DE102008027331A1

DE102008027331A1 - Verwendung von Indol-3-carbonsäureestern zur Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase

Info

Publication number: DE102008027331A1
Application number: DE102008027331A
Authority: DE
Inventors: Reinhard Troschütz; Eva-Maria Karg; Oliver Prof. Werz; Andreas Koeberle
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Friedrich Alexander Univeritaet Erlangen Nuernberg FAU
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Friedrich Alexander Univeritaet Erlangen Nuernberg FAU
Priority date: 2008-06-07
Filing date: 2008-06-07
Publication date: 2009-12-10
Also published as: WO2009146696A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Indol-3-carbonsäureestern und seiner Derivate zur Hemmung der induzierbaren mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 und/oder zur Hemmung der 5-Lipoxygenase. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Derivaten des 3-Carboxy-aryl[g]indols, vor allem von 2-Aryl- und 2-Arylalkyl-Aryl[g]indol-3-carbonsäureestern sowie deren strukturellen Abkömmlingen zur Hemmung der induzierbaren mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 und/oder zur Hemmung der 5-Lipoxygenase. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Indol-3-carbonsäureestern zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von PGE2- und/oder 5-LO-vermittelter Erkrankungen und krankhafter Zustände, insbesondere von entzündlichen chronischen Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Asthma, allergische Rhinitis, Multiple Sklerose, entzündliche Hauterkrankungen, Osteoporose und Krebs, Schmerz und Fieber, bei denen PGE2 und/oder 5-LO-Produkte eine Rolle spielen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Derivaten des 3-Carboxyindols, vor allem von 2-Aryl- und 2-Alkylaryl-indol-3-carbonsäureestern sowie deren strukturellen Abkömmlinge zur Hemmung der induzierbaren mikrosomalen Prostaglandin E₂ Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Derivaten des 3-Carboxyaryl[g]indols, vor allem 2-Aryl- und 2-Arylalkyl-Aryl[g]indol-3-carbonsäureester, zur Hemmung der mPGES-1 und der 5-LO. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Indol-3-carbonsäureestern zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Prostaglandin (PG)E₂- und/oder 5-LO-vermittelter Erkrankungen und krankhafter Zustände.
Akute und chronische entzündliche Erkrankungen gehen mit einer erhöhten Aktivität von entzündungsrelevanten Zellen wie z. B. Monozyten, Granulozyten, Lymphozyten und endothelialen Zellen einher, die vermehrt PGE₂ und/oder 5-LO Produkte (hauptsächlich Leukotriene (LTs)) freisetzen. Diese 5-LO Produkte und das PGE₂ sind maßgeblich für die Entstehung und Aufrechterhaltung entzündlicher Symptomatik (Schmerz, Schwellung, Rötung, Überwärmung und Funktionsverlust) verantwortlich bzw. wirken fördernd darauf ein. Daneben fördern 5-LO Produkte allergisches Asthma und allergische Rhinitis, sind an der Entstehung und Progression der Arteriosklerose beteiligt und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Pathologie kardiovaskulärer Erkrankungen (z. B. Angina pectoris, Schlaganfall, Herzinfarkt etc.). Weiterhin haben PGE₂ und 5-LO Produkte eine wichtige Funktion bei der Proliferation verschiedener Zellen und sind für die Entstehung und Aufrechterhaltung von Krebserkrankungen verantwortlich.
Die PG-Biosynthese wird durch die katalytische Umsetzung von Arachidonsäure zu PGH₂ durch die Cyclooxygenase (COX)-1 oder -2 eingeleitet (1). Gewisse PGs, dazu gehörend das PGE₂, sind Mediatorstoffe bei Entzündungen (v. a. rheumatoide Arthritis), Schmerz und Fieber, und sind des Weiteren bei Krebserkrankungen (Lunge, Kolon, Endometrium) beteiligt. Andere PGs dagegen erfüllen wichtige physiologische Funktionen [1, 2]. Hemmstoffe der COX-1 und -2 unterbinden damit die Synthese aller PGs und weisen aufgrund des Mangels physiologisch wichtiger PGs beträchtliche Nebenwirkungen (Magen, Niere) auf [3]. Die induzierbare mPGES-1 ist Mitglied der MAPEG Familie und katalysiert die Umwandlung von PGH₂ zu PGE₂ [4]. PGE₂ vermittelt seine Effekte über vier G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (sog. EP-Rezeptoren) auf entsprechenden Zielzellen und weist im Gegensatz zu den physiologisch notwendigen PGs ausgeprägte pathophysiologische Eigenschaften (Entzündung, Schmerz, Fieber, Krebserkrankungen, Angiogenese) auf. Im Magen und in der Niere trägt PGE₂ allerdings zur Homöostase bei.
Seit Entdeckung der induzierbaren mPGES-1 im Jahre 1999 ist man bestrebt, potente und selektive Hemmstoffe gegen die mPGES-1 zu entwickeln, um die entzündliche PGE₂ Synthese selektiv zu inhibieren, ohne dabei die Bildung der physiologisch wichtigen PGs zu unterdrücken [4, 5]. Dies macht die mPGES-1 zu einem interessanten Arzneistoff-Target, v. a. bei chronisch entzündlichen Erkrankungen (rheumatoide Arthritis), die mit Schmerz oder auch mit Fieber einhergehen, aber auch bei diversen Krebserkrankungen. Allerdings ist bislang kein Hemmstoff der mPGES-1 als Arzneimittel zur Therapie zugelassen. Nur eine geringe Anzahl an Hemmstoffen (wie z. B. MK-886) ist derzeit verfügbar und die Substanzen befinden sich noch in klinischer Prüfung. Die Motivation der pharmazeutischen Forschung sichere und selektive Hemmstoffe der mPGES-1 zu finden ist enorm.
Die 5-Lipoxygenase ist das Schlüsselenzym der Leukotrienbiosynthese, welches die Umsetzung der freien Arachidonsäure mit molekluarem Sauerstoff zur 5-Hydroperoxyeikosatetraensäure (5-HPETE) katalysiert (2) [6]. 5-HPETE kann durch Peroxidasen zum korrespondierenden Alkohol 5-Hydroxyeikosatetraensäure (5-HETE) reduziert oder erneut unter Katalyse der 5-LO zum LTA₄ umgesetzt werden. Das instabile LTA₄ wird dann enzymatisch zu LTB₄ oder zu den Cysteinyl-LTs C₄, D₄ und E₄ umgesetzt. Sämtliche 5-LO Produkte binden und agieren über spezifische G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf verschiedenen Zielzellen und vermitteln so ihre Wirkung. Diese biologischen Wirkungen reichen u. a. von der Chemotaxis und Chemokinese von Leukozyten, Aktivierung funktioneller Prozesse von Phagozyten, Erhöhung der Kapillarpermeabilität und Plasmaexudation, Konstriktion glatter Muskelzellen, insbesondere der Bronchiolen, bis hin zur Stimulation der Proliferation verschiedener Zelltypen [7]. Aufgrund der Kenntnis dieser Wirkungen und aufgrund von Studienergebnissen unter Verwendung von Hemmstoffen der 5-LO Produktbildung oder von LT Rezeptorantagonisten sowie von 5-LO knock-out-Mäusen, geht man davon aus, dass eine überschießende, nicht physiologische 5-LO Produktbildung an der Entstehung und Aufrechterhaltung von Erkrankungen und krankhaften Zuständen beteiligt ist, wie z. B. an entzündlichen Hauterkrankungen (Psoriasis, Neurodermitis), Asthma, allergische Rhinitis, Osteoarthritis, Rheumatoide Arthritis, Osteoporose, kardiovaskulären Erkrankungen (Arteriosklerose, Schlaganfall, Herzinfarkt, etc.) und auch bei Krebs (z. B. Pankreaskarzinom, Prostatakarzinom, Mamakarzinom etc.) [7].
