen 1 bis 4.
2 Apoptotischer Effekt von Az auf humane Krebszellen. Krebszelllinien werden 6 h lang mit verschiedenen Konzentrationen an Apoptozol 1 inkubiert und der Zelltod durch Zählen der Zellzahl unter Verwenden eines CyQuant-Kits gemessen. (A) Ovarienkrebszellen (SK-OV-3), (B) Kolonkrebszellen (HCT-15) und (C) Lungenkrebszellen (A549).
3 Unterdrückung von TNF-α und PHA-induzierte Aktivierung humaner Lymphozyten durch Apoptozol 1. (A) Humane Jurkat-Lymphozyten werden 1 h lang mit verschiedenen Konzentrationen an Apoptozol 1 behandelt und dann durch 1-stündige Inkubation mit 10 ng/ml TNF-α aktiviert, um die Bildung eines Uropods zu induzieren. Das gebildete Uropod wird mittels mikroskopischer Analyse von Zellgruppen bestimmt. (B) Lymphozyten, die 48 h lang mit TNF-α (10 ng/ml) behandelt wurden, werden 24 h lang mit verschiedenen Konzentrationen an Apoptozol 1 inkubiert. Die Zellzahl wird mittels eines CyQuant-Kits gemessen. (C) Humane Jurkat-Lymphozyten werden 1 h lang mit verschiedenen Konzentrationen an Apoptozol 1 und dann 1 h lang mit 10 μg/ml PHA inkubiert, um die Zellaggregation zu induzieren. Die Zellaggregate werden in 40 zufällig bestimmten Sichtfensters gemessen.
4 Intrazelluläre Bewegungen fehlgefalteter ΔF508-CFTR durch Apoptozol 1. Capan-1-Zellen, die normales CFTR exprimieren, zeigen eine starke Fluoreszenz in einer charakteristischen Ringstruktur, die eine Markierung der Zellmembran anzeigt. (B) CFPAC-1-Zellen, die ΔF508-CFTR exprimieren, zeigen ein geringes oder gar kein Fluoreszenzsignal an der Zelloberfläche, da ΔF508-CFTR durch Wechselwirkung mit Hsc70 im Proteosom-Weg abgebaut wurde. (C) CFPAC-1-Zellen, die 24 h lang mit einer geringeren Konzentration (100 nM) an Apoptozol 1, als derjenigen, die für die Apoptose erforderlich ist, behandelt wurden, verhindern einen durch Hsc70 vermittelten Abbau von ΔF508-CFTR (links: Mikroskopaufnahmen, rechts: Fluoreszenzaufnahmen nach der Immunfärbung). Die Immunfärbung für CFTR wird unter Verwenden von Standardverfahren zum Nachweis von CFTR an der Zelloberfläche ohne Permeabilisierung der Zellen durchgeführt.
Beste Form der Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Imidazolderivate mit den folgenden Strukturen und Aktivität zur Induktion von Apoptose bereit.
Beschrieben sind auch pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Imidazolderivate mit der Formel (I) enthalten, als Wirkstoffe zur Induktion von Apoptose:
Formel (I) in der
R₁ eine funktionelle Gruppe ist, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Wasserstoff, C_0-4-Alkylaryl, C_1-6-Alkyl, C_3-8-Cycloaryl oder -[(CH₂)₂-O]_0-3-(CH₂)₂NH₂ einschließt;
R₂ eine funktionelle Gruppe ist, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_0-4-Alkylaryl oder -Alkenylaryl einschließt;
R₃ eine funktionelle Gruppe ist, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_0-4-Alkylaryl oder -Alkenylaryl einschließt;
R₄ eine funktionelle Gruppe ist, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Alkyl, C_3-8-Cycloalkyl, C_0-4-Alkylaryl oder -Alkenylaryl einschließt.
Die Verbindungen schließen Derivate ein, in denen die R₁- bis R₄-Gruppen funktionelle Gruppen sind, die, die folgenden einschließen:
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden Verbindungen ein:
Die vorliegende Erfindung betrifft auch alle pharmazeutisch annehmbaren Isomere, Salze, Hydrate, Solvate und Pro-Pharmaka derselben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die beschriebenen Verbindungen als Wirkstoffe enthalten, zur Behandlung von Krebs bereit.
