WO1993000902A1

WO1993000902A1 - Apoptosis regulator

Info

Publication number: WO1993000902A1
Application number: PCT/JP1992/000841
Authority: WO
Inventors: Satoru Nakai; Koutoku Aihara; Hitomi Mori; Michiaki Tominaga; Masakazu Adachi; Hiroyuki Ichikawa; Seiji Akamatsu; Fumio Saito
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1991-07-03
Filing date: 1992-07-02
Publication date: 1993-01-21
Also published as: EP0552373A4; CA2090876A1; US5872120A; TW229157B; US5798358A; US5925640A; DE69230131D1; US5672603A; AU2231792A; EP0552373B1; MX9203950A; KR100196368B1; AU648690B2; DE69230131T2; EP0552373A1; KR930702002A; HK1004469A1; DK0552373T3; ES2138971T3; US5916890A

Description

明細書

アポトーシス調整剤，技術分野

本発明は、新しいアポトーシス調整剤に関する。

背景技術

本発明のアポトーシス調整剤は、下記一般式（ 1 ) で表わされるカルボスチリル誘導体（以下「化合物（ 1 ) 」という）及びその塩から選ばれる少なくとも 1種を有効成分とするものである。

( 1 ) 一般式

〔式中 Rはフェニル環上に置換基として低級アルコキシ基を有することのあるベンゾィル基を示す。カルボスチリル骨格の 3位と 4位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。〕

上記化合物（ 1 ) 及びその製法については、例えば特公平 1 一 4 3 7 4 7号公報に記載されており、これが強心剤として有用であることも公知である。

本発明者は、上記化合物（ 1 ) にっき、更に研究を続けた結果、これがその有している上記公知作用からは予想困難な制癌作用、細胞の分化誘導能等を始めとするァポト一シス調整（抑制乃至促進）作用を有していることを見い出した。

しかして従来より、細胞死は 2つのタイプのメカニズムにより起こるとされている。そのひとつは壊死と呼ばれてきた古典的細胞死である。これは形態学的には、ミトコンドリアの著しい膨化、細胞質の膨化、核の変性とそれに続く細胞の崩壊及び自己融解により特徵付けられ、受動的及び偶発的に生じる。組織壊死は、細胞に対する物理的外傷や化学的毒物等により一般に認められる。

もうひとつのタイプはアポトーシス（プログラムされた細胞死）と呼ばれる（Kerr. J. F. R. and Wyl 1 ie, A. H. , Br. J. Cancer, 239 (1972) ) 。これは生理学上の種々の条件下に起こるとされている。その形態学的特徵としては、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、ェンドヌクレアーゼの活性に関連したク口マチンの凝縮及び核凝縮、核の分節化等を挙げることができ、更に細胞表面の微絨毛の消失、細胞表面の平滑化（細胞表面の水疱形成： membrance b 1 ebb i ng) 等も観察され、またェンドヌヌクレアーゼ活性により、 D N Aのヌクレオソ一厶単位が 1 8 0〜 2 0 0塩基長の D N Aに断片化する現象も観察され、アポティック体の細胞の最終断片は隣接する細胞により貧食される機構として論じられている (Duva 11, E. a n d Wy 11 i e, A. H. , Immunology Today, 7 (4), 115 - 119 (1986) ： Science, 245, 301 - 305

上記ウイリーはまたダルココルチコィドにより誘発される胸腺細胞のアポトーシスが、細胞内のェンドヌクレアーゼの活性化を伴うことを報告している（Wyl 1 ie， A. H.， Nature, 284, 555 - 556 ( 1986) ) 。エンドヌクレアーゼ活性によりアポトーシスを受ける細胞の D N Aは、オリゴヌクレオチドレベルまで断片化され、これはァガロースゲル電気泳動を行なうことにより容易に確認できる。

上記アポトーシスとは、発生や分化や組織のターンォ一バーの過程でみられる、予めプログラムされた細胞死であると考えられる（Wy 11 i e, A. H.， e t a 1. , Int. Rev. Cytol. , 68, 251 - 306 ( 1980) ) 。

また、胸腺細胞ではカルシウムィオノファでカルシゥム濃度を上昇させたり、 c AM P濃度を上昇させたりすると、上記アポトーシスに特徵的な D N Aの断片化が促進される（Wy 11 i e， A. H. , e t a 1. , J. Pathol. , 142, 67 - 77 (1984)) ことから、アポトーシスのメカニズムに、力ルシゥムイオンや c A M Pの関与が推測されている。更にレチノィン酸ゃ力ルシゥムィオノファにより分化誘導される H L— 6 0細胞のァポト一シスが、上記の例として報告されている（Ma r t i n, S. ， e t a 1. , J. Immu no 1. , 145, 1859 - 1867 (1990) ： Martin, S. J. , et a 1. , Clin. Exp. Immunol. , 79, 448 - 453 (1990) ) 。

上記アポトーシスは、胚発生過程や正常の細胞回転の盛んな細胞（例えば肝、副腎皮質、前立腺等）にみられる生理的細胞死から、ダルココルチコィド処理、サイトトキシック一 T細胞による細胞障害、ホルモン依存性組織の萎縮、放射線照射、 N K細胞、キラー細胞、腫瘍壞死因子（T N F) 、リンホトキシン（L T) 等のサイト力イン類等によっても誘導されると報告されている

(Wyl lie, A. H. , et al. , Int. Rev. Cytol. , 68, 251 (1980) ： Du v a 11, E. a" Wyl lie, A. H.， Immunology Today, 7, 115 - 119 ( 1986 ) ： Se 11 i ns, K. S. , et a 1. , J. Immunol. , 139, 3199 (1987) ： Yamada, T. , et al. , Int. J. Radiat. Biol. , 53, 65 ( 1988) ： Wyll ie, A. H. , Nature, 284, 555 ( 1980) ： Schmi d, D. S. , et al. , P r o c. Na 11. A c a d. S c i . , USA, 83, 1881 - 1885 ( 1986) ： John, ， et al. , J, Immunol. , 129 (4), 1782 - 1787 (1982) ： Howel 1, D. M. , et a 1. , J. Immunol. , 140, 689 - 692 (1988) ： Gil lian, B. , et a 1. , Eur. J. Iimunol, H, 689 - 693 (1987) ) 。その他に、ある種の抗体、例えば抗 C D 3抗体、抗 A P O— I抗体、抗 F a s抗体等（Trau th, B. C.， e t a 1. , Science, 245，— 301 - 305 ( 1989 ) ： Smith, C. A. , e t a 1. , Nature, 337, 181 - 184 ( 1989) ： Tadakuma, T.， e t a 1.， Eur. J.

Immunol. ^1^779 ( 1990) ) でもアポトーシスが誘導され、悪性腫瘍での自然退縮（中村保夫他、臨床皮膚科， 11

(4 ) , 289 - 295 ( 1981 ) ) の所見においてもアポトーシスが確認されている。

一方、上記アポトーシスを抑制するものとしては、

R N A合成阻害剤であるァクチノマイシン D

(Actinomycin D)、蛋白合成阻害剤であるサイクロへキシミド（Cy c 1 ohex imi de)、カルシウムイオン（C a ^{2 +} ) キレート剤等が報告されており、その他に免疫抑制剤であるサイクロスポリン A、造血系サイトカイン（ I L一 3、 GM - C S F、 G— C S F等）、 I L— 2、 b c 1 — 2遺伝子産物等もアポトーシスを抑制すると報告されている (Cohen, J. J. J. Immunol, , 132, 38 ( 1984 ) ：

Wy I 1 i e, A. H. , et a 1. , J. Pathol. , 142, 67 ( 1984) ：

Shi, Y. , et a 1, , Nature, 339, 625 (1989) ； Wi lliams, G. T. , et al. , Nature, 343， 76 ( 1990) ： Ni e 1 o, M. A. , J. Immunol. , 143, 4166 (1989) ： Vaux, D. L. , et al. , Nature, 335, 1440 (1988)) 。但し、上記シクロへキシミドは急性白血病細胞に、ァクチノマイシン Dは小腸陰窩細胞に、両者が H L— 6 0細胞にそれぞれアポトーシスを誘導する報告 (Mar t i n, S. J. , e t a 1. , J. Immuno 1. , 145, 1859 - 1867 (1990)) がある。逆にサイクロへキシミドは、 X線照射前に存在し、 X線照射により増加したリンパ球系腫瘍細胞のアポトーシスを抑制し、ァクチノマィシン Dが上記アポトーシスを増加させる旨の報告もあり、アポトーシスの抑制又は促進には、細胞の種類ゃ条件、その他の機序の関与も示唆されている（五十嵐忠彦ら、日本血液学会誌、 11(2)， 144 (1988) ) 。いずれにせよ、細胞の分化、増殖、成熟がアポトーシスと密接な関係にあり、之等細胞の分化、増殖等に関与する作用を有する物質がアポト一シスにも関係すると考えられている。

