DE102007010077B4

DE102007010077B4 - [1,3]-Dioxane zur Modulation von GABAa-Rezeptoren

Info

Publication number: DE102007010077B4
Application number: DE102007010077A
Authority: DE
Inventors: Hanns Prof. Dr. Dr. Hatt; Andrea Dr. Kragler; Günter Dr. Gisselmann; Johannes Dr. Panten
Original assignee: Symrise AG; Ruhr Universitaet Bochum
Current assignee: Symrise AG; Ruhr Universitaet Bochum
Priority date: 2007-02-28
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2010-04-08
Anticipated expiration: 2027-03-01
Also published as: DE102007010077A1

Abstract

Verwendung von [1,3]-Dioxanen mit der Strukturformel (I)

worin
R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, C_1-6-Alkyl und C_1-6-Alkoxy;
R4, R5 und R6 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H und C_1-3-Alkyl; und
R7 ausgewählt ist aus H und C_1-3-Alkyl oder R1 mit R7 über eine -C(R₄)_n- Brücke verknüpft ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
zur Verstärkung der Wirkung von GABA auf GABA_A-Rezeptoren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von bestimmten [1,3]-Dioxanen zur Verstärkung der Wirkung von GABA auf GABA_A-Rezeptoren. Sie betrifft weiterhin Medikamente bzw. pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend eines oder mehrere dieser [1,3]-Dioxane, die insbesondere zur Therapie von Depressionen, Unruhe- und Angstzuständen, Schlafstörungen, Epilepsie, Demenzerkrankungen, Alkoholismus und/oder Migräne geeignet sind. Schließlich werden spezielle, bislang nicht bekannte [1,3]-Dioxane sowie ein Verfahren zu deren Herstellung zur Verfügung gestellt.
Hintergrund der Erfindung
Beruhigungsmittel (Sedativa), Schlafmittel (Hypnotika) und Entspannungsmittel (Tranquilizer) sind nach wie vor die am häufigsten verordneten Psychopharmaka. Dabei ist der Unterschied zwischen sedativer und hypnotischer Wirkung kein qualitativer, sondern ein quantitativer. Inzwischen kennt man verschiedene Gruppen von Pharmaka, die zentral dämpfend, d. h. die Aktivität des Aktivierungszentrums in der formatio reticularis vermindernd wirken. Die klassischen Stoffklassen, von denen sedative/hypnotische Wirksamkeit bekannt ist, sind Alkohole, Barbiturate, halogenierte Kohlenstoffverbindungen, Opiate (Morphinderivate), Promide und Promoreide. Mitte der fünfziger Jahre wurde dann eine Gruppe von Arzneimittelwirkstoffen entdeckt, die unter dem Oberbegriff Benzodiazepine heute zu den weltweit am häufigsten verordneten Arzneimitteln gehören. Sie zeichnen sich durch eine angstlösende, beruhigende, schlaffördernde und erregungsdämpfende Wirkung aus. Neben der starken Suchtgefahr wurden allerdings im Laufe der Jahrzehnte eine Reihe von ernstzunehmenden Nebenwirkungen registriert, die sich vor allem in Benommenheit, depressiver Verstimmung und zum Teil paradoxen Reaktionen (akute Erregungszustände), aber auch körperlichen Symptomen, wie Blutdruckabfall, Atembeschwerden, Mundtrockenheit, Muskelschwäche und Koordinationsstörungen mit verlängerter Reaktionszeit ausdrückten.
Benzodiazepine wirken über spezifische Haftstellen an Rezeptoren, die an Kontaktstellen von Nervenzellen (Synapsen) liegen und die Aktivität des hemmenden Neurotransmitters GABA verstärken. Es existiert also ein enger Zusammenhang zwischen Benzodiazepinen und GABA-Rezeptoren: Agonistische Besetzung der Bindestelle für Benzodiazepine an GABA-Kanalproteinen führt zur Erhöhung der Affinität des GABA-Rezeptors, dadurch wird die GABAerge Wirkung gesteigert.
Ähnliche Wirkprinzipien am GABA-Rezeptorkanalkomplex haben auch Barbiturate oder das kurz wirkende Hypnotikum (Anästhetikum) Propofol. Beide besitzen ebenfalls Bindestellen am GABA-Kanalprotein und verstärken die Wirkung des hemmenden Neurotransmitters GABA. Diese „allosterischen” Effektoren der GABA-Rezeptoren sind selbst nur in extrem hohen Konzentrationen in der Lage, den GABA-Kanal zu aktivieren, allerdings steigern sie die Wirkung des hemmenden Neurotransmitters um das 2-3fache. In Deutschland nehmen bis zu 20% der Bevölkerung im Verlauf eines Jahres GABAerge Modulatoren zur Behandlung von Spannungs-, Erregungs- und Angstzuständen, Schlafstörungen, als sog. Tranquilizer oder Psychopharmaka ein oder werden im Rahmen von Kurzzeitnarkosen klinisch damit behandelt.
GABA (gamma-amino-Buttersäure) ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im Säugetiergehirn. Positive allosterische Modulatoren von GABA_A-Rezeptoren sind wichtige Pharmazeutika, welche z. B. sedierend, angstlösend, krampflösend und anaesthetisch wirken können.
GABA_A-Rezeptoren sind Mitglieder der Superfamilie der liganden-gesteuerten Innenkanäle, zu denen auch die nikotinischen Acetylcholin-, Glyzin- und Serotoninrezeptoren (5-HT₃) zählen. GABA_A-Rezeptoren sind die wichtigsten Vermittler der schnellen GABA-induzierten hemmenden Neurotransmission (Sieghart, 1995). Sie bestehen aus einem heteropentameren Proteinkomplex aufgebaut aus homologen Untereinheiten, die von verwandten Genen bzw. Genfamilien kodiert werden (Macdonald und Olsen, 1994). Zur Zeit sind 6 α-Untereinheiten, 3 β-Untereinheiten, 3 γ-Untereinheiten, eine δ-Untereinheit, eine ε-Untereinheit, eine π-Untereinheit und eine θ-Untereinheit aus Säugetieren bekannt (Macdonald und Olsen, 1994; Schofield et el., 1987; Mehta und Ticku, 1999). Native Rezeptoren enthalten mindestens eine α- und eine β-Untereinheit (McKernan und Whiting, 1996). Jede Untereinheit hat eine große N-terminale Domäne und eine C-terminale Domäne. Die C-terminale Domäne weist 4 Transmembran-Segmente TM1 bis TM4 auf. Die extrazelluläre N-terminale Domäne beinhaltet die Agonistenbindestellen, die transmembranalen Domänen (insbesondere TM2) hingegen bilden den Ionenkanal (Xu und Akabas, 1996).
Von den vielen Untereinheitenkombinationen zur Bildung von heteromultimeren GABA_A Rezeptoren, die theoretisch möglich sind, wurden bisher nur wenige nachgewiesen. Der häufigste Rezeptorsubtyp im Gehirn ist aus α₁, β₂ und γ₂ Untereinheiten aufgebaut (McKernan und Whiting, 1996). Andere häufige Rezeptortypen bestehen aus verschiedenen anderen Kombinationen von α, β und γ₂ Untereinheiten (z. B. α₂β₃γ₂, α₃β₃γ₂, α₄β_xγ₂, α₅β₃γ₂ und α₆β_xγ₂ x = 1, 2 oder 3). Weiterhin kann ein einzelnes Pentamer auch zwei verschiedene α oder β Untereinheitenisoformen enthalten (Sieghart und Sperk, 2002). Diese molekulare Heterogenität hat wichtige funktionale Konsequenzen für GABA_A-Rezeptorsubtypen: die Untereinheitenzusammensetzung bestimmt nicht nur die Eigenschaften der Rezeptoren, sondern auch die Lokalisation auf der Zelloberfläche (Sieghart und Sperk, 2002). Die Verteilung der verschiedenen GABA_A-Rezeptoruntereinheiten zeigt eine starke Gewebespezifität. Während z. B. β₁ Untereinheiten vor allem im Hippocampus vorkommen und in den restlichen neuronalen Geweben eher schwächer exprimiert werden, werden β_2,3 Untereinheiten in verschiedensten neuronalen Geweben weitaus stärker exprimiert (Wisden et al., 1992).
