DE602004011515T2

DE602004011515T2 - Furazanobenzimidazole

Info

Publication number: DE602004011515T2
Application number: DE602004011515T
Authority: DE
Inventors: Martin Eberle; Felix Bachmann; Alessandro Strebel; Subho Kolkata ROY; Sudhir Varanasi SRIVASTAVA; Goutam Kolkata SAHA
Original assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Current assignee: Basilea Pharmaceutica AG
Priority date: 2003-05-23
Filing date: 2004-05-19
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2024-05-20
Also published as: PT1636215E; CY1107422T1; JP2006528238A; CA2526026C; DE602004011515D1; JP2011207909A; EP1636215B1; DK1636215T3; PL1636215T3; US20070043061A1; USRE42890E1; ES2300775T3; WO2004103994A1; JP4829791B2; JP5670266B2; CN100434428C; EP1636215A1; CN1812986A; ATE384718T1; US7385061B2

Description

Die Erfindung betrifft neue substituierte Furazanobenzimidazole, Verfahren zur Herstellung von diesen, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche dieselben enthalten, die Verwendung von diesen, gegebenenfalls in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch aktiven Verbindungen, zur Therapie neoplastischer Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen und ein Verfahren zur Behandlung solcher Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Krebs ist eine der Hauptursachen beim Tod von Menschen. Obwohl eine Vielzahl von Arzneimitteln gegen neoplastische Erkrankungen entwickelt wurde und Techniken wie z. B. Operation und Strahlentherapie verfügbar sind, gibt es immer noch einen Bedarf für alternative und verbesserte Verfahren zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen.
Autoimmunerkrankungen sind mit einer anomalen Lymphoproliferation als einer Folge von Defekten bei der Beendigung der Lymphozytenaktivierung und des Wachstums verbunden. Oft sind solche Erkrankungen mit einer Entzündung verbunden, wie rheumatoide Arthritis, insulinabhängiger Diabetes mellitus, multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematosus und dergleichen. Die Behandlung solcher Erkrankungen konzentriert sich auf antientzündliche und immunsuppressive Arzneimittel, welche in zahlreichen Fällen ernste Nebenwirkungen zeigen. Somit gibt es einen Bedarf für alternative Arzneimittel mit einem neuen Wirkungsmodus, die weniger Nebenwirkungen zeigen.
Apoptose ist ein Begriff, der verwendet wird, um eine Reihe von zellulären Ereignissen zu beschreiben, welche stattfinden, um einen programmierten Zelltod zu bewirken. Es gibt verschiedene Apoptosewege, von denen einige charakterisiert wurden, wogegen andere noch aufgeklärt werden müssen. Wenn das Gleichgewicht zwischen Zellteilung und Apoptose gestört ist, können lebensbedrohliche Erkrankungen einschließlich Krebs, Autoimmunkrankheiten, neurodegenerativen und kardiovaskulären Erkrankungen auftreten.
In den letzten Jahren ist klar geworden, dass der programmierte Zelltod (Apoptose) für die Gesundheit eines mehrzelligen Organismus ebenso wichtig ist wie die Zellteilung. Durch wiederholte Zellteilung und Differenzierung über die Entwicklung hinweg oder Gewebereparatur werden überschüssige oder sogar schädliche Zellen erzeugt. Um die Gewebehomöostase aufrecht zu erhalten, müssen diese Zellen entfernt oder abgetötet werden. Das feine Wechselspiel zwischen Zellwachstum und Apoptose in einem Organismus spiegelt sich in dem komplexen molekularen Gleichgewicht wieder, das bestimmt, ob eine einzelne Zelle eine Teilung durchmacht, in dem Zellzyklus anhält oder zu dem programmierten Zelltod übergeht.
Eine Dysregulation der Zellproliferation oder ein Fehlen eines angebrachten Zelltods hat weitreichende klinische Implikationen. Eine Anzahl von Erkrankungen, die mit einer solchen Dysregulation verbunden sind, beinhaltet Hyperproliferation, Entzündung, Gewebeumbildung und -reparatur. Bekannte Indikationen in dieser Kategorie beinhalten Krebs, Restenose, neointimale Hyperplasie, Angiogenese, Endometriose, lymphoproliferative Krankheiten, mit einer Transplantation zusammenhängende Symptomatiken (Transplantat-Abstoßung), Polyposis, Verlust von Neuralfunktion im Fall von Gewebeumbildung und dergleichen. Solche Zellen können die normale regulatorische Kontrolle der Zellteilung verlieren und können ebenso dabei versagen, den angebrachten Zelltod durchzumachen.
Da die Apoptose bei den meisten Typen von proliferativen, neoplastischen Erkrankungen inhibiert oder verzögert wird, ist die Induktion der Apoptose eine Option für die Behandlung von Krebs, insbesondere bei Krebstypen, welche eine Resistenz gegen die klassische Chemotherapie, Strahlen- und Immuntherapie zeigen (Apoptosis and Cancer Chemotherapy, Hickman und Dive, Herausg., Blackwell Publishing, 1999). Ebenso können bei Autoimmun- und mit einer Transplantation zusammenhängenden Erkrankungen und Symptomatiken Verbindungen, die eine Apoptose induzieren, verwendet werden, um normale Zelltodprozesse wieder herzustellen, und können daher die Symptome ausräumen und könnten die Erkrankungen heilen. Weitere Anwendungen von Verbindungen, die eine Apoptose induzieren, können bei einer Restenose, d. h. einer Ansammlung von vaskulären glatten Muskelzellen in den Wänden von Arterien, und bei hartnäckigen Infektionen, die durch ein Misslingen, Bakterien- und Virus-infizierte Zellen auszurotten, verursacht werden, liegen. Weiterhin kann die Apoptose in Epithelzellen, in Endothelzellen, in Muskel zellen und in anderen, welche den Kontakt mit der extrazellulären Matrix verloren haben, induziert oder wiederhergestellt werden. Diese Zellen sind potentiell in der Lage, andere Organe zu besiedeln, und können sich daher zu Pathologien wie Neoplasien, Endometriose und dergleichen entwickeln.
A. V. Sergievskii et al., Russian Journal of Organic Chemistry 2001, 37, 717–720 und A. V. Sergievskii et al., Russian Journal of Organic Chemistry 2002, 38, 872–874 beschreiben die Synthese von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylaminen durch die Reaktion von Methyl-4-aminofurazan-3-carboximidat mit o-Phenylendiamin, und die Alkylierung an N¹ des Benzimidazolkerns mit Alkylhalogeniden.
Die WO 03/066629 (Vertex Pharmaceuticals Inc.) beschreibt eine große Anzahl von Heteroarylverbindungen, die als Kinaseinhibitoren nützlich sind. Einige 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamine, die an der 3-Aminogruppe des Furazans und an N¹ des Benzimidazolkerns substituiert sind, werden ebenfalls offenbart. Diese Verbindungen werden als Inhibitoren der GSK-3- und LCK-Kinase beschrieben, weisen aber bei der Apoptose und medizinischen Zuständen, die damit verbunden sind, keine Relevanz auf.
Zusammenfassung der Erfindung
Furazanobenzimidazole mit der Formel (I) induzieren selektiv Apoptose in Krebszellen und können zur Behandlung von neoplastischen und Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Die Erfindung betrifft Verbindungen mit der Formel (I), insbesondere solche Verbindungen zur Verwendung als Medikamente, Verfahren zur Synthese solcher Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Verbindungen mit der Formel (I) enthalten, die Verwendung einer Verbindung mit der Formel (I) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von neoplastischen und Autoimmunerkrankungen und Verfahren der Behandlung von neoplastischen und Autoimmunerkrankungen unter Verwendung solcher Verbindungen mit der Formel (I) oder von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche dieselben enthalten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verbindungen mit der Formel (I)
wobei
R für Phenyl, Thienyl oder Pyridinyl steht,
wobei Phenyl gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl, Halogenniederalkyl, Hydroxyniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Acyloxyniederalkyl, Phenyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Hydroxyniederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Phenylniederalkoxy, Niederalkylcarbonyloxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Niederalkoxycarbonylamino, Niederalkylcarbonylamino, substituiertem Amino, wobei die zwei Substituenten am Stickstoff zusammen mit dem Stickstoff Heterocyclyl bilden, Niederalkylcarbonyl, Carboxy, Niederalkoxycarbonyl, Cyano, Halogen und Nitro; und wobei zwei benachbarte Substituenten Methylendioxy sind;
und wobei Pyridinyl gegebenenfalls substituiert ist mit Niederalkoxy, Amino oder Halogen;
X für eine Gruppe C=Y steht, wobei Y für Sauerstoff oder Stickstoff steht, das mit Hydroxy oder Niederalkoxy substituiert ist;
R¹ für Wasserstoff, Niederalkylcarbonyl, Hydroxyniederalkyl oder Cyanoniederalkyl steht;
R², R³ und R⁶ für Wasserstoff stehen;
R⁴ und R⁵, unabhängig voneinander, für Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy stehen; oder R⁴ und R⁵ zusammen für Methylendioxy stehen;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen;
oder wobei
R für Phenyl oder Pyridinyl steht,
wobei Phenyl gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl, Halogenniederalkyl, Hydroxyniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Acyloxyniederalkyl, Phenyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Hydroxyniederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Phenylniederalkoxy, Niederalkylcarbonyloxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Niederalkoxycarbonylamino, Niederalkylcarbonylamino, substituiertem Amino, wobei die zwei Substituenten am Stickstoff zusammen mit dem Stickstoff Heterocyclyl bilden, Niederalkylcarbonyl, Carboxy, Niederalkoxycarbonyl, Formyl, Cyano, Halogen und Nitro; und wobei zwei benachbarte Substituenten Methylendioxy sind;
und wobei Pyridinyl gegebenenfalls substituiert ist mit Niederalkoxy, Amino oder Halogen;
X für Sauerstoff steht;
R¹ für Wasserstoff, Niederalkylcarbonyl, Hydroxyniederalkyl oder Cyanoniederalkyl steht;
R², R³ und R⁶ für Wasserstoff stehen;
R⁴ und R⁵, unabhängig voneinander, für Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy stehen; oder R⁴ und R⁵ zusammen für Methylendioxy stehen;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Die allgemeinen Ausdrücke, die vorstehend und nachstehend verwendet werden, weisen vorzugsweise im Zusammenhang mit dieser Offenbarung die folgenden Bedeutungen auf, sofern nichts anderes angegeben ist:
Die Vorsilbe „nieder" bezeichnet einen Rest mit bis zu und einschließlich eines Maximums von 7, insbesondere bis zu und einschließlich eines Maximums von 4 Kohlenstoffatomen, wobei die in Frage stehenden Reste entweder linear oder verzweigt, mit einfacher oder mehreren Verzweigungen, sind.
Wo die Pluralform für Verbindungen, Salze und dergleichen verwendet wird, soll dieses ebenfalls eine einzelne Verbindung, ein Salz oder dergleichen bedeuten.
Doppelbindungen können im Prinzip E- oder Z-Konfiguration aufweisen. Die Verbindungen dieser Erfindung können daher als isomere Mischungen oder einzelne Isomere vorliegen. Wenn es nicht spezifiziert ist, sind beide isomeren Formen beabsichtigt.
Alle asymmetrischen Kohlenstoffatome können in der (R)-, (S)- oder (R,S)-Konfiguration, vorzugsweise in der (R)- oder (S)-Konfiguration, vorliegen. Die Verbindungen können somit als Mischungen von Isomeren oder als reine Isomere, vorzugsweise als enantiomerenreine Diastereomere, vorliegen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls mögliche Tautomere der Verbindungen mit der Formel (I).
Alkyl weist von 1 bis 12, vorzugsweise von 1 bis 7 Kohlenstoffatome auf und ist linear oder verzweigt. Alkyl ist vorzugsweise Niederalkyl.
Niederalkyl weist 1 bis 4 Kohlenstoffatome auf und ist Butyl wie z. B. n-Butyl, sec-Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Propyl wie z. B. n-Propyl oder Isopropyl, Ethyl oder Methyl. Vorzugsweise ist Niederalkyl Methyl oder Ethyl.
Bei gegebenenfalls substituiertem Phenyl sind Substituenten bevorzugt Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Methylendioxy, Halogenniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Halogen oder Nitro.
Heterocyclyl bezeichnet bevorzugt einen gesättigten, teilweise gesättigten oder ungesättigten mono- oder bizyklischen Ring, welcher 4–10 Atome enthält, die ein, zwei oder drei Heteroatome umfassen, welche ausgewählt sind aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, welche, wenn nichts anderes angegeben ist, über Kohlenstoff oder Stickstoff verknüpft sein können, wobei ein Ringstickstoffatom gegebenenfalls substituiert sein kann mit einer Gruppe, die ausgewählt ist aus Niederalkyl, Aminoniederalkyl, Aryl, Arylniederalkyl und Acyl, und ein Ringkohlenstoffatom substituiert sein kann mit Niederalkyl, Aminoniederalkyl, Aryl, Arylniederalkyl, Heteroaryl, Niederalkoxy, Hydroxy oder Oxo. Beispiele für Heterocyclyl sind Pyrrolidinyl, Oxazolidinyl, Thiazolidinyl, Piperidinyl, Morpholinyl, Piperazinyl, Dioxolanyl und Tetrahydropyranyl.
Acyl bezeichnet z. B. Alkylcarbonyl, Cycloalkylcarbonyl, Arylcarbonyl, Arylniederalkylcarbonyl oder Heteroarylcarbonyl. Niederacyl ist bevorzugt Niederalkylcarbonyl, insbesondere Propionyl oder Acetyl.
Hydroxyalkyl ist insbesondere Hydroxyniederalkyl, bevorzugt Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl oder 2-Hydroxy-2-propyl.
Cyanoalkyl bezeichnet bevorzugt Cyanomethyl und Cyanoethyl.
Halogenalkyl ist bevorzugt Fluoralkyl, insbesondere Trifluormethyl, 3,3,3-Trifluorethyl oder Pentafluorethyl.
Halogen ist Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Niederalkoxy ist insbesondere Methoxy, Ethoxy, Isopropyloxy oder tert-Butyloxy.
Wenn X für eine Gruppe C=Y steht, wobei Y für Stickstoff steht, welcher mit Hydroxy substituiert ist, entspricht dieses einer Oximfunktion. Oxime und die entsprechenden Oximalkylether (Stickstoff, substituiert mit Alkoxy) können in der E- oder Z-Form oder als Mischung von Isomeren vorliegen.
Salze sind insbesondere die pharmazeutisch verträglichen Salze der Verbindungen mit der Formel (I).
Solche Salze werden z. B. als Säureadditionssalze, vorzugsweise mit organischen oder anorganischen Säuren, aus Verbindungen mit der Formel (I) mit einem basischen Stickstoffatom, gebildet, insbesondere die pharmazeutisch verträglichen Salze. Geeignete anor ganische Säuren sind z. B. Halogensäuren wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Geeignete organische Säuren sind z. B. Carbon-, Phosphon-, Sulfon- oder Sulfaminsäuren, z. B. Essigsäure, Propionsäure, Octansäure, Decansäure, Dodecansäure, Glycolsäure, Milchsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Suberinsäure, Azelainsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Citronensäure, Aminosäuren wie z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Methylmaleinsäure, Cyclohexancarbonsäure, Adamantancarbonsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, 4-Aminosalicylsäure, Phthalsäure, Phenylessigsäure, Mandelsäure, Zimtsäure, Methan- oder Ethansulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Ethan-1,2-disulfonsäure, Benzolsulfonsäure, 2-Naphthalinsulfonsäure, 1,5-Naphthalindisulfonsäure, 2-, 3- oder 4-Methylbenzolsulfonsäure, Methylschwefelsäure, Ethylschwefelsäure, Dodecylschwefelsäure, N-Cyclohexylsulfaminsäure, N-Methyl-, N-Ethyl- oder N-Propylsulfaminsäure oder andere organische Protonensäuren wie z. B. Ascorbinsäure.
Zu Isolations- oder Reinigungszwecken ist es ebenfalls möglich, pharmazeutisch nicht verträgliche Salze, z. B. Picrate oder Perchlorate, zu verwenden. Zur therapeutischen Anwendung werden nur pharmazeutisch verträgliche Salze oder freie Verbindungen eingesetzt (wo anwendbar in der Form von pharmazeutischen Präparaten), und diese sind daher bevorzugt.
In Anbetracht der engen Verwandtschaft zwischen den neuen Verbindungen in freier Form und denen in der Form ihrer Salze, einschließlich jener Salze, die als Intermediate verwendet werden können, z. B. bei der Reinigung oder Identifizierung der neuen Verbindungen, ist jeglicher Bezug auf die freien Verbindungen vorstehend und nachstehend so zu verstehen, dass er sich ebenfalls auf die entsprechenden Salze bezieht, wenn dieses angemessen und zweckdienlich ist.
Verbindungen mit der Formel (I) weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verbindungen mit der Formel (I) wie vorstehend definiert zur Verwendung als Medikamente.
Die Wirksamkeit der Verbindungen der Erfindung beim Induzieren von Apoptose in Tumorzellen kann wie folgt gezeigt werden:
Relative Fluoreszenzaktivitäten von geeigneten Tumorzelllinien, die mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) transfiziert sind, werden in der Gegenwart von Verbindungen der Erfindung und von Standardtumorarzneimitteln gemessen, wobei das Verfahren verwendet wird, das in der WO 99/35493 beschrieben wird. Geeignete Tumorzelllinien sind A20.2J, ein BALB/c-B-Zell-Lymphom, PB-3c, eine IL-3-abhängige, nicht tumorigene Mastozytenlinie, die aus dem Knochenmark einer DBA/2-Maus isoliert wurde, Jurkat, eine humane akute T-Zell-Leukämie-Zelllinie, K562, eine humane chronische myelogene Leukämie-Zelllinie, HL60, eine humane akute promyelozytische Leukämie-Zelllinie, Ramos und Raji, humane B-Zell-Lymphom-Zelllinien, H9 und Hut78, humane T-Zell-Lymphom-Zelllinien, HeLa und KB, humane Plattenepithelkarzinom-Zelllinien, MCF7, SK-BR-3, PC3, HBL-100, SW480, H460 und H1792, humane Adenokarzinom-Zelllinien, und HT-1080, eine humane Fibrosarkom-Zelllinie.
Bevorzugte Standardarzneimittel als Verbindungen für Vergleiche sind: a) Antimetaboliten wie z. B. 5-Fluoruracil (ICN), Gemcitabin HC1(Gemzar^TM, Eli Lilly), b) alkylierende Mittel wie z. B. Oxaliplatin (Eloxantin^TM, Sanofi-Synthélabo), Dacarbazin (Detimedac^TM, Medac), Cyclophosphamid (Endoxan^TM, Asta) und Carboplatin (Paraplatin^TM, Bristol-Meyers Squibb), c) Inhibitoren des Zellzyklus wie z. B. Vinorelbin (Navelbine^TM, Robapharm), Vinblastin (Velbe^TM, Eli Lilly), Docetaxel (Taxotere^TM, Aventis), d) DNA-Brecher (Topoisomerase-Inhibitor, Interkalator, Strangbrecher) wie z. B. Doxorubicin HCl (Adriblastin^TM, Pharmacia-Upjohn), Bleomycin (Asta-Medica), Irinotecan (Campto^TM, Aventis), Etoposidphosphat (Etopophos^TM, Bristol-Meyers Squibb), Topotecan HCl (Hycamtin^TM, GlaxoSmithKline), e) Mischungen von diesen, f) Verbindungen, welche den Signaltransduktionsweg stören, wie z. B. Caspaseaktivitätsmodifikatoren, Agonisten und Antagonisten von Zelltodrezeptoren, Modifikatoren von Nukleasen, Phosphatasen und Kinasen wie z. B. Imatinibmesylat (Gleevec^TM, Novartis), Dexamethason, Phorbolmyristatacetat, Cyclosporin A, Quercetin, Tamoxifen (Alexis Corporation, Schweiz).
