DE69230131T2

DE69230131T2 - Apoptoseregulator

Info

Publication number: DE69230131T2
Application number: DE69230131T
Authority: DE
Inventors: Masakazu Adachi; Koutoku Aihara; Seiji Akamatsu; Hiroyuki Ichikawa; Hitomi Mori; Satoru Nakai; Fumio Saito; Michiaki Tominaga
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-07-03
Filing date: 1992-07-02
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2012-07-03
Also published as: US5798358A; US5925640A; AU2231792A; US5872120A; AU648690B2; WO1993000902A1; MX9203950A; ES2138971T3; HK1004469A1; EP0552373B1; EP0552373A1; EP0552373A4; TW229157B; US5916890A; CA2090876A1; KR930702002A; KR100196368B1; US5672603A; DE69230131D1; DK0552373T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Apoptoseregulierende Zusammensetzung.
Die Apoptose-regulierende Zusammensetzung der Erfindung umfaßt als Wirkstoff wenigstens ein Mitglied eines Carbostyril-Derivats, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (1) (nachfolgend als Verbindung (1) bezeichnet) und Salze davon.
worin R eine Benzoyl-Gruppe ist, die gegebenenfalls Niederalkoxy-Gruppen am Phenyl-Ring als Substituenten aufweisen kann, und worin die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung in den 3- und 4-Positionen des Carbostyryl-Gerüsts eine Einfachbindung oder Doppelbindung ist.
Bezüglich der obigen Verbindung (1) und der für ihre Herstellung erhältlichen Verfahren kann die Beschreibung der japanischen geprüften Patentveröffentlichung Nr. 43747/1989 herangezogen werden. Es ist ebenfalls bekannt, daß die Verbindung (1) als Kardiotonikum nützlich ist.
Der Erfinder dieser Erfindung betrieb weitere Forschung zur Verbindung (1) und fand heraus, daß sie eine Apoptoseregulierende oder -modifizierende (hemmende oder fördernde) Aktivität aufweist, einschließlich u. a. Antikrebsaktivität und Zelldifferenzierungs-induzierender Aktivität, welche kaum aus ihren oben genannten bekannten Aktivitäten vorhergesehen werden können.
Währenddessen wird gesagt, daß zwei Typen von Mechanismen am Zelltod beteiligt sind. Der eine ist der klassiche, Nekrose genannte Typ von Zelltod. Morphologisch ist Nekrose durch ein deutliches Anschwellen der Mitochondrien, Anschwellen des Cytoplasmas und durch eine Zellkernveränderung gekennzeichnet, gefolgt von Zellzerstörung und Autolyse. Sie tritt passiv oder zufällig auf. Gewebenekrose wird im allgemeinen verursacht durch Körpertrauma an Zellen oder z. B. ein chemisches Gift.
Ein anderer Typ von Zelltod wird Apoptose genannt (programmierter Zelltod) [J. F. R. Kerr und A. H. Wyllie, Br. J. Cancer, 265, 239 (1972)]. Es heißt, daß Apoptose unter verschiedenen physiologischen Bedingungen auftreten kann. Morphologisch ist Apoptose unter anderem gekennzeichnet durch einen Berührungsverlust benachbarter Zellen, eine Konzentrierung des Cytoplasmas, eine mit Endonuclase- Aktivität verbundene Chromatin-Kondensation und Pyknose und Segmentierung des Zellkerns. Ebenfalls beobachtet werden das Verschwinden von Mikrovilli aus der Zelloberfläche und die Glättung der Zelloberfläche (Vesikelbildung auf der Zelloberfläche: Membranbläschenbildung). Eine Fragmentierung der Nukleosom-Einheit der DNA zu DNA-Fragmenten mit einer Größe von 180 bis 200 Basenpaaren aufgrund von Endonuklease- Aktivierung ist weiterhin beobachtbar. Endfragmente der apoptotischen Körperzellen werden durch benachbarte Zellen phagozytiert. Dies ist der von Duvall und Wyllie diskutierte Mechanismus [E. Duvall und A. H. Wyllie, Immunology Today, 7 (4), 115-119 (1986); Science, 245, 301-305 (1989)]. Wyllie berichtete ferner, daß die Glukokortikoid-induzierte Apoptose von Thymozyten eine intrazelluläre Endonuklease-Aktivierung beinhaltet [A. H. Wyllie, Nature, 284, 555-556 (1986)]. Die Endonuklease-Aktivität verursacht auf der Oligonukleotid- Stufe Fragmentierung der DNA in den die Apoptose erfahrenden Zellen, und dies kann leicht durch Agarose-Gelelektrophorese bestätigt werden.
Apoptose kann als vorprogrammierter Zelltod betrachtet werden, der im Prozeß der Entwicklung, Differenzierung oder des Umsatzes von Geweben beobachtet wird [A. H. Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68, 251-306 (1980)].
In Thymozyten führt eine Zunahme des Calciumspiegels im Calciumionophor oder einer Zunahme des cAMP-Spiegels zur Förderung derjenigen DNA-Fragmentierung, die für die oben genannte Apoptose charakteristisch ist [A. H. Wyllie et al., J. Pathol., 142, 67-77 (1984)], und deshalb wird angenommen, daß Calciumionen und/oder cAMP am Apoptose-Mechanismus beteiligt sind. Als ein Beispiel, von dem bisher berichtet wurde, kann die Apoptose von HL-60-Zellen genannt werden, deren Differenzierung durch Retinoesäure oder das Calciumionophor induziert wird [S. J. Martin et al., J. Immunol., 145, 1859-1867 (1990); S. J. Martin et al., Clin. Exp. Immunol., 79, 448-453 (1990)].
Nach Berichten tritt Apoptose nicht nur beim physiologischen Zelltod im Prozeß der Embryogenese und beim physiologischen Tod normaler Zellen im aktiven Zellzyklus auf (z. B. Leber-, Nebennierenrinden- und Prostatazellen), sondern sie wird ebenfalls durch Glukokortikoid-Behandlung, Zellverletzung durch cytotoxische T-Zellen, Atrophie von Hormon-abhängigen Geweben, Bestrahlung, NK-Zellen, Killerzellen, Tumornekrosefaktor (TNF), Lymphotoxin (LT), andere Cytokinen etc. induziert [A. H. Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68, 251 (1980); E. Duvall und A. H. Wyllie, Immunology Today, 7, 115-119 (1986); K. S. Sellins et al., J. Immunol., 139, 3199 (1987); T. Yamada et al., Int. J. Radiat. Biol., 53, 65 (1988); A. H. Wyllie, Nature, 284, 555 (1980); D. S. Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1881-1885 (1986); C. John et al., J. Immunol., 129 (4), 1782-1787 (1982); D. M. Howell et al., J. Immunol., 140, 689-692 (1988); B. Gillian et al., Eur. J. Immunol., 17, 689-693 (1987)]. Zusätzlich ist Apoptose ebenfalls durch manche Antikörper induzierbar, z. B. Anti-CD3-, Anti-APO-I- und Anti-Fas-Antikörper [B. C. Trauth et al., Science, 245, 301-305 (1989); C. A. Smith et al., Nature, 337, 181-184 (1989); T. Tadakuma et al., Eur. J. Immunol., 20, 779 (1990)], und ferner wurde durch die Ergebnisse von Nakamura et al. bestätigt, daß Apoptose bei der spontanen Rückbildung von bösartigen Tumoren erhalten wird [Y. Nakamura et al., Rinsho Hifuka (Jpn. J. Clin. Dermatol.), 35 (4), 289-295 (1981)].
Andererseits wurde berichtet, daß unter anderem Actinomycin D (ein RNA-Synthese-Inhibitor), Cycloheximid (ein Protein- Synthese-Inhibitor) und Calciumionen- (Ca²&spplus;) komplexierende Mittel Apoptose zurückdrängen können, und zusätzlich können nach Berichten Cyclosporin A (ein Immunhemmer), Cytokine des blutbildenden Systems [IL-3, GM-CSF (Granulozytenmacrophagen- Kolonie-stimulierender Faktor), G-CSF (Granulozytenkoloniestimulierender Faktor)], IL-2, bcl-2-Genprodukt und dgl. Apoptose zurückdrängen [J. J. Cohen, J. Immunol., 132, 38 (1984); A. H. Wyllie et al., J. Pathol., 142, 67 (1984); Y. Shi et al., Nature, 339, 625 (1989); G. L. Williams et al., Nature 343, 76 (1990); M. A. Nielo, J. Immunol., 143, 4166 (1989); D. L. Vaux et al., Nature, 335, 1440 (1988)]. Andererseits liegt für Cycloheximid und Actinomycin D ein Bericht vor, der die Apoptose-Induzierung in akuten Leukämiezellen durch Cycloheximid, in Cryptazellen des Dünndarms durch Actimomycin D und in HL-60-Zellen durch beide beschreibt [S. J. Martin et al., J. Immunol., 145, 1859-1867 (1990)]. Andererseits wird berichtet, daß Cycloheximid die Apoptose der lymphozytischen Tumorzellen, die vor der Röntgenbestrahlung vorliegen und durch Röntgenbestrahlung vermehrt werden, eher hemmt und Actinomycin D diese verstärkt. Deshalb wird angenommen, daß die Art von Zellen, die Bedingungen und andere Mechanismen an der Hemmung oder Förderung der Apoptose beteiligt sind [T. Igarashi et al., Nippon Ketsueki Gakkaishi (Acta Hematol. Jpn.), 51 (2), 144 (1988)]. Auf jeden Fall wird derzeit in Betracht gezogen, daß die Differenzierung, das Wachstum und die Reifung von Zellen eng mit der Apoptose verbunden sind und daß Substanzen, die die eine oder andere Rolle in einer solche Zelldifferenzierung, -wachstum oder dgl. spielen, ebenfalls mit Apoptose verbunden sind.
Kürzlich wurde eine Krebsbehandlung mit Anti-Apo-I- Antikörpern als Apoptose-bezogene Therapie unternommen. Beim myelodysplastischen Syndrom (MDS) sollten die refraktäre Anämie (RA) und refraktäre Anämie mit Ringsideroblasten (RARS), worin Panzytopenie vorherrscht, bevorzugt mit einer Kombination aus Retinoesäure oder Vitamin D3, das ein Differenzierungsinduktor für blutbildende Zellen ist, und GM-CSF oder IL-3 als Apoptose-regulierendes Mittel behandelt werden, welches die übermäßige Apoptose von Blutplättchenerzeugenden Zellen hemmt, wohingegen bei RAEB (refraktäre Anämie mit Übermaß an Blasten) und RAEB-t (RAEB im Übergang ("in transformation")), worin Blastozytenwachstum aktiv ist, Retinoesäure und Vitamin D&sub3; als Differenzierungs-induzierende Mittel wirken sollen, die die Differenzierung von Blastozyten zu reifen Blutzellen induzieren, und Etoposid und Aclarubicin sollen als Apoptose-regulierende Mittel wirken, die das Blastozyten-Wachstum hemmen (und dadurch die Apoptose fördern) [T. Shibuya, J. Clin. Exp. Med., 160 (5), 319-323 (1992)].
Murakami et al. berichteten, daß etwa die Hälfe von transgenen Mäusen, die Anti-Erythrozyten-Autoantikörper exprimieren, Autoimmunkrankheiten als Ergebnis des Verlusts der Eigenverträglichkeit zeigen und daß dies auf einem Mangel an der Fähigkeit beruht, Autoantikörper-erzeugende Zellen zu eliminieren, die aus der Apoptose-Induzierung durch Reaktionen von Eigenantigenen mit Autoantikörper-erzeugenden Zellen wie in normalen Mäusen resultieren [M. Murakami et al., Nature, 357, 77-80 (1992)].