Als Potenzierung von GABA_A Rezeptoren bezeichnet man die Verstärkung der von GABA-induzierten Stromantwort durch verschiedene Neuromodulatoren. GABA_A-Rezeptoren werden durch verschiedene chemische Stoffe wie Benzodiazepine (Sigel, 2002), Neurosteroide, Barbiturate (Olsen et al., 1986) und Anästhetika (Krasowski et al., 1998) moduliert. Insgesamt haben GABA_A-Rezeptoren mehr als 10 verschiedene Bindungsstellen für Modulatoren und machen damit den Rezeptor zu einem wichtigen Zielmolekül für die Entwicklung neuer Pharmaka (Korpi, 1994). Während an der Modulation von Benzodiazepinen α- und γ-Untereinheiten beteiligt sind, haben verschiedene andere Modulatoren wie z. B. Propofol, Barbiturate oder Etomidate ihren Wirkungsort auf der β-Untereinheit der GABA_A-Rezeptoren. Durch eine Untersuchung von transgenen Mäusen, die durch die ”knock-in”-Technik mutierte GABA-Rezeptoren exprimieren, konnte definitiv bewiesen werden (Jurd et al., 2003), dass spezifische GABA_A-Rezeptoren an der Propofolwirkung beteiligt sind. Funktionsrelevante Stellen der Propofolwirkung konnten bislang nur auf β-Untereinheiten nachgewiesen werden (Krasowski et al., 1998). Jurd et al. beschreibt die Analyse einer Punktmutation in der β₃-Untereinheit des GABA-Rezeptors (Mutation N265M) (Jurd et al., 2003). Diese Punktmutation verhindert die Modulation von Etomidate und Propofol in vitro. Eine ähnliche Punktmutation in der β₁ Untereinheit (M286W) führt ebenfalls dazu, dass Propofol nicht mehr potenzierend auf GABA-Rezeptoren wirkt (Krasowski et al., 1998).
Die therapeutischen Einsatzgebiete von GABA-Modulatoren, die auf die β-Untereinheit wirken (z. B. Propofol, Barbiturate, Etomidate), sind sehr vielfältig. Propofol z. B., ein Alkylphenolderivat (2,6-Diisopropylphenol), ist ein kurz wirkendes intravenöses Anästhetikum, welches die GABA_A-Rezeptorfunktion verstärkt. Weitere Anwendungsgebiete für die oben genannten Stoffe gibt es z. B. bei der Behandlung von epileptischen Anfällen und Migräne sowie als Schlafmittel. Das Wirkungsprofil dieser GABA-Potenzierer ist stark dosisabhängig. Hohe Konzentrationen von Propofol bewirken Schlaf, Sedierung, Betäubung und Unbeweglichkeit, kleinere Dosen hingegen führen zur leichter Sedierung und einer Beeinflussung der Gedächtnisfunktion (Veselis et al., 2002). Im sedativen Konzentrationsbereich reduziert Propofol hauptsächlich die neuronale Aktivität im kortikalen Netzwerk. Bei höheren betäubend wirkenden Konzentrationen sind zusätzlich subkortikale Bereiche, unter anderem der Thalamus, die formatio reticularis und möglicherweise der Hypothalamus besonders betroffen (Rudolph und Antkowiak, 2004).
Eine der größten Herausforderungen der GABA-Rezeptorpharmakologie ist die Entwicklung von Modulatoren mit einer Spezifität für bestimmte GABA-Rezeptorsubtypen (Rudolph and Mähler, 2006). Wirkstoffe, die eine starke Untereinheitenspezifität haben, können Gehirnbereiche beeinflussen, in denen die betroffene Untereinheit besonders prominent ist. Agonisten mit Selektivität für GABA-Rezeptoren mit α₂ und/oder α₃ Untereinheiten wirken angstlösend, ohne einen sedierenden Effekt zu zeigen. Inverse Agonisten mit einer Selektivität für GABA-Rezeptoren mit α₅ Untereinheiten hingegen beeinflussen gezielt die Gedächtnisfunktion (Rudolph und Mähler, 2006). Modulatoren mit einer ausgesprochenen Selektivität für β₁ Untereinheiten sind bisher in der Literatur nicht beschrieben. Bekannte, als Anästhetika eingesetzte Modulatoren für GABA_A-Rezeptoren, wie Propofol oder Etomidate, sind entweder unspezifisch für den Subtyp der β-Untereinheit oder spezifisch für β₂ und β₃-Untereinheiten (Rudolph und Antkowiak, 2004).
Eine spezifische Modulation von β₁ enthaltenden Rezeptoren kann in besonderem Maße Gehirnbereiche betreffen, in denen diese Untereinheit hoch exprimiert ist. Diese Untereinheit ist besonders stark im Hippocampus zu finden, lässt sich aber auch in anderen Gehirnbereichen nachweisen (Wisden et al., 1992). Im Hippocampus fließen Informationen verschiedener sensorischer Systeme zusammen, die verarbeitet und von dort zum Kortex zurückgesandt werden. Damit ist er eminent wichtig für die Gedächtniskonsolidierung, also die Überführung von Gedächtnisinhalten aus dem Kurzzeit- in das Langzeitgedächtnis. Der Hippocampus ist auch für die Koordinierung der verschiedenen Gedächtnisinhalte verantwortlich. Beim Menschen können verschiedene Erkrankungen zu einer Veränderung des Hippocampus führen. Allen voran können Abbauprozesse bei Demenzerkrankungen diese Hirnstruktur schädigen. Darüber hinaus spielt der Hippocampus eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Epilepsieerkrankungen. Die einseitige neurochirurgische Entfernung dieser Hirnstruktur stellt heute eine Möglichkeit zur Behandlung von medikamentös unbeherrschbaren Anfällen dar. Daher sind Pharmaka, die spezifisch dämpfend auf hippocampale Neurone wirken, von Interesse.
EP 0288279 und DE 3429227 beschreiben 1,3-Dioxanderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel. Im einzelnen beschreibt DE 34299227 Arzneimittel gegen Ulcus pepticum und EP 0288279 pharmazeutische Zusammensetzungen zur Therapie von Erkrankungen bei Warmblütern, bei denen TXA2, PGH2, PGD2 und/oder PGF2 alpha eine Rolle spielen.
Im Lichte der vorstehenden Ausführungen bestand daher ein Bedarf, neue Modulatoren für GABA_A-Rezeptoren zu finden.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es wurde nunmehr überraschend gefunden, dass bestimmte [1,3]-Dioxane eine neue Klasse von positiven allosterischen Modulatoren der GABA-Wirkung sind. Diese [1,3]-Dioxane besitzen eine Spezifität für GABA_A-Rezeptoren, die β₁-Untereinheiten enthalten und sind daher für alle Anwendungen interessant, die auf der Beeinflussung von GABA_A-Rezeptoren beruhen. Das gilt vor allem für die Behandlung von Erkrankungen (z. B. des Nervensystems), welche auf die Potenzierung von GABA_A-Rezeptoren ansprechen. Weiterhin können die Substanzen eingesetzt werden, um sedierende, angstlösende oder betäubende Wirkungen auszulösen. Die Erfindung betrifft somit

