CN108715832A - 一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了医学技术领域的一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞及制备方法和应用。本发明提供一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞，为TLR5阳性间充质干细胞。所述TLR5阳性间充质干细胞的制备方法为利用流式分选TLR5高表达阳性间充质干细胞或在间充质干细胞上过表达TLR5。本发明还提供包含无血清培养基和TLR5阳性间充质干细胞的培养上清，进一步提供TLR5阳性间充质干细胞和培养上清在制备抗肿瘤药物中的应用。TLR5+MSC条件培养上清对肿瘤细胞的体外增殖、迁移和克隆形成能力具有明显的抑制作用；TLR5活化的MSC可显著提高NK细胞的体外杀伤活性；TLR5活化的MSC可抑制Lewis肺癌小鼠体内的肿瘤生长。

Description

一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞及制备方法和应用
技术领域
本发明属于医学技术领域，具体涉及一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞及制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是全球范围导致死亡的主要疾病之一，肿瘤微环境对肿瘤的发生、发展、侵袭和转移起着重要作用，而间充质干细胞(MSC)可参与体内肿瘤微环境的免疫调节，与肿瘤微环境关系密切。一方面，肿瘤组织在生长过程中会分泌大量的炎性因子和趋化因子，招募MSC归巢到肿瘤部位；另一方面，MSC分泌的IDO、PGE2、TGF-β1、MMP-9等活性物质可以作用于肿瘤细胞和免疫细胞，影响肿瘤的生长。MSC对肿瘤手术及放化疗导致的机体损伤具有修复作用，然而，MSC对肿瘤生长和转移的利弊作用一直备受争议，限制了其在肿瘤临床治疗方面的应用。
Toll Like Receptor(TLRs)是微生物天然免疫中一类重要的受体家族。在人源细胞中存在10种TLRs，分别命名为TLR1-TLR10；在小鼠细胞中存在12种TLRs，分别命名为TLR1-9、TLR11-13。TLRs家族成员一般通过髓样分化相关蛋白MyD88依赖和非依赖两种途径激活下游信号通路，调节多种细胞因子的分泌，参与免疫反应。TLR5是TLRs家族成员之一，被配体Flagellin活化后，可激活NF-κB信号通路，调节多种细胞因子、趋化因子的表达，参与天然性免疫反应。TLR5是辐射防护的重要药物靶点，同时也是抗肿瘤药物的一个理想靶点。
MSC表面可表达多种TLRs。研究发现，TLRs对MSC的迁移和免疫调节功能具有重要作用，MSC内TLRs的活化可影响IL-6、IL-8和CXCL10等细胞因子和趋化因子的分泌，从而影响免疫细胞增殖及其肿瘤杀伤活性。MSC表面TLRs的活化状态不同，使得MSC在免疫调节方面表现出两面性。Ruth S.Waterman曾提出将MSC分为促炎型(MSC2)和抗炎型(MSC1)两种类型，抗炎型MSC1为表面TLR4被活化的MSC，促炎型MSC2为表面TLR3被活化的MSC。当有外源性物质入侵时，骨髓内的MSC会表现出促炎活性，迅速被动员到受损部位，发挥修复功能；随后MSC会表现出抗炎活性，避免过度炎症，帮助伤口修复。
由于MSC可以归巢到受损和炎症部位，MSC已作为一种有效的治疗载体和治疗手段，被广泛应用于脊髓损伤、心血管疾病、骨组织损伤、免疫系统疾病以及骨髓移植引起的移植物抗宿主病。然而MSC在肿瘤治疗领域的应用却一直受到很大限制，原因是目前对于MSC与肿瘤的作用关系尚存在较大争议，其促瘤和抑瘤作用均被实验证实。本申请的目的在于寻找特异性发挥抑瘤作用的MSC细胞。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提出一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞及制备方法和应用。具体技术方案如下：
一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞，为TLR5阳性间充质干细胞。
进一步地，所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、脑癌和淋巴瘤。
所述TLR5阳性间充质干细胞的制备方法为：利用流式分选TLR5高表达阳性间充质干细胞或在间充质干细胞上过表达TLR5。