また最近、アポトーシスに関連する治療法として、抗 A p o— I抗体による癌の治療も試みられている。骨髄異形成症候群（MD S ) の内で、汎血球減少が主体である不応性貧血（R A) 及び鉄芽球性貧血（R A R S ) では、造血細胞の分化誘導剤としてのレチノィン酸ゃ活性型ビタミン D。と、血小板産生細胞の過剰アポトーシスを抑制するアポトーシス調節剤としての GM— C S Fや I L— 3の併用が望ましく、また同 MD Sの内、芽球の増殖が優勢な R A E Bゃ該 R A E Bの移行期（R A E B - t ) では、上記レチノィン酸ゃ活性型ビ夕ミン0₃ が、造血細胞の芽球への分化を誘導する分化誘導剤として、またエトポジド（ e p 0 s i d e ) やアクラルビシン

(aclarubicin ) が芽球の増殖を抑制（アポトーシス促進）するアポト一シス調節剤として、それぞれ働くとされている ( S h i b u y a, T. , J. Clinical a n d Experimental Medicine, 160 (5 ), 319 - 323 (1992) ) 。

また、ムラカミらは抗赤血球自己抗体を発現しているトランスジヱニックマウスの約半数が自己のトレランスの消失により自己免疫疾患を発症するとし、正常マウスのような自己抗原と自己抗体産生細胞の反応によるアポトーシス誘導による自己抗体産生細胞の除去能の欠如によると報告している（Murakami, M. , et al. , Nature, 357, 77 - 80 (1992 )) 。

ワタナベ一フクナガらは MR L 1 p r / 1 p r マウスにおいては、アポトーシスに関与する F a s分子に異常があり、胸腺における自己反応性 T細胞のネガティブセレクシヨン（アポトーシス）機構がうまく作動せず、その結果自己免疫疾患が発症すると示唆している

(Wa t anabe-Fukunaga, R. , et a 1. , ature, 356, 314 - 317 (1992) ) 。

モンタニェらは、 H I V—感染患者からの T リンパ球抽出物中には、 D Ν Αのアポプテツイックなバンドが観察され、この現象は無症候群の H I V感染患者の 9 0 %、 A I D S と A R C患者の 1 0 0 %に観察され、アポトーシスの誘導が H I V感染患者においても亢進していると報告している (Montagnier, L. , e t a 1. , S i x i em e

Co I 1 oque d e s Cent Gardes, 9-17 (1991) ) 。

ニヮトリ発生期の細胞死において、ニヮトリ胚に

N G F (nerve growth f actor ：神経細胞の神経節で細胞の肥大と神経繊維の伸長を促進する蛋白質）を前投与すると、この発生過程の神経細胞死は完全に抑制され

(Hamburger, V. , e t a 1. , J. Neurosci. , 60 ( 1981 ) ) 、逆に N G Fに対する抗体を投与すると、幼若な交感神経細胞の約 9 0 %が失われてしまうと報告されている

(Levi -Mo n t a 1 c h i n i, R. and Booker, B. , P r o c. Natl.

Acad. Sci. , USA, 4_6, 384 (1960)。

クラークは自然に起こる神経細胞死を 3つのタイプに区別し、その中のタイプ I の形態学的特徴がアポトーシスと一致し、更に成長因子除去による細胞死ではタイプ I の細胞死が起こり、 D N Aの断片化も起ることから、これをアポトーシスと考えている（Clark, P. G. H,，

Anat Embryol. , 181, 195 (1990) ： J. Neurosci. , 1^60 (1981) ： Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 46, 384

Rawson, C. L. , e t a 1. , J. Cel 1. Biol. , 113, 671 エドワーズらは N G Fにより交感神経細胞のプ口グラム死を抑制できると報告しており、アポトーシスが

N G Fにより抑制できると考えられる（Edwards, S. N. , et al. , J. Neurochemistry, 5J_(6), 2140 - 2143 ( 1991 ) ) 。

フィッシヤーらの報告によれば、老化して学習障害を持ったラッ卜に N G Fを投与すると、アルツハイマー病で障害を受けることが知られている前脳基底野コリン作動性神経細胞に該 N G Fが作用して、学習障害の回復がみられる（Fischer, W.， et a 1. , Nature, 329, 65 ( 1987) ： Ba rde Y-A, Neuron, 2^1525 ( 1989 ) ： Hatanaka, H. , Develop Brain Res. , 30, 47 (1986 ) ： Hatanaka, H. , et al. , Develop Brain Res. , 85 ( 1988) ) 。畠中らは、上記 N G Fが分化、成熟、生存維持、老化の防止に有効で、神経細胞の障害に対する保護回復作用、脳の老化に伴う神経疾患、特にアルツハイマー病での神経細胞死の防止作用を示す可能性を示唆している（畠中寛、代謝、 28, 891 - 899 ( 1991 )) 。

更に薬剤耐性ウィルス性肝炎の肝障害においては、薬剤又はウィルス感染により、直接的又は免疫的機序を介するアポトーシス亢進が、肝障害に関与していると考えられている（Bursh. W. , et al. , TiPS, 13, 245-251 (1992)) ο 一方、肝臓ではマイトジヱンによって肝細胞が増殖し、過形成状態をもたらすことが知られており、この状態は肝細胞の脱落壊死、即ちアポトーシスにより正常化される（Kerr， J. F. e t a 1. , Br. J. Cancer, 2_6, 239 - 257

(1972)) 。該アポトーシスは肝臓において、過形成肝、過形成性結節及び肝癌等で認められており（Columbano, A.， et a 1. , Lab. Invest. , 52, 670 - 675 ( 1985 ) ：

Co lumbano, A. e t a 1. , Am. J. Pathol. , 116, 441 - 446

、ケラーらはアポトーシスは炎症や線維増殖を伴わないと述べている（Kerr. J. F.， e t a 1. , Lancet, 2, 827 - 828 (1979) ) 。之等のことから、急性及び慢性肝炎に対してアポトーシスを抑制することができれば、之等肝炎の治療が可能と考えられる。また慢性肝炎が肝硬変肝癌に移行していく過程では、上記アポトーシスは抑制状態にあり、これがサイトトキシック T細胞による肝細胞の炎症に続く線維化、肝硬変へと進展するものと考えられ、該アポト一シスを促進させることができれば、肝炎の抑制及び肝硬変への進展が防止できると考えられる

発明の開示

本発明によれば、化合物（ 1 ) 及びその塩類から選ばれる少なくとも 1種を有効成分として含有するァポト一シス調整剤が提供される。本発明アポトーシス調製剤は、アポトーシス調整能を有しており、この作用に基づいて、例えば前述したように、制癌剤、抗レ卜ロウィルス剤、自己免疫疾患治療剤、血小板減少症治療剤、アルツハイマー病治療剤、肝炎、肝硬変等の肝疾患治療剤、癌転移抑制剤等として、医薬品分野で有効である。

上記化合物（ 1 ) を表わす一般式において、フニニル環上に置換基として低級アルコキシ基を有することのあるベンゾィル基としては、ベンゾィル、 2 —メトキシべンゾィル、 3 —メトキシベンゾィゾレ、 4 ーメトキシベンゾィル、 2 —エトキシベンゾィル、 3 —エトキシベンゾィル、 4 一エトキシベンゾィル、 4 一イソプロポキシベンゾィル、 4一へキシルォキシベンゾィル、 3， 4 — ジメトキシベンゾィル、 3 , 4 — ジェトキシベンゾィル、 3， 4 , 5 — トリメトキシベンゾィル、 2， 5 — ジメトキシベンゾィル等等のフヱニル環上に置換基として炭素数 1〜 6の直鎖又は分枝状のアルコキシ基を 1〜 3個有することのあるベンゾィル基を例示できる。

本発明において有効成分として用いる上記化合物（ 1 ) 中、特に好ましいものとしては、例えば 6 — [ 4 — ( 3 , 4 ージメトキシベンゾィル）一 1 — ピペラジニル] 一 3 , 4 ージヒドロカルボスチリル及びその塩を例示できる。上記有効成分化合物は、通常の酸を用いて容易に薬理的に許容される塩を形成させ得、之等の塩も遊離形態の化合物と同様に有効成分化合物として用いることができる。上記酸としては、硫酸、硝酸、塩酸、臭化水素酸等の無機酸及び酢酸、 p — トルエンスルホン酸、エタンスルホン酸、シユウ酸、マレイン酸、フマール酸、クェン酸、コハク酸、安息香酸等の有機酸を例示できる。

本発明アポトーシス調整剤の有効成分である化合物

( 1 ) は、通常、一般的な医薬製剤の形態で用いられる。かかる製剤は通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて調製される。この医薬製剤としては各種の形態が治療目的に応じて選択でき、この代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、点眼剤等が挙げられる。

錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシゥム、カオリン、結晶セルロース、ゲイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼ―ラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン糖の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第 4級アンモニゥム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロィド状ゲイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコ一ティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる o

丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知なるものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、夕ルク等の賦形^ アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナランカンテン等の崩壊剤等が例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコ一ル、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。

注射剤として調製される場合には、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものを全て使用でき、例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリォキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシェチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

更に本発明アポ卜一シス調整剤中には必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよい。

上記医薬製剤中に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常全組成物中 1〜 7 0重量％、好ましくは 1〜 3 0重量％含まれる量とするのが適当である。

上記医薬製剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合には経口投与される。また注射剤の場合には単独であるいはプドウ糖、ァミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更には必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与され、点眼剤の場合には目に適用される。

上記医薬製剤の投与量は用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常有効成分である化合物（ 1 ) の量は 1 日当り体重 1 kg当り約 0 . 5〜 3 0 mgとするのがよい。また、投与単位形態中に有効成分を約 1 0〜 1 0 0 O mg含有させるのがよい。

本発明アポトーシス調整剤は、その有するアポトーシス調整能や細胞の分化誘導能等に基づいて、各種疾患に適用でき、所望の薬理効果を期待できる。該適用疾患としては、より具体的には、例えば癌、 A I D S、 A R C ( A I D S関連疾患）、 A T L (成人 T細胞白血病： Adult T-ce H leukemia ) 、毛様細胞性白血病（Hairy cel l leukemia ) 、脊髄症（HAM/TSP ) 、呼吸器障害

(HAB/HABA) 、関節症（HAAP) 、ブドウ膜炎（HAU ) 等の H T L V— I 関連疾患、自己免疫疾患、例えば S L E (全身性ェリテマト一デス）、慢性関節リウマチ（R A) 等の膠原病、潰瘍性大腸炎、シニーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病

(Idio athic Thrombocytopenic P u r a p u r a： I TP ) 、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、橋本病、インスリン依存型（ I型）糖尿病等を例示できる。また血小板減少を伴う各種の疾患、例えば骨髄異形成症候群、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少症、汎発性血管内凝固症等にも、本発明アポトーシス調整剤が適用できる。更に本発明調整剤は、 C型、 A型、 B型、 F型等の各種の肝炎、アルツハイマー病、アルッハイマ一型老年痴呆症、心筋炎、 A R D S (成人呼吸急迫症候群）、感染症、肝硬変、前立腺肥大症、子宮筋腫、気管支喘息、動脈硬化症、各種先天性奇形症、腎炎、老人性白内障、慢性疲労症候群（Chronic Fatigiu Syndrome) 、筋ジストロフィー（Myotonic dystrophy) 等の各種疾患、にも適応可能である。

本発明アポトーシス調整剤は、例えば制癌剤として用いる場合、その投与により、癌細胞を分化させた後又は分化させることなく直接に、アポト一シスの誘導を促進又は抑制でき、かくして制癌作用を発揮する。またこの場合、本発明調整剤は、その製剤形態及び投与経路にかかわらず、例えばこれを癌の化学療法剤として知られている他の各種の制癌剤や放射線療法と併用することができる。かくして、本発明の有効成分化合物は優れた制癌効果を奏し得るため、併用する他の制癌剤の効果を一層助長し、相乗効果を発揮させることができる。従って、併用する制癌剤を通常用いられる量よりかなり少量とする場合でも、充分な癌治療効果が得られ、これにより併用制癌剤の副作用の軽減化をはかることができる。かかる化学療法剤としては、例えば 5 —フルォロウラシル ( 5 — F U、協和発酵工業株式会社製）、マイトマイシン（Mitomycin-C 、同上社製）、フトラフール（F T—

2 0 7、大鵬薬品工業株式会社製）、エンドキサン

(Endoxan 、塩野義製薬株式会社製）、トヨマイシン (Toyomicin 、武田薬品工業株式会社製）等を例示できる o

本発明アポトーシス調整剤は、これを血小板減少症治療に用いる場合、例えば R Aや R A R S等の MD S患者では、そ投与により細胞の分化誘導促進作用と共にァポト一シス抑制作用が発揮され、かくして造血細胞の増殖を剌激し、正常な分化、成熟を起こさせ得る。また、 R A E Bや R A E B— t等の M D S患者では、本発明調整剤の投与により芽球の分化が誘導されると共に、芽球の増殖が抑制され、かくして成熟細胞の増殖を起こさせ得る。また本発明調整剤は、巨核球前駆細胞や巨核球細胞に作用して、その分化、成熟を促進させることにより、血小板産生の促進作用も期待できる。

本発明アポトーシス調整剤を上記血小板減少症治療に用いる場合は、これは従来公知の血小板増加剤等の他の医薬品と併用でき、これにより之等併用薬剤の効果を助長し、従って併用剤量をかなり少量としても充分な治療効果を奏し得、副作用の軽減化をはかり得る場合がある。

本発明調整剤は、アルツハイマー病の治療及び予防剤としても有用である。この場合、例えば古典的なァルツハイマー病ゃァルツハイマー型老年痴呆症患者において、本発明調整剤はアポトーシスの抑制により N G F様作用を示し、かくして上記治療及び予防効果を発揮する。またこの場合、本発明製剤は従来公知の脳循環改善剤や脳代謝改善剤等のアルッハイマー病治療剤と併用することができ、之等の効果を助長し、之等による副作用を軽減できる場合がある。更に本発明調整剤は、アポトーシスを制御することにより、薬剤性及びゥィルス性肝炎患者における肝炎の治療乃至肝細胞の線維化防止を行ない得、従って肝硬変予防剤として利用することができる。

図面の簡単な説明

図 1 は、後記薬理試験例 1 に記載のアポトーシス調整効果試験における D N Aの断片化の結果を示す写真である O

図 2は、後記薬理試験例 5に記載の M l 2 メラノーマ細胞の増殖抑制効果試験の結果を示すグラフである。

図 3は後記薬理試験例 8に記載の自己免疫疾患に対する延命効果試験の結果を示すグラフである。

図 4〜図 7は後記薬理試験例 9に記載の血小板減少改善効果試験の結果を示す写真である。

図 8は後記薬理試験例 1 0に記載の自己免疫疾患治療効果試験の結果を示す写真である。

図 9及び図 1 0は後記薬理試験例 1 1 に記載の P C 1 2細胞に対する効果試験の結果を示す写真である。

図 1 1 は後記薬理試験例 1 2に記載の肝不全に対する効果試験の結果を示すグラフである。

図 1 2は後記薬理試験例 1 3に記載の B 1 6メラノ一マ細胞の実験肺転移モデルに対する効果試験の結果を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態以下に、本発明アポトーシス調整剤の製剤例及びアポト一シス調整剤有効成分化合物につき行なつた薬理試験結果を挙げる。

製剤例 1

6 - 〔 4一（ 3， 4ージメトキシベンゾィル）

— 1 —ピペラジニル〕一 3， 4—ジヒドロ力

ルボスチリノレ 1 5 0 g ァビセル（商標名，旭化成（株）製） 4 0 g コーンスターチ 3 0 g ステアリン酸マグネシウム 2 g ヒドロキシプロピルメチルセルロース 1 0 g ポリエチレングリコール一 6 0 0 0 3 g ヒマシ油 4 0 g メタノール 4 0 g 上記有効成分化合物、アビセル、コーンスターチ及びステアリン酸マグネシウムを混合研磨後、糖衣 R 1 0腿のキネで打錠する。得られた錠剤をヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール一 6 0 0 0、ヒマシ油及びメタノ一ルからなるフィルムコ一ティング剤で被覆を行ない、フィルムコーティング錠を製造する。製剤例 2

6— 〔 4 一（ 3， 4 ージメトキシベンゾィル）

— 1 —ピペラジニル〕一 3 , 4 — ジヒドロ力

ルボスチリル 5 0 0 g クェン酸 1 0 g ラクトース 3 3 5 g リン酸ニカルシゥム 7 0 0 g プル口ニック F— 6 8 3 0 0 g ラウリル硫酸ナトリウム 1 5 0 g ポリビニルピロリドン 1 5 0 g ポリエチレングリコール（カルボワックス 1 5 0 0 )

4 . 5 g ポリエチレングリコール（カルボワックス 6 0 0 0 )

