PT1636215E - Furazanobenzimidazoles - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO

" FURAZANOBENZIMIDAZOLES A presente invenção diz respeito a novos furazanobenzimidazoles substituídos, a processos para a sua preparação, a composições farmacêuticas que os contêm, à sua utilização eventualmente em associação com um ou mais outro(s) composto(s) activo(s) sob o ponto de vista farmacêutico para a terapia de doenças neoplásicas e de doenças auto-imunes, e a um método para o tratamento de tais doenças.

Antecedentes da Invenção O cancro constitui uma das causas principais de morte em seres humanos. Muito embora tenha sido desenvolvida uma variedade de fármacos contra doenças neoplásicas e se encontrem disponíveis técnicas tais como a cirurgia e a terapia de radiações, existe ainda uma necessidade de métodos alternativos e aperfeiçoados de tratamento de doenças neoplásicas.

As doenças auto-imunes encontram-se associadas com a linfoproliferação anormal como uma consequência de défices no término da activação e do crescimento dos linfócitos. Com frequência, tais doenças encontram-se associadas a inflamação tal como a artrite reumatóide, a diabetes mellitus dependente da insulina, a esclerose' múltipla, o lúpus eritematoso sistémico e similares. 0 tratamento de tais doenças detém-se sobre fármacos anti-inflamatórios e imunossupressores os quais, em numerosos casos, apresentam graves efeitos secundários. Desse .modo, existe a 2 necessidade de fármacos alternativos com um novo modo de acção que apresentam menos efeitos secundários. A apoptose constitui um termo utilizado para descrever uma série de acontecimentos celulares que ocorrem de modo a produzir a morte celular programada. Existem vários trajectos apoptóticos, alguns dos quais têm sido descritos, enquanto outros permanecem por esclarecer. Se o equilíbrio entre a divisão celular e a apoptose for perturbado, podem ocorrer doenças que põem a vida em risco incluindo o cancro, as perturbações auto-imunes, as doenças neurodegenerativas e cardiovasculares.

Nos anos recentes, tornou-se evidente que a morte celular programada (apoptose) é tão importante para a saúde de um organismo multicelular como a divisão celular. Pela divisão celular repetida e a diferenciação no decurso do desenvolvimento ou reparação de tecidos, produzem-se células em excesso ou mesmo prejudiciais. A fim de manter a homeostase tecidular estas células têm de ser removidas ou eliminadas. A delicada interacção reciproca entre o crescimento celular e a apoptose em um organismo é reflectida no' equilíbrio molecular complexo que determina se uma célula individual sofre divisão, suspende o ciclo celular ou se obriga a morte celular programada. A desregulação da proliferação celular, ou a falta da morte celular apropriada, tem uma vasta gama de implicações clínicas. Um número de doenças associadas com uma tal desregulação envolve a híperproliferação, a inflamação, a remodelação e a reparação tecidulares. Os indícios familiares nesta categoria incluem cancros, restenose, hiperplasia da neo-íntima, angiogénese, endometriose, 3 desordens linfoproliferativas, patologias relacionadas com transplantes (rejeição de enxertos), polipose, perda da função neuronal no caso da remodelação tecidular e similares. Tais células podem perder o controlo regulador normal da divisão celular e podem também ser incapazes de sofrer uma morte celular apropriada.

Como a apoptose é inibida ou retardada na maior parte dos casos de doenças neoplásicas proliferativas, a indução da apoptose constitui uma opção para o tratamento do cancro, especialmente em tipos de cancro que apresentam resistência à quimioterapia, radiação e imunoterapia clássicas (Apoptosis and Câncer Chemotherapy, Hickman and Drive, eds., Blackwell Publishing, 1999). De igual modo, nas doenças e patologias auto-imunes e relacionadas com transplantes os compostos que induzem a apoptose podem ser utilizados para restaurar os processos normais da morte celular e, por consequência, podem erradicar os sintomas e podem curar as doenças. Outras aplicações dos compostos que induzem a apoptose podem ser na restenose, isto é a acumulação de células da musculatura lisa vascular nas paredes das artérias e em infecções persistentes provocadas pelo fracasso da erradicação das células infectadas com bactérias e com vírus. Além disso, a apoptose pode ser induzida ou restabelecida em células epiteliais, em células endoteliais, em células musculares e em outras que perderam o contacto com a matriz extracelular. Estas células são potencialmente susceptíveis de colonizar outros órgãos e, por consequência, podem desenvolver patologias tais como neoplasias, endometriose e similares. A.V. Sergievskíi et al., Russian Journal of Organic Chemistry 2001, 37, 717-720 e A.V. Sergievskíi et al., 4

Russian Journal of Organic Chemistry 2002, 38, 872-874, descrevem a síntese de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3--ilaminas mediante reacção de 4-aminofurazan-3-carboximi-dato de metilo com o-fenilenodiamina e a alquilação no átomo de azoto N1 do núcleo do benzimidazole com halogene-tos de alquilo. A patente de invenção internacional WO 03/066629 (Vertex Pharmaceuticals Inc.) descreve um grande número de compostos heteroarilicos úteis como inibidores de quinases. Descrevem-se igualmente algumas 4-(lH-benzimida-zol-2-il)--furazan-3-ilaminas substituídas no grupo 3-amino do furazano e no átomo de azoto N1 do núcleo do benzimidazole. Estes compostos são descritos como sendo inibidores das quinases GSK-3 e LCK, mas não têm qualquer relevância na apoptose e nas situações clínicas com ela relacionadas.

Sumário da invenção

Os furazanobenzimidazoles de fórmula geral (I) induzem selectivamente a apoptose em células cancerosas, e podem ser utilizados para o tratamento de doenças neoplásicas e auto-imunes. A presente invenção refere-se a compostos de fórmula geral (I), especialmente a compostos para utilização como medicamentos, a processos de síntese desses compostos, a composições farmacêuticas que contêm compostos de fórmula geral (I), à utilização de compostos de fórmula geral (I) para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças neoplásicas e auto-imunes, e a métodos de tratamento de doenças neoplásicas e auto-imunes que utilizam tais compostos de fórmula geral (I) ou a composições farmacêuticas que os contêm. 5

Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção diz respeito a compostos de fórmula geral (I)

0) na qual o símbolo R representa um grupo fenilo, tienilo ou piridinilo em que o grupo fenilo se encontra eventualmente substituído por um ou dois substituinte(s) escolhido(s) independentemente de entre grupos alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi (inferior)-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxí, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior--alcoxí inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilo (inferior)-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi (inferior)-carbonilamino, alquilo (inferior)-carbonilamino, amino substituído em que os dois substituintes no átomo de azoto formam conjuntamente com o átomo de azoto do heterociclo, um grupo alquilo (inferior)--carbonilo, carboxi, alcoxi (inferior)-carbonilo, ciano, halogéneo e nitro; e em que dois substituintes adjacentes representam um grupo metilenodioxi; e em que o grupo piridinilo se encontra eventualmente substituído por átomos de halogéneo ou por grupos alcoxi inferior ou amino; 6 o símbolo X representa um grupo de fórmula geral C=Y, na qual o símbolo Y representa um átomo de oxigénio ou de azoto substituído por grupos hidroxi ou alcoxi inferior; o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior ou ciano-alquilo inferior; os símbolos R2, R3 e R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; os símbolos R4 e R5 representam, cada um, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior ou alcoxi inferior; ou os símbolos R4 e R5 representam, considerados conjuntamente, um grupo metilenodioxi, e aos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico; ou na qual o símbolo R representa um grupo fenilo ou piridinilo em que o grupo fenilo se encontra eventualmente substituído por um ou dois substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi--alquilo inferior, alcoxi (inferior)-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilo (inferior)-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi (inferior)--carbonilamino, alquilo (inferior)-carbonilamino, amino substituído em que os dois substituintes no átomo de azoto formam conjuntamente com o átomo de azoto do heterociclo, um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, carboxi, alcoxi (inferior)-carbonilo, formilo, ciano, halogéneo e nitro; e em que dóis substituintes adjacentes representam um grupo metilenodioxi; 7 e em que o grupo piridinilo se encontra eventualmente substituído por átomos de halogéneo ou por grupos alcoxi inferior ou amino; o símbolo X representa um átomo de oxigénio; o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior ou ciano-alquilo inferior; os símbolos R2, R3 e R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; os símbolos R4 e R5 representam, cada um, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior ou alcoxi inferior; ou os símbolos R4 e R5 considerados conjuntamente representam um grupo metilenodioxi; e aos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Os termos gerais utilizados anteriormente e em segqida apresentam preferivelmente no contexto da presente memória descritiva os significados seguintes, a menos que indicado de outro modo: 0 prefixo "inferior" significa um radical com até e incluindo um máximo de 7, especialmente até e incluindo um máximo de 4 átomos de carbono, sendo os radicais em questão quer de cadeia linear ou ramificada com uma ramificação simples ou múltipla.

Quando se utiliza a forma plural para os compostos, sais e similares, isto pretende significar igualmente um composto individual, um sal, ou um similar. 8

As ligações duplas, em princípio, podem ter a configuração E ou Z. Os compostos de acordo com a presente invenção podem, por consequência, existir sob a forma de misturas isoméricas ou de isómeros individuais. A menos que se especifique de outro modo, consideram-se ambas as formas isoméricas.

Quaisquer átomos de carbono assimétricos podem encontrar-se presentes na configuração (R) , (S) ou (R,S), de preferência na configuração (R) ou (S) . Os compostos podem, deste modo, encontrar-se presentes sob a forma de misturas de isómeros ou de isómeros puros, de preferência sob a forma de diastereómeros puros de enantiómeros. A presente invenção refere-se igualmente a tautómeros possíveis dos compostos de fórmula geral (I). 0 grupo alquilo tem entre 1 e 12, de preferência entre 1 e 7 átomos de carbono, e é de cadeia linear ou ramificada. 0 grupo alquilo é de preferência um grupo alquilo inferior. 0 grupo alquilo inferior tem 1 a 4 átomos de carbono e é um grupo butilo tal como n-butilo, sec.-butilo, isobutilo, terc.-butilo tal como n-propilo ou isopropilo, etilo ou metilo. De preferência, o alquilo inferior é um grupo metilo ou etilo.

Relativamente ao grupo fenilo eventualmente substituído, os substituintes são de preferência grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, alcoxi {inferior)-alcoxi inferior, metilenodioxi, halo-alquilo inferior, alcoxi (inferior)-alquilo inferior, halo ou nitro. 9 0 heterociclilo designa de preferência, um anel monocíclico ou bicíclico saturado, parcialmente saturado ou insaturado, o qual contém 4 a 10 átomos que compreendem um, dois ou três lieteroátomo (s) escolhido (s) de entre átomos de azoto, oxigénio e enxofre, que podem ser, a menos que se especifique de outro modo, carbono ou azoto ligados, em que um átomo de azoto do anel pode ser eventualmente substituído por um grupo escolhido de entre grupos alquilo inferior, amino-alquilo inferior, arilo, aril-alquilo inferior e acilo, e um átomo de carbono do anel pode encontrar-se substituído por um grupo alquilo inferior, amino-alquilo inferior, arilo, aril-alquilo inferior, heteroarilo, alcoxi inferior, hidroxi ou oxo. Exemplos do grupo heterociclilo são os grupos pirrolidinilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, dioxolanilo e tetra-hidropiranilo. O grupo acilo designa, por exemplo, um grupo alquilcarbonilo, ciclo-hexilcarbonilo, arilcarbonilo, aril--alquilo (inferior) -carbonilo ou heteroarilcarbonilo. 0 grupo acilo inferior é de preferência um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, em particular o grupo propionilo ou acetilo. 0 grupo hidroxialquilo é muito especialmente um grupo hidroxi-alquilo inferior, de preferência um grupo hidroximetilo, 2-hidroxietilo ou 2-hidroxi-2-propilo.

Cianoalquilo designa de preferência um grupo cianometilo e cianoetilo. 10

Haloalquilo significa de preferência um grupo fluoroalquilo, em especial um grupo trifluorometilo, 3,3,3--trifluoroetilo ou pentafluoroetilo.

Halogéneo significa um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo.

Alcoxi inferior significa em especial um grupo metoxi, etoxi, isopropiloxi ou terc.-butiloxi.

Quando o símbolo X representa um grupo de fórmula geral C=Y, na qual o símbolo Y representa um átomo de azoto substituído por um grupo hidroxi, isto corresponde a uma função óxima. As óximas e os éteres de alquilo de óxima correspondentes (átomo de azoto substituído por um grupo alcoxi) podem encontrar-se presentes sob forma E ou Z, ou sob a forma de misturas de isómeros.

Os sais são em especial sais de compostos de fórmula geral (I)aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Tais sais são formados, por exemplo, como sais de adição de ácido, de preferência com ácidos orgânicos ou inorgânicos, a partir de compostos de fórmula geral (I) cora um átomo de azoto básico, em especial os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Os ácidos inorgânicos apropriados são, por exemplo, ácidos halogenídricos, tais como ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico. Os ácidos orgânicos apropriados são, por exemplo ácidos carboxílico, fosfónico, sulfónico ou sulfâmico, por exemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido octanóico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, 11 ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tais como ácido glutâmico ou aspártico, ácido maleico, ácido hidroxiroaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclo-hexanocar-boxílico, ácido adamanteno-carboxílico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico', ácido ftálico, ácido f enilacético., ácido mandélico, ácido cinâmico, ácido metano- ou etano-sulfónico, ácido 2-hidroxietano-sulfónico, ácido etano-1,2-dissulfónico, ácido benzeno-sulfónico, ácido 2-naftaleno-sulfónico, ácido 1,5-naftaleno-dissulfó-nico, ácido 2-, 3- ou 4-metilbenzeno-sulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúri-co, ácido N-ciclo-hexilsulfâmico, ácido N-metil-, N-etil-ou N-propil-sulfâmico ou outros ácidos protónicos orgânicos, tais como o ácido ascórbico.

Para fins de isolamento ou de purificação, é igualmente possível a utilização de sais não aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, por exemplo picratos ou percloratos. Para utilização terapêutica, apenas se utilizam sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou compostos livres (quando apropriado sob a forma de preparações farmacêuticas), e estes são, por consequência, preferidos.

