CN107454844A

CN107454844A - 用于癌症治疗的细胞治疗剂以及使用该细胞治疗剂的联合治疗

Info

Publication number: CN107454844A
Application number: CN201680020932.XA
Authority: CN
Inventors: 徐海荣; 金性洙; 张多荣; 郑镇花; 李永敦; 黄宇燮; 朴真成; 李秀贞
Original assignee: Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Current assignee: Brain Rehabilitation Co ltd; N4u Technology Holding Academic Cooperation Fund Co ltd
Priority date: 2015-03-06
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2017-12-08
Also published as: JP2018508238A; BR112017019189A2; EP3266865A1; EP3266865A4; KR101850780B1; WO2016144051A1; SG11201707134WA; HK1245096A1; IL254228B; EP3266865B1; US20180037869A1; AU2016229710A1; KR20160108229A; IL254228A0; BR112017019189A8; CA2978262A1; NZ735160A; CA2978262C; AU2016229710B2; ES2861381T3

Abstract

本发明涉及一种用于制备癌症治疗细胞的方法，以及包含通过所述方法制备的细胞的癌症治疗试剂盒。本发明所述的制备方法可提供F细胞，其虽然与培养后立即收获并使用的表达胞嘧啶脱氨酶的间充质干细胞相比增殖能力没有差异，但是通过使用5‑FC处理显示出非常优异的肿瘤抑制作用，并且在与另一种抗癌药物联合治疗的情况下，产生超过使用现有抗癌药物联合治疗的效果的显著协同效应。因此，本发明可以用于包含所述F细胞的癌症治疗试剂盒，并且因此可以有利地用来最大化现有癌症治疗的效果。

Description

用于癌症治疗的细胞治疗剂以及使用该细胞治疗剂的联合治疗

技术领域

本公开涉及用于制备用于癌症治疗的细胞的方法，包含通过所述方法制备的细胞的抗癌辅助物，用于癌症治疗的试剂盒，以及癌症治疗方法。

背景技术

世界各地数百万人死于各种类型的癌症，其包括：骨癌、膀胱癌、血癌(白血病)、脑癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫颈癌、食道癌、肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、口腔癌、鼻癌、神经癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌、前列腺癌、颈癌、子宫癌和阴道癌。这些年来，一些方法包括放射和化学疗法已经用于治疗癌症，但是癌症患者的数量仍然在增加。已经广泛报告放射和化学疗法可能导致毒性相关疾病，甚至一些患者死亡。此外，在特定癌症的情况下，问题在于，恶性细胞仍然难以治疗。因此，需要广泛研究癌症细胞的生理或表型以找到选择性杀死癌细胞而不对患者的健康细胞造成不良事件的治疗方法。

尤其，脑肿瘤是一种对大脑造成极大损伤的癌症，并且具有非常低的存活率。在脑肿瘤的传统治疗方法中，通过外科手术进行取出是最有效的治疗，但是在大多数情况下，根据脑肿瘤的类型和位置手术是不适合的，并且术后并发症的风险在完成摘出时非常高。此外，与其他类型的肿瘤比较，因为抑制药物渗透的血脑屏障(BBB)存在于大脑中，为了使用抗癌剂通过化学疗法治疗脑肿瘤，需要施用高浓度的抗癌剂，这在身体的其他器官中产生严重的副作用。因此，需要一种能够通过增强抗癌剂的效果来降低抗癌剂剂量的新辅助方法、治疗剂和辅助物(adjuvant)。

此外，基因疗法是一种将抑制癌细胞增殖的基因直接引入到癌细胞的方法。为了基因引入，只要使用病毒，但是因为病毒自身不具有移动到癌的能力，因此需要外科手术注射病毒。然而，几乎不可能将病毒注入到每个微观肿瘤或癌症细胞，因此具有靶向癌细胞的限制。

在这方面，韩国专利注册第10-1022401号被称为一种用于将自杀基因引入间充质干细胞以增强靶向和治疗癌症的方法。然而，KR 10-1022401没有披露通过在特定环境下操作间充质干细胞和将间充质干细胞与另一种抗癌剂联合施用而改善抗癌剂效果的联合治疗辅助物，并且没有披露定期施用的方法。

此外，近来，已经进行了针对联合治疗的大量研究，如两种以上抗癌剂的联合治疗。在这点上，近来不仅报道了化疗剂的联合治疗，而且报道了化学治疗剂和多种抗癌剂联合的联合治疗等。然而，就联合治疗而言，存在多个案例，其中每种药物的联合施用显示出相同药效程度的简单相加效应。此外，已经报道了不可预测的副作用，例如，药物的效果由于药物的相互影响而相当恶化等。因此，对药物联合施用的研究仍在继续。

在癌症中联合施用的方面，对化疗剂和细胞治疗剂如间充质干细胞的联合治疗也存在研究。然而，在使用间充质干细胞的联合治疗中，已经集中进行目的在于施用细胞，如自体干细胞，以在通过化疗剂进行的抗癌治疗后恢复细胞损伤的研究，但是对利用干细胞本身作为联合治疗的治疗剂并没有进行太多研究。

因此，需要开发一种治疗剂和治疗方法，其能够具有很高的靶向以便癌症或肿瘤治疗剂可以被准确递送到癌症组织中，没有毒性以便不影响除肿瘤之外的其他部位，并且由于没有免疫毒性而被重复施用直到癌症消除。此外，需要和要求一种可以改善或增强现有抗癌剂功效的新的治疗方法、治疗剂、治疗辅助物和联合治疗。

发明内容

技术问题

本发明的发明人研究出能够克服现有化学疗法局限的新的癌症治疗剂，发现了通过将胞嘧啶脱氨基因(cytosine deamine gene)引入间充质干细胞以制备间充质干细胞/胞嘧啶脱氨酶(MSC/CD)，随后冷冻并解冻所制备的细胞，与简单培养的MSC/CD细胞相比，可显示出非常优异的肿瘤抑制效果和存活率改善效果，并且最大化使用现有抗癌剂的联合治疗的效果，并完成本公开。

本公开的目的是提供用于制备“F细胞”的方法，所述“F细胞”是可用作癌症治疗辅助物的细胞，包含F细胞的癌症治疗试剂盒，使用F细胞和化疗剂的联合施用剂，以及联合施用方法。

技术方案

为了实现前述目的，本公开提供一种用于制备F细胞的方法，其包括：1)将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)引入间充质干细胞(MSC)以制备间充质干细胞/胞嘧啶脱氨酶(MSC/CD)；2)冷冻所制备的MSC/CD以制备冷冻的MSC/CD；以及3)解冻并悬浮所述冷冻的MSC/CD以制备F细胞。

此外，本公开提供一种抗癌辅助物，其包含通过所述方法制备的F细胞。

此外，本公开提供一种癌症治疗试剂盒，其包含通过所述方法制备的F细胞和5-氟胞嘧啶(5-FC)。

此外，本公开提供一种用于预防或治疗癌症的方法，其包括：1)将胞嘧啶脱氨酶(CD)引入间充质干细胞(MSC)以制备间充质干细胞/胞嘧啶脱氨酶(MSC/CD)；2)冷冻所制备的MSC/CD以制备冷冻的MSC/CD；3)解冻并悬浮所述冷冻的MSC/CD以制备F细胞；4)向需要治疗的受试者施用F细胞；以及5)向需要治疗的受试者施用5-氟胞嘧啶(5-FC)。

有益效果

根据本公开所述的制备方法，可提供F细胞，虽然与培养后立即收集并使用的表达胞嘧啶脱氨酶的间充质干细胞相比增殖能力没有差异，但是通过使用5-FC一起治疗显示出非常优异的肿瘤抑制作用，并且在与另一种抗癌剂联合治疗的情况下，产生超过使用现有抗癌剂联合治疗效果的显著协同效应。因此，本公开可以用作包含所述F细胞的癌症治疗试剂盒，并且因此可以有利地用来最大化现有癌症治疗的效果。

