CN1154486C - 甲状腺素类似物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用无明显激素活性的甲状腺素类似物治疗肿瘤癌症，特别是恶性肿瘤的方法。甲状腺素类似物以有效地使恶性肿瘤生长抑制或退行的量或治疗癌症有效的量给予患者。特别优选的甲状腺素类似物是能使约35%或更高的体外的微管蛋白组合的初始速度得到抑制。

Description

甲状腺素类似物的应用
相关申请的交叉参考文献
本申请是待批美国专利申请08/655,267(1996，7，4提交)的部分续展申请，该申请文本并入本文供参考。
发明领域
本发明一般涉及癌症治疗领域。更具体的是，本发明涉及无明显激素活性的甲状腺素类似物，特别是3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯作为潜在的选择性和无毒抗肿瘤剂的应用。
发明背景
恶性肿瘤的生长由于它们独特的特性对现代医学形成了严重的挑战。这些特性包括：不可控制的细胞繁殖导致恶性组织无规则地生长，入侵局部甚至远端组织的能力，缺乏变异，缺乏可检测的症状，最重要的是，缺乏有效的治疗和予防方法。
癌症可在任何年龄段的任何器官中的任何组织中发生。癌症的病因学定义是不清楚的，但是诸如基因感受性、染色体断裂不规则、病毒、环境因素和免疫失调等机制都与恶性细胞生长和变异有关。
抗肿瘤化学疗法目前涵盖数类药物，包括烷化剂、嘌呤拮抗剂和抗肿瘤抗生素。烷化剂使细胞蛋白质和核酸烷化以防止细胞复制，放入细胞代谢，最终导致细胞死亡。典型的烷化剂是氮芥、环磷酰胺和苯丁酸氮芥。与烷化剂治疗有关的毒性包括恶心、呕吐、秃头、出血性膀胱炎、肺部纤维化和形成急性白血病的危险增加。
嘌呤、嘧啶和叶酸拮抗剂对细胞循环和相有特异性，为了促进抗肿瘤效果，它们要求细胞处于细胞复制阶段并在复制的DNA合成相阶段。诸如6-巯基嘌呤或6-硫代胍的嘌呤拮抗剂从头抑制嘌呤的合成和嘌呤的互相转换。诸如阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶或氟苷等的嘧啶拮抗剂通过抑制脱氧胞苷酸激酶和DNA聚合酶来抑制DNA合成。
叶酸盐拮抗剂，如氨甲喋呤与细胞内酶二氢叶酸盐还原酶紧密结合，最终由于嘧啶不能合成而导致细胞死亡。与使用这些化合物有关的毒性包括秃头症、抑制骨髓、呕吐、恶心和中枢运动失调和其它症状。
植物生物碱，如长春花新碱、长春花碱或鬼臼毒素依托泊苷和鬼臼噻吩甙通常抑制有丝分裂和DNA合成和依赖RNA的蛋白质合成。这些药物的毒性类似于上述药物的毒性，包括肌病、骨髓抑制、外周神经疾病、呕吐、恶心和秃头症。
诸如阿霉素、正定霉素和放线菌素的抗肿瘤抗菌素可作为DNA的插入物，防止细胞繁殖，抑制依赖DNA的RNA合成并抑制DNA聚合酶。博来霉素使DNA切断，丝裂霉素通过双官能团的烷化作用作为DNA合成的抑制剂。这些抗菌素有很多毒性，且毒性很严重，包括坏疽、骨髓抑制、过敏反应、食欲减退、依赖剂量的心毒性和肺部纤维化。
用作癌症化疗的其它化合物是诸如顺氯氨铂的无机离子，诸如干扰素的生物应答修饰剂，酶和激素。所有这些化合物与上述类似，都伴有毒性副反应。
因此，人们极为希望提供安全和无毒的化疗组合物，所述的组合物能有效地抑制和/或禁止肿瘤细胞繁殖和/或赘生物生长。此外，极为有利的也是提供安全、有效和无毒且方便使用者的化疗组合物。
因此需要安全有效、无毒和可口服给药的有机化合物，它能抑制或阻遏哺乳动物中恶性肿瘤的生长，也需要使用这类化合物来治疗癌症，本发明的目的即为上述内容。
发明综述
本发明涉及使用无明显激素活性的甲状腺素类似物，特别是3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(“DIME”)来抑制或阻遏恶性肿瘤生长和治疗癌症。该方法一般涉及将能抑制或遏制恶性肿瘤生长或治疗癌症有效量的甲状腺素类似物给予哺乳动物。甲状腺素类似物典型的特征是没有明显的激素活性。
具体的是，本发明涉及治疗哺乳动物恶性肿瘤的方法，该方法包括给有恶性肿瘤的哺乳动物使用足以抑制恶性肿瘤生长用量的甲状腺素类似物，其中甲状腺素类似物的特征是在体外对微管蛋白组合的最初速度抑制达约35％或更高，优选的是45％或更高，更好的是约70％或更高，最好是约90％或更高。
在一个示例性的技术方案中，用于本发明方法中的甲状腺素类似物是有下式结构的化合物及其药学上可接受的盐：
Figure C9719697900051
其中：
X＝O、S、CH2、羧基或没有X；
Y＝O或S；
R1＝甲基或乙基；
R2、R3、R4和R5各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基和卤素；和
R6、R7、R8和R9各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基、卤素、NO2和NH2。
在另一个示例性的技术方案中，用于本发明的甲状腺素类似物是有下式结构的化合物及其药学上可接受的盐：
其中：
X＝O、S、CH2。羧基或没有X；
Y＝O或S；
R1＝甲基或乙基；
R2、R3、R4和R5各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基和卤素；和
R7和R8各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基、卤素、NO2和NH2。
在本发明优选的技术方案中，甲状腺素类似物是3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(“DIME”)。
附图简述
图1阐述了在E-ras 20细胞上用4μM DIME培养18-24小时后对细胞形态学的影响。图1A，无药物处理(对照)；图1B，药物处理；图1C，药物处理。图1A和1B放大150x；图1C放大300x。
图2是揭示DIME处理的E-ras转移的牛上皮细胞肿瘤消失的曲线；
图3是揭示小鼠中血清半衰期(t)和DIM口服生物利用度的曲线。
图4显示了从105到106E-ras 20：每个接种体上的细胞用DIME(10μM处理4天)进行预处理的肿瘤生成作用。
图5显示了DIME浓度对由MDA-MB-231细胞菌落形成速率的作用。
图6归纳了被0.0μM(a)、2.0μM(b)、5μM(c)和10μM(d)导致的DNA断裂。用DIME对E-ras细胞(2×104细胞/cm2)进行处理，然后进行TUNEL分析。
图7显示了通过薄层层析分离的DIME(D)和它的羧酸(A)降解产物，A-549(肺癌)细胞萃取物(等当量于2×106细胞)。在实验中，系列1和2显示，在用1μM DIME培养4小时期间萃取物产生的酯化酶活性。系列2显示酯化酶被125μM BNPP所抑制。系列3和4显示除了细胞萃取物从与1μM DIME预培养24小时的完整细胞中制备，然后洗涤和萃取外，其它与系列1和2相同。该实验显示，酯化酶不被DIME所诱导。
图8显示BNPP对由DIME导致的A-59细胞生长抑制作用的增强作用。
图9图示了DIME对MDA-MB231细胞的作用。原始的引种密度为0.05×106/cm2。
图10提供了在MDA-MB231人体乳房癌细胞核上进行的细胞计量分析，它显示，暴露于药物达18小时，具有G2内含物的DNA核积聚，这表示M相被阻断。
图11显示在13小时延迟有丝分裂后无规地分裂成6个子细胞的图像。框1，0小时：0小时：0分钟；框2，10小时：55分钟；框3，24小时：20分钟；框4，24小时：40分钟；框5，24小时：55分钟；框6，25小时：10分钟，框7，26小时：35分钟；框8，28小时：20分钟。
图12显示了DIME对MDA-MB231细胞在M相阶段的作用。
图13显示了由DIME诱导的异常细胞分裂的定量分析。
图14显示了DIME对MDA-MB-231细胞进入M相速率的作用。
图15(A、B和C)显示在DIME-处理的MDA-MB-231细胞(转位期分布)里染色体19DNA的杂交。图16A是对照，图16B是DNA染色成像，图16C是用1μMDIME处理5天染色体19的杂交(转位期)。
图16(A、B和C)显示DIME处理对MDA-MB-231细胞有丝分裂纺锤体的作用。A图，对照(没有药物)；B图，1μM DIME处理18小时；C图，1μMDIME处理5天。
图17显示微管组装的光学试验(MTP聚合)。GTP浓度是1μM(右端曲线)，左端曲线显示了4μM DIME的作用。其它条件与表13所示的相同。
图18显示了随着DIME浓度增加对MTP聚合的原始线性速率的影响。GTP浓度是1mM，其它条件与表13中的相同。
图19显示了Michaelis-Menten分析1μM DIME(封闭循环)对MTP聚合初始线性速率的作用，它是GTP浓度的函数(开放循环，没有药物)。其它条件与表13相同。
发明详述
定义
本文使用的：
“烷基”指饱和支链、直链或环烃基。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、环丁基、叔丁基、戊基、己基等。
“链烯基”指有至少一个碳-碳双键的不饱和支链、直链或环烃基。该基团对于双键来说可为顺式或反式。典型的链烯基包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、环丙烯基、丁烯基、异丁烯基、环丁烯基、叔丁烯基、戊烯基、己烯基等。
“炔基”指有至少一个碳-碳三键的不饱和支链、直链或环烃基。典型的炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、戊炔基、己炔基等。
“烷氧基”指-OR基团，其中R是定义如上的烷基、链烯基或炔基。
“卤素”指氟、氯、溴和碘取代基。
“哺乳动物”指动物或人。
“药学上可接受的盐”指保留了游离碱的生物效应和性质，通过与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸等无机酸反应得到的化合物。药学上可接受的盐包括，如钠和钾的碱金属盐，碱土金属盐和铵盐。
“药效基团”指分子部分或片段(或电子密度分布)关键的三维排列，它由受体识别(Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Delivery卷I：原理和实践619，第5版，Johen Wiley & Sons，纽约)。
“治疗有效量”指化合物或组合物能有效地阻止、抑制或击退恶性肿瘤细胞生长或使与癌症疾病有关的症状改善的用量。
特定技术方案的阐述
本发明涉及用特征为没有明显激素活性的甲状腺素类似物治疗哺乳动物的恶性肿瘤和癌症的方法。优选的是，本发明部分基于这样的发现：某些没有激素活性的甲状腺素类似物是强效的、选择性的和无毒的恶性肿瘤生长的抑制剂。本文优选的甲状腺素类似物是DIME。
甲状腺素是甲状腺的氨基酸(Merck Index，1989，9348：1483)，甲状腺素类似物是本技术领域公知的。文献中已述及甲状腺激素，特别是甲状腺素T3和T4，具有两个明显类型的生物作用：一个对细胞代谢作用，第二个对细胞分化和生长作用(Jorgensen，1978，“甲状腺激素和类似物II，结构-活性关系”在：激素蛋白质和肽类，卷VI，107-204页，C.H.Li，编辑，Academic Press，NY)。例如，甲状腺素通过甲状腺抑制摄入碘(Money等，1959，“各种甲状腺素类似物对大鼠甲状腺摄入碘-131的抑制”内分泌学64：123-125)，并通过蝌蚪变形研究对细胞分化的诱发作用(Money等，1958，“一些甲状腺素类似物的化学结构改变对Rana Pipiens蝌蚪变形的作用”内分泌学63：20-28)。另外，甲状腺素和某些甲状腺素类似物抑制了非恶性肿瘤小鼠脑垂体甲状腺带肿瘤的生长(Kumaoka等，1960，“甲状腺素类似物对可移植小鼠脑垂体肿瘤的作用”内分泌学，66：32-38；Grinberg等，1962，“对小鼠脑垂体甲状腺带肿瘤的研究。V.各种甲状腺素类似物对生长和分泌的作用，”癌症研究22：835-841)。甲状腺素和甲状腺素类似物的结构要求对细胞分化的代谢刺激和诱导是不相同的(参见Jorgensen，1978，“甲状腺激素和类似物II。结构-活性关系”In：激素蛋白质和肽类，卷VI，150页，C.H.Li，编辑，Academic Press，NY)。例如，Money等已发现甲状腺碘的摄入抑制与蝌蚪变形之间不相关(Money等，1958，“一些甲状腺素类似物化学结构的改变对Rana Pipiens蝌蚪变形的作用”内分泌学63：20-28)。
根据这些陈述，人们认为特定的甲状腺素类似物可改变或诱导未经确认的细胞反应，所述的甲状腺素类似物没有显示出甲状腺素T3和T4的作用模式(代谢或分化)。化合物
用于本发明方法的甲状腺素类似物和其药学上可接受的盐具有下式结构：
Figure C9719697900091
其中：
X＝O、S、CH2，羧基或没有；
Y＝O或S；
R1＝甲基或乙基；
R2、R3、R4和R5各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基和卤素；R4、R7、R8和R9各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基、卤素、NO2和NH2。
在优选的技术方案中，用于本发明方法的甲状腺素类似物和其药学上可接受的盐具有下列结构式：
其中：
X＝O、S、CH2、羧基或没有；
Y＝O或S；
R1＝甲基或乙基；
R2、R3、R4和R5各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基和卤素；R7和R8各自独立地选自：H、(C1-C4)烷基、(C1-C4)链烯基、(C1-C4)炔基、羟基、(C1-C4)烷氧基、卤素、NO2和NH2。
在特别优选的技术方案中，甲状腺素类似物是3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(“DIME”)。
文献中已经述及诸如DIME的甲状腺素类似物。但是，不像甲状腺素，DIME被报道没有明显的代谢或细胞分化活性(由蝌蚪变形测定)(Money等，1958，“The Effect of Change in Chemical Structure of Some Thyroxine Analogues on theMetamorphosis of Rana Pipiens Tadpoles” Endocrinology 63：20-28；Stasilli等，1959，“Antigoitrogenic and Calorigenic Activities of Thyroxine Analogues inRats” Endocrinology 64：62-82)。例如，与甲状腺素相比，DIME对甲状腺摄入碘的抑制仅是很少的(15％)(Money等，1959，“The Effect ofVarious ThyroxineAnalogues on Suppression of Indine-131 Uptake by the Rat Thyroid”’ Endocrinology 64：123-125)。此外，据报道DIME对非恶性小鼠脑垂体腺瘤的生长没有抑制活性(Kumaoka等，1960，“甲状腺素类似物对可移植小鼠脑垂体肿瘤的作用”内分泌学66：32-38；Grinberg等，1962，“Studies with Mouse Pituitary ThyrotropicTumors.V.Effect of Various Thyroxine Analogs on Growth and Secretion” 癌症研究 (Cancer Research)22：835-841)。没有报道对恶性肿瘤细胞进行研究。
业已发现，某些甲状腺素类似物没有明显的激素活性，特别是DIME，不仅抑制了各种恶性肿瘤细胞的生长(参见表3)，而且也诱导了微核化后肿瘤细胞凋亡。这些白细胞郁滞和杀细胞活性对结构是敏感的。对DIME的13种结构类似物和对应物进行试验表明，即使对甲酯和4’-甲氧基取代基作微小的改变也会使分子完全失活。虽然DIME在细胞分析和体内都有高活性，4’-丙氧基和乙基酯对应物是完全失活的。因此，DIME限定了分子部分的关键排列，或药效基团，它有特定的白细胞郁滞和杀细胞活性，结果有明显的化疗效用。
虽然不希望为理论所限定，但据信，本文所述的大多数甲状腺素类似物的可能分子作用模式是细胞周期抑制和诱导细胞凋亡。
真核细胞通过细胞分裂周期的进程最初由依赖细胞素(cyclin)蛋白激酶所控制。最佳的研究时期是从G2到M相的过度期，它为由细胞素B复合的cdc2激酶控制(综述参见，Dunphy，1994， Trends Cell.Biol.4：202-207).cdc2激酶活化需要磷酰化，该过程需要由蛋白磷酸酶2A调节(综述参见，Wera & Hennings，1995，Biochem.J.311：17-29)。