Tendo em vista a relação próxima entre os novos compostos sob forma livre e aqueles sob a forma dos seus sais, incluindo os sais que podem ser utilizados como compostos intermédios, por exemplo na purificação ou na identificação dos novos compostos, qualquer referência aos compostos livres, anteriormente e no seguimento, deve ser entendida como fazendo igualmente referência aos sais correspondentes, conforme apropriado e expedito. 12

Os compostos de fórmula geral (I) possuem valiosas propriedades farmacológicas. A presente invenção refere-se igualmente aos compostos de fórmula geral (I) tal como definidos anteriormente para utilização como medicamentos. A eficácia dos compostos de acordo com a presente invenção na indução da apoptose em células de tumor pode ser demonstrada como segue:

Mediram-se as actividades fluorescentes relativas de linhas de células tumorais apropriadas transfectadas com proteína verde fluorescente (GFP) na presença de compostos de acordo com a presente invenção e de fármacos convencionais para tumores, utilizando o método descrito na patente de invenção internacional WO 99/35493. Linhas de células tumorais apropriadas são A20.2J, um linfoma de células B de camundongos BALB/c, PB-3c, uma linha de células mastócitos não tumorigénica dependente de IL-3 isolada da medula óssea de um murganho DBA/2, células Jurkat, uma linha de células de leucemia aguda de células T humana, K562, uma linha de células de leucemia mielogénica crónica humana, HL60, uma linha de células de leucemia promielocítica aguda humana, Ramos e Raji, linhas de células de linfoma de células B humanas, H9 e Hut78, linhas de células de linfoma de células T humanas, HeLa e KB, linhas de células de carcinoma de células escamosas humanas, MCF7, SK-BR-3, PC3, HBL-100, SW480, H460 e H1792, linhas de células de adenocarcinoma humano e HT-1080, uma linha de células de fibrossarcoma humano.

Os fármacos convencionais preferidos como compostos para comparações são: a) antimetabolitos tais como 5-fluorouracilo (ICN), gemcitabina HC1 (Gemzar™, Eli 13

Lilly), b) agentes de alquilação tais como oxaliplatina (Eloxantin™, Sanofi-Synthélabo), dacarbazina (Detimedac™, Medac), ciclofosfamida (Endoxan™, Asta) e carboplatina (Paraplatin™, Bristol-Meyers Squibb), c) inibidor do ciclo celular tais como vinorelbine (Navelbine™, Robapharm), vinblastina (Velbe™, Eli Lilly), docetaxel (Taxotere™, Aventis), d) composto que rompe a cadeia do ADN (inibidor de topo-isomerase, intercalador, rompedor do cordão) tal como doxorubicina HC1 (Adriblastin™, Pharmacia-Upjohn), bleomicina (Asta-Medica), irinotecan (Campto™, Aventis), fosfato de etoposido (Etopophos™, Bristol-Meyers Squibb), topotecano HC1, (Hycamtin™, GlaxoSmithKline), e) as suas misturas, f) compostos que interferem com o trajecto de transdução do sinal, tais como modificadores da actividade da caspase, agonistas e antagonistas dos receptores da morte celular, modificadores de nucleases, fosfatases e quinases tais como mesilato de imatinibe (Gleevec™, Novartis), dexametasona, miristato acetato de forbol, ciclosporina A, quercetina, tamoxifeno (Alexis Corporation, Suíça). A apoptose é determinada em uma despistagem primária utilizando um leitor de placas com fluorescência e em seguida uma despistagem secundária utilizando FACS [Fluorescence-activated cell scanning (captação imagiológica de células activadas por fluorescência)], Os compostos que provocam a apoptose sem efeitos secundários citotóxicos substanciais são escolhidos para ensaio ulterior ' e caracterização mediante utilização de uma associação dos seguintes ensaios bem estabelecidos: A) Coloração nuclear com corante Hoechst 33342 que proporciona a informação respeitante à morfologia nuclear e à fragmentação do ADN que são marcas de contraste da 14 apoptose. B) Ensaio de proliferação de MTS que mede a actividade metabólica das células. As células viáveis são metabolicamente activas enquanto que as células com uma cadeia respiratória comprometida apresentam uma actividade reduzida neste ensaio. C) Ensaio de ligação da anexina V que reflecte o teor de fosfatidilserina na bicamada lipidica exterior da membrana plasmática. Este acontecimento é considerado uma marca precoce da apoptose. D) Coloração com PI para a distribuição do ciclo celular o qual mostra quaisquer alterações na distribuição conjuntamente com as diferentes fases do ciclo celular. Pode determinar-se os pontos de interrupção do ciclo celular. E) Ensaio de proliferação que monitoriza a síntese do ADN mediante incorporação de bromodesoxiuridina (BrdU). Os efeitos inibidores sobre o crescimento/proliferação podem ser determinados directamente. F) Determinou-se a dependência da cisteína proteinase, respectivamente dependência da caspase pela inibição de inibidores específicos. Isto proporciona informação acerca do envolvimento possível de 'protéases específicas nos mecanismos. serosos,

Com base nestes estudos, um composto de fórmula geral (I) de acordo com a presente invenção apresenta uma eficácia terapêutica em especial contra doenças neoplásicas e doenças auto-imunes. Em particular, os compostos de acordo com a presente invenção são activos contra doenças malignas, por exemplo neoplasmas epiteliais, neoplasmas de células escamosas, neoplasmas de células basais, papilomas e carcinomas de células de transição, adenomas e adenocarcinomas, neoplasmas adnexais e de excrescências da pele, neoplasmas mucoepidermóides, neoplasmas císticos, neoplasmas mucinosos e serosos, neoplasmas ductais, 15 lobulares e medulares, neoplasmas de células acinares, neoplasmas epiteliais complexos, neoplasmas gonadais especializados, paragangliomas e tumores dos género glómus, nevos e melanomas, tumores e sarcomas dos tecidos moles, neoplasmas fibromatosos, neoplasmas mixomatosos, neoplasmas lipomatosos, neoplasmas miomatosos, neoplasmas complexos mistos e do estroma, neoplasmas fibroepiteliais, neoplasmas análogos aos sinoviais, neoplasmas mesoteliais, neoplasmas das células germinais, neoplasmas trofoblásticos, mesonefromãs, tumores dos vasos sanguíneos, tumores dos vasos linfáticos, neoplasmas ósseos e condromatosos, tumores das células gigantes, tumores ósseos miscelâneos, tumores odontogénicos, gliomas, neoplasmas neuroepiteliomatosos, meningiomas, tumores do revestimento dos nervos, tumores das células granulares e sarcomas da parte mole alveolar, linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, outros neoplasmas linfo-reticulares, tumores das células plasmáticas, tumores dos mastócitos, doenças imunoproliferativas, leucemias, perturbações mieloproliferativas miscelâneas, perturbações linfoproliferativas e síndromas mielodisplásicos.

Em particular, os compostos de fórmula geral {I) de acordo com a presente invenção apresentam eficácia terapêutica especialmente contra doenças neoplásticas sólidas, por exemplo neoplasmas epiteliais, neoplasmas das. células escamosas, neoplasmas das células basais, papilomas e carcinomas das células de transição, adenomas e adenocarcinomas, neoplasmas adnexais e de apêndices da pele, neoplasmas mucoepidemóides, neoplasmas císticos, neoplasmas mucionosos e serosos, neoplasmas ductais, lobulares e medulares, neoplasmas de células acinares, neoplasmas epiteliais complexos, neoplasmas gonadais 16 especializados, paragangliomas e tumores do género glómus, nevos e melanomas, tumores e sarcomas dos tecidos moles, neoplasmas fibromatosos, neoplasmas mixomatosos, neoplasmas lipomatosos, neoplasmas miomatosos, neoplasmas mistos e estromais complexos, neoplasmas fibroepiteliais, neoplasmas semelhantes a sinoviais, neoplasmas mesoteliais, neoplasmas das células germinais, neoplasmas trofoblásticos, mesonefromas, tumores dos vasos sanguíneos, tumores dos vasos linfáticos, neoplasmas ósseos e condromatosos, tumores das células gigantes, tumores ósseos miscelâneos, tumores odontogénicos, gliomas, neoplasmas neuropiteliomatosos, meningiomas, tumores do revestimento dos nervos, tumores das células granulares e sarcomas das partes moles alveolares.

Os compostos de acordo com a presente invenção, são igualmente activos contra doenças auto-imunes, por exemplo, contra lúpus eritematoso cutâneo, sistémico, discóide ou subagudo, artrite reumatóide, síndroma antifosfolipidico, CREST, esclerose sistémica progressiva, doença do tecido conjuntivo mista (Síndroma de Sharp), síndroma de Reiter, artrite juvenil, doença de aglutinina fria, crioglobulinémia mista essencial, febre reumática, espondilite anquilosante, políartrite crónica, miastenia grave, esclerose múltipla, polineuropatia desmielinante inflamatória crónica, síndroma de Guillan-Barré, desmatomiosite/polimiosite, anemia hemolítica auto-imune, púrpura trompocitopénica, neutropenia, diabetes mellitus de tipo I, tiroidite (incluindo doença de Hashimoto e de Grave), doença de Addison, síndroma poligrandular, penfigus, (vulgaris, folhosa, sebácea e vegetal), penfigoide bulhosa e cicatriacial, gestatione penfigoide, aquisita bulhosa epidermolise, doença IgA linear, líquenes 17 esclerosos e atróficos, morbus Duhring, psoríase vulgaris, gotiforme ("guttate"), psoríase postular e postular localizada generalizada, vitiligo, alopécia areata, cirrose biliar primária, hepatite auto-imune, todas as formas de glomerulonefrite, hemorragia pulmonar (síndroma de Goodpasture), nefropatia IgA, anemia perniciosa e gastrite auto-imune, doenças inflamatórias do intestino (incluindo colite ulcerosa e Crohn morbus), doença de Behcet, doença de Celic-Sprue, uveíte auto-imune, miocardite auto-imune, orquite.granulomatosa, aspermatogénese sem orquite, fibrose pulmonar idiopática e secundária, doenças inflamatórias com uma possibilidade de patogénese' auto-imune, tais como pioderma gangrensona, lichen ruber, sarcoidose (incluindo do tipo de Lõfgren e do tipo cutâneo/subcutâneo), granuloma anular, reacção imunológica alérgica de tipo I e de tipo IV, asma brônquica, polinose, dermatite atópica, de contacto e airborne (das vias aéreas respiratórias superiores), vasculite dos vasos grandes (células gigante e arterite de Takayasu), vasculite dos vasos de dimensões médias (poliarterite nodosa, doença de Kawasaki), vasculite dos vasos pequenos (granulomatose de Wegener, síndroma de Chung Strauss, polangite microscópica, púrpura de Henoch-Shoenlein, vasculite crioglobulinémica essencial, angilite leucoclástica cutânea), síndromas de hipersensibilidade, necrólise epidermal tóxica (síndroma de Stevens-Johnson, eritema multiforme), doenças devidas a efeitos secundários provenientes de fármacos, todas as formas de efeitos cutâneos organo-específicos e sistémicos devidos a formas imunogénicas de reacção de tipo I-VI (Classificação de Coombs), patologias relacionadas com os transplantes, tais como a doença aguda e crónica do enxerto versus hospedeiro e o hospedeiro versus o enxerto, envolvendo todos os órgãos (pele', coração, rins, medula óssea, olhos, fígado, baço, 18 pulmões, músculos, sistema nervoso central e periférico, tecido conjuntivo, ossos, vasos sanguíneos e linfáticos, sistema genito-urinátio, ouvidos, cartilagem, sistema linfático primário e secundário incluindo a medula óssea, os nódulos linfáticos, o timo, o tracto gastrointestinal, incluindo a oro-faringe, o esófago, o estômago, o intestino delgado, o cólon e o recto, incluindo partes dos Órgãos mencionados anteriormente até ao nível da célula individual e substruturas, por exemplo as células estaminais).

Um composto de fórmula geral (I) pode administrar-se sozinho ou em associação com um ou mais outros agentes terapêuticos, tomando a terapia de associação possível a forma de associações fixas, ou sendo a administração de um composto de acordo com a presente invenção e de um ou mais agentes terapêuticos alternada ou dada independente uns dos outros, ou a administração combinada de combinações fixas e um ou mais outros agentes terapêuticos. Um composto de fórmula geral (I) pode além disso ou em adição, ser administrado em especial, para a terapia de tumores em associação com quimioterapia, radioterapia, imunoterapia, intervenção cirúrgica ou uma associação de entre eles. A terapia a longo prazo é igualmente possível na medida em que constitui uma terapia adjuvante no contexto de outras estratégias de tratamento, conforme se descreveu anteriormente. Outros tratamentos possíveis são a terapia para manter o estado do doente após a regressão do tumor, ou mesmo a terapia quimiopreventiva, por exemplo em doentes de risco. 0 uso dos compostos de fórmula geral (I) em associação com radioterapia é particularmente preferido. ou

Os agentes terapêuticos para a associação possível são especialmente um ou mais compostos citostáticos 19 citotóxicos, por exemplo um ou mais agentes quimioterapêuticos escolhidos de entre o grupo que compreende indarubicina, citarabina, ínterferão, hidroxiureia, bissulfano ou um inibidor da biossíntese da poliamina, um inibidor de proteína de quinase, especialmente de proteína quinase de serina/treonina, tal como a proteína quinase C, ou a proteína quinase de tirosina, tal como a tirosina quinase do receptor do factor do factor de crescimento epidermal, a citoquina, ura regulador de crescimento negativo, tal como TGF-β ou INF-β, um inibidor da aromatase, um agente citostático clássico, um inibidor da interacção do domínio SH2 com uma proteína fosforilada, um inibidor de Bcl-2 e de moduladores dos membros da família Bcl-2 tais como as proteínas individuais Bax, Bid, Bad, Bim, Nip3 e BH3.

Um composto de acordo com a presente invenção destina--se não somente à gestão (profiláctica e de preferência terapêutica de seres humanos) mas igualmente para o tratamento de outros animais de sangue quente, por exemplo de animais úteis no comércio, por exemplo roedores, por exemplo tais como murganhos, coelhos ou ratos, ou cobaias. Um tal composto pode também ser utilizado como uma referência padrão nos sistemas de ensaios descritos anteriormente para permitir uma comparação com outros compostos.

Com os grupos de compostos preferidos de fórmula geral (I) mencionados no seguimento, as definições dos substituintes a partir das definições gerais mencionadas anteriormente podem ser utilizadas razoavelmente, por exemplo, para substituir definições mais gerais por 20 definições mais específicas ou especialmente por definições caracterizadas como sendo as preferidas.