Beschrieben ist auch das Verfahren zum Induzieren von Apoptose durch Behandeln von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen, wodurch die Krebszellen den Zelltod erfahren. Das Verfahren zum Induzieren der Apoptose von Krebszellen umfasst wünschenswerter Weise ferner einen Schritt des Nachweisens des Tods der Krebszellen und um den Tod der Krebszellen zu nachweisen ist es insbesondere gewünscht, den Verlust an Asymmetrie der Phospholipide auf der Plasmamembran der Krebszellen zu messen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die beschriebenen Verbindungen als Wirkstoffe enthalten, für die Unterdrückung der Aktivierung von Lymphozyten bereit.
Beschrieben ist auch das Verfahren zum Inaktivieren humaner Lymphozyten durch Behandeln der Lymphozyten mit einer erfindungsgemäßen Verbindung, wodurch die Lymphozyten inaktiviert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die beschriebenen Verbindungen als Wirkstoffe enthalten, zur Behandlung von cystischer Fibrose bereit.
Beschrieben ist auch das Verfahren zum Verbessern der intrazellulären Bewegungen fehlgefalteter Mutanten durch Behandeln von Zellen, die die Mutanten enthalten, mit einer erfindungsgemäßen Verbindung, wodurch die fehlgefalteten Mutanten zu den Zellmembranen transloziert werden.
Zudem beschrieben ist das Screening-Verfahren zum Identifizieren weiterer Verbindungen, die zum Induzieren von Apoptose nützlich sind, wobei die Zellen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung inkubiert und nachgewiesen werden.
Hsc70, welches das Zielprotein von Apoptozolen in der Zelle ist
Das Verständnis der Wirkweise der erfindungsgemäßen Apoptozole stellt wertvolle Informationen über die. an der Apoptose beteiligten Mechanismen bereit und hilft bei der Entwicklung neuer wirksamer Therapeutika zur Behandlung von Erkrankungen, die durch übermäßige Apoptose verursacht werden. Um die molekulare Basis von Apoptozolen für die Apoptose zu untersuchen, wird eine mit Apoptozol konjugierte Agarosematrix mit Proteinextrakt von P19-Zellen inkubiert und die gebundenen Proteine werden mittels SDS/PAGE analysiert. Nach Durchführen von Affinitätschromatographie wird eine starke Bande bei 70 kDa beobachtet. Wenn der Proteinextrakt mit externen Apoptozolen (0,25 und 0,50 mM) als kompetitivem Inhibitor vorbehandelt wird, wird weitestgehend eine Bindung des 70 kDa-Proteins an die Az-Matrix verhindert, was die Spezifität für die Apoptozole verdeutlicht. Diese Bande wird mit nanoLC-MS/MS als Heat Shock Cognate 70 (Hsc70) identifiziert. Um zu bestätigen, dass Hsc70 ein Zielprotein für die Apoptozole ist, wird in Gegenwart von externen Apoptozolen unter Verwenden eines anti-Hsc70-Antikörpers eine Western Blot-Analyse des an die Az-Matrix gebundenen Proteins durchgeführt. In Gegenwart von Apoptozolesas, einem Kompetitor während einer Affinitätschromatographie, wird Hsc70 nicht zurückgehalten. Um dieses Ergebnis weiter zu bestätigen, werden die P19-Zellen zu Beginn mit Natrium-4-phenylbutyrat (4-PBA, 0–1,5 mM) inkubiert, das die Protein- und mRNA-Expression von Hsc70 durch Abbau der mRNA um ~40–50% herunterreguliert, und dann wird das gebundene Protein unter Verwenden eines anti-Hsc70-Antikörpers mittels Western Blot-Analyse untersucht. Die Menge des an die Az-Matrix gebundenen Hsc70 nimmt mit steigender Konzentration an 4-PBA ab, da die mit 4-PBA behandelten P19-Zellen die Menge an Hsc70, die an die Az-Matrix binden können, reduzieren.