Bislang wurden zahlreiche 5-LO Inhibitoren und Leukotrienrezeptorantagonisten entwickelt. 5-LO Inhibitoren unterteilen sich gemäß dem molekularen Wirkungsmechanismus in (I) redoxaktive Substanzen, (II) Eisenligandinhibitoren, und (III) nicht-redoxaktive (kompetitive) 5-LO inhibitoren [8]. Ein weiterer Ansatz die 5-LO Produktbildung zu hemmen, besteht in der Blockade des 5-LO-aktivierenden Proteins (FLAP) durch niedermolekulare Inhibitoren. Während die Leukotrienrezeptorantagonisten (z. B. Montelukast, Zafirlukast und Pranlukast) fester Bestandteil der Asthmatherapie sind, ist derzeit nur ein 5-LO Inhibitor (Zileuton) als Arzneimittel zugelassen. Der Grund liegt an der geringen Wirksamkeit am Patient und/oder and den zahlreichen und schweren Nebenwirkungen der Wirkstoffe, insbesondere von redoxaktiven 5-LO Inhibitoren.
Zusammenfassend spielen also sowohl die mPGES-1 als auch die 5-LO Schlüsselrollen bei entzündlichen bzw. allergischen Erkrankungen, die jedoch sowohl hinsichtlich der unterschiedlichen Angriffspunkte des PGE₂ (EP-Rezeptoren) und der 5-LO Produkte (LT-Rezeptoren) als auch der Wirkungsweisen sehr unterschiedlich sind. Dies impliziert, dass die kombinierte/gleichzeitige Unterdrückung beider Enzyme zu einem additiven oder auch synergistischen Effekt führen kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Substanzen zu identifizieren, die die PGE₂ Synthese potent hemmen und die zusätzlich in der Lage sind, die 5-LO zu inhibieren und somit entzündliche, allergische und neoplastische Prozesse in einer additiven und/oder synergistischen Weise blockieren. Dabei sollen die Nachteile der bekannten Verfahren (Einsatz von steroidalen Antirheumatika (Glukokorticoide), NSAIDs, COX-2-selektiven Hemmstoffen, redoxaktive 5-LO Inhibitoren, und Leukotrienrezeptorantagonisten) umgangen werden und Wirkstoffe identifiziert werden, die zur Herstellung eines Arzneistoffes zur therapeutischen Behandlung von 5-LO Produkt- und/oder PGE₂-vermittelten Erkrankungen, insbesondere von chronischen Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Asthma, allergische Rhinitis, Multiple Sklerose, entzündliche Hauterkrankungen, Osteoporose, und Krebs, und krankhafter Zustände, insbesondere Schmerz und Fieber, verwendet werden können, um bei einer hohen Effizienz geringe Nebenwirkungen aufzuweisen.
Diese Aufgabe wird durch den Einsatz von Indol-3-carbonsäureestern, insbesondere von 2-Aryl- und 2-Arylalkyl-indol-3-carbonsäureestern sowie deren strukturellen Derivaten, gelöst, wie es im Anspruch 1 und abhängigen Ansprüchen 2 bis 9 beschrieben ist.
Es hat sich in der vorliegenden Erfindung herausgestellt, dass Indol-3-carbonsäureester effektive Inhibitoren der mPGES-1 bzw. der PGE₂-Synthese sind (Tabelle 1 und 2). Daher wurden ausgehend von Indol-3-carbonsäureestern Derivate entwickelt, die in der Lage sind, die mPGES-1 potent zu hemmen. Als besonders potent haben sich Indol-3-carbonsäureester erwiesen, die einen [6,7]-annelierten Aromaten aufweisen. Zudem wurde C2 und C5 des Indol-3-carbonsäureesters substituiert, insbesondere durch substituierte Benzyl- oder Anilinosubstituenten an C2 und durch Aryl-, Hydroxyl- oder Chlorsubstituenten an C5. Überraschenderweise greifen diese Verbindungen sehr potent in die Biosynthese des PGE₂ ein. Dem liegt eine Hemmung der katalytischen Aktivität der humanen mPGES-1 (Umwandlung von PGH₂ zu PGE₂ im zellfreien System) zugrunde, wie aus den Ausführungsbeispielen ersichtlich ist (Tabelle 1 und 2, 3). Die IC₅₀ Werte liegen bei diesen Substanzen im Bereich von ca. 0.5–10 μM. Damit wurden in der vorliegenden Erfindung Indol-3-carbonsäureester zum ersten Mal als direkte Hemmstoffe der mPGES-1 bzw. Hemmstoffe der PGE₂ Synthese identifiziert.
Tabelle 1 umfasst einige Beispiele für strukturelle Modifikationen von Indol-3-carbonsäureestern und deren Hemmwirkung auf mPGES-1. n. i. = keine Hemmung.
Die Befunde lassen den Schluss zu, dass Indol-3-carbonsäureester ein hohes Potential zur Therapie entzündlicher und/oder neoplastischer Erkrankungen und krankhafter Zustände haben, die mit einer erhöhten Bildung von PGE₂ einhergehen. Damit könnten durch Einsatz von Indol-3-carbonsäureestern PGE₂-vermittelte Erkrankungen behandelt werden, wobei im Gegensatz zu bisherigen Verfahren (COX-Hemmung) weniger Nebenwirkungen auftreten dürften.
Somit können Zubereitungen, die Indol-3-carbonsäureester enthalten, erfindungsgemäß zur Hemmung der mPGES-1 verwendet werden. Diese Zubereitungen können ferner zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der PGE₂ Synthese, insbesondere zur Hemmung der mPGES-1, verwendet werden. Insbesondere können diese Zubereitungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung PGE₂-vermittelter Erkrankungen und krankhafter Zustände verwendet werden. Diese können z. B. chronische Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, und Krebs, Schmerz und Fieber sein.
Es hat sich ferner herausgestellt, dass Indol-3-carbonsäureester zusätzlich die 5-LO potent hemmen können. Dabei zeigten die erstmals synthetisierten Aryl[g]indol-3-carbonsäureester eine besonders effektive Hemmung der 5-LO (Tabelle 2). Über die biologische Wirksamkeit dieser Aryl[g]indol-3-carbonsäureester war bislang nichts bekannt. In der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass diese Substanzen nicht nur die 5-LO Produktbildung in intakten Neutrophilen hemmen, sondern auch mit der 5-LO Aktivität in zellfreien Systemen interferieren (Tabelle 2, 5 und 6). Letzteres lässt den Schluss zu, dass die Verbindungen die 5-LO direkt hemmen.
Tabelle 2 umfasst einige Beispiele für strukturelle Modifikationen von Aryl[g]indol-3-carbonsäureester und deren Hemmwirkung auf mPGES-1 bzw. 5-LO. n. i. = keine Hemmung; n. d. = nicht bestimmt.
Erfindungsgemäß können Zubereitungen, die Indol-3-carbonsäureester, insbesondere Aryl[g]indol-3-carbonsäureester enthalten, zur dualen Hemmung der mPGES-1 und der 5-LO verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden 2-Aryl- und 2-Arylalkyl-Derivate der Aryl[g]indol-3-carbonsäureester verwendet, welche die beste Hemmwirkung gegenüber mPGES-1 und 5-LO zeigen.
Diese Zubereitungen können ferner zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen Hemmung der PGE₂ Synthese und der 5-LO Produktion verwendet werden. Bevorzugt können diese Zubereitungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Behandlung von PGE₂- und 5-LO vermittelten Erkrankungen und krankhafter Zustände, insbesondere von chronischen Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Asthma, allergische Rhinitis, Multiple Sklerose, entzündliche Hauterkrankungen, Osteoporose, und Krebs, und krankhafter Zustände, insbesondere Schmerz und Fieber.