现已发现，本文所述的甲状腺素类似物运用了蛋白磷酸酶2A体外和体内的特异性活化。在体内，蛋白磷酸酶2A的活化与cdc2激酶和MAP激酶及拓扑异构酶(topoisomerase)II的去磷酰化的抑制相符，这使后者的两个酶都失活。DIME没有代谢作用，也不抑制DNA、RNA或蛋白质的生物合成途径。这样，最可能的作用模式是通过这些关键调节蛋白质的去磷酰化来抑制细胞周期并诱导细胞凋亡。因此，磷酸酶2A的活化和cdc2激酶的同时抑制对于治疗癌症是重要的和有力的治疗靶向。
虽然对酯和4’-位的改变会明显影响DIME的作用，但用来抑制恶性肿瘤生长和治疗癌症的甲状腺素类似物不限于DIME。例如，与DIME相比，4’-乙氧基对应物对人体癌症细胞显示了约25-30％最大的杀细胞作用(实施例4)。也可预计DIME可在芳环位置或桥氧被取代，但不失去活性。
现已知甲状腺素的芳环不在相同的平面里(Jorgensen，1978，“ThyroidHormones and Analogues II.Structure-Activity Relationships”In： Hormonal Proteins and Peptides，卷VI，107-204页，C.H.Li，编辑，Academic Press，纽约)。现也已知甲状腺素里的芳环的环位置可被各种取代基，包括烷基、卤素、硝基和氨基所取代，它们都有不同程度的保留的激素活性(同上)。此外，可没有与环连接的醚氧或被各种不对芳环限于相同平面的基团或原子，如亚甲基、羧基或硫取代，而不明显失去激素活性(同上)。因此，可预见在DIME上相似的取代基不会明显失去抗癌活性。很明显，DIME的2’-氯类似物对人体癌细胞的生长与DIME相比显示了约25％最大的抑制作用(实施例5)。由于体外和体内作用的直接相关关系(参见，实施例2-7)，用于本发明方法的有效化合物可常规地在体外分析筛选试验中识别。如实施例2-3所述，这类试验可筛选能活化蛋白质磷酸酶2A的特定化合物。典型的是，用于本发明方法的化合物通过约2-3个因子增长了蛋白质磷酸酶2A的活性，由实施例2或3所述的分析试验测量。
这类试验也可筛选体外或体内抑制恶性肿瘤细胞生长或消除肿瘤细胞生长的特定化合物，这在实施例4-6中加以阐述。一般来说，用于本发明的活性化合物的I50(与对照培养物相比化合物使50％细胞培养物死亡的浓度)范围是约0.5μm-5.0μm，这用实施例4所述的分析方法测量。
本技术领域人员知道，许多种恶性肿瘤细胞培养物和细胞系可用来筛选活性，包括，当不限于HL-60、HT-144、E-ras-20、DU-145、MDA-168、MCF-7、855-2和MDA-MB-231。当然，其它对本技术领域人员来说很明显的体外和/或体内分析来筛选抗肿瘤和/或抗-癌症活性的方法也可用来识别用于本发明的有效的甲状腺素类似物。
本文的化学式会有互变现象或构形异构化。本说明书中的分子式仅代表互变异构或构型异构化形式的可能形式，应当明白本发明涵盖了本文揭示的生物或药理活性相似于DIME的所有互变异构或构型异构形式。
除了上述化合物和它们的药学上可接受的盐，本发明可用化合物的溶剂化物及非溶剂化物形式(如水化形式)。
本文所述的化合物可用已知能制备化合物的任何方法来制备。合适方法由代表性实施例揭示。必需的起始物质可由有机化学的标准方法得到。
癌症
本文揭示的甲状腺素类似物可用来治疗各种癌症。这类癌症包括，例如，但不限于，诸如咽、结肠、直肠、胰腺、胃、肝、肺、乳房、皮肤、前列腺、卵巢、子宫颈、子宫和膀胱癌的癌症疾病；白血病；淋巴瘤；神经胶质瘤；视网膜神经胶质瘤；和肉瘤。
本发明优选的技术方案中，癌症与包括如，但不限于乳房和前列腺癌的实体肿瘤的形成有关，
药剂和给药途径
用于本发明的甲状腺素类似物可以药效上可接受的盐形式或药物组合物形式给予人体本身，所述的药物组合物中，治疗有效量，即能有效抑制恶性细胞生长或改善与癌症疾病有关的症状剂量的化合物与合适的载体或赋形剂混合。
给药途径
本文揭示的甲状腺素类似物和药物组合物可通过各种途径给药。合适的给药途径包括，如口服、直肠给药、经粘膜给药或肠内的给药；非胃肠道给药，包括肌注、皮下给药、髓内注射及鞘内注射、直接的心室内注射、静注、腹腔内注射、鼻内或眼内注射。
可替换的是，化合物可以局部给药而不是全身给药方式，如将化合物直接注射到实体肿瘤里，它常是贮藏或缓释剂型。
此外，可以靶向给药系统，如在用肿瘤特异性抗体涂覆的脂质体里给予化合物。脂质体可靶向给予并被肿瘤选择性地摄入。
在优选的技术方案中，本发明的甲状腺素类似物和药物组合物可口服给药。
组合物/制剂
本文的药物组合物可以本身已知的方法，如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣药丸、弄成粉、乳化、胶囊化、陷入或冻干方法制备。
用于本发明的药物组合物从而可用常规方法用一种或多种生理上可接受的包括赋形剂和佐剂的载体配制，所述的载体使活性化合物能在药学上使用。正确的制剂根据所选择的给药途径而定。对于注射，本发明试剂可配制成水溶液，优选的是在生理配伍的缓冲剂，如Hanks’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜给药，制剂中使用适合穿透屏障的渗透剂。这类渗透剂是本技术领域公知的。
对于口服给药，可通过使化合物与本技术领域公知的药学上可接受的载体混合来容易地配制化合物。这类载体能使化合物配制成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆、悬浮剂等，供被治疗的病人口服摄入。口服给药的药物制剂可这样得到：使化合物与固体赋形剂混合，任意地研磨所得的混合物，需要时，在加入合适的辅剂后加工颗粒混合物，以得到片剂或糖衣药丸的核芯。合适的赋形剂是，具体的是填料，诸如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇的糖；和诸如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的纤维素制剂。需要时，可加入崩解剂，如聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或它的盐，如藻酸钠。
糖衣药丸核被合适的包衣所涂覆。为了达到该目的，可使用浓缩的糖溶液，它可任选地含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波沫胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可向片剂或糖衣药丸包衣中加入颜料或色素供识别或区分活性化合物的不同组合剂量。可口服的药物制剂包括由明胶制备的压入固定(push-fit)胶囊，及由明胶和诸如丙三醇或山梨醇的增塑剂制备的密封软胶囊。压入-固定胶囊可含活性组分，它与诸如乳糖的填料、如淀粉的粘合剂和/或如滑石粉或硬脂酸镁的润滑剂和任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性化合物可溶于或悬浮在合适的液体里，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可加入稳定剂。所有口服给药的制剂可配制成适合这类给药的剂量。
对于口颊给药，组合物可为用常规方法配制的片剂或锭剂形式。
对于吸入给药，用于本发明的化合物常规地以来自压力化包装或喷雾器形式，通过使用合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体以气雾剂形式来释放。对于压力化气雾剂，剂量单位可通过装一个阀以释放计量的剂量。用于吸入或吹入的明胶胶囊和囊芯(cartridge)可配制成含化合物与诸如乳糖或淀粉的合适粉末的粉末混合物。
化合物可配制成经注射，如通过大丸药注射或连续注入的非胃肠道给药的制剂。注射制剂可为单位剂型存在，如，在安瓿或多剂量容器里加入防腐剂。组合物可为在油或水赋形剂中的悬浮剂、溶液或乳液，可含诸如悬浮、稳定和/或分散剂的配制剂。
非胃肠道给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮剂可制备成油状的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或赋形剂包括诸如芝麻油的脂肪油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或三甘油酯，脂质体。水性注射悬浮液可含增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选的是，悬浮液也可含合适的稳定剂或增加化合物溶解度以制得高浓度溶液的试剂。
可替换的是，活性组分可为粉末形式，使用前以合适的赋形剂，如灭菌、无热源的水组成制剂。
化合物也可配制成直肠组合物，如栓剂或保持的灌肠剂，如，含诸如可可脂或其它甘油酯的常规栓剂基底。
除前所述，化合物也可配制成贮藏制剂。这样长作用制剂可通过植入来给药(如皮下植人或肌内植入)或通过肌注来给予。例如，化合物可与合适的聚合材料或疏水材料(如在可接受油中的乳剂)或离子交换树脂，或难以溶解的衍生物，如难溶解的盐一起配制。
实施本发明的疏水性化合物的合适药物载体是助溶系统，包括苄醇、非极性表面活性剂、能以水混和的有机聚合物和水相。助溶系统可为VPD助溶剂系统。VPD是3％(w/v)苄醇、8％(w/v)非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65％(w/v)聚乙二醇300和余量的无水乙醇。VPD助溶剂系统(VPD：5W)由用在水溶液中的5％(w/v)右旋糖按1∶1稀释的VPD。该助溶剂系统能很好地溶解疏水性化合物，其本身对全身给药的毒性很低。自然地，助溶剂系统的比例可以改变只要考虑不破坏它的溶解度和毒性特征。此外，对助溶剂组分的特性地可改变：例如，可用其它低毒性非极性表面活性剂来代替聚山梨醇酯80；可改变聚乙二醇的片断大小；其它生物配伍的聚合物可代替聚乙二醇，如，聚乙烯吡咯烷酮；其它糖或多糖可代替右旋糖。
可替换的是，可对疏水药物化合物使用其它给药系统。脂质体和乳剂是公知的疏水药物给药的赋形剂或载体的例子。可使用某些有机溶剂，如二甲亚砜，但常有毒性较大的问题。另外，可用缓释系统，如含治疗剂的固体疏水聚合物半渗透材料来释放化合物。已有各种缓释材料，且为本技术领域所公知。缓释胶囊根据它们的化学性质，在数周直至100天里释放化合物。药物组合物也可包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的例子包括，但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇的聚合物。
其它适合于本文的甲状腺素类似物给药的制剂是本技术领域公知的，可在如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.美国，最近版本中发现。
有效剂量
适合用于本发明的药物组合物包括含治疗有效量活性组分的组合物。本技术领域人员，特别在根据本发明所揭示的细节基础上能测定治疗有效剂量。对于用于本发明方法的任何化合物，可用细胞培养分析最初评估治疗有效剂量。例如，一个制剂可配制成动物模式，以得到包括了细胞培养中测得的I50(即，使50％细胞培养物致死的试验化合物浓度)或I100(即，使100％细胞培养物致死的试验化合物浓度)的循环浓度范围。这类信息可用来更精确地测定人体的有用剂量。原始剂量可通过将本文揭示的甲状腺素类似物在细胞培养分析试验里的效果与已知抗癌症药，如长春新碱的效果进行比较来配制。在该方法中，这样得到原始的剂量：将细胞培养分析里得到的甲状腺素类似物和已知抗癌药的有效浓度比乘以已知抗癌药物的有效剂量。例如，若甲状腺素类似物在细胞培养分析里的有效性是长春新碱的两倍(即，在同样分析试验中I50 DIME等于I50 长春新碱的一半)，甲状腺素类似物的最初有效剂量是长春新碱已知剂量的一半。用这些最初的原则，具有本技术领域基本技能的人员可以测定人体的有效剂量。也可从体内数据来评估原始剂量。例如，现已发现，250毫克/千克管饲法给药每天一次，一周5天，持续32天能足以明显地抑制裸鼠中乳房癌异源移植物(MDA-MB-231)的生长(参见实施例7.3)。研究也显示，DIME的血清半衰期(t1/2)为约2-2.5小时，本身(per os)给药的生物利用度为87％(参见实施例7.2)。具有本技术领域一般技能的人员可基于该数据使人体给药最优化。
可个别地调节剂量和间隔以使活性化合物的血药水平维持在治疗有效量上。一般口服给药病人的剂量为约50-2000mg/kg/天，通常为约250-1000mg/kg/天，优选的是约500-700mg/kg/天，最佳的是约350-550mg/kg/天。优选的是，在每天给予多剂后能达到治疗有效的血清水平。
对于局部给药或选择性摄入，药物的有效局部浓度与血药水平不相关。本技术领域人员能使治疗有效的局部剂量最优化而无需进行实验。
当然，给予组合物的用量将根据被治疗的对象、对象的体重、病情的严重程度、给药方式和医生的判断而定。
当能检测到肿瘤或甚至不可检测到肿瘤时可重复间隔地进行化疗。
此外，由于它无明显的毒性(下面将作讨论)，可单独进行治疗或与其它抗癌药或其它药物，如AZT、抗炎药、抗生素、皮质类固醇、维生素等合并给药。
可以预见本文揭示的甲状腺素类似物和其它药物之间可能的协同作用。另外也可预见到多个甲状腺素类似物之间的可能的协同作用。
毒性
通过细胞培养或实验动物的标准药物过程，如通过测定LD50(使50％种群致死的剂量)和ED50(对50％种群产生治疗有效的剂量)来测定本文所述的甲状腺素类似物的毒性和治疗效果。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可表达为LD50和ED50的比。治疗指数高的化合物是优选的。这些细胞培养分析试验和动物研究得到的数据可用于制定对人体使用无毒的剂量范围。这类化合物的剂量优选地在包括几乎无毒或没有毒性的ED50的循环浓度范围里。剂量可在该范围里根据使用的剂型和给药途径而定。确切的制剂、给药途径和剂量可通过个体医生根据病人情况来选择。(参见，如Fingl等，1975，In： 治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第1章，p.1)。
使用本文揭示的甲状腺素治疗癌症的一个优点是它们没有毒性。例如，业已发现，每天口服1克/千克剂量，持续12-15天，裸鼠没有不良效果(参见实施例7.1)。由于静注DIME的血清半衰期(t1/2)约为2-2.5小时，重复每天给予的甲状腺素类似物的剂量不会产生预期的不良效果。
已对本发明作了阐述，下列实施例仅通过示例来阐述发明物质，不供限定。
实施例1：化合物合成
合成14个甲状腺素类似物，纯化并特征化。下表1提供了每个合成化合物的结构和选择的物理数据。
表1
合成的甲状腺素类似物
序             R1         R2        R3      R4       熔点          式               质谱          质谱
号                                                       (℃)                           (计算值)      (测定值)
1              CH3O       CH3O      H        H         153-155       C15H12I2O4   509.882513    509.882960
2              EtO         CH3O      H        H         123-125       C16H16I2O4   523.898163    523.898737
3              n-PrO       CH3O      H        H         114-116       C17H16I2O4   537.913813    537.914014
4              n-BuO       CH3O      H        H         82-84         C18H19I2O4   551.929463    551.930000
5              CH3O       EtO        H        H         96-98         C14H16I2O4   523.898163    523.898202
6              CH3O       HO         H        H         233-235       C14H19I2O4   ref