Watanabe-Fukunaga et al. schlagen vor, daß für MRL lpr/lpr- Mäuse die Apoptose-bezogenen Fas-Moleküle eine Abnormalität aufweisen und der negative Beziehungsmechanismus (Apoptose) der autoreaktiven T-Zellen nicht richtig im Thymus arbeitet. Als Ergebnis tritt eine Autoimmunkrankheit auf [R. Watanabe- Fukunaga et al., Nature, 356, 314-317 (1992)].
Laut Montagnier et al. werden apoptotische DNA-Banden in T- Lymphozytenextrakten aus HIV-infizierten Patienten beobachtet. Dieses Phänomen wird bei 90% der asymptomatischen HIF-infizierten Patienten und bei 100% der AIDS-Patienten und ARC-Patienten ("AIDS-related-complex") beobachtet, was auf eine erhöhte Apoptose-Induzierung auch in HIV-infizierten Patienten hinweist [L. Montagnier et al., Sixieme Colloque des Cent Gardes, 9-17 (1991)].
Bezüglich des Zelltods im Entwicklungsstadium bei Kücken kann die vorhergehende Verabreichung von NGF (Nervenwachstumsfaktor; ein Protein, das die Zellhypertrophie und die Nervenfaserverlängerung im Nervenzellganglion fördert) in einer vollständigen Inhibierung des Nervenzelltods in dieser Entwicklungsstufe resultieren [V. Hamburger et al., J. Neurosci., 1, 60 (1981)], während die Verabreichung eines Antikörpers gegen NGF umgekehrt zum Verlust von etwa 90% der Jugendform der Sympathicus- Nervenzellen führt [R. Levi-Montalchini und B. Booker, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46, 384 (1960)].
Clark unterteilte die spontanen neuronalen Tode in drei Typen und identifizierte Typ I als Apoptose, da im neuronalen Tod Typ I die morphologischen Eigenschaften identisch mit denjenigen der Apoptose sind und da der Zelltod Typ I zusammen mit der DNA-Fragmentierung am Zelltod beteiligt ist, der durch einen Mangel an Wachstumsfaktor verursacht wird [P. G. H. Clark, Anat. Embryol., 181, 195 (1990); J. Neurosci., 1, 60 (1981); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46, 384 (1960); C. L. Rawson et al., J. Cell. Biol., 113, 671 (1991)].
Gemäß einem Bericht von Edwards et al. kann NGF den programmierten Tod von Sympaticus-Nervenzellen inhibieren, da NGF vermutlich die Apoptose reguliert [S. N. Edwards et al., J. Neurochemistry, 57 (6), 2140-2143 (1991)].
Gemäß Fischer et al. können sich alte Ratten mit Lernstörungen bei Verabreichung von NGF von der Lernstörung als Ergebnis der Wirkung des NGF auf die cholinergischen Nervenzellen des Vorderhirn-Basalfeldes erholen, von denen bekannt ist, daß sie bei der Alzheimer-Krankheit geschädigt sind [W. Fischer et al., Nature, 329, 65 (1987); Y.-A. Barde, Neuron, 2, 1525 (1989); H. Hatanaka, Develop. Brain Res., 30, 47 (1986); H. Hatanaka et al., Develop. Brain Res., 39, 85 (1988)]. Hatanaka et al. schlagen die Möglichkeit vor, daß NGF wirksam sein kann bei der Differenzierung, Reifung, Lebensunterstützung und Alterungsverhinderung, dem Schutz von Nervenzellen vor Schädigung, der Förderung der Erholung geschädigter Nervenzellen und der Inhibierung des Nervenzelltods bei Nervenkrankheiten, die mit dem Altern des Gehirns verbunden sind, insbesondere bei der Alzheimer- Krankheit [H. Hatanaka, Taisha (Metabolism), 28, 891-899 (1991)].
Bezüglich der Leberschädigung bei Hepatitis durch Arzneistoff-resistente Viren wird in Betracht gezogen, daß die Beschleunigung der Apoptose, die direkt oder durch das Immunsystem erfolgt, an der Leberschädigung beteiligt ist.
Andererseits ist es bekannt, daß in der Leber Mitogene das Wachstum von Leberzellen zur Erzeugung eines hyperplastischen Zustandes induzieren, und dieser Zustand wird durch Senkung und Nekrose, d. h. Apoptose, von Leberzellen normalisiert [J. F. Kerr et al., Br. J. Cancer, 26, 239-257 (1972)]. Bezüglich der Leber ist Apoptose unter anderem bei Leberhyperplasie, hyperplastischer Knötchenbildung und Leberkrebs beobachtbar [A. Columbano et al., Lab. Invest., 52, 670-675 (1985); A. Columbano et al., Am. J. Pathol., 116, 441-446 (1984)], während nach Kerr et al. die Apoptose nicht von Entzündung oder Fibroplasie begleitet ist [J. F. Kerr et al., Lancet, 2, 827-828 (1979)].
Im Hinblick auf die oben zitierten Berichte denken die Autoren der vorliegenden Erfindung, daß Patienten mit Hepatitis, sei sie akut oder chronisch, geheilt werden können, wenn die Apoptose inhibiert wird. Sie denken ferner, daß bei Patienten im Übergangszustand von chronischer Hepatitis zu Leberzirrhose und weiter zu Leberkrebs die Apoptose in einem kontrolliertem Zustand ist und daher zytotoxische T-Zellen eine Leberzellentzündung, gefolgt von Fibrose induzieren können, was eine Verschlechterung zur Leberzirrhose hin verursacht, und daß deshalb Hepatitis unterdrückt und die Entwicklung hin zur Zirrhose verhindert werden könnte, wenn die Apoptose gefördert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Apoptose-regulierende Zusammensetzung bereit, die als Wirkstoff eine effektive Menge wenigstens einer der Verbindungen der allgemeinen Formel (1) und Salze davon in Kombination mit einem dafür pharmakologisch akzeptablen Träger umfaßt.
Die Apoptose-regulierende Zusammensetzung dieser Erfindung kann Apoptose regulieren oder kontrollieren und ist aufgrund dieser Wirkung effektiv auf dem medizinischen Gebiet als Antikrebsmittel, Antiretrovirusmittel und Therapeutikum für Autoimmunkrankheiten, für Thrombopenie, für Alzheimer- Krankheiten und für verschiedene Typen von Hepatitis, als Tumormetastasen-inhibierendes Mittel etc., wie zuvor erwähnt.
In der allgemeinen Formel (1) schließt die Benzoyl-Gruppe, die Niederalkoxy-Gruppen als Substituenten am Phenyl-Ring aufweisen kann, Benzoyl-Gruppen mit 1 bis 3 geradkettigen oder verzweigten C&sub1;&submin;&sub6;-Alkoxy-Gruppen ein, die den Phenyl-Ring substituieren, wie Benzoyl, 2-Methoxybenzoyl, 3- Methoxybenzoyl, 4-Methoxybenzoyl, 2-Ethoxybenzoyl, 3- Ethoxybenzoyl, 4-Ethoxybenzoyl, 4-Isobutoxybenzoyl, 4- Hexyloxybenzoyl, 3,4-Dimethoxybenzoyl, 3,4-Diethoxybenzoyl, 3,4,5-Trimethoxybenzoyl, 2,5-Dimethoxybenzoyl usw.
Von den erfindungsgemäßen Wirkstoffverbindungen (1) ist 6-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]-3,4- dihydrocarbostyril am meisten bevorzugt.
Die Verbindungen (1), die als erfindungsgemäße Wirkstoffe dienen sollen, können leicht pharmakologisch akzeptable Salze mit herkömmlichen Säuren bilden. Als solche Säuren können anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Salpetersäure, Chlorwasserstoffsäure und Bromwasserstoffsäure, und organische Säuren genannt werden, wie Essigsäure, p-Toluolsulfonsäure, Ethansulfonsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure und Benzoesäure. Diese Salze können ebenfalls als erfindungsgemäße Wirkstoffverbindungen genau wie die freien Verbindungen der allgemeinen Formel (1) verwendet werden.
Die Verbindungen (1) und Salze davon können allgemein zu per se herkömmlichen pharmazeutischen Zubereitungen formuliert werden. Solche Zubereitungen werden hergestellt unter Verwendung herkömmlicher Füllstoffe, Streckmittel, Bindemittel, Befeuchtungsmittel, Sprengmittel, Tenside, Schmiermittel und ähnlicher Verdünnungsmittel oder Zusatzstoffe. Diese pharmazeutischen Zubereitungen können verschiedene Arzneiformen annehmen, ausgewählt gemäß den Therapiezwecken, und typische Beispiele dafür sind Tabletten, Pillen, Pulver, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Granalien, Kapseln, Suppositorien, Injektionen (Lösungen, Suspensionen etc.) und Augenlösungen.
Für die Herstellung von Tabletten kann eine große Vielzahl von bisher wohlbekannten Trägern auf diesem Gebiet verwendet werden. So kann z. B. Gebrauch gemacht werden von Trägern oder Zusatzstoffen, wie Lactose, Saccharose, Natriumchlorid, Glucose, Harnstoff, Stärke, Calciumcarbonat, Kaolin, kristalline Cellulose und Kieselsäure, Bindemitteln, wie Wasser, Ethanol, Propanol, einfacher Sirup, Glucoselösung, Stärkelösung, Gelatinelösung, Carboxymethylcellulose, Schellack, Methylcellulose, Kaliumphosphat und Polyvinylpyrrolidon, Sprengmitteln, wie trockene Stärke, Natriumalginat, gepulvertes Agar, gepulvertes Laminaran, Natriumhydrogencarbonat, Calciumcarbonat, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Natriumlaurylsulfat, Stearinsäuremonoglycerid, Stärke und Lactose, Zersetzungsinhibitoren, wie Saccharose, Stearin, Kakaobutter und hydrierte Ölen, Absorptionsförderern, wie quaternäre Ammoniumbasen und Natriumlaurylsulfat, Benetzungsmitteln oder Feuchthaltemitteln, wie Glycerin und Stärke, Adsorbentien, wie Stärke, Lactose, Kaolin, Bentonit und kolloides Silica, und Schmiermitteln, wie verfeinertes Talkum, Stearinsäuresalze, gepulverte Borsäure und Polyethylenglykol. Wenn erforderlich, können die Tabletten zusätzlich mit einem herkömmlichen Überzug versehen werden, um z. B. zuckerüberzogene Tabletten, gelatineüberzogene Tabletten, Tabletten mit magensaftresistentem Überzug, filmüberzogenen Tabletten oder doppelt überzogenen oder Mehrschichttabletten zu ergeben.
Für die Herstellung von Pillen kann eine große Vielzahl von auf diesem Gebiet wohlbekannten Trägern verwendet werden. Beispiele sind Träger oder Zusatzstoffe, wie Glucose, Lactose, Stärke, Kakaobutter, gehärtete pflanzliche Öle, Kaolin und Talkum, Bindemittel, wie gepulvertes Gummi arabicum, gepulvertes Tragacanthharz, Gelatine und Ethanol, und Sprengmittel, wie Laminaran und Agar.
Für die Herstellung von Suppositorien kann eine große Vielzahl von bisher bekannten Trägern verwendet werden. Als Beispiele können genannt werden: Polyethylenglykol, Kakaobutter, höhere Alkohole, höhere Alkoholester, Gelatine und halbsynthetische Glyceride.
