CN111848795B - 一种抗il-17ra单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗il-17ra单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体工程技术领域，具体提供了一种抗IL‑17RA单克隆抗体，单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区。本发明提供的抗IL‑17RA单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与IL‑17RA抗原特异性结合，阻断IL‑17A与IL‑17RA的结合，拮抗和阻断IL‑17/IL‑17R信号通路，是具有巨大潜力的自身免疫性疾病治疗药物，有效缓解自身免疫性疾病的症状，阻止疾病的进展，自身免疫性疾病包括但不局限于下列：银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或硬皮病等。

Description

一种抗IL-17RA单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体工程技术领域，特别涉及一种抗IL-17RA单克隆抗体及其应用。
背景技术
自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。许多疾病相继被列为自身免疫性疾病，例如银屑病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病等。其中，银屑病(Psoriasis)又称牛皮癣，其特点是皮肤出现大小不等、境界清楚的红斑鳞屑性斑块，上覆大量干燥的银白色鳞屑。银屑病皮肤的组织学特征是表皮角质化细胞过度增殖、血管增生以及树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞浸润，银屑病的发病机制涉及复杂的炎症反应和免疫系统。我国患病率约0.47％，据此推算，我国目前约有600多万银屑病患者。银屑病一旦发病，常常罹患终生，反复发作，大多数患者表现为复发与缓解交替出现的过程。类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病，主要病变特点为滑膜炎，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。全世界的发病率约为0.5～1.0％，我国发病率在0.3～0.4％，通常女性发病率是男性的3倍。强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是以骶髂关节和脊柱附着点、中轴骨骼炎症为主要症状，并以椎间盘纤维环及其附近结缔组织纤维化和骨化及关节强直为病变特点的慢性炎性疾病，属风湿病范畴，病因不明。多与感染、遗传因素、环境因素(如长期处于冷、潮、湿环境)等相关。
随着生物抗体药物的不断深入研究，发现白细胞介素-17(IL-17)是由辅助性T细胞17(Th17细胞)分泌的特征性细胞因子，其可以促进机体局部产生趋化因子、募集中性粒细胞、促进细胞增殖分化；但是，其还可与受体结合产生瀑布样炎症效应，造成组织损伤，其已被证实与多种自身免疫性疾病的发病过程密切相关。拮抗和阻断IL-17/IL-17R信号通路是具有巨大潜力的自身免疫性疾病治疗靶点，有望有效缓解自身免疫性疾病的症状，阻止疾病的进展。
IL-17受体(IL-17R)家族由5个成员组成，分别为IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和IL-17RE，所有成员都是Ⅰ型单次跨膜糖蛋白，具有保守结构基序，包括一个胞外的类纤维结合素Ⅲ结构域和一个胞内的结构域。人IL-17RA基因位于P22染色体上，人IL-17RA蛋白全长866个氨基酸，同时具有多个二硫键和糖基化位点，两个修饰位点，还含有胞外区，跨膜区和胞内区。
IL-17RA是IL-17A的受体，也是IL-17F的受体，IL-17RA结合IL-17A的亲和力高于IL-17F。IL-17RA的激活会减少CXCL1、CXCL8/IL-8和IL-6等炎症因子的表达。IL-17RA表达广泛，尤其在造血组织中表达水平较高。IL-17RA包含两个独特的结构域，即靠近SEF1R的toll/白细胞介素1受体样环状结构域和C末端结构域，IL-17RA可以引起多种分子的产生和释放，如细胞因子(IL-6，G-CSF，GM-CSF)、趋化因子(CCL2、CCL7、CCL20、CXCL1、CXCL5)、抗微生物肽(β防御素-2、S100A7、S100A8、S100A9)、黏蛋白(黏蛋白5B和黏蛋白5AC)及基质金属蛋白酶(MMP1、MMP3、MMP9、MMP12和MMP13)等，也可与多个IL-17家族成员结合发挥生物学作用。
目前，Brodalumab是安进/阿斯利康开发的一种选择性地结合人IL-17RA的单克隆抗体药物，在2016年-2017年间陆续获得日本PMDA、美国FDA和欧洲EMA批准上市。国内还没有相同靶点的药物上市，为满足国内市场的需求，急需研发亲和力更高、药效更优的抗IL-17RA单克隆抗体，来填补国内市场的空白。
发明内容
为了能够满足国内市场的需求，本发明利用噬菌体抗体库展示技术和高通量筛选的方法，筛选出亲和力更高，活性更好的抗IL-17RA单克隆抗体及其应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列选自以下序列中的一种：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10；所述轻链可变区的氨基酸序列选自以下序列中的一种：SEQID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
进一步的，本发明提供的所述单克隆抗体选自以下任意一种：
(mAb-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-5)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-6)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-7)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-8)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-9)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-10)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-11)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
进一步的，所述单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种，所述轻链恒定区为人的Cκ；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，所述单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