7              CH3O       H2N       H        H         207-209       C14H11I2NO3  494.882847    494.881880
8              CH3O      (CH3)HN    H        H         181-183       C13H13I2NO3  508.898497    508.898971
9              CH3O      (CH3)2N   H        H         162-164       C14H13I2NO3  522.914148    522.914364
10             HO          CH3O       H        H         204(分解)     C14H10I2O4   495.866863    495.867453
11             H           CH3O       H        H         142-144       C14H10I3O3   479.871948    479.872553
12             I           CH3O       H        H         139-141       C14H9I2O3    605.768600    605.767839
13             H           CH3O       H        CH3O     123-125       C13H12I2O4   509.882513    509.882387
14            CH3O        CH3O       Cl       H         132-134       C15H11CH2O4  543.843541    543.843424
ref：根据Borrows等J.Chem.Soc.1949：S183-S190。
b：分解温度。
1.1 3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物1)
根据Borrows等1949“甲状腺素和相关物质的合成。部分I。酪氨酸和它的部分衍生物的制备，和得到甲状腺素的新途径”J.Chem.Soc.1949(同上，颁布1号)：S185-S190所述来制备3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯，并用95％乙醇重结晶，熔点：153-155℃。
质谱：FAB，m/z(相对强度)：510(M+，100)，479(4.5)，384(4.5)。M+峰的高分辨数据：C15H12I2O4的计算值，509.882513；测定值，509.882960(偏差＝-0.9ppm)。
1H NMR光谱，DMSO-d6(相对于TMS的δ(ppm)值)：3.719(3H，单个)，3.876(3H，单峰)，6.693(2H，双峰，J＝9.45Hz，有细分裂)，6.845(2H，双峰，H＝9.36Hz，有细分裂)，8.390(2H，单峰)。
1.2 3，5-二碘代-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物2)
用Borrows等，1949“甲状腺素和相关物质的合成。部分I。酪氨酸和它的部分衍生物的制备，和得到甲状腺素的新途径”J.Chem.Soc.1949(增补，颁布1号)：S185-S190所述来制备3，5-二碘代-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物1)。
1.2.1 3，5-二硝基-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯
在室温下的50毫升烧瓶里，使4-乙氧基苯酚(Aldrich)(1492毫克，10.8毫摩尔)与2.0MKOH水溶液(5.50毫升)搅拌形成4-乙氧基苯酚酸钾。加入4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯(Ullmann，1909，Annalen der Chemie 366：92-93；商业来源：Spectrum Chemical Company，Gardena，美国加利福尼亚；2606毫克，10.0毫摩尔)，让混合物加热回流1小时，在冰浴里冷却，有橡胶样团块产物沉积出来。加入冷的1.0M KOH(水溶液20毫升)，继续冷却使产物固化。打碎橙黄色固体，在吸力滤器里收集，用水淋洗并干燥。用热的95％乙醇(50毫升)结晶材料(3.08克)得到2.56克(70.6％得率)3，5-二硝基-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。熔点：101-103℃。
质谱(EI)：高分辨的M+：C16H14N2O3的计算值：362.075016；测定值，362.074793(偏离＝0.6ppm)。
1.2.2 3，5-二碘代-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯
将3，5-二硝基-4-(4’-乙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯部分(724.4mg，2.00毫摩尔)溶于冰乙酸(50毫升)，在Parr型4561小反应器中与10％钯/碳催化剂混合(Aldrich)(200毫克)混合，在H2(43psi)气氛下加料，在氛围温度下快速搅拌直至由于反应停止而使压力下降(6分钟，最终为16psi)。混合物立即经硅藻土床过滤以除去催化剂，在旋转蒸发器上除去乙酸溶剂得到褐色油状残留物，它是3，5-二胺衍生物的粗制品。粗制品二胺溶于冰乙酸(6.0ml)，通过在3分钟里将它滴加到搅拌着的、冰冷却的亚硝酸钠溶液(345毫克，5毫摩尔)在浓硫酸里(3.5ml)里进行四氮化。在冰浴温度下搅拌30分钟后，粘稠的混合物被移入室温下的快速搅拌的在蒸馏水(2.5ml)中的碘化钾(3.0克)溶液。让黑色混合物搅拌30分钟，最后在70℃下加热5分钟。将混合物倒入乙酸乙酯(100毫升)，加入水(50毫升)。将两相混合物转移到分液漏斗中，再加入乙酸乙酯(50毫升)和水(50毫升)，将产物萃取入乙酸乙酯。有机层(乙酸乙酯)用两次水(每次50毫升)洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过蒸发除去乙酸乙酯得到黑色焦油状的残渣。
该粗制品溶于丙酮(8毫升)，用制备型薄层层析板(5)纯化(Whatman，硅胶，1000微米层，20厘米×20厘米，具有荧光指示剂)。板在正己烷∶乙酸乙酯∶乙酸(3∶1∶0.8v/v/v)中展开。产物带(Rf＝0.84)，UV光下观察，从各自的板上收集，汇合，用乙酸乙酯(3×50毫升)洗脱硅胶(保持在烧结的玻璃漏斗里)。除去乙酸乙酯得到类白色固体，用95％乙醇(10毫升)结晶。得率：两批白色晶体总量为275毫克(26％，基于2毫摩尔二硝基前体)。熔点：123-125℃。
质谱：EI，m/z(相对强度)：524(M+，100)，496(16.7)，310(9.1)，242(6.1)，211(7.6)，155(6.1)。M+峰的高分辨数据：C16H14I2O4的计算值：523.898163；测定值，523.898737(偏差＝-1.1ppm)。
1H NMR光谱，DMSO-d6(相对于TMS的δ(ppm)值)：1.303(3H，三峰，J＝6.94Hz)，3.877(3H，单峰)，3.971(2H，四重峰，J＝6.95Hz)，6.678(2H，双峰，J＝8.98Hz，细分裂)，6.879(2H，双峰，J＝9.06Hz，有细分裂)，8.389(2H，单峰)。
1.3 3，5-二碘代-4-(4’-正丙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物3)
按实施例1.2所述制备3，5-二碘代-4-(4’-正丙氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。通过用4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯处理4-正-丙氧基苯酚酸钾(从市售的4-正-丙氧基苯酚制备)的水溶液来合成二硝基前体。二硝基产物经H2/Pd(C)还原得到二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通过与碘化钾反应(Sandmeyer反应)转化为二碘代产物。用制备型TLC纯化和并重结晶。
1.4 3，5-二碘代-4-(4’-正丁氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物4)
如实施例1.2所述制备3，5-二碘代-4-(4’-正丁氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。通过用4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯处理4-正-丁氧基苯酚酸钾(从市售的4-正-丁氧基苯酚制备)的水溶液来合成二硝基前体。二硝基产物经H2/Pd(C)还原得到二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通过与碘化钾反应(Sandmeyer反应)转化为二碘代产物。用制备TLC纯化和并重结晶。
1.5 3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸乙酯(化合物5)
通过3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯合成3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸乙酯，前者在Borrows等，1949，J.Chem.Soc.1949：S185-S190中得以揭示。这样，在10毫升烧瓶里，将3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸(99.2毫克，0.200毫摩尔)转化为3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯。真空下除去过量硫酰氯后，搅拌下加入无水乙醇(5.0ml)，让混合物在70℃下加热5分钟。除去过量乙醇，干燥的残留物溶于热的95％乙醇(4.0ml)，从中产物酯在冰箱(3℃)里结晶。得率：55.8毫克(53％)浅黄色晶体。熔点96-98℃。
质谱：(EI)：M+峰的高分辨数据：C16H14I2O4的计算值：523.898163；测定值，523.898202(偏差＝-0.1ppm)。
1H NMR光谱，DMSO-d6(相对于TMS的δ(ppm)值)：1.336(3H，三重峰，J＝7.19Hz)，3.717(3H，单峰)，4.336(2H，四重峰，J＝7.06Hz)，6.695(2H，双峰，J＝9.34Hz，有细分裂)，6.895(2H，双峰，J＝9.20，有细分裂)，8.389(2H，单峰)。
1.6 3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸(化合物6)
如Borrows等，1949，J.Chem.Soc.1949：S185-S190所述来合成3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸。
1.7 3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰胺(化合物7)
通过使化合物1酰胺化来合成3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰胺。在125毫升烧瓶里，将3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物1)(100毫克，0.196毫摩尔)溶于无水甲醇(60毫升)。将无水氨气以中等速度在室温下通入溶液达5分钟。在用塞子塞住的烧瓶里静置1小时后，重复用氨气处理(5分钟)，让混合物在用塞子塞住的烧瓶里静置48小时。通过旋转蒸发除去甲醇/氨，干燥的残留物溶于甲醇∶水(7∶3v/v)(30毫升)，在冰箱(3℃)里结晶。得率：58.3毫克(60％得率)浅黄色晶体，熔点：207-209℃。
质谱(FAB)：M+峰的高分辨数据：C14H11I2NO3的计算值：494.882847；测定值，494.881880(偏差＝2.0ppm)。
1H NMR光谱，DMSO-d6(相对于TMS的δ(ppm)值)：3.716(3H，单峰)，6.682(2H，双峰，J＝8.93Hz)，6.895(2H，双峰，J＝8.99Hz)，7.528(1H，单峰)，8.113(1H，单峰)，8.402(2H，单峰)。
1.8 3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺(化合物8)
通过3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯来制备3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N-甲基苯甲酰胺(参见实施例1.5)。使酰氯与过量甲胺在四氢呋喃里在室温下(1小时)反应，过滤除去甲胺-盐酸盐沉淀物，蒸发溶剂，用95％乙醇使产物结晶。
1.9 3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N，N-二甲基苯甲酰胺(化合物9)
通过3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰氯来制备3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)-N，N-二甲基苯甲酰胺(参见实施例1.5)。使酰氯与过量甲胺在四氢呋喃里在室温下(1小时)反应，过滤除去甲胺-盐酸盐沉淀物，蒸发溶剂，用无水乙醇使产物结晶。
1.10 3，5-二碘代-4-(4’-羟基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物10)
如实施例1.2所述制备3，5-二碘代-4-(4’-羟基苯氧基)苯甲酸甲酯。如Borrows等，1949，“甲状腺素相关物质的合成，部分II，二硝基二苯基醚的制备”J.Chem.Soc.1949(增补本，颁布1号)：S190-199所述的方法，通过使4-氯-3，5-二硝基苯甲酸与氢醌在吡啶溶液里反应来制备二硝基前体。
1.11 3，5-二碘代-4-苯氧基苯甲酸甲酯(化合物11)
如实施例1.2所述制备3，5-二碘代-4-苯氧基苯甲酸甲酯。通过用4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯处理苯酚酸钾水溶液(从市售苯酚中制备)来合成二硝基前体。二硝基产物用H2/Pd(C)还原成二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通过与碘化钾反应转化为二碘产物(Sandmeyer反应)。用制备型TLC纯化并结晶。
1.12 3，5-二碘代-4-(4’-碘代苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物12)
如实施例1.2所述制备3，5-二碘代-4-(4’-碘代苯氧基)苯甲酸甲酯。由于二硝基前体里的碘取代基本身易于被H2/Pd(C)还原，碘代-二硝基前体被铁粉在乙酸/95％乙醇里还原成碘-二胺(参见，如Gemmill等，1956，“3-碘-、3，3’-二碘和3，3’-二碘代-5-溴代甲状腺素”J.Am.Chem.Soc.78：2434-2436)。然后用Sandmeyer反应使碘代-二胺进行四氮化并转化为二碘产物。用制备TLC纯化后，产物用乙醇结晶。(熔点139-141℃)
质谱(EI)：M+峰的高分辨数据：C14H9O3I3计算值：605.768600；测定值，605.767839(偏差＝1.3ppm)。
1H NMR光谱，DMSO-d6(相对于TMS的δ(ppm)值)：3.879(3H，单峰)，6.628(2H，双峰，J＝8.97Hz，有细小分裂)，7.670(2H，双峰，J＝9.12Hz有细小分裂)，8.396(2H，单峰)。
1.13 3，5-二碘代-4-(3’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物13)