(1) die Verwendung von [1,3]-Dioxanen mit der Strukturformel (I)
worin R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, C_1-6-Alkyl und C_1-6-Alkoxy; R4, R5 und R6 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H und C_1-3-Alkyl; und R7 ausgewählt ist aus H und C_1-3-Alkyl- oder R1 mit R7 über eine -C(R4)_n- Brücke verknüpft ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, zur Verstärkung der Wirkung von GABA auf GABA_A-Rezeptoren;
(2) eine bevorzugte Ausführungsform der Verwendung nach (1) in der die [1,3]-Dioxane zur Prophylaxe oder Therapie von Depressionen, Unruhe- und Angstzuständen, Schlafstörungen, Epilepsie, Demenzerkrankungen und/oder Migräne verwendet werden;
(3) einzelne, bislang nicht bekannte [1,3]-Dioxane der Strukturformel (I);
(4) ein Verfahren zur Herstellung der Dioxane nach (3), umfassend eine säurekatalysierte Umsetzung eines geeigneten Styrolderivates mit Aldehyden;
(5) ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eines oder mehrere der [1,3]-Dioxane wie in (1) oder (3) definiert;
(6) eine bevorzugte Ausführungsform von (5) wobei das Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Therapie von Depressionen, Unruhe- und Angstzuständen, Schlafstörungen, Epilepsie, Demenzerkrankungen und/oder Migräne geeignet ist;
(7) eine Zusammensetzung enthaltend eines oder mehrerer der [1,3]-Dioxane wie in (3) definiert; und
(8) die Verwendung der in (1) oder (3) definierten [1,3]-Dioxane als Reagenzienkit oder diagnostisches Werkzeug, um spezifisch β₁-enthaltende GABA-Rezeptoren in vivo oder in vitro zu aktivieren oder um pharmakologisch zu prüfen, ob in einem GABA-Rezeptor enthaltenden Präparat β₁-enthaltende GABA-Rezeptoren vorkommen.

