TW202246344A - 一種抗Claudin18.2抗體及其抗體藥物偶聯物 - Google Patents
一種抗Claudin18.2抗體及其抗體藥物偶聯物 Download PDFInfo
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Abstract
本發明提供了一種靶向Claudin 18.2的抗體、抗體藥物偶聯物及其在治療癌症中的用途。本發明還提供了編碼上述Claudin 18.2抗體的核苷酸、多核苷酸組合、表達載體及表達載體組合、包含上述Claudin 18.2的抗體、抗體藥物偶聯物的藥物組合物以及它們在製備治療或預防癌症藥物中的應用。
Description
本發明涉及生物醫藥領域,尤其涉及一種抗Claudin18.2抗體及其抗體藥物偶聯物,本發明還涉及上述抗體及其抗體藥物偶聯物的用途。
近年來,全球惡性腫瘤的總體發病率呈現持續升高的趨勢,嚴重威脅著人類的健康和生存。目前臨床上治療惡性腫瘤主要以手術、化療和放療為主,但是都很難達到滿意的療效。抗體藥物偶聯物(antibody-drug conjugate,ADC)是一種通過化學連接子(Linker)將具有生物活性的藥物(Drug)和抗體(Antibody)連接起來的一類生物藥。近些年,多個抗體藥物偶聯物在治療惡性腫瘤方面取得了突破性的進展,使其成為了繼手術、化療、放療後的一大新興治療方法。但截止到2021年3月,全球僅批准了11種抗體偶聯藥物(美國FDA批准了10種,日本PMDA批准了一種),且獲批適應症種類較少,遠不能滿足目前惡性腫瘤患者的臨床需求。
細胞連接密蛋白(Claudins或CLDNs)廣泛分佈於各種上皮組織,是細胞緊密連接的重要結構成分。研究發現,CLDNs蛋白與上皮細胞維持滲透壓、屏障功能以及細胞極性密切相關(文獻1:Gunzel D.Claudins:vital partners in transcellular and paracellular transport coupling[J].Pflugers Arch,2017,469(1):35-44.),且參與對病原體的免疫防禦過程(文獻2:Colpitts CC,Baumert TF.Claudins in viral infection:from entry to spread[J].Pflugers Arch,2017,469(1):27-34.)。另外,CLDNs被證實在許多腫瘤的發生發展過程中存在表達模式的改變,將CLDNs譜系作為特異性標誌蛋白的靶向治療研究已得到廣泛關注。但是,儘管大部分的CLDNs廣泛表達,但其中的個別成員如CLDN 18蛋白往往高度選擇性地表達於胃腸道等特定組織。CLDN 18基因位於人第3號染色體的3q22.3,其基因第一個外顯子有兩種選擇,由此形成兩種不同的剪切突變體,可表達出N端69個不同氨基酸序列的兩種蛋白亞型,分別為Claudin 18.1蛋白和CLDN 18.2蛋白(文獻3:Hayashi D,Tamura A,Tanaka H,et al.Deficiency of claudin- 18 causes paracellular H+leakage,up- regulation of interleukin- 1 β,and atrophic gastritis in mice[J].Gastroenterology,2012,142(2):292-304.),其中Claudin 18.1蛋白是肺泡上皮細胞選擇性表達的特異性抗原,僅在正常肺泡組織中高度表達,而在其他正常組織包括胰管等組織均未發現(文獻4:Li G,Flodby P,Luo J,et al.Knockout mice reveal key roles for clau-din 18 in alveolar barrier properties and fluid homeostasis[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,51(2):210-222.);Claudin 18.2蛋白也是一種具有高度選擇性的標誌蛋白,但其分佈的組織與Claudin 18.1蛋白完全不同。Claudin 18.2蛋白在正常健康組織中表達高度受限,但在胃癌、乳腺癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、支氣管癌以及非小細胞肺癌等多種原發惡性腫瘤中異常啟動和過度表達,尤其好
發於消化系統惡性腫瘤,包括胃癌(70%),胰腺癌(50%),食管癌(30%)等(文獻5:Kumar V,Soni P,Garg M,et al.Emerging Therapies in the Manage-ment of Advanced-Stage Gastric Cancer[J].Front Pharmacol,2018,9:404.)。另有研究表明,CLDN 18.2蛋白的表達並不局限于原發灶,在轉移灶中也高度表達,可能參與惡性腫瘤細胞增殖和趨化轉移的過程(文獻6:Woll S,Schlitter AM,Dhaene K,et al.Claudin 18.2 is a target for IMAB362 antibody in pancreatic neoplasms[J].Int J Cancer,2014,134(3):731-739;文獻7:Jiang H,Shi Z,Wang P,et al.Claudin18.2-Specific Chimeric Antigen Receptor Engineered T Cells for the Treatment of Gastric Cancer[J].J Natl Cancer Inst,2018,111(4):1-10.)。因此,Claudin 18.2是一種非常理想的腫瘤患者標記物和抗腫瘤藥物開發靶點,特別是胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌等,但是由於其靶點的特殊性(結構與Claudin 18.1高度相似,且二者胞外區第一結構域完全相同),Claudin 18.2治療性抗體的開發非常困難,這也是限制Claudin 18.2靶向藥物開發的主要原因。
目前靶向Claudin 18.2的抗體藥物偶聯物均處於臨床前研究階段,尚無一款推進到臨床階段。因此,開發靶向Claudin 18.2的抗體藥物偶聯物為臨床提供更多的選擇已迫在眉睫。