Die Erfindung umfasst die Verwendung von Zubereitungen zur Hemmung der PGE₂ Synthese, insbesondere zur Hemmung der mPGES-1 und/oder zur Hemmung der 5-LO, wobei diese Zubereitungen mindestens einen Indol-3-carbonsäureester und/oder eines seiner Derivate mit den folgenden Strukturformeln enthalten:
wobei X für einen annelierter Aryl- oder Heteroarylring mit insgesamt 3 bis 8 Ringatomen,
R1 für einen Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl oder Heteroarylalkyl steht, das über ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Kohlenstoffatom oder eine Aminoalkyl-, Oxoalkyl- oder Alkylgruppe an das Restmolekül geknüpft ist, wobei das Aryl-, Heteroaryl-, Arylalkyl- bzw. Heteroarylalkyl mit einem weiteren Ringsystem kondensiert sein kann, und ein oder mehrere H-Atome im Aryl, Heteroaryl, Arylalkyll bzw. Heteroarylalkyl substituiert sein können durch eine oder mehrere Gruppen aus der Substanzklasse Halogen, O, N, S, OH, NH₂, NO₂, SH, (C_1-10)Alkyl, (C_2-10)Alkenyl, (C_2-10)Alkinyl, OCF₃, (C_1-10)Alkoxy, (C_1-10)Alkylamin, (C_1-10)Alkylthio, (C_1-10)Alkylsilyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloheteroalkyl, oder Cycloheteroalkenyl,
R2 die Alkoholkomponente des Carbonsäureesters an C2 bildet und insbesondere einen Alkyl-, Aryl- oder Alkylarylrest darstellt, und
R3 für H oder einen beliebigen polaren oder lipophilen Rest, insbesondere eine OH-Gruppe oder Halogen, steht,
R4 für H steht oder auch durch einen Alkyl-, Aryl- oder Arylalkylrest substituiert ist.
Die Erfindung umfasst ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Indol-3-carbonsäureester nach einer der o. g. Strukturformeln und gegebenenfalls ein pharmazeutisches Trägermaterial enthält.
Zur therapeutischen Behandlung von PGE₂- und/oder 5-LO-vermittelten Erkrankungen sind Plasmakonzentrationen von ca. 0,1–10 μM Indol-3-carbonsäureester erstrebenswert. Das könnte etwa durch die p. o. Gabe von etwa 5–500 mg/Tag erreicht werden.
Die Verabreichung von Indol-3-carbonsäureestern oder diese enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Therapie von Erkrankungen kann oral oder parenteral erfolgen.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass für die Arzneistofftargets mPGES-1 und 5-LO Grundstrukturen identifiziert wurden, die zur Hemmung der Aktivität der mPGES-1 und der 5-LO führen. Damit könnte nun selektiv die Synthese des PGE₂ durch COX-2/mPGES-1 gehemmt werden, ohne dabei, wie bislang mittels Inhibitoren der COX-1 und -2, auch die Synthese anderer (physiologisch wichtiger) PGs zu hemmen. Parallel dazu kann die Bildung von 5-LO Produkten unterbunden werden. Dies hat zur Folge, dass die Therapie entsprechender Erkrankungen und krankhafter Zustände mittels Indol-3-carbonsäureestern im Vergleich zu COX-1/2 Inhibitoren weniger Nebenwirkungen aufweisen dürfte. Da selektive COX-2-Inhibitoren wegen ihrer Nebenwirkungen vom Markt genommen (Rofecoxib) oder ihnen die Zulassung nicht erteilt wurde (Etoricoxib), kann das hier vorgestellte Verfahren stellvertretend und zudem vorteilhafter eingesetzt werden.
Da nun die duale Hemmung der mPGES-1 und der 5-LO hinsichtlich der therapeutischen Anwendung bei Erkrankungen oder krankhaften Zuständen zu einer additiven oder sogar synergistischen Wirkung führen und geringere Nebenwirkungen aufweisen kann, ist darin ein Vorteil gegenüber anderen Verfahren (Monotherapie) zu sehen. Aufgrund der mPGES-1/5-LO-Hemmung können Indol-3-carbonsäureester gezielt bei entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden, die auf eine erhöhte Bildung von PGE₂ und/oder von 5-LO Produkten zurückzuführen sind.
Des Weiteren kann durch Verwendung von Indol-3-carbonsäureester der Einsatz bzw. die Dosis von steroidalen (Glucocortikoide) und nicht-steroidalen Antiphlogistika (COX Inhibitoren) reduziert und die Dauer der Einnahme verkürzt werden. COX Inhibitoren führen wie erwähnt wegen ihrer unspezifischen Blockade der Synthese aller PGs zu erheblichen Nebenwirkungen.
Die Erfindung kann genutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen und krankhafter Zustände, die mit einer erhöhten Produktion von PGE₂ und/oder 5-LO Produkten einhergehen, zu behandeln. Dabei handelt es sich primär um chronische Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Asthma, allergische Rhinitis, Multiple Sklerose, entzündliche Hauterkrankungen, Osteoporose und Krebs, Schmerz und Fieber, bei denen PGE₂ und/oder 5-LO Produkte eine Rolle spielen.
Weitere Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen zeigen:
1: Biosyntheseweg des PGE₂.
2: Biosyntheseweg der Leukotriene und anderer 5-LO Produkte.
3: Konzentrations-Wirkungskurven von 89a, 132b und 135a bezüglich der Hemmung der mPGES-1-vermittelten Synthese von PGE₂ (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in der mikrosomalen Fraktion von Interleukin-1β-stimulierten A549 Zellen (Mittelwert + Standardfehler, n = 3).
4: Hemmung der Synthese von PGE₂ (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in intakten Interleukin-1β-stimulierten A549 Zellen nach Aktivierung mit Ca²⁺-inophore A23187 und AA (Mittelwert + Standardfehler, n = 3). Konzentrations-Wirkungskurven von 89a und 135a.
5: Konzentrations-Wirkungskurven bezüglich der Hemmung der 5-LO Produktbildung (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in zellfreien Präparationen (100.000 × g Überstände von Lysaten aus 5-LO-eprimierenden E. coli). Die Ergebnisse sind als Mittelwert + Standardfehler, n = 3 angegeben.
6: Konzentrations-Wirkungskurven bezüglich der Hemmung der 5-LO Produktbildung (Prozentuale Aktivität gegenüber der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in isolierten humanen PMNL, stimuliert mit 2.5 μM Ionophor plus 20 μM Arachidonsäure. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + Standardfehler, n = 3 angegeben.
Ausführungsbeispiele
a) Einfluss von Indol-3-carbonsäureester auf die Aktivität der mPGES-1
1. Bestimmung der Aktivität der mPGES-1 in der mikrosomalen Fraktion von A549-Zellen:
A549 Zellen wurden mit Interleukin-1β (1 ng/ml) für 72 Stunden inkubiert. Nach Ernte und Zellzahlbestimmung wurden die pelletierten Zellen auf Trockeneis/Ethanol schockgefroren, durch Zugabe von 1 ml Homogenisierungspuffer (4°C) wieder aufgetaut und mittels Ultraschall homogenisiert. Nach Zentrifugation (10.000 g für 10 min bei 4°C) wurde der erhaltene Überstand bei 174.000 g und 4°C für 1 h Stunde zentrifugiert, um Mikrosomen zu gewinnen. Das Pellet (Mikrosomen) wurde im Homogensierungspuffer gelöst und mit den Testsubstanzen (Indol-3-carbonsäureester bzw. DMSO) für 15 min bei 4°C in 96-well Platten vorinkubiert. Dann wurde PGH₂ als Substrat zugegeben und die Reaktion nach 1 min bei 4°C mittels Stopplösung (enthält u. a. Fe²⁺, Zitronensäure und 11-β-PGE₂ als Standard) beendet. Ein Ansatz wird vor Reaktionsbeginn mit der Stopplösung versetzt um bereits in der PGH₂-Lösung enthaltenes PGE₂ zu ermitteln. Nach Festphasenextraktion (RP-18-Säulen und Acetonitril als Elutionsmittel) wurde die Probe mittels HPLC (RP-18, UV-Detektion bei 195 nm) analysiert.