4 5 . 0 g コーンスターチ 3 0 . 0 g 乾燥ラゥリル硫酸ナトリウム 3 . 0 g 乾燥ステアリン酸マグネシウム 3 . 0 g エタノール

上記有効成分化合物、クェン酸、ラクト一ス、リン酸二カルシウム、プル口ニック F— 6 8及びラウリル硫酸ナトリゥムを混合する。

上記混合物を N o . 6 0 スクリーンにて篩別し、ポリビニルピロリドン、カルボワックス 1 5 0 0及びカルボワックス 6 0 0 0を含むアルコール性溶液で湿式粒状化する。必要に応じてアルコールを添加し、粉末をペースト状塊にする。コーンスターチを添加し、均一な粒子が形成されるまで混合を続ける。 N o . 1 0スクリーンを通過させ、トレイに入れ、 1 0 0 °Cのオーブンで 1 2〜 1 4時間乾燥する。乾燥粒子を N o. 1 6スクリーンで篩別し、乾燥ラウリル硫酸ナトリウム及び乾燥ステアリン酸マグネシウムを加え、混合し、打錠機で所望の形状に圧縮成形する。

上記芯部をワニスで処理し、タルクを散布して湿気の吸収を防止する。芯部の周囲に下塗り層を被覆する。内服用のために充分な回数のワニス被覆を行なう。錠剤を完全に丸く且つ滑らかにするために、更に下塗り層及び平滑被覆を適用する。所望の色合が得られるまで着色被覆を行なう。乾燥後、被覆錠剤を磨いて均一な光沢の錠剤を調製する。

以下に示す供試化合物を用い、下記の薬理試験を行なつナ

〔供試化合物〕

1. 6 - 〔4— ( 3 , 4— ジメトキシベンゾィル）一

1— ピペラジニル〕一 3 , 4— ジヒドロカルボスチリル

2. 6— 〔 4— ( 3， 4, 5— トリメトキシベンゾィル）一 1 — ピペラジニル〕一 3， 4— ジヒドロ力ルボスチリル

3. 7— 〔 4— ( 3， 4 , 5— トリメトキシベンゾィル）一 1 ーピペラジニル〕一 3 , 4— ジヒドロ力ルボスチリル

4. 7— 〔 4 — ( 3 , 4— ジメトキシベンゾィル）一

1 ーピペラジニル〕一 3， 4ージヒドロカルボスチリル

5. 6— 〔 4一（ 4一エキシべンゾィル）一 1— ピぺラジニル〕一 3 , 4— ジヒドロカルボスチリル

6. 5— 〔 4— ( 3 , 4— ジメトキシベンゾィル）一

1 — ピペラジニル〕一 3 , 4— ジヒドロカルボスチリル

7. 6 - 〔4— ( 3 , 4— ジメトキシベンゾィル）一

1 ーピペラジニル〕カルボスチリノレ

8. 8 - 〔4— ( 3， 4— ジメトキシベンゾィル）一

1 ーピペラジニル〕一 3 , 4— ジヒドロカルボスチリル

薬理試験例 1

アポトーシス調整効果試験 CMK細胞を 1 0 %牛胎児血清含有 R P M I 1 6 4 0 培地中にて 1 X 1 0 ⁵ 個/^の濃度に調整した後、これに化合物 1を 3 0 ; g の濃度で加えて、 3 7 °Cで 2 日間及び 4日間培養フラスコ中にて培養した。尚、コントロールとして溶媒のみを加えたものを同様にして培養し / o

培養フラスコから細胞を取出し、 4 °Cで 1 0分間

2 0 0 X Gで遠心分離した。ペレツトを低張緩衝液

( 1 0 mMトリス塩酸、 I mM E D T A及び 0. 2 % トリトン X 1 0 0、 p H 7. 5 ) に溶解後、 4 °Cで 1 0 分間、 1 3 0 0 0 X Gにて遠心分離した。上清を採取後、 5 0 %イソプロピルアルコール一 0. 5 M N a C 中にて、一 2 0 °Cで一晩放置し、得られた沈殿物を 4でで 1 0分間、 1 3 0 0 0 X Gで遠心分離後、上清をすて、乾燥した。次に 1 0 mMトリス塩酸一 1 mM E D T A (p H 7. 4 ) 溶液に再懸濁させ、最終濃度が 0. l mg の濃度になるように上清に R N a s eを添加し、

3 7 °Cで 1時間ィンキュベートした。

更に、 1 X 1 0 ⁶ 細胞数に相当する量のサンプルに対して、 1 5 mM E D T A、 2 % S D S、 5 0 %グリセロール及び 0. 0 5 %ブロモフエニルブルーを含有するローディング緩衝液を、サンプルの 1 / 5容量加え、 6 5 °Cで 1 0分間ィンキュベートした。

得られたサンプルにっき、電気泳動を 1. 5 %ァガロ —スゲル中で 1 0 0 Vで 1 0 0分間行なった。また D N Aをェチジゥムプロマイドで染色した。

得られた結果を図 1に示す。

図中、両サイドのレーンはそれぞれマーカ一（マ — 1 = 1 2 0、 6 0 0及び 1 3 5 0 b p、マーカー 2 = 7 2、 4 2 0及び 9 3 0 b p ) であり、左から .2番目のレーンが化合物 1添加 2 日後を、左から 3番目のレーンはコントロール 2 日後を、左から 4番目のレーンは化合物 1添加 4日後を、また左から 5番目のレーンはコントロール 4 日後をそれぞれ示す。

該図より、化合物 1の添加によれば、 D N A断片の表出が電気泳動上に時間依存的に表れることが明らかであり、このことから、化合物 1は C MK細胞に対して、ァポトーシスを促進していることが判る。

薬理試験例 2

癌細胞増殖抑制効果試験

( 1 ) ヒト前骨髄性白血病細胞（H L— 6 0 ) の調整ヒト前骨髄性白血病細胞（H L— 6 0) は、ガロ

(Robert Gal lo) らにより樹立されたヒト白血病細胞株で、その細胞の性質は文献〔Gal lo, R. ， et al. , Blood, 54, 713 ( 1979) 3 に記載されており、アメリカンタイプ力ルチヤ一コレクション（A T C C ) に「A T C C N o . C C L — 2 4 0」なる寄託番号で受託されている。

上記 H L — 6 0は、 F C S (牛胎児血清、ギブコ社） 1 0 %添加 R P M I - 1 6 4 0培地（ギブコ社）で 1 x 1 0 ⁵ 個 ^に調整した。

( 2 ) ヒト胃癌細胞株（K A T O— I I I ) の調整

上記（ 1 ) と同様な培地で、 1 X 1 0 ⁵ 個に調整した。

( 3 ) 供試化合物の調整

供試化合物 1 は、醉酸で溶解後、上記（ 1 ) と同様な培地で希釈し、 2 N— N a 0 Hで中和した後、 1 0 0 β g

の濃度に調整した。

( 4 ) ギムザ染色液の調整

ギムザ試薬（メルク社）をリン酸緩衝液（P H 6. 4 ) で、 5 0〜 1 0 0倍に希釈し、ギムザ染色液とした。

( 5 ) エステラーゼ染色液の調整

ナフトール A S · Dクロロアセテート法によるエステラーゼ染色用試薬（武藤化学社）を用いた。

( 6 ) 抗 C D 3 3 モノクローナル抗体 M y 9の調整

未熟な顆粒球に特異的に反応するモノクローナル抗体 M y 9 (コール夕一社）は、 1バイアル当り 0. 5 の蒸留水を添加し、溶解後使用した。

( 7 ) 結果

a ) 上記（ 1 ) で調整した H L— 6 0に、上記（ 3 ) で調整した供試化合物を最終濃度 1 0 g 及び 1. 0 / g になるようにそれぞれ添加し、 1 2穴培養プレート（コ一スター社）を用い、 3 7 °C， 5 %炭酸ガス培養器中で 3〜 4 日培養した。コントロールとしては、供試化合物無添加の培地を用いた。培養後、各穴の細胞浮遊液を取り、 0. 2 % トリパンブル—含有リン酸緩衝液と混合し、顕微鏡下に未染色の生細胞数を計測し、その結果から生細胞数 1 X 1 0⁵ 個 ; ^に再調整し、同様な方法で培養を続けた。

2 7日目及び 3 3 日目の H L— 6 0に対する細胞増殖抑制効果を表 1に示した。

また上記（ 2 ) で調整した K A T 0— I I I についても同様に培養し、 2 4日目及び 3 3 日目の K A T 0— I I I に対する細胞増殖抑制効果を表 2に示した。 2 7 曰目の 3 3 曰目の供試化合物 1 増殖率（％) 増殖率（％) 無添加 1 0 0 1 0 0

