BRPI0609449A2 - detecção de agentes de modulação de gdf-8 - Google Patents

Abstract

DETECçãO DE AGENTES DE MODULAçãO DE GDF-8. A presente invenção refere-se a processos para detecção de agentes de modulação de GDF-8 em animais, incluindo humanos, são aqui providos, incluindo processos para detectar a presença de agente de modulação de GDF-8 exógeno tal como um inibidor de GDF-8 em uma amostra biológica. Em particular, processos para avaliação de presença e/ou quantidade de um agente de modulação de GDF-8 em uma amostra biológica são providos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETECÇÃO DE AGENTES DE MODULAÇÃO DE GDF-8".

Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente reivindica o benefício de pedido provisó-rio US NQ 60/664 400, depositado em 23 de março de 2005, o conteúdo doqual é aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.

Antecedentes

Fator de crescimento e diferenciação-8 (GDF-8), também co-nhecido como miostatina, é uma proteína secretada que é um regulador ne-gativo de massa de músculo de esqueleto. Inibidores de GDF-8 aumentamcrescimento de músculo, e são potencialmente benéficos no tratamento deuma variedade de condições incluindo sarcopenia, caquexia, e distrofiamuscular.

GDF-8 é um membro da superfamília de fator de crescimentotransformante-beta (TGF-p) de fatores de crescimento estruturalmente rela-cionados. Membros desta superfamília possuem propriedades morfogenéti-cas ereguladoras de crescimento fisiologicamente importantes (Kingsley etal., Genes Dev. 8:133-146 (1994); Hoodless et al., Curr. Topics Microbiol.Immunol. 228:235-272 (1998)). Similarmente, eles compartilham uma orga-nização estrutural comum incluindo um sinal peptídeo curto para secreção euma porção amino terminal separada de uma porção carbóxi terminal bioati-va por um sítio de clivagem proteolítica altamente conservado.

GDF-8 humano é sintetizado como uma proteína precursora de375 aminoácidos que inclui uma porção amino pró-peptídeo terminal e umaporção carbóxi madura terminal. O pró-peptídeo é clivado de GDF-8 maduraem Arg-266. A proteína GDF-8 madura é ativa como um homodímero ligadopor dissulfeto. Seguindo processamento proteolítico, é acreditado que doispró-peptídeos GDF-8 permaneçam não-covalentemente complexados com odímero domínio maduro de GDF-8, mantendo GDF-8 em um estado inativo,latente (Lee, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 98:9306-9311 (2001); Thieset al., Growth Factors 18:251-259 (2001)). Outras proteínas também são co-nhecidas ligarem-se a GDF-8 madura e inibirem sua atividade biológica. Taisproteínas inibidoras incluem folistatina e proteínas relacionadas à folistatina,incluindo GASP-1 (Gamer et al., Dev. Biol. 208:222-232 (1999)); patente USNe 2003-0180306-A1; patente US Ne 2003-0162714-A1).

Um alinhamento de seqüências de aminoácidos deduzidas devárias espécies demonstra que GDF-8 é altamente conservada por toda aevolução (McPherron et al., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 94:12457-12461(1997)). De fato, as seqüências de GDF-8 humanas, de camundongo, rato,suíno, e galinha são 100% idênticas na região terminal carboxi, enquanto embabuíno, bovino e ovino esta região difere somente por 3 aminoácidos. AGDF-8 de peixe zebra é mais diferente, mas ainda é 88% idêntica à seqüên-cia humana na região carbóxi terminal.

Devido GDF-8 ser um regulador negativo de massa de músculode esqueleto, há considerável interesse em identificação e desenvolvimentode processos terapêuticos envolvendo fatores que regulam a atividade bio- lógica de GDF-8. Por exemplo, camundongo e gado com mutações no geneGDF-8 mostram um acentuado aumento em peso de corpo e massa muscu-lar (McPherron et al., Nature 387:83-90 (1997); Zhu et al., FEBS Letters474:71-75 (2000); Grobet et al., Nature Genet. 17:71-74 (1997)). Administra-ção de um anticorpo de modulação de GDF-8 monoclonal de camundongono modelo de camundongo mdx de distrofia muscular de Duchenne (DMD),diminui degeneração de músculo e concentrações de creatina cinase emsoro, enquanto aumentando peso de corpo, massa muscular, tamanho demúsuclo, e resistência absoluta de músculo do camundongo mdx (Bodanovi-ch et al., Nature 420:418-421 (2002)). Ainda, inibição farmacológica de GDF-8 em camundongos C57BL/6 e BALB/c adulto conduz a um aumento emtamanho de músculo e resistência de presa (Whittemore et al., BBRC300:965-971 (2003)).