Es zeigt sich, dass die Vorinkubation der mikrosomalen Fraktion von Interleukin-1β-stimulierten A549 Zellen mit konkreten Indol-3-carbonsäureestern zu einer potenten Hemmung der mPGES-1 Aktivität führt, indem beispielsweise 10 μM Verbindung 135a die PGE₂-Synthese aus PGH₂ zu ca. 90% hemmt, der IC₅₀-Wert liegt bei ca. 1 μM (3).
2. Bestimmung der PGE₂-Synthese in intakten A549-Zellen:
A549 Zellen wurden mit Interleukin-1β (1 ng/ml) für 72 Stunden inkubiert. Nach Ernte und Zellzahlbestimmung wurden die Zellen (2 × 10⁶) in CaCl₂-haltigem PBS-Puffer resuspendiert. Nach Vorinkubation mit den Testsubstanzen für 10 min bei 37°C, wird die PGE₂-Bildung durch Zugabe von A23187 (2,5 μM), AA (1 μM) and [³H]AA (18,4 kBq) induziert. Die Reaktion wird nach 15 min bei 37°C durch Abkühlen auf 4°C gestoppt. Nach Zentrifugation (800 × g, 5 min, 4°C) wird der Überstand durch Zitronensäure angesäuert (pH 3) und mit dem internen Standard 11β-PGE₂ versehen. Das radiomarkierte PGE₂ wird durch Festphasenextraktion (RP-18-Säulen und Acetonitril als Elutionsmittel) und RP-HPLC (RP-18, UV-Detektion des Standards bei 195 nm) abgetrennt und mittels Flüssigszintillationszählung quantifiziert (LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter).
Auch im zellulären System treten Indol-3-carbonsäureester als potente Inhibitoren der PGE₂-Synthese auf und zeigen IC₅₀-Werte von ca. 5 μM für Verbindung 89a und 135a (4)
b) Einfluss von Aryl[g]indol-3-carbonsäureester auf die Aktivität der 5-LO
1. Bestimmung der Aktivität der 5-LO in zellfreien Systemen:
Zur Gewinnung rekombinanter 5-LO, werden E. coli (Stamm MV1190) mit dem Plasmid pT3-5LO transformiert, nach erfolgter 5-LO Expression geerntet und lysiert [9]. Lysate von E. coli werden einer 100.000 × g-Zentrifugation unterworfen. Aliquote des 100.000 × g Überstands werden dann mit den Inhibitoren auf Eis für 5 min vorinkubiert und für 30 sec im Wasserbad (37°C) vorgewärmt. Zur Induktion der 5-LO Produktbildung wird 20 μM Arachidonsäure und 1 mM Ca²⁺ zugegeben. Nach 10 min bei 37°C wird die Inkubation mit Methanol gestoppt, die gebildeten 5-LO Metabolite (trans-LTB₄, epi-trans-LTB₄, 5-H(P)ETE) mittels Festphasenextraktion isoliert und dann mittels automatisiertem RP-HPLC-System qualitativ und quantitativ analysiert [10].
Es zeigt sich (5), dass die Verbindungen 89a, 130d, 135a und 141d zu einer potenten und konzentrationsabhängigen Hemmung der 5-LO Aktivität führt, mit IC₅₀ Werten von 0.25, 0.07, 0.09, und 0.12 μM.
2. Bestimmung der Aktivität der 5-LO in intakten PMNL:
PMNL werden aus frischen menschlichen Leukozytenkonzentraten gemäß einem Standardprotokoll isoliert [11], in PBS in Gegenwart von 1 mM CaCl₂ resuspendiert und entsprechend mit Inhibitoren vorinkubiert. Nach Stimuluszugabe (2.5 μM Ionophor plus 20 μM Arachidonsäure) wird für 10 min bei 37°C inkubiert. Die Inkubation wird mit Methanol gestoppt, die gebildeten 5-LO Metabolite (trans-LTB₄, epi-trans-LTB₄, LTB₄, 5-H(P)ETE) mittels Festphasenextraktion isoliert, und dann mittels automatisiertem RP-HPLC-System qualitativ und quantitativ analysiert (s. o.).
Aus 6 wird ersichtlich, dass die Vorinkubation der PMNL mit den Verbindungen 89a, 130d, 135a, und 141d auch in zellulären Systemen zu einer potenten und konzentrationsabhängigen Hemmung der 5-LO Produktbildung führt, wobei die IC₅₀ Werte bei 0.65, 0.5, 0.3 und 0.4 μM liegen.
Synthese und Darstellung der Verbindungen:
Allgemeine Herstellungsvorschriften
Herstellungsvorschrift A
Die Lösung von 1,19 mmol eines Indol-3-carbonsäureesters in 5 ml CH₂Cl₂ wird auf 0°C gekühlt. Danach werden 75,0 mg (0,66 mmol) N,N'-Dimethylpiperazin und 175,0 mg (1,31 mmol) N-Chlorsuccinimid zugegeben und der Ansatz weitere 2 h lang bei 0°C stehengelassen. Anschließend wird eine Lösung von 50,0 mg (0,31 mmol) Trichloressigsäure und 2.34 mmol eines Anilin-, Amin- oder Phenolderivates in 5 ml CH₂Cl₂ zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird nun 2 h bei RT stehengelassen und nacheinander mit 10%iger NaHCO₃-Lösung, 1 molarer HCl und Wasser gewaschen. Die CH₂Cl₂-Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Die Isolierung des Produkts von nicht umgesetzten Edukten erfolgt mittels Flashchromatographie an Kieselgel (Cyclohexan/Ethylacetat 9:1 v/v).
Herstellungsvorschrift B
3,0 mmol β-Ketoester und die 5fache molare Menge an NH₄OAc (bzw. die doppelte Menge eines entsprechenden Amins) werden in 10 ml abs. Toluol unter Zusatz von 4 Tropfen Eisessig (bzw. Ameisensäure bei Aminen als Edukt) unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Das während der Reaktion entstehende Wasser wird durch azeotrope Destillation am Wasserabscheider aus dem Ansatz entfernt. Nach Beendigung der Wasserabscheidung (ca. 6 h) wird der abgekühlte Ansatz nacheinander mit gesättigter NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Die Isolierung des Produkts von nicht umgesetztem Edukt erfolgt mittels Flashchromatographie an Kieselgel (Cyclohexan/Ethylacetat 9:1 v/v).
Herstellungsvorschrift C 1
1,2 mmol des entsprechenden 1,4-Chinons werden unter Rühren über einen Zeitraum von 5 min zu einer Lösung des jeweiligen Enamins oder Ketenaminals (1,0 mmol) in 4 ml EtOH gegeben. Nach Rühren bei RT über eine Stunde wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und das Produkt aus dem verbleibenden schwarzen Rückstand via präparativer MPLC oder Flashchromatographie an Kieselgel isoliert (Cyclohexan/Ethylacetat 95:5 v/v).
Herstellungsvorschrift C 2
Zu einer Lösung des entsprechenden 1,4-Chinons (1,0 mmol) in 3 ml CH₂Cl₂ werden 32,0 mg (0,1 mmol) ZnI₂ gegeben und die Temperatur bis zum Rückfluss erhöht. Anschließend wird eine Lösung von 1,0 mmol des jeweiligen Enamins oder Ketenaminals in 2 ml CH₂Cl₂ über einen Zeitraum von 5–10 min unter Rühren zugetropft. Nach Weiterrühren unter Refluxbedingungen über ca. 40 min wird die Mischung 2–3 h lang bei 0–5°C stehengelassen. Der gebildetete Niederschlag wird abfiltriert und entsprechend kristallisiert bzw. umkristallisiert.
Spezielle Herstellungsvorschriften
Methyl 2-[(3-Chlorphenyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (76c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 298,5 mg (2,34 mmol) 3-Chloranilin. Ausbeute: 222,3 mg (62%) weißes Pulver.