附图说明

图1是稳定表达胞嘧啶脱氨酶的间充质干细胞系(MSC/CD)、其自杀效应(suicideeffect)以及旁观者效应(bystander effect)的简图。

图2显示MSC或MSC/CD与5-FC的治疗过程(A)，以及来源于此的自杀效应的结果(B)。

图3显示MSC或MSC/CD与5-FC的治疗(A)，以及来源于此的旁观者效应的结果(B、C)。

图4显示I细胞、F细胞(DMSO)和F细胞(CS10)的细胞制备和处理的过程(A)，用于比较各细胞的旁观者效应以及旁观者对各细胞的影响(B)。

图5显示I细胞和F细胞集落形成能力的显微镜观察(A)，以及使用CFU-A(集落形成单位测定)比较定量分析结果的图(B)。

图6显示在脑肿瘤模型中使用5-FC处理I细胞或F细胞的过程(A)，通过观察脑肿瘤的治疗变化获得在解剖显微镜下观察到的治疗后脑肿瘤变化的结果(B)，以及肿瘤体积变化(C)。

图7显示在肝癌细胞皮下移植的皮下肿瘤模型中，肿瘤体积根据I细胞或F细胞治疗变化的图(A)，以及显示肿瘤外部尺寸的代表性肿瘤模型(B)。

图8显示在胰腺癌细胞皮下移植的皮下肿瘤模型中(A)，在肺癌细胞皮下移植的皮下肿瘤模型中(B)，以及在结肠癌细胞皮下移植的皮下肿瘤模型中，肿瘤体积根据I细胞或F细胞治疗变化。

图9显示F细胞+5-FC+TMZ联合治疗(A)，来源于此的旁观者效应(B、C)，通过表达GFP的U87MG的荧光图像确认细胞死亡结果(D)，IC₅₀值的等效线图解法结果(E)。

图10显示F细胞+5-FC+抗癌剂联合治疗(A)，在抗癌剂联合治疗中，卡氮芥(carmustine)的IC₅₀值的等效线图解法结果(B)和依立替康(irinotecan)的IC₅₀值的等效线图解法结果(C)。

图11显示F细胞+5-FC+替莫唑胺(temozolomide)(TMZ)联合治疗(A)的过程，在解剖显微镜下观察到的治疗后脑肿瘤变化的结果，其显示通过联合治疗的脑肿瘤变化(B)、肿瘤体积变化(C)，以及改善存活率的协同效应(D)。

图12显示在皮下肿瘤模型中I细胞或F细胞+5-FC+替莫唑胺(temozolomide)(TMZ)联合治疗(A)效果的分析过程(A)、肿瘤体积变化(B)，以及F细胞+5-FC+替莫唑胺(temozolomide)(TMZ)在存活率分析中的协同效应(C)。

具体实施方式

本公开提供一种用于制备F细胞的方法，其包括：1)将胞嘧啶脱氨酶(CD)引入到间充质干细胞(MSC)中以制备间充质干细胞/胞嘧啶脱氨酶(MSC/CD)；2)冷冻所制备的MSC/CD以制备冷冻的MSC/CD；以及3)解冻并悬浮所述冷冻的MSC/CD以制备F细胞。

根据本公开所述的用于制备F细胞的方法，可以提供F细胞，虽然与培养I细胞后立即收获并使用的表达胞嘧啶脱氨酶的间充质干细胞相比增殖能力没有差异，但是通过使用5-FC处理显示出非常优异的肿瘤抑制作用，并且即使在使用另一种抗癌剂联合治疗的情况下，仍产生超过使用现有抗癌剂的联合治疗效果的显著协同效应。

本文所使用的“MSC/CD”指在间充质干细胞中制备以表达胞嘧啶脱氨酶(CD)的间充质干细胞。其中引入胞嘧啶脱氨酶的间充质干细胞是指这样的细胞，其以朝向癌细胞的嗜性移动至癌细胞附近，并且连续表达胞嘧啶脱氨酶以诱导自身的自杀效应，并且将非毒性前药转变为活性抗癌剂以表现出周围的癌细胞被杀死的旁观者效应。MSC/CD的优点在于，因为它经过细胞死亡，可以减少由不希望的连续效应导致的副作用，并且因为它移动至癌细胞附近，可能杀死浸润性癌细胞，从而作为有效抗癌剂起作用。尤其，“F细胞”，一种通过冷冻/解冻MSC/CD而制备的细胞，表现出协同效应，其中，当与现有抗癌剂联合使用时，抗癌效果显著增加，从而被用作增强抗癌剂效果的辅助物。

本发明的术语“间充质干细胞(MSC)”是一种干细胞，其能够从骨髓和脐带血中收集，并且指能够增殖的多能基质细胞(multipotent stromal cell)，并且尤其，能够被分化为各种细胞类型，如骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞和脂肪细胞，与造血干细胞不同。因此，本公开的间充质干细胞优选地可以是多能间充质干细胞。

本公开的术语“胞嘧啶脱氨酶”是一种自杀基因，其起到将对人体无害的前药转变为细胞毒性抗癌物质的作用，并且具体地，是一种基因，其将5-氟胞嘧啶(5-FC)即5-氟尿嘧啶(5-FU)的前药转变为5-FU。

根据本领域已知的细胞内引入基因的方法，如使用非病毒载体或包含其的病毒载体的方法或者物理方法，可以将自杀基因引入到间充质干细胞中。所述基因转移的物理方法的实例可包括电穿孔、流体动力(hydroporation)、注射等。使用非病毒载体的基因转移的实例可包括使用阳离子脂类、脂类聚合物或纳米颗粒的方法。病毒载体可包括，而不限于，可复制的病毒载体、不可复制的病毒载体，如腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杂交腺病毒系统载体、痘病毒载体、慢病毒载体和人类疱疹病毒第四型(Epstein Barr virus)载体。

例如，在本公开的示例性实施方式中，自杀基因可以被引入到逆转录病毒载体中以构建表达载体，该载体可以被转染到包装细胞(package cells)中，所转染的包装细胞可以被培养并过滤以获得逆转录病毒溶液，并且该逆转录病毒溶液可以用于转染间充质干细胞，从而将自杀基因插入到间充质干细胞中。然后，连续表达自杀基因的间充质干细胞可以使用包含在逆转录病毒载体中的筛选标记(selection marker)获得。

此外，因为已知间充质干细胞即使在同种异体移植过程中仍具有低的免疫排斥，因此可以使用从其他人分离出的细胞或从癌症患者自身分离出的细胞，并且使用血液数据库通过从具有相似HLA(人白细胞抗原)类型的骨髓中分离而在个体中进一步最小化免疫排斥。

本公开的MSC/CD可以通过首先将自杀基因引入到分离的干细胞中，然后在试管中于适当条件下筛选、增殖并分化而获得，或者可以通过有效增殖干细胞，将自杀基因引入干细胞，然后分化为间充质干细胞而获得。由于存在自杀基因，将MSC/CD注射到需要治疗的受试者中，并且在注射后，例如2至30日，优选5至15日，更优选5至10日，但不限于此，杀死它们自己，从而减少通过连续活动引起的副作用。

本公开的术语“F细胞(冷冻的细胞)”指一种细胞，其在冷冻并解冻其中引入胞嘧啶脱氨酶(CD)的间充质干细胞的MSC/CD后，没有经过额外的培养步骤，没有培养F细胞，并且被定义为一种以向待治疗的受试者施用为目的的被解冻和悬浮或被悬浮和洗涤的细胞。更具体地，F细胞指一种细胞，其通过将胞嘧啶脱氨酶(CD)引入间充质干细胞以制备MSC/CD，培养，在冷冻培养基中冷冻细胞，使用前立即在室温下解冻细胞，然后例如在含有人血清白蛋白，但不限于此的血浆溶液A等中悬浮，并离心而获得。作为从本公开的F细胞中分化的细胞，可以列举“立即收获的细胞(I细胞)”，其通过对MSC/CD进行相同的冷冻和解冻步骤而获得，但是通过随后的培养步骤最大化浓度和活性，并且通过在培养中直接收获细胞而使用。

