KR20150093640A - 미토콘드리아 활성화를 위한 조성물 - Google Patents

미토콘드리아 활성화를 위한 조성물 Download PDF

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KR20150093640A
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송민정
신의석
조시영
손종희
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Abstract

본 발명은 키토올리고당을 유효 성분으로 함유하는 미토콘드리아 활성화를 위한 조성물에 관한 것이다. 상기 키토올리고당은 미토콘드리아 관련 효소의 활성을 증가시키고 미토콘드리아 DNA 양을 증가시킬 수 있는 바, 미토콘드리아 활성화를 위한 조성물의 유효 성분으로 적합하게 사용될 수 있다.

Description

미토콘드리아 활성화를 위한 조성물{Composition For Activating Mitochondria}
본 발명은 미토콘드리아 활성화를 위한 조성물에 관한 것이다.
미토콘드리아(mitochondria)는 세포 내 소기관으로 대부분의 진핵세포에 존재하며, 핵 DNA와 분리되는 자체적인 DNA인 미토콘드리아 DNA(mtDNA)를 가진다.
미토콘드리아의 주요 기능은 세포 내 에너지원인 ATP를 생성하는 것이다. ATP는 미토콘드리아의 기질 내의 TCA 회로를 통해 생성되는 NADH, FADH2를 사용해 전자전달계에서 생성된다. 이렇게 생성된 ATP는 다양한 에너지-요구 생합성 및 여러 가지 대사 활성을 추진시키는 데 사용된다.
또한, 미토콘드리아는 세포 내 신호전달에 중요한 역할을 하는 칼슘이온을 기질 내에 저장하고 있다가 필요시에 세포질로 공급하는 역할을 하기도 한다. 이 밖에도 세포 사멸, 증식, 대사 등을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
더욱이, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 세포의 핵 DNA와는 달리 자체적인 수선 기작(repair mechanism)이 없으며, DNA를 보호하는 역할을 하는 히스톤 단백질이 없기 때문에 상대적으로 손상되기 쉽다. 이러한 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 손상은 미토콘드리아 질환의 발병과도 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 미토콘드리아의 기능 저하로 연결되어 세포 활동에 필요한 에너지원인 ATP 합성이 감소하게 되고, 다양한 질환 발병의 원인이 된다.
한편, 키토산은 폐수처리용 응집제, 중금속 흡착제, 기능성 식품, 이온교환제, 의약용품 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 있는데, 이러한 기능적 특성은 키토산의 분자량과 탈아세틸화에 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다.
최근 키틴, 키토산 및 그 유도체가 체내에 과잉 축적된 유해 콜레스테롤을 흡착, 배설하는 탈콜레스테롤 작용, 암세포의 증식을 억제하는 항암작용, 혈압상승의 원인이 되는 염화물 이온을 흡착하고 장에서의 흡수를 억제한 뒤 체외로 배출시키는 혈압상승 억제 작용을 하며, 장내의 유효세균을 증식시키고 세포를 활성화시킨다는 것이 알려져 있다. 그 밖에도 혈당조절과 간 기능 개선 작용, 체내 중금속 및 오염물질 배출효과 등 여러 가지 생리활성을 보이기 때문에 생의학 산업분야에서 높은 부가가치를 지닌 유망한 물질로 많은 연구가 진행되고 있다.
키토올리고당은 현재 건강식품 및 일반식품의 소재로 널리 사용되고 있음에도 불구하고 관련 기능에 대한 연구는 미흡한 편이다. 이와 관련하여, 한국 특허출원공개 제2005-0104910호는 산화된 저밀도지단백(oxLDL)에서 산화 LDL의 수용체인 LOX-1 유전자 발현억제물질로서 동맥경화예방에 효과적인 키토올리고당의 기능을 개시하였다. 또한, 한국 특허출원공개 제2005-0091354호는 키토올리고당의 지질대사의 주요 인자로 콜레스테롤 항상성 조절 및 지방세포분화 등 지방세포의 합성에 관여하는 PPAR 유전자의 발현 억제기능을 개시하고 있다.