Das Zielprotein Hsc70 spielt in zellulären Prozessen wesentliche Rollen, wie beispielsweise bei der Proteinfaltung neu synthetisierter cytoplasmatischer Proteine, der erneuten Faltung beschädigter Proteine, dem Abbau fehlgefalteter Proteine, der Translozierung cytoplasmatischer Proteine über die Membranen von Organellen und der Entfernung von Clathrin aus beschichteten Vesikeln. Da das Protein ein anti-apoptotisches Chaperonprotein ist, ist bekannt, dass Hsc70 auch an der Entwicklung von Krebs beteiligt ist. Die Entwicklung von Anti-Tumormitteln auf Basis der Modulierung der Neigung der Zellen, Apoptose zu erfahren, indem das Protein gehemmt wird, ist daher ein interessanter Ansatz in der Krebsforschung. Daneben ist Hsc70 ein Chaperonprotein, das den nuklearen Transport der Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise NF-kB, welcher an der Aktivierung von Lymphozyten beteiligt ist, vermittelt. Es wird vermutet, dass die unkontrollierte Aktivierung von NF-kB zu einer Reihe von Immun- und Entzündungserkrankungen, wie beispielsweise der Abstoßung von Allotransplantaten, rheumatoider Arthritis und bronchialem Asthma, führt. Als Folge davon können kleine Moleküle, die die Funktion von Hsc70 hemmen, als Immunsuppressiva zur Vorbeugung einer Abstoßung von Transplantaten und zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden, da sie die Aktivierung von NF-kB teilweise unterdrücken. Des Weiteren ist auch bekannt, dass Hsc70 den Abbau fehlgefalteter Proteine im ER unterstützt. Cystische Fibrose ist eine Erkrankung, die durch das Entfernen von mutantem CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) im ER verursacht wird. Die häufigste Mutation von CFTR ist die Deletion von Phenylalanin-508 im CFTR (ΔF508-CFTR). Diese Mutante wird in der fehlgefalteten Form exprimiert, die durch Verbindung mit Hsc70 für den nachfolgenden Abbau über den Ubiquitin-Proteasom-Weg im ER zurückgehalten wird. Dies führt zur Abwesenheit von CFTR-Cl^–-Kanälen in der Plasmamembran und verursacht daher in vielen Geweben einen anomalen Chloridtransport. Es wurde berichtet, dass die Hemmung der Assoziierung von der fehlgefalteten Mutante CFTR und Hsc70 dessen Austritt aus dem ER zulässt und den Abbau desselben verhindert. Dies zeigt, dass kleine Moleküle zum Transport von ΔF508-CFTR zur Plasmamembran durch Hemmen der Funktion von Hsc70 als Therapeutika für die Behandlung von durch eine CFTR-Mutation verursachte CF verwendet werden können.
Verfahren zum Induzieren von Apoptose in humanen Krebszellen mittels Apoptozolen
Beschrieben sind Verfahren zum Induzieren von Apoptose in Krebszellen zur Behandlung von Krebs. Die Krebszellen werden beispielsweise mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die Apoptozole 1 bis 4 enthält, inkubiert und erfahren den Zelltod. Humane Krebszellen (Eierstockkrebszellen; SK-OV-3, Kolonkrebszellen; HCT-15; Lungenkrebszellen; A549) werden mit verschiedenen Konzentrationen einer Verbindung mit der Formel I (oder einer Zusammensetzung derselben) inkubiert, wodurch die Zellen den apoptotischen Zelltod erfahren. Die Konzentration einer Verbindung mit der Formel I, wie beispielsweise den Apoptozolen 1 bis 4, kann so eingestellt werden, dass die Apoptose der Krebszellen induziert wird. Üblicherweise werden die Apoptozole 1 bis 4 in einer Konzentration zwischen 0,05 μM und 1,0 μM mit den Krebszellen inkubiert.
Humane kolorektale Adenokarzinomzellen HCT-15 und humane Eierstock-Adenokarzinomzellen SK-OV-3 werden in mit 10% FRS (fötalem Rinderserum) supplementiertem RPMI 1640-Medium kultiviert. Humane Lungenkarzinomzellen A549 werden in mit 10% FRS supplementiertem Ham's F12K-Medium kultiviert. Die Kulturmedien für die Zelllinien enthalten jeweils 4 mM L-Glutamin und sind mit 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin supplementiert. Die Krebszellen werden unter den Bedingungen kultiviert, die bekanntermaßen für das Zellwachstum optimal sind. Solche Bedingungen schließen eine Temperatur von 37°C mit 5% CO₂ in Luftatmosphäre ein. Die Zellen werden gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung auf Kunststoffplatten, in Kolben oder Rollflaschen kultiviert. Geeignete Kultivierungsgefäße schließen Platten mit vielen Vertiefungen (Multi-Well-Platten), Petrischalen, Gewebekulturröhrchen, Kolben, Rollflaschen und dergleichen ein.