Bei der Herstellung von Injektionen werden die Lösungen oder Suspensionen bevorzugt sterilisiert und sind bevorzugt isotonisch zum. Blut, und zur Herstellung solcher Arzneiformen können all die Verdünnungsmittel in herkömmlicher Anwendung auf diesem Gebiet eingesetzt werden. So können z. B. genannt werden: Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, ethoxylierter Isostearylalkohol, polyoxylierter Isostearylalkohol, und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester. In diesem Fall können die pharmazeutischen Zubereitungen Natriumchlorid, Glucose oder Glycerin in Mengen enthalten, die ausreichend zum Erhalt isotonischer Lösungen sind. Es ist möglich, herkömmliche Solubilisierungsmittel, Puffer, Linderungsmittel oder Lokalanästhetika etc. hinzuzufügen.
Zusätzlich können die pharmazeutischen Zubereitungen, wenn erforderlich, Färbemittel, Konservierungsmittel, Duftstoffe, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und dgl. ebenso wie andere Arzneistoffe enthalten.
Der Anteil der Wirkstoffverbindung in diesen pharmazeutischen Zubereitungen dieser Erfindung ist nicht kritisch, aber kann in geeigneterweise in einem breiten Bereich ausgewählt werden. Jedoch wird der Anteil allgemein in empfohlener Weise innerhalb des Bereiches von ca. 1 bis ca. 70 Gew.-%, bevorzugt ca. 1 bis ca. 30 Gew.-% ausgewählt.
Der Verabreichungsweg dieser pharmazeutischen Zubereitungen dieser Erfindung ist ebenfalls nicht kritisch, wird aber entsprechend der Arzneiform, dem Alter, Geschlecht und anderen Faktoren des Patienten und der Schwere der zu behandelnden Krankheit ausgewählt. So werden die Zubereitungen oral verabreicht, wenn sie z. B. in Form von Tabletten, Pillen, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Granalien oder Kapseln bereitgestellt werden. Injzierbare Lösungen werden entweder allein oder im Gemisch mit herkömmlichen Flüssigkeiten zur parenteralen Infusion, die Glucose, Aminosäuren usw. enthalten, intravenös verabreicht. Diese Lösungen können, wenn erforderlich, ebenfalls als solche auf dem intramuskulären, intradermalen, subkutanen oder intraperitonealen Weg verabreicht werden. Suppositorien werden rektal verabreicht. Augenlösungen sind Tropflotionen für die Augen.
Während die Dosierung der obigen pharmazeutischen Zubereitungen von der Verabreichungsmethode, dem Alter, Geschlecht und anderen Hintergrundfaktoren des Patienten, der Schwere der Krankheit usw. abhängig ist, wird es allgemein empfohlen, ca. 0,5 bis 30 mg des Wirkstoffs, d. h. der Verbindung (1), je kg Körpergewicht pro Tag zu verabreichen. Die in jeder Dosierungseinheit enthaltene Wirkstoffmenge beträgt ca. 10 bis 1000 mg.
Die Krankheiten, von denen erwartet werden kann, daß die erfindungsgemäße Apoptose-regulierende Zusammensetzung dagegen wirksam ist, beruhend auf ihren Zelldifferenzierungs- induzierenden und anderen Aktivitäten, schließen u. a. ein: Krebs, AIDS, ARC ("AIDS related complex"), ATL (ausgewachsene T-Zellen-Leukämie), Haarzellenleukämie, Myelopathie (HAM/TSP), Atemwegsstörung (HAB/HABA), Arthropathie (HAAP), Uveitis (HAU), andere HTLV-I-bezogene Krankheiten (HTLV-I: "human T cell leukemia virus type I", menschliches T-Zellen- Leukämievirus Typ I), Autoimmunkrankheiten, wie SLE (systemischer Lupus erythematosus), Collagen-Krankheiten, wie primärchronische Polyarthritis ("rheumatoid Arthritis", RA), ulzeröse Kolitis, Sjögren-Syndrom, primäre biliäre Leberzirrhose, Purpura thrombopenica ("idiopathic thrombocytopenic purpura", ITP), hämolytische Autoimmunanämie, Maysthenia gravis, Hashimoto-Krankheit und insulinabhängiger (Typ I) Diabetes mellitus. Die Apoptoseregulierende Zusammensetzung der Erfindung ist ebenfalls anwendbar auf verschiedene, von Thrombopenie begleitete Krankheiten, z. B. das myelodysplastische Syndrom, periodische Thrombopenie, aplastische Anämie, idiopathische Thrombopenie, verstreute intravaskuläre Gerinnung etc. Die Zusammensetzung der Erfindung ist weiterhin anwendbar auf verschiedene andere Krankheiten, die verschiedene Typen von Hepatitis (wie Typ C, A, B und F) einschließen, Alzheimer-Krankheit, Myocarditis, ARDS (ausgewachsenes Respiratory Distress Syndrom), infektiöse Krankheiten, Leberzirrhose, Prostatahypertrophie, Gebärmuttermyom, Bronchialasthma, Arteriosklerose, verschiedene angeborene Mißbildungen, Nephritis, Altersstar, chronisches Müdigkeitssyndrom und Myodystrophie.
Wenn die Apoptose-regulierende Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als Antikrebszusammensetzung verabreicht wird, induziert sie z. B. die Differenzierung von Krebszellen, fördert oder inhibiert anschließend die Apoptose-Induzierung oder fördert oder inhibiert direkt die Apoptose-Induzierung und erzeugt dadurch einen Antikrebseffekt. In diesem Fall kann die Zusammensetzung der Erfindung, unbeachtlich der Arzneiform und/oder des Verabreichungsweges, in Kombination mit einem oder mehreren verschiedenen, als Krebs-Chemotherapeutika bekannten Antikrebsmitteln und/oder Strahlentherapie verwendet werden. Die Wirkstoffverbindung der Erfindung, die einen ausgezeichneten Antikrebseffekt erzeugen kann, kann somit deutlich die Wirkung des (der) kombiniert verwendeten anderen Antikrebsmittel(s) zur Erzeugung eines Synergieeffektes fördern. Selbst wenn das (oder die) Partner-Antikrebsmittel in viel kleineren als den üblichen Dosen verwendet werden, kann deshalb ein zufriedenstellender Antikrebseffekt erhalten werden, wodurch die nachteiligen Wirkungen des (oder der) Partner-Antikrebsmittel minimiert werden können. Als solche Chemotherapeutika können z. B. genannt werden: 5-Fluoruracil (5-FU; Kyowa Hakko Kogyo), Mitomycin C (Kyowa Hakko Kogyo), Futraful (FT-207; Taiho Pharmaceutical), Endoxan (Shionogi & Co.) und Toyomycin (Takeda Chemical Industries).
Wenn die Apoptose-regulierende Zusammensetzung der Erfindung bei der Behandlung von Thrombopenie verwendet wird, kann sie eine die Zelldifferenzierungsinduzierung fördernde Wirkung und gleichzeitig eine die Apoptose hemmende Wirkung bei Patienten mit MDS, wie HA oder RARS, erzeugen und dadurch die Proliferation von blutbildenden Zellen stimulieren und eine normale Differenzierung und Reifung stimulieren. Bei Patienten mit MDS, wie RAEB oder RAEB-t, kann die Verabreichung der Zusammensetzung der Erfindung in einer induzierten Differenzierung von Blastozyten und Inhibierung der Blastozytenvermehrung resultieren, wodurch eine Proliferation von reifen Zellen verursacht werden kann. Es kann ferner erwartet werden, daß die Zusammensetzung der Erfindung auf Promegakaryozyten und Megakaryozyten wirkt und ihre Differenzierung und Reifung fördert und dadurch die Blutplättchenbildung fördert.
Zur Verwendung bei der Behandlung von Thrombopenie kann die Apoptose-regulierende Zusammensetzung der Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren anderen bekannten Arzneistoffen verwendet werden, wie die Bluttplättchenbildung fördernden Mitteln, um diese Partnerarzneistoffe zu potenzieren. So kann in manchen Fällen, selbst wenn die Partnerarzneistoffe in ziemlich reduzierten Dosen verwendet werden, ein zufriedenstellender therapeutischer Effekt erzeugt werden, und die nachteiligen Effekte dieser Arzneistoffe können dadurch reduziert werden.
Die Apoptose-regulierende Zusammensetzung der Erfindung ist ebenfalls nützlich als therapeutisches und prophylaktisches Mittel für die Alzheimer-Krankheit. In diesem Fall übt die Zusammensetzung der Erfindung bei Patienten mit klassicher Alzheimer-Krankheit oder Alterdemens des Alzheimer-Typs eine NGF-artige Wirkung durch die Inhibierung der Apoptose aus und erzeugt dadurch die oben genannten therapeutischen und prophylaktischen Effekte. Ferner kann die Zusammensetzung der Erfindung in diesem Fall in Kombination mit jedem der herkömmlichen Therapeutika für die Alzheimer-Krankheit verwendet werden, wie Mitteln zur Verbesserung der Gehirndurchblutung und Gehirnstoffwechselmitteln, wodurch deren Effekte gefördert und ihre nachteiligen Wirkungen in manchen Fällen reduziert werden können.
Die Apoptose-regulierende Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann als Zirrhose-Prophylaktikum verwendet werden, das die Apoptose bei Patienten mit Arzneistoff-induzierter Hepatitis oder Virushepatitis kontrolliert, um dadurch einen therapeutischen Effekt bei Hepatitis zu ergeben und die Fibrogenese von Leberzellen zu verhindern.
Einige Beispiele für Arzneiformen der Apoptose-regulierenden Zusammensetzung der Erfindung und Ergebnisse pharmazeutischer Studien über die Wirkstoffverbindungen sind nachfolgend gezeigt.
In den folgenden pharmakologischen Testbeispielen wird auf die begleitenden Abbildungen verwiesen, worin gilt:
Fig. 1 zeigt die DNA-Fragmentierungsergebnisse im Test des Apoptose-regulierenden Effekts gemäß dem pharmakologischen Testbeispiel 1;
Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der Inhibierung des M12-Melanom-Zellwachstums gemäß dem pharmakologischen Testbeispiel 5 zeigt;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse des lebensverlängernden Effekts auf eine Autoimmunkrankheit zeigt, erhalten durch das pharmakologische Testbeispiel 8;
Fig. 4 bis 7 zeigen die Ergebnisse des Thrombopenie- verbessernden Effekts gemäß dem pharmakologischen Testbeispiel 9;
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse des therapeutischen Effekts auf eine Autoimmunkrankheit gemäß dem pharmakologischen Testbeispiel 10;
Fig. 9 und 10 sind Photographien, die die Effekte auf PC12-Zellen gemäß dem pharmakologischen Testbeispiel 11 zeigen;
Fig. 11 ist ein Diagramm, das den Effekt auf das Leberversagen gemäß dem pharmakologischen Testbeispiel 12 zeigt;
Fig. 12 ist ein Diagramm, das den Effekt der B12-Melanom- Zellen auf das experimentelle Modell von Lungenmetastasen gemäß dem pharmakologischen Testbeispiel 13 zeigt.