KR2005-0104910 A KR2005-0091354 A
따라서, 본 발명의 일실시예에 따른 목적은 미토콘드리아 관련 효소의 활성을 증가시키고, 미토콘드리아 DNA 양을 증가시킴으로써 미토콘드리아를 활성화시키는 조성물을 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 미토콘드리아 활성화를 위한 조성물은 키토올리고당을 유효 성분으로 함유한다.
본 발명에 따른 미토콘드리아 활성화를 위한 조성물은 미토콘드리아 관련 효소의 활성을 증가시키고 미토콘드리아 DNA 양을 증가시킬 수 있는 바, 결과적으로 미토콘드리아의 활성 및 생성을 증가시킬 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 조성물은 미토콘드리아 기능 저하와 관련하여 발병하는 질환, 예를 들면 퇴행성 질환 또는 파킨슨병 등의 예방 및 치료의 목적으로 유효하게 적용될 수 있다
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 키토올리고당 처리에 의한 SIRT1 단백질의 활성을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 키토올리고당 처리에 의한 PGC1α 프로모터 활성을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 평균분자량 1155인 젖산염 키토올리고당 처리에 의한 미토콘드리아 DNA 복제수를 정량화한 그래프이다.
본 명세서에 언급된 "키토올리고당(chito-oligosaccharide)"은 키토산을 가수분해시킨 저분자의 다당류를 의미한다. 상기 저분자는 상대적으로 분자량 범위가 예를 들어, 10000 미만, 바람직하게는 9000 이하인 것으로, 상기 분자량 범위 내에서 본 발명에 따른 상기 저분자 다당류인 키토올리고당의 분자량은 바람직하게 700 내지 9000일 수 있다.
키토올리고당은 체내 흡수가 키토산에 비해 높고, 면역 증강작용, 항산화작용(Shon Y, J. Chitin and chitosan, 2001, 6:107-110) 및 암세포 성장 저해 작용(Nam MY, J. Chitin and chitosan, 1999, 4:184-188) 등에 대한 선행연구가 있으며,또한 사염화탄소에 의해 유도된 간 상해를 억제하는 기능을 보유하고 있음이 밝혀지기도 하였다. 그럼에도 불구하고, 키토올리고당을 유효성분으로 하는 조성물이 미토콘드리아 활성화에 직접적인 효과가 있음이 측정된 바 없으며, 본 출원의 발명자들은 키토올리고당의 에너지 대사촉진과 관련된 지표를 측정하여, 키토올리고당이 미토콘드리아를 활성화시키는 효과를 발휘할 수 있음을 확인하였다.
상기 키토올리고당을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 상기 키토올리고당은 게, 새우껍질 등을 분쇄, 탈염, 단백질 제거 및 불순물 제거 공정에 의해 키틴으로 분리 정제한 후, 탈아세틸화하여 키토산을 제조한 다음, 상기 키토산을 화학적 분해 또는 효소분해하여 제조되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 키토산을 효소분해하여 제조되는 것일 수 있다.
상기 키토산을 효소분해하여 키토올리고당을 제조하는 경우, 효소분해에 사용되는 효소는 특별하게 제한되지 않으나, 예를 들어 셀룰라아제(cellulase)를 통해 키토산을 효소분해하여 제조되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 키토산을 효소분해하는 경우 제조방법은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 키토산에 정제수를 첨가한 후 염산을 2~3% 첨가하고, 40~60℃의 온도에서 교반하여, 고형분 5~10%의 염산이 함유된 키토산 분산액을 만든 다음, 완전히 용해된 후, pH를 4~6으로 조정하고 키토산 분해 효소인 셀룰라아제를 정제수에 용해하여 투입하고, 이후 40~60℃에서 14~20시간 가수분해한 후, 80℃에서 30분간 열처리하여 효소를 실활한 다음, 여과 건조과정을 거쳐 키토올리고당을 제조할 수 있다.