Beschreibung der Figuren
1: (A) In Xenopus Oozyten, welche rekombinante α₁β₂γ₂ GABA_A Rezeptoren exprimieren, bewirkt eine Ko-Applikation von Vertacetal^® coeur eine dosisabhängige starke Potenzierung der GABA-induzierten Stromantworten (B).
2: PI24513 (2,4,6-Trimethyl-4-(4-methylphenyl)-1,3-dioxan; siehe Tabelle 3) und Vertacetal^® coeur verringern die erkundende Bewegungsaktivität. (oben) C57BL/6 Mäuse wurden (i. p.) mit PI24513 gelöst in PEG 400 injiziert (n = 4–18 Tiere pro Gruppe). Die Bewegungsaktivität in dem ”open field” Bereich wurde für 30 min aufgezeichnet. Mäuse, die mit 0,5 oder 0,2 g/kg PI24513 behandelt wurden, zeigen eine signifikante Reduktion in ihrer Bewegungsaktivität (0,5 g/kg: P < 0,001, 0,2 g/kg: P < 0,01). (unten) Die erkundende Bewegungsaktivität von C57BL/6 Mäusen wurde über 2 h in einer neuen Umgebung beobachtet. Vor dem Versuch wurden in die ”open field” Apparatur 500 μl Vertacetal^® coeur eingebracht (n = 4 Mäuse pro Gruppe). Die Inhalation von Vertacetal^® coeur unterdrückte die initiale erkundende Bewegungsaktivität in einer neuen Umgebung signifikant (**: P < 0,01; *: P < 0,05).
3: Identifizierung der β-Untereinheit als Wirkungsort für 1,3 dioxanderivate: Rekombinante β₁ GABA_A Rezeptoren, α₁β₁ GABA_A Rezeptoren und mutierte α₁β_1(M286W) Rezeptoren wurden funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert. Die GABA-Antwort (5 μM auf β₁ GABA_A Rezeptoren wir durch 100 μM Vertacetal und 100 μM PI24513 potenziert (A). Die GABA-Antworten (5 μM) in Oozyten, welche α₁β_1(M286W) GABA_A Rezeptoren exprimieren, werden durch [1,3]-Dioxanderivate (100 μM PI24513, 100 μM Vertacetal^® coeur) nicht potenziert (B). Die GABA-Antworten (5 μM) in Oozyten, welche α₁β₁ GABA_A Rezeptoren exprimieren, werden durch [1,3]-Dioxanderivate (100 μM PI24513, 100 μM Vertacetal^® coeur) potenziert. (C).
4: Bestimmung der untereinheitenspezifischen Wirkung von 1,3 Dioxanderivaten: Rekombinante α₁β₁γ₂, α₁β₂γ₂ oder α₁β₃γ₂ GABA_A Rezeptoren wurden funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert. Die Dosisabhängigkeit der Potenzierung durch PI24513 wurde bestimmt, indem GABA mit verschiedenen Konzentrationen von PI24513 ko-appliziert wurde. Die normalisierte Potenzierung wurde gegen die Konzentration von PI24513 aufgetragen und EC₅₀-Wert bestimmt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Mit den hier vorgestellten [1,3]-Dioxanen wird eine neue Klasse von GABA-Rezeptormodulatoren eingeführt, die GABA induzierte hemmende Kanalströme stark potenzieren. Diese Verbindungen wirken nicht nur bei systemischer intravenöser oder parenteraler Applikation, sondern auch bei Inhalation. Mit dieser neuen Klasse von GABA-Modulatoren lassen sich Anwendungen im Bereich der angstlösenden, beruhigenden, erregungs- und aggressionsdämpfenden und schlafanstoßenden Therapie durchführen. Durch chemische Strukturveränderungen können noch besser wirksame Verbindungen und/oder Verbindungen mit einer anwendungsfreundlicheren therapeutischen Breite entwickelt werden. Die erfindungsgemäße Verwendung nach Ausführungsform (1) nutzt die Wirkung von bestimmten [1,3]-Dioxanderivaten auf GABA-Kanalproteine. Diese Verbindungen induzieren eine dosisabhängige Potenzierung der GABAergen Wirkung. Die Effekte sind zum Teil stärker als die der seit langem bekannten Benzodiazepine. In elektrophysiologischen Messungen konnte an menschlichen GABA-Rezeptorkanalproteinen gezeigt werden, dass die Wirkung von GABA in Gegenwart von [1,3]-Dioxanderivaten (z. B. Vertacetal^® coeur) bis zu 15-fach erhöht ist (Beispiel 3–4). Molekularbiologische Daten, kombiniert mit Zellkultur und rekombinanter Expression von GABA-Rezeptoren, erlaubten eine Identifizierung der B-Untereinheit des GABA-Kanalkomplexes als diejenige, welche für die Bindung der [1,3]-Dioxane verantwortlich ist. Veränderungen an der Aminosäurestruktur des Kanalproteins, die zu einem Verlust der Propofolwirkung (s. o.) führten, hatten auch einen Wirkverlust für die getesteten Verbindungen zur Folge (Beispiel 5). In zusätzlichen Experimenten wurde die Wirkung von [1,3]-Dioxanen im Tierexperiment (Mäuse) getestet. Parenterale Applikation der Verbindungen führte zu einer konzentrationsabhängigen, reversiblen Sedierung der Mäuse (bestimmt aus der Reduktion der Bewegungsaktivität, Bsp. 7). Zusätzlich wurde die Wirkung der [1,3]-Dioxane bei Einatmung getestet. Setzt man die Mäuse in einen Plexiglaskäfig, in dessen Luft sich eine gesättigte Konzentration des Duftes befindet, zeigen die Mäuse ein hoch signifikant reduziertes Aktivitätsverhalten. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die 1,3, Dioxanderivate eine Substanzklasse sind, die auf GABA-Rezeptoren wirken und die GABA-Antwort verstärken. Diese Potenzierung der GABA-Antwort kann z. B. eine Sedation, Anxiolyse oder Aneasthesie bewirken oder zu anderen, für GABA-Potenzierer typischen Wirkung führen. Diese Substanzen haben eine Spezifität für GABA-Rezeptoren, welche eine β₁-Untereinheit enthalten, wirken aber im verminderten Maße auch auf Rezeptoren mit β₂ oder β₃ Untereinheiten. Sie sind also im besonderen Masse geeignet, Gehirnbereiche zu beeinflussen, die eine hohe Dichte an GABA-Rezeptoren im Allgemeinen und an β₁-enthaltenden GABA-Rezeptoren im speziellen aufweisen.
Weiterhin ist die Maus ein anerkanntes Modellsystem für die Erforschung von GABA-Potenzierern und die Ergebnisse sind in auf Grund der hohen Ähnlichkeit im GABA-ergen System auf den Menschen übertragbar. Anhand der Wirkung der 1,3 Dioxanderivate im Tierexperiment ist deshalb davon auszugehen, dass diese Substanzen auch beim Menschen in vivo in gleicher Weise wirksam sind.
Bevorzugte [1,3]-Dioxanderivate für die Verwendung gemäß Ausführungsform (1) sind Verbindungen mit der Strukturformel (I):
worin
R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Methyl, Ethyl, nPropyl, iPropyl, nButyl, iButyl, secButyl, tertButyl, Methoxy und Halogen,
R4 ausgewählt ist aus H, Methyl und Ethyl;
R5 und R6 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Methyl und Ethyl und
R7 ausgewählt ist aus H, Methyl und Ethyl oder mit R1 über eine -CH₂-CH₂- oder -CH₂- Brücke verknüpft ist.
Bevorzugt sind zwei der drei Reste R1, R2 und R3 H, und der dritte dieser Reste ist ausgewählt aus H, Methyl, Ethyl, nPropyl, iPropyl, nButyl, secButyl, tertButyl und Halogen.
Weiterhin bevorzugt sind drei der vier Reste R4, R5, R6 und R7 Methyl oder Ethyl, und der vierte dieser Reste H ist. Ganz besonders bevorzugt sind die Verbindungen in Tabelle 1, von denen viele hier erstmals beschrieben werden.
Tabelle 1: [1,3]-Dioxane für Verwendung in Ausführungsmodel 1
In einem bevorzugten Aspekt der Ausführungsform (1) wird ein [1,3]-Dioxan der Formel (I) verwendet, in welchem der Aromat mit einer Methyl-Gruppe substituiert ist.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt der Ausführungsform (1) ist der Aromat meta- oder para-substituiert, wobei para-Substitution nochmals bevorzugt ist.
Ein ganz besonders bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (1) ist also die Verwendung eines [1,3]-Dioxans der Formel (I), in dem der Aromat in meta- oder para-Stellung, und ganz speziell in para-Stellung, mit Methyl substituiert ist.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt der Ausführungsform (1) wird ein [1,3]-Dioxan der Formel (I) verwendet, das einen trisubstituierten [1,3]-Dioxanring trägt. in welchem also nur einer der Reste R4, R5, R6 und R7 H ist. Besonders bevorzugt sind dann die drei Substituenten am Dioxanring Methyl.
Am allerbevorzugtesten ist die folgende Verbindung:
Dass diese Strukturelemente und ihre Position für die Wirkung hochrelevant sind, zeigen Beispiele 3 und 4.
2,4,6-Trimethyl-4-phenyl-1,3-dioxan kann unterschiedliche Konformationen einnehmen und bildet daher verschiedene Steroisomere. Diese sind in den in Anwendungsform (1) bevorzugt verwendeten Zusammensetzungen Vertacetal und Vercetal coeur in den in Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen vorhanden.
Tabelle 2: Zusammensetzung von Vertacetal und Vertacetal^® coeur