进一步地，所述在间充质干细胞上过表达TLR5是通过将TLR5基因的逆转录病毒或慢病毒载体转入间充质干细胞。
本发明还提供一种培养上清，包含无血清培养基和所述TLR5阳性间充质干细胞。
进一步地，所述培养基包括α-MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、Ham's F12培养基、RPMI1640培养基中的一种或两种以上，例如IMDM培养基与Ham's F12培养基等量混合而成的IMDM/Ham's F12培养基)。
本发明还提供上述TLR5阳性间充质干细胞，或上述培养上清在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明进一步提供一种抗肿瘤药物组合物，其包含上述的TLR5阳性间充质干细胞以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
进一步地，所述抗肿瘤药物组合物还包括TLR5激动剂。
更进一步地，所述抗肿瘤药物组合物还包括NK细胞。
进一步地，所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、脑癌和淋巴瘤。
上述TLR5激动剂为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(Flagellin)及其衍生物-CBLB502，优选CBLB502。
进一步地，所述药物组合物的剂型为医学领域已知的任何剂型。
医学领域已知的剂型，例如片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。所述药物组合物的剂型优选注射剂。
药学上可接受的载体和/或赋形剂，是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Editedby Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、离子强度增强剂、维持渗透压的试剂、延迟吸收的试剂、稀释剂、佐剂、防腐剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠；维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物；延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶；稀释剂包括但不限于水、水性缓冲液(如缓冲盐水)、醇和多元醇(如甘油)等；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等；防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。在某些优选实施例中，所述药学上可接受的载体或赋形剂是无菌等渗水性或非水性溶液(例如平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。
本发明的有益效果为：
(1)间充质干细胞异质性导致可能因其表型的细微差异引起对肿瘤生长的不同作用，本发明利用流式分选TLR5高表达阳性间充质干细胞或在间充质干细胞上过表达TLR5而提供一种均一的TLR5阳性间充质干细胞。不同于现有技术多是研究肿瘤细胞或间充质干细胞表面TLR5的表达水平，以及TLR5激动剂对肿瘤细胞或间充质干细胞的抑制或促进作用，本发明直接研究TLR5阳性间充质干细胞对肿瘤细胞的抑制作用，发现TLR5阳性间充质干细胞能够特异性抑制肿瘤活性。
(2)间充质干细胞表面的TLR5被过表达或活化后，会引起MSC表型和分泌型的变化，进而改变肿瘤微环境。TLR5+MSC条件培养上清对肿瘤细胞的体外增殖、迁移和克隆形成能力具有明显的抑制作用。TLR5活化的MSC可显著提高NK细胞的体外杀伤活性，TLR5活化的MSC可抑制Lewis肺癌小鼠体内的肿瘤生长。TLR5阳性间充质干细胞及其条件培养上清可用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1为间充质干细胞的细胞形态图，放大倍数为100×。
图2为流式细胞术检测MSC免疫表型的结果图。
图3为间充质干细胞分化能力检测的结果图。
图4为不同脐带来源的间充质干细胞内TLR5的表达水平。
图5为TLR5阳性间充质干细胞的流式分选结果，其中，DATA.001为未经分选的MSC的平均荧光强度，DATA.002为分选后MSC的平均荧光强度。
图6为不同间充质干细胞条件培养上清对肿瘤细胞的体外增殖和迁移能力的抑制作用，其中，a-细胞transwell实验结果镜下图片；b-细胞transwell实验统计结果；c-细胞增殖实验结果。