Arzneiform-Beispiel 1

6-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3,4-dihydrocarbostyril 150 g
Avicel (Handelsbezeichnung, Ashai Chemical Industry Co., Ltd.) 40 g
Maisstärke 30 g
Magnesiumstearat 2 g
Hydroxypropylmethylcellulose 10 g
Polyethylenglykol 6000 3 g
Rizinusöl 40 g
Methanol 40 g
Die obige Wirkstoffverbindung, Avicel, Maisstärke und Magnesiumstearat werden zusammen vermischt und gemahlen, und die resultierende Mischung wird mit einem R10 mm Dragee- Stempel formgepreßt. Die so erhaltenen Tabletten werden mit einer Filmüberzugszusammensetzung überzogen, die aus Hydroxypropylmethylcellulose, Pclyethylenglykol 6000, Rizinusöl und Methanol besteht, um filmüberzogene Tabletten zu ergeben.

Arzneiform-Beispiel 2

6-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3,4-dihydrocarbostyril 150,0 g
Zitronensäure 1,0 g
Lactose 33,5 g
Dicalciumphosphat 70,0 g
Pluronic F-68 30,0 g
Natriumlaurylsulfat 15,0 g
Polyvinylpyrrolidon 15,0 g
Polyethylenglykol (Carbowax 1500) 4,5 g
Polyethylenglykol (Carbowax 6000) 45,0 g
Maisstärke 30,0 g
Trockenes Natriumlaurylsulfat 3,0 g
Trockenes Magnesiumstearat 3,0 g
Ethanol in genügender Menge
Die obige Wirkstoffverbindung, Zitronensäure, Lactose, Dicalciumphosphat, Pluronic F-68 und Natriumlaurylsulfat werden vermischt.
Nach einer Größensichtung unter Verwendung eines Nr. 60- Siebes wird die Mischung durch das Naßverfahren unter Verwendung einer alkoholischen Lösung, die Polyvinylpyrrolidon, Carbowax 1500 und Carbowax 6000 enthält, granuliert. Wenn erforderlich, wird Alkohol hinzugegeben, um das Pulver zu einer pastösen Masse zu machen. Dann wird Maisstärke hinzugegeben, und das Mischen wird fortgesetzt, bis einheitliche Granalien gebildet werden. Die Mischung wird dann durch ein Nr. 10-Sieb geführt, auf ein Tablett gegeben und in einem auf 100ºC gehaltenen Ofen für 12 bis 14 h getrocknet. Die getrockneten Granalien werden durch ein Nr. 16 Sieb gesiebt, dann werden trockenes Natriumlaurylsulfat und trockenes Magnesiumstearat hinzugegeben, und nach Vermischen wird die Mischung auf eine gewünschte Größe und Form unter Verwendung einer Tablettenpresse verpreßt.
Die obigen Kerne werden mit einem Lack behandelt und mit Talkum zur Verhinderung der Feuchtigkeitsabsorption bestäubt und dann mit einer Unterschicht versehen. Die Lackbeschichtung wird so häufig wiederholt, wie es zur internen Verwendung erforderlich ist. Die Tabletten werden vollständig rund und glatt gemacht durch Auftragung einer weiteren Unterschicht und eines Glättungsüberzugs. Eine Farbumhüllung wird durchgeführt, bis die gewünschte Färbung erhalten ist. Nach Trocknen werden die überzogenen Tabletten poliert, um einheitlich polierte Tabletten zu ergeben.
Die nachfolgend beschriebenen pharmakologischen Tests wurden unter Verwendung der folgenden Testverbindungen durchgeführt.
1. 6-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3,4-dihydrocarbostyril,
2. 6-[4-(3,4,5-Trimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3,4-dihydrocarbostyril,
3. 7-[4-(3,4,5-Trimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3,4-dihydrocarbostyril,
4. 7-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3,4-dihydrocarbostyril,
5. 6-[4-(4-Ethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]-3,4- dihydrocarbostyril,
6. 5-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3,4-dihydrocarbostyril,
7. 6-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- carbostyril,
8. 8-[4-(3,4-Dimethoxybenzoyl)-1-piperazinyl]- 3, 4-dihydrocarbostyril.

Pharmakologisches Testbeispiel 1

Apoptose-regulierender Effekt

CMK-Zellen wurden zur Herstellung einer Suspension aus 1 · 10&sup5; Zellen/ml in mit 10% Rinderfötusserum ergänztem RPMI- 1640-Medium verwendet, und Verbindung 1 wurde in einer Konzentration von 30 ug/ml hinzugegeben. Die Mischung wurde in einem Kulturkolben bei 37ºC für 2 oder 4 Tage inkubiert. Als Kontrolle wurde das Medium, zu dem allein das Lösungsmittel hinzugegeben wurde, in ähnlicher Weise inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 4ºC für 10 min mit 200 · G geernetet. Das Pellet wurde in einem hypotonischen Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 0,2% Triton · 100, pH 7,5) aufgelöst, und die Lösung wurde bei 4ºC für 10 min mit 13 000 · G zentrifugiert. Der Überstand wurde aufgefangen und über Nacht in 50% Isopropylalkohol - 0,5 M NaCl bei -20ºC stehengelassen. Der resultierende Niederschlag wurde bei 4ºC für 10 min mit 13 000 · G zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und das Sediment wurde getrocknet. Das trockene Sediment wurde erneut in 10 mM Tris - HCl-1 mM EDTA (pH 7,4) suspendiert. Zum Überstand wurde RNase in einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml hinzugegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC für 1 h inkubiert.
Zu einer Probe, die einer Zellzahl von 1 · 10&sup6; entsprach, wurde 1/5 Volumen eines Ladepuffers hinzugegeben, der 15 mM EDTA, 2% SDS, 50% Glycerin und 0,05 Bromphenolblau enthielt, und die Mischung wurde bei 65ºC für 10 min inkubiert.
Die so erhaltene Kulturprobe wurde der Elektrophorese in 1,5% Agarosegel bei 100 V für 100 min unterzogen. Die DNA wurde mit Ethidiumbromid gefärbt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.
In der Figur stellen die Bahnen an beiden Seiten den Marker 1 (12, 600 und 1350 Bp) bzw. 2 (72, 420 und 930 Bp) dar. Die zweite Bahn von links zeigt das Muster nach 2 Tagen Behandlung mit Verbindung 1, die dritte Bahn von links das Muster nach 2 Tagen Kontrollbehandlung, die vierte Bahn von links das Muster nach 4 Tagen Behandlung mit Verbindung 1 und die fünfte Bahn von links das Muster nach 4 Tagen Kontrollbehandlung.
Es ist somit deutlich, daß die Expression von DNA-Fragmenten zeitabhängig auf dem Elektrophorogramm erscheint. Dies zeigt, daß Verbindung 1 die Apoptose von CMK-Zellen fördert.