Wie Bsp. 4 zeigt, ist Vertacetal^® coeur aktiver als Vertacetal. Daher ist die (4SR)-Konfiguration bevorzugt. Für die Verwendung gemäß Ausführungsform (1) bedeutet dies, dass eine axiale Stellung des Aromaten am Dioxanring (wie bei Vertacetal coeur) bevorzugt ist.
EP 0982303 beschreibt eines der in Tabelle 1 aufgeführten 1,3-Dioxane und dessen Synthese (nämlich Vertacetal coeur), aber deutet dessen Wirkung auf GABA-Rezeptoren nicht an.
[1,3]-Dioxanderivate potenzieren die GABA Wirkung auf GABA_A Rezeptoren. Eine gebräuchliche Möglichkeit, um die Wirkung von GABA-Rezeptormodulatoren in vitro zu untersuchen, ist die elektrophysiologische Messung von rekombinant in Xenopus laevis Oozyten exprimierenden GABA-Rezeptoren. Nach Injektion entsprechender cRNA werden rekombinante GABA_A Rezeptoren funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert. Mit Hilfe der Zwei-Elektroden voltage-clamp-Methode kann dann die modulatorische Wirkung von Stoffen wie den [1,3]-Dioxanderivaten auf GABA-Rezeptoren untersucht werden. In einem typischen Versuch wird eine submaximale Konzentration von GABA (EC_10-30, 1–10 μM, typischerweise 3–10 μM) alleine oder zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanz (1 μM bis 1 μM, typischerweise 100 μM) appliziert. Vergrößert die gemeinsame Applikation der Testsubstanz mit GABA die Amplitude der GABA-Antwort im Vergleich zur Applikation von GABA alleine, so spricht man von einer Potenzierung der GABA-Antwort.
Verschiedene Derivate von Vertacetal^® coeur wurden hinsichtlich der Potenzierung der GABA-Antwort von rekombinanten α₁β₁ GABA_A Rezeptoren überprüft. In einem typischen Versuch wird eine submaximale Konzentration von GABA (EC₁₀, 1–10 μM, typischerweise 3–10 μM) alleine oder zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanz appliziert (1 μM–1 mM, typischerweise 100 μM) und die Potenzierung bestimmt. Als Vergleich diente die Potenzierung durch 100 μM Vertacetal^® coeur, welches in diesem Assay die GABA-Antwort auf α₁β₁ GABA_A Rezeptoren um 6,0 ± 0,6 fach verstärkt (Bsp. 4).
Eine potenzierende Verbindung (Konzentration 1 μM bis 1 mM) im Sinne der Erfindung potenziert die submaximale GABA-Antwort (EC₁₀-EC₂₀ für GABA) in einem solchen Assay um mindestens 10%, besser um 100% und idealerweise um mehr als 500% bezogen auf die Antwort einer submaximalen GABA-Konzentration (EC₁₀-EC₂₀) ohne Potenzierer.
[1,3]-Dioxanderivate wirken auf β Untereinheiten von GABA_A Rezeptoren. Eine Untersuchung mit dem Xenopus Oozyten-Expressionssystem von homomultimeren GABA-Rezeptoren, welche nur aus β₁, β₂ oder β₃ Untereinheiten aufgebaut sind, kann benutzt werden um zu beweisen, dass eine Bindungsstelle für den Modulator auf der β-Untereinheit vorliegt. Das ist z. B. für Substanzen wie Propofol und Barbiturate der Fall, aber nicht für Benzodiazepine, bei denen α und γ-Untereinheiten an der Bindung beteiligt sind. [1,3]-Dioxanderivate wirken direkt auf solche homomer aus 13 Untereinheiten aufgebauten GABA-Rezeptoren; ein Beweis, dass β Untereinheiten eine entsprechende Bindungsstelle besitzen müssen. Die Applikation von 100 μM Vertacetal^® coeur oder PI 24513 potenziert die Antwort auf GABA in diesen Rezeptoren und induziert weiterhin auch Ströme in Abwesenheit von GABA. Dieses Verhalten ist typisch für Modulatoren, die auf β Untereinheiten wirken, und wird auch für Propofol oder Barbiturate gefunden (Bsp. 5).
Die Untersuchung von punkmutierten GABA-Untereinheiten lässt weitere Rückschlüsse auf die beteiligten Untereinheiten und den Mechanismus der Wirkung zu. Es ist bekannt, dass eine Punktmutation in der TM3-Region der β₁ Untereinheit (M286W) die Potenzierung von GABA durch Propofol verhindert. Dieses Propofoltypische Verhalten zeigen auch [1,3]-Dioxanderivate. Die GABA-Antworten in Oozyten, welche α₁β_1(M286W) GABA_A Rezeptoren exprimieren, werden durch [1,3]-Dioxanderivate (z. B. 100 μM Vertacetal^® coeur) nicht potenziert. In nichtmutierten Rezeptoren hingegen ist 100 μM Vertacetal^® coeur ein effektiver Modulator, welcher die Antwort von 5 μM GABA in Oozyten um 6,0 ± 0,6 fach potenziert. Die TM3-Region der β Untereinheit ist also eine der strukturellen Determinanten der Potenzierung durch [1,3]-Dioxanderivate, und zwar in ähnlicher Weise wie für Propofol beschrieben (Bsp. 5).
[1,3]-Dioxanderivate haben eine hohe Spezifität für GABA_A Rezeptoren, die eine β₁ Untereinheit enthalten. Die Entwicklung von untereinheitenspezifischen Potenzierern ermöglicht die Entwicklung von GABA-Potenzierern mit hoch spezifischem Wirkspektrum, z. B. von Drogen, die nur angstlösend, aber nicht beruhigend wirken.
Die neu entwickelten [1,3]-Dioxanderivate zeigen eine hohe Affinität für Rezeptoren, die β₁ Untereinheiten enthalten. Die Affinitäten der einzelnen Substanzen in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des GABA-Rezeptors können im Xenopus Expressionsystem bestimmt werden. Der EC₅₀-Wert gibt an, bei welcher Konzentration ein halbmaximaler Potenzierungseffekt erzielt wird. Die Affinität von z. B. PI 24513 für α₁β₁γ₂ Rezeptoren ist sehr hoch mit einem EC₅₀ von 32.5 ± 5.6 μM (n = 7). Für die Potenzierung von Rezeptoren, die β₂ oder β₃ Untereinheiten enthalten, sind in etwa sechsfach höhere Konzentrationen nötig, wie man anhand der höheren EC₅₀-Werte erkennt für α₁β₂γ₂ (EC₅₀ = 177 ± 11 μM, n = 7) oder α₁β₃γ₂ Rezeptoren (EC₅₀ = 196 ± 42 μM, n = 6). Ähnliches gilt auch für α₁β₁, α₁β₂ und α₁β₃ Rezeptoren. Das [1,3]-Dioxanderivat PI 24513 hat also eine fünf bis sechsfach höhere Affinität für β₁ beinhaltende Rezeptoren als für Rezeptoren mit β₂ oder β₃ Untereinheiten (Bsp. 6). Wirkstoffe, die eine starke Untereinheitenspezifität haben, können Gehirnbereiche beeinflussen, in denen diese Untereinheit besonders prominent ist. Eine spezifische Modulation von β₁ enthaltenden Rezeptoren wird in besonderem Maße Gehirnbereiche betreffen, in denen diese Untereinheit hoch exprimiert ist. Diese Untereinheit ist besonders stark im Hippocampus zu finden, lässt sich aber auch in anderen Gehirnbereichen nachweisen (Wisden et al., 1992).
[1,3]-Dioxanderivate haben eine Wirkung auf das Verhalten von Mäusen in vivo. Um die Wirkung von GABA-Modulatoren in vivo zu untersuchen, steht eine Vielzahl von Verhaltestests im Mausmodell zur Verfügung. Durch den so genannten ”open field” Test lassen sich insbesondere sedierende und angstlösende Wirkungen untersuchen. Um entsprechende Wirkungen von z. B. PI 24513 oder Vertacetal^® coeur in Mäusen zu untersuchen, kann man die erkundende Bewegungsaktivität von Labormäusen (Stamm C57BL/6) nach Injektion (i. p.) von PI 24513 (0,02, 0,05, 0,1, 0,2 oder 0,5 g/kg) über einen Zeitraum von 30 min in einem ”open field” Test bestimmen. Die Injektion von PI 24513 (0,5 oder 0,2 g/kg) vermindert signifikant die Bewegungsaktivität um 87% (P < 0,001; Mann-Whitney U-Test) und 75% (P < 0,01; Mann-Whitney U-Test) verglichen mit kontrollinjezierten Mäusen (2, oben).
Eine entsprechende Wirkung lässt sich auch erzielen, wenn die Labortiere Vertacetal^® coeur als Geruch ausgesetzt werden. Naive C57BL/6 Mäuse werden in eine ”open field” Arena gesetzt und dem Geruch von Vertacetal^® coeur ausgesetzt.
Die aufsummierten Laufstrecken in zehnminütigen Intervallen wurden über einen Zeitraum von zwei Stunden bestimmt. Die Bewegungsaktivität von Mäusen, welche dem Vertacetal^® coeur Geruch ausgesetzt sind, und der Kontrollgruppe zeigt 2 (unten). Beide Gruppen zeigen eine typische höhere Bewegungsaktivität während der anfänglichen Zeit in der ”open field” Arena und erreichen dasselbe Aktivitätslevel nach Habituation. Eine Zwei-Weg ANOVA Analyse basierend auf Behandlung mit Vertacetal^® coeur und Zeit beweist aber, dass die Inhalation von Vertacetal^® coeur signifikant die Bewegungsaktivität verändert (F₍ ₁ _, ₇₂ ₎ = 15,96; P < 0,001), mit einer signifikanten Wechselwirkung zwischen der Vertacetal^®coeurApplikation und der Zeit (F_(11,72) = 2,06; P < 0,05). Eine Turkey post hoc Analyse zeigt, dass die Inhalation von Vertacetal^® coeur die Bewegungsaktivität während der ersten 20 min, in welcher die Mäuse einer neuen Umgebung ausgesetzt sind, signifikant erniedrigt (P < 0,05–0,01).
Die erfindungsgemäßen [1,3]-Dioxane nach Ausführungsform (3) sind bevorzugt [1,3]-Dioxane mit