Der apoptotische Zelltod wird durch die Verwendung einer Kombination aus FITC-Annexin V (2 μg/ml) und Propidiumiodid (PI, 5 μg/ml) gemessen (Cytometry, 1999, 37, 197–204). Die Apoptose läuft relativ schnell ab (2–4 h) und schließt den Verlust der Asymmetrie der Phospholipide auf der Plasmamembran ein, was dazu führt, dass Phosphatidylserin der äußeren Oberfläche ausgesetzt wird. Das exponierte Phosphatidylserin wird mittels FITC-Annexin V nachgewiesen. PI wird eher dazu verwendet, Zellen, deren Membran perturbiert ist (späte Apoptose und Permeabilisierung der Membran, ein Merkmal der frühen Phase von Nekrose), nachzuweisen, als Apoptose. Auf diese Weise werden Verbindungen, die in P19-Zellen eine positive Annexin V-Färbung und eine negative PI-Färbung zeigen, selektiert. Die Zellproliferation wird zudem unter Verwenden des CyQuant Cell Proliferation Assay-Kits (Invitrogen) bestimmt.
Verfahren zum Screenen von Verbindungen, die Apoptose induzieren
Beschrieben ist weiterhin ein Screening-Verfahren für weitere Verbindungen, die Apoptose induzieren. Die Zellen werden mit einer Testverbindung inkubiert, die das Vermögen besitzen kann, Apoptose zu induzieren. Der Tod der Zellen kann durch die Verwendung der Kombination aus FITC-Annexin V (2 μg/ml) und Propidiumiodid (PI, 5 μg/ml) nachgewiesen werden (Cytometry 1999, 37, 197–204) und die Anzahl der Zellen wird unter Verwenden des CyQuant Cell Proliferation Assay-Kits (Invitrogen) gezählt. Die Testverbindung, die Apoptose induziert, wird als „Treffer” bezeichnet.
Beschriebene Hochdurchsatz-Screnningverfahren schließen das Bereitstellen einer Bibliothek, die eine große Anzahl an potentiellen therapeutischen Verbindungen enthält, ein. Solche kombinatorischen chemischen Bibliotheken werden dann in einem oder mehreren Tests gescreent, um diejenigen Elemente der Bibliothek zu identifizieren, die eine Aktivität zur Induktion von Apoptose zeigen. Die so identifizierten Verbindungen können als herkömmliche Ausgangsverbindungen dienen oder als potentielle oder aktuelle Therapeutika eingesetzt werden.
Inaktivierung humaner Lymphozyten durch Apoptozole
Auch beschrieben sind Verfahren zum Inaktivieren von humanen Lymphozyten zur Behandlung von Erkrankungen, die das Immunsystem betreffen, bereit. Dabei werden die Lymphozyten mit einer Verbindung mit der Formel I (oder einer Zusammensetzung derselben) inkubiert, wodurch die Lymphozyten inaktiviert werden. Hsc70, das ein Zielprotein der Apoptozole ist, ist ein Chaperonprotein, das den nukleären Transport der Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise NF-kB, das an der Aktivierung von Lymphozyten beteiligt ist, vermittelt. Es wird angenommen, dass die unkontrollierte Aktivierung von NF-kB zu einer Reihe von Immun- und Entzündungserkrankungen, wie beispielsweise der Abstoßung von Allotransplantaten, rheumatoider Arthritis und bronchialem Asthma, führt (Pediatr. Transplant. 2004, 8, 594–599 J. Clin. Pharmacol. 1998, 38, 981–993). Als Folge davon können kleine Moleküle, die die Funktion von Hsc70 hemmen, als Immunsuppressiva zur Vorbeugung der Abstoßung von Transplantaten und zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet werden, indem sie die Aktivierung von NF-kB zum Teil unterdrücken.