상기 키토올리고당의 분자량은 예를 들어, 700 내지 9000일 수 있으며, 이러한 분자량 범위의 키토올리고당은 우수한 미토콘드리아 활성화 효과를 나타낼 수 있다. 상기 키토올리고당의 분자량은 제조공정 중 셀룰라아제의 첨가량에 따라 변화할 수 있으며, 셀룰라아제 효소의 투입량을 기준으로 키토산의 10% 셀룰라아제 효소 투입시에는 분자량 1000이하로, 키토산의 6% 셀룰라아제 효소 투입시에는 분자량 1500-2000으로, 키토산의 3% 셀룰라아제 효소 투입시에는 분자량 7000-10000의 키토올리고당을 얻을 수 있다. 이를 통해, 키토산을 효소분해하여 제조되는 분자량이 700 내지 9000인 키토올리고당을 제조할 수있다.
상기 키토올리고당은 미토콘드리아 활성화를 위한 조성물의 유효 성분으로서, 예를 들어 SIRT1(sirtuin 1)의 활성을 증가시키거나, PGC1α(PPARγ coactivator 1α)의 활성을 증가시키거나, 또는 미토콘드리아 DNA의 복제수(copy number)를 증가시키는 것일 수 있다.
상기 키토올리고당은 각종 다양한 염을 포함하는 키토올리고당일 수 있으며, 염의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 상기 키토올리고당은 예를 들어 평균 분자량 1155 젖산염 키토올리고당(L24)일 수 있으며, 하기 실시예에 입증된 바와 같이 각종 다양한 염을 포함하는 키토올리고당 중에서 평균 분자량 1155 젖산염 키토올리고당(L24)을 처리한 실험군에서 현저한 SIRT1(sirtuin 1)의 활성 증가, PGC1α(PPARγ coactivator 1α)의 활성 증가 또는 미토콘드리아 DNA의 복제수(copy number) 증가가 나타남을 확인하였다.
상기 SIRT1(sirtuin 1)과 PGC1α(PPARγ coactivator 1α)는 미토콘드리아 생성(mitochondria biogenesis)에 중요한 역할을 할 수 있다. 상기 SIRT1은 NAD-의존성(NAD-dependent) 탈아세틸화효소로, 미토콘드리아의 생성을 증가시킬 수 있다. 상기 PGC1α는 90 kDa의 핵 단백질로, 에너지 대사에 관여하는 유전자들을 조절하는 전사 보조활성인자이다. 상기 SIRT1에 의해 활성화되는 PGC1α는 ATP 생성과 미토콘드리아 생성에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시킬 수 있다. 이와 관련하여, 하기 실시예에 입증된 바와 같이 키토올리고당은 SIRT1(sirtuin 1)의 활성 및 PGC1α(PPARγ coactivator 1α)의 활성을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 손상 정도를 측정하거나 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 카피 수 측정에 의해 미토콘드리아의 생성 정도를 직접적으로 알아볼 수 있으며, 하기 실시예에 입증된 바와 같이 키토올리고당은 미토콘드리아 DNA의 복제수(copy number)를 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 미토콘드리아의 활성화와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물은 키토올리고당을 유효성분으로 포함함으로써 미토콘드리아의 활성 저하와 관련된 각종 퇴행성 질환, 뇌 질환, 신경 질환, 심장 질환, 간 질환, 신장 질환, 췌장 질환 또는 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물일 수 있다.
상기 퇴행성 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 퇴행성관절염, 류마티스성 관절염 또는 골성관절염 일 수 있다.
상기 뇌 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 치매, 파킨슨병, 뇌졸증, 발달지연, 신경정신장애, 편두통, 자폐증, 정신지체, 발작 또는 중풍 일 수 있다.
상기 신경 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 안검하수, 시신경위축, 사시, 망막색소변성증, 실명, 청력손실, 눈근육마비, 반사작용 저하, 실신, 신경 통증 또는 자율신경실조증 일 수 있다.