(i) der Strukturformel (II)
wobei R ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Halogen, und bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl oder Halogen ist; R4, R5 und R6 Methyl sind;
(ii) der Strukturformel (III)
wobei R ausgewählt ist aus H, Ethyl, Propyl und Butyl;
(iii) der Strukturformel (IV)
wobei R ausgewählt ist aus Ethyl, Propyl und Butyl; und
(iv) der Strukturformel (V)
wobei R ausgewählt ist aus Ethyl, Propyl und Butyl.

”Halogen” bzw. ”Hal” ist ein Halogen-Atom, also in allen im Kontext der vorliegenden Erfindung genannten Strukturformeln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, Br und I. In CHal₃-Gruppen sind alle Halogenatom bevorzugt dieselben Atome, also repräsentiert CHal₃ bevorzugt CF₃, CCl₃, CBr₃ oder CI₃.
Weder EP 0288279 noch DE 3429227 beschreiben diese erfindungsgemäßen 1,3-Dioxanderivate, denn die in ihnen beschrieben 1,3-Dioxane haben ein anderes Substitutionsmuster.
Die Synthese der erfindungsgemäßen 1,3-Dioxane erfolgt in EP 0982303 beschrieben. Sie umfasst eine säurekatalysierte Umsetzung eines geeigneten Styrolderivates mit Aldehyden gemäß dem nachfolgenden Reaktionsschema:
wobei die Variablen R, R4, R5 und R6 die vorstehend angegebene Bedeutung haben.
Die Verabreichung eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen [1,3]-Dioxane an einen Patienten erfolgt nach Maßgabe des behandelnden Arztes. Die Art und Dauer der Verabreichung und die Dosis hängt dabei unter anderem von der Art und Schwere der Erkrankung, dem Alter und der Konstitution des Patienten ab.
Die Zusammensetzung enthaltend einem oder mehreren der erfindungsgemäßen [1,3]-Dioxane gemäß Ausführungsform (7) ist z. B. eine Duftstoffzusammensetzung oder ein Parfümöl, die zusätzlich übliche Trägerstoffe, Stabilisatoren usw. enthalten kann. Die Zusammensetzung (7) kann auch ein Reagenzienkit oder diagnostisches Werkzeug sein, der/das für Nachweisverfahren eingesetzt werden kann, um spezifisch β₁-enthaltende GABA-Rezeptoren in vivo oder in vitro zu aktivieren oder um pharmakologisch zu prüfen, ob in einem GABA-Rezeptor enthaltenden Präparat β₁-enthaltende GABA-Rezeptoren vorkommen.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch die Erfindung nicht einschränken.
Beispiele
In den folgenden Beispielen wurden Standard-Methoden der Molekularbiologie und der DNA-Rekombinantion verwendet, wie sie in verschiedenen Standardwerken beschrieben sind, z. B. in Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, and Current Protocols in Cell Biology, Stand 2002, Wiley Interscience. Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Enzyme, Zellen, Reagentien, Apparate und Kits nach Herstellervorschrift verwendet.
Beispiel 1: GABA_A Rezeptor-Untereinheit-cDNAs und -cRNAs
Um GABA-Rezeptor cRNA mittels einer in vitro Transcription zu erzeugen, wurden Plasmide verwendet, welche die proteinkodierende Sequenz verschiedener GABA-Rezeptor cDNAs in der EcoRV-Schnittstelle des Polylinkers des Xenopus-Oocyten Expressionsplasmids pSGEM (Villmann, C.; Bull, L.; Hollmann, M., (1997) J. Neurosci. (20), p 7634–43) enthielten.

Plasmid 1: GABAα₁ der Ratte, insertierte DNA-Sequenz = SEQ ID NO:1 (AY574250, nt 1–1338).
Plasmid 2: GABAβ₁ der Ratte, insertierte DNA-Sequenz = SEQ ID NO: 2 (NM_012956, nt 78–1502).
Plasmid 3: GABAγ₂₁ der Maus, insertierte DNA-Sequenz = SEQ ID NO: 3 (NM_177408, nt 56–1393.
Plasmid 4: GABAβ₂ der Ratte, insertierte DNA-Sequenz = SEQ ID NO: 4 (NM_012957, nt 77–1501).
Plasmid 5: GABAβ₃ des Menschen, insertierte DNA-Sequenz = SEQ ID NO: 5 (NM_000814, nt 143–1564).
Plasmid 6: GABAβ₁₍ _M286W ₎ der Ratte, insertierte DNA-Sequenz = SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO: 2 mit Austausch von nt 856–858 (ATG) gegen TGG).

GABA-Rezeptoren aus Säugetieren (Ratte, Maus, Mensch) sind unter folgenden GenBank-Zugangsnummern zu finden: GABAα₁ (AY574250), GABAβ₁ (NM_012956), GABAβ₂ (NM_012957), GABAβ₃ (NM_000814) und GABAγ₂ (NM_177408). Die Plasmide wurden mit dem Enzym PacI linearisiert und die cRNA mit Hilfe des AmpliCap T7 high-yield message marker kit (Epicentre, Madison, WI, U. S. A.) synthetisiert. Dazu wurde 1 μg linearisierte Plasmid-DNA, suspendiert in 6 μl Wasser, mit 2 μl 10×Transkriptionspuffer, 8 μl Cap/PreMix, 2 μl 100 mM DTT und 2 μl ApliCap_Max T7 Enzym gemischt und 30 min bei 37°C inkubiert. Die entstandene cRNA wurde durch Fällung mit Ammoniumacetat gereinigt und in Wasser aufgenommen.
Beispiel 2: Expression rekombinanter GABA_A Rezeptoren in Xenopus Oozyten
Operativ präparierte Oozyten von Xenopus laevis (Nasco, USA) wurden mit 4 mg/ml KollagenaseA in Barth's Lösung ohne Calcium (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO₄, 2,4 mM NaHCO₃, 7,5 mM Tris-HCl, pH 7,5) für 2 h inkubiert. Defollikulierte Oozyten wurden anschliessend manuell abgetrennt, mit Barth's Lösung gewaschen (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO₄, 2,4 mM NaHCO₃, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,41 mM CaCl₂, 7,5 mM Tris-HCl, pH 7,5) und über Nacht bei 17°C gelagert. Am nächsten Tage wurden Oozyten mit cRNA (50 ng per Oozyte) injiziert und bei 17°C in ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM Hepes, pH 7,2) inkubiert. 3 bis 6 Tage nach Injektion der cRNA wurden die Oozyten aus GABA-Rezeptorexpression mit dem Zwei-Elektroden voltage-clamp System überprüft. Die Messelektroden wurden mit einem automatischen Pipettenziehgerät gezogen und mit 3 M KCl gefüllt. Oozyten wurden in eine Messkammer platziert und mit Frosch-Ringerlösung (115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 10 mM Hepes, pH 7,2) perfundiert. Stromsignale wurden mit einem Zwei-Elektroden voltage-clamp Verstärker (TURBO TEC-03, npi, Tamm, Deutschland) gemessen und mit der pCLAMP software (Axon Instruments, Union City, CA, U. S. A.) aufgezeichnet und analysiert. Das Membranpotential bei den Messungen war typischerweise bei –40 bis –60 mV. GABA, die entsprechenden Testsubstanzen oder die Mischung auf GABA und Testsubstanz wurden über ein manuelles „multibarrel” Perfusionssystem zugegeben. Die typische Applikationsdauer betrug 10 Sekunden.
Beispiel 3: Effekt von Vertacetal^® coeur auf α₁β₂γ₂ GABA_A Rezeptoren
Rekombinante α₁β₂γ₂ GABA_A Rezeptoren wurden funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert (Beispiel 1–2). Vertacetal^® coeur potenziert die Antwort von 5 μM GABA in einer dosisabhängigen Art und Weise (1A). Die maximal beobachtete Potenzierung war 1518 ± 133% bei 1 mM Vertacetal^® coeur (n = 7) bezogen auf die Antwort von 5 μM GABA als 100%. Der EC₅₀ Wert für die Potenzierung mit Vertacetal^® coeur beträgt 210 μM (n = 7, 1B). 1 zeigt ein Ergebnis solch einer Messung.
Beispiel 4: Untersuchung der relativen Wirksamkeit von verschiedenen [1,3]-Dioxanderivaten
Rekombinante α₁β₁ GABA_A Rezeptoren wurden funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert (siehe Beispiel 1–2). Die potenzierende Wirkung verschiedener Derivate von 1,3 Dioxanen auf die GABA-induzierten Ströme wurde untersucht. Dazu wurde GABA (3–10 μM) alleine oder in Mischung mit 100 μM der verschiedenen 1,3 Dioxanderivate auf die Oozyten appliziert (n = 3 – 10 für jede Substanz). Aus dem Vergleich der evozierten Amplituden (GABA und GABA+ 1,3 Dioxan) wurde die Potenzierung bestimmt.
Es wurden Vertacetal coeur, Magnolan, 4-Phenyl-[1,3]-Dioxan und die folgenden [1,3]-Dioxanderivate getestet:
PI24511 hat die in Formel IV gezeigte Struktur mt einer Methylgruppe in para Position
PI22471 hat die in Formel III gezeigte Struktur mit einer Methoxygruppe in para Position