Em particular, a presente invenção diz respeito aos compostos de fórmula geral (1} na qual o símbolo R1 representa um grupo ciano-alquilo inferior; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Mais particularmente, a presente invenção diz respeito aos compostos de fórmula geral (I) na qual o símbolo R representa um grupo fenilo ou piridilo; os símbolos R2, R3, R4, R5 ou R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Mais preferivelmente, a presente invenção diz respeito aos compostos dos Exemplos e aos sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, especialmente aos compostos seguintes 4-(l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina; 4-(l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina óxima; Éter metilico de 4-(l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il)-fura-zan-3-ilamina óxima; 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-íl]-furazan-3-ila- ΓΠΧΠ3 / 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metilico de 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2--íl]-furazan-3-ilamina óxima; 4-[1- (4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 21 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metilico de 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2--íl]-furazan-3-ilamina óxima; 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; 4-[1-(3-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 4-[1-(3-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-ilJ-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metilico de 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina óxima; 4-[1-(4-Fenilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-íla-mína; 4-[1-(4-Fenilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metilico de 4-[1-(4-Fenilfenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina óxima; ou 4-[1-(2,4-Diclorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il)]-furazan-3--lamina; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Os compostos de fórmula geral (I) mais preferidos são aqueles em que o símbolo R representa um grupo fenilo, tienilo ou piridinilo em que o grupo fenilo se encontra eventualmente substituído por um ou dois substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi- 22 -alquilo inferior, alcoxi (inferior)-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilo (inferior)-carboniloxi, amino, monoalquilaraino, dialquilamino, alcoxi (inferior)--carbonilamino, alquilo (inferior)-carbonilamino, amino substituído em que os dois substituintes no átomo de azoto formam conjuntamente com o átomo de azoto do heterociclo, um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, carboxi, alcoxi (inferior)-carbonilo, ciano, halogéneo e nitro; e em que dois substituintes· adjacentes representam um grupo metilenodioxi; e em que o grupo piridinilo se encontra eventualmente substituído por átomos de halogéneo ou por grupos alcoxi inferior ou amino; o símbolo X representa um grupo de fórmula geral C=Y, na qual o símbolo Y representa um átomo de oxigénio ou de azoto substituído por grupos hidroxi ou alcoxi inferior; o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior ou ciano-alquilo inferior; os símbolos R2, R3 e R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; os símbolos R4 e R5 representam, cada um, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior ou alcoxi inferior; ou os símbolos R4 e R5 considerados conjuntamente representam um grupo metilenodioxi, e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Os compostos de fórmula geral (I) altamente preferidos são aqueles em que 23 o símbolo R representa um grupo fenilo ou piridinilo em que o grupo fenilo se encontra eventualmente substituído por um ou por dois substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi (inferior)--alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilo (inferior)-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquil-amino, alcoxi (inferior)-carbonilamino, alquilo (inferior)--carbonilamino, amino substituído em que os dois substituintes no átomo de azoto formam conjuntamente com o átomo de azoto do heterociclo, um grupo alquilo (inferior)--carbonilo, carboxi, alcoxi (inferior)-carbonilo, formilo, ciano, halogéneo e nitro; e em que dois substituintes adjacentes formam um grupo metilenodíoxi; e em que o grupo piridinilo se encontra eventualmente substituído por átomos de halogéneo ou por grupos alcoxi inferior ou amino; o símbolo X representa um átomo de oxigénio; o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior ou ciano-alquilo inferior; os símbolos R2, R3 e R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; os símbolos R4 e R5 representam, cada um, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior ou alcoxi inferior; ou os símbolos R4 e R5 considerados conjuntamente representam um grupo metilenodioxi; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. 24

Outros compostos preferidos que entram em consideração são os compostos de fórmula geral (I) na qual o símbolo R representa um grupo fenilo ou piridinilo em que o grupo fenilo se encontra eventualmente substituído por um ou por dois substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi (inferior)--alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxí, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilo (inferior)-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquil-amino, alcoxi (inferior)-carbonilamino, alquilo (inferior)--carbonilamino, amino substituído em que os dois substituintes no átomo de azoto formam conjuntamente com o átomo de azoto do heterociclo, um grupo alquilo (inferior)--carbonilo, carboxi, alcoxi (inferior)-carbonilo, formilo, ciano, halogéneo e nitro; e em que dois substituintes adjacentes representam um grupo metilenodioxi; e em que o grupo piridinilo se encontra eventualmente substituído por átomos de halogéneo ou por grupos alcoxi inferior ou amino; o símbolo X representa um átomo de oxigénio; o símbolo R1 representa um grupo ciano-alquilo inferior; os símbolos R2, R3, R4 e R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Os compostos mais preferidos são escolhidos de entre o grupo que consiste em 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N--(2-cianoetil)-amina; 25 4-[1-(3-Metoxi-4-metoximetoxi-fenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina; 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N--(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(4-Aminofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N--(2-cianoetil}-amina; 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il--N-(2-cianoetil)-amina; 4-[1- (3,4-Dimetilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3--il-N-(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(4-Etilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N- -(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(6-Cloro-3-piridil-carbonilmetil)-lH-benzimidazol-2-—il]-furazan-3-ilamina;. 4-[1-(6-Amino-3-piridil-carbonilmetil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina; e 4-[1-(6-Amino-3-piridil-carbonilmetil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

Em especial,, a. presente invenção diz respeito aos compostos tais como foram descritos anteriormente para utilização como medicamentos. A presente invenção refere-se igualmente à utilização de um composto de fórmula geral (I) ou de um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico de um tal composto para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença neoplásica, uma doença auto-imune, uma patologia relacionada com um transplante e/ou uma doença degenerativa, em particular para o tratamento de uma doença neoplástica sólida. 26

Processo de preparação

Pode preparar-se um composto de acordo com a presente invenção recorrendo a processos que, muito embora não aplicados até à data aos novos compostos de acordo com a presente invenção, são conhecidos de per si, em particular A) um processo, em que se alquila um composto de fórmula geral (II)

na qual os símbolos R1, R2, R3, R4, R5 e R6 têm os significados definidos antes na fórmula geral (I), ou um seu derivado com grupos funcionais sob forma protegida e/ou um seu sal, com um agente de alquilação de fórmula geral (III) R-X-CH2-Z (III) na qual o símbolo R tem os significados definidos antes na fórmula geral (I), o símbolo X representa um grupo CO e o símbolo Z representa um grupo elirainável neocleofílico; ou B) um processo, em que se alquila um composto de fórmula geral (II) na qual os símbolos R1, R2, R3, R4, R5 e R6 têm os significados definidos antes na fórmula geral (I), ou um seu derivado com grupos funcionais sob forma protegida e/ou um seu sal, com uma mistura de um composto de tipo di--halogenometano de fórmula geral ΖΧ-0Η2-Ζ2 (IV), na qual os símbolos Z1 e Z2 representam grupos elimináveis, e um 27 composto de fórmula geral R-XH (V), na qual o símbolo R tem os significados definidos antes na fórmula geral (I) e o símbolo X representa um átomo de oxigénio; sendo quaisquer grupos protectores num derivado protegido de um composto de fórmula geral (I) eliminados; e, se assim se desejar, em converter um composto susceptível de ser obtido de fórmula geral (I) num outro composto de fórmula geral (I), se converter um composto livre de fórmula geral (I) num sal, se converter um sal susceptível de ser obtido de um composto de fórmula geral (I) no composto'livre ou num outro sal e/ou se separar uma mistura de compostos isoméricos de fórmula geral (I) nos isómeros individuais.

Os grupos elimináveis nucleofílicos apropriados representados pelo símbolo Z em um agente de fórmula geral (III) são por exemplo halogenetos, por exemplo cloreto, brometo ou iodeto, ou sulfonatos, por exemplo ésteres aromáticos do ácido sulfónico tais como benzeno-sulfonatos, p-tolueno-sulfonatos ou p-nitrobenzeno-sulfonatos ou igualmente metano-sulfonato ou trifluorometano-sulfonato. Consideram-se igualmente outros grupos elimináveis habituais como, por exemplo, sais de amónio, azidas, sais de diazónio, di- (p-tolueno-sulfonil) -airiinas, nitratos, sais de oxónio, sais de sulfónio ou sais de fosfónio. Os grupos elimináveis nucleofílicos apropriados representados pelos símbolos Z1 e Z2 num composto de tipo di-halogenometano de fórmula geral (IV) são os mencionados anteriormente, em particular o cloro, o bromo e o iodo.

Realiza-se a alquilação de um composto de fórmula geral (II) com um agente de alquilação de fórmula geral (III) de uma maneira conhecida de per si, habitualmente na 28 presença de um solvente aprótico polar ou dipolar apropriado, com arrefecimento ou com aquecimento, por exemplo numa gama de temperaturas compreendida entre cerca de -30 °C e cerca de +150 °C, especialmente compreendida entre cerca de 0o e a temperatura ambiente. Opcionalmente, adiciona-se uma base apropriada, em particular uma base de amina terciária tal como trietilamina ou diisopropiletilamina, ou um sal básico inorgânico, por exemplo carbonato de potássio ou de sódio.

Realiza-se uma alquilação mista de um composto de fórmula geral (II) e de um composto de fórmula geral (V) com um composto do tipo di-halogenometano de fórmula geral (IV) na presença, de um solvente aprótico polar ou dipolar apropriado, com arrefecimento ou com aquecimento, por exemplo numa gama de temperaturas compreendida entre cerca de -30 °C e cerca de +150 °C, especialmente compreendida entre cerca de 0 °C e a temperatura ambiente. As bases apropriadas utilizadas nesta, reacção são, por exemplo, carbonato de potássio e de sódio.

Se um ou mais outros grupos funcionais, por exemplo carboxi, hidroxi ou amino forem protegidos ou haver necessidade de serem protegidos num composto de fórmula geral (II), (III) ou (V), uma vez que eles não devem tomar parte na reacção, estes são grupos protectores tais que são habitualmente aplicados na síntese de amidas, em particular compostos peptídicos, cefalosporinas, penicilinas, derivados do ácido nucleico e açúcares.

Os grupos protectores podem já encontrar-se presentes nos precursores e devem proteger os grupos funcionais em questão contra reacções secundárias indesejadas, tais como 29 alquilações, acilações, eterificações, esterificações, oxidações, solvólise e reacções similares. Constitui uma caracteristíca dos grupos protectores que eles conduzam por si sós e rapidamente, isto é, sem quaisquer reacções secundárias indesejadas, à remoção, tipicamente por solvólise, redução, fotólise ou também por actividade enzimática, por exemplo sobre condições análogas às condições fisiológicas, e que eles não se encontrem presentes nos produtos finais. 0 especialista sabe, ou pode estabelecer facilmente, quais os grupos protectores que são apropriados para as reacções mencionadas anteriormente e no seguimento. A protecção de tais grupos funcionais por tais grupos protectores, os grupos protectores propriamente ditos e as suas reacções de eliminação encontram-se descritos, por exemplo, em livros de referência convencionais para a síntese dos péptidos e em livros especiais sobre grupos protectores tais como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, em "Methoden der organischem Chemie" (Methods of organic chemistry), Houben-Weyl, 4a edição Volume 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, e em T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York.

Nas fases de processo adicionais, realizadas conforme desejado, os grupos funcionais dos compostos iniciais que não devem tomar parte da reacção podem encontrar-se presentes sob forma não protegida ou podem ser protegidos,' por exemplo, por um ou mais dos grupos protectores mencionados anteriormente sobre a rubrica "grupos protectores". Os grupos protectores são então eliminados 30 total ou parcialmente de acordo com um ou mais dos processos descritos ai.

Na conversão de um composto de fórmula geral (I) susceptível de ser obtido num outro composto de fórmula geral (I) , pode, por exemplo, fazer-se reagir, o símbolo X com o significado C=Y na qual Y representa um átomo de oxigénio com uma hidroxilamina eventualmente O-substituída para se obter a óxima ou éter de óxima correspondente de fórmula geral (I) na qual o símbolo X representa um grupo de fórmula geral C=Y e o símbolo Y representa um átomo de azoto substituído por grupos hidroxi ou alcoxi.

Pode alquilar-se ou acilar-se um composto de fórmula geral (I) susceptível de ser obtido, na qual o símbolo R1 e/ou o R2 representa um átomo de hidrogénio, com um composto de fórmula geral R1-Z ou R2-Z, respectivamente, em que o símbolo Z representa um grupo eliminável nucleofílico conforme se descreveu anteriormente, para se obter um composto de fórmula geral (I), na qual os símbolos R1 e/ou R2 não representam um átomo de hidrogénio. As condições de acilação preferidas incluem o uso de anidridos de ácido e de cloretos de ácido a temperaturas elevadas, tipicamente compreendidas na gama entre cerca de +30 °C e cerca de +150 °C. Se assim se desejar, pode empregar-se um catalisador ácido ou básico. Pode obter-se um composto de fórmula geral (I) na qual os símbolos R1 e/ou R2 representam, cada um, um grupo alquilo mediante alquilaçâo do composto principal de fórmula geral (I) . As condições de reacção típicas que permitem esta transformação incluem a associação de uma base forte, tal como um hidreto de metal alcalino ou um alcoolato metálico e um composto de fórmula R1-Z ou R2-Z. 31

Outros grupos arnino presentes num grupo arilo ou heteroarilo representado pelo símbolo R ou num dos substituintes representados pelos símbolos R3, R4, R5 ou R6 podem ser transformados em outros substituintes que contêm átomos de azoto sobre condições conhecidas na especialidade. Por exemplo, a alquilação no átomo de azoto pode ser realizada com um aldeído sobre condições redutoras. Para a acilação, prefere-se o cloreto de acilo correspondente (Z = Cl). Como alternativa, pode utilizar-se um anidrido de ácido, ou pode. conseguir-se a acilação com o ácido livre (Z = OH) sobre as condições utilizadas para a formação de amidas conhecidas de per si na química dos péptidos, por exemplo com agentes de activação para o grupo carboxi, tais como 1-hidroxibenzotriazole, eventualmente na presença de catalisadores ou de co-reagentes apropriados.

Podem alquilar-se os compostos de fórmula geral (I) na qual o símbolo X representa um grupo NOH permitindo o acesso aos éteres de óxima correspondentes. As condições reaccionais que conduzem a esta transformação incluem associações de base fraca e de agentes de alquilação. As bases típicas incluem carbonatos ou bicarbonatos metálicos.

Realiza-se a redução de um grupo nitro num grupo arilo ou heteroarilo nitro-substituído representado pelo símbolo R ou num dos substituintes representados pelos símbolos R3, R4, R5 ou R6 para se obter o grupo arnino correspondente, por exemplo, com ferro em pó no seio de um álcool ou com outros agentes redutores.