1 . 0 g / m \ 7 6 ± 3 . 8 0

1 0 β g / m \ 5 4 ± 2 . 6 0 表 2

表 1及び表 2 より、腫瘍細胞は、供試化合物の濃度に依存して、増殖が抑制されることが明らかである。

b ) H L - 6 0の分化

上記（ 1 ) で調整した H L — 6 0を、 a ) で用いたのと同様に培養し、 2 7 日目の細胞をスライドグラス上に添加しギムザ染色を行なった後、顕微鏡下で形態学的観察を行なった所、供試化合物を添加した場合には、供試化合物無添加の場合と比較して、形態学的変化として顆粒を持つ細胞に分化していることが認められた。またナフトール A S · Dクロロアセテート法によるエステラ一ゼ染色の結果からも、 H L — 6 0の 7 0〜 8 5 %が顆粒球に分化していることが認められた。

c ) 抗 C D 3 3 モノクローナル抗体 M y 9 との反応性上記（ 1 ) で調整した H L — 6 0を、 a ) で用いたのと同様に培養し、 2 7 日目の細胞を 1 X 1 0⁶ 個 / に調整し、その 1 0 0 // 1 と蛍光標識（F I T C ) した M y 9の 1 0 〃 1 とを反応させた後フローサイトメトリー法で測定し、その陽性率を表 3に示した。

表 3

表 3より、供試化合物添加の場合、 H L — 6 0の未分化な細胞が減少し、分化した細胞の比率が多くなつたこと ¾ 認めた o

以上の結果より、本発明の有効成分化合物には、腫瘍細胞への増殖抑制効果及び分化誘導能が認められた。薬理試験例 3 分化誘導性試験

( 8 ) モノクローナル抗体 F H— 6の調整

シァリル L e ^Λを認識するモノクロ一ナル抗体 F H一 6 に蛍光標識（F I T C ) し、本発明有効成分化合物と F H— 6 との反応性を、以下の通り、フローサイトメトリ一法で検討した。

( 9 ) モノクローナル抗体 F H— 6 との反応性

上記（ 1 ) で調整した H L — 6 0 に、上記（ 3 ) で調整した供試化合物を最終濃度 1. 0 β g ZW及び 1 0 g になるようにそれぞれ添加し、 3 7 ° (：、 5 %炭酸ガス培養器中で 2時間培養した。その後細胞数を I X 1 0 ^D 個に調整し、その 1 0 0 1 と蛍光標識した F H— 6の 1 0 1 とを反応させ、フローサイトメトリ —法で測定し、その陽性率を表 4に示した。

表 4

以上の結果より、本発明有効成分化合物の添加で、 H L一 6 0の細胞表面からシアル酸が減少していることが認められた。このことは、 H L— 6 0が分化し、シァリダーゼ活性が高まつたことを示している。

薬理試験例 4

ヒト前骨髄性白血病細胞（H L— 6 0 ) に対する効果

H L— 6 0を 1 0 % F C S添加 R P M I — 1 6 4 0培地にて 3 7 °C、 5 % C 0₂ 下で培養し、細胞濃度を 5 X 1 0⁴ 個ノ; ^になるように調製した。

次に、 6穴のマイクロプレート（コースター社製）の各穴に各供試化合物を 3 0 / g Z; ^含む上記培地をそれぞれ添加した後、 3 7 °C、 5 % C 0₂ 下で 3 日間培養した。尚コントロール群として、上記培地のみを添加して同様に培養する群を設けた。培養後、各培養細胞浮遊液をエツペンドルフチューブに取り、 0. 2 % トリパンブルー含有リン酸緩衝液で染色した後、生細胞数を血球計算盤にて計測した。

上記細胞を 1 x 1 0⁷ 個ノ^に調製し、その 1 0 0 // 1 にフルォレセインイソチアネート（F I T C) 標識抗ヒト C D l l b抗体（M o l、コールター社製） 5 β 1 を添加し、氷上で 3 0分間暗所にて反応させた。反応後、 0. 1 % B S A (牛血清アルブミン、シグマ社製）含有 P B S (リン酸緩衝液、日水製薬社製）で 2回洗浄し、最終的に 5 0 0 1 に懸濁させた後、フローサイトメトリ一法により、プロファイル I I (コ一ルター社製）にて蛍光強度を測定した。

その結果を表 5及び表 6 に示す。

表 5

表

- 之等各表より各供試化合物を用いた群ではいずれも細胞増殖抑制効果が認められ、 C D l i b発現の増加により、顆粒球、単球 · マクロファージ系への分化誘導を促進していることが認められた。

薬理試験例 5

M 12メラノ一マ細胞の増殖抑制効果試験

この試験は 1群 1 0匹の B a 1 bZcヌードマウスを用いて実施した。

試験開始日（0日目）に M 1 2メラノーマ細胞の 2 X 1 0⁶ 個を、試験群マウスに移植した。腫瘍容量が 1 00顧 ³ に達した時、試験群マウスに供試化合物 1の 1 OmgZkgZ日を経口投与した。上記投与は 25日目から 55日目まで 30回行なった。腫瘍細胞移植後、腫瘍の径をキヤピラリーを用いて毎日測定した。腫瘍容量は下式により計算した。

腫瘍容量（醒 ³ ) - (長径） X (短径） ² X 1 / 2

結果を図 2に示す。

尚、図 2には、対照群（コントロール、供試化合物無投与）マウスの同結果を併記する。また図中 *はスチュ一デンッ Tテストによる有意差 pく 0. 0 5を示す。図 2より、供試化合物の投与により、 M 1 2メラノーマ細胞の増殖を有意に抑制できることが判る。

薬理試験例 6

A T L感染細胞の増殖抑制効果試験

供試化合物として化合物 1を用い、以下の薬理試験を行なった。

( a ) ヒト末梢血急性リンパ性白血病細胞（M o 1 t 一 4 ) の調製

ヒト末梢血急性リンパ性白血病細胞（M o 1 t 一 4 ) [ J. Minowada, e t a 1. , J. Nat l. Cancer Ins t. , 9, 89 1 - 895 (1972) ： ATCC CRL 1582 ] を、 1 0 % F C S (牛胎児血清、ギブコ社製）添加 R P M I — 1 6 4 0培地 (ギブコ社製）で l x l O ⁵ 個 Zm l に調製し、 A T L ウィルス非感染細胞とした。

( b ) ヒト成人 T細胞白血病細胞（ 5 S ) の調製

ヒト成人 T細胞白血病細胞（ 5 S ) を、 1 0 % F C S (ギブコ社製）添加 R P M I - 1 6 4 0培地（ギブコ社製）で 1 X 1 0⁵ 個 Zm l に調製し、 A T L ウィルス感染細胞とした。

( c ) 供試化合物の調製

化合物 1を塩酸に溶解後、上記と同培地で希釈し、 2 N N a O Hで中和後、 l g /m l、 1 0 g / m 1 及び 3 0 z g Zm l の各濃度に調製して利用した。

( d ) 薬理試験

2 4穴培養プレート（ヌンク社製）の各ゥヱルに、上記（ a ) 及び（b ) で調製した各細胞を入れ、これに上記（ c ) で調製した供試化合物を添加（最終濃度 1 β _g /m 1 l O ^ gZm l及び 3 0 z g Zm l ) し、 3 7 °C、 5 %炭酸ガス培養器中で 4日間培養した。コント口ール（対照）としては、供試化合物無添加の培地を用いた。上記培養終了後、各ゥエルの細胞浮遊液をとり、生細胞数を計測した。

その結果を表 7に示す。

表 Ί

表 7より、本発明有効成分化合物（化合物 1 ) は、 A T L Vウィルス非感染細胞に対しては影響を与えることなく、 A T L感染細胞に対して 1 g Zm 1 の濃度より強力にその増殖を抑制する効果を奏することが明らかであ ^ ) o

薬理試験伊 7

抗レトロウイルス活性の試験

( a ) ヒトトランスフォーム正常 T細胞（MT— 4 ) の調製ヒトトランスフォーム正常 T細胞（Μ Τ— 4 )

[Na gumo, T. and Ho s h i n o, H. , J n. J. Cancer Res. , 79, 9 - 11 (1988) 〕を、 1 0 % F C S (ギブコ社製）添加 R P M I — 1 6 4 0培地（ギブコ社製）で 2 x l O ^d 個 /m 1 に調製した。

( b ) 供試化合物の調製

化合物 1を塩酸に溶解後、上記と同培地で希釈し、 2 N N a O Hで中和後、 l iz g Zm 】、 l O iz g Zm l 3 0 β g /m 1 及び 1 0 0 β g /m 1 の各濃度に調製して利用した。

( c ) 薬理試験

1 2穴培養プレート（コースター社製）の各ゥヱルに、上記（ a ) で調製した各細胞及び上記（b ) で調製した供試化合物（最終濃度 1 ^ g Zm l 、 1 Q g /m \ ^ 3 0 g Zm l 及び l O O /z g Zm l ) を入れ、更に、 H I V浮遊液 5 0 a 1 ゥエルを添加して各ゥニル細胞を感染させ、 3 7で、 5 %炭酸ガス培養器中で 3 日間培養した。コントロール（対照）としては、供試化合物無添加の培地を用いた。上記培養終了後、各ゥエルの細胞浮遊液をとり、生細胞数を計測した。