本发明还提供了一种多肽或蛋白，所述多肽或所述蛋白包含所述的抗IL-17RA单克隆抗体。
本发明还提供了一种多核苷酸序列或组合，所述多核苷酸序列或组合编码所述的抗IL-17RA单克隆抗体的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸序列或组合。
本发明还提供了一种转染重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney 293Ecell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；NS0细胞为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
本发明还提供了一种药物或药物组合物，所述药物或所述药物组合物包含抗IL-17RA单克隆抗体。
本发明还提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途；
优选的，所述自身免疫性疾病包括银屑病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎或硬皮病。
本发明的有益效果如下：本发明提供的抗IL-17RA单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与IL-17RA抗原特异性结合，阻断IL-17A与IL-17RA的结合，拮抗和阻断IL-17/IL-17R信号通路，是具有巨大潜力的自身免疫性疾病治疗药物，有效缓解自身免疫性疾病的症状，阻止疾病的进展，自身免疫性疾病包括但不局限于下列：银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎或硬皮病等。
附图说明
图1为本发明实施例1中pScFvDisb-s的质粒图谱；
图2为本发明实施例1中单克隆抗体噬菌体鉴定Elisa实验数据图；
图3为本发明实施例3中单克隆抗体纯化噬菌体梯度稀释Elisa实验数据图；
图4为本发明实施例4中pTSE的质粒图谱；
图5为本发明实施例5中抗IL-17RA全抗体与IL-17RA在分子水平上结合能力比较图；
图6为本发明实施例6中抗IL-17RA全抗体竞争抑制IL-17A与IL-17RA结合能力比较图；
图7为本发明实施例8中抗IL-17RA全抗体与IL-17RA在细胞水平上的结合能力比较图；
图8为本发明实施例9中抗IL-17RA全抗体抑制HDF细胞中产生IL-6的生物活性实验比较图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体，其中，单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列选自以下序列中的一种：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10；轻链可变区的氨基酸序列选自以下序列中的一种：SEQID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13。
本发明利用全合成ScFv单链噬菌体抗体库筛选获得全人源的特异性结合IL-17RA的单克隆抗体。目前，全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向，抗体库技术的出现为全人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。噬菌体抗体库展示技术是由Smith首先建立的一种将编码外源蛋白或多肽的基因插入噬菌体衣壳蛋白基因，使外源蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库利用了上述原理将不同特异性的抗体或其功能性片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到特异性的高亲和力抗体。
具体的，抗IL-17RA单克隆抗体的生物淘选方法如下：
步骤一：噬菌体抗体库的筛选
采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库；
以IL-17RA-ECD-His为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜。用PBST-4％milk分别封闭免疫管和噬菌体抗体库(噬菌体投入量约为109-1012)，37℃封闭1h。封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，37℃反应1h。PBST-PBS洗去未结合或结合较弱的噬菌体，通过0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH 7.0左右。
将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至OD值约0.5-0.8的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，然后在150rpm摇床振荡培养1h。取出1％菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG小平皿上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，涂布于2YTAG大平皿，37℃过夜培养。将过夜培养菌转接至2YTAG液体培养基，在37℃，220rpm条件下的振荡培养至对数生长期，加入M13K07辅助噬菌体，在37℃的温度条件下静止感染30min后，150rpm振荡培养1h。在4000rpm下离心15min，弃去上清，菌体用50ml 2YTAKA培养基重悬，28℃，220rpm条件下的振荡培养过夜扩增噬菌体。第二天，PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。按照此方法共进行三轮噬菌体库富集筛选后备用。
步骤二：单克隆抗体的ELISA鉴定
经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有1ml 2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃，220rpm的条件下培养约5h至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min后，150rpm振荡培养1h。在4000rpm下离心15min，弃去上清，菌体用2YTAKA重悬，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。第二天，在4000rpm且4℃温度条件下离心15min，吸取含噬菌体上清液进行单克隆的ELISA鉴定，结果如图2所示，筛选得到亲和力较高的单克隆抗体，分别命名为mAb-1、mAb-2、mAb-3、mAb-4、mAb-5、mAb-6、mAb-7、mAb-8、mAb-9、mAb-10、mAb-11，将上述11株单克隆菌液进行基因测序确定为正确的抗体序列。