本發明提供了一種靶向Claudin 18.2的抗體、抗體藥物偶聯物及其在治療癌症中的用途。本發明還提供了編碼上述Claudin 18.2抗體的的核苷酸、多核苷酸組合、表達載體及表達載體組合、包含上述Claudin 18.2的抗體、抗體藥物偶聯物的藥物組合物以及它們在製備治療或預防癌症藥物中的應用。
具體的,本發明提供了一種抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段,所述抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區和輕鏈可變區,所述重鏈可變區的CDR和/或所述輕鏈可變區的CDR與如下序列限定的抗體具有相同的CDR序列或在如下序列限定的抗體的CDR上進行1-2個氨基酸替換,所述序列限定的抗體為:
(1)重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示;和/或
(2)輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示。
在特定實施方案中,根據採用不同的測定方法或系統認定,相
應重鏈和輕鏈可變區的互補決定區CDR1-3如表2所示。
進一步的,本發明還提供了一種抗Claudin18.2抗體或抗原結合片段,在某些具體實施方案中,其包含重鏈和輕鏈可變區序列,其中
(1)重鏈可變區CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:3、4、5、6或7所示或對SEQ ID NO:3、4、5、6或7進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序
列;CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示或對SEQ ID NO:8、9、10、11或12進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:13、14、15、16或17所示或對SEQ ID NO:13、14、15、16或17進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;
(2)輕鏈可變區CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:18、19、20、21或22所示或對SEQ ID NO:18、19、20、21或22進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:23、24、25、26或27所示或對SEQ ID NO:23、24、25、26或27進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:28、29、30、31或32所示或對SEQ ID NO:28、29、30、31或32進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列。
進一步的,本發明提供的抗Claudin18.2抗體或抗原結合片段,在某些具體的實施方案中,其中:
(1)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:3、8、13或對SEQ ID NO:3、8、13進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:18、23、28或對SEQ ID NO:18、23、28進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;
(2)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:4、9、14或對SEQ ID NO:4、9、14進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:19、24、29或對SEQ ID NO:19、24、29進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;
(3)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:5、10、15或對SEQ ID NO:5、10、15進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:20、25、30或對SEQ ID NO:20、25、30進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;
(4)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:6、11、16或對SEQ ID NO:6、11、16進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:21、26、31或對SEQ ID NO:21、26、31進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;
(5)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:7、12、17或對SEQ ID NO:7、12、17進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:22、27、32或對SEQ ID NO:22、
27、32進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列。
在某些具體實施方案中,本發明所提供的抗體或其抗原結合片段,其包括選自如下一組的可變區:
(1)重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,或與SEQ ID NO:1具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO:1相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列;和/或