次いで、上記各ゥエルの細胞浮遊液を遠心分離

( 1 5 0 0 r p m x 5分間）し、培養上清 7 5 0 1 を得た。

上記で得られた培養上清 7 5 0 β 1 をエツペンドルフチューブ（ 1. 8 m l ) に入れ、更に 4 Μ N a C l と P E G— 6 0 0 0 (シグマ社製）を加え、 0 °Cで 2時間反応させてウィルスを沈降させ、遠心分離（ 1 5 0 0 0 r p m x 2 0分間）により該ウィルス沈降物を得た。この沈降物に溶液 I 〔 5 0 %グリセリン（和光純薬社製）、 2 5 mM トリス ·塩酸（ p H 7. 5 ) 、 5 0 mM

K C 1、 0. 0 2 5 % トリトン X— 1 0 0 (シグマ社製）及び 5 mM D T T (シグマ社製）〕と溶液 I I

〔 0. 9 % トリトン X— 1 0 0 (シグマ社製）及び

1. 5 M K C 1 〕を加え、 0 °Cで 3 0分間を要して溶解させた。得られたウィルス溶解液 1 0〃 1 に 5m gZ m l B S A (牛血清アルブミン：シグマ社製）、 1 M トリス · 塩酸、 1 0 0 mM D T T (シグマ社製）、 1 M K C 1、 1 0 mMポリ A (シグマ社製）、 0. 1 5 mM T T P (シグマ社製）、 2 0 0 mM M g C 1 ₂ > 0. 1 5 mMオリゴ d T (N E N社製）及び〔 ^ύΗ〕一 Τ Τ Ρ (Ν Ε Ν社製）を加え、 3 7 °Cで 1時間反応させた。反応後、直ちに氷中に入れて反応を停止させ、フィルター（DE-81 Fi lter; ヮットマン社製）に全量をスポットして乾燥した。乾燥後、 0. 5 M N a ₂ H P 0₄ で 3回洗浄し、エタノール中ですすぎ落として乾燥させ膜上の D N A中に取り込まれた〔 ³H〕一 T T Pの放射能活性を液体シンチレ一ションカウンタ一で計測して、これを逆転写酵素活性（単位： c p m) として求めた。上記で求められた生細胞数（X 1 0⁴ 個）及び逆転写酵素活性（ c p m) の結果を表 8に示す。

表 8

表 8より、本発明有効成分化合物（化合物 1 ) は、 3 0 ^ gノ m l 及び 1 0 0 z gZm l の用量で、細胞増殖の抑制とともに逆転写酵素活性を強力に抑制することが判つた。

上記薬理試験例 6及び薬理試験例 7の結果から、本発明に有効成分として利用する化合物は、強力な抗レトロウィルス活性を有することが明らかである。

薬理試験例 8

自己免疫疾患モデル動物に対する効果 W/ B F J ： ( Z W X B X S B ) F ₁ マウスは、自然発症自己免疫疾患マウスであり、ループス腎炎だけでなく、高血圧症と心筋梗塞を高頻度に合併するモデル動物である [Hang, L. M. , et a 1. , J. Exp. Med. , 154 , 216 - 221

。また、加齢とともに抗血小板抗体が出現し著しい血小板減少が認められ、 I τ Ρのモデル動物でもある〔0ya i zu, Ν.， e t a 1. , J. Exp. Med. , 167 , 2017 - 2077

。該モデルは生後 8ヶ月以内に 9 0 %以上は心筋梗塞または腎不全で死亡することが報告されている〔池原進，代謝，増刊号， 1， 169-Π6 (1989)〕。

W/ B F！： (N Z W X B X S B ) F ₁ マウスに対する延命効果及び血球、抗血小板抗体への本発明の化合物 1投与による効果を検討した。

W/ B F j ： ( N Z W X B X S B ) F _{ マウスは、

14週齢（紀和実験動物社より購入）より使用した。各実験には、 1群 1 0匹のマウスを使用した。

上記各群のマウスには、通常この種のマウスに与える餌料（オリエンタル酵母社製）及び水を与えた。

化合 ' I 1 (ロット N o . 9 D 87 M) は、 0 5%力ルポキシメチルセルロース（ C M C ： Carboxy Me thy l Ce l lul ose ；セロゲン社製）溶液に懸濁して実験に供した。該化合物 1をマウス体重 1 kg当り、 l O OmgZkgZ 日及び 3 0 OnigZkgZ日で 14週齢より投与を開始し、 20週齢まで 6週間、 5投 2休で強制経口投与した。また、コントロール群として無投与群を設けた。

( 1 ) 観察項目は、延命作用として 14週齢から 20週齢までの生死数を観察し、統計学的処理は、無投与群を対照に Generalised Wi 1 coxon test により有意差を検定した。その結果を第 3図に示す。

該図中、縦軸は、生死数のパーセント（）、横軸は週齢（1 4週齢から 20週齢）を示す。

該図より化合物 1の 1 00 mg/kgZ日投与群では、 20週齢まで死亡例が認められなかった。また、 300 mgZkgZ日投与群では、 18週齢時に 2匹の死亡が観察された。無投与群は、 1 7週齢で 2匹、 1 8週齢で1匹、 1 9週齢で 3匹の死亡が確認され、本発明有効成分化合物（化合物 1) による自己免疫疾患モデルマウスに対する延命効果が確認された。

(2) 血球分析は、 14、 1 6、 18、 20週齢に眼底採血により血液サンプルを採血し、自動血球分析装置

(Coulter 〗R; コールター社製）を用いて血球数（白血球数、赤血球数、血小板数）の変動を測定した。また、白血球の分画数（好中球数、リンパ球数）は血液塗末標本を作製し、ライト，ギムザ染色後、測定した。統計学的処理は、各採血日の無投与群を対照にスチューデントの t テスト（Student' s 卜 test) によって検定した。

その結果を表 9に示す。

表 9 白血球（xlQ³ /mm³ )

Mm

処理 14 16 18 20 無投与 8. n±o.99 15.34土 4.53 10.87±1. 13.30±4.04

/ '1 k,g _ i. o [； o d - 台物 1 lU Umg ±4- 1

化 1. C 1 c

lb 1 L, 91 . - ±U 1 Π 1

10 lb. Ί j n a - ±4- Λ . n » o o 1 1 0

11. 1 1. ( 1 300mg/ 'kg 5.46±0.74 9.36±1.77 11.90±3· 52 12.97±5.95 好中球 (x 10³ / 'mm³ )

無投与 2.06±0. " 3.25±1.90 2.38±0.63 3.84±1.86 化合物 1 lOOmg o

ノ l a Π Q 7 -h fi 91 q n 1 + 9 1 h ς 0, o Q Z + 1

-Π 1, a o o c

o, Z 03z 1. U o 300mg/ ^kg 0.79±0.19 1.86±0.40 5.65±2.11 2.24±0.23 リンパ球 (x 10³ Z關 3 )

無投与 6.17±0.92 12.06±2.68 8.49±1.39 9.47±2, 23 化合物 1 lOOmg, /kg 6, 55±1.11 9. ±2.72 10.68±3.78 8.70±1.02

300mg, /kg 4.50±0.63 7.01±0.92 6.16±0.88 10.73±5.81

表 9 (綺き）週齢

処理 14 16 18 20

赤血球 (X 10° /

無投 9.12±0.53 7.82± 0.44 8.00± 0.60 6.80±0.53 化合物 1 lOOmg /kg 9.08 ± 0.19 9.06± 0.19* 8.46± 0.34 8.29±0.37*

300mg /kg 9. Π±0.21 8.43±0.30 8.83±0.32 7.90±0.30 血小板（X10³ / min^J )

無投与 1144.5±121.3 781.3±115.5 670.3 ±123.8 228.0 ± 90.0 化合物 1 lOOmg /kg 1225.2 ±187.6 749.6 ±U6.6 524.0±105.6 341.1±111· 9

300mg /kg 1316.8土 86.3 1055.8土 72.0 980.0 ±Π4· 4 823.3土 24.5**

(*:P<0.05, **:P<0.01)

WXB F _t マウスの血液学的特徵は前記池原の報告にあるように加齢とともに白血球増多と血小板の減少が認められる。白血球数は無投与群、化合物 1投与群で加齢と共に増加傾向が認められ、本発明有効成分化合物の影響は認められなかった。血小板数については、無投与群では、 1 4週齢（1 1 44. 5 ± 1 2 1. 3ノ mm ³ ) より減少が認められ、 2 0週齢時においては 1 4週齢時の約 5分の 1 (2 2 8. 0 ± 9 0. 0ノ ram³ ) まで減少した。しかし、本発明有効成分化合物（化合物 1 ) 3 0 0 mgZkgZ日投与群は、投与開始時より血小板数の減少抑制効果が現われ、 20週齢では（823. 3 ± 24. 5 mm³ ) で無投与群（ 22 8. 0 ± 9 0. 0ノ咖³ ) に対し有意な抑制効果が認められた。また、赤血球数においても同様な結果が得られた。