经过测序，上述筛选的11株单克隆的抗体序列如下，而且本发明保护的单克隆抗体选自以下任意一种：
(mAb-1)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-2)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-3)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-4)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-5)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(mAb-6)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-7)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；
(mAb-8)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-9)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-10)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；
(mAb-11)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
具体的，SEQ ID NO:1(mAb-1中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSYSNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYSKKLKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:2(mAb-2和mAb-11中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAWTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:3(mAb-3中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFSRFGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKHLLGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRFLKFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:4(mAb-4中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAYSNYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFIGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:5(mAb-5中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFAFTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYADQFIGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:6(mAb-6中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTRYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKQFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:7(mAb-7中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKNLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:8(mAb-8中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYGFASRGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:9(mAb-9中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTWTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFLGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:10(mAb-10中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGNTNYAKKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARRVLRLDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:11(mAb-1～5中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWANMPGTFGQGTKVEIK；
SEQ ID NO:12(mAb-6和mAb-7中轻链可变区的氨基酸序列)：
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQDISISLGWFQQKPGQAPRPLIYGWNTRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYSDPFLTFGGGTKVEIK；
SEQ ID NO:13(mAb-8～mAb-11中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVHTGLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFEHNPLTFGQGIKVEIK。
进一步的，单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种，轻链恒定区为人的Cκ；
优选的，重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
优选的，单克隆抗体为全人源抗体。
本发明提供了一种能够特异性结合IL-17RA，阻断其与IL-17A结合通路的抗IL-17RA单克隆抗体。
实施例2
本发明实施例2还提供了一种多肽或蛋白，所述多肽或所述蛋白包含实施例1中筛选得到的抗IL-17RA单克隆抗体。