(2)輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或與SEQ ID NO:2具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO:2相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列。
在特定的實施例中,本發明涉及的抗Claudin18.2抗體的重鏈可變區氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1):
在特定的實施例中,本發明涉及的抗Claudin18.2抗體的輕鏈可變區氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2):
在特定的實施例中,本發明涉及的抗Claudin18.2的:(1)重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;和/或(2)輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在某些具體實施方案中,本發明所提供的抗體或其抗原結合片段,其中:(1)重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示;和/或(2)輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
本發明所提供的抗體可以是單克隆抗體、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、單鏈Fv(“scFv”)、雙抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、嵌合抗體、人源化抗體或包含抗體的抗原結合部分的融合蛋白;優選的,所述的抗體為人源化單克隆抗體。
本發明所提供的抗體進一步包括人或鼠恒定區;優選的,所述恒定區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
本發明還提供了一種抗體藥物偶聯物,其含有前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
進一步的,所述的抗體藥物偶聯物結構如式(I)所示:
Ab-L-D (I)
其中:
Ab為前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段;
D為活性藥物單元;
L為任一連接基團,其分別與抗體或其抗原結合片段Ab及活性藥物單元D共價連接;
其中,所述Ab上通過一個或多個連接基團L連接一個或多個活性藥物單元D。
進一步的,所述的L與抗體Ab上氨基殘基或巰基殘基共價連接;優選的,所述L與抗體Ab上的巰基殘基共價連接;更優選的,所述L與抗體Ab上的鏈間二硫健打開後形成的巰基殘基共價連接。
進一步的,所述的L為可裂解連接子和不可裂解連接子。
更進一步的,所述的可裂解連接子包括肽單元,所述的肽單元包含2-20個氨基酸,優選的所述的肽單元選自由-纈氨酸-瓜氨酸-(-Val-Cit-)、-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-(-Gly-Gly-Phe-Gly-)、-纈氨酸-丙氨酸-(-Val-Ala-)、-纈氨酸-賴氨酸-(-Val-Lys-)、-纈氨酸-精氨酸-(-Val-Arg-)、-苯丙氨酸-瓜氨酸-(-Phe-Cit-)、-苯丙氨酸-賴氨酸-(-Phe-Lys-)、-苯丙氨酸-精氨酸-(-Phe-Arg-)及它們的組合。
進一步的,前述任一項所述的抗體藥物偶聯物,其特徵在於,所述的L包括現有的連接子結構(專利公開號為CN110997010A的中國發明專利說明書第7-10頁):
進一步的,所述的活性藥物單元D為細胞毒分子、細胞分化因數、幹細胞營養因數、類固醇類藥物、治療自身免疫疾病的藥物、抗炎症藥物或治療傳染性疾病的藥物;優選的,所述細胞毒分子包括但不限於微管蛋白抑制劑或DNA損傷劑,所述微管蛋白抑制劑包括但不限於海兔毒素(dolastatin)及奧瑞他汀(auristatin)類細胞毒分子,美登素(maytansine)類細胞毒分子;所述DNA損傷劑包括但不限於卡奇黴素類(calicheamicin)、倍癌黴素(duocarmycin)類、安麯黴素類衍生物PBD、喜樹堿(camptothecins)及喜樹堿類衍生物、SN-38;更優選的,所述奧瑞他汀(auristatin)類細胞素分子包括但不限於MMAE或MMAF或它們的衍生物,所述美登素類細胞毒分子包括但不限於DM1、DM4或它們的衍生物。更進一步的,所述的活性藥物單元D包含現有的用於ADC中的活性藥物單元(專利公開號為CN110997010A的中國發明專利說明書第12-14頁):
在一些優選的實施例中,本發明提供了如下結構的抗體藥物偶聯物(即Ab--Mc-Val-Cit-PAB-MMAE):
在另一些優選的實施例中,本發明提供了如下結構的抗體藥物偶聯物(即Ab-D07-Val-Cit-PAB-MMAE):
在另一些優選的實施例中,本發明提供了如下結構的抗體藥物偶聯物(即Ab--PY-Val-Cit-MMAE):
本發明還提供了一種分離的多核苷酸,其編碼前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供了一種分離的多核苷酸的組合,其包括:編碼前述任一項所述抗體或其抗原結合片段之重鏈的多核苷酸和編碼前述任一項所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈的多核苷酸。
本發明還提供了一種核酸構建體,其包含前述所述的多核苷酸。
進一步的,所述核酸構建體為載體。
本發明還提供了一種宿主細胞,其包含前述所述的核酸構建體或載體。
進一步的,所述的宿主細胞是原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸桿菌細胞或CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、
BHK細胞。
本發明還提供了一種藥物組合物,包含前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段和/或抗體藥物偶聯物,以及藥學上可接受的載體。
