ES2300775T3 - Furazanobencimidazoles. - Google Patents

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ES2300775T3 ES04733874T ES04733874T ES2300775T3 ES 2300775 T3 ES2300775 T3 ES 2300775T3 ES 04733874 T ES04733874 T ES 04733874T ES 04733874 T ES04733874 T ES 04733874T ES 2300775 T3 ES2300775 T3 ES 2300775T3
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Felix Bachmann
Alessandro Strebel
Subho Roy
Sudhir Srivastava
Goutam Saha
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Abstract

Un compuesto de fórmula (I) (Ver fórmula) en el que R representa fenilo, tienilo o piridinilo en el que fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilo inferior carbonilo, carboxi, alcoxi inferior carbonilo, ciano, halógeno y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en el que el piridinilo está opcionalmente sustituido por un alcoxi inferior, amino o halógeno; X representa un grupo C=Y, en el que Y representa oxígeno o nitrógeno sustituido por hidroxi o alcoxi inferior; R1 representa hidrógeno, alquilo inferior carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior; R2, R3 y R6 representan hidrógeno; R4 y R5, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. o en el que R representa fenilo o piridinilo en el que el fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilo inferior carbonilo, carboxi, alcoxi inferior carbonilo, formilo, ciano, halógeno y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi; y en el que el piridinilo está opcionalmente sustituido por alcoxi inferior, amino o halógeno; X representa oxígeno; R1 representa hidrógeno, alquilo inferior carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior; R2, R3 y R6 representan hidrógeno; R4 y R5, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R4 y R5 juntos representan metilendioxi; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Description

Furazanobencimidazoles.
La invención está relacionada con nuevos furazanobencimidazoles sustituidos, los procesos para la preparación de los mismos, las composiciones farmacéuticas que los contienen, la utilización de los mismos opcionalmente en combinación con uno o más compuestos distintos farmacéuticamente activos para la terapia de enfermedades neoplásicas y enfermedades autoinmunes, y un método para el tratamiento de tales enfermedades.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una de las principales causas de muerte en humanos. Aunque se han desarrollado una serie de fármacos contra las enfermedades neoplásicas y hay disponibles técnicas como la cirugía y la terapia de radiación, aún existe una necesidad de métodos alternativos y mejorados de tratamiento de las enfermedades neoplásicas.
Las enfermedades autoinmunes se asocian con una linfoproliferación anormal como resultado de defectos en la finalización de la activación y crecimiento de los linfocitos. A menudo, tales enfermedades se asocian con la inflamación, como la artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico y similares. El tratamiento de tales enfermedades se centra en los fármacos antiinflamatorios e inmunosupresores que en muchos casos muestran efectos secundarios severos. Por lo tanto, existe una necesidad de fármacos alternativos con una nueva vía de acción que muestren menos efectos secundarios.
Apoptosis es un término utilizado para describir una serie de sucesos celulares que ocurren para desencadenar la muerte celular programada. Existen varias vías apoptóticas, algunas de las cuales se han caracterizado, mientras otras aún estar por definir. Si el balance entre la división celular y la apoptosis se altera pueden aparecer enfermedades potencialmente mortales, lo que incluye el cáncer, los trastornos autoinmunes y enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares.
En los últimos años se ha hecho evidente que la muerte celular programada (apoptosis) es tan importante para la salud de un organismo multicelular como la división celular. Mediante las repetidas divisiones y diferenciaciones celulares que ocurren a lo largo del desarrollo o la reparación de tejido, se generan células excesivas o incluso dañinas. Para mantener la homeostasis de los tejidos estas células deben eliminarse o sacrificarse. La delicada interrelación entre el crecimiento celular y la apoptosis en un organismo se refleja en el complejo equilibrio molecular que determina si una célula individual se dirige hacia la división, se detienen en el ciclo celular o sufre una muerte celular programada.
La desregulación de la proliferación celular, o la falta de una muerte celular adecuada, tiene un amplio espectro de implicaciones clínicas. Una serie de enfermedades asociadas con tal desregulación involucran la hiperproliferación, inflamación, remodelación y reparación tisular. Algunos trastornos familiares en esta categoría incluyen los tumores, restenosis, hiperplasia neoíntima, angiogénesis, endometriosis, trastornos linfoproliferativos, patologías relacionadas con el transplante (rechazo de injerto), poliposis, pérdida de la función neural en el caso de la remodelación tisular y similares. Tales células pueden perder su control regulatorio normal de la división celular, y pueden fallar también en el desencadenamiento de una muerte celular apropiada.
Como la apoptosis se inhibe o retrasa en la mayoría de tipos de enfermedades neoplásicas proliferativas, la inducción de apoptosis es una opción para el tratamiento del cáncer, especialmente en los tipos de cáncer que muestran resistencia a la quimioterapia, radiación e inmunoterapia clásicas, (Apoptosis and Cancer Chemotherapy, Hickman y Dive, Ed., Blackwell Publishing, 1999). En las enfermedades y patologías autoinmunes y las relacionadas con el transplante también pueden utilizarse compuestos que inducen la apoptosis para restablecer los procesos de muerte celular normal y así llegar a erradicar los síntomas y poder curar las enfermedades. Otras aplicaciones de los compuestos que inducen apoptosis pueden ser en la restenosis, es decir la acumulación de células de musculatura lisa vascular en las paredes de las arterias, y en infecciones persistentes causadas por un fallo en la eliminación de las células infectadas bacterias y virus. Además, la apoptosis puede inducirse o restablecerse en células epiteliales, en células endoteliales, en células musculares y en otros que hayan perdido contacto con la matriz extracelular. Estas células son capaces potencialmente de colonizar otros órganos y por lo tanto, pueden desarrollar patologías como neoplasias, endometriosis y similares.
A. V. Sergievskii et al., Russian Journal of Organic Chemistry 2001, 37, 717-720 y A. V. Sergievskii et al., Russian Journal of Organic Chemistry 2002, 38, 872-874, describen la síntesis de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilaminas mediante la reacción de 4-aminofurazan-3-carboximidato de metilo con o-fenilendiamina, y la alquilación en N^{1} del núcleo bencimidazol con haluros de alquilo.
La WO 03/066629 (Vertex Pharmaceuticals Inc.) describe un gran número de compuestos heteroarilo útiles como inhibidores de quinasas. También se describen algunas 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilaminas sustituidas en el grupo 3-amino del furazano y en N^{1} del núcleo bencimidazol. Estos compuestos se describen como inhibidores de la GSK-3 y la quinasa LCK, pero no tienen relevancia en la apoptosis y los estados médicos relacionados con ésta.
Resumen de la invención
Los furazanobencimidazoles de fórmula (I) inducen selectivamente la apoptosis en células cancerosas, y pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades neoplásicas y autoinmunes. La invención está relacionada con compuestos de fórmula (I), en particular la utilización de tales compuestos como medicamentos, con los métodos de síntesis de tales compuestos, con las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula (I), con la utilización de un compuesto de fórmula (I) para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades neoplásicas y autoinmunes, y con los métodos de tratamiento de enfermedades neoplásicas y autoinmunes utilizando tales compuestos de fórmula (I) o composiciones farmacéuticas que los contienen.
Descripción detallada de la invención
La invención está relacionada con compuestos de fórmula (I)
1
en los que
R representa fenilo, tienilo o piridinilo
en el que el fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, halógeno y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
y en el que piridinilo está opcionalmente sustituido por un alcoxi inferior, amino o halógeno;
X representa un grupo C=Y, en el que Y representa oxígeno o nitrógeno sustituido por hidroxi o alcoxi inferior;
R^{1} representa hidrógeno, alquilcarbonilo inferior, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R^{2}, R^{3} y R^{6} representan hidrógeno;
R^{4} y R^{5}, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R^{4} y R^{5} juntos representan metilendioxi;
y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos;
o en el que
R representa fenilo o piridinilo
en el que el fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, formilo, ciano, halógeno y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
y en el que piridinilo está opcionalmente sustituido por un alcoxi inferior, amino o halógeno;
X representa oxígeno;
R^{1} representa hidrógeno, alquilcarbonilo inferior, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R^{2}, R^{3} y R^{6} representan hidrógeno;
R^{4} y R^{5}, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R^{4} y R^{5} juntos representan metilendioxi;
y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
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Los términos generales utilizados hasta aquí y de ahora en adelante, preferiblemente, están dentro del contexto de la descripción de los siguientes significados, a menos que se indique de otra manera:
El prefijo "inferior" indica un radical que tiene hasta un máximo de 7 átomos de carbono, siete incluido, especialmente hasta un máximo de 4, cuatro incluido, y los radicales en cuestión pueden ser lineales o ramificados de forma sencilla o múltiple.
Cuando la forma plural se utiliza para compuestos, sales y similares, también significa un compuesto, sal o similar singular.
Los dobles enlaces en principio pueden encontrarse en configuración E- o Z-. Los compuestos de esta invención pueden, por lo tanto, existir como mezclas isoméricas o isómeros únicos. Si no se especifica se engloban ambas formas isoméricas.
Cualquier átomo de carbono asimétrico puede estar presente en configuración (R)-, (S)- o (R,S)-, preferiblemente en configuración (R)- o (S)-. Los compuestos pueden así estar presentes como mezclas de isómeros o como isómeros puros, preferiblemente como diastereómeros enantiómeros puros.
La invención también se refiere a posibles tautómeros de los compuestos de fórmula (I).
El alquilo posee de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 7 átomos de carbono, y es lineal o ramificado. El alquilo es preferiblemente alquilo inferior.
El alquilo inferior posee de 1 a 4 átomos de carbono y es butilo, como n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, propilo, como n-propilo o isopropilo, etilo o metilo. Preferiblemente un alquilo inferior es metilo o etilo.
En el fenilo opcionalmente sustituido, los sustituyentes son preferiblemente alquilo inferior, alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, metilendioxi, halo-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, halo o nitro.
El heterociclilo designa preferiblemente un anillo saturado, parcialmente saturado o insaturado, mono- o bicíclico que contiene de 4 a 10 átomos que comprende uno, dos o tres heteroátomos seleccionados de entre nitrógeno, oxígeno y azufre, que pueden, a menos que se especifique de otra manera, estar unidos por carbono o nitrógeno, en el que un átomo de nitrógeno del anillo puede estar opcionalmente sustituido por un grupo seleccionados de entre alquilo inferior, amino-alquilo inferior, arilo, aril-alquilo inferior y acilo, y un átomo de carbono del anillo puede estar sustituido por alquilo inferior, amino-alquilo inferior, arilo, aril-alquilo inferior, heteroarilo, alcoxi inferior, hidroxi o oxo. Ejemplos de heterociclilo son pirrolidinilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, dioxolanilo y tetrahidropiranilo.
Acilo designa, por ejemplo, alquilcarbonilo, ciclohexilcarbonilo, arilcarbonilo, aril-alquilcarbonilo inferior, o heteroarilcarbonilo. Acilo inferior es preferiblemente alquilcarbonilo inferior, en particular propionilo o acetilo.