(3) W/ B F ₁ マウスには、オヤィズ（Oyaizu) らが血小板減少の原因が抗血小板抗体の出現によって起こることを報告しているが、上記（2) の如く、本発明化合物 1の投与によつて血小板の減少が抑制されたことから、 2 0週齢時の抗血小板抗体を同定した。

抗血小板抗体の測定は、 B a l bZcマウスより採取した血小板と 2 0週齢まで投与した WZB 血漿と共に 3 0分間室温でインキュベートし、 2回洗浄後、 F I T C標識抗マウス I g G (夕ゴ社製；コード N o. 6 2 5 0 ) と反応させて染色後、 F A C Sアナライザー (E P I C S— P r o f i 1 e I I、コールター社製）で解析した。陰性のコントロールは、 B a 1 b _ cマウスの血漿が 9 8 %陰性になるようにセッ卜し、各検体のサンプルの陽性率を求めた。

その結果を表 1 0に示す。

表 1 0

性率％)

マゥス画体番号無投与化合物 1 化合物 1

lOOnig/kg 300mg/kg

1 N. T 3. 7 2. 3

2 2 0. 9 1 3. 5 1 1. 4

3 N. T 3. 1 1 4. 1

4 N. T 1 7. 3 6. 0

5 N. T 2 1. 5 N. T

6 2 6. 0 1 6. 8 1 6. 4

7 N. T 1 8. 2 1 2. 1

8 2 7. 9 7. 8 4. 1

9 3. 7 8. 5 1 9. 5

1 0 N. T 2 7. 1 N. T

(Mean 土 SE) 19.6± 5.5 13.3土 2.7 10.7±2.2 該表において、 N. Tは、測定時において死亡していたため測定不可を示し、数字は陽性率パーセント（％) を示す。

該表より、無投与群では、陽性率が 1 9. 6 ± 5. 5 %であったのに対し、本発明有効成分化合物（化合物 1 )

1 0 0 mgノ kg/日投与群では、陽性率 1 3. 2 ± 2. 7 %、 3 0 0 mgZk Z日投与群では、陽性率 1 0. 7土

2. 2 %と用量依存的な抗血小板抗体の抑制が認められた。

W B F _{ マウスは、前述の如くヒト慢性 I T Pの自然発症モデルマウスであり、生後 3ヶ月よりループス腎炎を発症し、 8ヶ月以前に 9 0 %以上は心筋梗塞又は腎不全で死亡するが、このマウスの治療方法としては正常の B a 1 b Z cマウスの骨髄を移植することにより治療できることが報告されている [Ikehara, S, , et a 1. , Proc. Na 11. Acad. Sci. USA, Π, 2483 - 2487 (1985) ;Ya sum i zu, R. , et al. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 84, 6555 - 6557 (1987)； Ikehara, S. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 56, 3306 -

3310 (1989)] 。また、実際の臨床においても最も有効な I T Pの治療は、現在の所骨髄移植とされている。

本発明有効成分化合物のカルボスチリル誘導体は、上記（ 1：) 〜（ 3 ) の結果から判るように WZB F i マウスに対して有意な延命効果を示し、同時にこのマウスの血液学的特徴である抗血小板抗体の出現による血小板減少をも抑制することから、自己免疫疾患改善作用を持つことが判る。

薬理試験例 9

血小板減少改善効果試験

1 ) 供試化合物 1の調製

化合物 1を 1 N塩酸に溶解後、 F C S (牛胎児血清、ギブコ社製）で希釈し、 1

溶液を調製した。同溶液を 1 0 % F C S添加 R P M I — 1 6 4 0培地（フロー社製）に添加し、 1 N — N a 0 Hで中和した後、 3 0

gZ^の濃度に調製して利用した。

2 ) C M K細胞の調製

C M K細胞は、サトウらによって急性巨核芽球性白血病患者から樹立され、抗血小板抗体（抗糖タンパク l ib/ 111 a抗体、抗糖タンパク lb抗体、 Pl t-1 抗体）と反応し、また、細胞質内に α顆粒、血小板分離膜の形成が認められる等巨核球様の性質を有することから巨核球の増殖，分化の解析に用いられている〔Sa t o, T. , e t a 1. , Exp.

Hema t o 1. , 15, 495 (1987) ; Sunami, S. , e t a 1. , B l ood, 70, 368 (1987) ; Koma t su, N. , e t a l. , B l ood, 74 (1) 2 - 48

； Fu s e, A. , e t a 1. , Br i t i sh J. Ha enia t o 1 o ey, 77, 32 - 36 (1991 )；日本血液学会雑誌， 53 (2 ) 294 - 295, 317 - 318

CMK細胞は、千葉大医学部小児科佐藤武幸先生より供与を受け、 5 X 1 0⁴ 個 Zm lの細胞を 1 0 % F C S 含有 R P M I — 1 6 4 0倍地中で培養し、 4 日毎に細胞数で継代した。

3 ) CMK細胞の血小板関連抗原発現に及ぼす化合物 1 の影響

CMK細胞 l x l 0⁵ 個 Zm lを化合物 1を 3 0 〃 g 含む 1 0 % F C S含有 R P M I — 1 6 4 0倍地中で 4日間培養し、細胞表面の血小板関連抗原の発現を

F I T C標識 P1卜 1 抗体（コール夕一社製）を用いてフローサイトメトリー（フロー社製）により測定した。また、化合物 1を含まない培地のみを溶媒対照とした。

細胞表面抗原の解析は CMK細胞 1 X 1 0⁶ 個/

1 0 0 / 1 をチューブ（フイツシャ一社製）に採り、 F I T C標識 P1卜 1 抗体を 5 〃 1 を加えて 4 °Cで 3 0分間反応させた後、 0， 1 %牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で 3回洗浄後、陽性細胞率及び蛍光強度を測定した ₀

上記 PH- 1 抗体（コールター社製）は、血小板関連抗原である糖タンパク llb/lllaを認識する抗体で、 CMK 細胞では、分化或いは成熟に伴つて増加することが報告されている [Komatsu, N. , e t al. , Blood, 74 (1) 2 - 48 その結果を表 1 1 に示す。

該表より、使用した C MK細胞の約 9 6 %が P1卜 1 抗体で認識される血小板関連抗原の陽性細胞であり、化合物 1の 3 0 / gノ^添加によっても陽性細胞率の変化は認、められなかった。

しかしながら、細胞当りの抗原発現量を表す平均蛍光強度を比較した場合、溶媒対照の平均蛍光強度を 1 0 0 %とすると、化合物 1を 3 0 /z g Z 加した細胞では 1 9 1 %であり、化合物 1添加による C MK細胞表面上の P1卜 1 抗体で認識される血小板関連抗原の発現量が約 2倍に増加したことが判る。

4 ) C MK細胞の形態観察 CMK細胞 l x l O ⁵ 個を化合物 1を含む 1 0 % F C S含有 R P M I — 1 6 4 0倍地中で 4日間培養し細胞の形態を位相差写真により観察した。また、一部の細胞を採り、サイトスピン標本を作成後、ライトギムザ染色により細胞の形態を観察した。

その結果を図 4〜図 7に示す。図 4及び図 6は、溶媒対照を示し、図 5及び図 7は化合物 1の 3 0 / gノ投与による細胞の位相差図及び染色図を示す。

該位相差図より、本発明の化合物 1を 3 0 gZW添加した細胞では血小板産生過程様の細胞の断片化が認められた。また、染色図より本発明化合物 1を添加した細胞では、細胞膜の発芽と核の分葉化が認められた。

上記の結果より、本発明の有効成分であるカルボスチリル誘導体は、 C MK細胞表面上の血小板関連抗原の発現量を増加させ、血小板産生過程様の細胞の断片化を起こし、更に細胞の細胞膜の発芽と核の分葉化を生ぜしめることから、 CMK細胞の分化或いは成熟を促進すると考えられる。従ってこの特有な作用によって、巨核球前駆細胞或いは巨核球細胞に作用してその分化、成熟を促進することにより血小板の産生を促進し、血小板減少を改善することが期待できる。

薬理試験例 1 0 自己免疫疾患治療効果試験

この試験には雌性 MR LZMp— 1 p rマウス（7週齢、日本チャールズ · リバ—社より購入）を 1 9週齢より、 1群 5匹ずつ使用した。

上記供試マウスは自己免疫疾患を自然発症するマウスであり、その病態の特徴としては、ヒト S L E

(Systemic lupus erythematosus) 様の免疫複合体糸球体腎炎、リンパ腫、血管炎、多発性関節炎等が知られている ( Th e 0 { i 10 p 010 s, A. and Di on, F. J. , Adv.