Die Apoptose wird in einem ersten Screen bestimmt, indem ein Fluoreszenzplattenlesegerät verwendet wird, und dann in einem zweiten Screen, indem FACS (fluoreszenzaktiviertes Zellscanning) verwendet wird. Verbindungen, die ohne wesentliche zytotoxische Nebenwirkungen Apoptose verursachen, werden zum weiteren Testen und zur Charakteri sierung ausgewählt, indem eine Kombination der folgenden gut etablierten Tests verwendet wird: A) Anfärbung des Kerns mit dem Hoechst-Farbstoff 33342, welcher Informationen über die Kernmorphologie und die DNA-Fragmentierung liefert, welches Kennzeichen der Apoptose sind. B) MTS-Proliferationstest, welcher die metabolische Aktivität von Zellen misst. Lebensfähige Zellen sind metabolisch aktiv, wogegen Zellen mit beeinträchtigter Atmungskette in diesem Test eine verringerte Aktivität zeigen. C) Annexin V-Bindungstest, welcher den Phosphatidylseringehalt der äußeren Lipiddoppelschicht der Plasmamembran wiedergibt. Dieses Ereignis wird als ein frühes Kennzeichen der Apoptose betrachtet. D) PI-Anfärbung für die Zellzyklusverteilung, welche jegliche Veränderungen in der Verteilung zwischen den verschiedenen Phasen des Zellzyklus zeigt. Es können Haltepunkte im Zellzyklus bestimmt werden. E) Proliferationstest, welcher die DNA-Synthese überwacht, indem Bromdeoxyuridin (BrdU) eingebaut wird. Inhibitorische Wirkungen auf das Wachstum/die Proliferation können direkt bestimmt werden. F) Die Cysteinproteinase-Abhängigkeit bzw. die Caspase-Abhängigkeit wird bestimmt, indem spezifische Inhibitoren verwendet werden. Dieses liefert eine Information über eine mögliche Beteiligung von spezifischen Proteasen an den Mechanismen.
Auf der Grundlage dieser Studien zeigt eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß der Erfindung therapeutische Wirksamkeit insbesondere gegenüber neoplastischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen. Insbesondere sind die Verbindungen der Erfindung aktiv gegenüber Malignitäten, z. B. Epithelneoplasmen, Plattenepithelneoplasmen, Basalzellneoplasmen, Übergangszellpapillomen und -karzinomen, Adenomen und Adenkarzinomen, Adnex- und Hautanhangsneoplasmen, mukoepidermoiden Neoplasmen, zystischen Neoplasmen, muzinösen und serösen Neoplasmen, ductalen, lobulären und medullären Neoplasmen, azinaren Zellneoplasmen, komplexen Epithelneoplasmen, speziellen gonodalen Neoplasmen, Paragangliomen und Glomustumoren, Naevi und Melanomen, Weichteiltumoren und Sarkomen, fibromatösen Neoplasmen, myxomatösen Neoplasmen, lipomatösen Neoplasmen, myomatösen Neoplasmen, komplexen gemischten und Stromaneoplasmen, Fibroepithelneoplasmen, synovial-ähnlichen Neoplasmen, Mesothelialneoplasmen, Keimzellneoplasmen, trophoblastischen Neoplasmen, Mesonephromen, Blutgefäßtumoren, Lymphgefäßtumoren, Knochen- und Knorpelneoplasmen, Riesenzelltumoren, diversen Knochentumoren, odontogenen Tumoren, Gliomen, neuroepitheliomatösen Neoplasmen, Meningiomen, Nervenscheidentumoren, granulären Zelltumoren und alveolaren Weichteilsarkomen, Hodgkin's und nicht-Hodgkin's Lymphomen, anderen lymphoretikulären Neoplasmen, Plasmazelltumoren, Mastzelltumoren, immunproliferativen Erkrankungen, Leukämien, diversen myeloproliferativen Krankheiten, lymphoproliferativen Krankheiten und myelodysplastischen Syndromen.
Insbesondere zeigt eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß der Erfindung therapeutische Wirksamkeit besonders gegenüber soliden neoplastischen Erkrankungen, z. B. Epithelneoplasmen, Plattenepithelneoplasmen, Basalzellneoplasmen, Übergangszellpapillomen und -karzinomen, Adenomen und Adenkarzinomen, Adnex- und Hautanhangsneoplasmen, mukoepidermoiden Neoplasmen, zystischen Neoplasmen, muzinösen und serösen Neoplasmen, ductalen, lobulären und medullären Neoplasmen, azinaren Zellneoplasmen, komplexen Epithelneoplasmen, speziellen gonodalen Neoplasmen, Paragangliomen und Glomustumoren, Naevi und Melanomen, Weichteiltumoren und Sarkomen, fibromatösen Neoplasmen, myxomatösen Neoplasmen, lipomatösen Neoplasmen, myomatösen Neoplasmen, komplexen gemischten und Stromaneoplasmen, Fibroepithelneoplasmen, synovial-ähnlichen Neoplasmen, Mesothelialneoplasmen, Keimzellneoplasmen, trophoblastischen Neoplasmen, Mesonephromen, Blutgefäßtumoren, Lymphgefäßtumoren, Knochen- und Knorpelneoplasmen, Riesenzelltumoren, diversen Knochentumoren, odontogenen Tumoren, Gliomen, neuroepitheliomatösen Neoplasmen, Meningiomen, Nervenscheidentumoren, granulären Zelltumoren und alveolaren Weichteilsarkomen.
Die Verbindungen der Erfindung sind ebenso aktiv gegenüber Autoimmunerkrankungen, z. B. gegenüber systemischem, diskoidem oder subakut kutanem Lupus erythematosus, rheumatoider Arthritis, Antiphospholipid-Syndrom, CREST, progressiver systemischer Sklerose, gemischter Bindegewebserkrankung (Sharp-Syndrom), Reiter's Sndrom, juveniler Arthritis, Kälteagglutinin-Krankheit, essentieller gemischter Kryoglobulinämie, rheumatischem Fieber, Spondylitis ankylosans, chronischer Polyarthritis, Myasthenia gravis, multipler Sklerose, chronisch entzündlicher demyelinisierender Polyneuropathie, Guillan-Barré-Syndrom, Dermatomyositis/Polymyositis, autoimmun-hämolytischer Anämie, thrombozytopener Purpura, Neutropenie, Diabetes mellitus Typ I, Thyroiditis (einschließlich Hashimoto's und Grave's Erkrankung), Addison's Erkrankung, polyglandulärem Syndrom, Pemphigus (vulgaris, foliaceus, sebaceous und vegetans), bullösem und narbigem Pemphigoid, pemphigoider Gestationis, Epidermolysis bullosa acquisita, linearer IgA- Erkrankung, Lichen sclerosus et atrophicus, Morbus Duhring, Psoriasis vulgaris, guttate, genereller pustulärer und lokalisierter pustulärer Psoriasis, Vitiligo, Alopecia areata, primärer Gallengangszirrhose, Autoimmunhepatitis, allen Formen von Glomerulonephritis, pulmonaler Hämorrhagie (Goodpasture-Syndrom), IgA-Nephropathie, perniziöser Anämie und Autoimmun-Gastritis, entzündlichen Darmerkrankungen (einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn), Behcet's Erkrankung, Celic-Sprue-Erkrankung, Autoimmun-Uveitis, Autoimmun-Myocarditis, granulomatöser Orchitis, Aspermatogenese ohne Orchitis, idiopatischer und sekundärer pulmonaler Fibrose, entzündlichen Erkrankungen mit einer Möglichkeit einer Autoimmupathogenese, wie z. B. Pyoderma gangrensosum, Lichen ruber, Sarkoidose (einschließlich Löfgren und kutaner/subkutaner Typ), Granuloma anulare, allergischer Typ I- und Typ IV-Immunreaktion, Asthma bronchiale, Pollinose, atopischer, Kontakt- und Luftwegs-Dermatitis, Vaskulitis großer Gefäße (Riesenzell- und Takayasu's Arteritis), Vaskulitis mittelgroßer Gefäße (Polyarteritis nodosa, Kawasaki-Erkrankung), Vaskulitis kleiner Gefäße (Wegener's Granulomatose, Churg-Strauss-Syndrom, mikroskopische Polangiitis, Henoch-Schoenlein Purpura, essentielle kryoglobulinämische Vaskulitis, kutane leukoklastische Angiitis), Hypersensitivitätssyndromen, toxischer Epidermalnekrolyse (Stevens-Johnson-Syndrom, Erythema multiforme), Erkrankungen aufgrund von Arzneimittelnebenwirkungen, allen Formen von kutanen, organspezifischen und systemischen Wirkungen aufgrund von Typ I–VI (Coombs Klassifikation) Immunreaktionsformen, mit einer Transplantation zusammenhängenden Symptomatiken wie z. B. akuter und chronischer Transplantat-Wirt- und Wirt-Transplantat-Erkrankung, einschließlich aller Organe (Haut, Herz, Niere, Knochenmark, Auge, Leber, Milz, Lunge, Muskel, zentrales und peripheres Nervensystem, Bindegewebe, Knochen, Blut- und lymphatisches Gefäß, genito-urinäres System, Ohr, Knorpel, primäres und sekundäres lymphatisches System einschließlich Knochenmark, Lymphknoten, Thymus, Gastrointestinaltrakt, einschließlich Oropharynx, Ösophagus, Magen, Dünndarm, Darm und Rektum, einschließlich Teilen der oben erwähnten Organe bis hinunter zu dem Niveau einzelner Zellen und Substrukturen, z. B. Stammzellen).
Eine Verbindung mit der Formel (I) kann allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen therapeutischen Mitteln verabreicht werden, wobei eine mögliche Kombinationstherapie die Form von festgelegten Kombinationen annimmt, oder die Verabreichung einer Verbindung der Erfindung und eines oder mehrerer anderer therapeutischer Mittel gestaffelt ist oder diese unabhängig voneinander gegeben werden, oder die Form der kombinierten Verabreichung von festgelegten Kombinationen und eines oder mehrerer anderer therapeutischer Mittel annimmt. Eine Verbindung mit der Formel (I) kann daneben oder zusätzlich, insbesondere zur Tumortherapie, in Kombination mit einer Chemotherapie, Strahlentherapie, Immuntherapie, einem operativen Eingriff oder einer Kombination von diesen, verabreicht werden. Eine Langzeittherapie ist gleichermaßen möglich, wie auch eine begleitende Therapie im Zusammenhang mit anderen Behandlungsstrategien, wie oben beschrieben wurde. Andere mögliche Behandlungen sind eine Therapie, um den Status des Patienten nach einer Tumorregression zu erhalten, oder sogar eine Chemopräventionstherapie, beispielsweise bei Patienten mit einem Risiko. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen mit der Formel (I) in Kombination mit einer Strahlentherapie.
Therapeutische Mittel für eine mögliche Kombination sind insbesondere eine oder mehrere zytostatische oder zytotoxische Verbindungen, beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel oder mehrere, die ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend Indarubicin, Cytarabin, Interferon, Hydroxyharnstoff, Bisulfan, oder ein Inhibitor der Polyaminbiosynthese, ein Inhibitor einer Proteinkinase, insbesondere einer Serin/Threonin-Proteinkinase wie z. B. Proteinkinase C oder einer Tyrosin-Proteinkinase wie z. B. epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor-Tyrosin-Kinase, ein Zytokin, ein negativer Wachstumsregulator wie z. B. TGF-β oder IFN-β, ein Aromataseinhibitor, ein klassisches Zytostatikum, ein Inhibitor der Wechselwirkung einer SH2-Domäne mit einem phosphorylierten Protein, ein Inhibitor von Bcl-2 und Modulatoren der Bcl-2-Familienmitglieder wie z. B. Bax, Bid, Bad, Bim, Nip3 und BH3-only Proteine.
Eine Verbindung gemäß der Erfindung dient nicht nur der (prophylaktischen und vorzugsweise therapeutischen) Behandlung von Menschen sondern ebenfalls der Behandlung von anderen warmblütigen Tieren, beispielsweise kommerziell nützlichen Tieren, beispielsweise Nagern wie z. B. Mäusen, Kaninchen oder Ratten, oder Meerschweinchen. Eine solche Verbindung kann ebenfalls als ein Referenzstandard in den oben beschriebenen Testsystemen verwendet werden, um einen Vergleich mit anderen Verbindungen zu ermöglichen.
Bei den Gruppen von bevorzugten Verbindungen mit der Formel (I), die nachstehend erwähnt werden, können vernünftigerweise Definitionen von Substituenten aus den vorstehend erwähnten allgemeinen Definitionen verwendet werden, z. B. um allgemeinere Definitionen durch spezifischere Definitionen oder insbesondere durch Definitionen, die als bevorzugt charakterisiert wurden, zu ersetzen.
Insbesondere betrifft die Erfindung Verbindungen mit der Formel (I), wobei
R¹ für Cyanoniederalkyl steht;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung Verbindungen mit der Formel (I), wobei
R Phenyl oder Pyridyl ist,
R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ für Wasserstoff stehen;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Am meisten bevorzugt betrifft die Erfindung die Verbindungen der Beispiele und pharmazeutisch verträgliche Salze, insbesondere die Verbindungen
4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin;
4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylaminoxim;
4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylaminoximmethylether;
4-(1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim;
4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether;
4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim;
4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether;
4-[1-(4-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
4-[1-(4-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim;
4-[1-(3-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
4-[1-(3-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim;
4-[1-(3-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether;
4-[1-(4-Phenylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
4-[1-(4-Phenylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim;
4-[1-(4-Phenylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether;
und 4-[1-(2,4-Dichlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen mit der Formel (I), wobei
R für Phenyl, Thienyl oder Pyridinyl steht,
wobei Phenyl gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl, Halogenniederalkyl, Hydroxyniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Acyloxyniederalkyl, Phenyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Hydroxyniederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Phenylniederalkoxy, Niederalkylcarbonyloxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Niederalkoxycarbonylamino, Niederalkylcarbonylamino, substituiertem Amino, wobei die zwei Substituenten am Stickstoff zusammen mit dem Stickstoff Heterocyclyl bilden, Niederalkylcarbonyl, Carboxy, Niederalkoxycarbonyl, Cyano, Halogen und Nitro; und wobei zwei benachbarte Substituenten Methylendioxy sind;
und wobei Pyridinyl gegebenenfalls substituiert ist mit Niederalkoxy, Amino oder Halogen;
X für eine Gruppe C=Y steht, wobei Y für Sauerstoff oder Stickstoff steht, das mit Hydroxy oder Niederalkoxy substituiert ist;
R¹ für Wasserstoff, Niederalkylcarbonyl, Hydroxyniederalkyl oder Cyanoniederalkyl steht;
R², R³ und R⁶ für Wasserstoff stehen;
R⁴ und R⁵, unabhängig voneinander, für Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy stehen; oder R⁴ und R⁵ zusammen für Methylendioxy stehen;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
In hohem Maße bevorzugt sind Verbindungen mit der Formel (I), wobei
R für Phenyl oder Pyridinyl steht,
wobei Phenyl gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl, Halogenniederalkyl, Hydroxyniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Acyloxyniederalkyl, Phenyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Hydroxyniederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Phenylniederalkoxy, Niederalkylcarbonyloxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Niederalkoxycarbonylamino, Niederalkylcarbonylamino, substituiertem Amino, wobei die zwei Substituenten am Stickstoff zusammen mit dem Stickstoff Heterocyclyl bilden, Niederalkylcarbonyl, Carboxy, Niederalkoxycarbonyl, Formyl, Cyano, Halogen und Nitro; und wobei zwei benachbarte Substituenten Methylendioxy sind;
und wobei Pyridinyl gegebenenfalls substituiert ist mit Niederalkoxy, Amino oder Halogen;
X für Sauerstoff steht;
R¹ für Wasserstoff, Niederalkylcarbonyl, Hydroxyniederalkyl oder Cyanoniederalkyl steht;
R², R³ und R⁶ für Wasserstoff stehen;
R⁴ und R⁵, unabhängig voneinander, für Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy stehen; oder R⁴ und R⁵ zusammen für Methylendioxy stehen;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Andere bevorzugte Verbindungen, die in Betracht kommen, sind Verbindungen mit der Formel (I), wobei
R für Phenyl oder Pyridinyl steht,
wobei Phenyl gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl, Halogenniederalkyl, Hydroxyniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Acyloxyniederalkyl, Phenyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Hydroxyniederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Phenylniederalkoxy, Niederalkylcarbonyloxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Niederalkoxycarbonylamino, Niederalkylcarbonylamino, substituiertem Amino, wobei die zwei Substituenten am Stickstoff zusammen mit dem Stickstoff Heterocyclyl bilden, Niederalkylcarbonyl, Carboxy, Niederalkoxycarbonyl, Formyl, Cyano, Halogen und Nitro; und wobei zwei benachbarte Substituenten Methylendioxy sind;
und wobei Pyridinyl gegebenenfalls substituiert ist mit Niederalkoxy, Amino oder Halogen;
X für Sauerstoff steht;
R¹ für Cyanoniederalkyl steht;
R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ für Wasserstoff stehen;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Am meisten bevorzugt sind Verbindungen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin;
4-[1-(3-Methoxy-4-methoxymethoxy-phenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin;
4-[1-(4-Aminophenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin;
4-[1-(4-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin;
4-[1-(3,4-Dimethylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin;
4-[1-(4-Ethylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin;
4-[1-(6-Chlor-3-pyridyl-carbonylmethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
4-[1-(6-Amino-3-pyridyl-carbonylmethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; und
4-[1-(6-Amino-3-pyridyl-carbonylmethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin;
und pharmazeutisch verträgliche Salze von diesen.
Insbesondere betrifft die Erfindung Verbindungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, zur Verwendung als Medikamente.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer Verbindung mit der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, einer Autoimmunerkrankung, einer mit einer Transplantation zusammenhängenden Symptomatik und/oder einer degenerativen Erkrankung, insbesondere zur Behandlung einer soliden neoplastischen Erkrankung.
Verfahren zur Herstellung
Eine Verbindung der Erfindung kann durch Verfahren hergestellt werden, die, obwohl sie bisher nicht für die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung angewandt wurden, an sich bekannt sind, insbesondere