Hidroxialquilo es especialmente hidroxi-alquilo inferior, preferiblemente hidroximatilo, 2-hidroxietilo o 2-hidroxi-2-propilo.
Cianoalquilo designa preferiblemente cianometilo y cianoetilo.
Haloalquilo es preferiblemente fluoroalquilo, especialmente trifluorometilo, 3,3,3-trifluoroetilo o pentafluoroetilo.
Halógeno es flúor, cloro, bromo, o yodo.
Alcoxi inferior es especialmente metoxi, etoxi, isopropiloxi o terc-butiloxi.
Cuando X representa un grupo C=Y, en el que Y representa nitrógeno sustituido por hidroxi, éste corresponde a una función oxima. Las oximas y los correspondientes éteres de oxima alquilo (nitrógeno sustituido por alcoxi) pueden estar presentes en la forma E o Z, o como una mezcla de isómeros.
Las sales son especialmente las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula (I).
Tales sales están formadas, por ejemplo, como sales de adición ácida, preferiblemente con ácidos orgánicos o inorgánicos, a partir de compuestos de fórmula (I) con un átomo básico de nitrógeno, especialmente las sales farmacéuticamente aceptables. Los ácidos inorgánicos adecuados son, por ejemplo, ácidos de halógeno, como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados son, por ejemplo, ácidos carboxílico, fosfónico, sulfónico o sulfámico, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, como ácido glutámico o aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido adamantano-carboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinámico, ácido metano- o etanosulfónico, ácido 2-hidroxietano-sulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 1,5-naftaleno-disulfónico, ácido 2-, 3- o 4-metilbencenosulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclohexilsulfámico, ácido N-metil-, N-etil- o N-propil-sulfámico, u otros ácidos protónicos orgánicos, como el ácido ascórbico.
Con el propósito de aislar o purificar también es posible utilizar sales farmacéuticamente inaceptables, por ejemplo picratos o percloratos. Para el uso terapéutico, sólo se emplean sales farmacéuticamente aceptables o compuestos libres (aplicables en forma de preparaciones farmacéuticas), y éstas son por lo tanto preferidas.
En vista de la estrecha relación entre los nuevos compuestos en la forma libre y aquellos en forma de sus sales, incluyendo aquellas sales que pueden utilizarse como intermediarios, por ejemplo en la purificación o identificación de nuevos compuestos, cualquier referencia a los compuestos libres indicados anteriormente o de aquí en adelante se debe entender que se refiere también a las correspondientes sales, como apropiadas y convenientes.
Los compuestos de fórmula (I) poseen propiedades farmacológicas valiosas. La invención también está relacionada con compuestos de fórmula (I) como se han definido anteriormente para su uso como medicamentos.
La eficacia de los compuestos de la invención en la inducción de la apoptosis en las células tumorales puede demostrarse como sigue:
Las actividades fluorescentes relativas de las líneas celulares tumorales adecuadas transfectadas con la proteína verde fluorescente (GFP) se midieron en presencia de compuestos de la invención y de fármacos estándar para tumores, utilizando el método descrito en WO99/35493. Las líneas celulares tumorales adecuadas son A20.2J, un linfoma de células B BALB/c, PB-3c, una línea de mastocitos no tumorogénicos dependiente de IL-3 aislada de la médula ósea de un ratón DBA/2, Jurkat, una línea celular de leucemia aguda de células T humana, K562, una línea celular de leucemia mielogénica crónica humana, HL60, una línea celular de leucemia promielogénica aguda humana, Ramos y Raji, líneas celulares de linfoma de células B humanas, H9 y Hut78, líneas celulares de linfoma de células T humanas, HeLa y KB, líneas celulares de carcinoma de células escamosas humanas, MCF7, SK-BR-3, PC3, HBL-100, SW480, H460 y H1792, líneas celulares de adenocarcinoma y HT-1080 humanas, una línea celular de fibrosarcoma
humano.
Los fármacos estándar preferibles como compuestos para la comparación son: a) antimetabolitos como 5-fluorouracilo (ICN), gemcitabina HCl (Gemzar^{TM}, Eli Lilly), b) agentes alquilantes como oxaliplatino (Eloxantin^{TM}, Sanofi-Synthélabo), dacarbazina (Detimedac^{TM}, Medac), ciclofosfamida (Endoxan^{TM}, Asta) y carboplatino (Paraplatin^{TM}, Bristol-Meyers Squibb), c) inhibidores del ciclo celular como vinorelbina (Navelbine^{TM}, Robapharm), vinblastina (Velbe^{TM}, Eli Lilly), docetaxel (Taxotere^{TM}, Aventis), d) fragmentadores de DNA (inhibidores de la topoisomerasa, intercalantes, fragmentadores de cadena) como doxorubicina HCl (Adriblastin^{TM}, Pharmacia-Upjohn), bleomicina (Asta-Medica), irinotecan (Campto^{TM}, Aventis), etopósido fosfato (Etopophos ^{TM}, Bristol-Meyers Squibb), topotecan HCl, (Hycamtin^{TM}, GlaxoSmithKline), e) mezclas de los mismos, f) compuestos que interfieren con la vía de transducción de señales, como modificadores de la actividad de la caspasa, agonistas y antagonistas de los receptores de la muerte celular, y modificadores de nucleasas, fosfatasas y quinasas como mesilato de imatinib (Gleevec^{TM}, Novartis), dexametasona, acetato de forbol miristato, ciclosporina A, quercetina, tamoxifeno (Alexis Corporation, Suiza).
La apoptosis se determina en un cribaje primario utilizando un lector de placas fluorescente y después en un cribaje secundario utilizando FACS (cribaje celular activado por fluorescencia). Los compuestos que provocan la apoptosis sin efectos secundarios citotóxicos sustanciales se escogen para realizar pruebas posteriores y su caracterización utilizando una combinación de los siguientes ensayos conocidos: A) tinción nuclear con colorante Hoechst 33342 que proporciona información sobre la morfología nuclear y la fragmentación del DNA que son característicos de la apoptosis. B) Ensayo de proliferación con MTS que mide la actividad metabólica de las células. Las células viables son metabólicamente activas mientras que las células con una cadena respiratoria comprometida muestran una actividad reducida en esta prueba. C) Ensayo de unión a anexina V que refleja el contenido de fosfatidilserina de la bicapa lipídica externa de la membrana plasmática. Este evento se considera una característica temprana de la apoptosis. D) Tinción con IP de la distribución del ciclo celular que muestra las alteraciones en la distribución entre las diferentes fases del ciclo celular. Pueden determinarse puntos de detención del ciclo celular. E) Ensayo de proliferación que monitoriza la síntesis de DNA al incorporar bromodesoxiuridina (BrdU). Pueden determinarse directamente efectos inhibitorios sobre el crecimiento/ proliferación. F) La dependencia de la proteinasa de cisteínas y la dependencia de la caspasa se determinan mediante la utilización de inhibidores específicos. Esto proporciona información sobre la posible implicación de proteasas específicas en los mecanismos.
En base a estos estudios, un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la invención muestra eficacia terapéutica especialmente frente a enfermedades neoplásicas y enfermedades autoinmunes. En particular, los compuestos de la invención son activos frente a tumores, por ejemplo neoplasias epiteliales, neoplasias de células escamosas, neoplasias de células basales, papilomas y carcinomas de células de transición, adenomas y adenocarcinomas, neoplasias de anejos y piel, neoplasias mucoepidermoides, neoplasias císticas, neoplasias mucinosas y serosas, neoplasias ductales, lobulares y medulares, neoplasias de células acinares, neoplasias epiteliales complejas, neoplasias gonadales especializadas, paragangliomas y tumores de glomus, nevus y melanomas, tumores del tejido blando y sarcomas, neoplasias fibromatosas, neoplasias mixomatosas, neoplasias lipomatosas, neoplasias miomatosas, neoplasias mezcladas complejas y neoplasias estromales, neoplasias fibroepiteliales, neoplasias de tipo sinovial, neoplasias mesoteliales, neoplasias de células germinales, neoplasias trofoblásticas, mesonefromas, tumores de los vasos sanguíneos, tumores de los vasos linfáticos, neoplasias óseas y condromatosas, tumores de células gigantes, tumores óseos misceláneos, tumores odontogénicos, gliomas, neoplasias neuroepiteliomatosas, meningiomas, tumores de la vaina nerviosa, tumores de células granulares y sarcomas alveolares de partes blandas, linfomas de Hodgkin y no de Hodgkin, otras neoplasias linforeticulares, tumores de células plasmáticas, tumores de mastocitos, enfermedades inmunoproliferativas, leucemias, trastornos mieloproliferativos misceláneos, trastornos linfoproliferativos y síndromes mielodisplásicos.
En particular, un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la invención muestra una eficacia terapéutica especialmente frente a enfermedades neoplásicas sólidas, como neoplasias epiteliales, neoplasias de células escamosas, neoplasias de células basales, papilomas y carcinomas de células de transición, adenomas y adenocarcinomas, neoplasias de anejos y piel, neoplasias mucoepidermoides, neoplasias císticas, neoplasias mucinosas y serosas, neoplasias ductales, lobulares y medulares, neoplasias de células acinares, neoplasias epiteliales complejas, neoplasias gonadales especializadas, paragangliomas y tumores de glomus, nevus y melanomas, tumores del tejido blando y sarcomas, neoplasias fibromatosas, neoplasias mixomatosas, neoplasias lipomatosas, neoplasias miomatosas, neoplasias mezcladas complejas y neoplasias estromales, neoplasias fibroepiteliales, neoplasias de tipo sinovial, neoplasias mesoteliales, neoplasias de células germinales, neoplasias trofoblásticas, mesonefromas, tumores de los vasos sanguíneos, tumores de los vasos linfáticos, neoplasias óseas y condromatosas, tumores de células gigantes, tumores óseos misceláneos, tumores odontogénicos, gliomas, neoplasias neuroepiteliomatosas, meningiomas, tumores de la vaina nerviosa, tumores de células granulares y sarcomas alveolares de partes blandas.