Die Aktivierung der Lymphozyten führt zur Bildung eines Uropods in dem hinteren Pol während der Polarisierung und Proliferation der Zellen. Jurkat-Lymphozyten werden 1 h lang mit verschiedenen Konzentrationen der Apoptozole inkubiert und die behandelten Zellen werden dann durch 1-stündige Behandlung mit TNF-α aktiviert. Im Vergleich zu den Zellen, die nur mit TNF-α behandelt wurden, verringern die Apoptozole die durch TNF-α induzierte Bildung des Uropods um 45%. Apoptozole unterdrücken auch die durch TNF-α induzierte Proliferation von T-Zellen (Verringerung der Proliferation mit 100 nM Apotozolen um 65%). Des Weiteren unterdrücken die Apoptozole die durch Phytohämagglutinin (PHA) induzierte, homotypische Aggregation in den Lymphozyten. Die Jurkat-Lymphozyten werden 1 h lang mit verschiedenen Konzentrationen an Apoptozolen und dann 1 h Stunde lang mit PHA behandelt, um die homotypische Aggregation zu induzieren. Die Apoptozole unterdrücken die Aggregation der Lymphozyten (Verringerung der Aggregation durch 100 nM Apoptozole um 76%).
Translozierung von mutantem CFTR zu den Plasmamembranen durch die Apoptozole
Zudem sind Verfahren zur Translozierung von mutantem CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) zur Behandlung von cystischer Fibrose beschrieben. Hsc70 unterstützt den Abbau fehlgefalteter Proteine im ER (Nature 1996, 381, 571–579 Cell 1998, 92, 351–366 Science 1999, 286, 1888–1893). Cystische Fibrose ist eine Erkrankung, die durch das Entfernen von mutantem CFTR im ER verursacht wird. Die häufigste Mutation von CFTR ist die Deletion von Phenylalanin-508 im CFTR (ΔF508-CFTR). Diese Mutante wird in der fehlgefalteten Form exprimiert, die durch Assoziierung mit Hsc70 zum anschließenden Abbau über den Ubiquitin-Proteasom-Weg im ER zurückgehalten wird. Dies führt zur Abwesenheit von CFTR-Cl^–-Kanälen in der Plasmamembran und verursacht dadurch in vielen Geweben einen anomalen Chloridtransport. Es wurde berichtet, dass die Hemmung der Assoziierung zwischen der fehlgefalteten Mutante CFTR und Hsc70 dessen Austritt aus dem ER zulässt und den Abbau desselben verhindert (Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2001, 281, L43-L. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000, 278, C259–C267). Dies zeigt, dass kleine Moleküle zum Transport von ΔF508-CFTR zur Plasmamembran durch Hemmen der Funktion von Hsc70 als Therapeutika zur Behandlung von durch eine Mutation von CFTR verursachter CF verwendet werden können. Um das Potential von Apoptozolen zum Verstärken der intrazellulären Bewegungen von mutantem ΔF508-CFTR zur Plasmamembran zu untersuchen, werden für diese Studie zwei Zelllinien, Capan-1 und CFPAC-1, eingesetzt. Nicht-permeabilisierte Capan-1-Zellen exprimieren normales CFTR in der Zellmembran. Nicht-permeabilisierte CFPAC-1-Zellen, eine Pankreasgang-Zelllinie, die von einem Patienten mit CF, der eine ΔF508-Mutation trägt, stammt, exprimieren mutantes ΔF508-CFTR und zeigen wenig oder gar kein Protein an der Zelloberfläche, da ΔF508-CFTR im Proteosom-Weg proteolytisch abgebaut wird. Wenn die Capan-1-Zellen mit anti-CFTR-Antikörper immungefärbt werden, wird in der Zellmembran eine starke Fluoreszenz beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigen immungefärbte CFPAC-1-Zellen ein nur geringes oder gar kein Fluoreszenzsignal an der Zelloberfläche, da mutantes CFTR intrazellulär abgebaut wird. Nach 24-stündiger Behandlung mit 100 nM Apoptozolen (einer Konzentration, die keine Apoptose induziert) exprimieren die CFPAC-1-Zellen jedoch einen Teil des ΔF508-CFTR auf der Zellmembran, indem sie den durch die Funktion des Chaperons Hsc70 vermittelten Abbau umgehen.