A) ein Verfahren, wobei eine Verbindung mit der Formel (II)
wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ wie für Formel (I) definiert sind, oder ein Derivat von dieser mit funktionellen Gruppen in geschützter Form und/oder ein Salz von dieser mit einem Alkylierungsmittel mit der Formel (III) R-X-CH₂-Z (III)alkyliert wird, wobei R wie für Formel (I) definiert ist, X CO ist und Z eine nukleophile Abgangsgruppe ist; oder
B) ein Verfahren, wobei eine Verbindung mit der Formel (II), wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ wie für Formel (I) definiert sind, oder ein Derivat von dieser mit funktionellen Gruppen in geschützter Form und/oder ein Salz von dieser mit einer Mischung einer Verbindung vom Dihalogenmethantyp mit der Formel Z¹-CH₂-Z² (IV), wobei Z¹ und Z² Abgangsgruppen sind, und einer Verbindung mit der Formel R-XH (V), wobei R wie für Formel (I) definiert ist und X Sauerstoff ist, alkyliert wird; jegliche Schutzgruppen in einem geschützten Derivat einer Verbindung mit der Formel (I) entfernt werden; und, wenn so gewünscht, eine erhältliche Verbindung mit der Formel (I) in eine andere Verbindung mit der Formel (I) umgewandelt wird, eine freie Verbindung mit der Formel (I) in ein Salz umgewandelt wird, ein erhältliches Salz einer Verbindung mit der Formel (I) in die freie Verbindung oder ein anderes Salz umgewandelt wird und/oder eine Mischung von isomeren Verbindungen mit der Formel (I) in die einzelnen Isomere aufgetrennt wird.