Methyl 2-[(4-Chlorphenyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (76a)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 298,5 mg (2,34 mmol) 4-Chloranilin. Ausbeute: 219,2 mg (61%) weißes Pulver.

Methyl 2-[(2-Chlorphenyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (76e)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 298,5 mg (2,34 mmol) 2-Chloranilin. Ausbeute: 152,9 mg (43%) weißes Pulver.

Methyl 2-(3-Chlorphenylamino)-5-hydroxy-1H-indol-3-carboxylat (91b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 226,7 mg (1,0 mmol) Methyl (2EZ)-3-Amino-3-[(3-chlorphenyl)amino]acrylat (91aMe) und 129,7 mg (1,2 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 107,6 mg (34%) grauglänzendes Pulver.
Anmerkung: Um die Gefahr einer Umesterung zu vermeiden, ist MeOH als Lösungsmittel vorzuziehen.

Methyl (2EZ)-3-Amino-3-[(3-chlorphenyl)amino]acrylat (91aMe)
Eine Mischung aus 330,4 mg (2,52 mmol) Methyl (2E)-3-Amino-3-methoxyacrylat und 321,5 mg (2,52 mmol) 3-Chloranilin in 4 ml MeOH wird 48 h lang unter Rückfluss gekocht. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand mittels Flashchromatographie an Kieselgel aufgereinigt (Cyclohexan/Ethylacetat 7:3 v/v). Ausbeute: 337,7 mg (59%) transparenter Lack.
Methyl 2-[(3-Chlorphenyl)amino]-5-chlor-1H-indol-3-carboxylat (111)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 249,5 mg (1,19 mmol) Methyl 5-Chlor-1H-indol-3-carboxylat und 298,5 mg (2,34 mmol) 3-Chloranilin. Ausbeute: 172,0 mg (43%) weißes, kristallines Pulver.

Methyl 2-[(3-Fluorphenyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (121c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 260,0 mg (2,34 mmol) 3-Fluoranilin. Ausbeute: 195,3 mg (58%) weiße Kristalle.

Methyl 2-[(3-Trifluormethyl)phenylamino]-1H-indol-3-carboxylat (115)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 377,0 mg (2,34 mmol) 3-Trifluormethylanilin. Ausbeute: 210,4 mg (53%) weißes Pulver.