Asimismo, los compuestos de la invención son activos frente a enfermedades autoinmunes, por ejemplo frente a lupus eritematoso sistémico, discoide o subagudo cutáneo, artritis reumatoide, síndrome antifosfolípidos, CREST, esclerosis sistémica progresiva, enfermedad mixta del tejido conectivo (síndrome de Sharp), síndrome de Reiter, artritis juvenil, enfermedad de las aglutininas frías, crioglobulinemia esencial mixta, fiebre reumática, espondilitis anquilosante, poliartritis crónica, miastenia gravis, esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Guillan-Barré, dermatomiositis/ polimiositis, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénico, neutropenia, diabetes mellitus tipo I, tiroiditis (lo que incluye las enfermedades de Hashimoto y Grave), enfermedad de Addison, síndrome poliglandular, pénfigo (vulgar, foliáceo, sebáceo y vegetante), penfigoide bulloso y cicatricial, penfigoide gestacional, epidermólisis bullosa adquirida, enfermedad de IgA lineal, liquen escleroso y atrófico, morbus Duhring, psoriasis vulgar, Guttate, psoriasis pustular generalizada y pustular localizada, vitíligo, alopecia areata, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, todas las formas de glomerulonefritis, hemorragia pulmonar (síndrome de Goodpasture), nefropatía de IgA, anemia perniciosa y gastritis autoinmune, enfermedades inflamatorias intestinales (lo que incluye la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn), enfermedad de Behcet, enfermedad de Celic-Sprue, uveitis autoinmune, miocarditis autoinmune, orquitis granulomatosa, espermatogénesis sin orquitis, fibrosis pulmonar idiopática y secundaria, enfermedades inflamatorias con posibilidad de patogénesis autoinmune, como la pioderma gangrenosa, liquen ruber, sarcoidosis (lo que incluye los tipos Löfgren y cutáneo/ subcutáneo), granuloma anular, reacción inmunológica alérgica de tipo I y tipo IV, asma bronquial, polinosis, dermatitis atópica, de contacto y aérea, vasculitis de los grandes vasos (arteritis de células gigantes y de Takayasu), vasculitis de los vasos medianos (poliarteritis nudosa, enfermedad de Kawasaki), vasculitis de los vasos pequeños (granulomatosis de Wegener, síndrome de Churg Strauss, poliangitis microscópica, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis crioglobulinémica esencial, angiitis leucoclástica cutánea), síndrome de hipersensibilidad, necrólisis epidérmica tóxica (síndrome de Stevens-Johnson, eritema multiforme), enfermedades debidas a efectos secundarios de fármacos, todas las formas de efectos cutáneos, específicos de órgano y sistémicos debidos a formas inmunológicas de reacción de tipo I-VI (clasificación de Coombs), patologías relacionadas con el transplante, como la enfermedad de injerto contra huésped y de huésped contra injerto aguda y crónica, que involucra todos los órganos (piel, corazón, riñón, médula ósea, ojo, hígado, bazo, pulmón, músculo, sistema nervioso central y periférico, tejido conectivo, hueso, vasos sanguíneos y linfáticos, sistema genitourinario, oído, cartílago, sistema linfático primario y secundario, lo que incluye la médula ósea, nódulos linfáticos, timo, tracto gastrointestinal, lo que incluye la orofaringe, esófago, estómago, intestino delgado, colon y recto, lo que incluye las partes de los órganos anteriormente mencionados hasta el nivel de una única célula y subestructuras, por ejemplo las células madre).
Un compuesto de fórmula (I) puede administrarse solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos distintos, y la posible terapia de combinación puede realizarse en combinaciones fijadas, o en administración de un compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos distintos pueden administrarse de forma irregular o independientemente el uno del otro, o en administración combinada de combinaciones fijadas y uno o más agentes terapéuticos distintos. Un compuesto de fórmula (I) puede administrarse, además, especialmente para una terapia tumoral en combinación con la quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, intervención quirúrgica o una combinación de éstas. La terapia a largo plazo es igualmente posible como lo es la terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, como se ha descrito anteriormente. Otros posibles tratamientos son la terapia de mantenimiento del estado del paciente tras una regresión tumoral, o incluso la terapia quimiopreventiva, por ejemplo en pacientes de riesgo. Particularmente preferible es la utilización de los compuestos de fórmula (I) en combinación con la radioterapia.
Los agentes terapéuticos para su posible combinación son especialmente uno o más compuestos citostáticos o citotóxicos, por ejemplo un agente quimioterapéutico o varios seleccionados de entre el grupo que comprende la indarubicina, citarabina, interferón, hidroxiurea, bisulfan o un inhibidor de la biosíntesis de poliaminas, un inhibidor de las quinasas de proteínas, especialmente de las serina/ treonina-quinasas de proteínas, como la quinasa de proteínas C, o de las proteínas de quinasas de tirosina, como la tirosina-quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, una citoquina, un regulador negativo del crecimiento, como TGF-\beta o IFN-\beta, un inhibidor de la aromatasa, un citostático clásico, un inhibidor de la interacción de un dominio SH2 con una proteína fosforilada, un inhibidor de Bcl-2 y moduladores de los miembros de la familia Bcl-2 como las proteínas Bax, Bid, Bad, Bim, Nip3 y sólo BH3.
Un compuesto de acuerdo con la invención no es sólo para el tratamiento (profiláctico y preferiblemente terapéutico) de humanos, sino también para el tratamiento de otros animales de sangre caliente, por ejemplo de los animales útiles comercialmente, por ejemplo roedores, como los ratones, conejos o ratas, o conejillos de Indias. Tal compuesto también puede utilizarse como estándar de referencia en los sistemas de prueba descritos anteriormente que permita una comparación con otros compuestos.
En los grupos de compuestos de fórmula (I) preferibles mencionados a continuación, pueden utilizarse las definiciones de los sustituyentes de las definiciones generales mencionadas anteriormente de forma razonable, por ejemplo, para reemplazar definiciones más generales por definiciones más específicas o especialmente por definiciones que se caracterizan por ser preferibles.
En particular, la invención está relacionada con compuestos de fórmula (I) en el que R^{1} representa ciano-alquilo inferior; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Más particularmente la invención está relacionada con compuestos de fórmula (I) en el que R es fenilo o piridilo; R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, y R^{6} representan hidrógeno; y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Más preferiblemente, la invención está relacionada con los compuestos de los Ejemplos y sales farmacéuticamente aceptables, especialmente con los compuestos
4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina;
4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina oxima;
metiléter de 4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina oxima;
4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
metiléter de 4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
metiléter de 4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
4-[1-(4-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
4-[1-(4-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
4-[1-(3-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
4-[1-(3-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
metiléter de 4-[1-(3-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
4-[1-(4-fenilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
4-[1-(4-fenilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
metiléter de 4-[1-(4-fenilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima; y
4-[1-(2,4-diclorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina; y con sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
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Más preferibles son los compuestos de fórmula (I) en los que
R representa fenilo, tienilo o piridinilo
en el que fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, ciano, halógeno, y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
y en el que piridinilo está opcionalmente sustituido por alcoxi inferior, amino o halógeno;
X representa un grupo C=Y, en el que Y representa oxígeno o nitrógeno sustituido por hidroxi o alcoxi inferior;
R^{1} representa hidrógeno, alquilcarbonilo inferior, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R^{2}, R^{3} y R^{6} representan hidrógeno;
R^{4} y R^{5}, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R^{4} y R^{5} juntos representan metilendioxi;
y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
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Altamente preferibles son los compuestos de fórmula (I) en los que
R representa fenilo o piridinilo
en el que fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, formilo, ciano, halógeno, y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
y en el que piridinilo está opcionalmente sustituido por alcoxi inferior, amino o halógeno;
X representa oxígeno;
R^{1} representa hidrógeno, alquilcarbonilo inferior, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
R^{2}, R^{3} y R^{6} representan hidrógeno;
y R^{5}, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior;
o R^{4} y R^{5} juntos representan metilendioxi;
y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
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Otros compuestos preferibles que se tienen en consideración son los compuestos de fórmula (I) en el que
R representa fenilo o piridinilo
en el que fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, formilo, ciano, halógeno, y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
y en el que piridinilo está opcionalmente sustituido por alcoxi inferior, amino o halógeno;
X representa oxígeno;
R^{1} representa ciano-alquilo inferior;
R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} representan hidrógeno;
y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
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Más preferibles son los compuestos seleccionados de entre el grupo que consiste en
4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
4-[1-(3-metoxi-4-metoximatoxi-fenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
4-[1-(4-aminofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
4-(1-(4-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
4-[1-(3,4-dimetilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
4-[1-(4-etilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
4-[1-(6-cloro-3-piridil-carbonilmetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
4-[1-(6-amino-3-piridil-carbonilmetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina; y
4-[1-(6-amino-3-piridil-carbonilmetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
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Especialmente, la invención está relacionada con compuestos descritos anteriormente para su uso como medicamentos.
La invención también está relacionada con la utilización de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto para la preparación de un composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, autoinmune, patología relacionada con el trasplante y/o enfermedad degenerativa, en particular para el tratamiento de una enfermedad neoplásica sólida.
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Método de preparación
Un compuesto de la invención puede prepararse mediante los procesos que, aunque no se apliquen aún para los nuevos compuestos de la presente invención, son conocidos per se, en particular
A) un proceso, en el que un compuesto de fórmula (II)
2
en el que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen la misma definición que en la fórmula (I), o un derivado de los mismos con grupos funcionales en la forma protegida y/o una sal de los mismos, es alquilado con un agente alquilante de fórmula (III)
(III)R-X-CH_{2}-Z
en el que R es como se ha definido para la fórmula (I), X es CO y Z es un grupo saliente nucleofílico; o
B) un proceso, en el que un compuesto de fórmula (II) en el que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} tienen la misma definición que en la fórmula (I), o un derivado de los mismos con grupos funcionales en su forma protegida y/o una sal de los mismos, se alquila con una mezcla de un compuesto de tipo dihalometano de fórmula Z^{1}-CH_{2}-Z^{2} (IV), en el que Z^{1} y Z^{2} son grupos salientes, y un compuesto de fórmula R-XH (V), en el que R tiene la misma definición que en la fórmula (I) y X es oxígeno;
se elimina cualquier grupo protector en un derivado protegido de un compuesto de fórmula (I);
y, si se desea, un compuesto obtenible de fórmula (I) se convierte en otro compuesto de fórmula (I), un compuesto libre de fórmula (I) se convierte en una sal, una sal obtenible de un compuesto de fórmula (I) se convierte en el compuesto libre u otra sal, y/o una mezcla de compuestos isoméricos de fórmula (I) se separan en los isómeros individuales.
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Los grupos salientes nucleofílicos Z adecuados en un agente alquilante de fórmula (III) son por ejemplo haluros, por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro, o sulfonatos, por ejemplo, ésteres aromáticos del ácido sulfónico como bencenosulfonatos, p-toluenosulfonatos o p-nitrobencenosulfonatos, o también metanosulfonato o trifluormetanosulfonato. También se consideran otros grupos salientes usuales, por ejemplo, sales de amonio, azidas, sales de diazonio, di(p-toluenosulfonil)-aminas, nitratos, sales de oxonio, sales de sulfonio o sales de fosfonio. Grupos salientes nucleofílicos Z^{1} y Z^{2} adecuados en un compuesto de tipo dihalometano de fórmula (IV) son aquellos mencionados anteriormente, en particular cloro, bromo y yodo.
La alquilación de un compuesto de fórmula (II) con un agente alquilante de fórmula (III) se realiza de una forma conocida per se, normalmente en presencia de un solvente adecuado polar o dipolar aprótico, con frío o calor, por ejemplo en un rango de temperatura de aproximadamente -30ºC a aproximadamente +150ºC, especialmente entre alrededor de 0ºC y aproximadamente temperatura ambiente. Opcionalmente se añade una base adecuada, en particular una base amina terciaria como trietilamina o diisopropiletilamina, o una sal básica inorgánica, por ejemplo, carbonato potásico o sódico.