本发明还提供了一种多核苷酸序列或组合，多核苷酸序列或组合编码实施例1中筛选得到的抗IL-17RA单克隆抗体的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含上述多核苷酸序列或组合。
本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物或药物组合物，药物或所述药物组合物包含实施例1中筛选得到的抗IL-17RA单克隆抗体。
本发明还提供了一种抗IL-17RA单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途；
优选的，自身免疫性疾病包括但不限于银屑病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎或硬皮病。
实施例3、梯度稀释噬菌体Elisa比较抗IL-17RA单克隆抗体的亲和力
3.1单克隆抗体纯化噬菌体的制备：
将实施例1中获得的11株亲和力较高的单克隆抗体(mAb-1、mAb-2、mAb-3、mAb-4、mAb-5、mAb-6、mAb-7、mAb-8、mAb-9、mAb-10、mAb-11)的菌液转接至2YTAG液体培养基，振荡培养至对数生长期后加入M13K07辅助噬菌体感染，离心后菌体用2YTAKA重悬，28℃培养过夜扩增噬菌体，第二天PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体。制备上市产品Brodalumab的核心专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体(AMH14/AML14)的纯化噬菌体作为阳性对照。
3.2噬菌体水平上的亲和力比较
用pH 7.2的0.01M PBS缓冲液包被IL-17RA-ECD-His，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜。第二天，使用PBST洗涤Elisa板3次，加入PBST-4％milk(200μl/孔)，在37℃温度下封闭1h。同时将实施例1中筛选得到的11株单克隆纯化噬菌体样品和专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体(AMH14/AML14)制备的单克隆纯化噬菌体样品分别使用PBST-4％milk进行5倍梯度稀释，共稀释8个梯度，梯度稀释的噬菌体样品在37℃温度下封闭1h。将Elisa板中的PBST-4％milk弃掉，加入梯度稀释的噬菌体样品(100μl/孔)，37℃静置1h。用PBST洗涤Elisa板5次，再加入PBST-4％milk 1:5000稀释的anti-M13-HRP单克隆抗体(100μl/孔)，37℃放置1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，室温显色10min，用2M H2SO4(100μl/孔)终止显色。酶标仪波长450nm和630nm读数。使用软件GraphPad Prism 5Demo分析数据并作图，结果如图3和数据如表1所示。
表1、噬菌体水平上梯度稀释Elisa实验结果
抗体名称 EC50 抗体名称 EC50
Brodalumab 0.02327 mAb-6 0.01238
mAb-1 0.004287 mAb-7 0.01023
mAb-2 0.009335 mAb-8 0.003126
mAb-3 0.004054 mAb-9 0.003962
mAb-4 0.003761 mAb-10 0.004997
mAb-5 0.00844 mAb-11 0.006777
如图3所示，筛选出的11株不同的单克隆抗体均能够与IL-17RA进行结合，而且相对专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体，本发明提供的单克隆抗体与IL-17RA结合能力更强，具有更高的亲和力。
实施例4、抗IL-17RA全抗体的制备
将实施例1筛选出来的11株单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区的载体pTSE(如图4所示)上，重链恒定区为人IgG1恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:14)，轻链恒定区为κ链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:15)，载体pTSE以PTT载体为基础改造获得，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段，结构如图4所示。
SEQ ID NO:14(人的IgG1的重链恒定区序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:15(κ链的轻链恒定区序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
构建的载体测序成功后，使用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒的大量提取，将提取的质粒定量后，和转染试剂按一定的比例混合后，瞬时转染HEK293E细胞进行全抗体表达，培养4天后，收取上清。上清离心过滤后，使用AKTA仪器protein A亲和柱纯化获得全抗体蛋白。纯化获得蛋白通过超滤浓缩后，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白的定量，结果如表2所示。同时表达纯化上市产品Brodalumab的全抗体作为阳性对照。
表2、全抗体蛋白浓度数据表
抗体名称 浓度(mg/ml) 抗体名称 浓度(mg/ml)
Brodalumab 14.64 mAb-6 13.4
mAb-1 14.00 mAb-7 10.55
mAb-2 18.03 mAb-8 17.39
mAb-3 15.75 mAb-9 18.22
mAb-4 12.30 mAb-10 16.15
mAb-5 10.90 mAb-11 16.56
实施例5、抗IL-17RA全抗体与IL-17RA在分子水平上的结合实验
用pH 7.2的0.01M的PBS缓冲液包被IL-17RA-ECD-His，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜。第二天，使用PBST洗涤Elisa板3次，再加入PBST-4％milk(200μl/孔)，在37℃温度下封闭1h。使用PBST-4％milk梯度稀释实施例4中制备的全抗体和阳性对照抗体，所有抗体的起始最高浓度均是10μg/mL，5倍梯度稀释，每个全抗体均做8个梯度。将Elisa板中的PBST-4％milk弃掉，加入梯度稀释的全抗体样品(100μl/孔)，在37℃温度条件下孵育1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，再加入用PBST-4％milk 1:5000稀释的山羊抗人的IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，室温显色10min，然后用2M H2SO4(50μl/孔)终止显色。酶标仪波长450nm和630nm读数。使用软件GraphPad Prism 5Demo分析数据作图，实验结果如图5和表3所示。