Devido a sua função chave na regulação de muitos processosbiológicos críticos, GDF-8 é um desejável alvo para intervenção terapêuticapara muitos distúrbios. Agentes terapêuticos que inibem a atividade de GDF-8 podem ser usados para tratamento de distúrbios humanos ou animais nasquais um aumento em tecido muscular pode ser terapeuticamente benéfico,e agentes que modulam atividade de GDF-8 podem ser usados para trata-mento de distúrbio associada com tecido adiposo, homeostase de glicose,ou uma perda de osso. Ainda, um inibidor de GDF-8 administrado a um indi-víduo normal, por exemplo, pode aumentar a massa muscular naquele indi-víduo.

Um inibidor de GDF-8 é MYO-029, um anticorpo inteiramentehumano que é descrito ainda em detalhes na patente US 2004-0142382.MYO-029 é capaz de ligar GDF-8 madura com alta afinidade, inibindo ativi-dade de GDF-8 in vitro e in vivo, e inibindo atividade de GDF-8 associadacom regulação negativa de massa muscular de esqueleto. MYO-029 promo-ve aumentada massa muscular quando administrado a camundongos.

Agentes de modulação de GDF-8 são úteis em uma variedadede aplicações terapêuticas, e assim processos para detectar e/ou quantificaragentes de modulação de GDF-8 em uma amostra biológica de um indivíduosão desejáveis. Medição dos níveis de um agentes de modulação de GDF-8terapêutico em soro humano tem importância terapêutica. Tais processospermitem, por exemplo, acompanhamento do curso de terapia, avaliaçãofármaco-cinética ou biodisponibilidade do agente, medição de níveis de umagente em uma amostra biológica de um indivíduo, e/ou detecção de admí-nistração de um agente que modula atividade de GDF-8.

Ainda, devido a inibidores de atividade de GDF-8 desenvolvidospara aplicações terapêuticas aumentarem massa muscular, eles podem seralvos para o abuso de propósitos de aumento de performance. O risco douso ilícito de um agente de modulação de GDF-8 para propósitos não-terapêuticos eleva-se quando o agente torna-se disponível como um medi-camento. Fármacos administrados para aperfeiçoamento de performanceatlética de um indivíduo ou para aumentar a taxa de crescimento ou proprie-dades alimentícias de um animal de gado são, muitos casos, reguladas e/oubanidas. Assim, a habilidade para detectar o abuso de agentes de modula-ção de GDF-8 que têm legítimas aplicações médicas é crescentemente im-portante. Por isso é desejável o desenvolvimento de processos para detec-ção de uso de um inibidor de GDF-8 por um atleta ou em um animal de ali-mentação, por exemplo, e monitoração de uso de um agente de modulaçãode GDF-8 em um indivíduo.

Um estudo fármaco-cinético anterior do agente de modulação deGDF-8, MYO-029, envolveu marcação direta de anticorpo MYO-029 com oisótopo radioativo 125l. Detecção direta é desvantajosa, entretanto, na medi-da em que tais processos podem ser problemáticos e podem envolver intro-dução de substâncias tóxicas ou potencialmente perigosas no indivíduo aoqual o agente de modulação de GDF-8 é administrado (patente US N92004/0142382-A1). Processos aperfeiçoados para detecção de um agentede modulação de GDF-8 em uma amostra biológica são necessários.

Para monitorar ou avaliar terapia ou para detectar abuso de umagente de modulação de GDF-8, por isso é importante desenvolver ensaiose processos para detecção de presença de um agente de modulação deGDF-8 em uma amostra biológica, e processos para monitoração e/ou quan-tificação de um agente de modulação de GDF-8 em uma amostra biológica.

Sumário

Processos para detecção de um agente de modulação de GDF-8em uma amostra biológica, onde o agente GDF-8 é capaz de modular umaou mais atividades de GDF-8, são aqui descritos. Especificamente, proces-sos para detecção de inibidores de GDF-8 em amostras biológicas são pro-vidos. Estes processos detectam baixos níveis de um agente de modulaçãode GDF-8 em uma amostra biológica complexa, tal como soro, sangue,plasma, ou urina, por exemplo. Os processos podem ser usados para detec-ção de vários agentes GDF-8, e podem ser usados para indivíduos não-sintomáticos, sintomáticos ou saudáveis, por exemplo.

Em uma realização, um processo para detectar um agente demodulação de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica é provido, o pro-cesso compreendendo: (a) adição de uma amostra biológica de um indivíduoa ser testado a um ensaio in vitro para uma atividade de GDF-8; (b) detec-ção de modulação da atividade de GDF-8; e (c) comparação de modulaçãoda atividade de GDF-8 na presença da amostra biológica à modulação daatividade de GDF-8 na presença de uma amostra biológica controle, peloque detectando a presença do agente de modulação de GDF-8 exógeno naamostra biológica.