与I细胞比较，本公开的F细胞的特征在于，在没有通常用于最大化活化的培养步骤的情况下和不增加集落形成能力的情况下，抗癌效果得到增加。此外，本公开的F细胞的优点在于立即施用于需要治疗的患者和抗癌效果的改善。

在本公开中，冷藏保存状态或冷冻状态的细胞可以通过使用本领域中用于将细胞保持在冷冻状态的任一已知方法，如冷冻保护液、冷冻培养基等，来储存。例如，所述方法可包括包含冷冻保护剂的培养基，如二甲亚砜(DMSO)，葡聚糖、人血清、人血清白蛋白、牛血清、牛血清白蛋白、聚-1-赖氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、乙二醇、聚乙二醇、甘油和细胞分离液(percoll)(例如，cryostor CS2，可从BioLife Solutions Inc.购得的cryostor CS 10)，并且具体地，cryostor CS2、cryostor CS10和2～10％DMSO培养基，并且更具体地，2％、5％和10％DMSO培养基等。

本公开的F细胞在体外表现出与I细胞相似的集落形成能力，并且还有效地表现出MSC/CD的旁观者效应。此外，与I细胞或对照组相比，F细胞对各种肿瘤包括脑肿瘤和皮下肿瘤表现出两倍或更高的体内抑制效果，并且在使用现有抗癌剂即替莫唑胺(temozolomide，TMZ)的联合治疗中表现出高度提升的抗癌效果。换言之，虽然F细胞与I细胞比较集落形成能力没有差异，但是与其他I细胞比较，由于根据制备方法给出的F细胞的内在活性，F细胞表现出在体外无法预期的显著抗癌效果并且作为抗癌剂辅助物的作用。

即，本公开的F细胞可以通过在冷冻后不进一步进行细胞培养的制备方法而从通常使用的I细胞分化。

因此，本公开提供了一种制备F细胞的方法，其特征在于F细胞在冷冻后不经过细胞培养。

本公开的F细胞是用于癌症治疗的一种癌症治疗细胞。F细胞可以用于治疗作为癌症和恶性肿瘤被摘去的所有恶性肿瘤，而没有限制，并且可以在使用抗癌剂的化学疗法之前、同时和之后向需要治疗的受试者施用。

癌症可以是例如选自下组的至少一种：鳞状细胞癌(例如，上皮细胞的鳞状细胞癌)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌、腹膜癌、结肠直肠癌、胆道肿瘤、鼻咽癌、喉癌、支气管癌、口腔癌、骨肉瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、膀胱癌、黑素瘤、脑癌、神经胶质瘤、脑肿瘤、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、骨癌、食道癌、结肠癌、胃癌、子宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌和直肠癌，并且更优选地是，脑肿瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌和皮肤癌。

此外，本公开的F细胞还可以是抗癌的辅助物。抗癌的辅助物指能够引起主要治疗(primary therapy)更快起作用，并且通过与主要治疗，例如通过化疗或手术进行的癌症治疗的联合治疗强烈地形成其抗癌作用的辅助物。抗癌辅助物可以用来增强抗癌剂，抗癌剂为主要用于使用抗癌剂的化学疗法的主要治疗剂，并且可以通过术后处理剩余的癌症细胞用来最大化癌症治疗效果。

F细胞可以以组合物的形式存在，用于癌症治疗或用于抗癌辅助物，并且所述组合物可包括药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂。尤其优选的注射形式被优选地配制为适合于注射到组织或器官中的注射形式。

因此，本公开提供了一种包含F细胞的抗癌辅助物(adjuvant for anti-cancer)。

可以根据医师的处方或本领域熟知的方法将F细胞注射到患者体内，并且单次剂量将考虑到各种相关因素，例如待治疗的疾病、疾病的严重性、施用途径、患者的体重、年龄和性别等来确定。

此外，本公开提供了一种包含F细胞和5-氟胞嘧啶(5-FC)的癌症治疗试剂盒(kitfor cancer treatment)。

出于F细胞和5-氟胞嘧啶联合治疗的目的，制备癌症治疗试剂盒，并且是指被制备以便F细胞能够在前药5-氟胞嘧啶(5-FC)施用之前、同时或之后向需要治疗的受试者注射的试剂盒。

癌症治疗试剂盒可包含第一隔室(compartment)和第二隔室，其中，第一隔室可包含癌症治疗的F细胞或起抗癌辅助物作用的F细胞，并且第二隔室可包括5-氟胞嘧啶(5-FC)。试剂盒可以被包含在一个容器中，或包含在具有各自分剂量的一些不同的小容器中，以便改善便利性和便携性。因此，可以存在一些容器，每个容器以一定方法排列。如果需要，本公开的试剂盒可包括需要使用的设施，说明书包括各成分施用方法的描述等。

此外，本公开的癌症治疗试剂盒可进一步包括抗癌剂。抗癌剂可包括但不限于本领域中已知的抗癌剂，并且可以优选下组中的至少一种：氮芥、伊马替尼(imatinib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、利妥昔单抗(rituximab)、埃罗替尼(elotinib)、曲妥单抗(trastuzumab)、吉非替尼(gefitinib)、硼替佐米(bortezomib)、舒尼替尼(sunitinib)、卡铂(carboplatin)、索拉非尼(sorafenib)、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、桑寄生(viscum album)、天冬酰胺酶、维A酸、羟基脲、达沙替尼(dasatinib)、雌莫司汀(estramustine)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依铂(heptaplatin)、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶(amsacrine)、阿仑单抗(alemtuzumab)、甲苄肼(procarbazine)、前列地尔(alprostadil)、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨(gemcitabine)、去氧氟尿苷、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、卡培他滨(capecitabine)、吉美嘧啶(gimeracil)、奥替拉西(oteracil)、氮胞苷(azacytidine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、依诺他滨(enocitabine)、地西他滨(decitabine)、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)、卡莫氟(carmofur)、雷替曲塞(raltitrexed)、多西他赛(docetaxel)、泰素(paclitaxel)、贝洛替康(belotecan)、拓扑替康(topotecan)、长春瑞滨(vinorelbine)、依托泊苷(etoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、tenifocide、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、更生霉素(dactinomycin)、吡柔比星(pirarubicin)、阿柔比星(aclarubicin)、嘌呤霉素(pepromycin)、替莫唑胺(temozolomide)、白消安(busulfan)、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑(melphalan)、六甲蜜胺(altretamine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、噻替派(thiotepa)、尼莫司汀(nimustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、二溴卫矛醇(mitolactol)、泰索帝(taxotere)、格列卫(gleevec)、紫杉醇、赫赛汀(herceptin)、特罗凯(tarceva)、阿瓦斯汀(avastin)、诺雷德(zoladex)、阿霉素(adriamycin)、伊立替康(irinotecan)、10058-F4、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺，基于亚硝基脲的抗癌剂、甲氨蝶呤(methotrexate)和多柔比星(doxorubicin)。亚硝基脲包括卡氮芥(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)等。抗癌剂可以包括在癌症治疗试剂盒的第三部分。

此外，本公开提供了用于预防或治疗癌症的方法，其包括：1)将胞嘧啶脱氨酶(CD)引入间充质干细胞(MSC)以制备间充质干细胞/胞嘧啶脱氨酶(MSC/CD)；2)冷冻所制备的MSC/CD以制备冷冻的MSC/CD；3)解冻并悬浮所述冷冻的MSC/CD以制备F细胞；4)向需要治疗的受试者施用F细胞；以及5)向需要治疗的受试者施用5-氟胞嘧啶(5-FC)。