La mezcla de alquilación de un compuesto de fórmula (II) y de un compuesto de fórmula (V) con un compuesto de tipo dihalometano de fórmula (IV) se realizó en presencia de un solvente aprótico polar o dipolar adecuado, con frío o calor, por ejemplo en un rango de temperatura de aproximadamente -30ºC a aproximadamente +150ºC, especialmente entre alrededor de 0ºC y aproximadamente temperatura ambiente. Las bases adecuadas utilizadas en esta reacción son por ejemplo carbonato potásico o sódico.
Si uno o más grupos funcionales, por ejemplo carboxi, hidroxi o amino, están o necesitan estar protegidos en un compuesto de fórmula (II), (III) o (V), debido a que no toman parte en la reacción, se utilizan los grupos protectores que normalmente se utilizan en la síntesis de amidas, en particular compuestos peptídicos, cefalosporinas, penicilinas, derivados de ácidos nucleicos y azúcares.
Los grupos protectores pueden estar ya presentes en los precursores y deben protegerse los grupos funcionales relacionados frente a reacciones secundarias no deseadas, como alquilaciones, acilaciones, eterificaciones, esterificaciones, oxidaciones, solvolisis, y reacciones similares. Es una característica de los grupos protectores que se prestan fácilmente a su eliminación, es decir, sin reacciones secundarias no deseadas, normalmente mediante solvólisis, reducción, fotólisis o también mediante actividad enzimática, por ejemplo bajo condiciones análogas a las condiciones fisiológicas, y que no están presentes en los productos finales. El especialista sabe, o puede establecer fácilmente, qué grupos protectores son adecuados para las reacciones mencionadas anteriormente y de ahora en adelante.
La protección de tales grupos funcionales mediante tales grupos protectores, los grupos protectores en sí, y sus reacciones de eliminación se describen por ejemplo en los libros de referencia estándar para la síntesis de péptidos, y en especial en libros sobre grupos protectores como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London y New York 1973, en "Methoden der organischen Chemie" (Métodos de química orgánica), Houben-Weilo, 4ª edición, Volumen 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, y en T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York.
En los pasos adicionales del proceso, llevados a cabo como se desee, los grupos funcionales de los compuestos de partida que no toman parte en la reacción pueden estar presentes en su forma no protegida o pueden estar protegidos, por ejemplo por uno o más grupos protectores mencionados anteriormente en "grupos protectores". Los grupos protectores se eliminan total o parcialmente de acuerdo con uno de los métodos descritos allí.
En la conversión de un compuesto obtenible de fórmula (I) en otro compuesto de fórmula (I), X con el significado C=Y en el que Y es oxígeno puede, por ejemplo, reaccionar con una hidroxilamina opcionalmente O-sustituida para proporcionar la correspondiente oxima o éter de oxima de fórmula (I) en el que X es C=Y e Y es nitrógeno sustituido por hidroxi o alcoxi.
Un compuesto obtenible de fórmula (I), en el que R^{1} y/o R^{2} es hidrógeno, puede alquilarse o acilarse con un compuesto de fórmula R^{1}-Z o R^{2}-Z, respectivamente, en el que Z es un grupo saliente nucleofílico como se ha descrito antes, para proporcionar un compuesto de fórmula (I), en el que R^{1} y/o R^{2} es diferente de hidrógeno. Las condiciones de acilación preferidas incluyen la utilización de anhídridos ácidos y cloruros de ácido a elevadas temperaturas, normalmente en un rango de aproximadamente +30ºC a aproximadamente +150ºC. Se puede utilizar un catalizador ácido o básico si se desea. Un compuesto de fórmula (I) en el que R^{1} y/o R^{2} es alquilo puede obtenerse mediante alquilación del compuesto parental de fórmula (I). Las condiciones normales de reacción que permiten esta transformación incluyen la combinación de una base fuerte, como un hidruro metálico o un alcoholato metálico, y un compuesto de fórmula R^{1}-Z o R^{2}-Z.
Otros grupos amino presentes en un grupo arilo o heteroarilo R o en uno de los sustituyentes R^{3}, R^{4}, R^{5} o R^{6} pueden transformarse en otro nitrógeno que contiene sustituyentes bajo condiciones conocidas en la materia. Por ejemplo, la alquilación en el nitrógeno puede realizarse con un aldehído bajo condiciones reductoras. Para la acilación, es preferible el correspondiente cloruro de acilo (Z = Cl). Alternativamente, se puede utilizar un anhídrido ácido, o se puede lograr la acilación con el ácido libre (Z = OH) bajo las condiciones utilizadas para la formación de amida conocidas per se en la química de péptidos, por ejemplo, con agentes activadores del grupo carboxi, como 1-hidroxi-benzotriazol, opcionalmente en presencia de catalizadores o co-reactivos adecuados.
Los compuestos de fórmula (I) en los que X = NOH pueden alquilarse permitiendo el acceso al correspondiente éter de oxima. Las condiciones de reacción que derivan en esta transformación incluyen combinaciones de bases débiles y agentes alquilantes. Las bases típicas incluyen carbonatos o bicarbonatos metálicos.
La reducción de un grupo nitro en un grupo arilo o heteroarilo R nitro-sustituido o en uno de los sustituyentes R^{3}, R^{4}, R^{5} o R^{6} para proporcionar el correspondiente grupo amino se realiza, por ejemplo, con polvo de hierro en alcohol o con otros agentes reductores.
Un grupo carboxi en un grupo arilo o heteroarilo R carboxi-sustituido o un uno de los sustituyentes R^{3}, R^{4}, R^{5} o R^{6} puede ser amidado bajo las condiciones utilizadas para la formación de amida conocidas per se en la química de péptidos, por ejemplo, con la correspondiente amina y un agente activador del grupo carboxi, como 1-hidroxi-benzotriazol, opcionalmente en presencia de catalizadores o co-reactivos adecuados.
Puede sustituirse un sustituyente bromo o yodo en un grupo arilo o heteroarilo R o uno de los sustituyentes R^{3}, R^{4}, R^{5} o R^{6} por fenilo o un derivado de fenilo mediante la reacción con un ácido fenilborónico adecuado en una reacción de Suzuki, preferiblemente en un solvente aprótico dipolar como dimetilformamida, o en un éter polar, por ejemplo, tetrahidrofurano o dimetoxietano, en presencia de paladio(0) soluble o catalizador metálico relacionado, por ejemplo tetrakis-(trifenilfosfina)paladio.
Las sales de un compuesto de fórmula (I) con un grupo formador de sales puede prepararse de una forma conocida per se. Las sales de adición ácida de compuestos de fórmula (I) pueden así obtenerse mediante el tratamiento con un ácido o con un reactivo de intercambio de aniones adecuado.
Las sales normalmente pueden convertirse en compuestos libres, por ejemplo, mediante el tratamiento con agentes básicos adecuados, por ejemplo con carbonatos alcalino metálicos, hidrogenocarbonatos alcalinometálicos, o hidróxidos alcalinometálicos, normalmente carbonato potásico o hidróxido de sodio.
Se debe remarcar que las reacciones análogas a las conversiones mencionadas en este capítulo pueden también tener lugar a nivel del intermediario apropiado.
Todos los pasos del proceso descritos aquí pueden llevarse a cabo bajo condiciones de reacción conocidas, preferiblemente bajo aquellas mencionadas específicamente, en ausencia o normalmente en presencia de solventes o diluyentes, preferiblemente los que son inertes para los reactivos utilizados y capaces de disolverlos, en ausencia o presencia de catalizadores, agentes condensadores o agentes neutralizadores, por ejemplo intercambiadores de iones, normalmente intercambiadores de cationes, por ejemplo en forma de H+, dependiendo del tipo de reacción y/o reactantes a temperatura reducida, normal, o elevada, por ejemplo en el rango de -100ºC a alrededor de 190ºC, preferiblemente entre alrededor de -80ºC a alrededor de 150ºC, por ejemplo entre -80 y +60ºC, entre -20 y +40ºC, a temperatura ambiente, o en el punto de ebullición del solvente utilizado, bajo presión atmosférica o en un recipiente cerrado, cuando sea apropiado bajo presión, y/o en una atmósfera inerte, por ejemplo bajo argón o nitrógeno.
Las sales pueden estar presentes en todos los compuestos de partida y transitorios, si éstos contienen grupos formadores de sales. Las sales también pueden estar presentes durante la reacción de tales compuestos, siempre que no se interrumpa la reacción.
En todas las etapas de la reacción, pueden separarse las mezclas isoméricas aparecidas en sus isómeros individuales, por ejemplo, diastereómeros o enantiómeros, o en cualquier mezcla de isómeros, por ejemplo, racematos o mezclas diastereoméricas.
La invención se refiere también a aquellas formas del proceso en las que se comienza a partir de un compuesto obtenible en cualquier etapa como un compuesto transitorio y llevan a cabo los pasos omitidos, o interrumpe el proceso en cualquier etapa, o forma un material de partida bajo las condiciones de reacción, o utiliza dicho material de partida en forma de un derivado de reactivo o sal, o produce un compuesto obtenible mediante el proceso de acuerdo con la invención y continúa el procesado de dicho compuesto in situ. En la realización preferida, se empieza a partir de aquellos materiales de partida que producen los compuestos descritos hasta aquí como preferibles, particularmente como especialmente preferibles, preferibles en primer lugar, y/o preferibles sobre cualquier otro.
En la realización preferida, un compuesto de fórmula (I) se prepara de acuerdo con, o en analogía a, los procesos y pasos de procesos definidos en los Ejemplos.
Los compuestos de fórmula (I), incluyendo sus sales, son también obtenibles en forma de hidratos, o sus cristales pueden incluir por ejemplo el solvente utilizado para la cristalización, es decir, estar presentes como solvatos.
Los nuevos materiales de partida y/o intermediarios, así como los procesos para la preparación de los mismos, se describen de forma similar. En la realización preferida, se utilizan tales materiales de partida y las condiciones se seleccionan para permitir la obtención de los compuestos preferibles.
Los materiales de partida de fórmula (II), (III), (IV) y (V) son conocidos, están disponibles comercialmente, o pueden sintetizarse en analogía a o según los métodos que son conocidos en la materia.
Preparaciones farmacéuticas, métodos y su utilización
La presente invención está relacionada también con las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I) como ingrediente activo y que pueden utilizarse especialmente en el tratamiento de las enfermedades mencionadas al principio. Son especialmente preferibles las composiciones para su administración enteral, como nasal, bucal, rectal o, especialmente, administración oral, y para su administración parenteral, como la intravenosa, intramuscular o administración subcutánea, para animales de sangre caliente, especialmente humanos. Las composiciones comprenden sólo el ingrediente activo o, preferiblemente, junto a un transportador farmacéuticamente aceptable. La dosificación del ingrediente activo depende de la enfermedad a tratar y de las especies, su edad, peso, y condición individual, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración.