Geeignete nukleophile Abgangsgruppen Z in einem Alkylierungsmittel mit der Formel (III) sind beispielsweise Halogenide, z. B. Chlorid, Bromid oder Iodid, oder Sulfonate, z. B. aromatische Sulfonsäureester wie z. B. Benzolsulfonate, p-Toluolsulfonate oder p-Nitrobenzolsulfonate, oder ebenfalls Methansulfonat oder Trifluormethansulfonat. Ebenso werden andere übliche Abgangsgruppen in Betracht gezogen, z. B. Ammoniumsalze, Azide, Diazoniumsalze, Di(p-toluolsulfonyl)amine, Nitrate, Oxoniumsalze, Sulfoniumsalze oder Phosphoniumsalze. Geeignete nukleophile Abgangsgruppen Z¹ und Z² in einer Verbindung vom Dihalogenmethantyp der Formel (IV) sind jene, die oben erwähnt wurden, insbesondere Chlor, Brom und Iod.
Die Alkylierung einer Verbindung mit der Formel (II) mit einem Alkylierungsmittel mit der Formel (III) wird in einer an sich bekannten Weise durchgeführt, gewöhnlich in der Gegenwart eines geeigneten polaren oder dipolaren aprotischen Lösungsmittels, unter Kühlen oder Erwärmen, beispielsweise in einem Temperaturbereich von ungefähr –30°C bis ungefähr +150°C, insbesondere ungefähr um 0°C bis Raumtemperatur. Gegebenenfalls wird eine geeignete Base, insbesondere eine tertiäre Aminbase wie z. B. Triethylamin oder Diisopropylethylamin oder ein anorganisches basisches Salz, z. B. Kalium- oder Natriumcarbonat, zugegeben.
Die gemischte Alkylierung einer Verbindung mit der Formel (II) und einer Verbindung mit der Formel (V) mit einer Verbindung vom Dihalogenmethantyp mit der Formel (IV) wird in der Gegenwart eines geeigneten polaren oder dipolaren aprotischen Lösungsmittels, unter Kühlen oder Erwärmen, beispielsweise in einem Temperaturbereich von ungefähr –30°C bis ungefähr +150°C, insbesondere ungefähr um 0°C bis Raumtemperatur, durchge führt. Geeignete Basen, die in dieser Reaktion verwendet werden, sind z. B. Kalium- und Natriumcarbonat.
Wenn eine oder mehrere andere funktionelle Gruppen, beispielsweise Carboxy, Hydroxy oder Amino, in einer Verbindung mit der Formel (II), (III) oder (V) geschützt sind oder werden müssen, da sie an der Reaktion nicht teilnehmen sollen, sind dieses solche Schutzgruppen, wie sie gewöhnlich bei der Synthese von Amiden, insbesondere Peptidverbindungen, Cephalosporinen, Penicillinen, Nukleinsäurederivaten und Zuckern, angewendet werden.
Die Schutzgruppen können bereits in Vorläufern vorliegen und sollten die betroffenen funktionellen Gruppen gegen unerwünschte Sekundärreaktionen wie z. B. Alkylierungen, Acylierungen, Veretherungen, Veresterungen, Oxidationen, Solvolyse und ähnliche Reaktionen schützen. Es ist ein Charakteristikum von Schutzgruppen, dass diese leicht, d. h. ohne unerwünschte Sekundärreaktionen, typischerweise durch Solvolyse, Reduktion, Photolyse oder ebenfalls durch Enzymaktivität, beispielsweise unter Bedingungen, die zu physiologischen Bedingungen analog sind, entfernt werden können und dass diese in den Endprodukten nicht vorliegen. Der Spezialist weiß oder kann leicht feststellen, welche Schutzgruppen für die vorstehend und nachfolgend erwähnten Reaktionen geeignet sind.
Der Schutz solcher funktioneller Gruppen durch solche Schutzgruppen, die Schutzgruppen selbst und ihre Entfernungsreaktionen werden beispielsweise in Standardtextbüchern für die Peptidsynthese und in speziellen Büchern über Schutzgruppen wie z. B. J. F. W. McOmie, „Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London und New York 1973, in „Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4. Ausgabe, Band 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, und in T. W. Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, beschrieben.
In den zusätzlichen Verfahrensschritten, die nach Wunsch durchgeführt werden, können funktionelle Gruppen der Ausgangsverbindungen, welche nicht an der Reaktion teilnehmen sollten, in ungeschützter Form vorliegen oder können beispielsweise durch eine oder mehrere der Schutzgruppen, die vorstehend unter „Schutzgruppen" erwähnt wurden, geschützt werden. Die Schutzgruppen werden dann ganz oder teilweise gemäß einem der hierin beschriebenen Verfahren entfernt.
Bei der Umwandlung einer erhältlichen Verbindung mit der Formel (I) in eine andere Verbindung mit der Formel (I) kann X in der Bedeutung von C=Y, wobei Y Sauerstoff ist, beispielsweise mit einem gegebenenfalls O-substituierten Hydroxylamin umgesetzt werden, um das entsprechende Oxim oder den Oximether mit der Formel (I) zu ergeben, wobei X C=Y ist und Y Stickstoff ist, welcher mit Hydroxy oder Alkoxy substituiert ist.
Eine erhältliche Verbindung mit der Formel (I), wobei R¹ und/oder R² Wasserstoff ist, kann mit einer Verbindung mit der Formel R¹-Z bzw. R²-Z, wobei Z eine nukleophile Abgangsgruppe wie oben beschrieben ist, alkyliert oder acyliert werden, um eine Verbindung mit der Formel (I) zu ergeben, wobei R¹ und/oder R² von Wasserstoff verschieden ist. Bevorzugte Acylierungsbedingungen beinhalten die Verwendung von Säureanhydriden und Säurechloriden bei erhöhten Temperaturen, typischerweise in einem Bereich von ungefähr +30°C bis ungefähr +150°C. Ein saurer oder basischer Katalysator kann nach Wunsch eingesetzt werden. Eine Verbindung mit der Formel (I), wobei R¹ und/oder R² Alkyl ist, kann durch Alkylierung der Elternverbindung mit der Formel (I) erhalten werden. Typische Reaktionsbedingungen, welche diese Transformation erlauben, beinhalten die Kombination einer starken Base wie z. B. eines Metallhydrids oder eines Metallalkoholats und einer Verbindung mit der Formel R¹-Z oder R²-Z.
Weitere Aminogruppen, die in einer Aryl- oder Heteroarylgruppe R oder in einem der Substituenten R³, R⁴, R⁵ oder R⁶ vorliegen, können in andere Stickstoff enthaltende Substituenten unter Bedingungen umgewandelt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispielsweise kann eine Alkylierung am Stickstoff mit einem Aldehyd unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt werden. Für eine Acylierung ist das entsprechende Acylchlorid (Z = Cl) bevorzugt. Alternativ kann ein Säureanhydrid verwendet werden, oder die Acylierung kann mit der freien Säure (Z = OH) unter Bedingungen erreicht werden, die zur Amidbildung verwendet werden, welche in der Peptidchemie an sich bekannt sind, z. B. mit Aktivierungsmitteln für die Carboxygruppe wie z. B. 1-Hydroxybenzotriazol, gegebenenfalls in der Gegenwart geeigneter Katalysatoren oder Koreagenzien.
Verbindungen mit der Formel (I), wobei X = NOH, können alkyliert werden, was einen Zugang zu den entsprechenden Oximethern erlaubt. Die Reaktionsbedingungen, welche zu dieser Umwandlung führen, beinhalten Kombinationen von schwachen Basen und Alkylierungsmitteln. Typische Basen beinhalten Metallcarbonate oder -bicarbonate.
Die Reduktion einer Nitrogruppe in einer nitrosubstituierten Aryl- oder Heteroarylgruppe R oder in einem der Substituenten R³, R⁴, R⁵ oder R⁶, um die entsprechende Aminogruppe zu ergeben, wird z. B. mit Eisenpulver in Alkohol oder mit anderen Reduktionsmitteln durchgeführt.
Eine Carboxygruppe in einer carboxysubstituierten Aryl- oder Heteroarylgruppe R oder in einem der Substituenten R³, R⁴, R⁵ oder R⁶ kann unter Bedingungen amidiert werden, die zur Amidbildung verwendet werden, welche in der Peptidchemie an sich bekannt sind, z. B. mit dem entsprechenden Amin und einem Aktivierungsmittel für die Carboxygruppe wie z. B. 1-Hydroxybenzotriazol, gegebenenfalls in der Gegenwart geeigneter Katalysatoren oder Koreagenzien.
Ein Brom- oder Iodsubstituent in einer Aryl- oder Heteroarylgruppe R oder in einem der Substituenten R³, R⁴, R⁵ oder R⁶ kann durch Reaktion mit einer geeigneten Phenylboronsäure in einer Suzuki-Reaktion, vorzugsweise in einem dipolaren aprotischen Lösungsmittel wie z. B. Dimethylformamid oder in einem polaren Ether, z. B. Tetrahydrofuran oder Dimethoxyethan, in der Gegenwart eines löslichen Palladium(0)- oder eines verwandten Metallkatalysators, z. B. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium, durch Phenyl oder ein Phenylderivat ersetzt werden.
Salze einer Verbindung mit der Formel (I) mit einer salzbildenden Gruppe können in einer an sich bekannten Weise hergestellt werden. Säureadditionssalze von Verbindungen mit der Formel (I) können so durch Behandlung mit einer Säure oder mit einem geeigneten Anionenaustauscherreagens erhalten werden.
Salze können gewöhnlich in freie Verbindungen umgewandelt werden, z. B. durch Behandlung mit geeigneten basischen Mitteln, beispielsweise mit Alkalimetallcarbonaten, Alkalimetallhydrogencarbonaten oder Alkalimetallhydroxiden, typischerweise Kaliumcarbonat oder Natriumhydroxid.
Es sollte betont werden, dass Reaktionen, die zu den in diesem Kapitel erwähnten Umwandlungen analog sind, ebenfalls auf dem Niveau geeigneter Intermediate stattfinden können.
Alle hier beschriebenen Verfahrensschritte können unter bekannten Rektionsbedingungen, vorzugsweise unter jenen, die spezifisch erwähnt wurden, in der Abwesenheit oder gewöhnlich in der Gegenwart von Lösungsmitteln oder Verdünnungsmitteln, vorzugsweise solchen, die gegenüber den verwendeten Reagenzien inert sind und in der Lage sind, diese zu lösen, in der Abwesenheit oder Gegenwart von Katalysatoren, Kondensationsmitteln oder Neutralisationsmitteln, beispielsweise Ionenaustauschern, typischerweise Kationenaustauschern, z. B. in der H⁺-Form, abhängig von der Typ der Reaktion und/oder den Reaktanden bei verringerter, normaler oder erhöhter Temperatur, z. B. in dem Bereich von –100°C bis ca. 190°C, vorzugsweise von ca. –80°C bis ca. 150°C, z. B. bei –80 bis +60°C, bei –20 bis +40°C, bei Raumtemperatur oder bei dem Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels, unter Atmosphärendruck oder in einem geschlossenen Gefäß, wo geeignet unter Druck, und/oder in einer inerten Atmosphäre, beispielsweise unter Argon oder Stickstoff, durchgeführt werden.
Salze können bei allen Ausgangsverbindungen und Übergangsverbindungen vorliegen, wenn diese salzbildende Gruppen enthalten. Salze können ebenfalls während der Reaktion solcher Verbindungen vorliegen, vorausgesetzt, dass die Reaktion nicht dadurch gestört wird.
In allen Reaktionsstadien können isomere Mischungen, die auftreten, in ihre einzelnen Isomere, z. B. Diastereomere oder Enantiomere, oder in irgendwelche Mischungen von Isomeren, z. B. Racemate oder diastereomere Mischungen, getrennt werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls jene Formen des Verfahrens, in welchen man von einer Verbindung ausgeht, die in irgendeinem Stadium als eine Übergangsverbindung erhältlich ist, und die fehlenden Schritte durchführt, oder man das Verfahren in irgendeinem Stadium abbricht, oder man ein Ausgangsmaterial unter den Reaktionsbedingungen bildet, oder man das Ausgangsmaterial in der Form eines reaktiven Derivats oder Salzes verwendet, oder man eine Verbindung erzeugt, die mittels des Verfahrens gemäß der Erfindung erhältlich ist, und man diese Verbindung in situ weiter verarbeitet. In der bevorzugten Ausführungsform beginnt man mit jenen Ausgangsmaterialien, welche zu den hierin als bevorzugt, insbesondere als besonders bevorzugt, in erster Linie bevorzugt und/oder vor Allem bevorzugt beschriebenen Verbindungen führen.
In der bevorzugten Ausführungsform wird eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß oder in Analogie zu den Verfahren und Verfahrensschritten, die in den Beispielen definiert sind, hergestellt.
Die Verbindungen mit der Formel (I), einschließlich ihrer Salze, sind ebenfalls in der Form von Hydraten erhältlich, oder ihre Kristalle können beispielsweise das Lösungsmittel einschließen, das zur Kristallisation verwendet wird, d. h. als Solvate vorliegen.
Neue Ausgangsmaterialien und/oder Intermediate, wie auch Verfahren zur Herstellung von diesen, werden gleichfalls beschrieben. In der bevorzugten Ausführungsform werden solche Ausgangsmaterialien verwendet und die Reaktionsbedingungen so ausgewählt, dass es ermöglicht wird, dass die bevorzugten Verbindungen erhalten werden.
Die Ausgangsmaterialien mit der Formel (II), (III), (IV) und (V) sind bekannt, im Handel erhältlich oder können in Analogie zu oder gemäß Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, synthetisiert werden.
Pharmazeutische Präparate, Verfahren und Verwendungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, welche eine Verbindung mit der Formel (I) als aktiven Bestandteil umfassen und welche insbesondere bei der Behandlung der Erkrankungen, die am Anfang erwähnt wurden, verwendet werden können. Zusammensetzungen zur enteralen Verabreichung wie z. B. nasalen, bukkalen, rektalen oder insbesondere oralen Verabreichung und zur parenteralen Verabreichung wie z. B. intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Verabreichung an warm blütige Tiere, insbesondere Menschen, sind besonders bevorzugt. Die Zusammensetzungen umfassen den aktiven Bestandteil allein oder, vorzugsweise, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Dosierung des aktiven Bestandteils hängt von der zu behandelnden Erkrankung und von der Spezies, ihrem Alter, Gewicht und individuellen Zustand, den individuellen pharmakokinetischen Daten und dem Verabreichungsmodus ab.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, welche eine Verbindung mit der Formel (I), ein Tautomer oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder ein Hydrat oder Solvat davon und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung in einem Verfahren zur prophylaktischen oder insbesondere therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere in einem Verfahren zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, Autoimmunerkrankung, mit einer Transplantation zusammenhängenden Symptomatik und/oder degenerativen Erkrankung, insbesondere denen, die vorstehend erwähnt wurden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren und die Verwendung von Verbindungen mit der Formel (I) derselben zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, welche Verbindungen mit der Formel (I) als aktive Komponente (aktiven Bestandteil) umfassen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur prophylaktischen oder insbesondere therapeutischen Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, Autoimmunerkrankung, mit einer Transplantation zusammenhängenden Symptomatik und/oder degenerativen Erkrankung eines warmblütigen Tieres, insbesondere eines Menschen oder eines kommerziell nützlichen Säugetiers, das eine solche Behandlung benötigt, die eine neue Verbindung mit der Formel (I) als aktiven Bestandteil in einer Menge, die prophylaktisch oder insbesondere therapeutisch aktiv gegenüber den Erkrankungen ist, umfasst, ist gleichermaßen bevorzugt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen von ungefähr 1% bis ungefähr 95% aktiven Bestandteil, Einzeldosis-Verabreichungsformen umfassen in der bevorzugten Aus führungsform von ungefähr 20% bis ungefähr 90% aktiven Bestandteil und Formen, die nicht zum Einzeldosistyp gehören, umfassen in der bevorzugten Ausführungsform von ungefähr 5% bis ungefähr 20% aktiven Bestanteil. Einheitsdosisformen sind z. B. beschichtete und unbeschichtete Tabletten, Ampullen, Vials, Suppositorien oder Kapseln. Weitere Arzneiformen sind z. B. Salben, Cremes, Pasten, Schäume, Tinkturen, Lippenstifte, Tropfen, Sprays, Dispersionen usw. Beispiele sind Kapseln, die von ca. 0,05 g bis zu ca. 1,0 g aktiven Bestandteil enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in einer an sich bekannten Weise hergestellt, beispielsweise mittels herkömmlicher Mischungs-, Granulier-, Beschichtungs-, Lösungs- oder Lyophilisierungsprozesse.
Bevorzugt ist die Verwendung von Lösungen des aktiven Bestandteils und ebenfalls von Suspensionen oder Dispersionen, insbesondere von isotonischen wässrigen Lösungen, Dispersionen oder Suspensionen, welche beispielsweise in dem Fall von lyophilisierten Zusammensetzungen, welche den aktiven Bestandteil allein oder zusammen mit einem Träger, beispielsweise Mannitol, umfassen, vor der Verwendung gebildet werden können. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können sterilisiert werden und/oder können Arzneimittelträger, z. B. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel und/oder Emulgatoren, Solubilisatoren, Salze zur Regulation des osmotischen Drucks und/oder Puffer umfassen und werden in einer an sich bekannten Weise hergestellt, beispielsweise mittels konventioneller Lösungs- und Lyophiliserungsprozesse. Die genannten Lösungen oder Suspensionen können viskositätssteigernde Mittel, typischerweise Natriumcarboxymethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylpyrrolidon oder Gelatinen, oder ebenfalls Solubilisatoren, z. B. Tween 80^® (Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat), umfassen.
Suspensionen in Öl umfassen als die Ölkomponente die pflanzlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Öle, die zu Injektionszwecken üblich sind. Diese betreffend können speziell flüssige Fettsäureester erwähnt werden, die als die Säurekomponente eine langkettige Fettsäure mit von 8 bis 22, insbesondere von 12 bis 22 Kohlenstoffatomen, enthalten. Die Alkoholkomponente dieser Fettsäureester weist ein Maximum von 6 Kohlenstoffatomen auf und ist ein einwertiger oder mehrwertiger, beispielsweise ein ein-, zwei- oder dreiwer tiger Alkohol, insbesondere Glycol und Glycerol. Als Mischungen von Fettsäureestern sind pflanzliche Öle wie z. B. Baumwollsamenöl, Mandelöl, Olivenöl, Kastoröl, Sesamöl, Sojabohnenöl und Erdnussöl besonders nützlich.
Die Herstellung von injizierbaren Präparaten wird gewöhnlich unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wie auch das Einfüllen, beispielsweise in Ampullen oder Vials, und das Abdichten der Behälter.
Geeignete Träger sind insbesondere Füllstoffe wie z. B. Zucker, z. B. Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol, Cellulosepräparationen und/oder Calciumphosphate, z. B. Tricalciumphosphat oder Calciumhydrogenphosphat, und ebenfalls Bindemittel wie z. B. Stärken, z. B. Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelstärke, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, und/oder Polyvinylpyrrolidon, und/oder, wenn gewünscht, Desintegratoren wie z. B. die oben erwähnten Stärken, ebenfalls Carboxymethylstärke, vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Alginsäure oder ein Salz von dieser wie z. B. Natriumalginat. Zusätzliche Arzneimittelträger sind insbesondere Fliessverbesserer und Gleitmittel, z. B. Kieselsäure, Talkum, Stearinsäure oder Salze von dieser wie z. B. Magnesium- oder Calciumstearat, und/oder Polyethylenglycol oder Derivate davon.
Tablettenkerne können durch die Verwendung von unter anderem konzentrierten Zuckerlösungen, welche Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid umfassen können, oder Beschichtungslösungen in geeigneten organischen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelmischungen oder, zur Herstellung von enterischen Beschichtungen, Lösungen von geeigneten Cellulosepräparationen wie z. B. Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, mit geeigneten, wahlweise enterischen Beschichtungen versehen werden. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Tablettenbeschichtungen zugegeben werden, beispielsweise zu Identifizierungszwecken oder um unterschiedliche Dosen des aktiven Bestandteils anzuzeigen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung schließen ebenfalls harte Kapseln ein, die aus Gelatine bestehen, und ebenso weiche, abgedichtete Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher wie z. B. Glycerol oder Sorbitol bestehen. Die harten Kapseln können den aktiven Bestandteil in der Form von Granalien, z. B. in Beimischung mit Füllstoffen wie z. B. Maisstärke, Bindemitteln und/oder Gleitmitteln wie z. B. Talkum oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln ist der aktive Bestandteil vorzugsweise in geeigneten flüssigen Arzneimittelträgern wie z. B. Fettölen, Paraffinöl oder flüssigen Polyethylenglycolen oder Fettsäureestern von Ethylen- oder Propylenglycol gelöst oder suspendiert, zu welchen Stabilisatoren und Detergenzien, z. B. von Typ Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester, ebenfalls zugegeben werden können.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur rektalen Verabreichung geeignet sind, sind z. B. Suppositorien, die aus einer Kombination des aktiven Bestandteils und eines Grundstoffs für Suppositorien bestehen. Geeignete Grundstoffe für Suppositorien sind z. B. natürliche oder synthetische Triglyceride, Paraffinkohlenwasserstoffe, Polyethylenglycole oder höhere Alkanole.
Zur parenteralen Verabreichung sind wässrige Lösungen eines aktiven Bestandteils in wasserlöslicher Form, z. B. eines wasserlöslichen Salzes, oder wässrige Injektionssuspensionen, die viskositätssteigernde Substanzen, z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol und/oder Dextran, und, wenn gewünscht, Stabilisatoren enthalten, besonders geeignet. Der aktive Bestandteil, gegebenenfalls zusammen mit Arzneimittelträgern, kann ebenfalls in der Form eines Lyophilisats vorliegen und kann vor der parenteralen Verabreichung durch die Zugabe geeigneter Lösungsmittel zu einer Lösung gemacht werden.
Lösungen wie sie z. B. zur parenteralen Verabreichung verwendet werden, können ebenfalls als Infusionslösungen eingesetzt werden.
Bevorzugte Konservierungsstoffe sind z. B. Antioxidantien wie z. B. Ascorbinsäure oder mikrobizide Mittel wie z. B. Sorbinsäure oder Benzoesäure.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, Autoimmunerkrankung, mit einer Transplantation zusammenhängenden Symptomatik und/oder degenerativen Erkrankung, welches das Verabreichen einer Verbindung mit der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes von dieser, wobei die Reste und Symbole die Bedeutungen haben, wie sie oben für die Formel (I) definiert sind, in einer Menge, die gegenüber der Erkrankung wirksam ist, an ein warmblütiges Tier, das eine solche Behandlung benötigt, umfasst. Die Verbindungen mit der Formel (I) können als solche oder speziell in der Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen, prophylaktisch oder therapeutisch, vorzugsweise in einer Menge, die gegenüber der Erkrankung wirksam ist, an ein warmblütiges Tier, beispielsweise einen Menschen, welches eine solche Behandlung benötigt, verabreicht werden. In dem Fall eines Individuums mit einem Körpergewicht von ca. 70 kg beträgt die verabreichte tägliche Dosis von ungefähr 0,05 g bis ungefähr 5 g, vorzugsweise von ungefähr 0,25 g bis ungefähr 1,5 g, einer Verbindung der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ebenfalls die Verwendung einer Verbindung mit der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes von dieser, insbesondere einer Verbindung mit der Formel (I), von welcher gesagt wird, dass diese bevorzugt ist, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes von dieser als solcher oder in der Form einer pharmazeutischen Formulierung mit wenigstens einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur therapeutischen und ebenfalls prophylaktischen Behandlung von einer oder mehreren der Erkrankungen, die vorstehend erwähnt wurden, insbesondere einer neoplastischen Erkrankung, Autoimmunerkrankung, mit einer Transplantation zusammenhängenden Symptomatik und/oder degenerativen Erkrankung.
Die bevorzugte Dosismenge, Zusammensetzung und Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen (Medikamenten), welche in jedem Fall verwendet werden sollen, sind oben beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne die Erfindung in ihrem Umfang zu beschränken.
Beispiele