受试者优选为哺乳动物，包括人，并且可以包括需要癌症治疗的所有患者，正在进行癌症治疗的患者，已经历癌症治疗的患者和需要癌症治疗的患者，并且还可包括由于癌症治疗已经过手术摘去癌症的患者。

此外，本公开提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，其进一步包括：6)向需要治疗的受试者施用抗癌剂。

此外，本公开还提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，其包括：4)在步骤4)的F细胞施用之前、同时向需要治疗的受试者施用抗癌剂。

即，本公开提供了用于预防或治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者同时施用F细胞和抗癌剂，并且向需要治疗的受试者依序施用，如施用F细胞后施用抗癌剂，以及施用抗癌剂后施用F细胞。

抗癌剂可包括但不限于，本领域中已知的抗癌剂，并且优选地可以是选自下组的至少一种：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、埃罗替尼、曲妥单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、桑寄生、天冬酰胺酶、维A酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥佐米星、替伊莫单抗、依铂、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、甲苄肼、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美嘧啶、奥替拉西、氮胞苷、阿糖胞苷、氟达拉滨、依诺他滨、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西他赛、泰素、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、tenifocide、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、更生霉素、吡柔比星、阿柔比星、嘌呤霉素、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、泰索帝、格列卫、紫杉醇、赫赛汀、特罗凯、阿瓦斯汀、诺雷德、阿霉素，伊立替康、10058-F4、顺铂、环磷酰胺、基于亚硝基脲的抗癌剂、甲氨蝶呤和多柔比星。亚硝基脲包括卡氮芥(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)等。可以根据本领域中广泛已知的抗癌剂的处方剂量适当地和选择性地开处抗癌剂，但是考虑到与本公开的F细胞的协同效应，可以以小于平均处方剂量的剂量开处。

本公开的F细胞和5-氟胞嘧啶可以同时或按时间差依序施用，其可以根据5-氟胞嘧啶通过F细胞转变为5-氟尿嘧啶的适当的时间和时期选择。

因此，本公开提供了用于预防或治疗癌症的方法，其特征在于步骤4)的F细胞和步骤5)的5-氟胞嘧啶同时或依序施用。

此外，本公开的与5-氟胞嘧啶联合使用的抗癌剂可以同时或按时间差依序施用，并且可以根据适当的时间和时期选择。

因此，本公开提供了用于预防或治疗癌症的方法，其特征在于步骤5)的5-氟胞嘧啶和步骤6)的抗癌剂同时或依序施用。

本公开中的依序施用指要施用的多种成分按不同时间向受试者施用，并且可以将各活性成分的顺序适当调整。

F细胞可以以药学有效量向受试者的肿瘤部位输送，并且输送优选通过注射形式进行，但不限于此。尤其，更优选的是注射施用于哺乳动物，优选病人。

F细胞是MSC/CD细胞，其通过冷冻、解冻或解冻和洗涤MSC/CD立即使用，并且具有细胞毒性效应，其可以针对预定的一段时间通过自杀效应在受试者体内被杀死，优选注射后5日至15日。因此，可以将F细胞重复施用以连续治疗。此外，5-FC、抗癌剂可以根据治疗目的和患者的情况重复施用。F细胞、5-FC和抗癌剂重复施用的周期可以根据患者的情况适当调节，并且周期优选地可以是每10日至30日。例如，考虑到MSC/CD的细胞死亡，重复施用优选在至少10日后，并且考虑细胞使用注射器注射，还优选每30日的重复施用。

因此，本公开提供用于预防或治疗癌症的方法，其特征在于步骤4)的F细胞的使用每10日至30日重复。

根据F细胞施用周期的重复，5-氟胞嘧啶还可以定期重复施用，并且任选地，联合施用的抗癌剂也可以定期重复施用。

在本公开的用于预防或治疗癌症的方法中，F细胞可以用来治疗能够作为癌症或恶性肿瘤摘去的所有恶性肿瘤，而没有限制，并且可以在使用抗癌剂使用的化学疗法之前、同时和之后向需要的受试者施用。癌症可以是例如选自下组的至少一种：鳞状细胞癌(例如，上皮细胞的鳞状细胞癌)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌、腹膜癌、结肠直肠癌、胆道肿瘤、鼻咽癌、喉癌、支气管癌、口腔癌、骨肉瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、膀胱癌、黑素瘤、脑癌、神经胶质瘤、脑肿瘤、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、骨癌、食道癌、结肠癌、胃癌、子宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌和直肠癌，并且更优选地是，脑肿瘤、胰腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌和皮肤癌。

以下，将描述本发明的优选制备实施例和实施例以有助于理解本公开。然而，仅提供以下制备实施例和实施例以更容易地理解本公开，因此本公开不局限于此。

制备实施例1：制备表达胞嘧啶脱氨酶(CD)的间充质干细胞

1.1分离并培养间充质干细胞

将亚洲大学医学中心(Ajou University Medical Center)的IRB检查后捐赠的4m1人骨髓在无菌的15ml试管中覆盖在4ml的HISTOPAQUE1077(Sigma-Aldrich)上，并且在室温使用离心机在400x g离心30分钟。离心后，0.5ml的中间血沉棕黄层(buffy coat)使用巴斯德移液管小心收集，并且在250x g离心10分钟后，转移到含有10ml无菌磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)的试管中，丢弃上清液，并加入10ml磷酸盐缓冲溶液，并轻轻地悬浮，然后在250x g离心10分钟。将该操作重复两次，并且将最终的沉淀加入到补充有10％FBS(类标准胎牛血清(Hyclone))的DMEM培养基(Gibco)中并且分散在100mm动物细胞培养皿中以获得1x 10⁹个细胞。将培养器置于恒温箱中并在37℃培养4小时，同时供给5％二氧化碳和95％空气。随后，为了移除没有粘贴到培养器底部的细胞，移除上清液。向其中加入新鲜培养基，并且在恒温箱中培养。

分离的间充质干细胞保持在37℃的CO₂恒温箱中，并且在间充质干细胞培养基[(10％FBS(Gibco)+10ng/ml bFGF(Sigma-Aldrich)+1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(Gibco)+89％DMEM(Gibco)]中培养。培养细胞，同时每两日替换培养基。当细胞达到培养器的大约80％时，使用0.25％胰蛋白酶/0.1mM EDTA(Gibco)分离细胞，稀释以便满足800～1，1000个细胞/cm²，或者与培养基1∶10～1∶20稀释，并且在新的培养器中传代培养。一些细胞通过补充有2％-10％DMSO(Sigma-Aldrich，2％、5％、10％)的冷冻培养基冷冻保存。

1.2制备包含胞嘧啶脱氨酶(CD)的逆转录病毒

构建表达胞嘧啶脱氨酶(CD)，一种自杀基因，的逆转录病毒。其详细说明如下：

将DNA从大肠杆菌(E.coli)K-12 MG1655(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)中分离，然后，在94℃5分钟，94℃30秒，60℃40秒，72℃1分钟，27个循环；72℃7分钟的条件下，使用引物CD-F(5′-GAA TTC AGG CTA GCA ATG TCTCGA ATA ACG CTT TAC AAA C-3′)和CD-R(5′-GGATTC TCT AGC TGG CAG ACA GCC GC-3′)进行PCR。PCR产物使用pGEM-T Easy载体克隆试剂盒(Promega)，然后含有CD基因的PGEM-CD载体使用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，Sigma-Aldrich)和IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，Sigma-Aldrich)通过蓝白菌落筛选构建。通过序列分析确认所获得的CD基因的碱基序列与GeneBank(基因库)的gi：298594的碱基序列相同。所制备的pGEM-CD质粒和pcDNA3.1(Clontech)分别使用EcoRI和NotI限制性内切酶消化，并且从质粒pGEM-CD中分离的CD基因和切割质粒pcDNA3.1使用T4DNA连接酶连接。然后，将所获得的产物用来转化大肠杆菌DH5α即一种感受态细胞，并在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平版上培养并选择以获得质粒pcDNA3.1-CD。该质粒使用BamH I型限制性内切酶消化，并引入到能够产生逆转录病毒的逆转录病毒载体中。所获得的质粒通过CsCl-超高速离心机分离，并且通过磷酸钙沉淀转染到FLYRD18细胞，即逆转录病毒包装细胞系中(Jordan，Nucleic AcidResearch，24，596-601(1996))。然后，细胞在恒温箱中于37℃培养，同时供给5％二氧化碳和95％空气。48小时后，仅获得培养溶液，并且通过0.45μm滤膜过滤以获得逆转录病毒溶液。逆转录病毒溶液在-70℃储存时分配并使用。