La presente invención está relacionada especialmente con las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I), un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable, o un hidrato o solvato de los mismos, y al menos, un transportador farmacéuticamente aceptable.
La invención está relacionada también con las composiciones farmacéuticas para su utilización en un método para la prevención o especialmente para el manejo terapéutico del cuerpo humano o animal, en particular en un método para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, enfermedades autoinmunes, patologías relacionadas con el trasplante y/o enfermedades degenerativas, especialmente aquellas mencionadas anteriormente.
La invención está relacionada también con los procesos y con la utilización de estos compuestos de fórmula (I) para la obtención de preparaciones farmacéuticas que comprenden compuestos de fórmula (I) como componente activo (ingrediente activo).
Una composición farmacéutica para la prevención o especialmente para el manejo terapéutico de enfermedades neoplásicas, enfermedades autoinmunes, patologías relacionadas con el trasplante y/o enfermedades degenerativas de un animal de sangre caliente, especialmente un humano o un mamífero comercialmente útil que necesite dicho tratamiento, que comprende un nuevo compuesto de fórmula (I) como ingrediente activo en una cantidad que es profilácticamente, o especialmente, terapéuticamente activa frente a dichas enfermedades, es asimismo preferible.
Las composiciones farmacéuticas comprenden entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 95% de ingrediente activo, las formas de administración de dosis única comprendidas en la realización preferida entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 90% del ingrediente activo y las formas que no son del tipo de dosis única comprendidas en la realización preferida entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 20% del ingrediente activo. Las formas de dosis unitarias son, por ejemplo, los comprimidos recubiertos y no recubiertos, ampollas, viales, supositorios o cápsulas. Otras formas de dosificación son, por ejemplo, ungüentos, cremas, pastas, espumas, tinturas, pintalabios, gotas, pulverizadores, dispersiones, etc. Un ejemplo son las cápsulas que contienen entre alrededor de 0,05 g y alrededor de 1,0 g de ingrediente activo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan de forma conocida per se, por ejemplo mediante los procesos convencionales de mezclado, granulación, recubrimiento, disolución o liofilización.
Es preferente la utilización de soluciones del ingrediente activo, y también de suspensiones o dispersiones, especialmente soluciones acuosas isotónicas, dispersiones o suspensiones que, por ejemplo en el caso de composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un transportador, por ejemplo manitol, pueden reconstituirse antes de su uso. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsificantes, solubilizantes, sales para la regulación de la presión osmótica y/o tampones y se preparan de forma conocida per se, por ejemplo mediante los procesos convencionales de disolución y liofilización. Dichas soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que aumentan la viscosidad, típicamente carboximetilcelulosa sódica, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona, o gelatinas, o también solubilizantes, por ejemplo Tween 80® (polioxietileno(20)sorbitan mono-oleato).
Las suspensiones en aceite comprenden como componente oleoso los típicos aceites vegetales, sintéticos o semisintéticos para inyección. Respecto a ellos, debe hacerse mención especial de los ésteres de ácidos grasos líquidos que contienen como componente ácido un ácido graso de cadena larga con de 8 a 22, especialmente de 12 a 22 átomos de carbono. El componente alcohol de estos ésteres de ácidos grasos tiene un máximo de 6 átomos de carbono y es un alcohol monovalente o polivalente, por ejemplo mono-, di- o trivalente, especialmente glicol y glicerol. Son especialmente útiles las mezclas de ésteres de ácidos grasos, aceites vegetales como el aceite de semilla de algodón, aceite de almendra, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de sésamo, aceite de semilla de soja y aceite de cacahuete.
La elaboración de preparaciones inyectables se realiza normalmente bajo condiciones de esterilidad, así como el rellenado, por ejemplo, de ampollas o viales, y el sellado de los contenedores.
Los transportadores adecuados son especialmente los rellenos, como azúcares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa, y/o fosfatos de calcio, por ejemplo fosfato tricálcico o hidrógeno fosfato cálcico, y también aglutinantes, como los almidones, por ejemplo almidón de maíz, trigo, arroz o patata, metilcelulosa, metilcelulosa hidroxipropilo, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona, y/o si se desea, de-sintegrantes, como los anteriormente mencionados almidones, también almidón carboximetilo, polivinilpirrolidona entrelazada, ácido algínico o una sal del mismo, como el alginato sódico. Excipientes adicionales son especialmente los acondicionadores de flujo y lubricantes, por ejemplo el ácido silícico, talco, ácido esteárico o sales de los mismos, como el estearato de magnesio o calcio, y/o polietilenglicol, o derivados de los mismos.
Los núcleos de los comprimidos pueden proporcionarse con recubrimientos adecuados, opcionalmente entéricos, mediante el uso de, entre otros, soluciones concentradas de azúcares que pueden comprender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, o soluciones de recubrimiento en solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes, o, para la preparación de recubrimientos entéricos, soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas, como el ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de los comprimidos, por ejemplo con el propósito de su identificación o para indicar diferentes dosis de ingrediente activo.
Las composiciones farmacéuticas para su administración oral también incluyen las cápsulas duras que consisten en gelatina, y también cápsulas blandas, selladas que consisten en gelatina y un plastificante, como el glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener el ingrediente activo en forma de gránulos, por ejemplo en una mezcla con los rellenos, como almidón de maíz, aglutinantes, y/o deslizantes, como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente estabilizantes. En las cápsulas blandas, el ingrediente activo se disuelve o suspende preferiblemente en excipientes líquidos adecuados, como los aceites grasos, aceite de parafina o polietilenglicoles líquidos o ésteres de ácidos grasos de etilen- o propilenglicol, a los que también pueden añadirse estabilizantes y detergentes, por ejemplo de tipo éster del ácido graso polioxietilen sorbitan.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración rectal son, por ejemplo, los supositorios que consisten en una combinación del ingrediente activo y una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos, hidrocarburos de parafina, polietilenglicoles o alcanoles superiores.
Para la administración parenteral, son especialmente adecuadas las soluciones acuosas de un ingrediente activo en forma hidrosoluble, por ejemplo de una sal hidrosoluble, o suspensiones acuosas para inyección que contienen sustancias que aumentan la viscosidad, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano, y si se desea, estabilizantes. El ingrediente activo, opcionalmente junto con los excipientes, puede estar también en forma de un liofilizado y puede reconstituirse la solución antes de su administración parenteral mediante la adición del solvente adecuado.
Las soluciones que se utilizan, por ejemplo, para su administración parenteral también pueden utilizarse como soluciones para infusión.
Los conservantes preferibles son, por ejemplo, los antioxidantes, como el ácido ascórbico o microbicidas, como el ácido sórbico o ácido benzoico.
La presente invención está relacionada además con un método para el tratamiento de una enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, patología relacionada con el transplante y/o enfermedad degenerativa, que comprende la administración de un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que los radicales y símbolos tienen los significados que se han definido anteriormente para la fórmula (I), en una cantidad efectiva frente a dicha enfermedad, a un animal de sangre caliente que requiere tal tratamiento. Los compuestos de fórmula (I) pueden administrarse como tales o especialmente en forma de composiciones farmacéuticas, de forma profiláctica o terapéutica, preferiblemente en una cantidad efectiva frente a dichas enfermedades, a un animal de sangre caliente, por ejemplo un humano, que requiere tal tratamiento. En el caso de un individuo con un peso corporal de alrededor de 70 kg la dosis diaria administrada es de aproximadamente 0,05 g a aproximadamente 5 g, preferiblemente de aproximadamente 0,25 g a aproximadamente 1,5 g, de un compuesto de la presente invención.
La presente invención está relacionada también especialmente con la utilización de un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, especialmente un compuesto de fórmula (I) que sea preferible, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como tal o en forma de una formulación farmacéutica con al menos un transportador farmacéuticamente aceptable para el tratamiento terapéutico y también profiláctico de una o más de las enfermedades mencionadas anteriormente, en particular una enfermedad neoplásica, enfermedad autoinmune, patología relacionada con el transplante y/o enfermedad degenerativa.
La cantidad de dosis preferible, composición y preparación de las formulaciones farmacéuticas (medicamentos) que deben utilizarse en cada caso se han descrito anteriormente.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención sin limitar el alcance de esta invención.
Ejemplos
Abreviaturas: DMSO = dimetil sulfóxido; THF = tetrahidrofurano, DMAP = N,N-dimetilaminopiridina, DMF = N,N-dimetilformamida, DIPEA = N,N-diisopropil-N-etilamina.
Ejemplo 1 4-(1-Fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina
Se añadió bromuro de fenacilo (0,1 g, 0,49 mmol) a una suspensión eficientemente agitada de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,1 g, 0,4 mmol) [A.V. Sergievskii, O.A. Krasnoshek, S.F. Mel'nikova, I.V.Tselinskii, Russian Journal of Organic Chemistry, 2002, 38, 915-917] y carbonato potásico (0,172 g, 1,24 mmol) en DMF seco (5 ml) a temperatura ambiente. Tras 4 horas la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y la fase orgánica se lavó repetidamente con salmuera. El secado del solvente, el filtrado y la evaporación del solvente bajo presión reducida proporcionó el compuesto del título en su forma bruta. El compuesto del título se obtuvo en su forma pura mediante cromatografía sobre gel de sílice, p.f. 202-204ºC.
Ejemplo 2 4-[1-(4-Bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima
Una mezcla de 4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,083 g, 0,21 mmol, preparado de acuerdo con el Ejemplo 1), bicarbonato sódico (0,021 g, 0,25 mmol) y clorhidrato de hidroxilamina (0,014 g, 0,21 mmol) en etanol (5 ml) se sometió a reflujo durante 20 horas. La repartición de la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua, la separación de la fase orgánica seguido por el secado y la evaporación del solvente proporcionó el producto bruto. La purificación mediante cromatografía sobre gel de sílice proporcionó el compuesto del título como un mezcla E/Z, p.f. 198-201ºC.
Ejemplo de Referencia 3
Metil-{4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il}-amina
Una suspensión de 4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,282 mmol, preparado de acuerdo con el Ejemplo 1), carbonato potásico (0,233 g, 1,69 mmol) y dimetilsulfato (0,142 g, 1,12 mmol) en acetona (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La filtración de los sólidos, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro, p.f. 210-214ºC.
Ejemplo de Referencia 4
Dimetil-{4-[1-(4-clorofena-cil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il}-amina
Una suspensión de 4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,282 mmol), carbonato potásico (0,60 g, 4,22 mmol) y dimetilsulfato (0,50 g, 2,82 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a 60ºC durante 6 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido amarillento, p.f. 120-123ºC.
Ejemplo 5 N-{4-[1-(4-Clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il}-acetamida
Una solución de 4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,05 g, 0,143 mmol), piridina (0,022 g, 0,282 mmol), cloruro de acetilo (0,013 g, 0,169 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP en DMF (5 ml) se agitó a 80ºC durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido amarillento, p.f. 202-205ºC.