本發明還提供了一種製備抗Claudin18.2抗體的方法,其包括在適合表達編碼抗Claudin18.2抗體或抗原結合片段的載體的條件下培養前述所述的宿主細胞,並且回收所述抗體或片段。
前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段、抗體藥物偶聯物、多核苷酸、多核苷酸組合、核酸構建體、載體、或藥物組合物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途,其中所述癌症為實體瘤;進一步的,所述實體瘤包括胃癌、胰腺癌。
圖1為抗Claudin18.2鼠源抗體CLN-03-3A7、CLN-03-4E5、CLN-03-6H2給藥後動物腫瘤體積變化曲線圖;
圖2為抗Claudin18.2鼠源抗體CLN-03-3A7、CLN-03-4E5、CLN-03-6H2給藥後動物體重變化曲線圖;
圖3為嵌合抗體CLN-03-4E5-01、CLN-03-6H2-01及IMAB362親和力檢測對比圖;
圖4為嵌合抗體CLN-03-6H2-01及IMAB362內吞效率對比圖;
圖5為流式細胞法檢測RGCLN18.2及RGCLN18.2-PY-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-D07-Val-Cit-PAB-MMAE、IMAB362-MC-Val-Cit-MMAE的內吞效果對比圖;
圖6為RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE、IMAB362-MC-Val-Cit-PAB-MMAE及PBS給藥後動物體重變化曲線圖;
圖7為RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE、IMAB362-MC-Val-Cit-PAB-MMAE及PBS給藥後荷瘤體積變化曲線圖。
除非另有定義,本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關於本領域的定義及術語,專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。
在本發明中,抗體可變域的互補決定區(CDR)測定或編號方法包括本領域熟知的IMGT、Kabat、Chothia、AbM以及Contact法。
對本發明來說,兩種核酸或者氨基酸序列間的“一致性”、“同一性”或“相似性”是指,在最佳比對(最優比對)後所獲得的、待比較的兩序列之間相同核苷酸或相同氨基酸殘基的百分數,該百分數是純粹統計學的並且兩種序列間的差異隨機分佈並覆蓋其全長。兩種核酸或者氨基酸序列之間的序列比較通常是在以最優方式使它們匹配以後,通過比較這些序列而進行,所述比較能夠通過區段或者通過“比較窗”實施。除了能夠手工實施外,用於比較序列的最優比對,還能夠通過Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源性演算法、通過Neddleman和Wunsch的(1970)[J.MoI.Biol.48:443]局部同源性演算法、通過Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)相似性搜索方法、通過使用這些演算法的電腦軟體實施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI,或者通過BLAST N or BLAST P比較軟體)。
本文所使用的“抗體”以最廣義使用,並且涵蓋各種抗體結構,包括但不限於單克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體);本文所使用的“抗原結合片段”是指抗體片段由其來源抗體的重或輕可變鏈的部分序列構成或者包含它們,所述部分序列足以保留與其來源抗體相同的結合特異性和充分的親和力,優選至少等於其來源抗體親和力的1/100,在更優選方式中至少等於1/10。這種功能片段將包含最少5個氨基酸,優選其來源的抗體序列的10、15、25、50和100個連續氨基酸。包括(特別是)Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體,其含有至少一個足以使得特異性抗原結合於該多肽的免疫球蛋白片段。上述片段可經合成、或酶法、
或通過對完整免疫球蛋白的化學切割而製備,或通過重組DNA技術進行遺傳工程改造。其生產的方法在本領域中眾所周知。一條重鏈包含一重鏈可變區(縮寫為VH)和一重鏈恒定區。重鏈恒定區包含三個域(domain),CH1、CH2和CH3。一條輕鏈包含一輕鏈可變區(縮寫為VL)和一輕鏈恒定區。該輕鏈恒定區包含一個域,CL。VH和VL區域還可再細分為具有高可變性的多個區,被稱為互補決定區(CDR),其間散佈有更為保守的被稱為框架區(FR)的多個區域。每個VH和VL均由三個CDR和四個FR構成,按照以下順序從氨基端至羧基端排布:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的這些可變區包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主的組織或因數結合,包括免疫系統的各種細胞(如效應細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。嵌合或人源化抗體也涵蓋在根據本發明的抗體中。
術語“人源化抗體”是指一種抗體,其包含來源於非人源抗體的CDR區、並且該抗體分子的其他部分來源於一種(或幾種)人抗體。而且,為了保留結合親和力,可以修飾骨架(稱為FR)區段的一些殘基(文獻8:Jones et al.,Nature,321:522-525,1986;Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536,1988;Riechmann et al.,Nature,332:323-327,1988.)。通過本領域技術人員已知的技術可以製備根據本發明的人源化抗體或其片段(文獻9:Singer et al.,J.Immun.150:2844-2857,1992;Mountain et al.,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10:1-142,1992;或Bebbington et al.,Bio/Technology,10:169-175,1992.)。