1.3制备引入有CD基因的间充质干细胞

使用说明书1.2中制备的含有CD的逆转录病毒，将CD基因引入到说明书1.1中分离并培养的间充质干细胞中。更具体地，培养间充质干细胞达到100mm培养皿的大约70％。然后，加入3ml逆转录病毒溶液、3ml新鲜的间充质干细胞培养基和4μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich)并培养8小时。然后，除去病毒溶液，加入10ml间充质干细胞培养基并培养16小时，然后使用逆转录病毒再次感染。进行该操作1至3次后，最终使用胰蛋白酶取出间充质干细胞并通过使用培养基以1∶20稀释进行传代培养。在传代培养中，将嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)加入到培养基中至2μg/ml浓度。筛选细胞2周使得仅使用逆转录病毒感染的细胞可以存活。最终，构建连续表达CD(其为自杀基因)的间充质干细胞系(以下，称为MSC/CD)。

实施例1.MSC/CD的自杀效应和旁观者效应

1.1确认自杀效应

胞嘧啶脱氨酶(CD)是自杀基因。MSC/CD，其为表达胞嘧啶脱氨酶(CD)的间充质干细胞，可将前药5-氟胞嘧啶(5-FC)转化成5-氟尿嘧啶(5-FU)，并且可具有如图1所示的自杀效应(细胞杀死它们自己)和旁观者效应(杀死周围细胞)。因此，在说明书1.3中制备的MSC/CD的自杀效应和旁观者效应得到了去人。首先，在12-孔板中培养10,000个MSC/CD或间充质干细胞(MSC)。从次日，细胞使用浓度0～1,000μM的前药5-FC处理，并且使用含有药物的新培养基每两日替换一次。将培养基改为含有0.5mg/ml MTT(3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，Sigma-Aldrich)的细胞培养培养基，其能够在使用5-FC处理后第6日测量活细胞，并且在37℃反应2小时。然后，除去MTT溶液。向各孔中加入500μl DMSO以进行显色反应。然后，将裂解物转移至96-孔板，并且使用酶标仪(ELISA reader)(E-max，分子器件)在540nm测量吸光度。实验方法及其结果的简图示于图2.

如图2所示，确认了MSC/CD具有自杀效应，其中活细胞由于前药5-FC的浓度增加而减少，并且引起50％细胞死亡的IC₅₀为60.4μM。在间充质干细胞的情况下，其为对照组，确认了即使5-FC的浓度增加，细胞也没有杀死它们自己，因此没有观察到细胞毒性效应。

1.2旁观者效应

在12-孔板上培养10,000个表达GFP的U87MG(Korean Cell Line BankKCLBNo.30014)神经胶质瘤细胞和10,000个MSC/CD或间充质干细胞(MSC)。从次日，使用浓度0～1,000μM的前药5-FC处理细胞，并且使用含有药物的新培养基每两日替换一次，并且6日后获得细胞。所述试验方法简要地示于图3A。

然后，使用解剖荧光显微镜(Olympus)拍摄保留在整个孔中表达GFP的U87MG的荧光图像。在拍摄荧光图像后，加入200μl 1X被动裂解缓冲液(Promega)，并且将细胞裂解物置于冰上10分钟，并转移到E-管并在12,000rpm离心5分钟，并且将上清液转移到新的容器中。将100μl上清液转移到黑色96-孔板，并且使用荧光计(GEMINI EM，分子器件)在激发488nm和发射530nm的条件下测量荧光度。结果示于图3B和3C。

如图3B和3C所示，用MSC/CD培养的U87MG由于5-FC的浓度增加显示出表达荧光的细胞数量降低和荧光强度的显著降低，但是根据5-FC的浓度，使用其中不表达CD的间充质干细胞培养的U87MG没有显示出表达荧光的细胞数量和荧光强度的显著差异。在此，引起50％细胞死亡的IC₅₀为50.48μM。结果表明MSC/CD(其为引入有CD的间充质干细胞)不但显示出自杀效应而且还显示出周围细胞一起被杀死的旁观者效应。

制备实施例2.制备“I细胞”和“F细胞”

在细胞治疗剂的情况下，效果在各种条件下可以根据细胞状态的改变而变化。因此，为了确认细胞能力是否根据MSC/CD状态改变，制备冷冻后立即解冻状态的细胞(以下，称为F细胞(冷冻细胞))，和培养过程中立即从细胞收集状态的细胞(以下，称为I细胞(立即收集的细胞))。

为了分别制备F细胞和I细胞，培养MSC/CD，然后将2×10⁶个细胞分散在1ml含有2％～10％(2％、5％、10％)DMSO的冷冻培养基中或将2×10⁶个细胞分散在1ml CryostorCS10(BioLife Solutions)中。将细胞冷冻并储存在液氮容器中。首先，为了获得MSC/CD的“I细胞”，将通道5的细胞在37℃溶解，并置于9ml培养基中。然后，将细胞以9ml离心5分钟以除去上清液，并且将沉淀的细胞悬浮在培养溶液中，并分散在150mm培养器中。次日，将1.5X10⁵个细胞转移到150mm培养器中，并且使用新的培养基每两日替换一次。6日后，收集细胞以制备通道6相应的“I细胞”。

为了获得“F细胞”，将在-130℃以下冷冻并储存在通道6中的MSC/CD在37℃溶解，并且悬浮在含有9ml人血清白蛋白的血浆溶液A(CJ HealthCare Corp.)中，然后在500xg离心5分钟，或悬浮在含有最终7.5％葡聚糖-40(Daihan Pharm Co.，Ltd.)和5％人血清白蛋白(Green Cross Corp.)的生理盐水中，然后在800xg离心10分钟。然后，除去悬浮液，并且在培养基中悬浮沉淀的细胞并使用。换言之，F细胞是在冷冻和解冻后没有经过培养步骤的细胞。在移植入大脑前，将I细胞和F细胞分别洗涤两次。

实施例1.旁观者效应和F细胞的集落形成

1.1.F细胞的旁观者效应

进行实验以测定F细胞是否可以正常表现出MSC/CD的旁观者效应，以及旁观者效应是否有效出现而与制备方法例如培养基的种类无关。通过制备实施例2的方法制备的10,000个I细胞，使用10％DMSO冷冻培养基(DMSO)制备的10,000个I细胞，以及使用CryostorCS10(CSl0)制备的10,000个F细胞使用血浆溶液A洗涤，并且与神经胶质瘤U87/GFP细胞一起在12-孔板中共同培养，其中GFP基因被转导至U87MG(KCLB No.30014，由Korean CellLine Bank捐赠)，从而表达荧光性。从次日，细胞使用浓度为0～1,000μM的前药5-FC处理，并且使用含有药物的新培养基每两日替换一次，并且6日后获得细胞。加入200μl的1X被动裂解缓冲液(Promega)，并且将细胞置于冰上10分钟。将细胞裂解物转移到E-管并在12,000rpm离心5分钟，并且将上清液转移至新容器中。将100ul上清液转移至避光的黑色96-孔板，并且使用荧光计(GEMINI EM，分子器件)在488nm激发和530nm发射的条件下测量荧光度。实验方法和旁观者效应的简图示于图4。