Methyl 2-[(3,5-Dichlorphenyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (120a)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 379,1 mg (2,34 mmol) 3,5-Dichloranilin. Ausbeute: 155,1 mg (39%) weißes Pulver.

Methyl 2-[(3,4-Dichlorphenyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (120b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 379,1 mg (2,34 mmol) 3,4-Dichloranilin. Ausbeute: 165,0 mg (41%) weißes Pulver.

Methyl 2-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (120c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 379,1 mg (2,34 mmol) 2,6-Dichloranilin. Ausbeute: 169,1 mg (42%) weißes Pulver.

Methyl 2-(1-Pyridin-2-chlor-3-yl-amino)-1H-indol-3-carboxylat (80c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 300,8 mg (2,34 mmol) 2-Chlorpyridin-3-amin. Ausbeute: 196,9 mg (55%) weißes Pulver.

Methyl 2-(3-Chlorphenoxy)-1H-indol-3-carboxylat (118)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 300,8 mg (2,34 mmol) 3-Chlorphenol. Ausbeute: 169,6 mg (47%) weißes Pulver.

Methyl 2-[(3-Chlorphenyl)(methyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (115b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift A aus 208,5 mg (1,19 mmol) Methyl Indol-3-carboxylat und 331,3 mg (2,34 mmol) 3-Chlor-N-methylanilin. Ausbeute: 187,3 mg (50%) weißes Pulver.

Ethyl 2-[2-(3-Chlorphenyl)ethyl]-5-hydroxy-1H-indol-3-carboxylat (113c)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 253,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-5-(3-chlorphenyl)pent-2-enoat (113b) und 129,7 mg (1,2 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 102,7 mg (30%) weißes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 253,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-5-(3-chlorphenyl)pent-2-enoat (113b) und 108,1 mg (1,0 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 141,8 mg (41%) weißes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-5-(3-chlorphenyl)pent-2-enoat (113b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 761,1 mg (3,0 mmol) Ethyl 5-(3-Chlorphenyl)-3-oxopentanoat (113a) und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 566,3 mg (74%) farbloses Öl.

(R) Ethyl 5-Hydroxy-2-[(1-phenylethyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (56aR)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 234,1 mg (1,0 mmol) Rohprodukt (R) Ethyl (2EZ)-3-Amino-3-[(1-phenylethyl)amino]acrylat und 129,7 mg (1,2 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 121,2 mg (37%) graue Kristalle.

(S) Ethyl 5-Hydroxy-2-[(1-phenylethyl)amino]-1H-indol-3-carboxylat (56aS)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 234,1 mg (1,0 mmol) Rohprodukt (S) Ethyl (2EZ)-3-Amino-3-[(1-phenylethyl)amino]acrylat und 129,7 mg (1,2 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 111,0 mg (34%) graue Kristalle.

Anmerkung:

Die Darstellung von (R) und (S) Ethyl (2EZ)-3-Amino-3-[(1-phenylethyl)amino]acrylat erfolgt gemäß Herstellungsvorschrift der literaturbekannten racemischen Verbindung.

Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-indol-3-carboxylat (105a)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 129,7 mg (1,2 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 94,6 mg (29%) weißes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 108,1 mg (1,0 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 135,1 mg (41%) weißes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 722,0 mg (3,0 mmol) Ethyl 4-(3-Chlorphenyl)-3-oxobutanoat und 1.16 g (15.0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 616,3 mg (86%) hellgelbes Harz.

Ethyl 5-Hydroxy-2-phenylethyl-benzofuran-3-carboxylat (101)
1,65 g (7,5 mmol) Ethyl 5-Phenyl-3-oxopentanoat in 4 ml Diethylether werden tropfenweise zu einer 85–90°C heißen Lösung aus 1,05 g ZnCl₂ 99.99% in wenig Ethanol gegeben. 811 mg (7,5 mmol) 1,4-Benzochinon in 25 ml Diethylether werden tropfenweise hinzugegeben und die Mischung unter Rühren 19 h bei ca. 85°C gehalten. Nach Abkühlen des Ansatzes auf r. t. wird die braune pastenartige Masse mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt wird mittels Flashchromatographie an Kieselgel isoliert (Cyclohexan/Ethylacetat 9:1 v/v).
Ausbeute: 834,3 mg (36%) weißes Pulver.
Ethyl 1-Benzyl-2-(4-chlorphenyl)-5-hydroxy-1H-indol-3-carboxylat (134b)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 329,8 mg (1,0 mmol) Rohprodukt Ethyl (2Z)-3-(benzylamino)-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (134a) und 129,7 mg (1,2 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 54,0 mg (13%) weißes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 329,8 mg (1,0 mmol) Rohprodukt Ethyl (2Z)-3-(benzylamino)-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (134a) und 108,1 mg (1,0 mmol) 1,4-Benzochinon. Ausbeute: 118,3 mg (28%) weißes Pulver.
Anmerkung: Darstellung von 134a gemäß Herstellungsvorschrift B aus 722,0 mg (3,0 mmol) Ethyl 4-(4-Chlorphenyl)-3-oxobutanoat und 645,0 mg (6,0 mmol) Benzylamin ohne Aufreinigung via Flashchromatographie.

Ethyl 2-(3-Chlorphenylamino)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (89a)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 240,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2EZ)-3-Amino-3-[(3-chlorphenyl)amino]acrylat (91aEt) und 189,8 mg (1,2 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 84,3 mg (22%) hellgrünes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 240,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2E)-3-Amino-3-[(3-chlorphenyl)amino]acrylat (91aEt) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 133,3 mg (35%) hellgrünes Pulver.

Ethyl (2EZ)-3-Amino-3-[(3-chlorphenyl)amino]acrylat (91aEt)

Darstellung und Aufreinigung analog 91aMe mit 401,2 mg (2,52 mmol) Ethyl (2E)-3-Amino-3-ethoxyacrylat und 321,5 mg (2,52 mmol) 3-Chloranilin unter Verwendung von EtOH als Lösungsmittel. Ausbeute: 353,7 mg (58%) transparenter Lack.

Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (135a)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 189,8 mg (1,2 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 77,7 mg (20%) hellbraunes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 197,2 mg (52%) hellbraunes Pulver.

Ethyl 2-(4-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (132b)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (103b) und 189,8 mg (1,2 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 63,8 mg (17%) weißes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (103b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 162,3 mg (43%) weißes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(4-chlorophenyl)but-2-enoat (103b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 722,0 mg (3,00 mmol) Ethyl 4-(4-Chlorphenyl)-3-oxobutanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 613,0 mg (85%) hellgelbes Harz.