Pharmakologisches Testbeispiel 2

Inhibierung von Krebszellwachstum

(1) Menschliche promyelozytische Leukämiezellen (HL-60)
Die menschliche promyelozytische Leukämiezellinie HL-60 ist eine menschliche Leukämiezellinie, die von Robert Gallo et al. eingeführt wurde, und ihre typischen Eigenschaften sind in der Literatur beschrieben [R. C. Gallo et al., Blood, 54, 713 (1979)]. Sie ist erhältlich von der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Eingangs-Nr. ATCC Nr. CCL-240.
Die Konzentration der HL-60-Zellen wurde unter Verwendung von mit 10% FCF ("fetal calf serum", Rinderfötusserum; GIBCO) ergänztem RPMI-1640 Medium (GIBCO) auf 1 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.
(2) Menschliche Magenkrebszellen (KATO-III)
Die Zellkonzentration wurde unter Verwendung des gleichen Mediums wie oben in (1) verwendet auf 1 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt.
(3) Lösungen der Testverbindungen
Testverbindung 1 wurde in Essigsäure aufgelöst, gefolgt von Verdünnung mit dem gleichen Medium wie oben in (1) verwendet und Neutralisation mit 2 N NaOH, um Endkonzentrationen von 100 ug/ml, 10 ug/ml und 1,0 ug/ml zu ergeben.
(4) Giemsa-Anfärbelösung
Giemsa-Anfärbelösung wurde hergestellt durch 50- bis 100- faches Verdünnen von Giemsa-Reagens (Merck) mit Phosphatpuffer (pH 6,4).
(5) Esterase-Anfärbereagens
Ein Reagens zur Esterase-Anfärbung (Muto Kagaku) wurde gemäß dem Naphthol AS-D Chloracetat-Verfahren verwendet.
(6) Monoklonaler Anti-DC33-Antikörper My9
Der monoklonale Antikörper My9 (Coulter), der spezifisch mit unreifen Granulozyten reagieren kann, wurden durch Zugabe von 0,5 ml destilliertes Wasser je Phiole aufgelöst.
(7) Ergebnisse
a) Die wie oben unter (3) beschrieben hergestellten Lösungen der Testverbindung wurden zu HL-60 Zellsuspensionen, hergestellt wie oben unter (1) beschrieben, auf Endkonzentrationen von 10 ug/ml und 1,0 ug/ml hinzugegeben. Unter Verwendung von Kulturplatten mit 12 Vertiefungen (Costar) wurde die Kultivierung in einem auf 37ºC gehaltenen Inkubator mit 5% Kohlendioxidgas für 3 bis 4 Tage durchgeführt. Das Testverbindungs-freie Medium wurde als Kontrolle verwendet. Danach wurden Proben der Zellsuspension aus jeder Vertiefung entnommen und mit 0,2% Tryptanblau- haltigem Phosphatpuffer vermischt, und nicht angefärbte lebensfähige Zellen wurden unter einem Mikroskop gezählt. Auf der Grundlage des Zählergebnis wurde die Konzentration an lebensfähigen Zellen auf 1 · 10&sup5; Zellen/ml erneut eingestellt, und die Kultivierung wurden unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt.
Die Zellwachstumsinhibierenden Effekte am Tag 27 und 33 sind in Tabelle 1 gezeigt.
Wie oben unter (2) beschrieben hergestellte KATO-III-Zellen wurden in der gleichen Weise kultiviert. Die Zellwachstumsinhibierenden Effekte am Tag 24 und 33 sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 1 Tabelle 2
Aus den in Tabelle 1 und Tabelle 2 gezeigten Daten ist ersichtlich, daß das Wachstum von Tumorzellen in einer von der Konzentration der Testverbindung abhängigen Weise inhibiert wird.
b) Differenzierung von HL-60-Zellen
Wie oben unter (1) beschrieben hergestellte HL-60-Zellen wurden in der gleichen Weise wie in a) kultiviert. Am Tag 27 gesammelte Zellen wurden auf einen Objektträger gegeben und mit Giemsa-Lösung angefärbt, gefolgt von morphologischer Untersuchung unter einem Mikroskop. Wenn die Testverbindung hinzugegeben wurde, wurde eine Differenzierung zu Zellen mit Granula als morphologische Veränderung im Gegensatz zum Testverbindungs-freien Fall beobachtet. Die Ergebnisse der Esterase-Anfärbung durch das Naphthol AS-D-Chloracetat- Verfahren zeigten eine Differenzierung von 70 bis 85% der HL-60-Zellen zu Granulozyten.
c) Reaktivität mit monoklonalem Anti-CD22-Antikörper My9
Wie oben unter (1) beschrieben hergestellte HL-60-Zellen wurden in der gleichen Weise wie in a) kultiviert. Am Tag 27 wurde die Zellkonzentration auf 1 · 10&sup6; Zellen/ml eingestellt, und 100 ul jeder Aliquote wurden mit 10 ul Fluorescein- (FITC-) markiertem My9 umgesetzt, gefolgt von Flußcytometrie. Die so erhaltenen Daten mit positiver Rate sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Testverbindung 1 Positive Rate (%)
0 (Kontrolle) 97
1,0 ug/ml 90
10 ug/ml 77
Aus den in Tabelle 3 gezeigten Daten wurde bemerkt, daß bei Zugabe der Testverbindung der Anteil der undifferenzierten HL-60-Zellen abnahm, während sich der Anteil der differenzierten Zellen erhöhte.
Die obigen Ergebnisse zeigten, daß die Wirkstoffverbindung der vorliegenden Erfindung Wachstum-inhibierende und Differenzierungs-induzierende Effekte auf Tumorzellen hat.

Pharmakologisches Testbeispiel 3

Differenzierungsinduktionstest

(8) Monoklonaler Antikörper FH-6
Der monoklonale Antikörper FH-6, der Sialyl LeX erkennen kann, wurde Fluorescein- (FITC-) markiert, und die Reaktivität zwischen der Wirkstoffverbindung der vorliegenden Erfindung und FH-6 wurde durch Flußcytometrie wie folgt untersucht.
(9) Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper FH-6
Die wie oben unter (3) beschrieben hergestellten Testverbindungslösungen wurden zu wie oben unter (1) beschrieben hergestellten HL-60-Zellen auf eine Endkonzentration von 1,0 ug/ml oder 10 ug/ml hinzugegeben. Die Kultivierung wurde bei 37ºC für 2 h in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxidgas durchgeführt. Danach wurde die Zellkonzentration auf 1 · 10&sup6; Zellen/ml eingestellt, und 100 ul jeder Aliquote wurden mit 10 ml der Fluorescein- markierten FH-6-Lösung umgesetzt, gefolgt Flußcytometrie. Die so erhaltenen Daten mit positiver Rate sind in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Testverbindung 1 Positive Rate (%)
0 (Kontrolle) 95
1,0 ug/ml 82
10 ug/ml 76
Aus den obigen Ergebnissen ergab sich, daß die Zugabe der Wirkstoffverbindung der vorliegenden Erfindung in einem Verlust von Sialinsäure aus der HL-60-Zelloberfläche resultierte. Dies bedeutet eine Differenzierung der HL-60- Zellen und eine Zunahme der Sialidase-Aktivität.

Pharmakologisches Testbeispiel 4

Wirkung auf menschliche promyelozytische Leukämiezellen (HL-60)

HL-60-Zellen wurden in mit 10% FCS ergänztem RPMI-1640- Medium bei 37ºC unter 5% CO&sub2; kultiviert, und die Zellkonzentration wurde auf · 10&sup4; Zellen/ml eingestellt.
Dann wurde das oben genannte Medium, das 30 ug/ml jeder Testverbindung enthielt, in jede Vertiefung von Mikrotiterplatten mit 6 Vertiefungen (Costar) hinzugegeben, gefolgt von 3 Tagen Inkubierung bei 37ºC unter 5% CO&sub2;. In einer Kontrollgruppe wurde das obige Medium allein hinzugegeben, und die Inkubierung wurde in der gleichen Weise durchgeführt. Danach wurde eine Probe jeder kultivierten Zellsuspension in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben, und nach Anfärbung mit 0,2% Tryptanblauhaltigem Phosphatpuffer wurden die lebensfähigen Zellen unter Verwendung einer Blutkörperchen-Zählkammer gezählt.
Die obigen Zellen wurden auf 1 · 10&sup7; Zellen/ml eingestellt. Zu 100 ul der Zellsuspension wurden 5 ul einer Lösung aus Fluoresceinisothiocyanat- (FITC-) markiertem antimenschlichen CD11b-Antikörper (Mol; Coulter) hinzugegeben, und man ließ die Reaktion auf Eis in der Dunkelheit für 30 min fortschreiten. Dann wurden die Zellen zweimal mit PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; Nissui Pharmaceutical), die 0,1% BSA enthielt (Rinderserumalbumin; Sigma), gewaschen, schließlich in 500 ul des BSA-haltigen PBS suspendiert und auf Fluoreszenzintensität durch Flußcytometrie unter Verwendung von Profil II (Coulter) untersucht.
Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 und Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 5

Testverbindung Induktion des differenzierungsfördernden Effekts
1 322
3 384
4 383
5 232
6 303
7 898
8 344

Tabelle 6

Testverbindung Zellwachstum-inhibierender Effekt (%)
2 20,2
7 24,1
8 24,9
Aus den in den obigen Tabellen gezeigten Daten wurde festgestellt, daß in jeder Testverbindungsgruppe ein zellwachstumsinhibierender Effekt erzeugt wurde, während die Expression von CD11b erhöht wurde, wodurch die Induzierung der Differenzierung zur Granulozyten-, Monozyten- und Makrophagenserie gefördert wurde.

Pharmakologisches Testbeispiel 5

Inhibierung des M12-Melanom-Zellwachstums

Diese Studie wurde in Gruppen von 10 nackten Balb/c-Mäusen durchgeführt.
Am ersten Tag des Experiments (Tag 0) wurden 2 · 10&sup6; M12- Melanomzellen in Mäuse in der Testgruppe transplantiert. Als das Tumorvolumen 100 mm³ erreichte, wurde die Testverbindung 1 in Dosen von 10 mg/kg täglich an die Mäuse verabreicht. Diese Behandlung wurde 30-mal von Tag 25 bis Tag 55 durchgeführt. Der Tumordurchmesser wurde unter Verwendung eines Tasterzirkels jeden Tag nach der Transplantation der Tumorzellen gemessen. Das Tumorvolumen wurde gemäß der folgenden Formel berechnet.
Tumorvolumen (mm³) = (langer Durchmesser) · (kurzer Durchmesser)² · 1/2
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.
In Fig. 2 sind ebenfalls die entsprechenden Ergebnisse in der Kontrollgruppe dargestellt. In der Figur markiert * eine signifikante Differenz bei p< 0,05 (Student-t-Test).
Wie aus Fig. 2 ersichtlich, inhibiert die Verabreichung der Testverbindung signifikant das Wachstum von M12- Melanomzellen.

Pharmakologisches Testbeispiel 6

Inhibierung des Wachstums von ATL-infizierten Zellen

Der folgende pharmakologische Test wurde unter Verwendung der Verbindung 1 als Testverbindung durchgeführt.
(a) Herstellung von menschlichen akuten lymphozytischen Leukämiezellen aus peripherem Blut (Molt-4)
Menschliche akute lymphozytische Leukämiezellen aus peripherem Blut (Molt-4) [J. Minowada et al., J. Natl. Cancer Inst., 49, 891-895 (1972): ATCC CRL1582] wurden zur Herstellung einer Suspension aus 1 · 10&sup5; Zellen/ml in mit 10% Rinderfötusserum (FCS, Gibco) ergänztem RMPI-1640-Medium (Gibco) verwendet, um sie als nicht mit ATL-Virus infizierte Zellen zu verwenden.
(b) Herstellung von menschlichen ausgewachsenen T-Zell- Leukämie-Zellen (55)
Menschliche ausgewachsene T-Zell-Leukämiezellen (55) wurden zur Herstellung einer Suspension aus 1 · 10&sup5; Zellen/ml in mit 10% Rinderfötusserum (FCS, Gibco) ergänztem RPMI-1640-Medium (Gibco) verwendet, um sie als mit dem ATL-Virus infizierte Zellen zu verwenden.
(c) Zubereitung der Testverbindung
Verbindung 1 wurde in Salzsäure aufgelöst, mit dem gleichen Medium wie oben verdünnt, mit 2 N NaOH neutralisiert und auf Konzentrationen von 1 ug/ml, 10 ug/ml und 30 ug/ml eingestellt.
(d) Pharmakologischer Test
Die in (a) bzw. (b) oben hergestellten Zellen wurden in Vertiefungen einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen (Nung) gegeben, gefolgt von Zugabe der in (c) zubereiteten Testverbindung (Endkonzentration: 1 ug/ml, 10 ug/ml oder 30 ug/ml), und bei 37ºC für 4 Tage in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultiviert. Als Kontrolle wurde das Medium ohne Zugabe der Testverbindung verwendet. Nach Beendigung der Inkubierung wurde die Zellsuspension in jeder Vertiefung zur Bestimmung der lebensfähigen Zellen herangezogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich, übt die Wirkstoffverbindung der Erfindung (Verbindung 1) einen hochwirksamen inhibitorischen Effekt auf das Wachstums von ATLV-infizierten Zellen bei einer Konzentration von wenigstens 1 ug/ml aus, während sie nicht die ATLV-infizierten Zellen beeinflußt.