상기 심장 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 심장마비 또는 심장근육병증 일 수 있다.
상기 간 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 저혈당증 또는 간부전 일 수 있다.
상기 신장 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 신세뇨관산증 일 수 있다.
상기 췌장 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 췌장외분비기능부족증 또는 부갑상선부족증일 수 있다.
상기 근육 질환은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 과민성 장 증후군, 근육통, 근이영양증, 위식도역류질환, 저혈압, 경련, 운동장애, 변비 또는 설사일 수 있다.
상기 조성물은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 건강식품 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.
상기 건강식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐제 및 드링크 등과 같은 각종 형태로 제형화될 수 있다.
또한, 상기 건강식품 조성물에는 필요에 따라서 하기의 첨가제의 1종 또는 2종 이상을 첨가 배합할 수도 있다. 상기 첨가제로는, 예를 들어 그레이프프루트, 사과, 오렌지, 레몬, 파인애플, 바나나, 배 등의 각종 과즙(농축 과즙, 분말 과즙 등이어도 좋다); 비타민류(팔미트산 레티놀, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발아민(cyanocobalamine), 아스코르빈산 나트륨, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 엽산, 비오틴, 콜레칼시페롤(cholecalciferol), 중주석산 콜린, 토코페롤, β-카로틴 등의 수용성 및 지용성 비타민류); 향미료(레몬플레이버, 오렌지플레이버, 딸리플레이버, 그레이프프루트플레이버, 바닐라 에센스 등); 아미노산, 핵산 및 그들의 염류(글루탐산, 글루탐산나트륨, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴산 나트륨, 이노신산 등); 식물 섬유(폴리덱스트로오즈, 펙틴, 크산탄 고무, 글루코만난, 알긴산 등); 또는 미네랄류(염화 나트륨, 초산 나트륨, 황산 마그네슘, 염화 칼륨, 염화 마그네슘, 탄산 마그네슘, 염화 칼슘, 인산 2칼륨, 인산 1나트륨, 글리세로 인산 칼슘, 구연산제1철 나트륨, 구연산철 암모늄, 구연산철, 황산망간, 황산구리, 요오드화나트륨, 솔빈산칼륨, 아연, 망간, 구리, 요오드, 코발트 등) 등이 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 본 발명에 따른 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 언급된 중량비로 조합된 조성물 1 내지 500mg/kg, 바람직하게는 30 내지 200 mg/kg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 키토올리고당의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 10 ~ 90 중량% 범위로 함유되는 것이 바람직하다. 이는 정제 및 연질캡슐 제조시, 분말 및 기능성 성분의 함량이 10 ~ 60%, 하드캡슐의 제조시, 분말 및 기능성 성분의 함량이 10 ~ 90%일 수 있는 점을 고려하여, 키토올리고당을 10 ~ 90%로 함유하는 건강식품 조성물 또는 약학 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 in vitro 실험을 통해서 키토올리고당이 미토콘드리아 생성에 미치는 영향을 분석하였다. 즉, 키토올리고당이 미토콘드리아 생성을 증가시키는지 검토하기 위해 키토올리고당을 C2C12 근육세포에 처리한 뒤, SIRT1 활성 정도와 PGC1α의 프로모터 활성 정도, 및 미토콘드리아DNA(mtDNA) 카피 수를 측정하였다.