Die Testergebnisse zeigt Tabelle 3. Es kann aus diesen Messungen gefolgert werden, dass H- oder CH3-Substituenten am aromatischen Ring besonders bevorzugt sind. Weiterhin sind auch Dioxanderivate mit vom VC abweichenden Substitutionsmuster am Dioxanring wie z. B. Magnolan aktiv. Tabelle 3: Wirkung verschiedener [1,3]-Dioxane auf GABA_A Rezeptoren

Substanz	Amplitude relativ zu EC_10-15 GABA
Hohe Aktivität
Vertacetal^®coeur	6,0 ± 0,6
Vertacetal	5,6 ± 0,6
PI24513	6,6 ± 0,4
PA051244	6,8 ± 0,7
PA051242	6,1 ± 0,6
Mittlere Aktivität
Magnolan	2,2 ± 0,2
PI23758	2,9 ± 0,7
PI24511	2,4 ± 0,7
Geringe Aktivität
PI24471	1,3 ± 0,03
PI24514	1,9 ± 0,5
4-phenyl-[1,3]-dioxan	1,2 ± 0,2

Beispiel 5: Identifizierung der β-Untereinheit als Wirkungsort für 1,3 Dioxanderivate
Rekombinante β₁ GABA_A Rezeptoren, α₁β₁ GABA_A Rezeptoren und mutierte α₁β_1(M286W) Rezeptoren wurden wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert.
Die GABA-Antwort (5 μM) durch β₁ GABA_A Rezeptoren wurde durch 100 μM Vertacetal und 100 μM PI24513 potenziert (3A).
Die GABA-Antworten (5 μM) in Oozyten, welche α₁β_1(M286W) GABA_A Rezeptoren exprimieren, wurden durch [1,3]-Dioxanderivate (100 μM PI24513, 100 μM Vertacetal^® coeur) nicht potenziert (3C). In nichtmutierten Rezeptoren hingegen sind diese Substanzen effektive Potenzierer der GABA-Antwort (3B) (siehe auch Bsp. 4).
Beispiel 6: Bestimmung der untereinheitenspezifischen Wirkung von [1,3]-Dioxanderivaten
Rekombinante α₁β₁γ₂, α₂β₂γ₂ oder α₁β₃γ₂ GABA_A Rezeptoren wurden wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert. Die Dosisabhängigkeit der Potenzierung durch PI24513 wurde bestimmt, indem GABA mit verschiedenen Konzentrationen von PI24513 ko-appliziert wurde. Die normalisierte Potenzierung wurde gegen die Konzentration von PI24513 aufgetragen und EC50-Wert bestimmt (4)
Beispiel 7: Verhaltensstudien
Sechs Wochen alte C57BL/6 Mäuse wurden in einer Klima-kontrollierten Kolonie mit einem 12 Std. Tag/Nacht Zyklus gehalten und mit Futter und Wasser ad libitum versorgt. Vertracetal^® coeur und PI24513 wurden in PEG 400 gelöst (0,02–0,5 g/kg) und ein Volumen von 5 ml/kg Körpergewicht zwei Stunden vor dem Test i. p. injiziert. In Kontrollen wurde nur PEG injiziert. Behandelte Mäuse wurden für 30 min in eine quadratische Kammer gesetzt (40 cm × 40 cm × 40 cm opakes Plexiglas). Für die Duftexpositionsexperimente wurden 500 μl Vertacetal^® coeur (Reinsubstanz) in die quadratischen Kammern eingebracht, die Behältnisse mit einem transparenten Deckel abgedeckt und die Mäuse 2 Stunden in der Arena belassen. Eine digitale Videokamera (TSE, Bad Homburg, Deutschland) war über den Kästen befestigt, um die Bewegung der Versuchstiere aufzuzeichnen. Als Parameter für die Bewegungsaktivität wurden die horizontalen Laufdistanzen ausgewertet.
Ergebnis: Die Injektion von PI24513 (0,5 oder 0,2 g/kg) verminderte signifikant die Bewegungsaktivität um 87% (P < 0,001; Mann-Whitney U-Test) und 75% (P < 0,01; Mann-Whitney U-Test) verglichen mit kontrollinjizierten Mäusen (2, oben). Vertacetal^® coeur wirkte in diesen Konzentrationen ebenfalls statistisch signifikant.
Eine entsprechende Wirkung lässt sich auch erzielen, wenn die Labortiere Vertacetal^® coeur als Geruch ausgesetzt werden. Die Bewegungsaktivität von Mäusen, welche dem Vertacetal^® coeur Geruch ausgesetzt waren, und der Kontrollgruppe zeigt 2 (unten). Beide Gruppen zeigten eine typische höhere Bewegungsaktivität während der anfänglichen Zeit in der ”open field” Arena und erreichten dasselbe Aktivitätslevel nach Habituation. Eine Zwei-Weg ANOVA Analyse basierend auf Behandlung mit Vertacetal^® coeur und Zeit bewies aber, dass die Inhalation von Vertacetal^® coeur signifikant die Bewegungsaktivität verändert (F₍ ₁ _, ₇₂ ₎ = 15,96; P < 0,001), mit einer signifikanten Wechselwirkung zwischen der Vertacetal^® coeur-Applikation und der Zeit (F_(11,72) = 2,06; P < 0,05). Eine Turkey post hoc Analyse zeigt, dass die Inhalation von Vertacetal^® coeur die Bewegungsaktivität während der ersten 20 min, in welcher die Mäuse einer neuen Umgebung ausgesetzt sind, signifikant erniedrigt (P < 0,05–0,01).
Beispiel 8: Exemplarische 1,3-Dioxan-Synthese
Die Synthese aller 1,3-Dioxane der vorliegenden Anmeldung wurde wie in EP 0982303 beschrieben durchgeführt.
In einem 500 ml Dreihalskolben mit Flügelrührer, Kühlschale, Tropftrichter, Thermometer und Kühler wurden 19,3 g Eis und 25,8 g Schwefelsäure vorgelegt. Anschließend wurden unter Rühren 48 ml Hexan und bei 20–25°C ein Gemisch aus 34,5 g Paraldehyd und 45 g (0,34 mol) 2,m-Dimethylstyrol zugetropft. Es wurde 6 h unter Rückfluß erhitzt und anschließend bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Danach wurden die Phasen getrennt, die organische Phase mit je 7 g Soda-Lösung und Wasser neutral gewaschen und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abgezogen. Die Rohausbeute betrug 55,3 g (74%). Es wurde an einer Kieselgel-Säule chromatographisch gereinigt.
Ausbeute: 41 g (55%) eines Gemisches aus zwei Isomeren
Isomer I: (2RS,4SR,6RS)-2,4,6-Trimethyl-4-m-tolyl-1,3-dioxan
GC: 20 m ZB-Wax 0.18 μm, df: 0,18 mm, 60-9-220°C KAS Nr. 86740
RT: 7,540, Retentionsindex: 1824,93, GC-%: 46,65.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 1,229 (d, J = 6,1 Hz, 3H), 1,388 (d, 3 = 5,1 Hz, 3H), 1,406 (s, 3H), 1,673 (dd, 3 = 11,5 Hz, 3 = 13,8 Hz, 1H), 2,326 (dd, 3 = 1,9 Hz, 3 = 13,7 Hz, 1H), 2,360 (s, 3H), 3,672 (ddq (12 Linien), 3 = 2,1 Hz, 3 = 6,2 Hz, 3 = 11,5 Hz, 1H), 4,709 (q, 3 = 5,1 Hz, 1H), 7,03-7,08 (m, 1H), 7,12-7,14 (m, 2H), 7,22 – 7,25 ppm (m, 1H).