如图4所示，对于I细胞，表示引起50％细胞凋亡的浓度的IC₅₀值是60.4μM；对于使用10％DMSO冷冻培养基(DMSO)制备的F细胞，IC₅₀值是56.2μM；对于使用Cryostor CS10(CS10)制备的F细胞，IC₅₀值是55.4μM。这些结果表明，F细胞与I细胞相比是能够有效表现出旁观者效应的细胞，因此确认了：无论使用DMSO培养基或CS10培养基的制备方法，F细胞与I细胞相比更优异地表现出旁观者效应。

因此，以下使用10％DMSO冷冻培养基制备的F细胞用于制备实施例2中所制备的F细胞。

1.2.F细胞的集落形成效应

进行集落形成单位测定，以确认如在制备实施例2中通过冷冻和解冻制备的F细胞与I细胞相比是否表现出增殖能力的差异。如在制备实施例2和对应的相同传代(passage)中制备的I细胞，以及使用10％DMSO冷冻培养基制备的F细胞使用Countess(Invitrogen)计数，然后将100个细胞分别置于100mm培养器中并培养，同时使用新的培养基每两日替换一次。2周后，细胞使用10％福尔马林(formalin)固定10分钟，使用磷酸盐缓冲溶液(Gibco)洗涤，使用结晶紫溶液(Sigma-Aldrich)染色10分钟，并且使用水洗涤三次以通过Versa doc(BioRad)获得图像。对通过使一个细胞生长2周形成的集落数量进行光学计数，并示于图5.

如图5所示，确认了I细胞和F细胞的集落形成能力没有差异。这些结果表示F细胞与I细胞相比增加的旁观者效应不是由细胞数量的增加，如集落形成，的增加导致的，并且F细胞自己表现出与I细胞的旁观者效应相比更优异的旁观者效应。

实施例2.F细胞的抗癌效果

2.1.F细胞对脑肿瘤的抗癌效果

为了确认F细胞对脑肿瘤的抗癌效果，构建原位脑胶质瘤模型。首先，麻醉7周龄免疫缺陷小鼠(中心实验动物)，并且在立体定向框架中固定它们的口和耳。使用70％乙醇灭菌被切开的头，并且头的顶部被垂直切开大约0.5cm。表达LacZ的U87MG神经胶质瘤细胞(3x10⁵/3μl)在AP＝+0.5mm、ML＝-1.8mm和DV＝-3mm的脑坐标处以0.3μl/min速率被移植，从而构建脑肿瘤原位脑胶质瘤模型。在移植表达LacZ的U87MG神经胶质瘤细胞后第三日，将制备实施例2中制备的F细胞悬浮在血浆溶液A中，然后在500x g离心5分钟。丢弃上清液，并且重复洗涤操作一次或两次。然后，制备细胞悬浮液浓度为3x 10⁵/6μl。细胞悬浮液在AP＝+0.5mm、ML＝-1.8mm和DV＝-3mm的脑坐标处以0.3μl/min速率被移植。从细胞移植后的次日，5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。为了比较F细胞的抗癌效果，在制备实施例2中制备的I细胞以相同方式移植，并且从细胞移植后日次，5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。

在神经胶质瘤细胞移植后第28天，麻醉动物，并且通过将注射针插入动物的左心室而使用生理盐水灌注，然后，使用10％福尔马林溶液灌注。摘去大脑并固定在小鼠大脑基质(Stoelting)上。然后，以1mm的间隔水平切割大脑，并置于相同固定液体中30分钟，从而固定大脑切片。大脑切片使用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，浸没在含有20mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，Koma Biotech)、5mM亚铁氰化钾/铁氰化钾(Sigma-Aldrich)、2mM MgCl₂和0.02％NP40的磷酸盐缓冲溶液中，并在37℃反应16小时。脑肿瘤的图像通过原子显微镜获得。肿瘤的尺寸使用图像j(NIH)程序和以下等式计算，并且结果示于图6。

如图6所示，在F细胞移植组中，脑肿瘤的体积显著降低，并且与I细胞相比，表现出更优异的效果(B)。计算出的肿瘤平均尺寸在载体对照组中是91.3mm³，在I细胞移植比较组中是1.5mm³，而在F细胞移植动物组中是0.6mm³。即，根据体内结果，确认F细胞的肿瘤减小效果是MSC/CD中I细胞的两倍以上，并且F细胞是更有效的抗癌剂。

2.2.F细胞对肝癌的抗癌效果

将1x 10⁵个Huh7肝癌细胞(KCLB No.60104)悬浮在100μl含有20％Matrigel(BD)的磷酸盐缓冲溶液中，并且在7周龄免疫缺陷裸鼠(Balb/c裸体)中皮下移植。从移植14天后，当肿瘤尺寸达到10～100mm³时，注射制备实施例2中制备的I细胞和F细胞。更具体地，将制备实施例2中制备的I细胞和F细胞悬浮在磷酸盐缓冲溶液中，然后在500x g离心5分钟。重复该操作两次，然后，在磷酸盐缓冲溶液中制备I细胞或F细胞，浓度为1x 10⁶/100，并且使用注射器直接注射到肿瘤中。从I细胞和F细胞注射后的次日，将5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。肿瘤的尺寸使用数显卡尺每周测量一次或两次，并且使用以下等式计算肿瘤体积，并且结果示于图7。

皮下肿瘤体积(mm³)＝宽(mm)x长(mm)x高(mm)÷6

[就肿瘤体积测量而言，参见Cancer Chemother.Pharmacol.(1989)24：148-154]

如图7A所示，肿瘤体积在使用F细胞处理的实验组中被更有效地减小，确认了F细胞具有比I细胞更优异的抗癌效果。如图7B所示，增加的抗癌效果在使用肝癌细胞移植的皮下肿瘤模型中被目视证实，因此确认了F细胞的治疗效果是优异的(*，与PBS组比较时，p＜0.05)。

2.3.F细胞对胰腺癌的抗癌效果

BxPC3胰腺癌细胞(ATCC No.CRL-1687^TM)的生长速率快并且造成严重的溃疡，因此同时注射1x 10⁶个BxPC3胰腺癌细胞、I细胞和F细胞。更具体地，在制备实施例2中制备的I细胞和F细胞悬浮在磷酸盐缓冲溶液中，然后在500x g离心5分钟。重复该操作两次，然后在磷酸盐缓冲溶液中制备I细胞或F细胞，浓度为1x 10⁶/100μl。1x 10⁶个I细胞或F细胞悬浮在100μl含有20％Matrigel(BD)的磷酸盐缓冲溶液中，并且同时在7周龄免疫缺陷裸鼠(Balb/c裸体)中皮下移植。从细胞注射后的次日，将5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。

肿瘤体积以与实施例2.2中相同的方式测量，并且测量的肿瘤体积变化示于图8A。

如图8A所示，肿瘤体积在使用F细胞处理的实验组中被更有效地减小，确认了F细胞具有比I细胞更优异的抗癌效果，并且在胰腺癌皮下肿瘤模型中具有优异的治疗效果(*，与PBS组比较时，p＜0.05)。

2.4.F细胞对肺癌的抗癌效果

将5X 10⁶个A549肺癌细胞(ATCC No.CCL-185^TM)悬浮在100μl含有20％Matrigel(BD)的磷酸盐缓冲溶液中，并且在7周龄免疫缺陷裸鼠(Balb/c裸体)中皮下移植。从移植8天后，当肿瘤尺寸达到20～50mm³时，注射制备实施例2中制备的I细胞和F细胞。更具体地，将制备实施例2中制备的I细胞和F细胞悬浮在磷酸盐缓冲溶液中，然后在500x g离心5分钟。

重复该操作两次，然后在磷酸盐缓冲溶液中制备I细胞或F细胞，浓度为1x 10⁶/100，并且使用注射器直接注射到肿瘤中。从I细胞和F细胞注射后的次日，将5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。肿瘤的尺寸以与实施例2.2中相同的方式测量，并且测量的肿瘤体积变化示于图8B。