Abkürzungen: DMSO = Dimethylsulfoxid; THF = Tetrahydrofuran; DMAP = N,N-Dimethylaminopyridin, DMF = N,N-Dimethylformamid, DIPEA = N,N-Diisopropyl-N-ethylamin.

Beispiel 1: 4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin
Phenacylbromid (0,1 g, 0,49 mmol) wird zu einer effizient gerührten Suspension von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin (0,1 g, 0,4 mmol) [A. V. Sergievskii, O. A. Krasnoshek, S. F. Mel'nikova, I. V. Tselinskii, Russian Journal of Organic Chemistry, 2002, 38, 915–917] und Kaliumcarbonat (0,172 g, 1,24 mmol) in trockenem DMF (5 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 4 Stunden wird die Reaktionsmischung mit Ethylacetat verdünnt, und die organische Phase wird wiederholt mit Salzlösung gewaschen. Trocknen des Lösungsmittels, Filtrieren und Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergibt die Titelverbindung in roher Form. Die Titelverbindung wird in reiner Form durch Chromatographie über Kieselgel erhalten, Smp. 202–204°C.
Beispiel 2: 4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin-oxim
Eine Mischung von 4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin (0,083 g, 0,21 mmol, hergestellt gemäß Beispiel 1), Natriumbicarbonat (0,021 g, 0,25 mmol) und Hydroxylaminhydrochlorid (0,014 g, 0,21 mmol) in Ethanol (5 ml) wird für 20 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Verteilung der Reaktionsmischung zwischen Ethylacetat und Wasser, die Abtrennung der organischen Phase gefolgt von Trocknung und Verdampfung des Lösungsmittels ergibt das rohe Produkt. Eine Reinigung durch Chromatographie auf Kieselgel ergibt die Titelverbindung als eine E/Z-Mischung, Smp. 198–201°C.
Referenzbeispiel 3: Methyl-{4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl}-amin
Eine Suspension von 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin (0,10 g, 0,282 mmol, hergestellt gemäß Beispiel 1), Kaliumcarbonat (0,233 g, 1,69 mmol) und Dimethylsulfat (0,142 g, 1,12 mmol) in Aceton (5 ml) wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Filtration der Feststoffe, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff, Smp. 210–214°C.
Referenzbeispiel 4: Dimethyl-{4-[1-(4-chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl}-amin
Eine Suspension von 4-[1-4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin (0,10 g, 0,282 mmol), Kaliumcarbonat (0,60 g, 4,22 mmol) und Dimethylsulfat (0,50 g, 2,82 mmol) in DMF (5 ml) wird bei 60°C für 6 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen gelblichen Feststoff, Smp. 120–123°C.
Beispiel 5: N-{4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl}-acetamid
Eine Lösung von 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin (0,05 g, 0,143 mmol), Pyridin (0,022 g, 0,282 mmol), Acetylchlorid (0,013 g, 0,169 mmol) und einer katalytischen Menge von DMAP in DMF (5 ml) wird bei 80°C für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen gelblichen Feststoff, Smp. 202–205°C.
Beispiel 6: 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin
Eine Suspension von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin (0,10 g, 0,39 mmol), Kaliumcarbonat (0,08 g, 0,58 mmol) und 4-Chlorphenacylbromid (0,11 g, 0,47 mmol) in DMF (5 ml) wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen gelblichen Feststoff, Smp. 191–192°C.
Beispiel 6a: 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin
Zu einer Lösung von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin (0,10 g, 0,497 mmol) in Pyridin (5 ml) werden Natrium in Methanol (0,02 g, 0,86 mmol in 1 ml) und Acrylnitril (0,03 g, 0,39 mmol) nacheinander bei 0°C zugegeben. Die Mischung wird über Nacht gerührt. Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Verteilung des resultierenden Rückstands zwischen Wasser und Ethylacetat gefolgt von Trocknen der organischen Lösung über Natriumsulfat ergibt die Titelverbindung in reiner Form. ¹H-NMR (400 MHz, d⁶-DMSO): 13,7 (s, 1H); 7,82 (d, 1H); 7,60 (d, 1H); 7,36 (m, 2H); 7,20 (t, 1H); 3,67 (q, 2H); 2,94 (t, 2H).
Beispiel 7: 4-(1-Phenoxymethyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin
Zu einer Lösung von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin (0,10 g, 0,497 mmol) werden Kaliumcarbonat (0,172 g, 1,24 mmol) und Iodmethoxybenzol (0,128 g, 0,546 mmol) zugegeben. Die Mischung wird über Nacht gerührt. Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Verteilung des resultierenden Rückstands zwischen Wasser und Ethylacetat gefolgt von Trocknen der organischen Lösung über Natriumsulfat und Chromatographie des Rückstands ergibt die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff, Smp. 171–173°C.
Beispiel 8: 4-[1-(4-Fluorphenoxymethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin
Zu einer Lösung von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin (0,10 g, 0,497 mmol) wird Kaliumcarbonat (0,172 g, 1,24 mmol) gefolgt von 4-Fluorphenol (0,0557 g, 0,497 mmol) und Diiodmethan (0,133 g, 0,497 mmol) zugegeben. Die Mischung wird über Nacht gerührt. Verdampfung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Verteilung des resultierenden Rückstands zwischen Wasser und Ethylacetat gefolgt von Trocknen der organischen Lösung über Natriumsulfat und Chromatographie des Rückstands ergibt die Titelverbindung als einen farblosen Feststoff, Smp. 155–158°C.
Referenzbeispiel 9: 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-methoxycarbonylethyl)-amin
Eine Suspension von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(2-methoxycarbonylethyl)-amin (0,052 g, 0,181 mmol), Kaliumcarbonat (0,062 g, 0,452 mmol) und 4-Chlorphenacylbromid (0,047 g, 0,199 mmol) in DMF (5 ml) wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als hygroskopischen Feststoff mit undefiniertem Schmelzpunkt. ¹H-NMR (400 MHz, d⁶-DMSO): 8,14 (d, 2H); 7,87 (m, 2H); 7,41 (m, 2H); 7,32 (d, 2H); 7,29 (t, 1H); 6,37 (s, 2H); 3,63 (m, 2H); 3,61 (s, 3H); 2,76 (t, 2H).
Beispiel 9a: 4-[1-(1H-Benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-methoxycarbonylethyl)-amin
Eine Lösung von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin (0,05 g, Beispiel 6a) in Methanol, welcher mit Salzsäure (5 ml) gesättigt ist, wird unter Rückfluss für 40 Minuten erhitzt. Nach Zugabe eines Tropfens Wasser wird das Erhitzen unter Rückfluss für 2 Stunden fortgesetzt. Die Mischung wird neutralisiert, indem Natriumbicarbonat verwendet wird, und dann wiederholt extrahiert, indem Ethylacetat verwendet wird. Die vereinigten organischen Extrakte werden getrocknet und bis zur Trockenheit unter vermindertem Druck verdampft. Verreiben mit Hexan und Filtrieren ergibt die Titelverbindung in reiner Form. ¹H-NMR (400 MHz, d⁶-DMSO): 13,8 (s, 1H); 7,80 (m, 1H); 7,59 (m, 1H); 7,32 (m, 2H); 7,03 (m, 1H); 3,63 (m, 2H); 3,61 (s, 3H); 2,76 (t, 2H).
Beispiel 10: 4-[1-(3,4-Dimethylphenoxymethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin
Eine Suspension von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin (0,15 g, 0,59 mmol, Beispiel 6a), Kaliumcarbonat (0,325 g, 2,36 mmol), Diiodmethan (0,16 g, 0,59 mmol) und 3,4-Dimethylphenol (0,072 g, 0,59 mmol) in DMF (5 ml) wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen gelblichen Feststoff, Smp. 132–135°C.
Beispiel 11: 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(3-hydroxypropyl)-amin
Eine Suspension von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(3-hydroxypropyl)-amin (0,70 g, 0,27 mmol), Kaliumcarbonat (0,472 g, 3,42 mmol) und 4-Chlorphenacylbromid (0,069 g, 0,29 mmol) in DMF (5 ml) wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen gelblichen Feststoff, Smp. 166–169°C.
Beispiel 11a: 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(3-hydroxypropyl)-amin
Eine Lösung von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin (0,272 g, 0,947 mmol, Beispiel 6a) in THF (5 ml) wird tropfenweise bei 0°C zu einer effizient gerührten Suspension von LiAlH₄ (0,054 g, 1,42 mmol) in THF (5 ml) zugegeben. Nach Rühren für 16 Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung durch die sorgfältige Zugabe einer wässrigen gesättigten Lösung von Natriumsulfat gequencht. Die Suspension wird filtriert und das Filtrat bis zur Trockenheit verdampft. Kristallisation durch Zugabe von Hexan ergibt die Titelverbindung in reiner Form. ¹H-NMR (400 MHz, d⁶-DMSO): 13,6 (s, 1H); 7,66 (m, 2H); 7,31 (m, 2H); 6,92 (t, 1H); 4,61 (m, 1H); 3,51 (m, 2H); 3,39 (m, 2H); 1,81 (m, 2H).
Referenzbeispiel 12: E-1-[2-(4-Aminofurazan-3-yl)-benzimidazol-1-yl]-4-phenyl-but-3-en-2-on
Eine Suspension von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin (0,275 g, 1,37 mmol), Kaliumcarbonat (0,472 g, 3,42 mmol) und 1-Chlor-4-phenyl-but-3-en-2-on (0,297 g, 1,64 mmol) in DMF (5 ml) wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen gelblichen Feststoff, Smp. 176–180°C.
Beispiel 12a: 1-Chlor-4-phenyl-but-3-en-2-on
Eine Mischung of 1-Chlor-3-(triphenylphosphanyliden)-propan-2-on (2,8 g, 7,9 mmol) und frisch destilliertem Benzaldehyd (0,7 g, 6,6 mmol) in Toluol (10 ml) wird für 20 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Verdampfung bis zur Trockenheit ergibt eine Mischung, welche die Titelverbindung enthält, die in dem nachfolgenden Schritt ohne Reinigung verwendet wird.
Beispiel 12b: 1-Chlor-3-(triphenylphosphanyliden)-propan-2-on
Eine Mischung von Triphenylphosphin (10,0 g, 38,1 mmol) und 1,3-Dichloraceton (4,84 g, 38,1 mmol) in THF (20 ml) wird für 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Beim Abkühlen wird der resultierende Niederschlag filtriert, mit THF gewaschen und getrocknet. Zu dem effizient gerührten Niederschlag in Methanol (20 ml) wird eine 20% wässrige Lösung von Natriumcarbonat (2,02 g, 19 mmol), gefolgt von zusätzlichem Wasser, zugegeben. Das resultierende Produkt wird filtriert und getrocknet, um das reine Produkt zu ergeben. ¹H-NMR (400 MHz, d⁶-DMSO): 7,61 (m, 15H); 4,07 (2s, 0,5H jedes); 3,98 (s, 2H).
Referenzbeispiel 13: 4-[1-(4-Aminophenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-carboxyethyl)-amin
Eine Lösung von 4-[1-(4-Acetaminophenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin (0,061 g) in wässriger Salzsäure (5 ml, HCl konz.) wird für zwei Stun den unter Rückfluss erhitzt. Die Mischung wird mit Wasser verdünnt und durch Zugabe von Natriumbicarbonat neutralisiert. Extraktion mit Ethylacetat, Trocknen über Natriumsulfat, Filtrieren und Verdampfung des resultierenden Filtrats bis zur Trockenheit ergibt die Titelverbindung in reiner Form, Smp. 174–177°C. ¹H-NMR (400 MHz, d⁶-DMSO): 12,40 (s, 1H); 7,84 (m, 4H); 7,38 (m, 3H); 6,65 (m, 2H); 6,28 (S, 2H); 6,17 (s, 2H); 3,57 (m, 2H); 2,66 (t, 2H).
Beispiel 14: 4-[1-(3-Amino-4-chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin
Zu einer gerührten Lösung von 4-[1-(4-Chlor-3-nitrophenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin (0,07 g, 0,175 mmol) in Ethanol (6 ml) und Wasser (1 ml) werden zwei Tropfen von konzentrierter Salzsäure und Eisenpulver (0,1 g, 17,5 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 80°C für 8 Stunden erwärmt. Filtration und Verdampfung bei vermindertem Druck ergibt das rohe Produkt. Reinigung durch Extraktion mit Ethylacetat und Chromatographie auf Kieselgel ergibt die Titelverbindung als farblosen Feststoff, Smp. 228–230°C.
Beispiel 14a: 4-[1-(4-Chlor-3-nitrophenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin
Eine Suspension von 4-(1H-Benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin (0,228 g, 1,14 mmol), Kaliumcarbonat (0,40 g, 2,85 mmol) und 4-Chlor-3-nitrophenacylbromid (0,35 g, 1,25 mmol) in DMF (5 ml) wird bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats, Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck und Chromatographie des Rückstands auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan-Ethylacetat als Elutionsmittel ergibt die Titelverbindung als einen Feststoff, Smp. 198–200°C. (Diese Verbindung ist ebenfalls als Beispiel 66 in Table 1 aufgelistet.)
Beispiel 15: 4-[1-(3-Methoxy-4-methoxymethoxy-phenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin
Eine Mischung von 4-[1-(3-Methoxy-4-hydroxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin (0,10 g, 0,27 mmol), DIPEA und Methoxymethylchlorid in trockenem DMF wird bei Raumtemperatur für 14 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration des Natriumsulfats und Konzentrierung des Filtrats unter vermindertem Druck ergibt die Titelverbindung als farblosen, reinen Feststoff, Smp. 190°C.
Beispiel 15a: 4-[1-(3-Methoxy-4-hydroxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin
Zu einer Lösung von 4-[1-(3-Methoxy-4-benzyloxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin (1,00 g) in THF (20 ml) wird Palladium auf Kohlenstoff (10%, 0,2 g) zugegeben. Die Mischung wird unter einer Wasserstoffatmosphäre für 1 Stunde gerührt. Der Katalysator wird filtriert und das Filtrat bis zur Trockenheit verdampft, um die Titelverbindung in reiner Form zu ergeben, Smp. 265°C. (Diese Verbindung ist ebenfalls als Beispiel 74 in Table 1 aufgelistet.)
Die folgenden Verbindungen werden in Analogie zu den Beispielen 1–15 hergestellt: Tabelle 1:

*Referenzbeispiel

*Referenzbeispiel

*Referenzbeispiel

Die folgenden Verbindungen aus der WO 03/066629 werden zum Vergleich ihrer Aktivität in Analogie zu den vorstehend beschriebenen Beispielen hergestellt: Tabelle 5:
Allgemeine Methoden zum Testen von Verbindungen der Erfindung:
Beispiel 121: Zellkulturen und Zelllinien
Zelllinien werden in Gewebekulturmedium RPMI-1640 kultiviert, das entweder 5% oder 10% fötales Kalbsserum, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin und Penicillin/-Streptomycin, 50 μg/ml, enthält (Vollmedium) (Sigma, Buchs, Schweiz). Die allgemeinen Wachstumsbedingungen sind 37°C und 7,5% CO₂.
Die folgenden Mauszelllinien (entweder EGFP-transfiziert oder nicht) werden verwendet: A20.2J (ATCC: TIB-208), MC57G (ATCC: CRL-2295).
Die folgenden Humanzelllinien (entweder EGFP-transfiziert oder nicht) werden verwendet: HeLa (ATCC: CCL-2), KB (ATCC: CCL-17), MCF7 (ATCC: HTB-22), SK-BR-3 (ATCC: HTB-30), SK-Mel 1 (ATCC: HTB-67), SK-Mel 28 (ATCC: HTB-72), PC-3 (ATCC: CRL-1435), SW 480 (ATCC: CCL-228), NCI-H460 (ATCC: HTB-177), NCI-H1792 (ATCC: CRL-5895), HT1080 (ATCC: CCL-21), Jurkat (ATCC: TIB-152), Ramos (ATCC: CRL-1596), Raji (ATCC: CCL-86), H9 (ATCC: HTB-176), Hut78 (ATCC: TIB-161), K562 (ATCC: CCL 243), HL-60 (ATCC: CCL 240), U-87MG (ATCC: HTB-14), HepG2 (ATCC: HB-8065), U-2 OS (ATCC: HTB-96), Saos-2 (ATCC: HTB-85), U937 (ATCC: CRL 1593), Hs 578T (ATCC: HTB 126), HBL-100 (ATCC: HTB 124), Molt-4 (ATCC: CRL 1582).
Beispiel 122: Erster Screeningaufbau
All die Manipulationen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Tests werden in kommerziell erhältlichen klaren Mikrotiterplatten mit flachem Boden und 96 bzw. 384 Vertiefungen (Greiner, Deutschland) durchgeführt, welche für Gewebekulturtechniken geeignet sind. Eine definierte Anzahl von EGFP-transfizierten adhärenten Testzellen (Platten mit 96 Vertiefungen: 10⁴–10⁵, Platten mit 384 Vertiefungen: 1500 – 2·10⁴) werden 24 Stunden vor der Behandlung in entweder 75 μl (Platten mit 96 Vertiefungen) oder 60 μl (Platten mit 384 Vertiefungen) Vollmedium pro Vertiefung ausplattiert, um eine angemessene Ausbreitung der Zellen sicher zu stellen. Zu diesem Zweck wird eine Peristaltikpumpe (z. B. Multidrop von Thermo-Labsystems, Finnland) oder eine andere geeignete Vorrichtung verwendet. Zellen in Suspension werden gemäß derselben Prozedur aber 1 h vor der Behandlung ausplattiert. Zwischen dem Aussäen und der Behandlung oder der Zugabe von Verbindungen werden die Zellen bei 37°C unter 7,5% CO₂ inkubiert. Anschließend werden die Verbindungen, die untersucht werden, bei definierten Konzentrationen (40–80 μM in entweder 25 μl (Platten mit 96 Vertiefungen) oder 20 μl (Platten mit 384 Vertiefungen) Vollmedium, das max. 4% DMSO enthält) mit einer geeigneten Vorrichtung (z. B. ein Flüssigkeitsbehandlungssystem, eine Mehrkanalpipette usw.) zugegeben, was zu einer Endkonzentration in der Testvertiefung von 10–20 μM Verbindung in max. 1% DMSO führt.
Unmittelbar nach der Zugabe der Verbindungen zu den Zellen wird der Nullfluoreszenzwert (t = 0 h) bestimmt, indem ein Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät verwendet wird, um in der Lage zu sein, die Fluoreszenzaktivitäten zu normieren. Danach werden die Testplatten weiter für insgesamt 48 h bei 37°C unter 7,5% CO₂ inkubiert und werden nur zu dem Zweck der Messung nach 8 h, 24 h bzw. 48 h kurz entfernt.
Beispiel 123: Messung und Quantifizierung des ersten Screenings
Relative Fluoreszenzaktivitäten von EGFP in mit einer Verbindung behandelten Testzellen in Bezug auf Kontrollzellen und Zellen, die mit Standardarzneimitteln behandelt wurden, werden gemessen, indem ein BMG Fluostar Mikroplatten-Fluoreszenzlesegerät verwendet wird, das mit einem Filterpaar für Anregung/Emission bei 485 nm/520 nm ausgerüstet ist. Das optimale Signal-zu-Rauschen-Verhältnis wird festgestellt, indem der zeitaufgelöste Messmodus mit einer Verzögerung von 20 μs und einer Integrationszeit über 1 ms verwendet wird. Die Zunahme (gain) wird in einer solchen Weise eingestellt, dass die Kontrollzellen eine Fluoreszenzaktivität von 90% des Maximums erzeugen. Kinetiken werden durchgeführt, indem die relativen Fluoreszenzaktivitäten bei t = 0 h, 8 h, 24 h und 48 h gemessen werden. Rohe Fluoreszenzaktivitäten werden individuell für die verschiedenen Zellzahlen und verschiedene optische Aktivitäten der Testverbindungen/Platte-Vertiefungen normiert, indem jeder Wert von t = 8 h, 24 h und 48 h durch den Wert von t = 0 h geteilt wird, was zu E(8)-, E(24)- und E(48)-Werten führt. Anschließend werden die E(x)-Werte weiter verarbeitet, indem der Umkehrwert (Q-Wert) der Produkte E(8)·E(24)·E(48) gebildet wird, was zu Zahlen > 1 für apoptotische/nekrotische Aktivitäten der Verbindungen und Zahlen < 1 für proliferative Aktivitäten der Verbindungen führt. Kontrollen (unbehandelt) zeigen Werte ähnlich zu 1. Verbindungen, die Q-Werte > 2 erzeugen, werden im Hinblick auf apoptotische/nekrotische Aktivität als relevant betrachtet und werden anschließend in dem zweiten Screeningaufbau getestet.
Beispiel 124: Zweiter Screeningaufbau
All die Manipulationen werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Tests werden im Fall von adhärenten Zellen in kommerziell erhältlichen Gewebekulturplatten mit flachem Boden und 24 Vertiefungen (Greiner, Deutschland) bzw. im Fall von Suspensionszellen in Polypropylenröhrchen (P-Röhrchen) 1,4 ml (Matrix, UK) durchgeführt.
Adhärente Testzellen: 2·10⁴–4·10⁴ EGFP-transfizierte Zellen in 0,5 ml Vollmedium werden 24 h vor der Behandlung ausplattiert. Bei t = 0 wird das Medium entfernt, und 450 μl neues Vollmedium werden zugegeben. Anschließend werden 50 μl Vollmedium, das die Testverbindung in max. 5% DMSO enthält, zugegeben, was zu Endkonzentrationen von 20 μM, 10 μM, 3 μM, 1 μM bzw. 0,3 μM der Testverbindungen führt. Nach 48 h Inkubation werden die Zellen geerntet und mit einer Fluoreszenz-aktivierten Zellscanningvorrichtung (FACSCalibur^TM, BD Biosciences) gemäß Standardprozeduren analysiert.
Suspensionszellen: 10⁵ Testzellen in 450 μl Vollmedium werden in P-Röhrchen pipettiert. 50 μl Vollmedium, das die Verbindungen (siehe adhärente Zellen) enthält, wird unmittelbar zugegeben. Nach 48 h Inkubation werden die Testzellen direkt auf einem FACSCalibur^TM analysiert.
Beispiel 125: Quantifizierung des zweiten Screenings
Durch ein Überwachen der EGFP-Fluoreszenzaktivität bei FL1 auf einem FACSCalibur^TM ist es möglich, zwischen proliferierenden Zellen, apoptotischen Zellen und nekrotischen Zellen innerhalb derselben Zellpopulation zu unterscheiden. Die proliferierenden Zellen zeigen eine hohe GFP-Fluoreszenzaktivität, die apoptotische Population zeigt eine mittlere Fluoreszenzaktivität, wogegen die nekrotischen Zellen eine Residualfluoreszenzaktivität zeigen, die mit scheintransfizierten Zellen vergleichbar ist. Bei der CellQuest Software (BD Biosciences) sind drei Regionen in dem Histogramm definiert: M1, welche die proliferierenden Zellen umfasst, M2, welche die apoptotische Zellpopulation umfasst, und M3, welche die nekrotische Zellpopulation umfasst. Als Ablesung wird die relative Abundanz von Zellen, die entweder zu M1, M2 oder M3 gehören, ausgedrückt. Verbindungen, die M2-Werte > 50% und M3-Werte < 30% induzieren, werden als relevant betrachtet und werden weiter in dem dritten/fortgeschrittenen Screeningaufbau getestet und charakterisiert.
Beispiel 126: Dritter Screeningaufbau
A) Kernfärbung mit Hoechst 33342
Dieser Test wird in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Geeignete Anzahlen von Zellen (adhärente Zellen: 3–5·10³, Suspensionszellen: 8–10·10³) werden in 80 μl Vollmedium ausgesät. Adhärente Zellen werden vor der Zugabe von Testverbindungen zur richtigen Ausbreitung für 24 h inkubiert, während Suspensionszellen nach dem Aussäen unmittelbar mit Testverbindungen behandelt werden. Die Testverbindungen werden in 20 μl Vollmedium, das max. 5% DMSO enthält, zugegeben. Die Endkonzentrationen der Verbindungen in den Tests sind 10 μM, 3 μM, 1 μM bzw. 0,3 μM. Nach 24 h oder 48 h Inkubation bei Kulturbedingungen werden 10 μl Medium, das Hoechst 33342-Farbstoff (Sigma B-2261) mit 2–5 μg/ml enthält, zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Testplatten werden dann weiter für 30 Minuten inkubiert und anschließend mit einem Standardinversfluoreszenzmikroskop analysiert.