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ = 21,19 (q), 21,60 (q), 21,63 (q), 34,31 (q), 41,08 (t), 69,10 (d), 76,61 (s), 93,77 (d), 123,00 (d), 126,56 (d), 127,60 (d), 128,60 (d), 138,28 ppm (s).
MS (70 eV): M = 219 (M-1), 205, 176, 160, 145 (100%), 119 (100%), 132, 105, 91.
Isomer II: (2RS,4RS,6RS)-2,4,6-Trimethyl-4-m-tolyl-1,3-dioxan
GC: 20 m ZB-Wax 0.18 μm, df: 0,18 mm, 60-9-220°C KAS Nr. 86740
RT: 9,308, Retentionsindex: 1987,86, GC-%: 42,58.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 1,223 (d, 3 = 6,2 Hz, 3H), 1,342 (d, 3 = 5,2 Hz, 3H), 1,59 (d, 3 = 0,6 Hz, 3H), 1,612 (dd, 3 = 12 Hz), 1,797 (dd, 3 = 2,3 Hz, 3 = 13,2 Hz, 1H), 2,366 (s, 3H), 4,018 (ddq (12 Linien), J = 2,4 Hz, 3 = 6,2 Hz, 3 = 11,7 Hz, 1H), 5,195 (q, 3 = 5,1 Hz, 1H), 7,03-7,08 (m, 1H), 7,22 – 7,25 (m, 2H), 7,28 ppm (m, 1H).
¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ = 21,66 (q), 21,71 (q), 21,81 (q), 23,20 (q), 43,66 (t), 68,62 (d), 92,28 (d), 120,95 (d), 124,63 (d), 127,30 (d), 128,04 (d), 137,68 ppm (s).
MS (70 eV): 220 (M), 205, 176, 159, 134, 119 (100%), 91, 43.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Verwendung von [1,3]-Dioxanen mit der Strukturformel (I)
worin R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, C_1-6-Alkyl und C_1-6-Alkoxy; R4, R5 und R6 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H und C_1-3-Alkyl; und R7 ausgewählt ist aus H und C_1-3-Alkyl oder R1 mit R7 über eine -C(R₄)_n- Brücke verknüpft ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, zur Verstärkung der Wirkung von GABA auf GABA_A-Rezeptoren.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Methyl, Ethyl, nPropyl, iPropyl, nButyl, secButyl, tertButyl, Methoxy und Halogen; R4 ausgewählt ist aus H, Methyl und Ethyl; R5 und R6 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Methyl und Ethyl; und R7 ausgewählt ist aus H, Methyl und Ethyl oder R1 mit R7 über eine -CH₂-CH₂- oder -CH₂- Brücke verknüpft ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei in der Strukturformel (I) (i) zwei der drei Reste R1, R2 und R3 H sind, und der dritte dieser Reste ausgewählt ist aus H, Methyl, Ethyl, nPropyl, iPropyl, nButyl, secButyl, tertButyl und Halogen; und/oder (ii) drei der vier Reste R4, R5, R6 und R7 Methyl oder Ethyl sind und der vierte dieser Reste H ist, wobei vorzugsweise R4 Methyl ist, R5 und R6 Methyl sind; und R7 H ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die [1,3]-Dioxane ausgewählt sind aus Verbindungen (i) der Strukturformel (II)
wobei R ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Halogen und R4, R5 und R6 Methyl sind; (ii) der Strukturformel (III)
wobei R ausgewählt ist aus H, Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl; (iii) der Strukturformel (IV)
wobei R ausgewählt ist aus Ethyl, Propyl und Butyl; und (iv) der Strukturformel (V)
wobei R ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die [1,3]-Dioxane ausgewählt sind aus Verbindungen mit der Strukturformel
und bevorzugt 2,4,6-Trimethyl-4-(4-methylphenyl)-1,3-dioxan verwendet wird.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei (i) die [1,3]-Dioxane spezifische Modulatoren von GABA_A-Rezeptoren sind, welche mindestens eine β₁-Untereinheit enthalten; und/oder (ii) die GABA_A-Rezeptoren Säuger-Rezeptoren sind und bevorzugt aus Mensch, Maus oder Ratte stammen.
Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei die [1,3]-Dioxane zur Prophylaxe und/oder Therapie von Depressionen, Unruhe- und Angstzuständen, Schlafstörungen, Epilepsie, Demenzerkrankungen und/oder Migräne eingesetzt werden.
[1,3]-Dioxan mit (i) der Strukturformel (II)
wobei R ausgewählt ist aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Halogen und R4, R5 und R6 Methyl sind; (ii) der Strukturformel (III)
wobei R ausgewählt ist aus H, Ethyl, Propyl und Butyl; (iii) der Strukturformel (IV)
wobei R ausgewählt ist aus Ethyl, Propyl und Butyl; und (iv) der Strukturformel (V)
wobei R ausgewählt ist aus Ethyl, Propyl und Butyl.
[1,3]-Dioxan gemäß Anspruch 8, das eine Verbindung mit der Strukturformel (VI) ist
wobei 2,4,6-Trimethyl-4-(4-methylphenyl)-1,3-dioxan besonders bevorzugt ist.
Verfahren zur Herstellung der [1,3]-Dioxane nach Anspruch 8 oder 9, umfassend die Reaktion
wobei R, R4, R5 und R6 die in Anspruch 8 oder 9 angegebene Bedeutung hat.
Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eines oder mehrere der [1,3]-Dioxane wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 9 definiert.
Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 zur Therapie von Depressionen, Unruhe- und Angstzuständen, Schlafstörungen, Epilepsie, Demenzerkrankungen und/oder Migräne.
Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11 oder 12, zusätzlich enthaltend einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Zusammensetzung, enthaltend eines oder mehrere der [1,3]-Dioxane wie in Anspruch 8 oder 9 definiert.
Verwendung eines [1,3]-Dioxanes wie in einem oder mehreren der Anspüche 1 bis 5 oder 8 bis 9 definiert als Reagenzienkit oder diagnostisches Werkzeug, um spezifisch β₁-enthaltende GABA-Rezeptoren in vivo oder in vitro zu aktivieren oder um pharmakologisch zu prüfen, ob in einem GABA-Rezeptor enthaltenden Präparat β₁-enthaltende GABA-Rezeptoren vorkommen.