如图8B所示，肿瘤体积在使用F细胞处理的实验组中被更有效地减小，确认了F细胞具有比I细胞更优异的抗癌效果，并且在肺癌皮下肿瘤模型中具有优异的治疗效果(*，与PBS组比较时，p＜0.05)。

2.5.细胞对结肠癌的抗癌效果

将5X 10⁶个HT29结肠癌细胞(ATCC No.HTB-38^TM)悬浮在100μl含有20％Matrigel(BD)的磷酸盐缓冲溶液中，并且在7周龄免疫缺陷裸鼠(Balb/c裸体)中皮下移植。移植后，当肿瘤尺寸达到40～100mm³时，注射制备实施例2中制备的I细胞和F细胞。更具体地，将制备实施例2中制备的I细胞和F细胞悬浮在磷酸盐缓冲溶液中，然后在500x g离心5分钟。

重复该操作两次，然后，在磷酸盐缓冲溶液中制备I细胞或F细胞，浓度为1x 10⁶/100，并且使用注射器直接注射到肿瘤中。从I细胞和F细胞注射后的次日，将5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。肿瘤的尺寸以与实施例2.2中相同的方式测量，并且测量的肿瘤体积变化示于图8C。

如图8C所示，肿瘤体积在使用F细胞处理的实验组中被更有效地减小，确认了F细胞具有比I细胞更优异的抗癌效果，并且在结肠癌皮下肿瘤模型中具有优异的治疗效果(*，与PBS组比较时，p＜0.05，以及#，与I细胞组比较时p＜0.05)。

从以上结果，确认F细胞在各种类型的肿瘤，如脑肿瘤、肝癌、肺癌、结肠癌中具有优异的抗癌效果，并且在所有类型的肿瘤中表现出比I细胞更优异的抗癌效果。

实施例3.F细胞联合治疗的协同效应(体外)

3.1与替莫唑胺的体外联合治疗

在12-孔板上培养10,000个表达GFP的U87MG(Korean Cell Line BankKCLBNo.30014)神经胶质瘤细胞和10,000个F细胞或间充质干细胞(MSC)。次日，使用浓度0～1，000μM的替莫唑胺(TMZ)和浓度为0～1,000μM的前药5-FC处理细胞，并且使用含有药物的新培养基每两日替换一次，并且6日后获得细胞。该实验的简图示于图9A。剩余在整个孔中表达GFP的U87MG荧光图像使用解剖荧光显微镜(Olympus)拍摄，并且确认细胞死亡。结果示于图9D。

如图9D所示，根据替莫唑胺治疗浓度的增加和5-FC治疗浓度的增加，确认荧光表达降低，并且F细胞的旁观者效应通过联合施用替莫唑胺而升高。

在拍摄荧光图像后，加入200μl 1X被动裂解缓冲液(Promega)，并且将细胞置于冰上10分钟。将细胞裂解物转移到E-管并在12,000rpm离心5分钟，并且将上清液转移到新的容器中。将100μl上清液转移到黑色96-孔板，并且使用荧光计(GEMINI EM，分子器件)在激发488nm和发射530nm的条件下测量荧光强度(图9B和C)。通过一起处理两种类型的抗癌剂获得的真实IC₅₀值表示为等效线图(isobologram)。等效线图中，连接单独处理抗癌剂时的IC₅₀值的实线是理论相加线，其指当通过同时处理两种抗癌剂而获得的值在实线上时，具有简单的相加效应。另一方面，其指当所述值低于实线时，具有协同效应，并且相反地，当所述值高于实线时，具有反协同效应。结果示于图9E。

如图9E所示，与单独处理抗癌剂时的IC₅₀值比较，5-FC和替莫唑胺的联用处理MSC/CD时的所有标记点存在于较低侧，其确认具有比通过一起使用两种抗癌剂简单治疗而获得的相加效应更优异的协同效应。

3.2与卡氮芥(BCNU)的体外联合治疗

在12-孔板上培养10,000个表达GFP的U87MG神经胶质瘤细胞，即U87/GFP(KoreanCell Line Bank KCLBNo.30014)和10,000个F细胞(MSC/CD)。从次日，使用浓度0～300μM的卡氮芥(BCNU，Sigma)和浓度为0～300μM的前药5-FC处理细胞，并且使用含有药物的新培养基每两日替换一次。在第7日，除去培养溶液，然后向每个孔中加入200μl 1X被动裂解缓冲液(Promega)，并且使每个孔在4℃静置10分钟。收集细胞裂解物，并且在12,000rpm离心5分钟以获得上清液。将100μl上清液转移到光被阻碍的黑色96-孔板，并且使用荧光计(GEMINIEM，分子器件)在激发488nm和发射530nm的条件下测量荧光强度。该实验的简图示于图10A。

通过使用两种抗癌剂一起治疗而获得的实际IC₅₀值表示为等效线图，并且结果示于图10B。

如图10B所示，与单独处理抗癌剂时的IC₅₀值比较，[F细胞(MSC/CD)+5-FC]和卡氮芥联用处理U87/GFP时的所有标记点存在于实线的较低侧，其确认具有比通过一起使用两种抗癌剂简单治疗获得的相加效应更优异的协同效应。

3.3与伊立替康的体外联合治疗

在12-孔板上培养10,000个U87/GFP和10,000个F细胞(MSC/CD)。从次日，使用浓度0～30μM的伊立替康(Sigma)和浓度为0～300μM的前药5-FC处理细胞，并且培养6日，同时使用含有药物的新培养基每两日替换一次。在第7日，除去培养溶液，然后向每个孔中加入200μl 1X被动裂解缓冲液，并且使每个孔在4℃静置10分钟。收集细胞裂解物，并且在12,000rpm离心5分钟以获得上清液。将100μl上清液转移到光被阻碍的黑色96-孔板，并且使用荧光计(GEMINI EM)在激发488nm和发射530nm的条件下测量荧光强度。通过使用两种抗癌剂一起治疗而获得的实际IC₅₀值表示为等效线图，并且结果示于图10C。

如图10C所示，在等效线图中通过单独使用伊立替康治疗而获得的IC₅₀值是3.2μM，以及通过使用5-FC治疗而获得的IC₅₀值是73.6μM，并且连接这些IC₅₀值以获得表示简单相加效应的理论相加线。与单独处理抗癌剂时的IC₅₀值比较，[F细胞(MSC/CD)+5-FC]和伊立替康的联用处理U87/GFP时获得的IC₅₀值存在于实线的较低侧，其确认具有比通过一起使用两种抗癌剂简单治疗获得的效果更优异的协同效应。

因为所有替莫唑胺、卡氮芥和伊立替康被称为起增殖细胞作用的抗癌剂，如果它们不但影响U87/GFP细胞的存活还影响增殖F细胞，那么[F细胞(MSC/CD)+5-FC]的抗癌效果可能降低。然而，与预期相反，从图9E确认，当[F细胞(MSC/CD)+5-FC]与替莫唑胺联合使用时，与单独或联合施用抗癌剂比较，可以获得较高的协同效应。即，协同效应是在现有联合治疗中无法被预期的意想不到的效果。

3.4与替莫唑胺的体内联合治疗

在上述3.1至3.3的说明中确认的协同效应在体内被进一步确认并证实。在移植表达LacZ的U87MG神经胶质瘤细胞后第6日，将制备实施例2中制备的F细胞悬浮在血浆溶液A中，然后在500x g离心5分钟。丢弃上清液，并且重复洗涤操作两次。然后，制备细胞悬浮液，浓度为3x 10⁵/6μl。将细胞悬浮液在AP＝+0.5mm，ML＝-1.8mm，and DV＝-3mm的脑坐标以0.3μl/min的速率移植。从细胞移植后的次日，5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。4日后，替莫唑胺以5mg/kg的剂量腹膜内注射5日。在第28日，脑组织从每个动物组中的8个动物中获得，并且以与实施例2相同的方式进行X-gal染色以测量脑肿瘤的尺寸。实验操作示于图11，并且所测量的脑肿瘤尺寸的变化示于图11B和C。