Die Ablesung erlaubt die Bestimmung des Anteils an apoptotischen Kernen wie auch anderer morphologischer Kriterien, die für Apoptose spezifisch sind, als einer Funktion der Behandlung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Die folgenden Werte werden verwendet: 0 in Bezug auf keine Aktivität, 1 in Bezug auf eine schwache Aktivität, welche weniger als 70% der Zellen umfasst, und Wert 2 in Bezug auf eine starke Aktivität, welche mehr als 70% der Zellen umfasst. Tabelle 6: Kernfärbung mit Hoechst 33342

Beispiel	Konz.	Jurkat	Jily	PBLs	HeLa	H460	MRC5
1	1 μM	2	n. d.	0	2	2	1
	0.1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d.	0	0	0	0
2	1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d.	0	0	0	0
3	1 μM	0	n. d.	0	0	n. d.	0
	0.1 μM	0	n. d.	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	n. d.	0	0	n. d.	0
4	1 μM	2	2	0	2	1	2
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
5	1 μM	2	n. d.	0	2	n. d.	0
	0,1 μM	0	n. d.	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	n. d.	0	0	n. d.	0
6	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	2	0	0	0	2
7	1 μM	2	2	0	2	2	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
8	1 μM	1	0	0	1	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
9	1 μM	2	2	2	2	0	2
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
10	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	2	1	0	0	1	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
11	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	0	1
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
12	1 μM	2	2	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
13	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
14	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	2	1
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
15	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.01 μM	2	2	0	1	2	2
16	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
17	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
18	1 μM	2	n. d.	0	2	1	1
	0.1 μM	0	n. d	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d	0	0	0	0
19	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
20	1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.1 μM	0	n. d	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d	0	0	0	0
21	1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.1 μM	0	n. d	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d	0	0	0	0
22	1 μM	2	n. d.	0	2	0	0
	0.1 μM	0	n. d	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d	0	0	0	0
23	1 μM	2	n. d.	0	2	n. d.	0
	0.1 μM	0	n. d	0	0	n. d	0
	0.01 μM	0	n. d	0	0	n. d	0
24	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
25	1 μM	1	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
26	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
27	1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d.	0	0	0	0
28	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
29	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	0	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
30	1 μM	2	1	0	1	0	2
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
31	1 μM	1	n. d.	0	0	0	0
	0.1 μM	0	n. d.	0	0	0	0
	0.01 μM	0	n. d.	0	0	0	0
32	1 μM	2	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
33	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
34	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
35	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	1	0	0	0	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
36	1 μM	n. d.	0	0	0	0	0
	0.1 μM	n. d.	0	0	0	0	0
	0.01 μM	n. d.	0	0	0	0	0
37	1 μM	n. d.	2	0	0	0	1
	0.1 μM	n. d.	0	0	0	0	0
	0.01 μM	n. d.	0	0	0	0	0
38	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
39	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
40	1 μM	0	1	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
41	1 μM	2	2	1	2	n. d.	0
	0.1 μM	0	0	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	0	0	0	n. d.	0
42	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	2	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
43	1 μM	2	1	0	1	n. d.	1
	0.1 μM	0	0	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	0	0	0	n. d.	0
44	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	2	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
45	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	2	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
46	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
47	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	0	0	0	0	0
48	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	0	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
49	1 μM	2	1	0	1	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
50	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	2	0	0	1	0
51	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	1	0	0	0	0	0
52	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	1	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
53	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	0	0	0	0	1
54	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	1	1	0	0	0	0
55	1 μM	2	2	0	2	2	0
	0.1 μM	1	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
56	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	2	2	0	1	0	1
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
57	1 μM	2	2	0	2	0	2
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
58	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	2	0	2	2	1
59	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
60	1 μM	2	2	0	1	0	2
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
61	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
62	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
63	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
64	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.01 μM	2	2	0	0	0	0
65	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	2	0	0	2	0
66	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	1	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
67	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	2	2	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
68	1 μM	2	1	0	2	2	1
	0.1 μM	2	1	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
69	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	1	1	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
70	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	2	0	0	1	1
71	1 μM	2	1	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
72	1 μM	2	2	0	2	2	0
	0.1 μM	1	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
73	1 μM	2	1	0	1	2	1
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
74	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
75	1 μM	2	2	0	1	2	1
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
76	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	2	2	0	0	1	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
77	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
78	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	2	0	2	2	1
79	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	2	2	0	2	2	1
80	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
81	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
82	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
83	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
84	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
85	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
86	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
87	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
88	1 μM	2	1	0	2	n. d.	0
	0.1 μM	0	0	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	0	0	0	n. d.	0
89	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
90	1 μM	2	1	0	1	n. d.	1
	0.1 μM	0	0	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	0	0	0	n. d.	0
91	1 μM	2	2	0	0	n. d.	0
	0.1 μM	0	0	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	0	0	0	n. d.	0
92	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
93	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	0	1	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
94	1 μM	2	2	0	2	2	2
	0.1 μM	2	2	0	1	2	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
95	1 μM	2	1	0	1	n. d.	0
	0.1 μM	0	0	0	0	n. d.	0
	0.01 μM	0	0	0	0	n. d.	0
96	1 μM	2	2	0	2	1	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
97	1 μM	2	2	0	2	2	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
98	1 μM	2	2	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
99	1 μM	1	1	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
100	1 μM	1	1	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
101	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	2	1	0	1	1	1
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
102	1 μM	2	1	0	0	1	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
103	1 μM	2	2	0	2	2	1
	0.1 μM	1	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
104	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
105	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
106	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
107	1 μM
	0.1 μM
	0.01 μM
108	1 μM	2	2	0	0	1	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
109	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
110	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
111	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
112	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
113	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
114	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
115	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
116	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
117	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
118	1 μM	0	1	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
119	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
120	1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.1 μM	0	0	0	0	0	0
	0.01 μM	0	0	0	0	0	0
A	30 μM	0	0	0	0	0	0
	10 μM	0	0	0	0	0	0
	3 μM	0	0	0	0	0	0
B	30 μM	0	0	0	0	0	0
	10 μM	0	0	0	0	0	0
	3 μM	0	0	0	0	0	0

0:	keine Wirkung
1:	schwache Wirkung
2:	starke Wirkung

B) MTS-Proliferationstest

Der Test wird in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Zellen (Bereich: 1,5·10³–10⁴) werden 24 h vor der Behandlung mit Verbindungen in 80 μl Vollmedium ausgesät. Die Testverbindungen werden in 20 μl Vollmedium zugegeben, das max. 5% DMSO enthält. Die Endkonzentrationen der Verbindungen in den Tests sind 10 μM, 3 μM, 1 μM bzw. 0,3 μM. Die Testplatten werden für 72 h bei Kulturbedingungen inkubiert. Das MTS-Reagens wird gemäß der Vorschrift des Herstellers (Promega G1111) hergestellt. 20 μl MTS-Reagens werden zu jeder Vertiefung zugegeben, die Testplatten werden schnell abzentrifugiert und für weitere 3 h bei Kulturbedingungen inkubiert. Anschließend werden die Platten kurz geschüttelt, und die Absorption wird mit einem Mikroplattenlesegerät bei 492 nm gemessen. IC₅₀-Werte werden durch graphische Analyse bestimmt und sind in der Tabelle 7 in μM Konzentration angegeben. Tabelle 7: MTS-Proliferationstest

Nr.	IC 50
Nr.	Jurkat	Jily	HT1080	HeLa	MRC5
1	2	n. d.	n. d.	1	0
2	0	n. d.	n. d.	0	0
3	1	n. d.	n. d.	n. d.	0
4	2	1	1	1	1
5	1	n. d.	n. d.	1	1
6	3	2	2	2	1
7	1	1	1	1	1
8	1	1	1	1	1
9	1	1	1	1	1
10	n. d.	2	n. d.	1	n. d.
11	n. d.	2	n. d.	1	n. d.
12	1	1	0	0	0
13	1	1	1	1	1
14	2	2	2	2	2
15	3	3	3	2	3
16	1	2	2	1	2
17	0	n. d.	n. d.	0	n. d.
18	1	n. d.	n. d.	0	1
19	2	n. d.	n. d.	1	1
20	1	n. d.	n. d.	0	0
21	0	n. d.	n. d.	0	0
22	1	n. d.	n. d.	1	1
23	1	n. d.	n. d.	1	1
24	0	n. d.	n. d.	0	0
25	1	n. d.	n. d.	0	0
26	0	n. d.	n. d.	0	0
27	0	n. d.	n. d.	0	0
28	0	n. d.	n. d.	0	0
29	2	n. d.	n. d.	2	2
30	1	n. d.	n. d.	1	1
31	1	1	0	1	1
32	1	n. d.	n. d.	1	0
33	0	n. d.	n. d.	0	0
34	0	n. d.	n. d.	0	0
35	2	2	1	2	1
36	2	2	1	2	1
37	1	n. d.	n. d.	1	1
38	1	n. d.	n. d.	1	0
39	0	n. d.	n. d.	0	0
40	1	n. d.	n. d.	1	0
41	1	1	1	1	1
42	2	2	2	2	1
43	1	1	1	1	1
44	3	2	2	2	2
45	2	2	2	2	1
46	3	2	2	2	1
47	3	3	2	2	1
48	3	2	2	2	2
49	1	1	0	0	0
50	2	2	2	2	2
51	2	2	2	2	2
52	n. d.	2	n. d.	2	n. d.
53	n. d.	2	n. d.	2	n. d.
54	n. d.	2	2	2	2
55	n. d.	2	1	1	1
56	n. d.	2	2	2	2
57	2	2	1	1	1
58	3	3	3	2	3
59	1	1	1	1	1
60	1	1	1	1	1
61	2	2	2	2	2
62	2	2	2	1	2
63	0	n. d.	0	0	0
64	2	2	2	2	2
65	3	3	3	2	3
66	2	1	1	1	1
67	1	2	1	1	1
68	2	2	1	1	1
69	2	1	1	1	1
70	3	3	3	3	3
71	n. d.	1	0	1	0
72	1	1	1	1	1
73	1	1	1	1	1
74	1	1	1	1	1
75	1	1	1	1	1
76	1	2	1	1	1
77	1	1	1	1	1
78	3	3	3	3	3
79	3	3	3	3	3
80
81
82
83
84
85
86
87
88	1	1	1	1	1
89	2	2	2	2	1
90	1	1	1	1	1
91	1	1	1	1	1
92	2	2	2	2	1
93	2	2	1	1	1
94	2	2	2	2	1
95	1	1	1	1	1
96	1	1	1	1	1
97	1	1	1	1	1
98	1	1	0	0	0
99	1	1	0	0	0
100	1	0	0	0	0
101	n. d.	2	2	2	2
102	n. d.	1	0	0	1
103	n. d.	2	1	1	1
104
105
106
107
108	1	1	1	1	1
109	1	n. d.	n. d.	0	0
110	0	n. d.	0	0	0
111	0	n. d.	0	0	0
112	0	n. d.	0	0	0
113	0	n. d.	0	0	0
114	0	n. d.	0	0	0
115	0	n. d.	0	0	0
116	0	n. d.	0	0	0
117	0	n. d.	0	0	0
118	0	0	0	0	0
119	0	0	0	0	0
120	0	0	0	0	0
A	0	0	0	0	0
B	0	0	0	0	0