如实施例1.2所述制备3，5-二碘代-4-(3’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物3).通过用4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯处理3-甲氧基苯酚酸钾水溶液(从市售苯酚中制备)来合成二硝基前体。二硝基产物用H2/Pd(C)还原成二胺衍生物，然后用NaNO2/H2SO4四氮化，并通过与碘化钾反应转化为二碘产物(Sandmeyer反应)。用制备型TLC纯化并结晶。
1.14 3，5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物14)
除了用替换的方法代替二硝基前体还原外，其它用实施例1.2所述的一般方法来合成3，5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(化合物14)。
1.14.1 3，5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯
如实施例1.2.1所述，通过使2-氯-4-甲氧基苯酚(Aldrich Chemical Co.，美国WI)成为2-氯-4-甲氧基苯酚酸钾与4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯反应来制备二硝基前体。用乙醇结晶得到3，5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯的橙色结晶(得率66％)。熔点：116-119℃。
质谱(EI)：M+峰的高分辨数据：C15H11ClN2O8计算值：382.020393；测定值，382.020187(偏差＝0.5ppm)。
1.14.2 3，5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯
由于二硝基前体里的2’-氯取代基在H2/Pd(C)还原里易于反应，故与实施例1.12相似，用乙酸/95％乙醇里的铁粉将前体还原成2’-氯二胺。这样，在250ml烧瓶里，3，5-二硝基-4-(2’-氯-4‘-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(765.5毫克，2.00毫摩尔)溶于冰醋酸(35毫升)和95％乙醇(35毫升)，将溶液加热到70℃，加入铁粉(2.00克)。在热浴(70℃)里激烈打旋混合物。打旋3分钟后，混合物出现褐色。在70℃下继续打旋35分钟。然后将混合物转移到分液漏斗里，加入水(250毫升)和乙酸乙酯(250毫升)，产物萃取入乙酸乙酯层，让乙酸乙酯相与水相分开(3小时)。用无水Na2SO4干燥萃取物，过滤，用旋转蒸发器除去乙酸乙酯得到固化的粗制的3，5-二氨基产物。
将粗制的二氨基产物立即溶于冰醋酸(6.0ml)，按实施例1.2所述四氮化并经Sandmeyer反应转化为3，5-二碘代-4-(2’-氯-4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。如实施例1.2所述，经制备型薄层层析纯化(Rf＝0.70)，产物用95％乙醇重结晶(250.8毫克类白色晶体，23％得率)。熔点：132-134℃。
质谱：EI，m/z(相对强度)：546(34)，545(16)，544(M+，100)，418(6)，382(6)。M+峰的高分辨数据：C15H11ClI2O4计算值：543.843541；测定值，543.843424(偏差＝0.2ppm)。
1H NMR光谱，DMSO-d6(相对于TMS的δ(ppm)值)：3.747(3H，单峰)，3.881(3H，单峰)，6.328(1H，双峰，J＝8.97Hz)，6.780(1H，双峰，J＝9.10Hz和J＝2.95Hz)，7.195(1H，双峰，J＝3.02Hz)，8.400(2H，单峰)。
1.15 其它化合物
用上述的合成方法从合适的起始物质里合成本文所述的另外的甲状腺素，这对有机化学技术领域人员来说是很显然的。本技术领域里也可发现其它指南丛书，特别是Borrows等，1949，“甲状腺素和相关物质的合成，部分I。酪氨酸和它的衍生物的制备，和新途径制备甲状腺素”J.Chem.Soc.1949(增补本，颁布1号)：S185-S190；Borrows等，1949，“甲状腺素和相关物质的合成。部分II。二硝基苯基醚的制备”J.Chem.Soc.1949(增补本，颁布1号)S190-S199；Clayton等，1951，“甲状腺素和相关物质的合成。部分VIII。一些卤代和硝基-二苯基醚的制备”J.Chem.Soc.1951：2467-2473；Gemmill等，1956，“3-碘代-、3，3’-二碘代-和3，3’-二碘代-5-溴甲状腺素”J.Am.Chem.Soc.78：2434-2436；Meltzer等，1957，“甲状腺素类似物(Thyroxine Analogs”J.Org.Chem.22：1577-1581；Crowder等，1958，“双苄基异喹啉(Bisbenzylisoquinolines)部分II。5-(2-氨乙基)-4’-羧基-2，3-二甲氧基二苯基醚的合成”J.Chem.Soc.1958：2142-2149；Jorgensen，1978，“甲状腺激素和类似物，I.合成，物理性质和理论计算”In；激素蛋白质和肽类，卷VI，57-105页，C.H.Li编辑，AcademicPress(在此并入供参考)；和Jorgensen，1978“甲状腺激素和类似物，II.结构-活性关系”In：激素蛋白质和肽类，卷VI，107-204页，C.H.Li编辑(在此并入供参考)。
实施例2：纯化蛋白磷酸酯酶2A的活化
对表1所列的化合物1和3进行蛋白质磷酸酯酶2A活化的试验。
2.1 32P-标记的组蛋白H1底物的制备
体积为100微升的组蛋白H1根据标准方法用蛋白激酶C(UpstateBiotechnology，Inc.，纽约)磷酰化。可替换的是，在用P13-Suc琼脂糖技术(Smythe和Newport，1992，“Coupling of Mitosis to the Completion of S phase in XenopusOccurs via Modulation of the Tyrosine Kinase that Phosphorylates p34cdc2”，Cell 68：787-797)后，用在4-8阶段快速繁殖的Mytilus Edulis胚胎纯化得到的p34cdc2激酶进行磷酰化。
2.2磷酸酯酶含量测定
使125ng纯化的蛋白磷酸酯酶2A(Upstate Biotechnology，Inc.，纽约；Usui等，1983，J.Biol.Chem.258：10455-10463)与甲状腺素类似物(50μM)在缓冲液(20mM MOPS或Tris，pH7.5，1mM MgCl2，60μM β-巯基乙醇)于23℃下预培养10分钟。总的反应体积为20微升。加入32P-标记的组蛋白H1底物(10微克，105cpm)，让脱磷酰反应在23℃下持续5分钟，然后通过加入2微升Laemmli缓冲液来终止反应。对同样含125ng未处理的蛋白磷酸酯酶2A进行同样的反应作为对照。
磷酰化和脱磷酰化的组蛋白H1通过凝胶电泳进行分离(12％SDS-PAGE)，割下含磷酰化组蛋白H1，通过闪烁计数器分析32P活性。
2.3结果
在5分钟内去磷酰化的速度是去磷酰化反应初速度(v初)的指示值。下表2列出了化合物1和3的v初。
                                  表2
                          蛋白磷酸酯酶2A的活化
          甲状腺素类似物                           活性/5分钟(cpm)
          对照                                     10217±1708
          化合物1                                  24655±8600
          化合物3                                  7521±1562
报告值是三个样品的平均值。
这些结果显示与DIME(化合物1)一起预培养蛋白质磷酸酯酶2A的时间短(10分钟)，它超过了组蛋白H1脱磷酰化的v初双倍。4’-丙氧基相应物不使蛋白磷酸酯2A活化。这些数据表明，即使DIME药效基团结构末端(即甲氧基和甲酯基团)的最小改变也明显影响活性。在体外恶性细胞分析(实施例3)观察到和观察小鼠体内抗肿瘤生成作用(参见实施例4和6)得到这些数据与蛋白磷酸酯酶2A活性有很大的相关性。
实施例3 蛋白质磷酸酯酶A2在肿瘤细胞培养物里的活化
根据Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮处理来修饰与生长相关的酶途径和使Ras-转移牛上皮细胞系肿瘤生长缺失(Modification ofGrowth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss of Tomorigenicity of Ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with 5-Iodo-6-Amino-1，2-Benzopyrone(INH2BP))”国际肿瘤学杂志(Intemational J.Oncology)8：239-252。
表3显示了由DIME(化合物1)活化的结果。所有其它化合物是无效的。
                           表3
        DIME对E-ras20细胞核萃取物的磷酸酯酶活性作用
                                                        磷酸酯酶活性
                                                (fmol Pi/毫克蛋白质×分钟)
E-ras核萃取物(每次测定用5-10微克蛋白质)                     29±5
E-ras核萃取物+50μMDIME                                     44±7
DU-145(每次测定用5-10微克蛋白质)                            12.1±3
DU-145+50μMDIME                                            19.1±2.5
Pi＝无机磷酸盐
这些结果显示，50μM DIME使在E-ras转移牛上皮细胞和DU-145细胞中的蛋白磷酸酯酶2A活化至少两倍。
实施例4：对人体癌细胞的杀细胞作用
在体外对7种人体癌细胞试验化合物1-13的杀细胞作用。DIME(化合物1)具有最大活性，乙氧基衍生物(化合物2)的活性是最大活性的25-30％。
4.1实验方案
从ATCC得到7种人体癌细胞(Rockville，MD)，并保持在推荐的生长培养基里。将细胞以2×104细胞/cm2密度植入坑(2cm2)。在植入时向培养基中加入各种浓度的化合物1-13。
使培养物在37℃下培养72小时(5％CO2，大气压)。培养后用胰蛋白酶使细胞分离，在血细胞计数器里计数。
4.2结果
DIME(化合物1)的活性最大，乙氧基类似物(化合物2)的活性是最大活性的25-30％。所用其它被试验的类似物(化合物3-13)完全没有活性。
DIME(化合物1)的实验结果做成下表4。I100表示该浓度下没有存活细胞；I50表示与对照相比，该浓度下50％细胞存活。
                                 表4
                     DIME对各种人体癌细胞系的作用
细色胞系                          I50(μM)               I100(μM)
HT144(黑素瘤)                      0.5                       4.0
DU145(前列腺癌)                    0.5                       3.5
HeLA(子宫颈)                       0.6                       3.5
HL-60(前髓细胞白血病)              0.6                       3.0
MDA-MD-231(乳房癌)                 0.4                       3.0
SK-Br-3(乳房癌)                    0.6                       5.0
T470(管乳房癌)                     0.7                       3.5
实施例5：对肿瘤细胞生长的抑制
试验化合物1和14对MDA-MD-231癌细胞生长的抑制。与DIME(化合物1)相比化合物14显示约25％抑制活性。
5.1实验方案
从ATCC(美国马里兰)得到人体癌细胞MDA-MD-231，保持在推荐的生长培养基里。使细胞在37℃下在化合物1和14的各种浓度存在下生长3天。
5.2结果
实验结果制成下表5。
                                表5
                        MDA-MD-231细胞的生长速率
化合物1(μM)           细胞(×106)          化合物14         细胞(×106)
0.0                       0.95                 0.0              0.95
0.5                       0.20                 0.5              0.95
1.0                       0.10                 1.0              0.71
2.0                       0.09                 2.0              0.20
与DIME(化合物1)相比，DIME(化合物14)的2’-氯类似物显示了约25％的抑制活性。
实施例6：E-ras移植的牛上皮细胞肿瘤生长性的缺失
在高肿瘤生长的E-ras移植的牛上皮细胞系里试验DIME(化合物1)的形态作用。
6.1实验方案
将E-ras移植的牛上皮细胞(Bauer等，1996，Intl.J.Oncology 8：239-252)暴露于10μM DIME达3天。将DIME-处理过的细胞(105或106细胞/100μL)皮下注射到裸鼠体内，肿瘤持续了25天，
6.2结果
如图1所示，暴露于10μM DIME达3天的E-ras移植的上皮细胞会诱发出广泛的小核化(micronucleation)，与肿瘤生长的缺失相符。如图2所示，暴露于未处理的细胞的动物有肿瘤生长(顶部曲线)，在第25天死于肿瘤。在注射前将细胞暴露于10μM DIME则几乎完全消除了肿瘤生长性(较低的曲线)。即使在3个月后未经体内药物治疗也不出现肿瘤。
实施例7：体内实验
下列实验显示了无毒性，生物利用度，血清半衰期(t1/2)和DIME处理人体乳房癌异源移植入小鼠的体内效果。
7.1毒性
让10个裸鼠每天口服14C-标记的DIME(化合物1)(1.0g/kg，在0.1毫升玉米油里)，持续12-15天。在治疗阶段观察到小鼠都没有病状。
7.2血清半衰期(t1/2)和生物利用度
口服给予小鼠126毫克/kg 14C-标记的DIME(化合物1)。给药后，在15和30分钟，1、2、4、6、8和24小时采血。在液体闪烁计数器里分析血液等分物(50微升)，数据表达为微克-等当量/毫升。通过RSTRIP方法(Micromath，Salt LakeCity，UT)来分析血药数据。用24.5mg/kg 14C-标记的DIME对小鼠平行组进行静注给药，采血时间为10、20和30分钟，和1、2、4、6和8小时。
7.2.1结果
14C-标记的DIME(毫克-当量/毫升)的血药水平如图3所示。对于口服给药，血药浓度-时间曲线下的面积是665.28微克-小时/毫升(由圆形代表的数据)，对于静注给药为156微克-小时/毫升(由正方形代表的数据)。口服给予DIME的生物利用度用标准率×剂量的方法从这些数据中算得为83％。DIME的半衰期(t1/2)是约2-2.5小时。
7.3体内效果