術語“嵌合抗體”系指以下抗體,其中的可變區序列來自一物種而恒定區序列來自另一物種,例如可變區序列來自小鼠抗體而恒定區序列來自人抗體的抗體。通過使用基因重組技術可以製備根據本發明的嵌合抗體或其片段。例如,所述嵌合抗體可以通過克隆重組DNA來生產,所述重組DNA包含啟動子和編碼根據本發明的非人尤其是鼠單克隆抗體可變區的序列、以及編碼人抗體恒定區的序列。由這種重組基因編碼的本發明嵌合抗體將是,例如,鼠-人嵌合體,該抗體的特異性由來源於鼠DNA的可變區確定,並且其同種型由來源於人DNA的恒定區來確定。對於製備嵌合抗體的方法,例如,可以參考檔Verhoeyn et al.(BioEssays,8:74,1988)。
術語“單克隆抗體”系指具有單一分子組成的抗體分子的製備
物。單克隆抗體組合物顯示出對於特定表位元的單一結合特異性和親和性。
術語“分離地”核酸分子是從至少一個污染物核酸分子中鑒別與分離的核酸分子,在抗體核酸的天然來源中其一般地與該污染物核酸分子有聯繫。分離的核酸分子在其形式或環境上與其在自然界中發現時不同。分離的核酸分子因此不同于其在自然細胞中存在的核酸分子。然而,分離的核酸分子包括在通常表達抗體的細胞中加以包含的核酸分子,在該細胞中例如核酸分子位於與自然細胞不同的染色體位置上。
通常,為了製備單克隆抗體或其功能片段,尤其是鼠源的單克隆抗體或其功能片段,可以參考尤其描述在手冊“Antibodies”中的技術(文獻10:Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,1988)或者參考Kohler和Milstein描述的從雜交瘤細胞製備的技術(Nature,256:495-497,1975)。
[實施例]
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述,但是本領域技術人員將會理解,下面實施例僅用於說明本發明,而不應視為限定本發明的範圍。
實施例1 抗Claudin18.2鼠源抗體篩選及親和力檢測
以包含編碼Claudin18.2第一胞外區蛋白的真核表達質粒的細胞作為免疫原免疫Claudin18.2敲除小鼠(來源於百奧賽圖(北京)醫藥科技股份有限公司)。
共篩選獲得鼠源抗體22株,分別是:CLN-40-3C8、CLN-07-4C3、CLN-39-8D11、CLN-39-1E1、CLN-03-6H2、CLN-03-4E5、CLN-03-1A8、CLN-03-4A11、CLN-07-5B10、CLN-07-5G11、CLN-03-3A7、CLN-03-4C11、CLN-38-4H3、CLN-03-4G7、CLN-39-1B6、CLN-39-3E7、CLN-03-1F5、CLN-38-8A1、CLN-39-7H7、CLN-03-6G10、CLN-40-6C9、CLN-07-5D9。
採用FACS的方法,檢測獲得的22株鼠源抗體同Claudin18.2的結合活性。將樣品稀釋至終濃度依次為:10ug/mL、1ug/mL、0.1ug/mL、0.01ug/mL、0.001ug/mL,分別與CHO-Claudin18.2細胞4℃反應30min後,離心棄上清,每孔加入200μl PBS,2000rpm,5min,洗
滌2遍後,每孔加入50μL 1:100倍稀釋的anti-mouse IgGFc-FITC抗體(Abcam,貨號ab97264),4℃反應30min,後重複洗滌步驟,洗滌一次,最後每孔加200μL PRS,重懸,上機檢測。檢測結果如表3所示,多株抗體表現較好的結合活性。
實施例2 抗Claudin18.2鼠源抗體體內藥效評價
選取11株親和力較好的抗Claudin18.2鼠源抗體(CLN-40-3C8、CLN-07-4C3、CLN-39-8D11、CLN-39-1E1、CLN-03-6H2、CLN-03-4E5、CLN-03-1A8、CLN-03-4A11、CLN-07-5B10、CLN-07-5G11、CLN-03-3A7),通過胃癌PDX模型選出CLN-03-3A7,CLN-03-4E5,CLN-03-6H2具有治療潛力,繼而對上述3株抗體進行後續的體內藥效評價。
將胃癌腫瘤接種於B-NDG小鼠(本小鼠模型由百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司提供)皮下,待腫瘤體積達到150mm3時進行分組,每個實驗組5只小鼠。分組後,分別將內吞和結合表現較優的鼠源抗體CLN-03-3A7,CLN-03-4E5,CLN-03-6H2按照每週兩次10mg/kg的劑量注射入小鼠腹腔,每週兩次監測小鼠的腫瘤生長情況(腫瘤體積=0.5*長徑*短徑2)。具體結果如圖1和圖2所示,實驗結果顯示了Claudin18.2鼠源抗體對腫瘤有明顯的抑制作用,並且抗體安全性良好,小鼠的體重沒有發生明顯變化,且三株鼠源抗體的抑腫瘤活性大小為CLN-03-6H2>CLN-03-4E5>CLN-03-3A7。
實施例3 嵌合抗體製備及親和力檢測
對CLN-03-4E5和CLN-03-6H2兩株鼠源抗體分別進行嵌合抗體改造後獲得CLN-03-4E5-01,CLN-03-6H2-01嵌合抗體。比較CLN-03-4E5-01,CLN-03-6H2-01和IMAB362(人鼠嵌合單抗,claudiximab)的親和力。結果可見(如表4和圖3所示),CLN-03-4E5-01,CLN-03-6H2-01和IMAB362均表現出良好的親和活性,且本發明提供的CLN-03-4E5-01,CLN-03-6H2-01兩株嵌合抗體的結合活性均優於IMAB362。
實施例4 嵌合抗體內吞效率檢測
對CLN-03-6H2-01嵌合抗體和IMAB362(人鼠嵌合單抗,claudiximab)的內吞效率進行了檢測和比較,按照promega PHAb抗體染料標記試劑盒(Promega G9841)說明書標記純化的嵌合抗體,抗體標記前濃度為2mg/mL。將標記好的抗體與胃癌模型KATOIII(ATCC),胰腺癌模型AsPC-1(ATCC),肺癌模型A549(AICC)細胞按照一定的濃度梯度,於37℃孵育。時間梯度設置為:0h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,濃度梯度設定為:0.1nM,1nM,10nM。每個採樣點結束後採用細胞流式儀檢測螢光強度。實驗結果(參見圖4)顯示嵌合抗體CLN-03-6H2-01在不同腫瘤細胞系上的內吞效應均優於IMAB362。