Ethyl 1-Benzyl-2-(4-chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (134c)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 329,8 mg (1,0 mmol) Rohprodukt Ethyl (2Z)-3-(benzylamino)-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (134a) und 189,8 mg (1,2 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 56,3 mg (12%) weißes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 329,8 mg (1,0 mmol) Rohprodukt Ethyl (2Z)-3-(benzylamino)-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (134a) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 123,6 mg (26%) weißes Pulver.

Ethyl 2-(3-Chlorphenyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (130D)
Variante a:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 225,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-3-(3-chlorphenyl)acrylat (130b) und 189,8 mg (1,2 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 70,5 mg (19%) weißes Pulver.

Variante b:

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 225,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-3-(3-chlorphenyl)acrylat (130b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 139,9 mg (38%) weißes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-3-(3-chlorphenyl)acrylat (130b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 680,0 mg (3,0 mmol) Ethyl 3-(3-Chlorphenyl)-3-oxopropanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 562,9 mg (83%) farblose Kristalle.

Benzyl 2-(4-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (141d)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Benzyl (2Z)-3-Amino-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (141b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 128,5 mg (29%) weißes Pulver.

Benzyl (2Z)-3-Amino-4-(4-chlorphenyl)but-2-enoat (141b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 908,3 mg (3,0 mmol) Benzyl 4-(4-Chlorphenyl)-3-oxobutanoat (141a) und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 771,6 mg (85%) farbloses Öl.

Benzyl 4-(4-Chlorphenyl)-3-oxobutanoat (141a)
2,33 g (12,0 mmol) 3-(Benzyloxy)-3-oxopropansäure werden in 15 ml trockenem THF gelöst. Nach Zugabe von 686,6 mg (6,0 mmol) Magnesiumethylat wird 4 h lang bei RT gerührt und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Das entstandene Magnesiumsalz wird gut mit Ether gewaschen, abfiltriert und erneut im Vakuum getrocknet.
1,78 g (11,0 mmol) N,N'-Carbonyldiimidazol werden portionsweise zu einer Lösung von 1,71 g (10,0 mmol) 4-Chlorphenylessigsäure in 20 ml trockenem DMF gegeben. Nach einstündigem Rühren der Mischung unter Stickstoff wird das Magnesiumsalz zugegeben und der Ansatz ca. 4 h lang weitergerührt.
Zur Aufarbeitung wird mit 2N HCl angesäuert, das Produkt dreimal mit EtOAc extrahiert, die vereinigten Phasen nacheinander mit gesättigter NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Ausbeute: 2,52 g (83%) farbloses Öl.
Benzyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (142d)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 302,8 mg (1,0 mmol) Benzyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (142b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 128,7 mg (29%) weißes Pulver.

Benzyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (EKV142b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 908,3 mg (3,0 mmol) Benzyl 4-(3-Chlorphenyl)-3-oxobutanoat (142a) und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 752,5 mg (83%) farbloses Öl.

Benzyl 4-(3-Chlorphenyl)-3-oxobutanoat (142a)

Darstellung und Aufreinigung analog 141a mit 2,33 g (12,0 mmol) 3-(Benzyloxy)-3-oxopropansäure und 1,71 g (10,0 mmol) 3-Chlorphenylessigsäure. Ausbeute: 2,51 g (83%) transparentes Öl.

Ethyl 5-Hydroxy-2-phenylpropyl-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (144d)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 1 aus 233,3 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-6-phenylhex-2-enoat (144b) und 189,8 mg (1,2 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 64,3 mg (17%) hellgraues Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-6-phenylhex-2-enoat (EKV144b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 702,9 mg (3,0 mmol) Ethyl 3-Oxo-6-phenylhexanoat (144a) und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 506,6 mg (74%) farblose Kristalle.

Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-7,8-dimethoxy-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (139b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 218,2 mg (1,0 mmol) 6,7-Dimethoxy-1,4-naphthochinon. Ausbeute: 123,7 mg (28%) hellgraues Pulver.

Ethyl 7-Biphenyl-4-yl-(3-chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-indol-3-carboxylat (157b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 260,3 mg (1,0 mmol) 2-Biphenyl-1,4-benzochinon. Ausbeute: 134,4 mg (28%) weißes, kristallines Pulver.

Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-6-phenyl-1H-indol-3-carboxylat (155c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 184,2 mg (1,0 mmol) 2-Phenyl-1,4-benzochinon. Ausbeute: 132,7 mg (33%) weißes, kristallines Pulver.

Ethyl 2-(2-Chlor-6-fluorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (158d)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 mit 257,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(2-chlor-6-fluorphenyl)but-2-enoat (158b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 149,0 mg (37%) hellbraunes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(2-chlor-6-fluorphenyl)but-2-enoat (158b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 776,0 mg (3,0 mmol) Ethyl 4-(2-Chlor-6-fluorphenyl)-3-oxobutanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 677,2 mg (88%) farbloses Harz.

Ethyl 2-(2-Chlorpyridin-3-yl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (160c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 aus 226,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-3-(2-chlorpyridin-3-yl)acrylat (160b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 168,1 mg (46%) rötlich-braunes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-3-(2-chlorpyridin-3-yl)acrylat (160b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 682,9 mg (3,0 mmol) Ethyl 3-(2-Chlorpyridin-3-yl)-3-oxopropanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 546,2 mg (80%) weißes flockiges Pulver.

Ethyl 2-[2-(tert-Butoxycarbonylamino)ethyl]-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (162d)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 mit 258,3 mg (1,0 mmol) Rohprodukt Ethyl (2Z)-3-Amino-5-(tert-butoxycarbonylamino)pent-2-enoat (162b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon in 40 ml EtOH. Ausbeute: 139,0 mg (35%) weißes Pulver.

Anmerkung:

Darstellung von 162b gemäß Herstellungsvorschrift B aus 567,6 mg (3,0 mmol) Ethyl 5-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-3-oxopentanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat ohne Aufreinigung via Flashchromatographie.

Ethyl 2-(3-Brombenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (166c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 mit 284,2 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-bromphenyl)but-2-enoat (166b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 187,2 mg (44%) hellbraunes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-bromphenyl)but-2-enoat (166b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 855,4 mg (3,0 mmol) Ethyl 4-(3-Bromphenyl)-3-oxobutanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 709,4 mg (83%) farbloses Harz.

Ethyl 2-(3-Methoxybenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (167c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 mit 235,3 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-methoxyphenyl)but-2-enoat (167b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 147,2 mg (39%) hellbraunes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-methoxyphenyl)but-2-enoat (167b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 708,8 mg (3,0 mmol) Ethyl 4-(3-Methoxyphenyl)-3-oxobutanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 605,5 mg (86%) farbloses Harz.

Ethyl 2-(4-Fluorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (168c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 mit 223,3 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(4-fluorphenyl)but-2-enoat (168b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 119,2 mg (33%) hellbraunes Pulver.

Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-pyrrolo[2,3-f]chinolin-3-carboxylat (170)

Darstellung nach Herstellungsvorschrift C 2 aus 239,7 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-chlorphenyl)but-2-enoat (103a) und 159,1 mg (1,0 mmol) Chinolin-5,8-dion. Ausbeute: 70,0 mg (18%) graues Pulver.

Ethyl 2-(3-Fluorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (171c)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift C 2 mit 223,3 mg (1,0 mmol) Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-fluorphenyl)but-2-enoat (171b) und 158,2 mg (1,0 mmol) 1,4-Naphthochinon. Ausbeute: 152,2 mg (42%) hellbraunes Pulver.

Ethyl (2Z)-3-Amino-4-(3-fluorphenyl)but-2-enoat (171b)

Darstellung gemäß Herstellungsvorschrift B aus 855,4 mg (3,0 mmol) Ethyl 4-(3-Fluorphenyl)-3-oxobutanoat und 1,16 g (15,0 mmol) Ammoniumacetat. Ausbeute: 597,4 mg (89%) farbloses Harz.

Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-phenyl-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (176b)
Eine Mischung aus 112,2 mg (0,55 mmol) Phenylboronsäurepinakolester, 256,0 mg (0,50 mmol) Ethyl 5-[[(Trifluormethyl)sulfonyl]oxy]-2-(3-chlorbenzyl)-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (176a), 3,4 mg (0,015 mmol) PdOAc₂, 3,9 mg (0,015 mmol) PPh₃, wässriger Na₂CO₃-Lösung und DMF wird 2 h lang unter Rückfluss gekocht. Anschließend wird der Ansatz in Wasser aufgenommen und das Produkt mittels EtOAc extrahiert. Das nach Abdestillieren des Lösungsmittels erhaltene Rohprodukt wird via Flashchromatographie an Kieselgel isoliert (Cyclohexan/Ethylacetat 9:1 v/v). Ausbeute: 75,1 mg (34%) weißes Pulver.
Ethyl 5-[[(Trifluormethyl)sulfonyl]oxy]-2-(3-chlorbenzyl)-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (176a)
949,6 mg (2,5 mmol) Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-hydroxy-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (135a) werden in 5 ml CH₂Cl₂ gelöst. Nach Zugabe von 506,0 mg (5,0 mmol) Triethylamin werden unter Eiskühlung 1,76 g (6,25 mmol) Trifluormethansulfonsäureanhydrid (TfO₂) zugesetzt und die Reaktionsmischung 4 h lang bei 0°C gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und das Produkt mittels Flashchromatographie an Kieselgel isoliert (Cyclohexan/Ethylacetat 4:1 v/v). Ausbeute: 1,04 g (81%) weißes Pulver.
Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-(4-chlorphenyl)-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (176c)

Darstellung und Aufreinigung analog 176b mit 131,2 mg (0,55 mmol) 4-Chlorphenylboronsäurepinakolester und 256,0 mg (0,50 mmol) Ethyl 5-[[(Trifluormethyl)sulfonyl]oxy]-2-(3-chlorbenzyl)-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (176a). Ausbeute: 67,1 mg (28%) weißes Pulver.

Ethyl 2-(3-Chlorbenzyl)-5-(4-cyanophenyl)-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (176d)

Darstellung und Aufreinigung analog 176b mit 126,0 mg (0.55 mmol) 4-Cyanophenylboronsäurepinakolester und 256,0 mg (0,50 mmol) Ethyl 5-[[(Trifluormethyl)sulfonyl]oxy]-2-(3-chlorbenzyl)-1H-benzo[g]indol-3-carboxylat (176a). Ausbeute: 77,4 mg (33%) weißes Pulver.

Literatur

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Claims

Verwendung von Zubereitungen zur Hemmung der PGE₂ Synthese, insbesondere zur Hemmung der mPGES-1 und/oder zur Hemmung der 5-Lipoxygenase, wobei diese Zubereitungen mindestens einen Indol-3-carbonsäureester und/oder eines seiner Derivate mit einer der folgenden Strukturformeln enthalten:
wobei X für einen anellierter Aryl- oder Heteroarylring mit insgesamt 3 bis 8 Ringatomen, R1 für einen Aryl, Heteroaryl, Arylalkyl oder Heteroarylalkyl steht, das über ein Stickstoff-, Sauerstoff- oder Kohlenstoffatom oder eine Aminoalkyl-, Oxoalkyl- oder Alkylgruppe an das Restmolekül geknüpft ist, wobei das Aryl-, Heteroaryl, Arylalkyl- bzw. Heteroarylalkyl mit einem weiteren Ringsystem kondensiert sein kann, und ein oder mehrere H-Atome im Aryl, Heteroaryl, Arylalkyll bzw. Heteroarylalkyl substituiert sein können durch eine oder mehrere Gruppen aus der Substanzklasse Halogen, O, N, S, OH, NH₂, NO₂, SH, (C_1-10)Alkyl, (C_2-10)Alkenyl, (C_2-10)Alkinyl, OCF₃, (C_1-10)Alkoxy, (C_1-10)Alkylamin, (C_1-10)Alkylthio, (C_1-10)Alkylsilyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloheteroalkyl, oder Cycloheteroalkenyl, R2 die Alkoholkomponente des Carbonsäureesters an C2 bildet und insbesondere einen Alkyl-, Aryl- oder Alkylarylrest darstellt, und R3 für H oder einen beliebigen polaren oder lipophilen Rest, insbesondere eine OH-Gruppe oder Halogen, steht, R4 für H steht oder auch durch einen Alkyl-, Aryl- oder Arylalkylrest substituiert ist.
Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei der Indol-3-carbonsäureester ein 2-Aryl- oder 2-Arylalkyl-indol-3-carbonsäureester oder ein strukturelles Derivat davon ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Indol-3-carbonsäureester ein Aryl[g]indol-3-carbonsäureester ist.
Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei an C2-Position des Indol-3-carbonsäureesters substituierte Benzyl- oder Anilinosubstituenten eingeführt sind.
Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei der Indol-3-carbonsäureester an C5-Position durch Aryl-, Hydroxyl- oder Chlor-Reste substituiert ist.
Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der PGE₂ und/oder der 5-LO.
Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel ferner ein pharmazeutisches Trägermaterial enthält.
Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung PGE₂- und/oder 5-LO-vermittelter Erkrankungen oder krankhafter Zustände.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die PGE₂- und/oder 5-LO-vermittelte Erkrankungen chronische Entzündungen wie rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Asthma, allergische Rhinitis, Multiple Sklerose, entzündliche Hauterkrankungen, Osteoporose und Krebs oder krankhafte Zustände, insbesondere Schmerz und Fieber, sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Plasmakonzentrationen von Indol-3-carbonsäureestern und/oder ihren Derivaten nach der Applikation des Arzneimittels 0,1–10 μM beträgt.