表3、全抗体亲和实验EC50值数据表
抗体名称 EC50(ng/ml) 抗体名称 EC50(ng/ml)
Brodalumab 108 mAb-6 46.7
mAb-1 42.97 mAb-7 61.15
mAb-2 23.34 mAb-8 14.38
mAb-3 25.15 mAb-9 25.46
mAb-4 26.24 mAb-10 35.58
mAb-5 25.1 mAb-11 30.65
如图5和表3所示，筛选出的11株不同的单克隆抗体的全抗体均能与IL-17RA进行结合，本发明提供的11株不同的单克隆抗体的EC50值均明显低于专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体的全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与IL-17RA结合的亲和力较高，具有较好的活性，此外，从图5和表3还可以得出，这11株全抗体中mAb-8的全抗体的EC50值最低，说明其与IL-17RA结合能力最好，亲和力最高，活性最好。
实施例6、全抗体竞争抑制IL-17A与IL-17RA的结合实验
用pH 7.2的0.01M PBS包被IL-17A-Fc(100ng/孔/100μl)，4℃包被过夜。第二天，使用PBST洗涤Elisa板3次，再加入PBST-4％milk，在37℃温度条件下封闭1h。使用PBST-4％milk稀释IL-17RA-ECD-His至浓度2μg/ml；使用PBST-4％milk梯度稀释实施例4中的全抗体和阳性对照抗体，所有抗体的起始最高浓度均是300μg/mL，3倍梯度稀释，每个全抗体均做8个梯度。将Elisa板中的PBST-4％milk弃掉，分别加入IL-17RA-ECD-His(50μl/孔)和梯度稀释的全抗体样品(50μl/孔)，在37℃温度条件下孵育2h。PBST洗涤Elisa板5次，加入PBST-4％milk稀释1:5000的小鼠抗His IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。使用PBST洗涤Elisa板5次，TMB显色试剂盒显色(100μl/孔)，室温显色10min，用2M H2SO4(50μl/孔)终止显色。酶标仪波长450nm和630nm读数。使用软件GraphPad Prism 5Demo作图，实验结果如图6和表4所示。
表4、全抗体竞争实验IC50值数据表
抗体名称 IC50(ng/ml) 抗体名称 IC50(ng/ml)
Brodalumab 3443 mAb-6 2905
mAb-1 2355 mAb-7 2166
mAb-2 2452 mAb-8 1576
mAb-3 2083 mAb-9 2322
mAb-4 2021 mAb-10 2802
mAb-5 1911 mAb-11 2666
如图6和表4所示，筛选出的11株不同的单克隆抗体的全抗体均能有效抑制IL-17A与IL-17RA的结合，本发明提供的11株不同的单克隆抗体的IC50值均明显低于阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体对IL-17A与IL-17RA结合的抑制能力较强，此外，从图6和表4还可以得出，这11株全抗体中mAb-8的全抗体的IC50值最低，说明其对IL-17A与IL-17RA结合的抑制能力最强。
实施例7、BIAcore X100测定全抗体的亲和力
采用捕获法测定全抗体的亲和力：将山羊抗人IgG偶联到CM5芯片表面，抗体HBS-EP buffer分别稀释至浓度1μg/ml确保其可以被山羊抗人IgG捕获。将IL-17RA-ECD-His设置一系列的浓度梯度(20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0μg/ml)流经固定相表面，测定实施例4提供的11株全抗体和阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体的亲和力，数据如下表。
表5、Biacore测定的全抗体亲和力结果数据表
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
mAb-1 8.077E+05 8.421E-05 1.042E-10
mAb-2 7.887E+05 5.732E-05 7.267E-11
mAb-3 1.126E+06 4.840E-05 4.298E-11
mAb-4 1.023E+05 6.571E-06 6.426E-11
mAb-5 1.022E+06 7.439E-05 7.275E-11
mAb-6 6.358E+04 1.066E-05 1.676E-10
mAb-7 7.517E+04 1.936E-05 2.575E-10
mAb-8 3.213E+05 4.923E-06 1.532E-11
mAb-9 8.160E+04 1.471E-06 1.803E-11
mAb-10 5.205E+05 3.413E-05 6.356E-11
mAb-11 1.001E+05 1.393E-05 1.392E-10
Brodalumab 1.504E+05 4.333E-05 2.882E-10
通过表5数据得出，本发明提供的11株单克隆抗体的全抗体都具有较高的亲和力，且KD(M)值明显低于阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体，说明本发明提供的11株单克隆抗体具有较高的生物学活性。
实施例8、全抗体与细胞表面IL-17RA的结合特异性分析
采用现有方法构建过表达IL-17RA的CHO细胞来检测不同的抗IL-17RA抗体与细胞表面IL-17RA的结合情况。
梯度稀释实施例4中的全抗体和对照抗体，所有抗体的初始最高浓度为20μg/ml，5倍梯度稀释，每个全抗体均做8个梯度。离心收集CHO细胞，PBS+1％BSA洗涤3次并重悬细胞，调整细胞密度至2x 106个/mL，每孔加入50μl细胞，同时加入50μl梯度稀释的抗IL-17RA全抗体，室温孵育1小时。3000rpm离心去上清液，用PBS洗涤细胞3遍，加入50μl/孔稀释好的FITC标记的山羊抗人IgG抗体溶液重悬细胞，室温避光孵育1小时。3000rpm离心去上清液，再次使用PBS洗涤3遍，再用100μl PBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。结果用GraphpadPrism 5Demo作图分析，结果如图7和表6所示。
表6、抗IL-17RA全抗体与细胞表面的IL-17RA的结合实验
抗体名称 EC50(ng/ml) 抗体名称 EC50(ng/ml)
Brodalumab 272.9 mAb-6 213.1
mAb-1 176.8 mAb-7 216.1
mAb-2 130.7 mAb-8 48.45
mAb-3 78.14 mAb-9 66.14
mAb-4 106.3 mAb-10 101.4
mAb-5 146.0 mAb-11 189.6
通过上述数据及如图7所示，本发明制备的11株全抗体的EC50值均明显低于阳性对照上市产品Brodalumab的全抗体，说明本发明提供的11株抗体均能结合细胞表达的IL-17RA，而且这11株全抗体中mAb-8的全抗体的EC50值最低，说明其与IL-17RA抗原特异性结合能力最好，亲和力最强，活性最好。