Pharmakologisches Testbeispiel 7

Test zur Antiretrovirus-Aktivität

(a) Zubereitung von menschlichen transformierten normalen T- Zellen (MT-4)
Menschliche transformierte normale T-Zellen (MT-4) [T. Nagumo und H. Hoshino, Jpn. J. Cancer Res. 79, 9-11 (1988)] wurden zur Herstellung einer Suspension aus 2 · 10&sub5; Zellen/ml in mit 10% FCS (Gibco) ergänztem RPMI-1640-Medium (Gibco) verwendet.
(b) Zubereitung der Testverbindung
Verbindung 1 wurde in Salzsäure aufgelöst, im gleichen Medium wie oben verdünnt, mit 2 N NaOH neutralisiert und auf Konzentrationen von 1 ug/ml, 10 ug/ml, 30 ug/ml und 100 ug/ml eingestellt.
(c) Pharmakologischer Test
Die in (a) oben hergestellten Zellen und die in (b) oben zubereitete Testverbindung (Endkonzentration: 1 ug/ml, 10 ug/ml, 30 ug/ml oder 100 ug/ml) wurden in die Vertiefungen einer Kulturplatte mit 12 Vertiefungen (Costar) gegeben. Dann wurden 50 ul/Vertiefung einer HIV-Suspension zur Infizierung der Zellen in jede Vertiefung hinzugegeben, gefolgt von einer 3-tägigen Inkubierung bei 37ºC in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Als Kontrolle wurde das Medium ohne Zugabe der Testverbindung verwendet. Nach Beendigung der Inkubierung wurde die Zellsuspension in jeder Vertiefung herangezogen, und die lebensfähigen Zellen wurden gezählt.
Die Zellsuspension in jeder Vertiefung wurde dann zentrifugiert (1500 U.p.M · 5 min), und 750 ul Kulturüberstand wurde erhalten.
Der oben erhaltene Kulturüberstand, 750 ul, wurde in ein Eppendorfröhrchen (1,8 ml) gegeben, und 4 M NaCl und PEG-6000 (Sigma) wurden hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 0ºC für 2 h zur Ausfällung des Virus reagieren gelassen, und das Virus wurde durch Zentrifugieren (15000 U.p.M. · 20 min) geerntet. Zu diesem Viruspellet wurden eine Lösung I [50% Glycerin (Wako Pure Chemical), 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM KCl, 0,025% Triton X-100 (Sigma) und 5 mM DTT (Sigma)] und eine Lösung II [0,9% Triton X-100 (Sigma) und 1,5 M KCl] zur Lyse bei 0ºC für 30 min hinzugegeben. Zur resultierenden 10 ul-Virus-Lösung wurden 5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA, Sigma), 1 M Tris-HCl, 100 mM DTT (Sigma), 1 M KCl, 10 mM Poly A (Sigma), 0,15 mM TTP (Sigma), 200 mM MgCl&sub2;, 0,15 mM Oligo(dt) (NEN) und [³H]-TTP (NEN) hinzugegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC für 1 h reagieren gelassen. Die Reaktion wurde dann angehalten, indem die Mischung in Eis gegeben wurde, und die Gesamtmenge wurde punktförmig auf einen Membranfilter (DE-81 Filter, Whatman) aufgetragen und getrocknet. Nach dem Trocknen wurde der Filter dreimal mit 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4; gewaschen und in Ethanol gespült und getrocknet. Die Radioaktivität des in die DNA aufgenommenen [³H]-TTP auf der Membran wurde mit einem Flüssigkeits- Szintillationszähler gezählt, um die Aktivität der reversen Transkriptase zu bestimmen (Einheit, cpm (Impulse/min)).
Die oben gefundene Zahl lebensfähiger Zellen (· 10&sup4; Zellen) und die Aktivität der reversen Transkriptase (cpm) sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
Aus Tabelle 8 wurde offenbar, daß die Wirkstoffverbindung dieser Erfindung (Verbindung 1) nicht nur das Zellwachstum inhibiert, sondern ebenfalls die Aktivität der reversen Transkriptase deutlich bei Dosen von 30 ug/ml und 100 ug/ml inhibiert.
Die Ergebnisse der obigen pharmakologischen Testbeispiele 6 und 7 zeigen, daß die als Wirkstoff dieser Erfindung verwendete Verbindung eine hohe Antiretrovierus-Aktivität aufweist.

Pharmakologisches Testbeispiel 8

Effekt der Wirkstoffverbindung dieser Erfindung in einem Tiermodell zur Autoimmunkrankheit

W/BF&sub1;:(NZW X BXSB)F&sub1;-Mäuse sind Mäuse mit einer spontanen Autoimmunkrankheit. Sie sind als Tiermodell für Lupus nephritis bekannt, der mit hoher Häufigkeit von Hypertonie und Myokardinfarkt begleitet wird [L. M. Hand et. al., J. Exp. Med., 154, 216-221 (1981)]. Sie entwickeln Anti- Blutkörperchen-Antikörper mit zunehmenden Alter, was sich durch deutliche Thrombopenie zeigt, und werden als Tiermodell für Purpura thrombopenica ("idiopathic thrombocytopenic purpura", ITP) ebenfalls verwendet [N. Oyaizu et al., J. Exp. Med. 167, 2017-2077 (1988)]. Es wurde berichtet, daß mehr als 90% der Modelltiere an Myokardinfarkt oder Nierenversagen innerhalb 8 Monaten nach Geburt sterben [S. Ikehara, Metabolism and Disease, (Suppl) 26, 169-176 (1989)].
Die lebensverlängernde Wirkung der Verbindung 1 dieser Erfindung und die Wirkungen der gleichen Verbindung auf die Blutzellen und Anti-Blutplättchen-Antikörper wurden in diesen W/BF&sub1;:(NZW · BXSB)F&sub1;-Mäusen untersucht.
W/BF&sub1;:(NZW · BXSB)F&sub1;-Mäuse wurden im Alter von 14 Wochen verwendet (gekauft von Kiwa Experimental Animal). Gruppen von 10 Mäusen wurden in jedem Experiment verwendet.
Den Mäusen in den jeweiligen Gruppen wurde eine Diät (Oriental Yeast), die gewöhnlich dieser Art Mäuse gegeben wird, und Wasser verabreicht.
Verbindung 1 (Chargen-Nr. 9D87M) wurde als Suspension in einer 0,5%igen Lösung von Carboxymethylcellulose (CMC, Cellogen) verwendet. Verbindung 1 wurde an die Mäuse durch eine künstliche orale Sonde in Dosen von 100 und 300 mg/kg Körpergewicht/Tag für 6 Wochen vom Alter von 14 Wochen bis zum Alter von 20 Wochen gemäß einem 5-tägigen Verabreichungs- und 2-tägigen Einstellungsplan verabreicht. Als Kontrolle wurde eine unbehandelte Gruppe bereitgestellt.
(1) Zur Untersuchung des lebensverlängernden Effekts wurden die Tiere auf Überleben oder Tod vom Alter von 14 bis 20 Wochen beobachtet. Eine statistische Analyse wurde durch den verallgemeinerten Wilcoxon-Test bezüglich der unbehandelten Gruppe durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
In der Figur stellt die Ordinate die Überlebensrate (%) dar, und die Abszisse stellt das Alter in Wochen (14 Wochen bis 20 Wochen) dar.
Wie aus der Figur ersichtlich, trat in der Gruppe, der 100 mg/kg/Tag der Verbindung 1 dieser Erfindung gegeben wurde, kein Todesfall bis zum Alter von 20 Wochen auf. In der Gruppe mit 300 mg/kg/Tag wurden zwei Tiere im Alter von. 18 Wochen tot aufgefunden. In der unbehandelten Gruppe wurden zwei, eins und drei Tiere im Alter von 17, 18 bzw. Wochen tot aufgefunden. Somit wurde der lebensverlängernde Effekt der Wirkstoffverbindung dieser Erfindung (Verbindung 1) in einem Mäusemodell einer Autoimmunkrankheit bestätigt.
(2) Zur Blutzellanalyse wurden Blutproben aus dem Augenhintergrund im Alter von 14, 16, 18 und 20 Wochen entnommen. Änderungen im Blutbild (weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen und Blutplättchen) wurden unter Verwendung eines automatischen Blutzellenanalysators (Coulter JR, Coulter) bestimmt. Die differenziellen Zahlen (Neutrophile und Lymphozyten) wurden unter Verwendung von mit Wright- Giemsa-Lösung angefärbten Blutabstrichen bestimmt. Zur statistischen Analyse wurde der Student-t-Test an jedem Blutprobenentnahmetag verwendet, wobei die unbehandelte Gruppe als Kontrolle herangezogen wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9
*: P < 0,05 **: P < 0,01
Wie im oben genannten Bericht von Ikehara beschrieben, ist das hämatologische Merkmal von W/BF&sub1;-Mäusen die Entwicklung von Leukozytose und Thrombopenie mit zunehmen Alter. Sowohl in der unbehandelten Gruppe als auch in der Gruppe, der die Verbindung 1 dieser Erfindung gegeben wurde, neigte die weiße Blutkörperchenzahl zur Zunahme mit dem Alter, was anzeigt, daß die Verbindung dieser Erfindung keinen Effekt auf diesen Parameter hat. Die Blutplättchenzahl in der unbehandelten Kontrollgruppe begann im Alter von 14 Wochen anzusteigen (1144,5 ± 121,3/mm³) und nahm im Alter von 20 Wochen auf ca. ein Fünftel (228,0 ± 90,0/mm³) der Zahl ab, die im Alter von 14 Wochen gefunden wurde. Jedoch begann in der Gruppe, der 300 mg/kg/Tag der Wirkstoffverbindung dieser Erfindung (Verbindung 1) gegeben wurde, eine Inhibierung der Abnahme der Blutplättchenzahl direkt nach Behandlungsbeginn aufzutreten, und eine signifikante Inhibierung wurde im Vergleich zur unbehandelten Gruppe (228,0 ± 90,0/mm³) im Alter von 20 Wochen (823,3 ± 24,5/mm³) gefunden. Ein ähnliches Ergebnis wurde für die rote Blutkörperchenzahl gefunden.
(3) Oyaizu et al. haben berichtet, daß in W/BF&sub1;-Mäusen die Thrombopenie mit dem Auftreten von Anti-Blutplättchen- Antikörpern verbunden ist. Da die Verabreichung der Verbindung 1 der Erfindung, wie oben unter (2) erwähnt, eine Abnahme der Blutplättchenzahl inhibierte, wurde der Assay der Anti-Blutplättchen-Antikörper im Alter von 20 Wochen durchgeführt.
Die aus Balb/c-Mäusen gewonnen Blutplättchen und das aus bis zum Alter von 20 Wochen behandelten W/BF&sub1;-Mäusen gewonnene Plasma wurden zusammen bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Die Mischung wurde zweimal gewaschen und mit FITC- markiertem Anti-Maus-IgG (Tago, Code Nr. 6250) umgesetzt, und nach Anfärbung wurden die Anti-Blutplättchen-Antikörper mit einem FACS-Analysator untersucht (EPICS-Profile II, Coulter). Die negative Kontrolle wurde so eingestellt, daß das Plasma von Balb/c-Mäusen zu 98% negativ war. Die positive Rate jeder Probe wurde bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10
In der Tabelle bedeutet N. T. "nicht getestet" wegen des Todes zum Zeitpunkt der Bestimmung. Die Zahlen stellen die positiven Raten (%) dar.
Die Tabelle zeigt, daß die positive Rate 13,2 ± 2,7% in der Gruppe war, der 100 mg/kg/Tag der Wirkstoffverbindung dieser Erfindung (Verbindung 1) gegeben worden war, und 10,7 ± 2, 2% in der Gruppe mit 300 mg/kg/Tag, wohingegen die positive Rate in der unbehandelten Gruppe 19,6 ± 5,5% war, was eine dosisabhängige Inhibierung der Anti-Blutplättchen-Antikörper zeigt.
Wie oben erwähnt ist die W/BF&sub1;-Maus ein Tiermodell für spontane ITP für menschliche chronische ITP. Diese Tiere entwickeln Lupus nephritis drei Monate oder später nach der Geburt, und mehr als 90% von ihnen sterben an Myokardinfarkt oder Nierenversagen vor dem Erreichen von 8 Monaten nach Geburt. Es wurde berichtet, daß diese Mäuse durch Transplantieren von Knochenmark aus normalen Balb/c-Mäusen behandelt werden können [S. Ikehara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 2483-2487 (1985); R. Yasumizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 6555-6557 (1987); S. Ikehara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 56, 3306-3310 (1989)]. Auch in der klinischen Praxis wird als die effektivste heute erhältliche Behandlungsmodalität für ITP die Knochenmarkstransplantation angesehen.
Wie aus den Ergebnissen (1) bis (3) oben ersichtlich ist, übt die Wirkstoffverbindung dieser Erfindung einen signifikanten lebensverlängernden Effekt in W/BF&sub1;-Mäusen aus und inhibiert die Thrombopenie aufgrund des Auftretens von Anti- Blutplättchen-Antikörpern, was ein hämatologisches Merkmal dieses Stammes von Mäusen ist, was zeigt, daß die Verbindung einen die Autoimmunkrankheit verbessernden Effekt hat.