實施例5 嵌合抗體CLN-03-6H2-01的人源化改造
通過移植輕鏈或重鏈CDR到免疫球蛋白輕鏈或重鏈框架區對嵌合抗體CLN-03-6H2-01進行人源化改造。嵌合抗體CLN-03-6H2-01抗體輕鏈和重鏈的CDR用Kabat系統確定。通過對抗體可變區資料庫比對,確定人IgG1框架區。設計並合成了不同的人源化Clandin 18.2抗體的輕鏈可變區序列和不同的人源化Clandin 18.2抗體的重鏈可變區序列。將人源化Clandin 18.2抗體輕鏈可變區與人kappa恒定區通過PCR融合,得到人源化Clandin 18.2輕鏈全長;將人源化Clandin 18.2重鏈可變區與IgG1恒定區用PCR方法融合,得到人源化Clandin 18.2重鏈全長。不同輕重鏈組合並表達,採用流式(FACS)的方法檢測純化後的多株人源化抗體的親和力(見表5),選擇具有最佳親和力的H-1號抗體(命名為RGCLN18.2抗體)進行測序。
表6示出了RGCLN18.2抗體輕鏈和重鏈的CDR氨基酸序列(Kabat編號)。
RGCLN18.2抗體重鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO:1):
RGCLN18.2抗體輕鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
RGCLN18.2抗體的重鏈氨基酸序列(SEQ ID NO:33):
RGCLN18.2抗體的輕鏈氨基酸序列(SEQ ID NO:34):
實施例6 抗體藥物偶聯物(ADC)的製備
抗體藥物偶聯物(ADC)的製備採用通用的偶聯方法:用純化水分別配製還原劑和保護劑如下:1~20mM TCEP(Tris-2-carboxyethyl-phosphine)、1~20mM DTPA(Diethylene triamine pentacetate acid)母液,還原劑用量根據所需偶聯率不同可在一定濃度範圍內添加,與一定濃度單克隆抗體(如:5~30mg/mL)按照一定體積比(1:1)混合,TCEP與抗體的終濃度摩爾比0.5~6.0:1,於25℃攪拌反應1h。TCEP還原後的抗體可直接進行偶聯。
配製一定濃度(5mM)連接子-活性藥物單元化合物溶於25%的DMSO(dimethyl sulfoxide,二甲亞碸),按照藥物與巰基的摩爾比0.3~2.8:1緩慢加藥,於25℃攪拌反應1-4h。反應結束後,用PBS緩衝液離心超濾3次,純化去除殘餘未反應藥物以及DMSO等游離小分子,並且利用SDS-PAGE電泳和疏水高效液相(HIC-HPLC)法檢測偶聯情況。
本實施例採用的連接子-活性藥物單元化合物為MC-Val-Cit-PAB-MMAE、D07-Val-Cit-PAB-MMAE和Py-MAA-Val-Cit-PAB-MMAE,其結構式分別如下所示(合成方法分別參見專利申請CN108853514A(說明書第14頁),CN111433188A(說
明書第53頁),WO2019223579A1(說明書第25-27頁))。
利用上述方法製備了如下ADC(p為選自1、2、3、4、5、6、7、8的整數,q為選自1、2、3、4的整數,Ab為本發明提供的RGCLN18.2抗體),這些ADC的平均DAR為3.5-4.5。
實施例7 抗體藥物偶聯物的細胞內吞實驗
將人胃癌細胞NCI-N87細胞系每孔約1×105個細胞重懸于6孔板中。將RGCLN18.2、RGCLN18.2-PY-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-D07-Val-Cit-PAB-MMAE分別與pHAb胺反應性染料綴合,然後用細胞培養基稀釋至10μg/ml。將100μl RGCLN18.2及ADC的染料複合物加入到細胞中,在指示時間(0小時、1小時、3小時、5小時、21小時和24小時)下于37℃溫育。通過流式細胞儀測量RGCLN18.2及ADC的內吞效果。結果如圖5所示,從內吞實驗結果來看,發現RGCLN18.2-PY-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE、
RGCLN18.2-D07-Val-Cit-PAB-MMAE ADC在24h時的內吞率均為98%左右。結果表明RGCLN18.2 ADC在人胃癌細胞NCI-N87細胞中有非常好的內吞效果。
實施例8 抗體藥物偶聯物的體外細胞評價
將人胃癌細胞NCI-N87細胞株懸液以100μL/孔、5000個/孔的密度加到96孔板中,置於水飽和的37℃的CO2培養箱培養過夜。將抗體藥物偶聯物(RGCLN18.2-PY-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-D07-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE、IMAB362-MC-Val-Cit-MMAE)濃度進行梯度稀釋並加到含有細胞的96孔板中,100μL/孔。繼續置於37℃培養箱中培養72小時。酶標儀讀取450nm處OD值,抑制率計算公式為:IR%=(OD空白-OD藥物)×100/OD空白。由曲線擬合軟體Softmax Pro7.0.3 Gxp計算得IC50值,結果見表7所示。從以上實驗資料體外藥效試驗來看,發現RGCLN18.2-PY-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE、RGCLN18.2-D07-Val-Cit-PAB-MMAE ADC的增值抑制效果均優於IMAB362-MC-Val-Cit-MMAE。
實施例9 抗體藥物偶聯的PDX(人源腫瘤組織來源移植瘤模型)實驗
將人胰腺癌組織清洗後切成小塊,用套針接種於裸鼠背部右側肩胛處,待腫瘤生長至100~300mm3後將動物隨機分組,對照組及實驗組給藥情況如表8所示。
實驗結果如圖6、圖7所示,其中圖6給出了對照組及實驗組動物體重變化曲線,圖7給出了對照組及實驗組動物荷瘤體積變化曲線,結果顯示,RGCLN18.2-MC-Val-Cit-PAB-MMAE在人胰腺癌PDX模型中的抑腫瘤藥效強於IMAB362-MC-Val-Cit-PAB-MMAE。