实施例9、抗IL-17RA抗体抑制人皮肤成纤维细胞(HDF)产生IL-6的生物活性实验
使用0.25％胰蛋白酶消化HDF细胞，8000个/孔铺板，在37℃温度条件下过夜培养。使用PBS稀释IL-17A至浓度2μg/ml；使用PBS梯度稀释实施例4中的全抗体和对照抗体，全抗体的起始最高浓度均为200μg/ml，5倍梯度稀释，每个全抗均做8个梯度。每孔加入PBS稀释终浓度1μg/ml的IL-17A和梯度稀释的抗IL-17RA抗体和对照抗体(专利US7833527B2提供的抗IL-17RA单克隆抗体)，在37℃温度条件下过夜培养。取90μl上清液，使用IL-6ELISA检测试剂盒对细胞因子IL-6分泌水平进行定量分析，结果如图8和表7所示。
表7、抗IL-17RA抗体的生物学活性实验
抗体名称 IC50(ng/ml) 抗体名称 IC50(ng/ml)
Brodalumab 116.8 mAb-6 33.41
mAb-1 28.37 mAb-7 29.69
mAb-2 22.72 mAb-8 13.54
mAb-3 33.42 mAb-9 24.76
mAb-4 35.77 mAb-10 36.35
mAb-5 22.92 mAb-11 60.8
通过上述表7数据及如图8所示，说明本发明提供的11株全抗体均能通过与IL-17A竞争性的结合IL-17RA，降低IL-6的分泌水平，此外，本发明提供的11株不同的单克隆抗体的IC50值均明显低于阳性对照上市产品Brodalumab全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与IL-17RA的结合能力强于阳性对照抗体与IL-17RA的结合能力，此外，通过上述数据还可以得出，这11株全抗体中mAb-8的全抗体的活性最好，与IL-17A竞争性最强。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种抗IL-17RA单克隆抗体及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Tyr Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ser Lys Lys Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Trp Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys His Leu
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Phe Leu Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Ile Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Gln Phe
50 55 60
Ile Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Gln Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Asn Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe Ala Ser Arg
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Trp Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Leu Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Asn Met Pro Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Leu Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Trp Asn Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Phe Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val His Thr Gly
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Glu His Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Ile Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种抗IL-17RA单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:13。
2.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种，所述轻链恒定区为人的Cκ。
3.如权利要求2所述的抗IL-17RA单克隆抗体，其特征在于，所述重链恒定区为人的IgG1。
4.如权利要求1所述的抗IL-17RA单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
5.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1-4任一项所述的抗IL-17RA单克隆抗体。
6.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求5所述的多核苷酸分子。
7.一种转染如权利要求6所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
9.一种药物，其特征在于，所述药物包含如权利要求1-4任一项所述的抗IL-17RA单克隆抗体。
10.一种权利要求1-4任一项所述的抗IL-17RA单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的用途，所述自身免疫性疾病选自银屑病、类风湿关节炎、强直性脊柱炎或硬皮病。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070197441A1 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 Rixon Mark W Truncated il-17ra soluble receptor and methods of using in inflammation
CN101541833A (zh) * 2006-10-02 2009-09-23 安姆根有限公司 Il-17受体a抗原结合蛋白质
CN103936854A (zh) * 2014-04-30 2014-07-23 北京精益泰翔技术发展有限公司 抗il-17a单克隆抗体及其制备与应用
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