Behandlungsverfahren
Beschrieben sind weiterhin Verfahren zum Behandeln von Patienten mit Erkrankungen oder Störungen, die durch Verabreichung von Apoptozolen behandelt werden können. Patienten, die einer solchen Behandlung bedürfen, werden mit einer Verbindung mit der Formel (I) (z. B. den Apoptozolen 1 bis 4 oder Zusammensetzungen derselben) behandelt, wodurch Krebszellen
Apoptose erfahren, Lymphozyten inaktiviert werden oder mutantes CFTR auf der Zellmembran exprimiert wird.
Die folgenden Beispiele sollen die beanspruchte Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken.
Beispiel 1: Synthese von 4-2[3,5-Bis(trifluormethyl)phenyl]-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol-1-yl-methylbenzamid (Apoptozol 1)
Zu einer gerührten Lösung von Ammoniumacetat (0,6 g, 8,0 mmol) in Essigsäure (5 ml) wurden bei 100°C 3,5-Bis(trifluormethyl)benzaldehyd (0,3 μl, 1,7 mmol), 4,4'-Dimethoxybenzil (0,5 g, 1,7 mmol) und 4-(Aminomethyl)benzamid (0,2 g, 1,3 mmol) gegeben. Nach 5-stündigem Rühren wurde die Reaktionsmischung mit CH₂Cl₂ verdünnt und mit H₂O und Lauge gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingeengt. Das Rohprodukt wurde mittels Flash-Säulenchromatographie (3:1 bis 1:1 Hexan/EtOAc) gereinigt, um ein Rohprodukt (0,4 mmol, 30%) zu erhalten: ¹H-NMR (250 MHz, CD₃OD) δ 8,82 (s, 2H), 8,67 (s, 2H), 8,40 (d, 2H, J = 10,0), 8,06 (d, 2H, J = 8,8), 7,90 (d, 2H, J = 8,1), 7,62-7,58 (m, 4H), 7,45 (d, 2H, J = 8,8), 5,91 (s, 2H), 4,45 (s, 3H), 4,40 (s, 3H), ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) δ 171,6, 162,0, 160,5, 145,9, 142,4, 140,1, 134,5, 134,3, 133,7, 133,4, 133,2, 132,5, 130,4, 129,6, 129,4, 127,6, 127,2, 123,7, 123,1, 115,8, 114,8, 55,9, 55,8, 40,5, MALDI-TOF-MS berechnet für C₃₃H₂₅F₆N₃O₃ (M+Na)⁺ 648,18 gefunden 648,18.
Beispiel 2: Synthese von N-2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxylethy1-4-2-[3,5-bis(trifluormethyl)phenyl]-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol-1-yl-methyl]-benzamid (Apoptozol 2)
Zu einer gerührten Lösung von Ammoniumacetat (0,9 g, 11,9 mmol) in Essigsäure (5 ml) wurden bei 100°C 3,5-Bis(trifluormethyl)benzaldehyd (0,4 μl, 2,6 mmol), 4,4'-Dimethoxybenzil (0,7 g, 2,6 mmol) und 4-(Aminomethyl)benzoesäure (0,3 g, 2,0 mmol) gegeben. Nach 5-stündigem Rühren wurden die flüchtigen Substanzen unter reduziertem Druck abgezogen. Zum übrig bleibenden Öl wurde Wasser gegeben und ein Feststoff als Rohprodukt erhalten. Der Feststoff wurde mittels Filtration gesammelt und mehrmals mit Ether gewaschen, um eine Säure als Rohprodukt (0,6 mmol, 32%) zu ergeben: ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d) δ 8,18 (s, 2H), 8,13 (s, 2H), 7,79 (d, 2H, J = 8,2), 7,42 (d, 2H, J = 8,7), 7,29 (d, 2H, J = 8,6), 7,02 (d, 2H, J = 8,6), 6,83 (d, 4H, J = 8,8), 5,26 (s, 2H), 4,45 (s, 3H), 3,78 (s, 3H) ¹³C-NMR (62,5 MHz, DMSO-d) δ 176,4, 169,3, 167,7, 152,9, 151,5, 147,2, 142,6, 141,8, 140,5, 140,2, 139,9, 139,4, 139,3, 138,0, 137,0, 136,3, 135,5, 134,8, 131,4, 124,3, 123,3, 64,7, 64,6, 24,7; MALDI-TOF-MS berechnet für C₃₃H₂₄F₆N₂O₄ (M+Na)⁺ 649,15, gefunden 649,16.