人体肿瘤在无胸腺的小鼠(如裸鼠)里生长成的异源移植物的能力是研究对人体肿瘤治疗的生物反应的有用的体内模型。由于人体肿瘤异源移植到无胸腺小鼠里的首次成功(Rygaard和Povlsen，1969，Acta Pathol.Microbial.Scand.77：758-760)，许多不同的人体肿瘤细胞系(如乳房的、肺部的、泌尿生殖器的、胃肠道的、头部和颈部的、恶性胶质瘤、骨癌和恶性黑素瘤)也已成功地移植入裸鼠并在其中生长。人体乳房肿瘤细胞系，包括MCF-7、ZR75-1和MDA-MB-231已能在裸鼠皮下得到皮下移植物(Warri等，1991，Intl.J.Cancer 49：616-23；Ozzello &Sordat，1980，“由人体乳房细胞系移植到无胸腺的裸鼠产生的肿瘤行为”Eur.J.Cancer 16：553-559；Osbourne等，1985，Cancer Res.45：584-590；Siebert等，1983，Cancer Res.43：2223-2239)。
该实验显示在裸鼠中抑制了MDA-MB-231异源移植物。
7.3.1实验方案
从ATCC(Rockville，MD)得到MDA-MB-231(人体乳房癌)细胞并保持在推荐的生长培养基里。20个裸鼠每个都皮下接种MDA-MB-231细胞(106细胞/100微升)。10个鼠一组通过管饲法给予DIME(250毫克/千克，10毫升/千克在玉米油里)，每天给予一次，每周5天，持续32天。另一组(对照)的10个小鼠根据相同的给药剂量给予赋形剂。用Vernier测径器每周测两次，在每个时间点测定平均肿瘤体积。用不配对、双尾t-试验进行组之间的比较，用变异分析来分析结果。
7.3.2结果
在接种后14、21、28和32天时测量处理和未处理小鼠平均肿瘤体积，结果如下表5所示。
                               表6
                 DIME处理后的MDA-MB-231肿瘤体积
处理组           14天±SEMa       21天±SEMa       28天±SEMa    32天±SEMa
                    (p值)             (p值)             (p值)          (p值)
对照(赋形剂)     286.6±42.0       622.2±58.1       979.0±154     1176.6±222.4
DIME             172.0±34.3       285.7±62.4       430±85.6      543.8±122.1
(250mg/kg)       (p＝0.06)         (p＝0.02)         (p＝0.01)      (p＝0.01)
减少％           40％              54％              56％           54％
aSEM＝均值标准误
这些数据表明DIME即使在非最佳治疗方案下也有明显减少恶性肿瘤生长的作用。
7.4体内效果
如上所述试验其它甲状腺素类似物。根据这些试验，类似物显示了预期的活性。
实施例8：制剂
下列实施例提供了例举性的、非限制的对哺乳动物，特别是人、病人给予本发明的甲状腺素类似物的制剂。虽然实施例显示了DIME制剂，但应当明白本文所述的任何甲状腺素类似物可配制成下列制剂。
8.1片剂
每片含60毫克活性组分的片剂制成如下：
DIME                                        60毫克
淀粉                                        45毫克
微晶纤维素                                  45毫克
羧甲基淀粉钠                                4.5毫克
滑石粉                                      1毫克
聚乙烯吡咯烷酮(10％，在水中)                4毫克
硬脂酸镁                                    0.5毫克
                                            150毫克
使活性组分、淀粉和纤维素经过美国45号筛，并彻底混合。使聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得的粉末混合，然后经过美国14号筛。使颗粒在50-60℃下干燥，通过美国18号筛。然后将已通过了美国60号筛的羧甲基淀粉、硬脂酸镁和滑石粉加入颗粒中，混合后，用压片机压制混合物以得到每片重达150毫克的片剂。
可通过湿法制粒，然后压制可从列于表1中的组分里制备片剂。
8.2明胶胶囊
用下列组分制备硬胶囊：
DIME                                         250毫克/胶囊
于燥淀粉                                     200毫克/胶囊
硬脂酸镁                                     10毫克/胶囊
使上述组分混合并以460毫克量填入硬的明胶胶囊
8.3气雾剂溶液
制备含下列组分的气雾剂溶液：
DIME                                          0.25％(w/w)
乙醇                                          29.75％(w/w)
推进剂22(氯二氟甲烷)                          77.00％(w/w)
使活性化合物与乙醇混合，将混合物加到部分推进剂22中，冷却到-30℃，转移到填充装置。然后将所需的量装入不锈钢容器，用剩余的推进剂稀释。将阀门单元固定在容器里。
8.4栓剂
如下制备每个含225毫克活性组分的栓剂：
DIME                                  225毫克
饱和脂肪酸甘油酯                      2000毫克
使活性组分经美国60号筛，并悬浮在用最少必须热量使之熔化脂肪酸甘油酯中。然后将混合物倒入容量为2克的栓剂模中，并让它冷却。
8.5混悬剂
如下制备每5毫升含50毫克药物的混悬剂：
DIME                                  50毫克
羧甲基纤维素钠                        50毫克
糖浆                                  1.25毫升
苯甲酸溶液                            0.10毫升
调味品                                适量
着色剂                                适量
纯水加到                              5毫升
使活性组分经过美国45号筛，与羧甲基纤维素钠和糖浆混合形成平滑的糊状。苯甲酸溶液、调味品和一些着色剂用一部分水稀释，并搅拌加入。然后加入足量的水以得到所需的体积。
实施例9：
在6-氨基-1，2-苯并吡喃的第5位上用碘原子代替H可明显提高母体化合物的pADPRT抑制效力、抗HIV活性和抗肿瘤作用。Cole等，1991“通过聚(ADP-核糖)聚合酶的两个配对物6-氨基-1，2-苯并吡喃酮和5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮在培养物里抑制HIV-1 IIIb在AA-2细胞里的复制”BiochemBiophys.Res.Commun.180：504-514；Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃(INH2BP)治疗来修饰与生长相关的酶途径和ras-转移牛上皮细胞系肿瘤生长的缺失”Intl.J.Oncol.8：239-252。问题在于在特定芳族分子里碘取代基的数目增加是否会改善它们的分子药理性质。为了该解决该问题，我们首先分析移植二碘代化合物，如甲状腺激素类似物的细胞作用。
现已确认，甲状腺激素类似物的代谢和产生变形作用视其化学结构而定。Jorgensen，E.1978，“甲状腺激素和类似物。II.结构-活性关系：在“激素蛋白质和肽类”VI卷，LiCH(编辑)，Academic Press，美国纽约，108-203页。在1949年第一次合成了激素失活的3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)(Borrows等，1949，“甲状腺素和相关物质的合成，部分I.酪氨酸及其一些衍生物的制备和甲状腺素的合成的新途径”J.Chem.Soc.补充颁布号1：S185-S190)，但没有报道该物质有明显的代谢或变形作用，Money等，1958，“一些甲状腺素类似物的化学结果改变对Rana pipiens蝌蚪变形的作用”内分泌学63：20-28；Stasili等，1959，“甲状腺素类似物在大鼠中抗致甲状腺肿的活性和产热活性”内分泌学64：62-82Money等1959，“各种甲状腺素类似物对由大鼠甲状腺摄入的131I的抑制作用”内分泌学64：123-125；Kumaoka等，1960，“甲状腺素类似物对可移植小鼠的脑垂体肿瘤的作用”内分泌学66：32-38；Grinberg等，1962，“对小鼠脑垂体甲状腺带肿瘤的研究。V.各种甲状腺素类似物对生长和分泌的作用”，癌症研究(Cancer Res.)22：835-841。在由发明者较早提出的著作中，已显示DIME可在细胞培养物中和体内作为潜在的杀肿瘤剂。Kun等，1996，“3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯诱导的肿瘤凋亡解(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3，5-diiodo-4-(4’-methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”文摘号102，Int.J.Oncol.9：补充829；Zhen等，1997，“由DIME诱导的人体癌症细胞M相阻断和内复制(Induction ofMetaphase Block and Endoreduplication in Human Cancer Cells by 3，5-diiodo-4(4’-methoxyphenoxy)Benzoate(DIME)”文摘，Amer.Assoc.Cancer Res.，美国待批专利申请08/655,267(1996，6，4提交)“Method of Treating Malignant Tumors withThyroxine Analogs having no significant Hormonal activity”显示了细胞信号和癌症合成的症状，和对DIME结构同类物和类似物(仅侧链取代不同)的测试，描写了DIME杀肿瘤活性的结构特异性。
下列著作显示了与DIME和其类似物17比较的结构活性，并揭示了CIME本身的细胞水平的杀肿瘤作用。对DIME的药物代谢和细胞摄入分析表明它对动物没有体内毒性的理由。对DIME的作用模式细胞计数分析和生化机制分析是连续研究的对象。
用来合成表1中1-4和10-18化合物的取代苯酚由Aldrich Chemical Co.(美国威斯康辛)出售。从4-氯-3，5-二硝基苯甲酸(Aldrich)制备4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯，Ullmann F，1909，“die 4-chlor-3，5-dinitrobenzoesaure”，Annalen der Chemie 36：92-93。
9.1一般合成
使每个取代苯酚(作为它的苯酚酸钾盐)与4-氯-3，5-二硝基苯甲酸甲酯反应得到3，5-二硝基-4-(取代苯氧基)苯甲酸甲酯，然后还原成相应的3，5-二胺，并通过Sandmeyer反应转化为目标的3，5-二碘化合物。Kun等，1996，“通过DIME使肿瘤凋亡(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3，5-diiodo-4-(4’methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”，文摘号102，Int.J.Oncol.9：补充829。一般来说，还原是催化氢化，但对于R1或R3是卤原子(化合物12和14)的情况，还原通过在乙酸/乙醇中的铁粉进行，以避免脱卤化。Kun等，1996，“通过DIME使肿瘤凋亡(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3，5-diiodo-4-(4’methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”，文摘号102，Int.J.Oncol.9：补充829。纯化通常通过制备型薄层层析和结晶来进行。对于表7中R2不是甲氧基的化合物(化合物5-9)，用另外的合成反应。化合物6通过化合物1的碱水解来制备。Borrows等，1949，“甲状腺素和相关物质的合成部分I。制备酪氨酸和它的衍生物和用新方法得到甲状腺素(The Synthesis of Thyroxine and Related Substances.Part I.The preparation of Tyrosine and Some of its Derivatives，and a New Route tothyroxine”J.Chem.Soc.补充颁布号1：S185-S190。通过使Borrows等，1949，“甲状腺素和相关物质的合成部分I。制备酪氨酸和它的衍生物和用新方法得到甲状腺素(The Synthesis of Thyroxine and Related Substances.Part I.Thepreparation of Tyrosine and Some of its Derivatives，and a New Route to thyroxine”J.Chem.Soc.补充颁布号1：S185-S190。所述的化合物6的酰氯依次与无水乙醇、甲胺和二甲胺反应可制备化合物5、8和9。Kun等，1996，“通过DIME使肿瘤消散(Induction of Tumor Apotosis by methyl-3，5-diiodo-4-(4’methoxyphenoxy)benzoate(DIME)”，文摘号102，Int.J.Oncol.9：补充829。通过使1与氨在无水甲醇中反应可得到化合物7。所有化合物由熔点和高分辨的质谱定出特征(表7)，已知的羧酸6除外。对化合物1-14测量1H NMR光谱，所有的结果都是令人满意的。
表7
Figure C9719697900331
化合物序号      R1       R2        R3       R4       M.P.℃       分子式             计算值        测定值
1               CH3O    CH30     H        H        153-155      C15H12I2O4    509.882513    509.882960
2               EtO      CH30     H        H        123-125      C16H14I2O4    523.898163    523.898737
3               n-PrO    CH30     H        H        114-116      C17H16I2O4    537.913813    537.914014
4               n-BuO    CH30     H        H        82-84        C18H18I2O4    551.929463    551.930000
5               CH3O    EtO       H        H        96-98        C16H14I2O4    523.898163    523.898202
6               CH3O    HO        H        H        233-235      C14H10I2O4        a
7               CH3O    H2N      H        H        207-209      C14H11I2NO3   494.882847    494.881880
8               CH3O   (CH3)HN   H        H        181-183      C15H13I2NO3   508.898497    508.898971