Immunology, Π, 269 ( 1985) ： Murphy, E. D. Roths, J. B.， Autocommuiii ty and lymphoprol iferation, Elsevier North Hoi land, New york, 207 - 221 (1978) ：谷ロ吉弘、現代医療， , 131 ( 1989 ) ) 。

化合物 1投与群及びコントロール群（無処置群）の各マウスには、マウス飼料（オリエンタル酵母社製）及び水を与えた。

化合物 1は 0. 5 %カルボキシメチルセルロース

(CMC. 第一工業製薬社製）溶液に懸濁させて用いた。化合物 1をマウス体重 l kg当り 3 0 OmgZkgZ日の量で 1 9週齢より投与開始し、 2 5週齢まで週 5投 2休で強制投与した（化合物 1投与群）。

各群マウスにつき、尿蛋白量変化、リンパ腫径、耳介の血管炎及び脱毛の有無を調べた。

その結果、化合物 1投与群はコントロール群と対比して、尿蛋白量の上昇を抑制する傾向が認められた。またリンパ腫径がコントロール群の 9. 0 ± 0. 8咖に比して 7. 8 ± 1. 3卿となっており、その肥大がやや抑制された。

上記血管炎、脱毛及びリンパ腫の程度を比較した結果を図 8に示す。

図より、化合物 1投与群ではコントロール群に比して血管炎及び脱毛の改善並びにリンパ腫径の縮少が認められた。

以上の結果より、化合物 1投与によれば、アポトーシス調整作用に基づく自己免疫疾患改善作用が期待できることが判る。

薬理試験例 1 1

P C 1 2細胞に対する効果試験

5 %熱非働化（ 5 6で、 3 0分）ゥマ血清と 1 0 %ゥシ胎児血清（F C S) を含むダルベッコ変法 M E M (D— M E M) 培地で継代した P C 1 2細胞を、コラーゲンでコートした直径 3 5腿プラスチックペトリデイツシュに 6 X 1 0⁴ 細胞 Z 3 * 培地の濃度で移植した。移植 2日目に、種々の濃度の化合物 1、神経成長因子 (N G F、和光純薬社製）及び F C Sのそれぞれを含む D— ME M (コントロール）に交換し、そのそれぞれにつき培養を続け、 3 日目の細胞の形態変化を位相差顕微鏡により観察した。

その結果を図 9及び図 1 0に示す。

図 9は上段が F C Sのみ添加の対照群、下段が化合物 1の 3 0 / g ^添加群であり、図より、上段に比して、下段では典型的な形態変化である神経線維様突起の形成が観察され、最も顕著な神経線維様突起形成は F C S 0. 3 %共存下（下段左）で観察されることが判る。共存 F C S濃度を更に高くすると形態の異なる細胞も出現する（下段中央及び右）。かくして、全細胞の 3 0〜

5 0 %に形態変化が誘導された。

図 1 0は上段が N G Fのみ添加群（但し 0. 3 %

F C S共存下）であり、下段が 0. 3 % F C S存在下に化合物 1の 3 0 g と N G F ( 0〜 3 0 ngノ；^) とを添加した群である。該図より、上段に認められる

G F刺激による神経様突起の形成に加えて、下段では化合物 1 と N G Fの共存（但し 0. 3 % F C S共存下）によって、それらのそれぞれ単独よりも上記突起の伸長が促進されていると認められた。

上記各図より、本発明の有効成分化合物 1はアポトーシス調整作用に基ずく N G F様の作用を示し、このことからァルツハィマ一病の治療剤として有用であること力く判る。

薬理試験例 1 2

肝不全に対する効果試験

雄性 B A L BZ cマウス（ 7週齢、日本エスエルシ一社より購入）に、 P. a c n e s加熱死菌（大阪市立大学医学部第 3内科、溝口先生より贈与） 3 ingZbodyを静脈内投与した。その 7日後に溶媒（ 0. 5 % C M C、第一工業製薬社製）投与群、非投与群と共に、化合物 1の 1 OmgZkg又は 1 0 OingZkgを経口投与した試験群を設けた。上記化合物 1投与の 1時間後に L P S (Lipopoly saccharide. シグマ社製）の 5 g /bodyを静脈内投与して、急性肝障害を誘発させた。

上記各群マウスの生存率を L P S投与 7 日後まで観察した。

結果を図 1 1に示す。

該図より、化合物 1の 1 OmgZkg投与群（試験群）の生存率は 3 0 %で、化合物 1の 1 0 0 ingZkg投与群（試験群）の生存率は 7 0 %であった。これに対して非投与群の生存率は 0 %、溶媒投与群では 1 0 %であった。このことから、化合物 1は、急性肝炎モデルに対して、用量依存的に優れた延命効果を奏することが判り、かくしてアポトーシス調整作用に基ずく肝炎治療剤として有効であると認められる。

薬理試験例 1 3

B 1 6メラノーマ細胞の実験肺転移モデルに対する効果

5^験

2 1 0⁶ 細胞の B 1 6マウスメラノ一マ細胞

( K 0 r e n, S. and F 1 e i s c hma n n, W. R. , J. I nte r f eron

Reseach, _6, 473 - 482 ( 198 ) を、予め化合物 1の 3 // g ノ^又は 1 0 / gノ^を添加するか無添加の 1 0 %

F B S (ギブコ社製）添加ィ一グルー M E M培地（日水製薬社製）に懸濁させた。 7 5 cnfのフラスコ（コ一ニング社製）にて 5 %炭酸ガス下に、 3 7 °Cのインキュベーター（ナショナルアプリアンス、モデル 5 3 0 0

(Nat iona l ap l i ance, mode l 5300) ) で 4 日間培養した。培養後、細胞をダルベッコ P B S ( （日水製薬社製）溶液で洗浄し、 0. 0 5 % トリプシン（フロー社製）溶液を加えてフラスコから剥離した。 1 2 0 0回転で 5分間遠心分離（日立製作所製、 0 5 P R— 2 2使用）して 2回洗浄後、 0. 2 % トリパンブルー（和光純薬社製）溶液を加え、血球計算板（No, KAYAGAKI WORKS) にて、生細胞数を数え、ハンクス（Hank' s、フロー社製）溶液にて細胞数を 1. 5 X 1 0⁶ 個に希釈調製した次に、上記で得られた処理細胞を、 1群 7匹の C 5 7 B LZ6マウス（7週齢、雌性、日本チャールズ · リバ —社より購入）の尾静脈から 3 x 1 0⁵ 個ずつ移植し、 1 2日後にマウスを頸椎脱臼して殺し、肺に転移したコロニ一数を計測した。

その結果を図 1 2及び下記表 1 2に示す。

表 1 2

但し *はスチューデンッ Tテストによる pく 0. 0 5 を示す。

上記図及び表より、 3 g の化合物 1を含む培地で培養した細胞を移植した群及び 1 Q β gZ^の化合物 1を含む培地で培養した細胞を移植した群のいずれにおいても、明らかに転移抑制効果が認められた。このことから、本発明の有効成分化合物は、アポトーシス調整作用に基ずいて、癌転移抑制剤として有用であることが判 O

産業上の利用可能性

本発明アポトーシス調整剤は、その特有のアポト一シス調整能、細胞分化誘導能に基づいて、癌の化学療法剤として有効利用できる。また抗レトロウイルス効果により A I D S、 A R C、 A T L等の関連疾患や H T L V— I 関連疾患の治療剤として、自己免疫疾患の延命効果により自己免疫疾患治療剤として、血小板関連抗原の発現量の増加効果により血小板減少症治療剤として、 N G F 様効果によるアルツハイマー病治療剤として、肝不全の延命効果により肝炎治療剤として、癌転移抑制効果による癌転移抑制剤として、それぞれ有効である。

Claims

請求の範囲

1 . 一般式

〔式中 Rはフニニル環上に置換基として低級アルコキシ基を有することのあるベンゾィル基を示す。カルボスチリル骨格の 3位と 4位との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。〕

で表わされるカルボスチリル誘導体及びその塩から選ばれる少なくとも 1種の化合物を有効成分として、薬理的に許容される担体と共に含有することを特徵とするアポト一シス調整剤。

2 . 制癌剤として用いられる請求項 1 に記載のアポトーシス調整剤。

3 . 抗レトロウイルス剤として用いられる請求項 1 に記載のアポトーシス調整剤。

4 . 自己免疫疾患治療剤として用いられる請求項 1 に記載のアポト一シス調整剤。

5 . 血小板減少症治療剤として用いられる請求項 1 に記載のアポト一シス調整剤。

6 . アルツハイマー病治療剤として用いられる請求項 1 に記載のアポトーシス調整剤。

7 . 肝疾患治療剤として用いられる請求項 1 に記載のァポトーシス調整剤。

8 . 癌転移抑制剤として用いられる請求項 1 に記載のァポト一シス調整剤。