Ejemplo 6 4-[1-(4-Clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina
Una suspensión de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina (0,10 g, 0,39 mmol), carbonato potásico (0,08 g, 0,58 mmol) y bromuro de 4-clorofenacilo (0,11 g, 0,47 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido amarillento, p.f. 191-192ºC.
Ejemplo 6a
4-(1H-Bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina
A una solución de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,497 mmol) en piridina (5 ml) se le añadieron secuencialmente a 0ºC sodio en metanol (0,02 g, 0,86 mmol en 1 ml) y acrilonitrilo (0,03 g, 0,39 mmol). La mezcla se agitó durante la noche. La evaporación del solvente bajo presión reducida y la repartición del residuo resultante entre agua y acetato de etilo seguido del secado de la solución orgánica sobre sulfato sódico proporcionó el compuesto del título en forma pura. ^{1}H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): 13,7 (s, 1H); 7,82 (d, 1H); 7,60 (d, 1H); 7,36 (m, 2H); 7,20 (t, 1H); 3,67 (q, 2H); 2,94 (t, 2H).
Ejemplo 7 4-(1-Fenoximetil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina
A una solución de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,497 mmol) se le añadió carbonato potásico (0,172 g, 1,24 mmol) y yodometoxibenceno (0,128 g, 0,546 mmol). La mezcla se agitó durante la noche. La evaporación del solvente bajo presión reducida y la repartición del residuo resultante entre agua y acetato de etilo seguido del secado de la solución orgánica sobre sulfato sódico y la cromatografía del residuo proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro, p.f. 171-173ºC.
Ejemplo 8 4-[1-(4-Fluorofenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina
A una solución de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,497 mmol) se le añadió carbonato potásico (0,172 g, 1,24 mmol) seguido por 4-fluorofenol (0,0557 g, 0,497 mmol) y diyodometano (0,133 g, 0,497 mmol). La mezcla se agitó durante la noche. La evaporación del solvente bajo presión reducida y la repartición del residuo resultante entre agua y acetato de etilo seguido por el secado de la solución orgánica sobre sulfato sódico y la cromatografía del residuo proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro, p.f. 155-158ºC.
Ejemplo de Referencia 9
4-[1-(4-Clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il-furazan-3-il-N-(2-metoxicarboniletil)-amina
Una suspensión de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-metoxicarboniletil)-amina (0,052 g, 0,181 mmol), carbonato potásico (0,062 g, 0,452 mmol) y bromuro de 4-clorofenacilo (0,047 g, 0,199 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido higroscópico con un punto de fusión no definido. ^{1}H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): 8,14 (d, 2H); 7,87 (m, 2H); 7,41 (m, 2H); 7,32 (d, 2H); 7,29 (t, 1 H); 6,37 (s, 2H); 3,63 (m, 2H); 3,61 (s, 3H); 2,76 (t, 2H).
Ejemplo 9a 4-(1-(1H-Bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-metoxicarboniletil)-amina
Una solución de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina (0,05 g, Ejemplo 6a) en metanol saturado con ácido clorhídrico (5 ml) se calentó a reflujo durante 40 minutos. Tras la adición de una gota de agua, el reflujo continuó durante 2 horas. La mezcla se neutralizó utilizando bicarbonato sódico y después se extrajo repetidamente utilizando acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron y se evaporaron hasta la sequedad bajo presión reducida. La trituración con hexano y la filtración proporcionó el compuesto del título en forma pura. ^{1}H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): 13,8 (s, 1 H); 7,80 (m, 1 H); 7,59 (m, 1 H); 7,32 (m, 2H); 7,03 (m, 1H); 3,63 (m, 2H); 3,61 (s, 3H); 2,76 (t, 2H).
Ejemplo 10 4-[1-(3,4-Dimetilfenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina
Una suspensión de 4-(1 H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina (0,15 g, 0,59 mmol, Ejemplo 6a), carbonato potásico (0,325 g, 2,36 mmol), diyodometano (0,16 g, 0,59 mmol) y 3,4-dimetilfenol (0,072 g, 0,59 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 1,6 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido amarillento, p.f. 132-135ºC.
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Ejemplo 11 4-[1-(4-Clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(3-hidroxipropil)-amina
Una suspensión de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(3-hidroxipropil)-amina (0,70 g, 0,27 mmol), carbonato potásico (0,472 g, 3,42 mmol) y bromuro de 4-clorofenacilo (0,069 g, 0,29 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido amarillento, p.f. 166-169ºC.
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Ejemplo 11a
4-(1H-Bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(3-hidroxipropil)-amina
Una solución de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina (0,272 g, 0,947 mmol, Ejemplo 6a) en THF (5 ml) se añadió por goteo a 0ºC a una suspensión eficientemente agitada de LiAlH_{4} (0,054 g, 1,42 mmol) en THF (5 ml). Tras agitar durante 16 horas a temperatura ambiente la mezcla se paró mediante la adición cuidadosa de una solución saturada acuosa de sulfato sódico. La suspensión se filtró y el filtrado se evaporó hasta la sequedad. La cristalización mediante la adición de hexano proporcionó el compuesto del título en forma pura. ^{1}H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): 13,6 (s, 1H); 7,66 (m, 2H); 7,31 (m, 2H); 6,92 (t, 1H); 4,61 (m, 1H); 3,51 (m, 2H); 3,39 (m, 2H); 1,81 (m, 2H).
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Ejemplo de Referencia 12
E-1-[2-(4-Aminofurazan-3-il)-bencimidazol-1-il]-4-fenil-but-3-en-2-ona
Una suspensión de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,275 g, 1,37 mmol), carbonato potásico (0,472 g, 3,42 mmol) y 1-cloro-4-fenil-but-3-en-2-ona (0,297 g, 1,64 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido amarillento, p.f. 176-180ºC.
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Ejemplo 12a 1-Cloro-4-fenil-but-3-en-2-ona
Una mezcla de 1-cloro-3-(trifenilfosfaniliden)-propano-2-ona (2,8 g, 7,9 mmol) y benzaldehído recién destilado (0,7 g, 6,6 mmol) en tolueno (10 ml) se calentó a reflujo durante 20 horas. La evaporación hasta la sequedad proporcionó una mezcla que contenía el compuesto del título que se utilizó en el siguiente paso sin purificación.
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Ejemplo 12b 1-Cloro-3-(trifenilfosfaniliden)-propano-2-ona
Una mezcla de trifenilfosfina (10,0 g, 38,1 mmol) y 1,3-dicloroacetona (4,84 g, 38,1 mmol) en THF (20 ml) se calentó a reflujo durante 4 horas. Después de enfriar, el precipitado resultante se filtró, se lavó con THF y se secó. Al precipitado eficientemente agitado en metanol (20 ml) se le añadió una solución acuosa al 20% de carbonato sódico (2,02 g, 19 mmol) seguido de más agua. El producto resultante se filtró y se secó para proporcionar el producto puro. ^{1}H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): 7,61 (m, 15H); 4,07 (2s, 0,5H cada uno); 3,98 (s, 2H).
Ejemplo de Referencia 13
4-[1-(4-Aminofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-carboxietil)-amina
Una solución de 4-[1-(4-acetaminofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina (0,061 g) en ácido clorhídrico acuoso (5 ml, HCl conc.) se calentó a reflujo durante dos horas. La mezcla se diluyó con agua y se neutralizó mediante la adición de bicarbonato sódico. La extracción con acetato de etilo, el secado sobre sulfato sódico, el filtrado y la evaporación del filtrado resultante hasta la sequedad proporcionó el compuesto del título en forma pura, p.f. 174-177ºC. ^{1}H-RMN (400 MHz, d6-DMSO): 12,40 (s, 1H); 7,84 (m, 4H); 7,38 (m, 3H); 6,65 (m, 2H); 6,28 (S, 2H); 6,17 (s, 2H); 3,57 (m, 2H); 2,66 (t, 2H).
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Ejemplo 14 4-[1-(3-Amino-4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina
A una solución agitada de 4-[1-(4-cloro-3-nitro-fenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,07 g, 0,175 mmol) en etanol (6 ml) y agua (1 ml) se le añadieron dos gotas de ácido clorhídrico concentrado y polvo de hierro (0,1 g, 17,5 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante 8 horas. La filtración y la evaporación a presión reducida proporcionó el producto bruto. La purificación mediante extracción con acetato de etilo y la cromatografía sobre gel de sílice proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro, p.f. 228-230ºC.
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Ejemplo 14a
4-[1-(4-Cloro-3-nitrofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina
Una suspensión de 4-(1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina (0,228 g, 1,14 mmol), carbonato potásico (0,40 g, 2,85 mmol) y bromuro de 4-cloro-3-nitrofenacilo (0,35 g, 1,25 mmol) en DMF (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico, la concentración del filtrado bajo presión reducida y la cromatografía del residuo sobre gel de sílice utilizando hexano-acetato de etilo como eluyente proporcionó el compuesto del título como un sólido, p.f. 198-200ºC. (Este compuesto también está referido como Ejemplo 66 en la Tabla 1).
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Ejemplo 15 4-[1-(3-Metoxi-4-metoximatoxi-fenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina
Una mezcla de 4-[1-(3-metoxi-4-hidroxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (0,10 g, 0,27 mmol), DIPEA y cloruro de metoximetilo en DMF seco se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato sódico. La filtración del sulfato sódico y concentración del filtrado bajo presión reducida proporcionó el compuesto del título como un sólido incoloro puro, p.f. 190ºC.
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Ejemplo 15a
4-[1-(3-Metoxi-4-hidroxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina
A una solución de 4-[1-(3-metoxi-4-benciloxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina (1,00 g) en THF (20 ml) se le añadió paladio sobre carbono (10%, 0,2 g). La mezcla se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 1 hora. El catalizador se filtró y el filtrado se evaporó hasta la sequedad para proporcionar el compuesto del título en forma pura, p.f. 265ºC. (Este compuesto también está referido como Ejemplo 74 en la Tabla 1). Los siguientes compuestos se prepararon en analogía a los Ejemplos 1-15:
TABLA 1
3
TABLA 1 (continuación)
4
TABLA 1 (continuación)
5
TABLA 1 (continuación)
6
TABLA 1 (continuación)
7
TABLA 1 (continuación)
8
TABLA 1 (continuación)
9
TABLA 2
10
TABLA 2 (continuación)
11
TABLA 3
12
TABLA 4
13 
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Los siguientes compuestos de WO 03/066629 se prepararon para comparación de su actividad en analogía a los ejemplos descritos hasta aquí:
TABLA 5
14
Métodos generales para probar los compuestos de la invención Ejemplo 121 Cultivos celulares y líneas celulares
Las líneas celulares se cultivaron en medio de cultivo de tejidos RPMI-1640 que contiene un 5% o un 10% de suero fetal bovino, 2-mercaptoetanol 0,05 mM, glutamina 2 mM y penicilina/ estreptomicina 50 \mug/ml (medio completo) (Sigma, Buchs, Suiza). Las condiciones de crecimiento generales son 37ºC y 7,5% de CO_{2}.