以上描述地僅是優選實施方案,其只作為示例而不限制實施本發明所必需特徵的組合。所提供的標題並不意指限制本發明的多種實施方案。術語例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外,除非另有說明,沒有數詞修飾時包括複數形式,以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定義,本文使用的所有技術和科學術語的意思與本領域技術人員通常理解的相同。
本申請中提及的所有公開物和專利通過引用方式併人本文。不脫離本發明的範圍和精神,本發明的所描述的方法和組合物的多種修飾和變體對於本領域技術人員是顯而易見的。雖然通過具體的優選實施方式描述了本發明,但是應該理解所要求保護的本發明不應該被不適當地局限於這些具體實施方式。事實上,那些對於相關領域技術人員而言顯而易見的用於實施本發明的所描述的模式的多種變體意在包括在隨附的請求項的範圍內。
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<120> 一種抗Claudin18.2抗體及其抗體藥物偶聯物
<130> 2021
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Claims (25)
- 一種抗Claudin18.2抗體或其抗原結合片段,所述抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區和輕鏈可變區,所述重鏈可變區的CDR和/或所述輕鏈可變區的CDR與如下序列限定的抗體具有相同的CDR序列或在如下序列限定的抗體的CDR上進行1-2個氨基酸替換,所述序列限定的抗體為:(1)重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示;和/或(2)輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示。
- 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段,其中:(1)重鏈可變區CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:3、4、5、6或7所示或對SEQ ID NO:3、4、5、6或7進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:8、9、10、11或12所示或對SEQ ID NO:8、9、10、11或12進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:13、14、15、16或17所示或對SEQ ID NO:13、14、15、16或17進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;(2)輕鏈可變區CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:18、19、20、21或22所示或對SEQ ID NO:18、19、20、21或22進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:23、24、25、26或27所示或對SEQ ID NO:23、24、25、26或27進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:28、29、30、31或32所示或對SEQ ID NO:28、29、30、31或32進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列。
- 根據請求項2所述的抗體或其抗原結合片段,其中,(1)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:3、8、13或對SEQ ID NO:3、8、13進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:18、23、28或對SEQ ID NO:18、23、28進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;(2)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:4、9、14或對SEQ ID NO:4、9、14進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:19、24、29或對SEQ ID NO:19、24、29進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;(3)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:5、10、15或對SEQ ID NO:5、10、15進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:20、25、30或對SEQ ID NO:20、25、30進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;(4)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:6、11、16或對SEQ ID NO:6、11、16進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:21、26、31或對SEQ ID NO:21、26、31進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;(5)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:7、12、17或對SEQ ID NO:7、12、17進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列;和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO:22、27、32或對SEQ ID NO:22、27、32進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列。