Pode amidar-se um grupo carboxi num grupo arilo ou heteroarilo carboxi-substituído representado pelo símbolo R ou num dos substituintes representados pelos símbolos R3, 32 R4, R5 ou R6 sob as condições utilizadas para a formação de amidas conhecidas de per si na química dos péptidos, por exemplo, com a amina correspondente e um agente de activação para o grupo carboxi, tal como 1--hidroxibenzotriazole, eventualmente na presença de catalisadores ou de co-reagentes apropriados.

Pode substituir-se um átomo de bromo ou de iodo substituinte num grupo arilo ou heteroarilo representado pelo símbolo R ou num dos substituintes representados pelos símbolos R3, R4, R5 ou R6 por um grupo fenilo ou por um grupo derivado fenilo mediante reacção com um ácido de fenilborónico apropriado numa reacção de Suzuki, de preferência no seio de um solvente aprótico dipolar tal como a dímetilformamida, ou no seio de um éter polar, por exemplo tetra-hidrofurano ou dimetoxietilano, na presença de um catalisador de paládio (0} ou de metal associado solúvel, por exemplo tetraquis-(trifenilfosfina)-paládio.

Pode preparar-se os sais de um composto de fórmula geral (I) com um grupo formador de sal por uma maneira conhecida de per si. Os sais de adição de ácidos dos compostos de fórmula geral (I) podem, deste modo, ser obtidos mediante tratamento com um ácido ou com um reagente permutador de aniões apropriado.

Os saís que podem ser habitualmente convertidos nos compostos livres, por exemplo, mediante tratamento com agentes básicos apropriados, por exemplo com carbonatos de metais alcalinos, hidrogenocarbonatos de metais alcalinos, ou hidróxidos de metais alcalinos, tipicamente carbonato de potássio ou hidróxido de sódio. 33

Deve salientar-se que reacções análogas às conversões mencionadas neste capitulo podem também ter lugar ao nível dos intermediários apropriados.

Pode realizar-se todas as fases do processo descritas aqui sobre condições reaccionais conhecidas, de preferência sobre as mencionadas especificamente, na ausência de ou habitualmente na presença de solventes ou diluentes, de preferência tais que sejam inertes em relação aos reagentes utilizados e que sejam susceptíveis de dissolver estes últimos, na ausência ou na presença de catalisadores, de agentes de condensação ou de agentes de neutralização, por exemplo permutadores de iões, tipicamente permutadores de catiões, por exemplo sob a forma H+, dependendo do tipo de reacção e/ou dos reagentes utilizados a uma temperatura reduzida, normal ou elevada, por exemplo compreendida na gama entre -100 °C e cerca de 190 °C, de preferência compreendida entre cerca de -80 °C e cerca de 150 °C, por exemplo compreendida entre -80 °C e +60 °C, compreendida entre -20 °C e +40 °C, à’ temperatura ambiente, ou à temperatura de ebulição do solvente utilizado, sob a pressão atmosférica ou num recipiente fechado, quando apropriado sob pressão, e/ou no seio de uma. atmosfera inerte, por exemplo uma atmosfera de árgon ou de azoto.

Os sais podem encontrar-se presentes em todos os compostos iniciais e transientes, se estes contiverem grupos formadores de sais. Os sais podem encontrar-se igualmente presentes durante a reacção de tais compostos, desde que a reacção não seja deste modo perturbada.

Em todos os estádios da reacção, podem separar-se as misturas isoméricas que ocorram nos seus isómeros 34 individuais, por exemplo diastereómeros ou enantiómeros, ou em quaisquer misturas de isómeros, por exemplo racematos óu misturas diastereoméricas. A presente invenção refere-se igualmente àquelas formas do processo em que se parte de um composto que é susceptivel de ser obtido em qualquer estádio como um transiente e se realiza as fases em falta, ou se rompe o processo em qualquer estádio, ou se forma um material inicial sob as condições reaccionais, ou se usa o referido material inicial sob a forma de um derivado reagente ou sal, ou se produz um composto susceptivel de ser obtido por meio do processo de acordo com a presente invenção e se processa ainda o referido composto in situ. De acordo com uma forma de realização preferida, parte-se daqueles materiais iniciais que conduzem aos compostos descritos anteriormente como sendo os preferidos, particularmente tal como especialmente preferidos, principalmente preferidos e/ou preferidos acima de tudo.

De acordo com a forma de realização preferida, prepara-se um composto de fórmula geral (I) de acordo com ou em analogia com os processos e as fases do processo definidos nos Exemplos.

Os compostos de fórmula geral (I) , incluindo os seus sais, são igualmente susceptíveis de ser obtidos sob a forma de hidratos, ou os seus cristais podem incluir, por exemplo, o solvente' utilizado para a cristalização, isto é encontrar-se presentes sob a forma de produtos de solvatação. 35

Os novos materiais iniciais e/ou intermediários, bem como os processos para a sua preparação, encontram-se igualmente descritos. De acordo com uma fórmula de realização preferida, utilizam-se tais materiais iniciais e escolhem-se as condições reaccionais de tal modo que seja possivel a obtenção dos compostos preferidos.

Os materiais iniciais de fórmulas gerais (II), (III), (IV) e (V) são conhecidos, encontram-se disponíveis no comércio, ou podem ser sintetizados em analogia com ou de acordo com os processos que lhe são conhecidos na especialidade.

Composições farmacêuticas, métodos e usos A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas que compreendem um composto de fórmula geral (I) como ingrediente activo e que podem ser utilizadas muito especialmente no tratamento das doenças mencionadas no inicio na presente memória descritiva. As composições para administração por via entérica, tais como a administração nasal, bucal, rectal ou, especialmente oral e para administração parentérica, tal como a administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea, a animais de sangue quente, especialmente seres humanos, são especialmente preferidas. As composições compreendem um ingrediente activo isoladamente ou, de preferência, em conjunto com um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A dosagem do ingrediente activo depende da doença a ser tratada e da espécie, da sua idade, peso e estado individual dos dados farmacocinético individuais e do modo de administração. 36 A presente invenção refere-se muito especialmente a composições farmacêuticas que compreendem um composto de fórmula geral (I), um seu tautómero ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, ou um seu hidrato ou um seu produto de solvatação, e pelo menos um veiculo aceitável em farmácia. A presente invenção refere-se também ás composições farmacêuticas para utilização em um método para a gestão profiláctica ou especialmente terapêutico do corpo humano ou animal, em particular em um método de tratamento de doenças neoplásicas, doenças auto-imunes, patologias relacionadas com transplantes e/ou doenças degenerativas, especialmente as que se mencionaram anteriormente. A presente invenção refere-se também aos processos e à utilização dos seus compostos de fórmula geral (I) para a preparação de composições farmacêuticas que compreendem os compostos de fórmula geral (1} como componente activo (ingrediente activo).

Uma composição farmacêutica para a gestão profiláctica ou especialmente terapêutica de uma doença neoplástica, de uma doença auto-imune, uma patologia relacionada com um transplante e/ou uma doença degenerativa, de um animal de sangue quente, especialmente um ser humano ou um mamífero útil sob o ponto de vista comercial que requerem um tal tratamento, compreende um novo composto de fórmula geral (I) como ingrediente activo em uma quantidade que é profilacticamente ou especialmente terapeuticamente activa contra as referidas doenças, é igualmente preferida. 37

As composições farmacêuticas compreendem entre cerca de 1% e cerca de 95% de ingrediente activo, as formas de administração de dose individual que se encontram compreendidas na forma de realização preferida entre cerca de 20% e cerca de 90% de ingrediente activo e as formas que não são do tipo de dose individual que se encontram compreendidas na forma de realização preferida entre cerca de 5% e cerca de 20% de ingrediente activo. As formas de dosagem unitárias são, por exemplo, comprimidos revestidos ou não revestidos, ampolas, frascos, supositórios ou cápsulas. Outras formas de dosagem unitária são, por exemplo, pomadas, cremes, pastas, espumas, tinturas, sticks para os lábios, gotas, sprays, dispersões, etc.. Exemplos são cápsulas que contêm entre cerca de 0,05 g e cerca de 1,0 g de ingrediente activo.

Prepararam-se as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção por uma maneira conhecida de per si, por exemplo por meio de processos convencionais de mistura, granulação, revestimento, dissolução ou liofilização. Dá-se preferência à utilização de soluções do ingrediente activo e também de suspensões ou dispersões, especialmente soluções, dispersões ou suspensões aquosas isotónicas das quais, por exemplo, no caso de composições liofilizadas compreendem o ingrediente activo sozinho ou conjuntamente com um veiculo, por exemplo o manitol, que podem ser preparadas antes da utilização. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo conservantes, estabilizantes, agentes molhantes e/ou emulsionantes, solubilizantes, sais para regular a pressão osmótica e/ou 38 tampões e são preparadas ppr uma maneira conhecida de per si, por exemplo por meio de processos convencionais de dissolução e de liofilização. As referidas soluções ou suspensões podem compreender agentes que aumentam a viscosidade, tipicamente carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose, dextrano, polivinilpirrolidona ou gelatinas, ou também solubilizantes, por exemplo Tween 80® (mono-oleato de polioxietileno(20)sorbitano).

As suspensões em óleo compreendem como componente oleoso os óleos vegetais, sintéticos, ou semi-sintéticos habituais para fins de injecção. A este respeito, pode fazer-se uma menção especial aos ésteres líquidos de ácidos gordos que contêm, como componente ácido, um ácido gordo de cadeia longa com entre 8 e 22, especialmente entre 12 e 22, átomos de carbono. 0 componente álcool destes ésteres de ácido gordo tem um máximo de 6 átomos de carbono e é um álcool monovalente ou polivalente, por exemplo um álcool mono-, di- ou trivalente, especialmente glicol e glicerol. Como misturas de ésteres de ácidos gordos, são especialmente úteis óleos vegetais tais como óleo de sementes de algodão, óleo de amêndoas, azeite, óleo de rícino, óleo se sésamo, óleo de sementes de soja e óleo de nozes moídas.

Realiza-se habitualmente a preparação de preparações injectáveis sob condições estéreis, tal como o é o enchimento, por exemplo, em ampolas ou frascos, e o fecho dos recipientes.

Os veículos apropriados são especialmente cargas, tais como açúcares, por exemplo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose e/ou fosfatos de cálcio, 39 por exemplo fosfato de tricálcio ou hidrogenofosfato de cálcio, e também ligantes, tais como amidos, por exemplo de milho, de trigo, de arroz ou amido de batata, metilcelulose, hidroxigropilmetilcelulose, carboximetil-celulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona e/ou, se assim se desejar, agentes desintegrantes, tais como os amidos mencionados anteriormente, do mesmo modo que carboximetilamido, polivinilpirrolidona reticulada, ácido alginico ou um seu sal, tal como o alginato de sódio. Os excipientes adicionais são especialmente agentes que condicionam o fluxo e agentes lubrificantes, por exemplo ácido silícico, talco, ácido esteárico ou os seus sais, tais como o estearáto de magnésio ou de cálcio e/ou polietileno glicol ou os seus derivados.

Os núcleos dos comprimidos podem ser providos com um revestimento apropriados, eventualmente entérico, através do uso de, entre outros, soluções concentradas de açúcar que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes orgânicos apropriados ou misturas de solventes, ou, para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de preparações de celulose apropriadas, tais como ftalato de acetilcelulose ou ftalato de hidroxipropilmetilcelulose. Podem adicionar--se corantes ou pigmentos aos comprimidos ou aos revestimentos dos comprimidos, por exemplo para fins de identificação ou para indicar diferentes doses de ingrediente activo.

As composições farmacêuticas para a administração por via oral incluem igualmente cápsulas duras que consistem em gelatina e igualmente cápsulas moles fechadas que consistem 40 em gelatina e um agente plastificante, tal como o glicerol ou o sorbitol. As cápsulas duras podem conter o ingrediente activo sob a forma de grânulos, por exemplo em mistura com cargas, tais como amido de milho, ligantes e/ou agentes de deslizamento, tais como talco ou estearato de magnésio e eventualmente estabilizantes. Nas cápsulas moles, o ingrediente activo encontra-se de preferência dissolvido ou em suspensão em excipientes líquidos apropriados, tais como óleo gordos, óleo de parafina ou polietileno glicóis líquidos ou ésteres de ácido gordo de etileno ou propileno glicol, aos quais podem ser adicionados agentes estabilizantes e detergentes, por exemplo do tipo de éster de ácido gordo de polioxietileno sorbitano.

As composições farmacêuticas apropriadas para a administração pela via rectal são, por exemplo, supositórios que consistem numa combinação do ingrediente activo e numa base para supositórios. As bases para supositórios apropriadas são, por exemplo, triglicéridos naturais ou sintéticos, hidrocarbonetos parafínicos, polietileno glicóis ou alcanóis superiores.

Para a administração por via parentérica, são especialmente apropriadas soluções aquosas de um ingrediente activo sob a forma solúvel em água, por exemplo de um sal solúvel em água, ou suspensões para injecção aquosas que contêm substâncias que aumentam a viscosidade, por exemplo. carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano e, se assim se desejar, agentes estabilizantes. O ingrediente activo, eventualmente em conjunto com excipientes, pode também apresentar-se sob a forma de um liofilizado e pode ser solubilizado antes da administração parentérica mediante a adição de solventes apropriados. 41

Pode igualmente utilizar-se as soluções tais como são utilizadas, por exemplo, para a administração parentérica sob a forma de infusões.

Os agentes conservantes preferidos são, por exemplo, agentes antioxidantes, tais como ácido ascórbico, ou microbicidas, tais como ácido sórbico ou ácido benzóico. A presente invenção refere-se, além disso, a um método para o tratamento de uma doença neoplástica, de uma doença auto-imune, de uma patologia relacionada com um transplante e/ou de uma doença degenerativa, que compreende a administração de um composto de fórmula geral (I) ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em que os radicais e os símbolos têm os significados tais como definidos anteriormente para a fórmula geral (I), em uma quantidade eficaz contra a referida doença, a um animal de sangue quente com necessidade de tal tratamento. Pode administrar-se os compostos de fórmula geral (I) como tais ou, muito especialmente, sob a forma de composições farmacêuticas, profilacticamente ou terapeuticamente, de preferência em uma quantidade eficaz contra as referidas doenças, a um animal de sangue quente, por exemplo um ser humano, com necessidade de um tal tratamento. No caso de um indivíduo com um peso do corpo de cerca de 70 kg a dose diária administrada encontra-se compreendida entre cerca de 0,05 g e cerca de 5 g, de preferência compreendida entre cerca de 0,25 g e cerca de 1,5 g, de um composto de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se especialmente também à utilização de um composto de fórmula geral (I) , ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, 42 especialmente um composto de fórmula geral (I) que é considerado como sendo preferido, ou de um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, como tal ou sob a forma de uma formulação farmacêutica com pelo menos um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico para a gestão terapêutica e também profiláctica de uma ou mais das doenças mencionadas anteriormente, em particular uma doença neoplástica, uma doença auto-imune, uma patologia relacionada com um transplante e/ou uma doença degenerativa. A quantidade de dose preferida, a composição e a preparação das formulações farmacêuticas (fármacos) devem ser utilizadas em cada caso encontram-se descritas anteriormente.