Se utilizaron las siguientes líneas celulares de ratón (transfectadas con EGFP o no): A20.2J (ATCC: TIB-208), MC57G (ATCC: CRL-2295).
Se utilizaron las siguientes líneas celulares humanas (transfectadas con EGFP o no): HeLa (ATCC: CCL-2), KB (ATCC: CCL- 17), MCF7 (ATCC: HTB-22), SK-BR-3 (ATCC: HTB-30), SK-Mel 1 (ATCC: HTB-67), SK-Mel 28 (ATCC: HTB-72), PC- 3 (ATCC: CRL-1435), SW480 (ATCC; CCL-228), NCI-H460 (ATCC: HTB-177), NCI-H1792 (ATCC: CRL-5895), HT1080 (ATCC: CCL-21), Jurkat (ATCC: TIB-152), Ramos (ATCC: CRL-1596), Raji (ATCC: CCL-86), H9 (ATCC: HTB-176), Hut78 (ATCC: TIB-161), K562 (ATCC: CCL 243), HL-60 (ATCC: CCL 240), U-87MG (ATCC: HTB-14), HepG2 (ATCC: HB-8065), U-2 OS (ATCC: HTB-96), Saos-2 (ATCC: HTB-85), U937 (ATCC: CRL 1593), Hs 578T (ATCC: HTB 126), HBL-100 (ATCC: HTB 124), Molt-4 (ATCC: CRL 1582).
Ejemplo 122 Configuración primaria de cribado
Todas las manipulaciones se realizaron bajo condiciones estériles. Los ensayos se realizaron en placas microtituladas de fondo plano y trasparente de 96 o 384 pocillos disponibles comercialmente (Greiner, Alemania) respectivamente, que son adecuadas para las técnicas de cultivo de tejidos. Se sembró en placa un número determinado de células de prueba adherentes transfectadas con EGFP (placas de 96 pocillos: 10^{4}-10^{5}, placas de 384 pocillos: 1500 -
2*10^{4}) hasta 24 h antes del tratamiento en 75 \mul (placas de 96 pocillos) o 60 \mul (placas de 384 pocillos) de medio completo por pocillo para asegurar una expansión apropiada de las células. Para este propósito, se utilizó una bomba peristáltica (por ejemplo, Multidrop de Thermo-Labsystems, Finlandia) u otro dispositivo adecuado. Las células en suspensión se sembraron en placa de acuerdo con el mismo procedimiento pero 1 h antes del tratamiento. Entre la siembra y el tratamiento o la adición de compuestos, las células se incubaron a 37ºC bajo un 7,5% de CO_{2}. Posteriormente, los compuestos bajo investigación se añadieron a unas concentraciones concretas (40 - 80 \muM en 25 \mul (placas de 96 pocillos) o 20 \mul (placas de 384 pocillos) de medio completo que contiene un máximo de 4% de DMSO) con un dispositivo apropiado (por ejemplo, un sistema de manipulación de líquidos, pipeta multicanal etc.) resultando en una concentración final en los pocillos de prueba de 10-20 \muM de compuesto en un en máximo de un 1% de DMSO.
Inmediatamente tras la adición de los compuestos a las células, se determinó el valor de fluorescencia cero, (t = 0 h) utilizando un lector de fluorescencia de placas para poder normalizar las actividades de fluorescencia. Tras ello, las placas se incubaron durante un total de 48 h a 37ºC bajo un 7,5% de CO_{2} y se retiraron por un breve periodo de tiempo con el propósito de medir a las 8 h, 24 h y 48 h, respectivamente.
Ejemplo 123 Medición y cuantificación del cribado primario
Las actividades relativas de fluorescencia de EGFP en las células de prueba tratadas con el compuesto en relación con las células control y las células tratadas con fármacos estándar se midieron utilizando un lector de fluorescencia de placas BMG Fluostar equipado con un par de filtros para la excitación/ emisión a 485 nm/ 520 nm. La proporción óptima de señal respecto al ruido de fondo se detectó utilizando el modo de medición a tiempo transcurrido con un retraso de 20 ms y un tiempo de integración de 1 ms. La ganancia se ajustó de tal forma que las células control producen una actividad de fluorescencia del 90% del máximo. La cinética se realizó midiendo las actividades de fluorescencia relativas a t = 0 h, 8 h, 24 h y 48 h. Las actividades de fluorescencia brutas se normalizaron individualmente para el diferente número de células y las diferentes actividades ópticas de los compuestos de prueba/ pocillos dividiendo cada valor de t = 8 h, 24 h y 48 h por el valor de t = 0 h resultando en los valores E(8), E(24) y E(48). Posteriormente, los valores E(x) se procesaron formando el inverso (valor Q) de los productos E(8)*E(24)*E(48) que dio lugar a números >1 para las actividades apoptóticas/ necróticas de los compuestos y a números <1 para las actividades proliferativas de los compuestos. Los controles (sin tratar) muestran valores similares a 1. Los compuestos que producen valores Q >2 se consideran relevantes en términos de actividad apoptótica/ necrótica y se prueban posteriormente en la configuración de cribado secundario.
Ejemplo 124 Configuración secundaria de cribado
Todas las manipulaciones se realizaron bajo condiciones estériles. Los ensayos se realizaron en el caso de las células adherentes en placas de cultivo de fondo plano de 24 pocillos disponibles comercialmente (Greiner, Alemania) y en el caso de células en suspensión en tubos de polipropileno de 1,4 ml (tubos P) (Matrix, UK), respectivamente.
Células de prueba adherentes: 2 x 10^{4} - 4 x 10^{4} células transfectadas de EGFP en 0,5 ml de medio completo se sembraron en placa 24 h antes del tratamiento. A t = 0 se retiró el medio y se añadieron 450 \mul de nuevo medio completo. Posteriormente, se añadieron 50 \mul de medio completo que contiene el compuesto prueba en un máximo de un 5% de DMSO resultando en concentraciones finales de 20 \muM, 10 \muM, 3 \muM, 1 \muM y 0,3 \muM de los compuestos prueba, respectivamente. Tras 48 h de incubación las células se recogieron y se analizaron con un dispositivo de escaneo de células activadas por fluorescencia (FACSCalibur^{TM}, BD Biosciences) de acuerdo con los procedimientos estándar.
Células en suspensión: se pipetearon 10^{5} células de prueba en 450 \mul de medio completo en tubos P. Se añadieron inmediatamente 50 \mul de medio completo que contenía los compuestos (ver células adherentes). Tras 48 h de incubación las células de prueba se analizaron directamente en un FACSCalibur^{TM}.
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Ejemplo 125 Cuantificación del cribado secundario
Monitorizando la actividad de fluorescencia de EGFP en FL1 en un FACSCalibur^{TM}, es posible distinguir entre células proliferativas, células apoptóticas y células necróticas dentro de la misma población celular. Las células proliferativas muestran una alta actividad fluorescente GFP, la población apoptótica muestra una actividad fluorescente intermedia mientras que las células necróticas muestran un actividad fluorescente residual comparable con las células transfectadas control. Dentro del CellQuest Software (BD Biosciences) se definen tres regiones en el histograma: M1 que comprende las células proliferativas, M2 que comprende la población de células apoptóticas y M3 que comprende la población de células necróticas. Se expresa como lectura la abundancia relativa de las células pertenecientes a M1, M2 o M3. Los compuestos que inducen valores M2 >50% y valores M3 <30% se consideran relevantes, y se prueban y caracterizan a fondo en la configuración terciaria/ avanzada.
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Ejemplo 126 Configuración del cribado terciario A) Tinción nuclear con Hoechst 33342
Este ensayo se realizó en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se sembró un número adecuado de células (células adherentes: 3-5 x 0^{3}, células en suspensión: 8-10 x 10^{3}) en 80 \mul de medio completo. Las células adherentes se incubaron durante 24 h para una correcta expansión antes de la adición de los compuestos prueba mientras que las células en suspensión se trataron inmediatamente con los compuestos prueba después del sembrado. Los compuestos prueba se añadieron en 20 \mul de medio completo que contiene un máximo de 5% de DMSO. Las concentraciones finales del compuesto en los ensayos son de 10 \muM, 3 \muM, 1 \muM y 0,3 \muM, respectivamente. Tras 24 h o 48 h de incubación en condiciones de cultivo, se añadieron 10 \mul de medio con tinción de Hoechst 33342 (Sigma B-2261) a 2-5 \mug/ml a cada pocillo. Las placas de ensayo se incubaron entonces durante 30 minutos más y posteriormente se analizaron con un microscopio de fluorescencia invertido estándar. La lectura permite la determinación de la fracción de núcleos apoptóticos así como otros criterios morfológicos específicos de la apoptosis como función del tratamiento. Los resultados se indican en la Tabla 6. Se utilizan las siguientes puntuaciones: 0 indica que no hay actividad, 1 indica una actividad débil que comprende menos del 70% de las células y 2 indica una fuerte actividad que comprende más del 70% de las células.
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TABLA 6 Tinción nuclear con Hoechst 33342
15
16
17
18
19
20
21
22
0: Sin efecto
1: Efecto débil
2: Efecto fuerte
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B) Ensayo de proliferación con MTS
El ensayo se realizó en placas de cultivos de tejido de 96 pocillos. Las células (rango: 1,5 x 10^{3}-10^{4}) se sembraron en 80 \mul de medio completo 24 h antes del tratamiento con el compuesto. Los compuestos de prueba se añadieron en 20 \mul de medio completo que contiene un máx. del 5% de DMSO. Las concentraciones finales del compuesto en los ensayos son de 10 \muM, 3 \muM, 1 \muM y 0,3 \muM, respectivamente. Las placas de ensayo se incubaron durante 72 h en condiciones de cultivo. El reactivo MTS se preparó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega G1111). Se añadieron 20 \mul de reactivo MTS a cada pocillo; las placas de ensayo se centrifugaron rápidamente y se incubaron durante otras 3 h en condiciones de cultivo. Posteriormente, las placas se agitaron un momento y se midió la absorción con un lector de microplacas a 492 nm. Los valores de CI_{50} se determinaron mediante el análisis gráfico y se indicaron en la Tabla 7 en concentración \muM.