[ 시험예 1] SIRT1 활성화에 미치는 영향
SRIT1 활성 측정에는 'SIRT1 Fluorimetric Drug Discovery Kit'(BIOMOL, AK-555)를 사용하였다. SIRT1 인간 재조합(SIRT1 human recombinant) 단백질과 SIRT1의 기질인 Fluor de Lys-SIRT1과 NAD+는 키트에서 제공하는 것을 사용하였다. 전체 반응 부피 50㎕ 중, SIRT1 단백질은 1U을 사용하였고, 기질 [Fluor de Lys-SIRT1 : NAD+ = 50μM : 100μM]의 농도로 사용하였다. 실험에 처리한 키토올리고당은 각각 500 ppm으로 처리하였다. SIRT1 단백질과 기질, 실험 물질을 우선 처리하여 45분 반응시킨 후, Fluor de LysTM Developer Ⅱ/2 mM 니코틴 아마이드(nicotinamide)를 첨가한 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 결과는 형광 측정 기기인 플렉스스테이션 3(Flexstation 3: Molecular Devices, Ex. 360 nm, Em. 460 nm)을 사용하여 클린-볼륨 96-웰 마이크로플레이트(clean-volume 96-well microplates: Corning Costar사)에서 측정하였다. 대조군은 SIRT1 단백질이 따로 첨가되지 않은 블랭크(blank) 값을 사용하였다. 또한, 양성 대조군은 레스버러트롤(resveratrol) 100 μM을 사용하였고, 음성대조군으로는 니코틴아마이드(nicotinamide) 100 μM을 사용하였다. 하기 표 1에 나타난 바와 같이 다양한 염을 포함하는 키토올리고당을 이용하여 SIRT1 활성을 측정한 결과를 도 1에 나타내었으며, 도 1에 나타난 바와 같이, 대부분의 키토올리고당이 SIRT1의 활성을 증가(대조군 대비 약 1.5~3 배 증가)시키는 것으로 나타났다.
[표 1]
Figure pat00001
특히, 젖산염 키토올리고당 중 평균 분자량이 가장 작은 L24 키토올리고당에서 SIRT1 활성이 대조군 대비 약 3.1 배로 가장 높게 측정되었다. 이러한 결과는 키토올리고당이 미토콘드리아 생성에 중요한 역할을 하는 단백질인 SIRT1의 활성을 증가시켜 미토콘드리아 활성을 증가시킬 수 있는 가능성을 보여준다.
[ 시험예 2] PGC1 α프로모터 활성에 미치는 영향
PGC1α프로모터 활성 실험은 PGC1α 프로모터를 함유하는 형질감염 Huh7 세포주를 이용하여 수행하였다. 양성 대조군으로는 레스버러트롤(resveratrol) 100 μM을 사용하였고, 시험예 1과 마찬가지로 하기 표 2에 나타난 바와 같이 다양한 염을 포함한 키토올리고당을 평균 분자량을 기준으로 각각 5 그룹으로 나누어 500 ppm을 세포주에 처리하였다. 키토올리고당 24 시간 처리 후, PBS(Phosphate buffered saline) 용액으로 2회 세척하고 루시퍼라제 분석 키트(Steady Glo Luciferase assay system, Promega, E2520)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 구체적으로, 루시퍼라제 시약(Steady Glo Reagent) 100 ㎕를 세포가 들어있는 배양접시에 첨가하여 5분 동안 반응 시켰다. 반응이 끝난 후에, 96-웰 플레이트(96-well plate)로 각 샘플을 옮긴 다음, 형광 측정기(Luminometer)를 이용하여 형광발색 값을 측정하였다.
[표 2]
Figure pat00002
도 2에서 보는 바와 같이, 아스코르빈산염 키토올리고당을 제외한 대부분의 키토올리고당은 PGC1α프로모터 활성을 약 1.2~2 배 정도 증가시키는 것을 확인하였다. 특히, 평균 분자량 1155 젖산염 키토올리고당(L24)은 시험예 1의 SIRT1 활성 측정 실험에서와 마찬가지로 PGC1α프로모터에도 가장 큰 활성을 보였다. SIRT1과 같이 미토콘드리아 생성에 중요한 역할을 하는 PGC1α가 키토올리고당에 의해 그 프로모터의 활성이 증가했다는 것은 키토올리고당이 미토콘드리아 생성 및 활성화를 증가시킴을 시사한다.