Os Exemplos seguintes servem para ilustrar a invenção sem a limitar no seu âmbito.

Exemplos

Abreviaturas: DMSO: dimetil sulfóxido; . THF = tetra- -hidrofurano, DMAP = N,N-dimetilaminopiridina, DMF = N,N--dimetilformamida, DIPEA = N,N-diisopropil-N-etilamina.

Exemplo 1: 4-(l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3- -ilamina

Adicionou-se brometo de fenacilo (0,1 g, 0,49 mmol) a uma suspensão eficazmente agitada de 4-(lH-benzimidazol-2--il)-furazan-3-ilamina {0,1 g, 0,4 mmol) [A.V. Sergievskii, O.A. Krasnoshek, S.F. Mel'nikova, I.V. Tselinskii, Russian Journal of Organic Chemistry, 2002, 38, 915-917] e 38 carbonato de potássio (0,172 g, 1,24 mmol) em 5 ml de DMF anidro à temperatura ambiente. Decorridas 4 horas diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo e lavou-se a fase orgânica repetidamente com salmoura. A secagem do solvente, a filtração e a evaporação do solvente sob pressão reduzida proporciona o composto do titulo sob a forma bruta. Obteve--se o composto do titulo sob forma pura mediante cromatografia sobre gel de sílica, P.F. 202-204 °C.

Exemplo 2: 4-[1- (4-Brorrtofenacil)-lH-benzim.idazol-2-il] - -furazan-3-il óxima

Aqueceu-se a refluxo durante 20 horas uma mistura de 4-[1-(4-bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina (0,083 g, 0,21 mmol), preparada de acordo com o Exemplo 1, bicarbonato de sódio (0,021 g, 0,25 mmol) e cloridrato de hidroxilamina (0,014 g, 0,21 mmol) em 5 ml de etanol. A distribuição da mistura reaccional entre acetato de etilo e água, a separação da fase orgânica seguida pela secagem e pela evaporação do solvente proporciona o produto bruto. A purificação mediante cromatografia sobre gel de sílica proporciona o composto do título sob a forma de uma mistura E/Z, P.F. 198-201 °C.

Exemplo de Referência 3: Metil-{4-[1-(4-clorofenacil)-1H--benzimidazol-2-il]-furazan-3-il}-amina

Agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas uma suspensão de 4-[1-(4-clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]--furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,282 mmol), preparada de acordo com o Exemplo 1), carbonato de potássio (0,233 g, 1,69 mmol) e sulfato de dimetilo (0,142 g, 1,12 mmol) em 5 ml de acetona. A filtração dos sólidos, a concentração do 44 filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de silica utilizando hexano-acetato de etilo como eluente proporciona um composto do titulo sob a forma de um sólido incolor, P.F. 210-214 °C.

Exemplo de Referência 4: Dimetil-{4-[1-(4-clorofenacil)-1H--benzimidazol-2-il]-furazan-3-il}-amina

Agita-se à temperatura de 60 °C durante 6 horas uma suspensão de 4-[1-(4-clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]--furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,282 mmol), carbonato de potássio (0,60 g, 4,22 mmol) e sulfato, de dimetilo (0,50 g, 2,82 mmol) em 5 ml de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou-se com água e secou-se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, a concentração do filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do residuo sobre gel de silica utilizando hexano-acetato de etilo como eluente proporciona o composto do titulo sob a forma de um sólido de cor amarelada, P.F. 120-123 °C.

Exemplo 5: N-{4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]--furazan-3-il}-acetamida

Agitou-se à temperatura de 80 °C durante 16 horas uma solução de 4-[1-(4-clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-3--ilamina (0,05 g, 0,143 mmol), piridina (0,022 g, 0,282 mmol) cloreto de acetilo (0,013 g, 0,169 mmol) e uma quantidade catalítica de DMAP em 5 ml' de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou-se com água e secou-se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, a concentração do filtrado sobre pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando 45 hexano-acetato de etilo como eluente proporciona o composto do titulo sob a forma de um produto sólido de cor amarelada, P.F. 202-205 °C.

Exemplo 6; 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]- -furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina

Agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas uma suspensão de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-ciano-etil)-amina (0,10 g, 0,39 mmol) , carbonato de potássio (0,08 g, 0,58 mmol) e brometo de 4-clorofenacilo (0,11 g, 0,47 mmol) em 5 ml de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou-se com água e secou--se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, a concentração do filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando hexano-acetato de etilo como eluente proporciona o composto do título sob a forma de um produto sólido de cor amarelada, P.F. 191-192 °C.

Exemplo 6a: 4-(1H-(Benzimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2- -cianoetil)-amina A uma solução de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3--ilamina (0,10 g, 0,497 mmol) em 5 ml de piridina adicionaram-se sequencialmente e à temperatura de 0 °C sódio em metanol (0,02 g, 0,86 mmol em 1 ml) e acrilonitrilo (0,03 g, 0,39 mmol). Agitou-se a mistura durante a noite. A evaporação do solvente sob pressão reduzida e a distribuição do resíduo resultante entre água e acetato de etilo seguida por secagem da solução orgânica sob sulfato de sódio proporciona o composto do título sob forma pura. RMN ΧΗ (400 MHz, ds-DMSO) : 13,7 (s, 1H) ; 7,2 46 (d, 1H) ; 7,60 (d, 1H) ; 7,36 (m, 2H) ; 7,20 (t, 1H) ; 3,67 (q, 2H) ; 2,94 (t, 2H) .

Exemplo 1: 4-(l-Fenoximetil-lH-benzimidazol-2-il) -furazan- -3-ilamina A uma solução de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3--ilamina (0,10 g, 0,497 mmol) adicionou-se carbonato de potássio (0,172 g, 1,24 mmol) e iodometoxi benzeno (0,128 g, 0,546 mmol). Agitou-se a mistura durante a noite. A evaporação do solvente sob pressão reduzida e a distribuição do resíduo resultante entre água e acetato de etilo seguida pela secagem da solução orgânica sobre sulfato de sódio e pela cromatografia do resíduo proporcionou o composto do título sob a forma de um produto sólido incolor, P.F. 171-173 °C.

Exemplo 8: 4-[1-(4-Fluorofenoximetil)-lH-benzimidazol-2- -il]-furazan-3-ilamina A uma solução de 4-(lH-benzimiazol-2-il)-furazan-3--ilamina (0,10 g, 0,497 mmol). adicionou-se carbonato de potássio (0,172 g, 1,24 mmol) seguido por 4-fluorofenol (0,0557 g, 0,497 mmol) e diiodometano (0,133 g, 0,497 irnnol). Agitou-se a mistura durante a noite. A evaporação do solvente sob pressão reduzida e a distribuição do resíduo resultante entre água e acetato de etilo seguida pela secagem da solução orgânica sobre sulfato de sódio e pela cromatografia do resíduo proporciona o composto do título sob a forma de um produto sólido incolor, P.F. 155-158 °C. 47

Exemplo de Referência 9: 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-ben- zimidazol-2-il] -furazan-3-il-N- (2-metoxicarboniletil) -amlna

Agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas uma suspensão de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-il-N- (2--metoxícarboniletil)-amina (0,052 g, 0,181 mmol), carbonato de potássio (0,062 g, 0,452 mmol) e brometo de 4--clorofenacilo (0, 047 g, 0,199 mmol) em 5 ml de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou--se com água e secou-se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, a concentração do filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando hexano-acetato de etilo como eluente proporciona o composto do título sob a forma de um produto sólido hidroscópico de ponto de fusão indefinido. RMN ΧΗ (400 MHz, d6-DMS0) : 8,14 (d, 2H) ; 7,87 (m, 2H) ; 7,41 (m, 2H) ; 7,32 (d, 2H) ; 7,29 (t, 1H) ; 6,37 (s, 2H) ; 3,63 (m, 2H) ; 3,61 (s, 3H) ; 2,76 (t, 2H) .

Exemplo 9a: 4-[1-ÇlH-Benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2--metoxicarboniletil)-amina

Aqueceu-se a refluxo durante 40 minutos uma solução de 4-(lB-benzimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina (0,05 g, Exemplo 6a) em metanol saturado com 5 ml de ácido clorídrico. Após a adição de uma gota de água prosseguiu-se o refluxo durante 2 horas. Neutralizou-se a mistura reaccional utilizando bicarbonato de sódio e extraiu-se então de maneira repetida utilizando acetato de etilo. Secaram-se os extractos orgânicos reunidos e evaporaram-se até à secura sob pressão reduzida. A trituração com hexano e a filtração permite obter o composto do título sob forma pura. RMN 2Η (400 . MHz, ds-DMSO): 13,8 (s, 1H) ; 7,80 (m, 48

I i 1H) ; 7,59 (m, 1H) ; 7,32 (m, 2H) ; 7,03 <m, 1H); 3,63 (m, 2H); 3,61 (s, 3H); 2,76 (t, 2H).

J

Exemplo 10: 4-[1-(3,4-Dimetilfenoximetil)-lH-benzimidazol- i -il] -furazan-3-il] -N- (2-cian.oetil) -amina

Agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas uma ! 1 suspensão de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2- -cianoetil)-amina (0,15 g, 0,59 mmol, Exemplo 6a), carbonato de potássio (0,325 g, 2,36 mmol), diiodometano (0,16 g, 0,59 mmol) e 3,4-dimetilfenol (0,072 g, 0,59 mmol)

I em 5 ml de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetatp de etilo, lavou-se com água e secou-se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, a concentração do filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando hexano-acetato de etilo como eluente proporciona o composto do título sob a forma de um produto sólido de cor amarelada, P.F. 132-135 °C.

Exemplo 11: 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]- -furazan-3-il-N-(3-hidroxipropil)-amina

Agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas uma i suspensão de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(3--hidroxipropil)-amina (0,70 g, 0,27 mmol), carbonato de potássio (0,472 g, 3,42 mmol) e brometo de 4-clorofenacilo (0, 069 g, 0,29 mmol) em 5 ml de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou-se com água e secou-! -se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, a concentração do filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando hexano-acetato de etilo como eluente proporciona o composto 49 do titulo sob a forma de um sólido de cor amarelada, P.F. ! 166-169 °C. j

Exemplo 11a: 4-(lH-Benzimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(3-hi-droxipropil)-amina ; Adicionou-se, gota a gota, à temperatura de 0°C uma ' solução de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-íl-N-(2-cia- | noetil)-amina (0,272 g, 0,947 mmol, Exemplo 6a) em 5 ml de i THF a uma suspensão agitada eficazmente de L1AIH4 (0,054 g, ! 1,42 mmol) em 5 ml de THF. Após agitação durante 16 horas à j temperatura ambiente extinguiu-se a mistura reaccional . mediante adição cuidadosa de uma solução aquosa saturada de i sulfato de sódio. Filtrou-se a suspensão e evaporou-se o filtrado até à secura. A cristalização mediante adição de hexano permite obter o composto do título sob forma pura. RMN XH (400 MHz, d6-DMSO) : 13,6 (s, 1H) ; 7,66 (m, 2H) ; 7,31 (m, 2H) ; 6,92 (t, 1H); 4,61 (m, 1H) ; 3,51 (m, 2H); 3,39 (m, I 2H); 1,81 (m, 2H). j

Exemplo de Referência 12: £-1-[2-(4-Aminofurazan-3-il)- -benzimidazol-l-il]-4-fenil-but-3-en-2-ona

Agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas uma suspensão de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,275 g, 1,37 mmol), carbonato de potássio (0,472 g, 3,42 mmol) e l-cloro-4-fenil-but-3-en-2-ona (0,297 g, 1,64 mmol) em 5 ml de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou-se com água e secou-se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, a concentração do filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando hexano-acetato de etilo como 50 eluente proporciona o composto do titulo sob a forma de um produto sólido de cor amarelada, P.F. 176-180 °C.

Exemplo 12a: l-Cloro-4-fenil-but-3-en-2-ona

Aqueceu-se a refluxo durante 20 horas uma mistura de l-cloro-3-(trifenilfosfanilideno)-propano-2-ona (2,8 g, 7,9 mmol) e de benzaldeído recentemente destilado (0,7 g, 6,6 mmól) em 10 ml de tolueno. A evaporação até à secura permite obter uma mistura que contém o composto do titulo que se utiliza na fase subsequente sem purificação.

Exemplo 12b; l-Cloro-3-(trifenilfosfanilideno)-propano-2--na

Aqueceu-se a refluxo durante 4 horas uma mistura de trifenilfosfina (10,0 g, 38,1 mmol) e 1,3 dicloroacetona (4,84 g, 38,1 mmol) em 20 ml de THF. Mediante aquecimento filtra-se o precipitado resultante, lava-se com THF e seca--se. Ao precipitado agitado de maneira eficaz em 20 ml de metanol adiciona-se uma solução aquosa a 20% de carbonato de sódio (2,02 g, 19 mmol) seguido por mais água. Filtra-se o produto resultante e seca-se para se obter o produto puro. RMN XH (400 MHz, d6-DMSO) : 7,61 (m, 15H) ; 4,07 (2s, 0,5H cada); 3,98 (s, 2H).

Exemplo de Referência 13: 4-[ 1-(4-Aminofenac.il)-1H- -benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-carboxíetil)-amina

Aqueceu-se a temperatura a refluxo durante duas horas uma solução de 4-[1-(4-acetaminofenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina (0,061 g) em ácido clorídrico aquoso (5 ml, HC1 conc.) Diluiu-se a mistura 51 reaccional com água e neutralizou-se mediante adição de bicarbonato de sódio. A extracção com acetato de etilo, a secagem sobre sulfato de sódio, a filtração e a evaporação do filtrado resultante até à secura proporciona o composto do titulo sob forma pura, P.F. 174-177 °C. RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO) : 12,40 {s, 1H) ; 7,84 (m, 4H) ; 7,38 (m, 3H) ; 6,65 (m, 2H); 6,28 (s, 2H); 6,17 (s, 2H); 3,57 (m, 2H); 2,66 (t, 2H) .