Eine Lösung der aus dem obigen Schritt erhaltenen Säure (50,1 mg, 80 μmol), 1-Benzotriazolyloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP, 53,0 mg, 120 μmol), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt, 16,2 mg, 120 μmol) und N-Ethylmorpholin (NEM, 15,2 ml, 120 μmol) in DMF (500 μl) wurde aminoethyliertem Wang-Harz (0,04 g, 40 μmol) zugesetzt. Nach 12-stündigem Schütteln wurde das Harz mehrmals mit DMF gewaschen. Das gekoppelte Harz wurde 1 h lang mit TFA-TES (90:10) umgesetzt, um ein Produkt freizusetzen. Das Rohprodukt wurde über 90 min mittels präparativer RP-HPLC mit einem Gradienten von 2–100% CH₃CN in Wasser gereinigt: ¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ 8,17 (s, 2H), 8,07 (s, 2H), 7,70 (d, 2H, J = 8,4), 7,40 (d, 2H, J = 8,8), 7,25 (d, 2H, J = 8,8), 6,96 (d, 2H, J = 8,8), 6,81 (d, 2H, J = 9,2), 5,27 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,68-3,63 (m, 8H), 3,54 (t, 2H, J = 5,6), 3,08 (t, 2H, J = 5,2) ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) δ 169,6, 162,1, 160,7, 145,6, 141,9, 139,4, 135,1, 133,7, 133,6, 133,5, 133,2, 132,5, 130,5, 129,7, 129,0, 127,3, 126,8, 124,0, 122,7, 115,8, 114,9, 71,5, 71,4, 70,7, 68,0, 55,9, 55,8, 40,8, 40,7; MALDI-TOF-MS berechnet für C₃₉H₃₈F₆N₄O₅ (M+Na)⁺ 779,26, gefunden 779,27.
Unter Verwenden der in den Beispielen 1–2 oben beschriebenen Verfahren und den geeigneten Ausgangsstoffen und Reagenzien wurden auch die folgenden Imidazolderivate dargestellt:
4-[2-(9H-Fluoren-3-yl)-4,5-diphenylimidazol-1-yl-methyl]benzamid (Apoptozol 3) und N-2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl-4-[2-(9H-fluoren-3-yl)-4,5-diphenylimidazol-1-yl-methyl]benzamid (Apoptozol 4).
Beispiel 3: Zellkultur und Screenen nach kleinen Molekülen (Referenzbeispiel)
Humane Jurkat-Lymphozyten werden in mit 5% FRS supplementiertem RPMI 1640-Medium kultiviert. Humane kolorektale Adenokarzinomzellen HCT-15 und humane Eierstockadenokarzinomzellen SK-OV-3 werden in mit 10% FRS supplementiertem RPMI 1640-Medium kultiviert. Humane Lungenkarzinomzellen A549 werden in mit 10% FRS supplementiertem Ham's F12K-Medium kultiviert. Die Kulturmedien für alle Zelllinien enthalten jeweils 4 mM L-Glutamin und sind mit 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin supplementiert. Alle Zellen werden bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.