[ 시험예 3] 미토콘드리아 카피 수에 미치는 영향
(1) C2C12 세포의 배양 및 분화
C2C12는 생쥐 유래 세포이며, ATCC에서 구입하였다. C2C12 세포를 10 % 우혈청(fetal bovine serum), 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 포도당 4.5 g/L의 DMEM(Dulbecco modified eagle's medium)에서 배양하였다. 배양 접시 내의 세포 밀도가 95~100 %에 이르게 되면, 근육세포로 분화할 수 있도록 2 % 호스 세럼(horse serum), 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 포도당 4.5 g/L의 DMEM으로 배양액을 교환하여 약 5일 정도 분화시켰다.
(2) 미토콘드리아 카피 수에 미치는 영향
시험예 3의 방법으로 근육세포로 분화시킨 C2C12 세포에 표 3에서와 같이 양성대조군인 레스버라트롤(resveratrol) 50μM과 시험예 1과 2에서 가장 뛰어난 효과를 보인 평균분자량 1155인 젖산염 키토올리고당 500 ppm을 24 시간 처리하였다. PBS 용액으로 1회 세척하고 DNA 분리 키트(DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, 69504)를 사용하여 총 DNA를 분리하였다.
[표 3]
Figure pat00003
그 후, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 카피 수를 결정하기 위해, 다음과 같이 정량적 PCR을 수행하였다. 공지된 생쥐의 미토콘드리아 DNA 염기서열(Xiao-Rui cheng, Neurobiol Aging, 2007, 28:297-506)에 기초하여 Mtco1 유전자의 일부분을 증폭하는(250 bp 크기) 프라이머 Mtco1-F(5'-TATCCAACTCATCCCTTGACATCG-3':서열번호 1)와 Mtco1-R(5'-GAGTAGCGTCGTGGTATTCCTG-3':서열번호 2)을 합성하였다. 미토콘드리아 DNA는 미토콘드리아 고유의 유전자를 핵에서 발현되는 유전자로 나누어 보정하여 카피 수를 결정하게 되는데 핵 유전자는 β-actin(TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems, NM_007393.3)을 사용하였다. PCR 반응 조건은 Mtco1 유전자의 경우, 전체 20 ㎕ 반응용액 중, iQTM SYBR Green Supermix(BioRad, 170-8880) 10 ㎕, 프라이머 각 5 pmole을 사용하여 95℃ 3분 1회 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 20초 동안 반응시키는 과정을 50회 실시하여 유전자가 증폭됨에 따라 증가하는 형광을 실시간으로 로토-진(Rotor-Gene: Corbett Research, RG3000)기기를 통해 측정하였다. β-actin 유전자의 PCR 반응 조건은 전체 20 ㎕ 반응 용액 중, QuantiTectTM Probe PCR Kit(Qiagen, 204343) 10 ㎕, 프라이머 1 ㎕를 사용하여 50℃ 2분 1회, 95℃ 10분 1회 후, 95℃ 15초, 60℃ 1분 동안 반응시키는 과정을 50회 실시하여 유전자가 증폭됨에 따라 증가하는 형광을 측정하였다.
실험 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3을 참조하면, 평균분자량 1155인 젖산염 키토올리고당 500 ppm을 처리한 경우, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 카피 수가 대조군 대비 약 30 % 정도 증가하였다. 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 카피 수의 증가는 미토콘드리아 생성이 증가되었음을 직접적으로 보여주는 지표로 키토올리고당이 앞서 실험한 SIRT1 활성과 PGC1α 프로모터 활성 증가를 통해 미토콘드리아의 활성을 증가시키고 생성 또한 증가시킨다는 것을 확인하였다.
하기에 상기 조성물의 제형예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[ 제형예 1] 연질 캡슐의 제조
키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 팜유 2mg, 식물성 경화유 8mg, 황납 4mg 및 레시틴 9mg을 혼합하고, 통상의 방법에 따라 혼합하여 연질캡슐 충진액을 제조하였다. 1 캡슐당 400㎎씩 충진하여 연질캡슐을 제조하였다. 그리고, 상기와 별도로 젤라틴 66 중량부, 글리세린 24 중량부 및 솔비톨액 10 중량부의 비율로 연질캡슐시트를 제조하고 상기 충진액을 충진시켜 본 발명에 따른 조성물 400mg이 함유된 연질캡슐을 제조하였다.