TABLA 7 Ensayo de proliferación con MTS
23
24
25
0: CI50 > 1 \muM
1: 0,1 \muM <CI50 < 1 \muM
2: 0,01 \muM <CI50 < 0,1 \muM
3: CI50 < 0,01 \muM
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C) Anexina V/ tinción 7-AAD
Se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (1-2 x 10^{5}) células adherentes 24 h antes del tratamiento con el compuesto. Las células en suspensión se pipetearon a tubos P inmediatamente antes de añadir el tratamiento con los compuestos de prueba, llevándolos a una concentración final de 10 \muM. Las células se recogieron tras 24 h de tratamiento (en el caso de las células adherentes mediante tripsinización) y se transfirieron a tubos FACS (BD Biosciences). Tras la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, se añadieron 100 \mul de medio completo que contenía Anexina V-GST (10 \mug), se mezcló y se incubó a 4ºC durante 30 minutos. Posteriormente, las células se lavaron una vez con medio y se incubaron con 100 \mul de anti-GST Alexa 488 (Molecular Probes A-11131) en medio diluido 1:500 durante 30 minutos a 4ºC. Después, las células se lavaron una vez y se tiñeron con 7-aminoactinomicina D 1 \mug/ml (7-AAD) (Molecular Probes A-1310) en 250 \mul de medio y se analizaron en el FACSCalibur^{TM}. Se midió la Anexina V en FL1 mientras que la 7-AAD se midió en FL3.
D) Tinción de IP para la distribución del ciclo celular
Se sembraron de 1-2 x 10^{5} células en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se incubaron durante 24 h antes de la adición del compuesto. Los compuestos se añadieron durante 24 h en una concentración final de 3 \muM o 10 \muM. Las células adherentes se recogieron mediante tripsinización. Las suspensiones celulares se fijaron añadiendo 2 partes de etanol al 100% enfriado con hielo mientras se aplicaba al vórtex. Se almacenaron las muestras durante >2 h a -20ºC. Posteriormente las células se lavaron con PBS una vez y se resuspendieron en 250 \mul de PBS que contenía 50 \mug/ml de IP (Calbiochem nº 537059), después las muestras se incubaron a 37ºC durante 30 minutos y posteriormente se analizaron en un FACSCalibur^{TM} para monitorizar la actividad fluorescente lineal de IP en FL2. La lectura permite la detección de una posible influencia directa o indirecta de los compuestos probados sobre el ciclo celular. Pueden ocurrir los siguientes eventos: a) Generación de un pico subG1 indicativo de fragmentación de DNA, b) aumento de la población celular detenida en la fase G2M. Ambos eventos se puntúan con 1 para los sucesos débiles y 2 para los fuertes. 0 indica que no ha habido suceso. En la Tabla 8 se demuestra la influencia de varios compuestos de prueba.
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TABLA 8 Tinción de IP para la distribución del ciclo celular
26 
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E) Incorporación de BrdU (proliferación)
Se sembraron 2-4 x 10^{4} células adherentes/ pocillo/ ml en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos 24 h antes del tratamiento. Las células en suspensión se sembraron a 2 x 10^{5} células/ ml/ pocillo en placas de 24 pocillos. Los compuestos se añadieron llegando a una concentración final de 3 \muM y 10 \muM, respectivamente. Posteriormente, se añadió BrdU (Molecular Probes Nº B-23151) a una concentración final de 10 \muM y las placas se incubaron durante 48 h. Tras la incubación, las células se procesaron de acuerdo con los procedimientos estándar. La detección de la BrdU incorporada se realizó con el Mab anti-bromodeoxiuridina PRB-1, conjugado con Alexa Fluor 660 (Molecular Probes Nº A-21306). El análisis se realizó en un FACSCalibur^{TM} monitorizando la actividad fluorescente en FL3. La lectura refleja síntesis de DNA que es una característica de la proliferación.
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F) Dependencias de Caspasa
Se ha evaluado las dependencias de caspasas combinando el tratamiento del compuesto con el inhibidor de pan-caspasa zVAD o su péptido control zFA (ICN Pharmaceuticals nº FK009 y FK029, respectivamente). Ambos péptidos se utilizaron a una concentración de 20 \muM. En el caso de las dependencias de caspasa se puede detectar una clara inhibición de la lectura específica en todas las pruebas de apoptosis. Comparando la lectura de las muestras tratadas con zVAD y zFA con el compuesto control es posible detectar dependencias de caspasa respecto a la proteinasa de cisteína. En el caso de la inhibición por zVAD pero no por zFA, se observa una clara dependencia de caspasa. Una inhibición por zVAD así como por zFA apunta a la participación de proteinasas de cisteína en la cascada apoptótica.
Ejemplo 127 Cápsulas blandas
Se prepararon como sigue 5000 cápsulas blandas de gelatina, cada una contiene como ingrediente activo 0,05 g de uno de los compuestos de fórmula (I) mencionados en los Ejemplos anteriores: se resuspenden 250 g de ingrediente activo pulverizado en 2 litros de Lauroglykol® (laurato de propilenglicol, Gattefossé S.A., Saint Priest, Francia) y se situaron en un pulverizador húmedo para producir un tamaño de partícula de alrededor de 1 a 3 \muM. Se introdujeron porciones de 0,419 g de la mezcla en cápsulas blandas de gelatina utilizando una máquina rellenadora de cápsulas.

Claims (15)

  1. \global\parskip0.870000\baselineskip
    1. Un compuesto de fórmula (I)
    27
    en el que R representa fenilo, tienilo o piridinilo
    en el que fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxi-alcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilo inferior carbonilo, carboxi, alcoxi inferior carbonilo, ciano, halógeno y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
    y en el que el piridinilo está opcionalmente sustituido por un alcoxi inferior, amino o halógeno;
    X representa un grupo C=Y, en el que Y representa oxígeno o nitrógeno sustituido por hidroxi o alcoxi inferior;
    R^{1} representa hidrógeno, alquilo inferior carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
    R^{2}, R^{3} y R^{6} representan hidrógeno;
    R^{4} y R^{5}, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R^{4} y R^{5} juntos representan metilendioxi;
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    o en el que
    R representa fenilo o piridinilo
    en el que el fenilo está opcionalmente sustituido por uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de entre alquilo, halo-alquilo inferior, hidroxi-alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aciloxi-alquilo inferior, fenilo, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, fenil-alcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino sustituido en el que los dos sustituyentes del nitrógeno forman junto con el nitrógeno un heterociclilo, alquilo inferior carbonilo, carboxi, alcoxi inferior carbonilo, formilo, ciano, halógeno y nitro; y en el que dos sustituyentes adyacentes son metilendioxi;
    y en el que el piridinilo está opcionalmente sustituido por alcoxi inferior, amino o halógeno;
    X representa oxígeno;
    R^{1} representa hidrógeno, alquilo inferior carbonilo, hidroxi-alquilo inferior o ciano-alquilo inferior;
    R^{2}, R^{3} y R^{6} representan hidrógeno;
    R^{4} y R^{5}, independientemente el uno del otro, representan hidrógeno, alquilo inferior o alcoxi inferior; o R^{4} y R^{5} juntos representan metilendioxi;
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \vskip1.000000\baselineskip
  2. 2. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 en el que
    R^{1} representa ciano-alquilo inferior;
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \vskip1.000000\baselineskip
  3. 3. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el que
    R representa fenilo o piridinilo, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, y R^{6} representan hidrógeno;
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \vskip1.000000\baselineskip
  4. 4. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 que es
    4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina;
    4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina oxima;
    metiléter de 4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina oxima;
    4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    metiléter de 4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(4-Clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    metiléter de 4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    4-[1-(4-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-yt]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(4-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    4-[1-(3-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(3-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    metiléter de 4-[1-(3-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    4-[1-(4-fenilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(4-fenilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    metiléter de 4-[1-(4-fenilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima; o
    4-[1-(2,4-diclorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \vskip1.000000\baselineskip
  5. 5. Un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con la reivindicación 1 que es
    4-(1-fenacil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina oxima;
    N-{4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il}-acetamida;
    4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-(1-fenoximetil-1H-bencimidazol-2-il)-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(4-fluorofenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(3,4-dimetilfenoximetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(3-hidroxipropil)-amina;
    4-[1-(3-amino-4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina; o
    4-[1-(3-metoxi-4-metoximatoxi-fenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \global\parskip1.000000\baselineskip
  6. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula
    28
    en el que
    29 
    \newpage
    (Continuación)
    30 
    \newpage
    (Continuación)
    31 
    \newpage
    (Continuación)
    32 
    \newpage
    (Continuación)
    33
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \newpage
  7. 7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de fórmula
    34
    en el que
    35 
    \newpage
    (Continuación)
    36
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \vskip1.000000\baselineskip
  8. 8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado de entre el grupo que consiste en
    4-[1-(4-clorofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-[1-(3-metoxi-4-metoximatoxi-fenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(4-bromofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-[1-(4-aminofenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-[1-(4-metoxifenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-[1-(3,4-dimetilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-[1-(4-etilfenacil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina;
    4-[1-(6-cloro-3-piridil-carbonilmetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    4-[1-(6-amino-3-piridil-carbonilmetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-il-N-(2-cianoetil)-amina; y
    4-[1-(6-amino-3-piridil-carbonilmetil)-1H-bencimidazol-2-il]-furazan-3-ilamina;
    y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
    \vskip1.000000\baselineskip
  9. 9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 de fórmula
    37
    en el que
    38
    y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    \vskip1.000000\baselineskip
  10. 10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 de fórmula
    39
    en el que
    40
    y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    \vskip1.000000\baselineskip
  11. 11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 de fórmula
    41 
    \vskip1.000000\baselineskip
    en el que
    \vskip1.000000\baselineskip
    42
    y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    \vskip1.000000\baselineskip
  12. 12. Un método para la preparación de un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que
    A) un compuesto de fórmula (II)
    43 
    \vskip1.000000\baselineskip
    en el que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} con la misma definición que en la fórmula (I), o un derivado de los mismos con grupos funcionales en forma protegida y/o una sal de los mismos, se alquila con un agente alquilante de fórmula (III)
    (III)R-X.CH_{2}-Z
    en el que R tiene la misma definición que en la fórmula (I), X es CO y Z es un grupo saliente nucleofílico; o
    B) un compuesto de fórmula (II), en el que R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} con la misma definición que en la fórmula (I), o un derivado de los mismos con grupos funcionales en su forma protegida y/o una sal de los mismos, se alquila con una mezcla de un compuesto de tipo dihalometano de fórmula Z^{1}-CH_{2}-Z^{2} (IV), en el que Z^{1} y Z^{2} son grupos salientes, y un compuesto de fórmula R-XH (V), en el que R es como se ha definido para la fórmula (I) y X es oxígeno;
    se elimina cualquier grupo protector en un derivado protegido de un compuesto de fórmula (I);
    y, si se desea, un compuesto obtenible de fórmula (I) se convierte en otro compuesto de fórmula (I), un compuesto libre de fórmula (I) se convierte en una sal, una sal obtenible de un compuesto de fórmula (I) se convierte en el compuesto libre u otra sal, y/o una mezcla de compuestos isoméricos de fórmula (I) se separan en los isómeros individuales.
    \vskip1.000000\baselineskip
  13. 13. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. La utilización de un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, enfermedades autoinmunes, patologías relacionadas con el trasplante y/o enfermedades degenerativas.
  15. 15. La utilización de acuerdo con la reivindicación 14 de un compuesto de fórmula (I) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una sal farmacéuticamente aceptable de tal compuesto para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neoplásica sólida.
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