- 根據請求項1-3任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其特徵在於:(1)重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,或與SEQ ID NO:1具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO:1相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列;和/或(2)輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或與SEQ ID NO:2具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO:2相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列。
- 根據請求項4所述的抗體或其抗原結合片段,其中,(1)重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示;和/或(2)輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
- 根據請求項1所述的抗體或抗原結合片段,所述的抗體或其功能性結合片段包括單克隆抗體、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、單鏈Fv(scFv)、雙特異性抗體、多特異性抗體、嵌合抗體、人源化抗體或包含抗體的抗原結合部分的融合蛋白;優選的,所述的抗體為人源化單克隆抗體。
- 根據請求項1-6任一項所述的抗體或其抗原結合片段,其進一步包括人或鼠恒定區;優選的,所述恒定區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
- 一種抗體藥物偶聯物,其含有請求項1-7任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 根據請求項8所述的抗體藥物偶聯物,其特徵在於,所述的抗體藥物偶聯物結構如式(I)所示:Ab-L-D (I)其中:Ab為請求項1-7任一項所述的抗體或其抗原結合片段;D為活性藥物單元;L為任一連接基團,其分別與抗體或其抗原結合片段Ab及活性藥物單元D共價連接;其中,所述Ab上通過一個或多個連接基團L連接一個或多個活性藥物單元D。
- 根據請求項9所述的抗體藥物偶聯物,其特徵在於,所述L與所述Ab上氨基殘基或巰基殘基共價連接;優選的,所述L與所述Ab上的巰基殘基共價連接;更優選的,所述L與所述Ab上的鏈間二硫健打開後形成的巰基殘基共價連接。
- 根據請求項9所述的抗體藥物偶聯物,其特徵在於,所述L包括可裂解連接子和不可裂解連接子。
- 根據請求項11所述的抗體藥物偶聯物,其特徵在於:所述的可裂解連接子包括肽單元,所述的肽單元包含2-20個氨基酸,優選的所述的肽單元選自由-纈氨酸-瓜氨酸-(-Val-Cit-)、-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-(-Gly-Gly-Phe-Gly-)、-纈氨酸-丙氨酸-(-Val-Ala-)、-纈氨酸-賴氨酸-(-Val-Lys-)、-纈氨酸-精氨酸-(-Val-Arg-)、-苯丙氨酸-瓜氨酸-(-Phe-Cit-)、-苯丙氨酸-賴氨酸-(-Phe-Lys-)、-苯丙氨酸-精氨酸-(-Phe-Arg-)及它們的組合。
- 根據請求項9所述的抗體藥物偶聯物,其特徵在於,所述的活性藥物單元D為細胞毒分子、細胞分化因數、幹細胞營養因數、類固醇類藥物、治療自身免疫疾病的藥物、抗炎症藥物或治療傳染性疾病的藥物;優選的,所述細胞毒分子包括但不限於微管蛋白抑制劑或DNA損傷劑,所述微管蛋白抑制劑包括但不限於海兔毒素(dolastatin)及奧瑞他汀(auristatin)類細胞毒分子,美登素(maytansine)類細胞毒分子;所述DNA損傷劑包括但不限於卡奇黴素類(calicheamicin)、倍癌黴素(duocarmycin)類、安麯黴素類衍生物PBD、喜樹堿(camptothecins)及喜樹堿類衍生物、SN-38;更優選的,所述奧瑞他汀(auristatin)類細胞素分子包括但不限於MMAE或MMAF或它們的衍生物,所述美登素類細胞毒分子包括但不限於DM1、DM4或它們的衍生物。
- 分離的多核苷酸或其組合,其編碼請求項1-7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種核酸構建體,其包含請求項17的多核苷酸。
- 請求項18所述的核酸構建體,所述核酸構建體為載體。
- 一種宿主細胞,其包含請求項18或19中的核酸構建體。
- 請求項20所述的宿主細胞,所述細胞是原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸桿菌細胞或CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、BHK細胞。
- 藥物組合物,包含請求項1-7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段和/或請求項8或15的抗體藥物偶聯物,以及藥學上可接受的載體。
- 製備抗Claudin18.2抗體的方法,其包括在適合表達編碼抗Claudin18.2抗體或抗原結合片段的載體的條件下培養請求項20或21所述的宿主細胞,並且回收所述抗體或片段。
- 請求項1-7中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項8-15所述的抗體藥物偶聯物、請求項17的多核苷酸或其組合、請求項18的核酸構建體、請求項19的載體、或請求項22的藥物組合物在製備用 於治療或預防癌症的藥物中的用途。
- 請求項24所述的用途,其中所述癌症為實體瘤;進一步的,所述實體瘤包括胃癌、胰腺癌。
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