图7为不同间充质干细胞条件培养上清对肿瘤细胞体外克隆形成能力的抑制作用。
图8为TLR5活化的间充质干细胞对NK细胞体外杀伤能力的促进作用。
图9为TLR5活化的间充质干细胞对Lewis肺癌小鼠体内肿瘤的抑制作用，其中，a-小鼠体内肿瘤大小；b-肿瘤体积统计结果；c-肿瘤重量统计结果。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。试验方法如无特殊说明均为常规实验方法，实验材料及试剂如无特殊说明均可通过商业途径获得。
实施例1：人脐带间充质干细胞的分离及鉴定
1.人脐带间充质干细胞(MSC)的分离培养
采用脐带组织块爬片法分离间充质干细胞(MSC)，共分离了16根离体脐带的MSC，具体方法如下：
(1)将正常分娩的离体脐带放入含有200U/mL青霉素和200U/mL链霉素的PBS缓冲液中，为保证脐带组织活性，新鲜脐带需在6h内分离完毕。
(2)用20mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血，用组织剪将脐带组织剪碎成1mm3大小的组织块，再将获得的小块脐带组织用200目滤网滤过，收集200目滤网上的脐带组织块，去掉过小的脐带组织块，获得直径为1-1.5mm多个脐带组织块。
(3)收集直径为1-1.5mm的组织块，将组织块直接接种在培养瓶中，直接放置于5％CO2、37℃培养箱内，静置1-2h。
(4)待组织块贴壁比较牢固后，添加含10％胎牛血清的α-MEM培养液(购自Gibco)，置于5％CO2、37℃培养箱内继续培养，五天后，在培养瓶中脐带组织间充质干细胞增生铺满约80％；以0.25％胰蛋白酶(0.01％EDTA)消化，所得细胞为原代细胞。
脐带组织块爬片法分离培养MSC，72h后在脐带组织周围有少量细胞爬出，约7天后，细胞游离出组织，并逐渐形成克隆。如图1所示，细胞多为两个突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞。细胞传代后扩增十分迅速，长至80％融合时，呈漩涡状生长。
2.间充质干细胞(MSC)流式检测细胞表面抗原
选择生长状态良好的MSC，用0.05％胰酶消化，PBS缓冲液洗两遍后分别用小鼠抗人CD11b-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-FITC及CD19-FITC抗体标记MSC，每个待测样品约1×106个细胞，室温避光放置30min，再用PBS洗两遍后，4％多聚甲醛固定，通过流式细胞技术(FACS)检测。
通过FACS检测MSC细胞免疫表型，结果如图2所示：MSC高表达干细胞表面标志，如CD90、CD105及CD73；而不表达造血细胞的表面标志，如CD19、CD34、CD45、CD11b等，也不表达II类主要组织相容性抗原(HLA-DR)。
3.间充质干细胞成脂、成骨诱导分化
(1)成脂诱导：选择生长状态良好的MSC，用0.05％胰酶消化，按照2×104/孔的细胞密度铺于24孔板中，于第2天置换为成脂诱导培养基(购自BI公司，间充质干细胞无血清成脂诱导分化培养基试剂盒)，之后每隔3天换液，第14天后进行油红O(Oil-Red O)染色，倒置显微镜下拍照。
(2)成骨诱导：选择生长状态良好的MSC，用0.05％胰酶消化，按照5×103/孔的细胞密度铺于24孔板中，于第2天置换为成骨诱导培养基(购自BI公司，间充质干细胞无血清成骨诱导分化培养基试剂盒)，之后每隔3天换液，第21天后进行茜素红-S染色，倒置显微镜下拍照。
成骨、成脂分化是鉴定MSC的经典诱导方案。在成骨的诱导培养基下，MSC细胞间隙逐渐变小，产生骨钙沉积，茜素红S(Alizarin red S)染色呈阳性；而在成脂的诱导培养基下，从诱导7天后，细胞内即可以看见细小的脂滴，显微镜下为圆形透亮结构，随后脂滴慢慢增大、增多，至21天，以油红O(Oil red O)染色发现，脂滴染成红颜色(图3)。
实施例2：TLR5阳性MSC的筛选
1.TLR5mRNA在MSC中表达水平的检测
对于实施例1中分离培养的16根脐带的MSC按照说明书用TRIZOL裂解液提取不同批号MSC的mRNA，按照试剂盒说明反转录成cDNA，用q-PCR方法检测其TLR5的表达水平，使用表1中引物序列对TLR5和β-actin进行扩增，检测并计算TLR5mRNA在各批号MSC中的表达水平。结果发现(图4)，第16号脐带分离出的MSC表达TLR5水平相对较高。
表1 TLR5及β-actin引物序列
2.流式细胞分选TLR5阳性MSC