Exemplo 14: 4-[1-(3-Amino-4-clorofenacil)-lH-benzimidazol- -2-il]-furazan-3-ilamina A uma solução agitada de 4-[1-(4-cloro-3-nitrofena-cíl)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,07 g, 0,175 itimol) em 6 ml de etanol e 1 ml de água adicionam-se duas gotas de ácido clorídrico concentrado e ferro em pó (0,1 g, 17,5 mmol). Aqueceu-se a mistura reaccional à temperatura de 80 °C durante 8 horas. A filtração e a evaporação sob pressão reduzida proporciona o produto bruto. A purificação mediante extracção com acetato de etilo e a cromatografia sobre gel de sílica permite obter o composto do título sob a forma de um produto sólido incolor, P.F. 228-230 °C.

Exemplo 14a: 4-[1-(4-Cloro-3-nitrofenacil)-lH-benzimidazol--2-il]-furazan-3-ilamina

Agitou-se à temperatura ambiente durante 16 horas uma suspensão de 4-(lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,228 g, 1,14 mmol), carbonato de potássio (0,40 g, 2,85 mmol) e brometo de 4-cloro-3-nitrofenacilo (0,35 g, 1,25 mmol) em 5 ml de DMF. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou-se com água e secou-se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio, A ! 52 concentração do filtrado sob pressão reduzida e a cromatografia do resíduo sobre gel de sílica utilizando hexano-acetato de etilo como eluente proporciona o composto do titulo sob a forma de um sólido, P.F. 198-200 °C. (Este composto encontra-se indicado na lista como Exemplo 66 no Quadro 1).

Exemplo 15:_4-[1-(3-Metoxi-4-metoximetoxi-fenacil)-1H- -benzimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina

Agitou-se à temperatura ambiente durante 14 horas uma mistura de 4-[1-(3-metoxi-4-hidroxifenacil)-lH-benzimida-zol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,27 mmol, DIPEA e cloreto de metoximetilo em DMF anidra. Diluiu-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lavou-se com água e secou--se sobre sulfato de sódio. A filtração do sulfato de sódio e a concentração do filtrado sob pressão reduzida proporcionou o composto do título sob a forma de um produto sólido puro incolor, P.F. 190 °C.

Exemplo 15a: 4-[1-(3-Metoxi-4-hidroxifenacil)-lH-benzimida-zol-2-il]-furazan-3-il-amina A uma solução de 4-[1-(3-metoxi-4-benziloxif enacil -lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (1,00 g) em 20 ml de THF adicionou-se paládio sobre carvão (10%, 0,2 g) .

Agitou-se a mistura reaccional sob atmosfera de hidrogénio durante 1 hora. Filtrou-se o catalisador e evaporou-se o filtrado até à secura para se obter o composto do título sob forma pura, P.F. 265 °C. (Este compostos encontra-se igualmente indicado na lista como Exemplo 74 no Quadro 1). 53

Prepararam-se os compostos seguintes por analogia com os Exemplos 1 a 15:

Quadro 1:

R

Ex. R Y R1 Sal Comentário P.F. 16 jx 0 H - 198-200°C 17 cr NOH H - E/Z 210°C 18 (X NOMe H - E/Z 156-158°C 19 jcr 0 H - 160-162°C 20 NOH H - E/Z 17 6—178 °C 21 NOH H - E/Z 204-206°C 22 Cf NOMe H - E/Z 206-208°C 23 0 H - 181-184°C 24 NOH H - E/Z 18 9-192° C 25 NOMe H - E/Z 160°C 26 jy 0 H - . 226-228°C 54

27 jy NOH H - E/Z 196-198°C 28 jy NOMe H - E/Z 164-166°C 29 jy 0 H - 212-214°C 30 jy NOMe H - E/Z 150-154°C 31 jy. 0 H - 200"201°C 32 (X 0 H - 207-209°C 33 (X NOH H - E/Z 160-163°C 34 cx NOMe H - E/Z 136-140°C 35 “XX 0 H - 192-194°C 36 “XX NOH H - E/Z 188-190°C 37 “XX NOMe H - E/Z 125-127 °C 38 ..-CX' NOMe H - E/Z 110-113°C 39 jy 0 H - 202°C 40 (X 0 Ή - 226°C 41* % o H - 226°C 55

42* OCX 0 H - 180-183°C 43 yy 0 H - 215-218 °C 44 jy 0 H - 206-2Q9°C 45 yy 0 H - 211-214°C 46* OCX 0 CHeCHjCW - 180-182°C 47 jy 0 CH2CH2CN - 204 °C 48 0 CH2CH2CN - 210°C 49 0 H - 224-227°C 50 jy 0 H - 92-96“C 51 jy 0 H HC1 227-230°C 52 XX 0 CH2CH2CH2OH - 160-162°C 53 xx 0 H - 191-194°C 54 0 CH2CH2CN - 175-178°C 55 0 H - 208-210°C 56 εχχ 0 ch2ch2cn - 180-183°C 57 jy 0 ch2ch2cn 178-181°C 56

58 yy 0 CH2CH2CK - 196-199°C 53 Cr 0 H - 179°C 60 jcr 0 H - 250°C 61 jy 0 ch2ch2cn [COOH)2 137-140°C 62 jy ny&i 0 H (COOH}2 148-150°C 63 0 H - 242-246°C 64 ^χχ 0 H - 250-252“C 65 °yy 0 H - >250°C 66 °yy 0 H - 198-200°C 67 XX 0 H - 218-220°C 68 cyV"Y' mo ^ 0 H - 220-223°C 69 ΎΤ 0 ch2ch2cn - 225-226°C 70 fY' 0 H - 190-192°C 71 ’XX 0 H - 186-188°C 72 θ' 0 H - 205°C 57 73 JCX 0 H - 208-210°C 74 :xx 0 H - 2 65 “C 75 “YV 0 H - 205-208 °C 76 ·*νγ 0 H - 24â°C 77 cr 0 H - 174°C 78 JCX 0 H - >250°C 79 w-O r 0 CH2CH2CN - 223°C 80* ΛΧΧ 0 ch2ch2cn - 81 ixx 0 H - 250°C 82* 0 CH2CH2CR - 83 0 H - óleo 84* jC ( 0 CH2CH2CH - 85* vOX 0 ch2ch2ch HC1 86 jCX 0 ch2ch2cn - 87 0 ch2ch2cn HC1 *Exemplo de Referência

Quadro 2:

4.

R

Ex. R Rx Sal Comentário P.F. sa H - 162-165°C 89 jy H ' - 164-167°C 90 jQT H - 156-159°C 91 ,yy H - 148-150 °C 92 yy H - 151-153 °C 93 yy ch2ch2cn - 162-165°C 94 jy ch2ch2cn - 178-179°C 95 θ' ch2ch2cn - 175-178°C 96 jy H - 193-196°C 97 ~jy H - 98 xy H - 190-193°C 99 H - 110-113°C 59 100 jy H HC1 251—252 °C ιοί yy H - 142—145 °C 102 c*, H - 155-158°C 103 'yy H - 145-148 °C 104 XX m* CH2CH2CN - 105 1 1 ch2ch2ch2oh - 106 jy cr^fcr H - 107 XT tyr ΤΓ H -

Quadro 3:

Ex. R R4 R5 Sal Comentário P,F, 108 y Me Me - 250°C 109 jy Me Me - 238 °C 110 jy Me Me - 237°C 111 jy Me Me - 218-220°C

60 112 JX Me Me - 228 °C 113 (X OMe OMe - >250°C 114 JX OMe OMe - >250 °C 115 jy OMe OMe - >250°C 116 JX OMe OMe - >250°C 117 JX OMe OMe - 23 8 °C

Quadro 4:

* Exemplo de Referência Prepararam-se os compostos seguintes a partir da patente de invenção WO 03/066529 para comparação da sua actividade em analogia com os exemplos descritos anteriormente: 61

Quadro 5:

Ex. R MH+ A JL 244 B 256 Métodos gerais para o ensaio dos compostos de acordo com a presente invenção:

Exemplo 121: Culturas de células e linhas de células..

As linhas de células são cultivadas em meio de cultura de tecido RPMI-1640 que contém quer 5% ou 10% de soro fetal de vitela, 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de glutamina e penicilina estreptomicina 50 μ$/τη1 (meio completo) (Sigma, Buchs, Suíça). As condições gerais de crescimento são temperatura 37 °C e 7,5% de C02.

Utilizam-se as seguintes linhas de células de murganho (quer transfectadas com EGFP ou não): A20.2J (ATCC: TIB--208), MC57G (ATCC: CRL-2295).

Utilizam-se as seguintes linhas de células humanas (quer transfectadas com EGFP ou não): HeLa (ATCC: CCL-2) , KB (ATCC: CCL-17), MCF7 (ATCC: HBT-22), SK-BR-3 (ATCC: HTB--30), SK-Mel 1 (ATCC: HBT-67), SK-Mel 28 (ATCC: HTB-72), PC-3 (ATCC: CRL-1435), SW 480 (ATCC: CCL-228), NC1-H460 (ATCC: HTB-177), NC1-H1792 (ATCC: CRL-5895), HT1080 (ATCC: CCL-21), Jurkat (ATCC: TIB-152), Ramos (ATCC: CRLO-1596), 62

Raji (ATCC: CCL-86), H9 (ATCC: HTB-176) , Hut78 (ATCC: TIB--161), K562 (ATCC: CCL 243), HL-60 (ATCC: CCL 240), U-87MG (ATCC: HTB-14), HepG2 (ATCC: HB-8065), U-2 OS (ATCC: HTB--96), Saos-2 (ATCC: HTB-85), U937 (ATCC: CRL 1593), Hs 578T (ATCC: HTB 126), HBL-100 (ATCC: HTB 124), Molt-4 (ATCC: CRL 1582).

Exemplo 122: Preparação da despistaqem primária

Realizaram-se todas as manipulações sob condições estéreis. Realizaram-se os ensaios em placas de microtitulação transparentes de fundo plano disponíveis no comércio com 96 ou 384 cavidades (Greiner, Alemanha), respectivamente, que são apropriadas para as técnicas de cultura de tecidos. Colocou-se um número definido de células de ensaio aderentes transfectadas com EGFP (placas com 96 cavidades: 104 - 105, placas com 384 cavidades: 1500-2*104) durante 24 horas antes do tratamento quer em 75 μΐ (placas com 96 cavidades) ou 60 μΐ (placas com 384 cavidades) de meio completo por cavidade de modo a assegurar um espalhamento apropriado das células. Para esta finalidade utilizou-se uma bomba peristáltica (por exemplo Multidrop de Thermo-Labsytems, Finlândia) ou. um outro dispositivo apropriado. Colocaram-se as células em suspensão de acordo com o mesmo processo mas 1 hora antes do tratamento. Entre a sementeira e o tratamento ou a adição dos compostos incubaram-se as células à temperatura de 37°C sob uma atmosfera de 7,5% de CO2. Subsequentemente, adicionaram-se os compostos ' sob investigação para concentrações definidas 40 - 80 μΜ em quer 25 μΐ (placas com 96 cavidades) ou 20 μΐ (placas com 384 cavidades) de meio completo que contém um máximo de 4% de DMSO) com um dispositivo apropriado (por exemplo um sistema de 63 63 ι manipulação liquido, pipeta com canais múltiplos, etc.) do que resulta uma concentração final na cavidade em estudo de 10 - 20 μΜ de composto num máximo de 1% de DMSO.

Imediatamente após a adição dos compostos às células determinou-se o valor nulo da fluorescência (t = 0 h) mediante utilização de um leitor de microplacas de fluorescência de modo a conseguir normalizar as actividades de fluorescência. Em seguida, incubaram-se ainda as placas de ensaio durante um total de 48 horas à temperatura de 37°C sob uma atmosfera de 7,5% de C02 e removeram-se rapidamente apenas com o objectivo de realizar as medições às 8 horas, 24 horas e 48 horas, respectivamente.

Exemplo 123: Medição e quantificação da despistaqem primária

Mediram-se as actividades relativas de fluorescência de EGFP em células de ensaio tratadas com o composto relativamente às células testemunhas e às células tratadas com fármacos convencionais pela utilização de um leitor de microplacas de fluorescência BMG Fluostar equipado com um par de filtros para excitação/emissão a 485 nm/520 nm. Detectou-se a razão óptima de sinal para ruido pela utilização do modo de medição resolvido no tempo com um atraso de 20 ps e um tempo de integração superior a 1 ms. Ajustou-se o ganho de tal modo que as células testemunhas produzam uma actividade de fluorescência de 90% do valor máximo. Realizou-se a cinética mediante medição das actividades de fluorescência relativas para os tempos t = 0 h, 8 h, 24 h e 48 h. As actividades de fluorescências brutas são normalizadas individualmente para diferentes números de células e diversas actividades ópticas dos 64 compostos em estudo / cavidades da placa mediante divisão de cada valor de t = 8 h, 24 h e 48 h pelo valor de t = 0 h do que resulta os valores E(8), E(2 4) e E(48). Subsequentemente, processaram-se ainda os valores E(x) mediante formação do valor inverso (valor de Q) dos produtos E(8)*E(24)*E(48) que resultam em números superiores a 1 para as actividades apoptóticas /necróticas dos compostos e números inferiores a 1 para as actividades proliferativas dos compostos. As testemunhas (não tratadas) apresentam valores semelhantes a 1. Os valores que produzem valores de Q superiores a 2 são considerados relevantes em termos de actividade apoptótica / necrótica e são ensaiados subsequentemente na preparação de despistagem secundária.

Exemplo 124: Preparação da despistaqem secundária.

Realizaram-se todas as manipulações sob’ condições estéreis. Realizaram-se os ensaios no caso de . células aderentes em placas de cultura de tecido de fundo redondo com 24 cavidades disponíveis no comércio (Greiner, Alemanha) e no caso de células em suspensão em tubos de polipropileno (P-tubos) 1,4 ml (Matrix, UK), respectivamente. Células de ensaio aderentes: colocaram-se 2*104-4*104 de EGFP de células transfectadas em 0,5 ml de meio completo 24 horas antes do tratamento. No instante t = 0 removeu-se o meio e adicionaram-se 450 μΐ de meio completo novo. Subsequentemente, adicionaram-se 50 μΐ de meio completo que contém o composto em estudo para um máximo de 5% de DMSO do que resultam concentrações finais de 20 μΜ, 10 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ e 0,3 μΜ dos compostos em estudo, respectivamente. Decorridas 48 horas de incubação colheram-se as células e 65 analisaram-se com um dispositivo de varrimento de células activadas por fluorescência (FACSCalibur™, BD Biosciences) de acordo com processos convencionais. Células em suspensão: pipetara-se 105 células em estudo em 450 μΐ de meio completo para tubos P. Adicionaram-se imediatamente 50 μΐ de meio completo que contém os compostos (veja-se as células aderentes). Decorridas 48 horas de incubação analisaram-se as células em estudo dírectamente em um FACSCalibur™.