9               CH3O   (CH3)2N  H        H        162-164      C16H15I2NO3   522.914148    522.914364
10              CH3O    H          H        H        204-dec      C14H10I2O4    495.966963    495.867453
11              CH3O    H          H        H        142-144      C14H10I2O3    479.871948    479.872553
12              CH3O    H          H        H        139-141      C14H9I3O3     605.768600    605.767839
13              CH3O    H         CH3O     H        123-125      C15H12I2O4    509.882513    509.882387
14              CH3O    CH3O     Cl        H        132-134      C15H11ClI2O4  543.843541    543.843424
15              CH3O    CH3O     H         CH3O    189-192      C16H14I2O3    539.893078    539.893930
16              CH3O    H         H         H         116-119      C16H14I2O3    507.903248    507.903425
17              CH3O    H         H         H         125-128      C15H12I2O3    493.887598    493.886936
18              CF3O    CH3O     H         H         94-97        C15H9F3I2O4 563.854248    563.855633
元素分析以前Borrows等在J.Chem.Soc.1949，S185-S190中有报告。
9.2化合物1的合成
化合物1(DIME，熔点153-155℃)的合成根据以前Borrows等1949“甲状腺素和相关物质的合成。部分I。酪氨酸和它的部分衍生物的制备，和得到甲状腺素的新途径”J.Chem.Soc.颁布号：1：S185-S190所述方法进行。基础的光谱测定如下(以前未对该化合物进行报道)。乙醇中的紫外吸收光谱τmax(ε)为289nm(4.20×103)，232nm(3.08×104)，213nm(2.48×104)。质谱：FAB，m/z(相对强度)：510(M+，100)，479(4.5)，384(4.5)。M+峰的高分辨率数据：C15H12I2O4的计算值为509.882513；测定值为509.882960(偏差为-0.9ppm)。DMSO-d6中的1H NMR谱(相对于TMS的δ(ppm)值)：3.719(3H，单峰)，3.876(3H，单峰)，6.693(2H，双峰，J＝9.45Hz，细分裂)，6.845(2H，双峰，H＝9.36Hz，细分裂)，8.390(2H，单峰)。
9.3化合物7的合成
化合物7(3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酰胺)通过在室温下将氨气吹入无水甲醇(60m1)中的化合物1(100mg，0.196mmole)5分钟来制得。在用塞子塞住的烧瓶里静置1小时后，再次用氨气处理混合物，然后使混合物在用塞子塞住的烧瓶里静置48小时。旋转蒸发除去甲醇/氨，将干燥的残留物溶于温热的甲醇：水(7∶3v/v)(30毫升)，在冰箱(3℃)里结晶。得率：58.3毫克(60％)浅黄色晶体。熔点：207-209℃。质谱(FAB)：M+峰的高分辨数据：C14H11I2NO3的计算值：494.882847；测定值，494.881880(偏差＝2.0ppm)。1H NMR光谱，DMSO-d6中(相对于TMS的δ(ppm)值)：3.716(3H，单峰)，6.682(2H，双峰，J＝8.93Hz细分裂)，6.895(2H，双峰，J＝8.99Hz，细分裂)，7.528(1H，单峰)，8.113(1H，单峰)，8.402(2H，单峰)。
9.4细胞培养
根据Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理来修饰与生长相关的酶途径和Ras-转移牛上皮细胞系肿瘤生长减少(Modification of Growth Related Enzymatic Pathways and Apparent Loss ofTomorigenicity of Ras-Transformed Bovine Endothelial Cell Line by Treatment with5-Iodo-6-Amino-1，2-Benzopyrone(INH2BP))”国际肿瘤学杂志(Intl J.Oncol)8：239-252中所述的方法培育E-ras 20细胞；HT 144(黑素瘤)、DU 145(前列腺癌)、HeLa(子宫颈癌)、HL 60(前髓细胞白血病)、MDA-MD-231(乳房癌)、SK-Br-3(乳房癌)、T47D(管乳房癌)、A559(肺癌)细胞购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)，并在指定的培养基中培育。以2×104细胞/cm2的起始细胞密度来测试培养物中DIME的效果，在加入药物72小时后，在血细胞计数器中胰蛋白酶消化后直接进行细胞计数，测定DIME对细胞生长的作用(通过锥虫蓝排斥来鉴别完整的细胞)进行比较。
9.5E-ras20细胞的肿瘤生长作用
如前所述，测定E-RAS20细胞在无胸腺的裸鼠中的致肿瘤性。Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理来修饰与生长相关的酶途径和Ras-转移牛上皮细胞系肿瘤生长减少”国际肿瘤学杂志8：239-252。如同肿瘤生长测定中那样，在接种了106MDA-MB-231细胞的无胸腺的小鼠中测定DIME在体内抗肿瘤生长的作用。在约10-14天后，当皮下肿瘤出现时，开始进行DIME悬浮剂口服给药治疗(一天一次)，并持续28-32天(如Kun等，1996，″用3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使肿瘤凋亡″，摘要号102， Int.J.Oncol.9：增刊829中所述)。
9.6菌落形成的定量测定
菌落形成的定量测定如Vidair等，1986“细胞间Na+，K+，Ca2+和Mg2+在高温杀死细胞中的作用的评价” Radiation Res.105：187-200所述那样进行。
9.7DIME-琼脂糖凝胶亲和柱
用水洗涤EAH-琼脂糖凝胶(Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)(2.0g，湿型)，将溶剂交换成60％DMF(水性)。将湿饼重新悬浮在含有DIME羧酸衍生物(化合物6)(60mg)的60％DMF(1.0ml)和10倍量的N，N′二环己基碳二亚胺(Sigma)中，在室温下轻微转动悬浮液16小时。然后在烧结玻璃滤器上收集琼脂糖凝胶颗粒，随后用DMF、二噁烷、DMF、DMF水溶液(66％、50％和33％)以及水洗涤。根据取代的珠粒的紫外吸收谱，DIME-基团的含量范围为每毫升湿饼中有1-2μmol。
9.8[14C]-DIME的代谢
(a)将每份小鼠组织匀浆物(大脑、肾、肝、肺)与含有20μM[14C]-DIME(10.55mCi/mmol)的1.0ml MES缓冲液(100mM pH6.5)合并，组织匀浆物中包括1.0ml匀浆缓冲液(50mM Tris(pH7.4)，400mM NaCl，10mM MgCl2，1mM EDTA，0.5％NP-40，0.5mM PMSF)中的0.2g组织，使混合物在37℃下培育4小时。然后在每个试管中依次加入乙酸乙酯(1.5ml)、硫酸铵(900mg)和60％高氯酸(160μl)，每次加入后均进行涡流搅拌。静止10分钟，用台式离心促进相分离。弃去上层(乙酸乙酯)，下层水性和中间相物质用第二部分乙酸乙酯(1.5ml)萃取。合并的乙酸乙酯萃取物含有原始培育物中总cpm(约4×105cpm)的90％以上。用N2气流将萃取物蒸干，各残余物用乙酸乙酯(100μl)吸收，并等份(10μl)加在分析用硅胶TLC平板(Whatman PE SIL G/UV可移动平板，厚250μm，10cm×20cm)，用正己烷/乙酸乙酯/乙醇(v∶v∶v＝3∶1∶0.8)展开。通过放射自显影可以看到包括作为参比标准的[14C]-DIME在内的分析物条带。平板上其它的参比标准(非放射性的DIME及其羧酸同系物)在紫外光下可以看到。(b)[14C]-DIME在培育中细胞中的代谢：细胞与[14C]-DIME一起培育(每个测试中有2-5×106个)，然后如(a)中所述进行匀浆，测定代谢物。
9.9DIME的胞间浓度
使9.6cm2孔(3ml培养基)中的单层培养物暴露于[14C]-DIME(10.55mCi/mmol)24小时，然后用含有未标记的DIME的1ml培养基洗涤7次。将细胞溶解在1ml的4％Na2CO3，和0.2M NaOH中，用闪烁计数测定放射性。通过血细胞容量计和细胞计数测定用未标记DIME处理的平行孔中的细胞体积。
9.10DNA切割产物的测定
根据测定试剂盒生产商(Boehinger Mannheim，Indianapolis，IN，USA，Cat No.168-4817)的说明，通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)反应来测定作为凋亡信号的DNA切割产物。
9.11结果
羧基-酯酶抑制剂二[对-硝基苯]磷酸酯(BNPP)(Heymann等，1968，″羧基-酯酶抑制剂二[对-硝基苯]磷酸酯抑制小鼠中非那西汀和乙酰苯胺诱导的正铁血红蛋白症″，Biochem.Pharmacol.18：801-811)购自Sigma。
DIME及其同源物和类似物的结构专一性可以通过测定表7和表8来测得。我们已经制备了17种具有新结构的DIME类似物，并比较了化合物中的10个的抗肿瘤活性(表8)，结果显示出足以获得一些大致的结论。选用的生物测定方法是测定药物对裸鼠中E-ras细胞的体内致肿瘤性的抗肿瘤发生作用(Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理来修饰与生长相关的酶途径和使Ras-转移牛上皮细胞系肿瘤生长明显减少”国际肿瘤学杂志8：239-252)。用10μM DIME或类似物培育E-ras20细胞(105或106)4天，然后将105和106个细胞皮下接种到裸鼠(每个测试5只)中，通过直接测定肿瘤体积来测定肿瘤形成的速度(cf.2)。如DIME本身所示(图4)，肿瘤形成完全消除。对9种DIME类似物进行相同的抗肿瘤发生试验，以DIME的效果计为100％(比较25天时的肿瘤大小)，抗肿瘤效率计算成DIME活性的百分数。应当注意，E-ras20细胞对于DIME不如人肿瘤那样敏感，因此，这些结果只能作为比较DIME类似物的一个根据。表8中归纳的结果描述了R1和R2中的取代基决定了抗肿瘤效率。这一效果在比较R1中R1CH3O，EtO，n-Pro，nBuO时是特别明显的，这说明，侧链参数(而不是“甲状腺素样”核心结构本身的结合)赋予了药学专一性。
该结论通过DIME琼脂糖凝胶亲和柱的初级蛋白结合研究得以证明。在该亲和柱中，DIME与R2骨架共价连接，因此该DIME衍生物的破坏肿瘤作用明显低于DIME(与表8中的结果类似)，(参见Kun等，美国专利申请No.08/655,267，1996年6月4日提交，“用没有明显激素活性的甲状腺毒素类似物治疗恶性肿瘤的方法”，该申请公开的内容纳入本文作参考)。但是细胞抽提物渗滤通过该柱会使蛋白质与亲和性骨架结合；其中一种被吸收的蛋白质被确认为是微管蛋白。DIME的蛋白结合通过前述的着丝粒(centricon)方法来测定(Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理来修饰与生长相关的酶途径和使Ras-转移牛上皮细胞洗肿瘤生长减少”国际肿瘤学杂志8：239-252)。根据Scatchard作图计算，在细胞抽提物中有蛋白质(甚至是BSA)存在时，可获得109-1010的KD值，这表示DIME与各种蛋白间有可能为疏水缔合。根据DIME-琼脂糖凝胶亲和柱的结果，我们将这种结合归为DIME“核心”结构的作用。
                      表8
E-ras 20致肿瘤性的抑制：DIME以及一些结构类似物的效率
化合物编号                               效率(％)
1                                        100
2                                        93
5                                        83
9                                        64
7                                        53
6                                        45
3                                        44
8                                        22
10                                       14
4                                        4
测定25天时肿瘤减少的大小，将DIME类似物对E-ras20细胞在无胸腺的小鼠体内致肿瘤性的药效与DIME(化合物1，视为100)作比较。DIME或其类似物(表7)的预处理是在皮下(s.c.)接种前用10μm处理4天，a如表7中所指定的。
从表8可以推出DIME类似物的相对活性，然而本试验主要侧重于DIME本身的细胞杀死作用，以确定适用于更详细地分析DIME类似物的实验系统。将DIME(图1)抗肿瘤发生作用延伸到体内条件，通过对裸鼠给予DIME(每日0.25-1.0g/kg的口服剂量)会在25-35天内产生70-85％的肿瘤消退(Kun等，1996，″用甲基-3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使肿瘤凋亡″，摘要号102， Int.J.Oncol.9：增刊829)。由于下述一些可能存在的原因，这些大剂量没有产生显著的毒性。由于0.25g/kg和1.0g/kgDIME有相同的抗肿瘤效果，因此，剂量应答的对应关系不明显。这种似是而非的结论可通过药物被选择性吸收入体内肿瘤细胞来解释。
在本研究中，我们侧重于显微分析细胞杀死的方法。如图5所述的，在10天内，MDA-MB-231细胞的菌落形成能力被浓度为1-2μM的DIME大幅度降低。当在与细胞培育8小时的终止前除去DIME时，细胞杀死受到抑制，药物诱导的形态改变完全被逆转。在用1-10μM DIME预培育后，重新平板培养洗至不含DIME的细胞8小时会使正常的细胞生长和复制重新开始。在药物处理8小时后产生导致细胞死亡的不可逆途径的关键因素还未知道，它有待于进一步的研究。然而，一个容易检测到的由于DIME而诱导最终细胞死亡的因素是如图6所示的药物浓度-依赖型DNA的断裂。
DIME的一个显著的性质是其对体内肿瘤有明显的选择性。我们进行了药物代谢和细胞吸收DIME的试验，以进一步表征这一性质。在前述条件下(Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理来修饰与生长相关的酶途径和使Ras-转移牛上皮细胞洗肿瘤生长减少”国际肿瘤学杂志8：239-252)，使细胞与[14DIME一起培育，结果使得细胞吸收的药物不能用含有非放射性DIME(与培育时胞外浓度相同)的PBS洗涤脱离细胞(cf.2)。细胞(如MADA-MP-231)中的药物吸收速度非常高的与DIME敏感性较低的细胞相比，这些细胞最容易被杀死(表9)。我们研制出一种正常肾细胞(CV-l细胞)的转化表型，这种表型表现出没有接触抑制，并有迅速的增倍时间(12小时，而非转化表型为54小时)。如表9中所示的，肿瘤发生的转化细胞通常比未转化细胞(CV-1)或对DIME杀死的敏感性较差的细胞(如E-ras 20)更容易吸收DIME。已建立的细胞系已经经受了不灭危险期(immortality crisis)，因此，生理上不严格操作的细胞、我们的药物吸收结果以及体内明显缺少DIME毒性均表明，完整的动物的正常细胞不会吸收或只吸收很少的DIME。另一方面，正常小鼠器官的匀浆物使DIME有活性代谢(脱酯化)(如表10所述)。“DIME酯酶”活性的最高速度发生在大脑匀浆物中。