0	IC 50 > 1 μM
1	0,1 μM < IC 50 < 1 μM
2	0,01 < IC 50 < 0,1 μM
3	IC 50 < 0,01 μM

C) AnnexinV/7-AAD-Anfärbung
Adhärente Zellen (1–2·10⁵) werden 24 h vor der Behandlung mit Verbindungen in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Suspensionszellen werden unmittelbar vor der Behandlung in P-Röhrchen pipettiert. Testverbindungen werden zugegeben, was zu einer Endkonzentration von 10 μM führt. Nach 24 h Behandlung werden die Zellen geerntet (im Fall von adhärenten Zellen durch Trypsinierung) und in FACS-Röhrchen (BD Biosciences) überführt. Nach Zentrifugation und Entfernung des Überstands werden 100 μl Vollmedium, welches AnnexinV-GST (10 μg) enthält, zugegeben, gemischt und bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Anschließend werden die Zellen einmal mit Medium gewaschen und mit 100 μl anti-GST Alexa 488 (Molecular Probes A-11131) in Medium, das 1:500 verdünnt ist, für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Dann werden die Zellen einmal gewaschen und mit 1 μg/ml 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (Molecular Probes A-1310) in 250 μl Medium angefärbt und auf dem FACSCalibur^TM analysiert. AnnexinV wird bei FL1 gemessen, während 7-AAD bei FL3 gemessen wird.
D) PI-Anfärbung für die Zellzyklusverteilung
1–2·10⁵ Zellen werden in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät und vor der Zugabe von Verbindungen für 24 h inkubiert. Verbindungen werden für 24 h in einer Endkonzentration von 3 μM oder 10 μM zugegeben. Adhärente Zellen werden durch Trypsinierung geerntet. Die Zellsuspensionen werden fixiert, indem 2 Teile eiskalter Ethanol 100% zugegeben werden, während gevortext wird. Dann werden die Proben für > 2 h bei –20°C gelagert. Anschließend werden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und in 250 μl PBS, welcher 50 μg/ml PI (Calbiochem # 537059) enthält, resuspendiert, dann werden die Proben für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend auf einem FACSCalibur^TM analysiert, wobei die lineare PI-Fluoreszenzaktivität bei FL2 überwacht wird. Die Ablesung erlaubt den Nachweis eines möglichen direkten oder indirekten Einflusses der getesteten Verbindungen auf den Zellzyklus. Die folgenden Ereignisse können auftreten: a) Erzeugung eines subG1-Peaks, welcher ein Anzeichen für DNA-Fragmentierung ist, b) Zunahme der Zellpopulation, welche in der G2M-Phase festgehalten wird. Beide Ereignisse werden bewertet mit 1 für ein schwaches und 2 für ein starkes Auftreten. 0 zeigt überhaupt kein Auftreten an. In Tabelle 8 werden die Einflüsse von mehreren getesteten Verbindungen demonstriert. Tabelle 8: PI-Anfärbung für die Zellzyklusverteilung

Nr. Jurkat 3 μM HeLa 10 μM

subG1 G2M subG1 G2M

16 0 0 0 2

19 0 0 0 2

29 0 0 0 2

30 0 0 0 2

58 0 0 0 2

0: keine Wirkung

1: schwache Wirkung

2: starke Wirkung
E) BrdU-Einbau (Proliferation)
Adhärente Zellen werden bei 2–4·10⁴ Zellen/Vertiefung/ml 24 h vor der Behandlung in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Suspensionszellen werden bei 2·10⁵ Zellen/ml/Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Verbindungen werden zugegeben, was zu Endkonzentrationen von 3 μM bzw. 10 μM führt. Anschließend wird BrdU (Molecular Probes #B-23151) bei einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben, und die Platten werden für 48 h inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen gemäß Standardprozeduren verarbeitet. Der Nachweis des eingebauten BrdU wird mit dem anti-Bromdeoxyuridin-Mab PRB-1, Alexa Fluor 660-Konjugat (Molecular Probes #A-21306) durchgeführt. Die Analyse wird auf einem FACSCalibur^TM durchgeführt, indem die Fluoreszenzaktivität bei FL3 überwacht wird. Die Ablesung spiegelt die DNA-Synthese wieder, welche ein Kennzeichen für die Proliferation ist.
F) Caspase-Abhängigkeiten
Caspase-Abhängigkeiten werden ausgewertet, indem die Behandlung mit Verbindungen mit dem pan-Caspase-Inhibitor zVAD oder dessen Kontrollpeptid zFA (ICN Pharmaceuticals # FK009 bzw. FK029) kombiniert wird. Beide Peptide werden in einer Konzentration von 20 μM verwendet. Im Fall von Caspase-Abhängigkeiten sollte bei allen Apoptosetests eine klare Inhibition der spezifischen Ablesung nachgewiesen werden. Durch ein Vergleichen der Ablesung von mit zVAD und zFA behandelten Proben mit der Verbindungskon trolle ist es möglich, Caspase- bzw. Cysteinproteinase-Abhängigkeiten nachzuweisen. Im Fall der Inhibition durch zVAD, nicht aber duch zFA, ist eine klare Caspase-Abhängigkeit offensichtlich. Eine Inhibition durch zVAD wie auch durch zFA deutet auf die Beteiligung von Cysteinproteinasen an der apoptotischen Kaskade hin.
Beispiel 127: Weiche Kapseln
5000 Weichgelatinekapseln, die jeweils als aktiven Bestandteil 0,05 g von einer der Verbindungen mit der Formel (I), die in den vorhergehenden Beispielen erwähnt wurden, umfassen, werden wie folgt hergestellt: 250 g pulverisierter aktiver Bestandteil werden in 2 Litern Lauroglykol^® (Propylenglycollaurat, Gattefossé S. A., Saint Priest, Frankreich) suspendiert und in einem Nasspulverisierer gemahlen, um eine Partikelgröße von ca. 1 bis 3 um zu erzeugen. Portionen der Mischung mit 0,419 g werden dann in die Weichgelatinekapseln eingeführt, indem eine Kapselfüllmaschine verwendet wird.

Claims

Eine Verbindung mit der Formel (I)
wobei R für Phenyl, Thienyl oder Pyridinyl steht, wobei Phenyl gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl, Halogenniederalkyl, Hydroxyniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Acyloxyniederalkyl, Phenyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Hydroxyniederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Phenylniederalkoxy, Niederalkylcarbonyloxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Niederalkoxycarbonylamino, Niederalkylcarbonylamino, substituiertem Amino, wobei die zwei Substituenten am Stickstoff zusammen mit dem Stickstoff Heterocyclyl bilden, Niederalkylcarbonyl, Carboxy, Niederalkoxycarbonyl, Cyano, Halogen und Nitro; und wobei zwei benachbarte Substituenten Methylendioxy sind; und wobei Pyridinyl gegebenenfalls substituiert ist mit Niederalkoxy, Amino oder Halogen; X für eine Gruppe C=Y steht, wobei Y für Sauerstoff oder Stickstoff steht, das mit Hydroxy oder Niederalkoxy substituiert ist; R¹ für Wasserstoff, Niederalkylcarbonyl, Hydroxyniederalkyl oder Cyanoniederalkyl steht; R², R³ und R⁶ für Wasserstoff stehen; R⁴ und R⁵, unabhängig voneinander, für Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy stehen; oder R⁴ und R⁵ zusammen für Methylendioxy stehen; und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser; oder wobei R für Phenyl oder Pyridinyl steht, wobei Phenyl gegebenenfalls substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus Alkyl, Halogenniederalkyl, Hydroxyniederalkyl, Niederalkoxyniederalkyl, Acyloxyniederalkyl, Phenyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Hydroxyniederalkoxy, Niederalkoxyniederalkoxy, Phenylniederalkoxy, Niederalkylcarbonyloxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Niederalkoxycarbonylamino, Niederalkylcarbonylamino, substituiertem Amino, wobei die zwei Substituenten am Stickstoff zusammen mit dem Stickstoff Heterocyclyl bilden, Niederalkylcarbonyl, Carboxy, Niederalkoxycarbonyl, Formyl, Cyano, Halogen und Nitro; und wobei zwei benachbarte Substituenten Methylendioxy sind; und wobei Pyridinyl gegebenenfalls substituiert ist mit Niederalkoxy, Amino oder Halogen; X für Sauerstoff steht; R¹ für Wasserstoff, Niederalkylcarbonyl, Hydroxyniederalkyl oder Cyanoniederalkyl steht; R², R³ und R⁶ für Wasserstoff stehen; R⁴ und R⁵, unabhängig voneinander, für Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkoxy stehen; oder R⁴ und R⁵ zusammen für Methylendioxy stehen; und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß Anspruch 1, wobei R¹ für Cyanoniederalkyl steht; und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R für Phenyl oder Pyridinyl steht, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ für Wasserstoff stehen; und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß Anspruch 1, welche 4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin; 4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylaminoxim; 4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylaminoximmethylether; 4-(1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim; 4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether; 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim; 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether; 4-[1-(4-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(4-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim; 4-[1-(3-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(3-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim; 4-[1-(3-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether; 4-[1-(4-Phenylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(4-Phenylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim; 4-[1-(4-Phenylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoximmethylether; oder 4-[1-(2,4-Dichlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß Anspruch 1, welche 4-(1-Phenacyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin; 4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylaminoxim; N-{4-[1-[4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl)-acetamid; 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-(1-Phenoxymethyl-1H-benzimidazol-2-yl)-furazan-3-ylamin; 4-[1-(4-Fluorphenoxymethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(3,4-Dimethylphenoxymethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(3-hydroxypropyl)-amin; 4-[1-(3-Amino-4-chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-amin; oder 4-[1-(3-Methoxy-4-methoxymethoxy-phenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin ist; und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 mit der Formel

und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1 mit der Formel

und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 4-[1-(4-Chlorphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-[1-(3-Methoxy-4-methoxymethoxy-phenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(4-Bromphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-[1-(4-Aminophenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-[1-(4-Methoxyphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-[1-(3,4-Dimethylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-[1-(4-Ethylphenacyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; 4-[1-(6-Chlor-3-pyridyl-carbonylmethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; 4-[1-(6-Amino-3-pyridyl-carbonylmethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-yl-N-(2-cyanoethyl)-amin; und 4-[1-(6-Amino-3-pyridyl-carbonylmethyl)-1H-benzimidazol-2-yl]-furazan-3-ylamin; und pharmazeutisch verträgliche Salze von dieser.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 6 mit der Formel
und ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 6 mit der Formel
und ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser.
Eine Verbindung gemäß Anspruch 6 mit der Formel
und ein pharmazeutisch verträgliches Salz von dieser.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit der Formel (I) gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, wobei A) eine Verbindung mit der Formel (II)
wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ wie für Formel (I) definiert sind, oder ein Derivat von dieser mit funktionellen Gruppen in geschützter Form und/oder ein Salz von dieser mit einem Alkylierungsmittel mit der Formel (III) R-X-CH₂-Z (III)alkyliert wird, wobei R wie für Formel (I) definiert ist, X CO ist und Z eine nukleophile Abgangsgruppe ist; oder B) eine Verbindung mit der Formel (II), wobei R¹, R², R³, R⁴, R⁵ und R⁶ wie für Formel (I) definiert sind, oder ein Derivat von dieser mit funktionellen Gruppen in geschützter Form und/oder ein Salz von dieser mit einer Mischung einer Verbindung vom Dihalogenmethan-Typ mit der Formel Z¹-CH₂-Z² (IV), wobei Z¹ und Z² Abgangsgruppen sind, und einer Verbindung mit der Formel R-XH (V), wobei R wie für Formel (I) definiert ist und X Sauerstoff ist, alkyliert wird; jegliche Schutzgruppen in einem geschützten Derivat einer Verbindung mit der Formel (I) entfernt werden; und, wenn so gewünscht, eine erhältliche Verbindung mit der Formel (I) in eine andere Verbindung mit der Formel (I) umgewandelt wird, eine freie Verbindung mit der Formel (I) in ein Salz umgewandelt wird, ein erhältliches Salz einer Verbindung mit der Formel (I) in die freie Verbindung oder ein anderes Salz umge wandelt wird und/oder eine Mischung von isomeren Verbindungen mit der Formel (I) in die einzelnen Isomere aufgetrennt wird.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung mit der Formel (I) gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verwendung einer Verbindung mit der Formel (I) gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung, einer Autoimmunerkrankung, einer mit einer Transplantation zusammenhängenden Symptomatik und/oder einer degenerativen Erkrankung.
Die Verwendung gemäß Anspruch 14 einer Verbindung mit der Formel (I) gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer soliden neoplastischen Erkrankung.