Exemplo 125: Quantificação a despistaqem secundária

Mediante monitorização da actividade de fluorescência de EGFP em FL1 num FACSCalibur™, é possível distinguir entre as células proliferativas, as células apoptóticas e as células necróticas dentro da mesma população de células. As células que proliferam mostram uma elevada actividade de fluorescência da GFP, a população apoptótica apresenta uma actividade de fluorescência intermédia enquanto que as células necróticas demonstram uma actividade residual de fluorescência comparável à das células de imitação transfectadas. Dentro de CellQuest Software (BD Biosciences) definiram-se três regiões no histograma: Ml que compreende as células proliferativas, M2 que compreende a população de células apoptóticas e M3 que compreende a população de células necróticas. Como leitura exprime-se a abundância relativa das células que pertencem quer a Ml, M2 ou M3. Os compostos que induzem valores de M2 superiores a 50% e de valores M3 inferiores a 30% são considerados relevantes e são ainda ensaiadas e caracterizadas na preparação de despistagem terciária / avançada. 66

Exemplo 126: Preparação da despistaqem terciária A) Coloração nuclear com Hoechst 33342

Realizou-se este ensaio em placas de cultura de tecidos com 96 cavidades. Semeou-se um número apropriado de células (células aderentes: 3-5*103, células em suspensão: 8-10*103) em 80 μΐ de meio completo. Incubaram-se as células aderentes durante 24 horas para o espalhamento apropriado antes da adição dos compostos em estudo enquanto que as células em suspensão são tratadas imediatamente com os compostos em estudo após a sementeira. Adicionaram-se os compostos em estudo a 20 μΐ de meio completo que contém um máximo de 5% de DMSO. As concentrações do composto final nos ensaios são de 10 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ e 0,3 μΜ, respectivamente. Decorridas 24 horas ou 48 horas de incubação nas condições de cultura, adicionaram-se 10 μΐ de meio que contém o corante Hoechst 33342 (Sigma B-2261) para 2-5 μς/πύ. a cada cavidade. Incubaram-se então ainda as placas de ensaio durante 30 minutos e, subsequentemente, analisaram-se com um microscópio de fluorescência inversa convencional. A leitura permite a determinação da fracção de núcleos apoptóticos bem como outros critérios morfológicos específicos da apoptose como função do tratamento. Os resultados encontram-se indicados no Quadro 6. Utilizaram--se as seguintes marcas: 0 diz respeito à ausência de actividade, 1 diz respeito a uma actividade fraca que compreende menos de 70% das células e a marca 2 diz respeito a uma actividade forte que compreende mais do que 70% das células. 67

Quadro 6: Coloração nuclear com Hoechst 33342

Exemplo Cone. Jurkat Jily PBLS HeLa Η460 MRC5 1 ΙμΜ 2 τι. d. 0 2 2 1 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η .d. 0 0 0 0 2 ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 3 ΙμΜ 0 η.d. 0 0 η. d. 0 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 η.d. 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 η.d. 0 4 ΙμΜ 2 2 0 2 1 2 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 5 ΙμΜ 2 η .d. 0 2 η.d. 0 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 η.d* 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 η.d. 0 6 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 2 0 0 0 2 7 ΙμΜ 2 2 0 2 2 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 8 ΙμΜ 1 0 0 1 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 9 ΙμΜ 2 2 2 2 0 2 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 10 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 2 1 0 0 1 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 11 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 0 1 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 12 ΙμΜ 2 2 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 13 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 14 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 2 1 0,ΟΙμΜ Ο 0 0 1 0 0 15 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0,ΟΙμΜ 2 2 0 1 2 0 16 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 17 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 18 ΙμΜ 2 η.d. 0 2 1 1 0, ΙμΜ 0 η,d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 19 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 ο 1 68 20 ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η. d. 0 0 0 0 21 ΙμΜ 0 η,d. 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 22 ΙμΜ 2 η,d. 0 2 0 0 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 23 ΙμΜ 2 η. d. 0 2 η.d. 0 0, ΙμΜ 0 η.d* 0 0 η,d. 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 η. d. 0 24 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 25 ΙμΜ 1 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 26 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 27 ΙμΜ 0 η,d. 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 η. d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 28 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0' 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 29 ΙμΜ 2 2 2 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 0 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 30 ΙμΜ 2 1 0 1 0 2 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 31 ΙμΜ 1 η.d. 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 η.d. 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 η,d. 0 0 0 0 32 ΙμΜ 2 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 33 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 34 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 35 ΙμΜ . 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 1 0 0 0 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 36 ΙμΜ η.d. 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ η.d. 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ η.d. 0 0 0 0 0 37 ΙμΜ η. d. 2 0 0 0 1 0, ΙμΜ η, d. 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ η.d. 0 0 0 0 0 38 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 39 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 69 40 ΙμΜ 0 1 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 41 ΙμΜ 2 2 1 2 η.d. 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 η.d. .0 42 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 2 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 43 ΙμΜ 2 1 0 1 η.d. 1 0, ΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 η. d. 0 44 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 2 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 45 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 2 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 46 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 47 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 0 0 0 ο 0 48 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 0 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 49 ΙμΜ 2 1 0 1 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 50 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 2 0 0 1 0 51 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 1 0 0 0 0 0 52 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 1 2 0,ΟΙμΜ ' 0 0 0 0 0 0 53 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 0 0 0 0 1 54 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 1 1 0 0 0 0 55 ΙμΜ 2 2 0 2 2 0 0, ΙμΜ 1 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 56 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 2 2 0 1 0 1 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 57 ΙμΜ 2 2 0 2 0 2 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 58 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 2 0 2 2 1 59 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0

I 70 60 ΙμΜ 2 2 0 1 0 2 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 SI ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 62 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 63 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 64 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0,ΟΙμΜ 2 2 0 0 0 0 65 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 2 0 0 2 0 66 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 1 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 67 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 2 2 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 63 ΙμΜ 2 1 0 2 2 1 0, ΙμΜ 2 1 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 69 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 1 1 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 70 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΟΙμΜ 2 2 0 0 1 1 71 ΙμΜ 2 1 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 72 ΙμΜ 2 2 Ό 2 2 0 0, ΙμΜ 1 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 73 ΙμΜ 2 1 0 1 2 1 - 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 74 ΙμΜ 2 2 0 2 ' 2 1 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 75 ΙμΜ 2 2 0 1 2 1 0Γ ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 76 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 2 2 0 0 1 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 77 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 78 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 2 0 2 2 1 79 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 2 2 0 2 2 1 71 80 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 81 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 82 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 83 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 84 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0, ΟΙμΜ 85 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 86 ΙμΜ 0, ΙμΜ Ο,ΟΙμΜ 87 ΙμΜ 0, ΙμΜ Ο,ΟΙμΜ 88 ΙμΜ 2 1 0 2 η.d. 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 Ο,ΟΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 89 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 Ο,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 90 ΙμΜ 2 1 0 1 η.d. 1 0, ΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 91 ΙμΜ 2 2 0 0 η.d. 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 η. d* 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 92 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 93 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 0 1 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 94 ΙμΜ 2 2 0 2 2 2 0, ΙμΜ 2 2 0 1 2 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 95 ΙμΜ 2 1 0 1 η. d. 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 η.d. 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 η. d. 0 96 ΙμΜ 2 2 0 2 1 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 97 ΙμΜ 2 2 0 2 2 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 98 ΙμΜ 2 2 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 99 ΙμΜ 1 1 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 Ο,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 72 100 ΙμΜ 1 1 0 0 ο I ο 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 1 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 101 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 2 1 0 1 1 1 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 102 ΙμΜ 2 1 0 0 1 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 103 ΙμΜ 2 2 0 2 2 1 0, ΙμΜ 1 0 0 0 0 0 0, ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 104 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 105 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 106 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 107 ΙμΜ 0, ΙμΜ 0,ΟΙμΜ 108 ΙμΜ 2 2 0 0 1 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 109 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 110 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 111 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 112 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 113 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 114 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 115 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 116 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 117 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 118 ΙμΜ 0 1 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 119 ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 0,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 73 120 l|iM 0 0 0 0 0 0 0, ΙμΜ 0 0 0 0 0 0 Ο,ΟΙμΜ 0 0 0 0 0 0 A 30μΜ 0 0 0 0 0 0 10μΜ 0 0 0 0 0 0 3μΜ 0 0 0 0 0 . 0 B 30μΜ 0 0 0 0 0 0 10μΜ 0 0 0 0 0 0 3μΜ 0 0 0 0 0 0 0 ausência de efeito 1 efeito fraco 2 efeito forte

B) Ensaio da proliferação com MTS

Realizou-se o ensaio em placas de cultura de tecido com 96 cavidades. Semearam-se células (gama: 1,5*103 - 104) em 80 μΐ de meio completo 24 horas antes do tratamento com o composto. Adicionaram-se os compostos em estudo a 20 μΐ de meio completo que contém um máximo de 5% de DMSO. As concentrações finais do composto nos ensaios eram de 10 μΜ, 3 μΜ, 1 μΜ e 0,3 μΜ, respectivamente. Incubaram-se as placas de ensaio durante 72 horas para as condições de cultura. Preparou-se o reagente MTS de acordo com o protocolo do fabricante (Promega Gllll). Adicionaram-se a cada cavidade 20 μΐ de reagente MTS, rodaram-se rapidamente as placas de ensaio e incubaram-se durante mais 3 horas nas condições de cultura. Subsequentemente, agitaram-se brevemente as placas e mediu-se a absorção com um leitor de microplacas de 492 nm. Determinaram-se os valores da CI50 mediante análise gráfica e encontram-se indicados no Quadro 7 em concentração em μΜ.

Quadro 7: Ensaio de proliferação com MTS N. 0 ci50 Jurkat Jily HT1080 HeLa MRC5 1 2 n.d. n.d. 1 0 2 0 n.d. n.d. 0 0 3 1 n.d.. n. d. n.d. 0 74 4 2 1 1 1 1 5 1 η.d. η.d. 1 1 6 3 2 2 2 1 7 1 1 1 1 1 8 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 10 η. d. 2 η.d. 1 η. d. 11 η.d. 2 η. d. 1 η. d. 12 1 1 0 0 0 13 1 1 1 1 1 14 2 2 2 2 2 15 3 3 3 2 3 16 1 2 2 1 2 17 0 η.d. η.d. 0 η. d. 18 1 η. d. η. d. 0 1 19 2 η. d. η.d. 1 1 20 1 η.d. η. d. 0 0 21 0 η.d. η.d. 0 0 22 1 η, d. η.d. 1 1 23 1 η. d. η. d. 1 1 24 0 η. d. η.d. 0 0 25 1 η.d. η. d. 0 0 26 0 η.d. η.d. 0 0 27 0 η. d. η.d. 0 0 28 0 η. d. η. d. 0 0 29 2 η.d. η.d. 2 2 30 1 η.d. η.d. 1 1 31 1 1 0 1 1 32 1 η.d. η.d. 1 0 33 0 η. d. η. d. 0 0 34 0 η. d. η.d. 0 0 35 2 2 1 2 1 36 2 2 1 2 1 37 1 η. d. η. d. 1 1 38 1 η. d. η. d. 1 0 39 0 η.d. η. d. 0 0 40 1 η.d. η.d. 1 0 41 1 1 1 1 1 42 2 2 2 2 1 43 1 1 1 1 1 44 3 2 2 2 2 45 2 2 2 2 1 46 3 2 2 2 1 47 3 3 2 2 1 48 3 2 2 2 2 49 1 1 0 0 0 50 2 2 2 2 2 51 2 2 2 2 2 52 η.d. 2 η. d. 2 η. d. 53 η. d. 2 η.d. 2 η. d. 54 η. d. 2 2 2 2 55 η.d. 2 1 1 1 56 η.d. 2 2 2 2 57 2 2 . 1 1 1 58 3 3 3 2 3 59 1 1 1 1 1 60 1 1 1 1 1 75 61 2 2 2 2 2 62 2 2 2 1 2 63 0 η.d. 0 0 0 64 2 2 2 2 2 65 3 3 3 2 3 66 2 1 1 1 1 67 1 2 1 1 1 68 2 2 1 1 1 69 2 1 1 1 1 70 3 3 3 3 3 71 n. d. 1 0 1 0 72 1 1 1 1 1 73 1 1 1 1 1 74 1 1 1 1 1 75 1 1 1 1 1 76 1 2 1 1 1 77 1 1 1 1 1 78 3 3 3 3 3 79 3 3 3 3 3 80 81 82 83 84 85 86 87 88 1 1 1 1 1 89 2 2 2 2 1 90 1 1 1 1 1 91 1 1 1 1 1 92 2 2 2 2 1 93 2 2 1 1 1 94 2 2 2 2 1 95 1 1 1 1 1 96 1 1 1 1 1 97 1 1 1 1 1 98 1 1 0 0 0 99 1 1 0 0 0 100 1 0 0 0 0 101 η.d. 2 2 2 2 102 η.d. 1 0 0 1 103 η. d. 2 1 1 1 104 105 106 107 108 1 1 1 1 1 109 1 η.d. η. d. 0 0 110 0 η.d. 0 0 0 111 0 η. d. 0 0 0 112 0 η. d. 0 0 0 113 0 η. d. 0 0 0 114 0 η. d. 0 0 0 115 0 η.d. 0 0 0 116 0 η.d. 0 0 0 117 0 η.d. 0 ο | ο 76 118 0 0 0 0 0 119 0 0 0 0 0 120 0 0 0 0 0 A 0 0 0 0 0 B 0 0 0 0 0 0 CIsn > ΙμΜ 1 Ο,ΙμΜ < CI50 < ΙμΜ 2 0, 01μΜ < CI50 < 0, ΙμΜ 3 CI50 < 0,01 μΜ