                          表9
                        DIME的吸收
细胞类型                胞外DIMEa，b               胞内DIME
E-ras2-(24小时)             10                   105±20(n＝4)
MDA-MB-231(24小时)          2                    120±15(n＝4)
CV-1(24小时)                2                    25±4，(n＝3)
CV-1-转化细胞(24小时)       2                    66+6，(n＝3)
四种细胞类型在培育24小时(见方法)后的DIME细胞浓度。aμM；bDIME的浓度选择成引起100％的生长抑制，留下20-50×104连接细胞/cm2。
                               表10
  在各种组织匀浆物中用酯酶将DIME切割成其羧酸a
组织                   [14C]-DIMEb            [14C]-酸a，b
大脑                   14.9(305,000cpm)         3.6(73,800cpm)
                       17.1(350,000cpm)         2.0(41,250cpm)
肝                     186.(381,000cpm)         1.4(27,900cpm)
肺                     19.4(396,000cpm)         1.0(20,500cpm)
a表7中的化合物6。b用nmol表示，用薄层层析分离，从在37℃在2.0ml匀浆物中培育4小时的20.0mol[14C]-DIME开始。cpm值的偏差为±2％，[14C]-DIME的比放射活性为20,470cpm/nmol。
人肺肿瘤细胞(A-549)的试验也证明了DIME的药物代谢和杀肿瘤细胞作用的相互关系。如图4所示，A-549细胞很容易切割DIME中的酯键(R2)，而用二(对-硝基苯)磷酸酯(Heymann，1968，″羧基-酯酶抑制剂二[对-硝基苯]磷酸酯抑制小鼠中非那西汀和乙酰苯胺诱导的正铁血红蛋白症″，Biochem.Pharmacol.18：801-811)会使DIME对A-549细胞有更多的细胞杀死效果(从图V可以看出)。表11中归纳了DIME对各种癌细胞的抑制细胞生长作用(以3天内使50％细胞停止生长的DIME浓度表示)的比较。图6中显示了最终浓度为0.5，1.0和2.0μM的DIME对MDA-MB-231的作用的时间曲线。
                   表11
         DIME对各种人癌细胞系的作用
细胞系                               I50，μM(第3天)
E-ras20                              1.0
LHT 144(黑素瘤)                      0.5
DU 145(前列腺癌)                     0.5
HeLA(子宫颈癌)                       0.6
HI 60(前髓细胞白血病)                0.4
MDA-MD-231(乳房癌)                   0.4
SK-Br-3(乳房癌)                      0.6
T470(管乳房癌)                       0.7
对于DIME暴露试验，以2×104细胞/cm2的密度将细胞接种入2cm2孔中。在接种时加入各种浓度的DIME。然后培育细胞培养物3天(37℃，5％，CO2气氛中)。
DIME是一种独特的杀肿瘤细胞分子，因为除了对完整动物中生长的肿瘤细胞外，它没有宏观可观察到的体内毒性，通过药物吸收测定可以明显看出，对DIME细胞杀死作用敏感的那些细胞会最易亲和该药物。DIME也不同程度地抑制了培养物中生长的非癌细胞的复制(未显示)，然而药物并未表现出有体内毒性。因此，细胞培养物中细胞对DIME的渗透性与体内细胞的功能不同。这种明显的肿瘤专一性的原因主要取决于培养物中生长的细胞和动物组织中生长的细胞的一些细胞膜性能(还未知)间的差异，这有待进一步的研究。这种细胞培养物中生长的细胞以及体内调控的细胞(肿瘤细胞和非肿瘤细胞)间对DIME的明显的渗透性差异不会抑制肿瘤细胞的体内生长(Kun等，1996，″用甲基-3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使肿瘤凋亡″，摘要号102， Int.J.Oncol.9：增刊829)，因为体内的肿瘤细胞已被进入的DIME杀死(Kun等，1996，″用甲基-3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)使肿瘤凋亡″，摘要号102，Int.J.Oncol.9：增刊829)。体内给予的DIME剂量(0.25-1.0g/kg)大大超过了细胞培养物获得的胞外杀肿瘤细胞浓度(0.5-2.0μM)，说明肿瘤细胞在体内会吸收少部分的给予体内的DIME，而体内生长的肿瘤细胞看上去保留了与细胞培养物对DSME相同的灵敏性，即培养物中和体内的肿瘤细胞有相似的药物吸收。体内肿瘤细胞膜与细胞培养中生长的细胞系的相似之处看来是肿瘤细胞的一个新的习性，这还需要进一步的分析。除了肿瘤中对DIME渗透有明显的体内选择性外，肿瘤细胞与通常没有可检测DIME酯酶活性(未显示)的正常细胞不同(除了A-549细胞(肺癌)外)。对这些细胞的研究(图4，5)明显说明，DIME本身而不是其酯酶产生的代谢物是杀肿瘤细胞的分子。从表8可以看出，DIME的甲酯基团(R2)被更长的乙酯或酰胺基团代替后仍能使某些DIME类似物对E-ras 20细胞有相当的抗肿瘤效率。在这个研究中，只对DIME进行了相当详细地分析，但各种“活性”DIME类似物也值得进一步的注意，因为它们可能还有被用于其它化学治疗用途的细胞和体内效果。关于DIME及其类似物中的碘原子，这些庞大的原子无疑会在两个苯环间形成构象限制，并且同时可能是细胞渗透中的关键决定因素。
实施例10：DIME对细胞和核形态的作用
下面提供了关于用甲状腺素类似物治疗广泛癌症的更广概念的其它证据。我们已经报道了DIME是一种诱导细胞培养物中和体内的肿瘤细胞死亡的强诱导剂。选择性杀肿瘤细胞作用最能通过该药物选择性渗透进入体内肿瘤细胞来加以解释(Mendeleyev等，1997，″-3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)的结构特异性和杀肿瘤细胞作用″， Intl.J.Oncol.，在出版)。如这里所描述的，将肿瘤细胞暴露在1-4DIME下会导致细胞学的改变和有丝分裂阻断，这暗示有几个DIME作用的生化位点参与。重要的是，在分析生化水平位点前首先要用细胞计数法确定DIME的细胞作用方式。本实施例涉及有丝分裂时DIME对细胞与核的形态和发展的作用。
10.1显微形态
E-ras细胞的显微形态用早先报道的技术(Mendeleyev等，1997，″甲基-3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)的结构特异性和杀肿瘤细胞作用″，Intl.J.Oncol.，在出版；Bauer等，1996，“通过用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)处理来修饰与生长相关的酶途径和使Ras-转移牛上皮细胞洗肿瘤生长减少”)来进行测定。
10.2中期显象(M Phase Visualization)的制备
从ATCC(Rockville，MD，USA)购得MDA-MB-231细胞，细胞培育在37℃、T-75摇瓶中补充有10％FCS的基本必需培养基α(Minimum Essential Medial-α)内。在收集中期-阻断细胞和制备细胞涂布物(spread)前，在培养物中加入0.1μg/ml秋水仙酰胺(不加入DIME)培养4小时，作为对照。DIME和秋水仙酰胺在中期细胞周期阻断方面的效果是不可区别的，因此在测试DIME对中期涂布物的效果时，不加入秋水仙酰胺。从0.025％胰蛋白酶消化5分钟的T-75胰蛋白酶消化物中分离获得细胞107，离心沉淀，重新悬浮并保持在37℃、10ml 75mM KCl中10分钟，重新沉淀，用10ml甲醇-乙酸固定，连续更换甲醇-乙酸四次。将等份的最终细胞悬液(100μl)滴在乙醇-清洗的载玻片上，用空气干燥。
10.3原位杂交
人染色体专一性探针由ONCOR(Gaithersburg，MD，USA)生产。用Pinkel等(1986，″用定量高灵敏度荧光杂交的细胞遗传分析″， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2934-2938)描述的方法的改进方案进行杂交。用胃蛋白酶(0.01N HCl中20μg/ml)在37℃处理载玻片固定的细胞10分钟，然后依次在70％、85％和100％的乙醇中脱水，浸入70％甲酰胺，然后是70℃、2X标准盐水柠檬酸(IX SSC是0.5MNaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)中2分钟，使DNA变性，并如上所述在乙醇中脱水。总体积为10μl的杂交混合物包括50％甲酰胺IX SSC、10％右旋酶酐硫酸盐、0.5μg鲱精子DNA和1-5μg蛋白酶K处理过的人胎盘DNA。预先将鲱精子DNA和人胎盘DNA超声处理成200-600bp片段，加入约40ng核苷酸的异羟基详地黄毒苷化的探针DNA(在70℃下变性5分钟)，在37℃下培育1小时。将该混合物加到含有固定细胞的载玻片上，密封在盖玻片下，在37℃下培育2-3天。在杂交完成后，在45℃下用50％甲酰胺，2X SSC，pH7.0洗涤三次(3×5分钟)，在PN缓冲液中(包括0.1M NaH2PO4和0.1M NaHPO4，0.1％Nonidet P-40pH8.0)在45℃下洗涤两次，然后用在PNM缓冲液(在离心除去固体后，是含有0.02％叠氮钠的5％无脂干牛奶)中的5μg/ml抗异羟基洋地黄毒苷FITC、2μg/ml兔抗羊FITC(Boehringer Mannheim)在室温下处理20分钟，在每次培育后各用PN缓冲液洗涤两次各3分钟，用抗褪色溶液(Vector Labs，Burlingame，CA，USA)中的0.4μM D API(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)对DNA染色。在装有多条带通过过滤器的蔡斯荧光显微镜(Chroma Technology，Brattleboro，VT，USA)上观察载玻片，测定每个核细胞的FISH信号前数。
10.4时间推移(time-lapse)的可视显微法(videomicroscopy)
将密封在T-25组织培养摇瓶中的细胞放在温度控制的培育室单元中，以使倒转的相对比显微镜封闭。培育室与环境房间光线隔绝。每5分钟，打开显微镜光12秒，在该时间内用购自Compix，Inc.(Mars，PA，USA)的作图系统捕捉图象。用相同公司的软件分析图象顺序。
10.5流式细胞计数
使受不同处理作用的细胞生长至铺满，用胰蛋白酶消化，用磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗涤。对于核分析，将细胞固定在Vindelov柠檬酸盐细胞缓冲液(1000ml溶液中有蔗糖250mM，柠檬酸三钠二水合物40mM，DMSO 50ml，pH7.6)中。从血液中获得的正常人淋巴细胞用作对照。用血细胞计数器对每个细胞样品和对照计数，将细胞浓度调节到2×106细胞/毫升。总体积2ml中有每个细胞系的2百万个细胞用新鲜的PBS洗涤两次，在37℃下用200μg/ml RNA酶处理30分钟，并用10μg/ml丙基碘鎓(propidium iodide)染色45分钟。流式细胞计数分析在装有空气冷却、调至488nm的亚弧激光的FACScan台式流式细胞计数器(Becton-Dickinson，San Jose，CA，USA)上进行。收集两万个结果作为6个参数列表方式数据，以便进行分析和档案保存。在1024个数据通道分辨率下，得到两个光散射参数(正向和侧向)，在576/26nm和620nm上方测得的丙基碘鎓荧光，以及荧光脉冲宽度和面积的双重辨别。获取数据设定在通道100上方的丙基碘鎓正性结果。控制阀门以排斥小的碎片，在获取后获得大的团块和细胞双联体。
10.6免疫细胞化学
将细胞固定在-20℃的甲醇中5分钟。初级抗体是小鼠单克隆抗β微管蛋白(Amersham)，次级抗体来自山羊，其与来自Cappel的荧光素异硫氰酸酯(Durham，NC，USA)结合。细胞核的DNA通过在0.05μg/ml 4′-6-二酰胺(diamidono)-2-苯基吲哚(DAPI)中培育10分钟来染色。染色的细胞可用蔡斯40xPlan-Neofluar或Nikon60xPlanApo目镜来观察。对于有丝分裂期间的细胞分类，分裂前期和分裂中期合并成一类，因为很难区分前期后阶段与中期。
10.7结果
图10中描述了4μM DIME在与E-ras20细胞一起培育18-24小时后对细胞形态的影响。肿瘤细胞增大，尤其在300倍放大倍数下可见，并出现许多微核。进一步研究这些细胞变化的特征。在MDA-MB 231人乳房癌细胞核上进行流式细胞计数分析(图11)，结果证明通过受药物作用18小时，有DNA G2含量的核累积，暗示有中期阻断。
上述观察结果鼓励我们测定受DIME作用的细胞中进入有丝分裂的动力学。使细胞在含有IμM DIME的培养基中培育，然后进行材料和方法部分中所述的时间推移的可视显微测定。图12示出的图表示有丝分裂延迟13小时并不规则地分裂成6个子细胞。相反，对照细胞中有丝分裂只延迟约0.5小时(见图13)，并且总是分裂成2个子细胞(数据未列出)。
时间推移的可视显微法也能使我们监测上述不规则细胞分裂获得的子细胞的命运。在1μM DIME存在下，观察到有20％的有丝分裂产生了融合的子细胞(表12)，它们通常形成如图10所示类型的多核大细胞。对照细胞没有表现出在这种分裂后有融合。
                                   表12
                         DIME诱导子细胞在有丝分裂后融合
                 监测的有丝分裂数目a        其后有子细胞融合的有丝分裂数目b
1.0μM DIME              35                                  7
对照                     32                                  0
a有丝分裂通过细胞连续受DIME作用期间的时间推移可视显微法来监测；
b子细胞的融合通常在细胞分裂后几分钟内发生，融合涉及2-5个子细胞。
测定在1μM DIME存在下发生的细胞分裂，以定量地评价每次有丝分裂获得的子细胞数目(图14)。每次有丝分裂的子细胞数在1-6之间。在对照细胞中，细胞总是(33/33)分裂成两个子细胞。因此，这里描述的药物诱导的有丝分裂长期延迟之后将是高度异常的细胞分裂。
图15显示了培育在1μM DIME中的细胞和对照细胞进入有丝分裂的比例，曲线几乎是重合的，这说明DIME不影响细胞经历分裂间期的速度。相反，药物使有丝分裂所费的平均时间提高了20多倍(图13)。通过它们缩合和增大的染色质(图16)和异常的有丝分裂纺锤体(图17)，可以确认受DIME阻断的圆形细胞的确处于有丝分裂期间。
用对染色体1、2、7、11和19有专一性的探针进行中期细胞核原位杂交的染色体分析。它们都产生了相似的结果，因此只对染色体19进行描述。图16A、B和C中显示了染色体19的典型结果。在所有例子中均采用MDA-MB-231(人乳房癌)细胞。图16A显示了染色体19的原位杂交。受1μM DIME作用18小时没有可检测的效果，因此图16A和16B均代表了对照和药物处理的细胞。图16B是DNA染色(DAPI)，其描述了DNA染色与染色质重合，而图16A是对染色体19进行染色。然而，细胞暴露在药物(1μM DIME)作用下5天将诱导一些细胞中期染色质大量积累，有约40条染色体19的信号，约100条染色体(图16C)。不能获得染色体断裂的任何证据，即使该药物处理最终将杀死细胞(Mendeleyev等，1997，″3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯(DIME)的结构特异性和杀肿瘤细胞作用″， Intl.J.Oncol.，10：689-695)。