Pharmakologisches Testbeispiel 9

Thrombopenie-verbessernder Effekt

1) Zubereitung der Testverbindung
Verbindung 1 wurde in 1 N Salzsäure aufgelöst und mit Rinderfötusserum (FCS, Gibco) zum Erhalt einer 1 mg/ml-Lösung verdünnt. Diese Lösung wurde zu mit 10% FCS ergänztem RPMI-1640-Medium (Flow Laboratories) hinzugegeben, und die Mischung wurde mit 1 N NaOH neutralisiert und auf eine Konzentration von 30 ug/ml vor der Verwendung eingestellt.
2) Zubereitung von CMK-Zellen
CMK-Zellen wurden von T. Sato et al. von Patienten mit akuter megakaryozytischer Leukämie eingeführt. Es ist bekannt, daß sie mit Anti-Blutplättchen-Antikörpern reagieren (Anti- Glykoprotein IIb/IIIa-Antikörper, Anti-Glykoprotein Ib- Antikörper und Plt-1-Antikörper). Ferner weisen sie Megakaryozyten-artige Eigenschaften auf, wie die Bildung von α-Granula und eine Abgrenzungsmembran im Cytoplasma. Deshalb wurden diese Zellen zur Analyse des Wachstums und der Differenzierung von Megakaryozyten verwendet [T. Sato et al., Exp. Hematol., 15, 495 (1987); S. Sunami et al., Blood, 70, 368 (1987); N. Komatsu et al., Blood, 74(1), 42-48 (1989); A. Fuse et al., British J. Haematology, 77, 32-36 (1991); Acta Haematologia Japonica 53(2), 294-295, 317-318 (1990)].
CMK-Zellen wurden von Dr. Takeyuki Sato vom Department of Pediatrics, Chiba University School of Medicine, zur Verfügung gestellt. Die Zellen, 5 · 10&sup4; Zellen/ml, wurden in mit 10% FCS ergänztem RPMI-1640-Medium kultiviert und alle vier Tage subkultiviert.
3) Effekt der Verbindung 1 auf die Expression von Blutplättchen-assoziiertem Antigen von CMK-Zellen
CMK-Zellen (1 · 10&sup5; Zellen/ml) wurden in mit 10% FCS versetztem RPMI-1640-Medium, das 30 ug/ml Verbindung 1 enthielt, für 4 Tage inkubiert, und die Expression des Blutplättchen-assoziierten Antigens auf der Zelloberfläche wurde durch Flußcytometrie (Coulter) unter Verwendung eines FITC-markierten Plt-1-Antikörpers (Coulter) bestimmt. Das keine Verbindung 1 enthaltende Medium wurde als Lösungsmittelkontrolle verwendet.
Zur Analyse des Zelloberflächenantigens wurden 1 · 10&sup6; Zellen/100 ul der CMK-Zellen in ein Röhrchen (Fischer) überführt und mit 5 ul FITC-markiertem Plt-1-Antikörper bei 4ºC für 30 min umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dreimal mit 0,1% Rinderserumalbumin enthaltendem Phosphatpuffer gewaschen und auf den Prozentgehalt der positiven Zellen und die Fluoreszenzintensität hin untersucht.
Der oben genannte Plt-1-Antikörper (Coulter) ist ein Antikörper, der das Blutplättchen-assoziierte Antigen, Glykoprotein IIb/IIIa, erkennt, und es wurde berichtet, daß er mit Differenzierung oder Reifung von CMK-Zellen zunimmt [N. Komatsu et al., Blood, 74(1), 42-48 (1989)].
Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11
Die Tabelle zeigt, daß ca. 96% der verwendeten CMK-Zellen solche Zellen sind, die für das durch den Plt-1-Antikörper erkannte Blutplättchen-assoziierte Antigen positiv sind. Die Zugabe von 30 ug/ml der Verbindung 1 verursachte keine Änderung im Prozentanteil der positiven Zellen.
Jedoch zeigt die Analyse der mittleren Fluoreszenz- Intensität, die das Maß der Antigen-Expression pro Zelle darstellt, daß bei Verwendung der mittleren Fluoreszenz- Intensität der Lösungsmittelkontrollzellen als 100% die Intensität der mit 30 ug/ml der Verbindung 1 behandelten Zellen ca. 191% war. Es ist somit ersichtlich, daß die Zugabe der Verbindung 1 in einer 2-fachen Zunahme der Expression des Blutplättchen-assoziierten Antigens, das vom Plt-1-Antikörper erkannt wird, auf der Oberfläche der CMK- Zellen resultierte.
4) Morphologische Untersuchung der CMK-Zellen
CMK-Zellen (1 · 10&sup5; Zellen/ml) wurden in mit 10% FCSversetztem RPMI-1640-Medium, das die Verbindung 1 enthielt, für 4 Tage inkubiert und auf die Morphologie der Zellen hin unter dem Phasenkontrastmikroskop untersucht. Eine Portion der Zellpopulation wurde genommen, und eine Cytospin- Zubereitung wurde hergestellt und mit Wright-Giemsa-Lösung zur Bestimmung der Zellmorphologie angefärbt.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 4 bis 7 dargestellt. So sind die Fig. 4 und 6 die Phasenkontrast-Mikrophotographie bzw. angefärbte Karte des Kontrollmediums, und die Fig. 5 und 7 stellen die entsprechenden Abbildungen für mit 30 ug/ml der Verbindung 1 behandelten Zellen dar.
In den mit 30 ug/ml der Verbindung 1 dieser Erfindung behandelten Zellen zeigt die Phasenkontrast-Mikrophotographie die Fragmentierung von Zellen wie im Prozeß der Blutplättchenerzeugung. Die angefärbte Karte zeigt die Knospung der Zellmembran und die Lappenbildung der Kerne in den mit Verbindung 1 dieser Erfindung behandelten Zellen.
Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen, daß das Carbostyril- Derivat, der Wirkstoff dieser Erfindung, die Expression von Blutplättchen-assoziiertem Antigen auf der Oberfläche von CMK-Zellen erhöht, die Fragmentierung von Zellen wie im Prozeß der Blutplättchenerzeugung verursacht und zusätzlich die Knospung der Zellmembran und Lappenbildung der Kerne von Zellen verursacht, und sie lassen vermuten, daß die Verbindung die Differenzierung oder Reifung von CMK-Zellen fördert. Es wird deshalb erwartet, daß Verbindung 1 auf Promegakaryozyten oder Megakaryozyten zur Förderung ihrer Differenzierung und Reifung aufgrund dieser charakteristischen Effekte wirkt und dadurch die Blutplättchen-Erzeugung stimuliert und die Thrombopenie lindert.