[ 제형예 2] 정제의 제조
키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 갈락토올리고당 200㎎, 유당 60㎎ 및 맥아당 140㎎을 혼합하고 유동층 건조기를 이용하여 과립한 후 당 에스테르(sugar ester) 6㎎을 첨가하였다. 이들 조성물 504mg을 통상의 방법으로 타정하여 정제를 제조하였다.
[ 제형예 3] 드링크제의 제조
키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 포도당 10g, 구연산 0.6g, 및 액상 올리고당 25g을 혼합한 후 정제수 300㎖를 가하여 각 병에 200㎖씩 되게 충진하였다. 병에 충진한 후 130℃에서 4∼5 초간 살균하여 음료를 제조하였다.
[ 제형예 4] 과립의 제조
키토올리고당 80mg, 비타민 E 9mg, 비타민 C 9mg, 무수결정 포도당 250㎎ 및 전분 550㎎을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하여 제조하였다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
<110> Amorepacific Corporation <120> Composition For Activating Mitochondria <130> 15p399ind <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tatccaactc atcccttgac atcg 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gagtagcgtc gtggtattcc tg 22

Claims (7)

  1. 미토콘드리아 기능 저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 조성물은, 키토올리고당 젖산염을 유효 성분으로 함유하고,
    상기 미토콘드리아 기능 저하 관련 질환은, 뇌 질환, 신경 질환, 심장 질환, 간 질환, 신장 질환, 췌장 질환, 근육 질환, 퇴행성관절염, 류마티스성 관절염, 골성관절염, 치매, 파킨슨병, 뇌졸증, 발달지연, 신경정신장애, 편두통, 자폐증, 정신지체, 발작, 중풍, 안검하수, 시신경위축, 사시, 망막색소변성증, 실명, 청력손실, 눈근육마비, 반사작용 저하, 실신, 신경 통증, 자율신경실조증, 심장마비, 심장근육병증, 저혈당증, 간부전, 신세뇨관산증, 췌장외분비기능부족증, 부갑상선부족증, 과민성 장 증후군, 근육통, 근이영양증, 위식도역류질환, 저혈압, 경련, 운동장애, 변비 및 설사로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 조성물.
  2. 미토콘드리아 기능 저하 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로서,
    상기 조성물은, 키토올리고당 젖산염을 유효 성분으로 함유하고,
    상기 미토콘드리아 기능 저하 관련 질환은, 뇌 질환, 신경 질환, 심장 질환, 간 질환, 신장 질환, 췌장 질환, 근육 질환,퇴행성관절염, 류마티스성 관절염, 골성관절염, 치매, 파킨슨병, 뇌졸증, 발달지연, 신경정신장애, 편두통, 자폐증, 정신지체, 발작, 중풍, 안검하수, 시신경위축, 사시, 망막색소변성증, 실명, 청력손실, 눈근육마비, 반사작용 저하, 실신, 신경 통증, 자율신경실조증, 심장마비, 심장근육병증, 저혈당증, 간부전, 신세뇨관산증, 췌장외분비기능부족증, 부갑상선부족증, 과민성 장 증후군, 근육통, 근이영양증, 위식도역류질환, 저혈압, 경련, 운동장애, 변비 및 설사로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 키토올리고당 젖산염은 분자량이 700 내지 9000인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유효 성분은 SIRT1(sirtuin 1)의 활성을 증가시키는, 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유효 성분은 PGC1α(PPARγ coactivator 1α)의 활성을 증가시키는, 조성물.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유효 성분은 미토콘드리아 DNA의 복제수(copy number)를 증가시키는, 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 유효 성분은 조성물 전체 중량에 대하여 10~90 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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