图17显示了暴露于1μM DIME18小时后有丝分裂纺锤体的结构。图17A是未经药物处理的MDA-MB-231癌症细胞里小管染色的(tubulin-stained)有丝分裂的纺锤体。图17B显示了经18小时暴露于药物后对异常小管分布进行撞击，这些多中心结构在暴露于1μM DIME达5天后变得更为厉害(图17C)。小管的细胞多中心分布(图17B和17C)类似于体外加入中心体后小管的核化，如Mitchison等，1984，“通过分离中心体使微管组合核化(Microtubule Assembly Nucleated byIsolated Centrosomes)”Nature 312：232-237。但是，我们不能通过免疫荧光检测到异常中心体的数目(数据未显示)，这样18小时DIME(1μM)处理后使小管明显多中心核化可能不直接与中心体有关。这些图没有显示是否1μM DIME诱导小管去聚合或抑制再聚合。
在初步研究(资料未显示)中，我们已经通过免疫细胞技术研究了某些与纺锤体相关的蛋白质。Cdc-2激酶在没有1μM DIME时与纺锤体无关，但在细胞暴露于药物达18小时后，它能诱导cdc-2-激酶-纺锤体连接。药物处理不改变对中心体蛋白中心体粒周围(pericentrin)由抗血清的染色换式，因为只见到两个焦点(foci)。细胞周期蛋白(Cyclin)B-微管-纺锤体相关物也没有改变。但是，诱导纺锤体磁极中心组织异常的药物仍与细胞周期蛋白B结合。蛋白磷酸酯酶2a(pp2a)-纺锤体相关物相同于中心体粒周围蛋白(pericentrin)或细胞周期蛋白B，它不为药物处理(1μM处理18小时)所影响。
这些例举性研究包含了进一步研究细胞生物学的基础。在初步实验中也试验了磷酸酯酶在蛋白质-纺锤体相关物里可能的作用。暴露于100nM细胞外加入的okadaic酸达18小时仅消灭了cdc-2激酶和pp2a-纺锤体相关物，这表明涉及了蛋白质磷酸酯酶(数据未显示)。
这些结果似乎与早先的1μM DIME的作用有区别，后者在暴露于药物达18-24小时里发生，后面的结果是药物处理5天后可见到形成的染色体数目。但是，可能后者仅反应了由DIME与特定细胞位点结合引发的细胞反应的一系列结果。早期包括明显的细胞学改变，特别是大的多核细胞的外观改变。人们公知在辐照损伤后会形成微核，在后期由于缺少着丝点和微管纺锤体连接，而使无中心的染色体片段不能进行核聚集以极化，Bedford，J.S.，1991，“暴露于离子化辐照的哺乳动物细胞中的亚损伤、潜在的致命损伤和染色体畸变”J.Radiation Oncol.Biol.Phys.21：1457-1469。时间推移研究显示，硫酸长春花碱也诱发中期阻滞的多核细胞，Kirshan，1968，“Time Lapse and Ultrastructure Studies on the Reversal ofMitotic Arrest Induces by Vinblastine Sulfate in Earl’s L cells”J.Natl.CancerInstitute 41：581-595，这里显示了结果(图10)，除了长春花属生物碱对动物显示出严重的毒性作用外，DIME没有毒性。蛋白质磷酸酯酶2a(pp2a)也诱导多核化的表述，Wera等，1995，“Deregulation of Transitional Control of the 65kDaRegulatory Subunit(PR65 Alpha)of Protein phosphatase 2A leads to MultinucleatedCells”J.Biol.Chem.270：21374-21381，很清楚地表明该复杂过程(多核化)的发展机制可能涉及许多可能相关的酶活性。这些结果显示pp2a在DIME细胞(1.c.1)里的活化，可能是由于DIME对该酶的直接作用。DIME对各种细胞酶的作用模式细节在各自生化报告里已作报道。
最容易观察到的由DIME诱导的细胞现象之一是DIME对中期(M相)的阻滞(图11和13)，与colcemid或特别与长春花属生物碱极为类似，它可被DIME代替。如与染色体1、2、7、11和19的DNA-荧光杂交所示，由于细胞不能分裂造成了染色体的积聚，使DIME有滞后效应(5-天)。DIME对DNA没有明显的直接作用。在双链DNA中的内切物(图12)，Mendeleyev等，1997，“DIME的结构特异性和杀肿瘤作用”Int.J.Oncology 10：689-695，是DIME与癌症细胞相互作用的结果，最能反映DNA核酸细胞内切酶的上调作用，它们在DIME处理的细胞里通过聚(ADP-核糖)糖水解酶的间接作用进行去-聚-ADP-核糖化(de-poly-ADP-ribosylated)(参考文献1的脚注1)。核酸细胞内切酶活化不仅仅是DIME导致生长中细胞死亡的单个原因，因为已知细胞的分化机制会导致凋亡，Wertz等，1996，“Diverse Molecular Provocation of Programmed Cell Death”TIBS 21：359-364。在DIME处理的细胞中出现异常染色体纺锤体表示DIME对小管系统初始的细胞作用，已知这在细胞分裂中起关键的作用，Murray等，1993，“TheCell Cycle：an Introduction.”，Oxford University Press，美国纽约。
由于DIME是“激素样失活的”甲状腺激素类似物，那么出现了一个有趣的问题，甲状腺激素的代谢前体(或分解物)在保持生理差异上，作为“抗恶性肿瘤”读出调节剂是否起了作用。对甲状腺素代谢物的杀肿瘤作用的研究作了肯定的回答。
实施例11：对小管聚合作用的影响
在下列实验中，激素样失活的甲状腺素类似物DIME以1-5μM的浓度抑制了MTP的依赖GTP的聚合，这由光学试验测定。该抑制作用严格地依赖于GTP浓度。在MTP聚合为线性速率，然后发生Michaelis-Menten动力学和抑制为“混合”类型，其中GTP的km和U最大可同时改变的情况下，DIME和GTP的浓度之间是相关的。DIME的化学类似物在与它们体内抗肿瘤作用的同时也抑制了MTP聚合。MTP位点是对DIME早期细胞反应的位点之一。
将人体乳房癌症细胞(MDA-MB-231)暴露于1μM DIME，在药物处理18小时里诱发异常的纺锤体结构，这样推定的DIME-微管-蛋白质(MTP)相互作用似乎是早期细胞对药物反应的一个组成，Zhen等，1997，“Cellular Analysis of themode of action of methyl-3，5-diiodo-4-(4’-methoxyphenoxy)benzoate(DIME)ontumor cells”Intl..J.Oncol.。异常的纺锤体结构是DIME-MTP相互作用或DIME与微管的器官中心的组成反应或与接着得到的或同时的目前尚未定义的系统反应的结果。由于，原位对依赖时间的MTP系统的定量分析不适合于最初的速度测量，现将神经小管的体外部件系统作为DIME与MTP相互作用的定量分析模式。由Gaskin等，1974，“Turbidimetric studies of the in vitro assembly anddisassembly of porcine neurotubules”J.Mol.Biol.89：737-758；和Kirschner等，1974，“来自哺乳动物大脑的微管：它们脱聚合的产物的性质和组装和去组装的可能机理”，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.71：1159-1163；该系统适合于MTP组装部件的体外动力学分析。MTP组装件的时间进程由引发、繁殖和终止步骤构成，Gaskin等，1974，“Turbidimetric studies of the in vitro assembly and disassemblyof porcine neurotubules”J.Mol..Biol.89：737-758。在给定条件下的繁殖速率与动力学分析成线性，它用用来对DIME和GTP浓度进行评估。我们已经显示，由DIME对MTP组装件的抑制作用会发生在体内抑制肿瘤发生或抑制细胞复制或最后诱发细胞死亡所需的药物浓度的相同浓度，Mendeleyev等，1997，”Structureal specificity and tumoricidal action of DIME”’Int.J.Oncol.10：689-695和上表8；因此DIME-MTP相互作用是DIME作用的明显多向性细胞机制的最可能的组成。
11.1微管蛋白(MTP)的分离
公开的方法，如Gaskin等，1974，“Turbidimetric studies of the in vitroassembly and disassembly of porcine neurotubules”，J.Mol.Biol.89：737-758；Tiwari等，1993，“使微管蛋白得率成倍的pH和温度依赖的循环方法”，Anal.Biochem.215：96-103，适合于MTP的制备和对聚合作用的光学试验。使牛或兔脑在含100mM Pipes/K+(pH7.4)、4M EGTA、1M MgCl2、0.5mM DTT和0.1mMPMSF的等体积冰冷缓冲液(pH 7.4)里均质化，在4℃下以39000g离心1小时。向该上层液中加入DMSO(8％最终浓度)和GTP(1mM最终浓度)，然后在37℃下培养30分钟。使微管在37℃、100,000g下成丸达30分钟。让丸化物在冰上培养15分钟，然后再悬浮于冰冻的PEM缓冲液(100mM Pipes/K+(pH6.9)、1mMEGTA，1mM MgCl2)。再重复一次温热的聚合反应和冰冻的去聚合反应循环，用冰冻的、再悬浮单体化的MTP(8-10mg/ml蛋白质)对聚合反应动力学进行光学试验。兔脑或牛脑都得到同样的MTP制剂。
光学试验的组合物如图和表12所示。通过加入100微升MTP溶液(相当于0.8-1.0毫克蛋白质)来开始聚合反应，然后在装有热温度控制的试管支持器的Perkin-Elmer 552双束分光计测量在350nm的吸收以测量原始的线性速度增加，并在37℃下记录。(见图1)
11.2结果和讨论
图18显示了MTP的聚合的光学分析。除了GTP浓度是1mM(右侧曲线)，DIME的浓度为4μM(左侧曲线)外，其它按照表7的条件进行实验，很明显MTP聚合作用以线性方式进行。这样最大的聚合速率条件符合如Berne，B在1974“Interpretation of light scattering from long rods”，J.Mol.Biol.89：755-758一文所述。因此，可以通过比较各种药物和活化剂浓度存在下的线性速度来测定〔DIME〕和〔GTP〕之间的定量相关性。1mM GTP浓度下，DIME浓度梯度地增长会抑制MTP聚合作用(图18)。
如图20所示，1μM DIME与〔GTP〕定量相关的抑制和双倒数图产生了“混合”类型的抑制，Dixon等，1964，Enzymes，234-237页，Acad.Press，Inc.，美国纽约。V最大和km值在50％的km的GTP从6.7μM改变成14μM，而v最大降低到50％时发生改变。混合抑制的最简单介入，根据Briggs-Haldane等式(参见7)是k2，即，〔ES〕分解成E和P(产物)，直接被影响，然后它改变了km和v最大。k2的真正性质是未知的，它需要对GTP水解反应产物进行分析，已有著作进行报道，变构修饰也可得到相似的结果，Dixon等，1964 Enzymes，234-237页，Acad.Press，Inc.，美国纽约。本实验的目的是将DIME与它的类似物对MTP聚合反应的效果进行比较(参见表12)，用细胞病理方法(如体内抑制肿瘤生长)来校正结果。
在DIME和作用于MTP聚合(表13)的其类似物7的化学结构和它们对体内肿瘤生长的抑制性之间有很明显的相关性(与表8比较或上述的Mendeleyev等文献比较)。例如，取代基R1用EtO和正-丁氧基代替CH3O会逐渐消除MTP聚合作用的抑制性，几乎都平行于减少抗肿瘤生成作用(与表8或上述的Mendeleyev等文献比较)。另一方面，R2取代基中，羧酸代替甲酯会完全消除对MTP聚合作用的抑制效应，但使抗肿瘤生成作用减少一半，该实验对E-ras20个细胞进行(参见表8和图5或上述的Mendeleyev等)。可能是这类用量差异会影响细胞类型的特异性改变。
                                  表13
                 DIME和一些类似物在体外微管组装件里的作用
Figure C9719697900501
化合物序号           R1                 R2       对初始速度的抑制百分数
1                    CH3O               CH3O        93
2                    EtO                 CH3O         76
4                    n-BuO               CH3O         8
6                    CH3O               HO            0
5                    CH3O               EtO           35
7                    CH3O               H2N          43
9                    CH3O              (CH3)2N      6
18                   CF3O               CH3O          7
该分析系统由240微升含8％DMSO的PEM缓冲液和GTP(最终浓度为1mM)、10μM最终浓度的药物(加入3微升)或溶剂对照物和0.6毫克MTP(60微升)构成。在37℃下、λ＝350nm下检测微管组装件，最初速度被计算为mA350/分钟。对照的最初速度为180mA350/分钟。这些值是双份分析的平均值。
对MTP聚合的抑制会有很复杂的细胞结果。在胞质分裂中该抑制干扰了微管的牵引力，并防止形成断裂的皱纹，而所述的皱纹是细胞分裂所必需，Burton等，1997，“Traction force of cytokinesis measured with optically modified elasticsubstrate”，Nature 385：450-454。由DIME对MTP聚合的抑制应当用该药物的生化位点进行校正。与Mendeleyev等(同上)进行比较，DIME直接活化pp2-酶，因此需要用有DIME诱导的染色体相关的现象与该效果等同。例如，最近Kawabe等在1997，”HOXII interacts with protein phosphatase pp2a and pp1 and disruptsG2/M cell cycle check point”’Nature 385：454-458一文报道了，pp2-酶可调节G2/M过渡时期，pp2-酶也是潜在的致癌基因，它对促进肿瘤生成进行抑制。也DIME使pp2-酶活化可能抵抗肿瘤的生成。
在这些实验的基础上可见，甲状腺素类型的类似物，如DIME能阻滞癌症细胞的有丝分裂。本发明提供了通过使用这些技术，使用细胞类型、染色体染色或其它细胞里的DNA分析来快速筛选这类化合物。
前述说明书内容被认为足以使本技术领域人员能实施本发明。对药学领域或相关领域的人员很明显的上述实施本发明模式的各种修饰也被包括在下列权利要求书的范围里。

Claims (4)

1.一种具有下式的甲状腺素类似物或其药学上可接受的盐在制备治疗哺乳动物恶性肿瘤的药物中的应用，
其中：
当R1＝CH3O时，R2＝OH，OCH3，OCH2CH3，NH2或N(CH3)2，
当R1＝CH3CH2O时，R2＝OCH3。
2.根据权利要求1所述的应用，其中甲状腺素类似物是3，5-二碘代-4-(4’-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯。
3.根据权利要求1所述的应用，其中恶性肿瘤选自癌和肉瘤。
4.根据权利要求1所述的应用，其中甲状腺素类似物是口服给予的形式。
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