如图11B和C所示，载体对照肿瘤的平均尺寸是59.8mm³，而其中移植F细胞的动物组的平均尺寸是11.8mm³，单独使用替莫唑胺处理的动物组的平均尺寸是9.9mm³，以及其中移植F细胞+替莫唑胺的动物组的平均尺寸是2.7mm³。其中移植F细胞和替莫唑胺联合治疗的动物组具有最小的肿瘤平均尺寸，并且显示出最优异的抗癌效果。

此外，测量根据脑肿瘤治疗的存活率长达90日，并且结果在每个实验组中比较并示于图11D。

如图11D所示，对照组中的生存中值为32日，但是在F细胞治疗组中延长到42日，并且在替莫唑胺治疗组中延长到42日。尤其，生存中值在F细胞和替莫唑胺联合治疗组中被延长到70日，并且甚至与单独使用抗癌剂处理的组和对照组比较，观察到存活率的显著改善。

表明甚至在使用现有抗癌剂的联合治疗中，使用F细胞的联合治疗显示出显著优异的效果，因此使用F细胞的联合治疗能够用作用于改善现有化学疗法的治疗法。

实施例4.F细胞的皮下肿瘤治疗效果

为了确定F细胞在除脑肿瘤之外的肿瘤中是否可以表现出抗癌效果，将U87MG神经胶质瘤细胞移植入皮下组织以构建非脑癌模型。将1x 10⁶个U87MG神经胶质瘤细胞悬浮在100μl含有20％基质胶(BD)的磷酸盐缓冲溶液中，并且在7周龄免疫缺陷裸鼠中皮下移植。肿瘤的尺寸使用数显卡尺每周测量两次，并且使用以下等式计算肿瘤体积。

皮下肿瘤体积(mm³)＝宽(mm)x长(mm)x高(mm)÷6

当肿瘤的尺寸在将U87MG神经胶质瘤细胞移植入皮下组织后第20天达到30mm³以上时，将制备实施例2中制备的I细胞和F细胞悬浮在血浆溶液A中，并且在500x g离心5分钟。重复该操作两次，然后在血浆溶液A中制备I细胞或F细胞，浓度为1x 10⁶/100μl，并且使用注射器直接注射在肿瘤中。从I细胞和F细胞注射后的次日，将5-FC(15mg/ml生理盐水)以500mg/kg的剂量腹膜内注射一周。从终止试用-FC一周后，替莫唑胺(Sigma-Aldrich)以5mg/kg的剂量腹膜内注射5日。所述实验方法简要示于图12A。测量的肿瘤体积变化示于图12B。在皮下肿瘤模型中通过测量裸鼠寿命获得的卡普兰迈耶(Kaplan Meier)生存曲线示于图12C。

如图12B所示，确认直到施用替莫唑胺前第11日，肿瘤体积在使用F细胞处理的实验组中被更有效地减小，并且F细胞比I细胞显示出更优异的抗癌效果。此外，在施用替莫唑胺后第21天，确认与非治疗组(对照组)和I细胞治疗组比较，F细胞治疗组中肿瘤体积抑制效果非常显著。此外，如图12C所示，对照组的生存中值为23日，并且I细胞治疗组的生存中值为30日，而F细胞治疗组显示出58日的生存中值，因此寿命延长效果在使用F细胞的动物组中也是最显著的。因此，可以理解F细胞在皮下肿瘤模型中具有优异的治疗效果，并且尤其，表现出通过使用替莫唑胺联合治疗的协同治疗效应，其证明了在其他器官中难以单独从体外实验中预期的F细胞联合治疗的卓越性。

Claims

1.用于制备F细胞的方法，其包括：

1)将胞嘧啶脱氨酶(CD)引入到间充质干细胞(MSC)中，制备间充质干细胞/胞嘧啶脱氨酶(MSC/CD)；

2)冷冻所制备的MSC/CD，制备冷冻的MSC/CD；以及

3)解冻并悬浮所述冷冻的MSC/CD，制备F细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述F细胞在冷冻后不经过细胞培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述F细胞用于癌症治疗。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述癌症是选自下组的至少一种：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌、腹膜癌、结肠直肠癌、胆道肿瘤、鼻咽癌、喉癌、支气管癌、口腔癌、骨肉瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、膀胱癌、黑素瘤、脑癌、神经胶质瘤、脑肿瘤、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、骨癌、食道癌、结肠癌、胃癌、子宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌和直肠癌。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述F细胞是抗癌辅助物。

6.抗癌辅助物，其包含通过根据权利要求1所述的方法制备的F细胞。

7.癌症治疗试剂盒，其包含通过根据权利要求1所述的方法制备的F细胞以及5-氟胞嘧啶(5-FC)。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其进一步包含抗癌剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述抗癌剂是选自下组中的至少一种：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、埃罗替尼、曲妥单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、桑寄生、天冬酰胺酶、维A酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥佐米星、替伊莫单抗、依铂、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、甲苄肼、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美嘧啶、奥替拉西、氮胞苷、阿糖胞苷、氟达拉滨、依诺他滨、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西他赛、泰素、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、tenifocide、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、更生霉素、吡柔比星、阿柔比星、嘌呤霉素、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、泰索帝、格列卫、紫杉醇、赫赛汀、特罗凯、阿瓦斯汀、诺雷德、阿霉素，伊立替康、10058-F4、顺铂、环磷酰胺、基于亚硝基脲的抗癌剂、甲氨蝶呤、卡氮芥(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和多柔比星。

10.用于预防或治疗癌症的方法，其包括：

1)将胞嘧啶脱氨酶(CD)引入间充质干细胞(MSC)以制备间充质干细胞/胞嘧啶脱氨酶(MSC/CD)；

2)冷冻所制备的MSC/CD以制备冷冻的MSC/CD；

3)解冻并悬浮所述冷冻的MSC/CD以制备F细胞；

4)向需要治疗的受试者施用F细胞；以及

5)向需要治疗的受试者施用5-氟胞嘧啶(5-FC)。

11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括6)向需要治疗的受试者施用抗癌剂。

12.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括，根据步骤4)在施用所述F细胞之前，或根据步骤4)在施用所述F细胞同时，向需要治疗的受试者施用抗癌剂。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述抗癌剂选自下组的至少一种：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、埃罗替尼、曲妥单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、桑寄生、天冬酰胺酶、维A酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥佐米星、替伊莫单抗、依铂、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、甲苄肼、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美嘧啶、奥替拉西、氮胞苷、阿糖胞苷、氟达拉滨、依诺他滨、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西他赛、泰素、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、tenifocide、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、更生霉素、吡柔比星、阿柔比星、嘌呤霉素、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、泰索帝、格列卫、紫杉醇、赫赛汀、特罗凯、阿瓦斯汀、诺雷德、阿霉素，伊立替康、10058-F4、顺铂、环磷酰胺、基于亚硝基脲的抗癌剂、甲氨蝶呤、卡氮芥(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和多柔比星。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，步骤4)的F细胞和步骤5)的5-氟胞嘧啶同时或依序施用。

15.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤5)的5-氟胞嘧啶和步骤6)的抗癌剂同时或依序施用。

16.根据权利要求11所述的方法，其中，根据步骤4)所述的F细胞的施用以10至30日一个循环重复。

17.根据权利要求10所述的方法，其中，所述癌症选自下组的至少一种：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌、腹膜癌、结肠直肠癌、胆道肿瘤、鼻咽癌、喉癌、支气管癌、口腔癌、骨肉瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、膀胱癌、黑素瘤、脑癌、神经胶质瘤、脑肿瘤、皮肤癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、骨癌、食道癌、结肠癌、胃癌、子宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、头颈癌和直肠癌。