Pharmakologisches Testbeispiel 10

Therapeutischer Effekt auf eine Autoimmunkrankheit

Gruppen von fünf weiblichen MRL/Mp-lpr/lpr-Mäusen (erworben im Alter von 7 Wochen von Charles River Japan, Inc.) wurden im Alter von 19 Wochen verwendet.
Mäuse des obigen Stammes sind für die spontane Entwicklung von Autoimmunkrankheiten bekannt, wie menschlicher systemischer Lupus erythematosus (SLE)-artiger Immunkomplex, Glomerulonephritis, Lymphom, Vaskulitis und Polyarthritis (A. Theofilopolos und F. J. Dixon, Adv. Immunology, 37, 269 (1985); E. D. Murphy, J. B. Roths, Autoimmunity and lymphoproliferation, Elsevier North Holland, New York, 207-221 (1978); Y. Taniguchi, Gendai Iryo, 21, 131 (1989); C. Abe).
Mäuse in sowohl der mit Verbindung 1 behandelten Gruppe als auch in der Kontrollgruppe (unbehandelte Gruppe) wurde eine Mausdiät (Oriental Yeast) und Wasser verabreicht.
Verbindung 1 wurde als Suspension in 0,5%iger Carboxymethylcellulose-Lösung (CMC, Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) verwendet.
Verbindung 1 wurde durch eine künstliche orale Sonde in einer Dosis von 300 mg/kg Körpergewicht täglich vom Alter von 19 Wochen an bis zum Alter von 25 Wochen gemäß einem 5-tägigen Verabreichungs- und 2-tägigen Unterbrechungsplan verabreicht (mit Verbindung 1 behandelte Gruppe).
Mäuse in den jeweiligen Gruppen wurden auf Änderung im Urinprotein, Lymphom-Durchmesser, Vaskulitis des Ohrs und Haarverlust untersucht.
Als Ergebnis zeigte die mit Verbindung 1 behandelte Gruppe eine Tendenz zur Inhibierung der Zunahme des Urinproteins im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bezüglich der Lymphom-Größe betrug der Durchmesser in der mit Verbindung 1 behandelten Gruppe 7,8 ± 1,3 mm gegenüber 9,0 ± 0,8 mm in der Kontrollgruppe, was anzeigt, daß die Lymphomknotenschwellung geringfügig inhibiert wurde.
Fig. 8 vergleicht das Ausmaß von Vaskulitis, Haarverlust und Lymphknotenschwellung zwischen den Gruppen.
Die Figur zeigt Verbesserungen bei Vaskulitis und Haarverlust und eine Reduktion der Lymphknotenschwellung in der mit Verbindung 1 behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen, daß erwartet werden kann, daß die Verabreichung der Verbindung 1 die Autoimmunkrankheit auf der Grundlage ihrer Apoptose- modifizierenden Wirkung verbessert.

Pharmakologisches Testbeispiel 1

Effekt auf PC12-Zellen

PC12-Zellen, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (D-MEM) subkultiviert wurden, das mit 5% hitzeinaktiviertem (56ºC, 30 min) Pferdeserum und 10% Rinderfötusserum (FCS) ergänzt wurde, wurden auf Collagen-beschichtete Kunststoff- Petrischalen (35 mm Durchmesser) mit einer Konzentration von 6 · 10&sup4;-Zellen/3 ml Medium überführt. Am Tag 2 der Übertragung wurde das Kulturmedium gegen mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindung 1, von Nervenwachstumsfaktor (NGF, Wako Pure Chemical) oder FCS (Kontrolle) ergänztem D-MEM ersetzt, und die Kultur wurde weiter fortgesetzt. Die Zellen wurden auf morphologische Veränderungen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop am Tag 3 untersucht.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 9 und 10 gezeigt.
In Fig. 9 stellt die obere Reihe die Kontrollgruppe dar, in der allein FCS hinzugegeben wurde, und die untere Reihe stellt die Gruppe mit 30 ug/ml der Verbindung 1 dar. Wie aus der Figur ersichtlich ist, wird die typische morphologische Veränderung (d. h. die Bildung von nervenfaserartigen Prozessen) in der unteren Reihe im Gegensatz zur oberen Reihe gefunden, und die deutlichste Bildung von nervenfaserartigen Prozessen wird in Gegenwart von FCS 0,3% (unten links) beobachtet. Wenn die Konzentration von FCS erhöht wurde, erschienen Zellen unterschiedlicher Formen (unten, Mitte und rechts). So wurden morphologische Veränderungen in 30 bis 50% der Gesamtzellpopulation induziert.
In Fig. 10 stellt die obere Reihe die Gruppe mit allein NGF dar (jedoch wurde 0,3% FCS hinzugegeben), und die untere Reihe stellt die Gruppe mit 30 ug/ml der Verbindung 1 dar. Diese Figur zeigt, daß wie die Bildung von nervenartigen Prozessen aufgrund von NGF-Stimulierung, wie sie in der oberen Reihe gesehen wird, die Bildung von nervenartigen Prozessen in der Gruppe der Verbindung 1 ebenfalls beobachtet wird. Die untere Reihe zeigt, daß die Kombination von Verbindung 1 und NGF (jedoch in Gegenwart von 0,3% FCS) die Ausdehnung des Prozesses im Vergleich zu Verbindung 1 oder NGF allein fördert.

Pharmakologisches Testbeispiel 12

Effekt auf Leberversagen

Hitzegetötete Zellen von P. acnes (eine Spende von Dr. Mizoguchi, Third Departmend of Internal Medicine, Osaka City University School of Medicine) wurden intravenös in einer Dosis von 3 mg/Körper an männliche Balb/c-Mäuse verabreicht (7 Wochen alt, erworben von Japan SLC). Sieben Tage später wurden einer Lösungsmittelgruppe (0,5% CMC, Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) und einer unbehandelten Gruppe ebenso wie den Testgruppen 10 oder 100 mg/kg der Verbindung 1 oral verabreicht. Eine Stunde nach der Verabreichung der Verbindung 1 wurden 5 mg/Körper von Lipopolysaccharid (LPS, Sigma Co., Ltd.) intravenös zur Induzierung von akutem Leberversagen verabreicht.
Die Mäuse in den jeweiligen Gruppen wurden auf die Überlebensrate bis zu 7 Tage nach der LPS-Verabreichung beobachtet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 11 gezeigt.
Wie die Figur zeigt, betrug die Überlebensrate 30% für die Gruppe mit 10 mg/kg der Verbindung 1 (Testgruppe) und 70% für die Gruppe mit 100 mg/kg der Verbindung 1 (Testgruppe). Im Gegensatz betrugen die Überlebensraten für die unbehandelten und Lösungsmittel-Gruppen 0 bzw. 10%. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verbindung 1 einen dosisabhängigen und ausgezeichneten lebensverlängernden Effekt im Modell der akuten Hepatitis ausübt.

Pharmakologisches Testbeispiel 13

Effekt von B16-Melanomzellen auf ein experimentelles Modell zur Lungenmetastase.

B16-Maus-Melanomzellen [S. Koren und W. R. Fleischmann, J. Interferon Research, 6, 473-482 (198)], 2 · 10&sup6; Zellen, wurden in mit 10% FBS (Gibco) ergänztem Eagle-MEM-Medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) suspendiert, dem zuvor 3 oder 10 ug/ml der Verbindung 1 hinzugegeben worden waren oder nicht. Die Suspension wurde in einem 75 ml Kolben (Corning) in einem Inkubator (National Appliace Model 15300) bei 37ºC unter 5% Kohlendioxid für 4 Tage kultiviert. Dann wurden die Zellen mit Dulbecco-PBS-Lösung (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) gewaschen, und 0,05% Trypsin (Flow Laboratories) wurde zum Ablösen der Zellen aus dem Kolben hinzugegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren zweimal gewaschen (Hitachi 05PR-22, 1200 U.p.M., 5 min), und nach Zugabe von 0,2% Trypanblau (Wako Pure Chemical Industries Ltd.) wurden die lebensfähigen Zellen unter Verwendung einer Blutkörperchenzählkammer gezählt (Nr. J7796 Kayagaki Works), und die Zellen wurden mit Hank-Lösung (Flow Laboratories) auf eine Konzentration von 5 · 10&sup6; Zellen/ml verdünnt.
Die oben erhaltenen Zellen wurden in einer Population von jeweils 3 · 10&sup5; Zellen in Gruppen von 7 C57BL/6-Mäusen (7 Wochen alt, weiblich, erworben von Charles River Japan, Inc.) durch die Schwanzvene transplantiert. Zwölf Tage später wurden die Mäuse durch Genickdislokation getötet, und die Anzahl der in die Lungen metastasierten Kolonien wurden bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 12 und in Tabelle 12 unten gezeigt. Tabelle 12
*: P < 0,05 (Student-t-Test)
Wie aus der Figur und der Tabelle ersichtlich ist, wurde eine deutliche Inhibierung der Lungenmetastase in beiden Gruppen gefunden, in denen die im 3 oder 10 ug/ml der Verbindung 1 enthaltenden Medium inkubierten Zellen transplantiert worden waren.
Die Apoptose-regulierende Zusammensetzung der Erfindung kann effektiv als Krebs-Chemotherapeutikum aufgrund ihrer charakteristischen Apoptose-regulierenden und die Zelldifferenzierung induzierenden Aktivitäten verwendet werden. Die Zusammensetzung ist ebenfalls effektiv als Therapeutikum für AIDS, ARC, ATL, andere verwandte Krankheiten und HTLV-I-assoziierte Krankheiten aufgrund ihrer Antiretrovirus-Aktivität, als Therapeutikum für Autoimmunkrankheiten aufgrund ihrer lebensverlängernden Aktivität bei Autoimmunkrankheiten, als Therapeutikum für Thrombopenie aufgrund ihres Effekts der Erhöhung der Expression von Blutplättchen-assoziierten Antigenen, als Therapeutikum für Alzheimer-Krankheiten, als Therapeutikum für Hepatitis aufgrund ihrer lebensverlängernden Aktivität in der Hepatorgie und als inhibierendes Mittel von Lungenmetastase.

Claims

1. Verwendung wenigstens eines Carbostyril-Derivats der allgemeinen Formel (1)

worin R eine Benzoyl-Gruppe ist, die optional Niederalkoxy-Gruppen am Phenyl-Ring als Substituenten aufweisen kann, und worin die Kohlenstoff-Kohlenstoff- Bindung in den 3- und 4-Positionen des Carbostyril- Gerüsts eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung ist; oder von Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die bewirkt werden durch Stimulierung und/oder Inhibierung der Apoptose, bei der therapeutischen Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten, Thrombopenie, Alzheimer-Krankheit, Hepatitis, bei der Inhibierung von Tumormetastasen oder als Antiretrovirus-Mittel.