Zum Screenen nach kleinen Molekülen werden Imidazolderivate in parallelen Platten mit 96 Vertiefungen gescreent, wobei eine Platte zum Messen des während der Apoptose an der Zellmembran exponierten Phosphatidylserins (über FITC-Annexin V-Markierung der Zellmembran) verwendet wird und eine Platte zum Messen der Permeabilisierung der Zellmembran (über Propidiumiodid-Markierung des Zellkerns) verwendet wird. Jede Verbindung wird in zwei Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen, die 5 × 10⁴ P19-Zellen mit einer Endkonzentration von 500 nM enthält, gegeben. Als Positivkontrolle werden zwei Vertiefungen 3 h lang mit 500 μM Wasserstoffperoxid, um Apoptose zu induzieren, inkubiert. Einzig mit 0,1% DMSO behandelte Zellen werden als Negativkontrolle verwendet. Die Zellen werden 3 h lang mit jeder Verbindung inkubiert und dann zweimal mit PBS gewaschen. Nach Fixierung der inkubierten Zellen mit 3% Formaldehyd in PBS für 10 min bei Raumtemperatur werden die fixierten Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellkulturen in einer Platte mit 96 Vertiefungen werden mit einer Verdünnung von FITC-Annexin V (2 μg/ml) inkubiert und die Zellen der zweiten Platte werden mit P1 (5 μg/ml) behandelt. Beide Platten werden 5 min lang im Dunkeln inkubiert. Die Zellkulturen werden dreimal mit PBS gewaschen und die Intensität der Fluoreszenz wird mittels eines Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegeräts (SpectraMax GeminiEM, Molecular Devices) gemessen. Das Signal von FITC-Annexin V wird bei einer Anregung bei 485 nm und einer Emission bei 538 nm ausgelesen. Das Signal von PI wird bei einer Anregung von 544 nm und einer Emission bei 612 nm ausgelesen. Verbindungen, die bei FITC-Annexin V positiv und bei PI negativ sind, werden als „Trefferverbindungen”, die Apoptose induzieren, selektiert.
Beispiel 4: Zellproliferations- und Überlebenstest
In einer Platte mit 96 Vertiefungen werden Zellen mit 10⁵ Zellen/ml ausplattiert und 48 h lang in komplettem Wachstumsmedium kultiviert. Die Zellen werden 6 h lang mit den Apoptozolen behandelt und dann werden die Zellen mit wirkstofffreiem Medium kultiviert. Die Zellen werden mittels Trypsinierung geerntet, um die toten Zellen von der Probe abzutrennen. Die Zellproliferation wird mit dem CyQuant Cell Proliferation Assay-Kit (Invitrogen) bestimmt.
Beispiel 5: Unterdrückung der Aktivierung von Lymphozyten
Humane Jurkat-Lymphozyten werden in Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 103 Zellen/ml in 5% FRS angesät, um die Neigung zu spontaner Bildung eines Uropods zu verringern. Die Lymphozyten werden 1 h lang mit verschiedenen Konzentrationen (0–100 μM) an Az behandelt. Die mit Az behandelten Lymphozyten werden 1 h lang durch Inkubation mit TNF-α (10 ng/ml), um die Bildung eines Uropods zu induzieren, aktiviert. Das gebildete Uropod wird durch mikroskopische Analyse von Zellgruppen bestimmt.
Für Studien der homotypischen Aggregation werden die Lymphozyten in Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/ml angesät und 1 h lang mit verschiedenen Konzentrationen (0–100 nM) an Az behandelt. Dann werden die Zellen 1 h lang mit 10 μg/ml PHA, um die Zellaggregation zu induzieren, inkubiert. Die Zelle werden in 40 zufällig bestimmten Sichtfeldern gezählt.
Beispiel 6: Nachweis der Expression von ΔF508-CFTR an der Zellmembran
Capan-1- und CFPAC-1-Zellen werden 24 h lang auf Permanox-Objektträgern (Fisher Scientific) angezüchtet und 24 h lang mit 1 mM 4-PBA und 100 nM Az behandelt. Die behandelten Zellen werden dreimal mit warmem PBS gewaschen. Mit den Zellsuspensionen wird unter Verwenden von Standardprozeduren eine Immunfärbung unter Verwenden von polyklonalem CFTR-Kaninchen (1:500, Abcam), Biotin-konjugiertem Anti-Kaninchen (1:500, Abcam) und Texas Rot konjugiertem Streptavidin durchgeführt, wobei Triton X-100 aus der Fixierungslösung weggelassen wurde, um einen Nachweis von CFTR an der Zelloberfläche zuzulassen. Die Objektträger wurden unter Verwenden eines Fluoreszenzmikroskops (Nikon Eclipse TE2000) analysiert.

Claims

Verbindung, welche ein Element ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Strukturen:
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine Verbindung, welche ein Element ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Strukturen:
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die in Anspruch 2 beschriebene Verbindung als Wirkstoff zur Behandlung von Krebs enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die in Anspruch 2 beschriebene Verbindung als Wirkstoff zur Unterdrückung der Autoimmunität enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die in Anspruch 2 beschriebene Verbindung als Wirkstoff zur Behandlung von cystischer Fibrose enthält.