以第16号脐带P2代MSC进行扩增，收集生长状态良好的MSC约1×108个(P4代)，PBS清洗两次，平均分至10个15mL离心管中，每管加入950μL PBS和50μL FITC-TLR5抗体，室温避光孵育30min。用PBS清洗细胞两次，用流式分选仪进行细胞分选，收集TLR5阳性MSC，将获得TLR5阳性MSC进行扩增培养，即可得到TLR5+MSC。
对TLR5+MSC再次进行扩增培养，细胞冻存备用。对扩增培养后的TLR5+MSC P10代细胞进行流式检测，分析其表面TLR5的表达情况，发现其平均荧光强度提高4倍左右(图5)，表明其表面TLR5表达水平提高，可以用于后续实验。在后续研究中，均使用P10以内的TLR5+MSC细胞进行实验。
实施例3：TLR5阳性MSC对肿瘤的抑制作用
1.MSC相关条件培养上清的收集
(1)将获得的MSC、TLR5+MSC分别接种于18cm培养皿中，每皿约5×104个细胞，置于细胞恒温培养箱中培养，其中，TLR5+MSC设置两组培养皿。
(2)待细胞贴壁生长至融合度为50％-60％时，向其中一组TLR5+MSC培养皿中加入激动剂CBLB502(鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物)(终浓度100ng/mL)，继续置于37℃恒温培养箱中培养，用于分别制备MSC、TLR5+MSC和TLR5+MSC+CBLB 502条件培养上清。
(3)37℃恒温培养箱中诱导48h，吸除三组培养皿中的完全培养基，更换成无血清DMEM培养基，每皿20mL，继续孵育24h后收集上清，即制成条件培养上清。
(4)将收集的条件培养上清转移至超滤浓缩管中，以4000rpm离心浓缩(4℃条件)，最终制成10×浓缩条件培养上清(conditioned medium,CM)，存放于-80℃冰箱，备用。
2.NK-92细胞培养
从液氮中取出冻存NK-92细胞，37℃复苏，加入到含有10mL培养基的离心管中，125×g离心5min。以NK-92细胞培养基(Lonza，X-Vivo 15培养基+1000U/ml IL2)重悬，调整活细胞浓度为4×105/mL，置于细胞培养箱培养，每2-3天加入新鲜培养基或换液。
3.细胞迁移实验
(1)取一块24孔板，各对应孔加入完全条件培养上清600μL后，将transwell小室(8μm孔径)放入孔中，将24孔板置于37℃培养箱中孵育1h。
(2)取生长状态良好的细胞(SKBR3、PC3M和HepG2)，经胰酶消化、血清中和、PBS清洗后，最终重悬于无血清培养基中，调整细胞浓度为2×105/mL。
(3)取出已孵育1h的24孔板，向小室内加入(2)中细胞悬液200μL，即每个小室内有4×104个细胞。
(4)将24孔板再次置于37℃培养箱中孵育迁移，SKBR3迁移8h，PC3M迁移8h，HepG2迁移10h。
(5)取出小室，放入加有600μL4％多聚甲醛的孔内，固定40min。
(6)取出小室，放入加有600μL0.1％结晶紫染色液的孔内，染色10min。
(7)用清水轻轻冲洗小室，并用棉签擦去小室内未迁移的细胞。将小室放入干净的孔内，置于显微镜下观察，拍照，细胞计数。
结果显示(图6-a和图6-b)，尽管MSC、TLR5+MSC和TLR5+MSC+CBLB 502条件培养上清可在不同程度上促进这三种肿瘤细胞的迁移，但与之相比，TLR5+MSC-CM可明显抑制肿瘤细胞的迁移，当使用CBLB502进一步激活TLR5+MSC表面的TLR5后，其抑制作用更加明显。
4.细胞增殖实验
将生长状态良好的肿瘤细胞(SKBR3、PC3M和HepG2)消化、重悬，调整细胞浓度至2×104个/mL，按组别加入到96孔板内，100μL/孔，每组设五个平行孔。待细胞贴壁后将培养基更换为对应的条件培养上清(CM)，培养48h后，每孔加入10μL CCK-8检测试剂，37℃避光孵育1.5h，测定OD450nm。
结果显示(图6-c)，尽管MSC、TLR5+MSC和TLR5+MSC+CBLB 502条件培养上清可在不同程度上促进这三种肿瘤细胞的增殖，但与之相比，TLR5+MSC-CM可明显抑制肿瘤细胞的增殖，当使用CBLB502进一步激活TLR5+MSC表面的TLR5后，其抑制作用更加明显。
5.细胞集落形成实验
将生长状态良好的肿瘤细胞(SKBR3、PC3M和HepG2)消化、重悬，调整细胞浓度至100个/mL，按组别加入到6孔板内，2mL/孔。待细胞贴壁12h后将培养基更换为对应的条件培养上清，培养10-14d，肉眼可见细胞集落。吸除培养基，用PBS清洗两次，4％多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫染色10min，拍照。