C) Coloração com Anexina V/7-AAD

As células aderentes (1 - 2*105) são semeadas 24 horas antes do tratamento com o composto em placas de cultura de tecido com 24 cavidades. Pipetaram-se as células em suspensão para tubos P imediatamente antes do tratamento. Adicionaram-se os compostos em estudo o que conduz a concentrações finais de 10 μΜ. Decorridas 24 horas de tratamento colheram-se as células (no caso das células aderentes mediante tripsinização) e transferiram-se para tubos FACS (BD Biosciences). Após centrifugação e remoção do sobrenadante, adicionaram-se 100 μΐ de meio completo que contém Anexina V-GST (10 pg) e incubaram-se à temperatura de 4~C durante 30 minutos. Subsequentemente, lavaram-se as células uma vez com meio e incubaram-se com 100 μΐ de anti.GST Alexa 488 (sondas moleculares Probes A-11131) em meio diluído a 1:500 durante 30 minutos à temperatura de 4°C. Em seguida, lavaram-se as células uma vez e coraram-se com 1 μg/ml de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (sondas moleculares A-1310) em 250 μΐ de meio e analisaram-se num equipamento FACSCalibur™. Mediu-se a Anexina V em FL1 enquanto se mediu a 7-AAD em FL3. 77 D) Coloração com PI da distribuição do ciclo de células

Semearam-se 1 - 4*104 células em placas de cultura de tecido com 24 cavidades e incubaram-se durante 24 horas antes da adição do composto. Adicionaram-se os compostos durante 24 horas para uma concentração final de 3 μΜ e 10 μΜ. Colheram-se as células aderentes mediante tripsinizaçâo. Fixaram-se as suspensões de células mediante adição de 2 partes de etanol arrefecido com gelo a 100% enquanto se agitou num ciclone. Lavaram-se então as amostras durante mais de 2 horas à temperatura de -20°C. Subsequentemente lavaram-se as células com PBS uma vez e voltaram a suspender-se em 250 μΐ de PBS que contém 50 μς/πιΐ de PI (Calbiochem # 537059) , então incubaram-se as amostras à temperatura de 37 °C durante 30 minutos e subsequentemente analisaram-se num FACSCalibur™ para monitorizar a actividade de fluorescência linear de PI sobre FL2. A leitura permite a detecção de uma possível influência directa ou indirecta dos compostos em estudo sobre o ciclo celular. Podem ocorrer os seguintes acontecimentos: a) Produção de um pico subGl indicativo da fragmentação do ADN, b) aumento da população de células presa na fase G2M. Ambos os acontecimentos são marcados como 1 para uma ocorrência fraca e 2 para uma ocorrência forte. 0 indica a ausência total. No Quadro 8 demonstraram--se as influências dos diversos compostos em estudo. 78

Quadro 8: Coloração com PI para a distribuição do ciclo celular N. 0 Jurkat 3 μΜ HeLa 10μΜ subGl G2M subGl G2M 16 0 0 0 2 19 0 0 0 2 29 0 0 0 2 30 0 0 0 2 58 0 0 0 2 0 ausência de efeito 1 efeito fraco 2 efeito forte E) Incorporação de BrdU (proliferação)

Semearam-se células aderentes à razão de 2 - 4*104 células/cavidade/ml em placas de cultura de tecido de 24 cavidades 24 horas antes do tratamento. Semearam-se as células em suspensão à razão de 2*105 células/ml/cavidade em placas com 24 cavidades. Adicionaram-se os compostos o que conduz a concentrações finais de 3 μΜ e 10 μΜ, respectivamente. Subsequentemente, adicionou-se BrdU (Sondas Moleculares #B-23151) para uma concentração final de 10 μΜ e incubaram-se as placas durante 4 8 horas. Em seguida,· processaram-se as células de incubação de acordo com técnicas convencionais. Realizou-se a detecção do BrdU incorporado com um conjugado da anti-bromodesoxiuridina Mab PRB-1, Alexa Fluor 660 (Sondas Moleculares #A 21306). Realizou-se a análise em um equipamento FACSCalibur™ mediante monitorização da actividade de fluorescência' FL3. A leitura reflecte a síntese do ADN que constitui um sinal marcante da proliferação. F) Dependências da Caspase 79

Avaliaram-se as dependências da caspase mediante associação do tratamento com o composto com o inibidor da pan-caspase zVAD ou o seu péptido de controlo zFA (ICN Pharmaceuticals #FK009 e FK029, respectivamente). Utilizaram-se ambos os péptidos para uma concentração de 20 μΜ. No caso das dependências da caspase deveria detectar-se uma inibição clara da leitura especifica em todos os ensaios de apoptose. Mediante comparação da leitura das amostras tratadas com zVAD e com zFA com o composto testemunha é possível detectar as dependências da caspase, respectivamente cisteína proteínase. No caso da inibição por zVAD mas não por zFA é óbvia uma dependência clara da caspase. Uma inibição por zVAD bem como por zFA aponta no sentido do envolvimento das cisteína proteínases na cascata apoptótica.

Exemplo 127; Cápsulas Moles

Prepararam-se 5000 cápsulas de gelatina mole, cada uma das quais compreende, como ingrediente activo, 0,05 g de um dos compostos de fórmula geral (I) mencionados nos Exemplos anteriores, como segue: suspenderam-se 250 g de componente activo pulverizado em 2 litros de Lauroglykol® (laurato de propileno glicol, Gattefossé S.A., Saint Priest, França) e moeram-se em um pulverizador a húmido para produzir um tamanho de partícula de cerca de 1 a 3 μΜ. Introduziram-se então porções de 0,419 g da mistura nas cápsulas de gelatina mole utilizando uma máquina para enchimento de cápsulas.

Lisboa, 17 de Abril de 2008

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula geral (I)

na qual o símbolo R representa um grupo fenilo, tienilo ou piridinilo em que o grupo fenilo se encontra eventualmente substituído por um ou dois substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi--alquilo inferior, alcoxi (inferior)-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilo (inferior}-carboniloxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxi (inferior)-carbonilamino, alquilo (inferior)-carbonilamino, amino substituído em que os dois substituintes no átomo de azoto formam conjuntamente com o átomo de azoto do heterociclo, um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, carboxi, alcoxi (inferior)-carbonilo, ciano, halogéneo e nitro; e em que dois substituintes adjacentes representam um grupo metilenodioxi; e em que o grupo piridinilo se encontra eventualmente substituído por átomos de halogéneo ou por grupos alcoxi inferior ou amino; 2 o símbolo X representa um grupo de fórmula geral C=Y, na qual o símbolo Y representa um átomo de oxigénio ou de azoto substituído por grupos hidroxi ou alcoxi inferior; o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior ou ciano-alquilo inferior; os símbolos R2, R3 e R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; os símbolos R4 e R5 representam, cada um, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior ou alcoxi inferior; ou os símbolos R4 e R5 considerados conjuntamente representam um grupo metilenodioxi. e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico; ou na qual o símbolo R representa um grupo fenilo ou piridinilo em que o grupo fenilo se encontra eventualmente substituído por um ou por dois substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi (inferior)--alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilo (inferior)-carboniloxi, amino, rnonoalquilamino, diãlquil-amino, alcoxi (inferior)-carbonilamino, alquilo (inferior)--carbonilamino, amino substituído em que os dois substituintes no átomo de azoto formam conjuntamente com o átomo de azoto do heterociclo, um grupo alquilo (inferior)--carbonilo, carboxi, alcoxi (inferior)-carbonilo, formilo, ciano, halogéneo e nitro; e em que dois substituintes adjacentes representam um grupo metilenodioxi; 3 e em que o grupo piridinilo se encontra eventualmente substituído por átomos de halogéneo ou por grupos alcoxi inferior ou amino; o símbolo X representa um átomo de oxigénio; o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (inferior)-carbonilo, hidroxi-alquilo inferior ou ciano-alquilo inferior; os símbolos R2, R3 e R6 representam, cada um, um átomo de hidrogénio; os símbolos R1 e R2 representam, cada um, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior ou alcoxi inferior; ou os símbolos R1 e R2 considerados conjuntamente representam um grupo metilenodioxi; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

2. Composto de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1., em que o símbolo R1 representa um grupo ciano-alquilo inferior; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

3. Composto de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1. ou 2., em que o símbolo R representa um grupo fenilo ou pirifinilo e os símbolos R2, R3, R1, R2 e R6, representam, cada um, um átomo de hidrogénio; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. 1 Composto de fórmula geral (I) de acordo com a 2 reivindicação 1., o qual é 4 4-(l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina; 4- (l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il) -furazan-3-ilamina óxima; Éter raetilico de 4-(l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il)-fura-zan-3-ilamina óxima; 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metílico de 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina óxima; 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzímidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metilico de 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina óxima; 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; 4-[1-(3-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 4-[1-(3-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metilico de 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina óxima; 4-[1-(4-Fenilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina; 4-[1-(4-Fenilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; Éter metilico de 4-[1-(4-Fenilfenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina óxima; ou 5 4-[1-(2,4-Dxclorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il)]-furazan-3--lamína; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

5. Composto de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1., o qual é 4-(l-Fenacil-lB-benzimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina; 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-ila-mina óxima; 4-{4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-fúrazan-3--il}-acetamida; 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N--(2-cianoetil)-amina; 4-(l-Fenoximetil-lH-benzimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina; 4-[1-(4-Fluorofenoximetil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3--ilamina; 4-[1- (3,4-Dimetilfenoximetil)-lH-benzimidazol-2-il]-fura-zan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-~(3-hidroxipropil)-amina; 4-[1-(3-Amino-4-clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-fura-zan-3-ilamina; ou 4-[1-(3-Metoxi-metoximetoxi-fenacil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1., de fórmula geral i I i R* hnT

δ na qual Ex. R Y R1 16 jy 0 H 17 cr NOH H 18 cr NOMe H 19 sy MeO ^ 0 H 20 jy NOH H 21 jy NOH H 22 „jy NOMe H 23 0 H 24 "XX NOH H 25 "“TX NOMe H 26 jy 0 H 27 jy NOH H 28 jy NOMe H 29 jy 0 H 30 jy NOMe H 7 31 JX 0 H 32 <X 0 H 33 ec NOH H 34 cc NOMe H 35 Xr 0 H 36 CXX NOH H 37 xr NOMe H 38 XX MeS NOMe H 39 JX 0 H 40 cr 0 Ac 43 0 H 44 JX 0 H 45 CCr' 0 H 47 0 CH2CH2CN 48 0 ch2ch2cn 49 JX 0 H 50 JX 0 H 52 yx 0 ch2ch2ch2oh 8 53 Xr 0 H 54 1 I 0 ch2ch2cn 55 jcr 0 H 56 jy 0 ch2ch2cn 57 jy 0 ch2ch2cn 58 jy 0 ch2ch2cn 59 (X 0 H 60 jy 0 H 63 jy 0 H 64 ^ ΥΎ AeHWA^ 0 H 65 ZCr 0 H 66 yx 0 H 67 XX 0 H 68 0 H 69 yy 0 ch2ch2cn 70 0 H 71 *XX 0 H 72 <y 0 H 9

e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1., de fórmula geral

na qual Εχ. R R1 88 H 89 .IX H 90 xx H 91 χχ H 92 xx H 93 XX ch2ch2cn 94 XX ch2ch2cn 95 (T CH2CH2CN 9 6 XX H 97 -XX H 98 XX H 99 jy H 101 XX H 102 CF* H 103 H 104 XX CH2CH2CN 105 CH2CH2CH2OH 106 XX H 11 11

e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

8. Composto de acordo com a reivindicação 1., escolhido de entre o grupo que consiste em 4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N- -{2-cianoetil)-amina; 4-[1-(3-Métoxi-4-metoximetoxi-fenacil)-lH-bênzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina; 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzímidazol-2-il]-furazan-3-il-N--(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(4-Aminofenacil)-lH-ben.zimidazol-2-il]-furazan-3-il-N--(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(4-Metoxifenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il--N-(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(3, 4-Dimetilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3--il-N-(2-cianoetil)-amina; 4-[1-(4-Etilfenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazan-3-il-N--(2-cianoétil)-amina; 4-[1-(6-Cloro-3-piridil-carbonilmetil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina; 4-[1-(6-Amino-3-piridil-carbonilrnetil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina; e 4-[1-(6-Amino-3-piridil-carbonilmetil)-lH-benzimidazol-2--il]-furazan-3-ilamina; e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

9. Composto de acordo com a reivindicação 6., de fórmula geral 12 R' hn'

R na qual Ex. R y R1 70 cÁJ 0 H e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

10. Composto de acordo com a reivindicação 6., de fórmula geral

na qual Ex·. R Y R1 78 fY 0 H wjr & e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

11. Composto de acordo com a reivindicação 6., de fórmula geral 13 RS Η»'

na qual Ex. R Y R1 79 JX 0 ch2ch2cn e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

12. Processo para a preparação de um composto de fórmula geral (I) de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 11., em que A) se alquila um composto de fórmula geral (II)

na qual os símbolos R1, R2, R3, R4, R5 e R6. têm os significados definidos antes para a fórmula geral (I), ou um seu derivado, com grupos funcionais sob forma protegida e/ou um seu sal, um agente de alquilação de fórmula geral (III) R-X~CH2-Z (III) na qual o símbolo R tem os significados definidos antes na fórmula geral (I), o símbolo X répresenta um grupo CO e o símbolo Z representa um grupo eliminável nucleofílico; ou B) se alquila um composto de fórmula geral (II), na qual os símbolos R1, R2, R3, R4, R5 e R6 têm . os significados 14 definidos antes para a fórmula geral (I), ou um seu derivado, com grupos funcionais sob forma protegida e/ou um seu sal, com uma mistura de um composto de tipo di--halogenometano de fórmula geral Z1-CH2-Z3 (IV), na qual os símbolos Z1 e Z2 representam grupos elimináveis, e um composto de fórmula geral R-XH (V), na qual o símbolo R tem os significados definidos antes para a fórmula geral (I) e o símbolo X representa um átomo de oxigénio; se eliminam quaisquer grupos protectores em um derivado protegido de um composto de fórmula geral (I), e, se assim se desejar, se converte um composto de fórmula geral (I) susceptível de ser obtido em outro composto de fórmula geral (I), se converte um composto livre de fórmula geral (I) em um seu sal, se converte um sal e um composto de fórmula geral (I) susceptível de ser obtido no composto livre ou em um outro sal, e/ou se separa uma mistura de compostos isoméricos de fórmula geral (I) nos isómeros individuais.

13. Composição farmacêutica que compreende um composto de fórmula geral (I) de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 11. e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

14. Utilização de um composto de fórmula geral (I) de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 11. ou de um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico de um tal composto para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença neoplásica, de uma doença auto-imune, de uma patologia relacionada com transplantes e/ou de uma doença degenerativa. 15

15. Utilização de acordo com a reivindicação 14. de um composto de fórmula (1} de acordo com qualquer das reivindicações 1. a 11. ou de um sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico de um tal composto para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença neoplásica sólida. Lisboa, 17 de Abril de 2008