结果表明(图7)尽管MSC、TLR5+MSC和TLR5+MSC+CBLB 502条件培养上清可在不同程度上促进这三种肿瘤细胞的体外克隆形成能力，但与之相比，TLR5+MSC-CM可明显抑制肿瘤细胞的克隆形成，当使用CBLB502进一步激活TLR5+MSC表面的TLR5后，其抑制作用更加明显。
6.NK细胞与TLR5+MSC共培养
使用8μm孔径、6孔trans-well培养板进行共培养。在各孔底部分别接种MSC细胞和TLR5+MSC细胞，1×105个/孔，1.5mL/孔，贴壁过夜。向各孔内插入insert，向insert内加入NK细胞1×106个/孔，2.6mL/孔，置于培养箱内共培养48h，收集NK细胞，检测NK细胞体外杀伤肿瘤细胞能力。根据组别不同，在加入NK细胞前，向对应孔底部培养基内加入CBLB502(终浓度100ng/mL)；在加入CBLB502前10min，向需要封闭的孔内加入TLR5封闭性抗体(终浓度5μg/mL)封闭10min。
结果显示，MSC具有免疫抑制作用，与NK细胞共培养后会抑制NK细胞的杀伤活性；但CBLB502活化的TLR5+MSC与NK细胞共培养后，NK细胞的杀伤活性显著提高，可达90％以上；若在TLR5激活前10min，使用TLR5封闭性抗体阻断其活化后，共培养的NK细胞的杀伤活性又恢复到原来的水平(图8)。以上结果表明，CBLB502活化的TLR5+MSC可显著提高NK细胞的免疫杀伤活性。
实施例4：CBLB502活化的TLR5+MSC的体内抑瘤活性
使用美国PROMEGA公司的非放射性细胞毒性检测试剂盒进行检测，实验流程参照说明书。效靶比为10:1。
鼠Lewis肺癌细胞为本室保存，复苏后PBS清洗两遍，皮下注射至C57BL/6J小鼠，约2-3周待肿瘤长大后处死小鼠，剥离肿瘤，无菌条件下剪碎，用70目无菌细胞筛网轻轻研磨组织，将收集的细胞用PBS清洗、计数、离心，按1×106个/100μL重悬，注射到小鼠右腋皮下。
实验小鼠随机分为3组，每组5只，分别给予生理盐水、TLR5+MSC及TLR5+MSC-CBLB502(CBLB502诱导2d的TLR5+MSC)治疗。每只小鼠的细胞给药量为1×106个/100μL，每周一次给药，给药途径为尾静脉注射。
结果显示，经CBLB502诱导的TLR5+MSC(TLR5+MSC-CBLB502)治疗的小鼠，其肿瘤生长受到明显抑制(图9)，其中与TLR5+MSC治疗组相比，TLR5+MSC-CBLB502的肿瘤体积抑制率达28.7％左右，瘤重抑制率达35.1％左右，表明CBLB502活化的TLR5+MSC在小鼠体内具有抑瘤活性。

Claims (10)

1.一种抑制肿瘤生长的间充质干细胞，为TLR5阳性间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、脑癌和淋巴瘤。
3.权利要求1所述TLR5阳性间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：利用流式分选TLR5高表达阳性间充质干细胞或在间充质干细胞上过表达TLR5。
4.一种培养上清，其特征在于，包含无血清培养基和权利要求1所述TLR5阳性间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的培养上清，其特征在于，所述培养基包括α-MEM培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、Ham's F12培养基、RPMI1640培养基中的一种或两种以上。
6.权利要求1或2所述TLR5阳性间充质干细胞，或权利要求4或5所述培养上清在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.一种抗肿瘤药物组合物，其包含权利要求1所述的TLR5阳性间充质干细胞以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
8.如权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，还包括TLR5激动剂。
9.如权利要求8所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，还包括NK细胞。
10.如权利要求7-9任一项所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述肿瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、脑癌和淋巴瘤。
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