Em algumas modalidades, o ensaio in vitro compreende as eta-pas de:

(a) contato de uma proteína GDF-8 com uma superfície de um vaso de rea-ção, onde a proteína GDF-8 é um dímero proteína GDF-8 madura; (b) adiçãode uma amostra biológica ao vaso de reação; (c) adição de um agente dedetecção; e (d) detectando um complexo de agente de modulação de GDF-8/ proteína GDF-8 associado com a superfície do vaso de reação, pelo que detectando um agente de modulação de GDF-8 exógeno. Em uma realiza-ção, a proteína GDF-8 compreende uma porção biotina e contata a superfí-cie por meio da porção biotina. Ainda em modalidades, a GDF-8 é biotiniladasobre um resíduo lisina, a razão molar da porção biotina para proteína GDF-8 é menos que cerca de 5:1, e/ou a razão molar da porção biotina para pro-teína GDF-8 está entre cerca de 0,5:1 e cerca de 4:1. Em outras modalida-des deste processo, avidina ou estreptavidina é adsorvida à superfície dovaso de reação antes de adição da proteína GDF-8.

Em uma modalidadeadicional, o ensaio in vitro compreende asetapas de: (a) contato de um receptor de GDF-8 solúvel com uma superfíciede um vaso de reação; (b) adição de uma amostra biológica ao vaso de rea-ção; (c) adição de uma proteína GDF-8 rotulada ao vaso de reação; e (d)detecção de quantidade de complexo de proteína GDF-8 rotulada / receptorde GDF-8 associada com a superfície na presença e ausência da amostrabiológica, onde uma redução na quantidade de complexo de proteína GDF-8rotulada / receptor de GDF-8 na presença da amostra biológica detecta umagente de modulação de GDF-8 exógeno na amostra biológica. Em uma rea-lização, o processo ainda compreende a etapa de incubação de amostrabiológica com a proteína GDF-8 rotulada antes de adição de amostra ao va-so de reação.

Ainda em adicionais modalidades, os processos compreendemum ensaio de gene repórter in vitro baseado em célula que inclui as etapasde: (a) provimento de uma célula hospedeira compreendendo uma constru-ção de gene repórter em um vaso de reação, onde a construção compreen-de um elemento controle responsivo a GDF-8 e um gene repórter; (b) adiçãode uma amostra biológica ao vaso de reação; e (c) detecção de expressãode gene repórter na célula na presença e ausência da amostra biológica,pelo que detectando um agente de modulação de GDF-8 exógeno.

Em certas modalidades, os processos ainda compreendemquantificação de nível do agente de modulação de GDF-8 na amostra bioló-gica através de comparação de modulação de atividade de GDF-8 atravésde amostra biológica de um indivíduo a uma pluralidade de amostras contro-les, cada uma compreendendo uma conhecida concentração do agente demodulação de GDF-8. Em uma outra modalidadepreferida, a amostra bioló-gica compreende uma amostra de um indivíduo ao qual um agente de modu-lação de GDF-8 foi ou é suspeito de ter sido administrado. Em outras moda-lidades, a amostra biológica é escolhida de soro, sangue, plasma, amostrade biópsia, amostra de tecido, suspensão de células, saliva, fluido oral, fluidocérebroespinhal, fluido amniótico, leite, colostro, secreção de glândula ma-maria, linfa, urina, suor, fluido lacrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, e muco.

Os processos aqui providos podem ser usados para detecção deum agente de modulação de GDF-8 escolhido de, por exemplo: um anticorpoque se liga especificamente a GDF-8; um anticorpo que se liga especifica-mente a um parceiro de ligação de GDF-8; um receptor de GDF-8; uma pro-teína ActRIlB; uma proteína contendo domínio folistatina; uma proteína folis-tatina; uma proteína GASP-1; uma proteína GDF-8; um pró-peptídeo GDF-8;um inibidor não-protéico; e uma molécula pequena. Em certas modalidades,o agente de modulação de GDF-8 é um inibidor de GDF-8. Em outras moda-lidades, o agente é um anticorpo que se liga especificamente a uma proteínaGDF-8. Em uma modalidadepreferida, o agente de modulação de GDF-8 éMYO-029, um anticorpo neutralizante humano que se liga especificamente aGDF-8.

Ainda em uma realização, um processo para detectar um agentede modulação de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica é provido quecompreende: (a) contato de uma proteína GDF-8 madura com uma superfí-cie de um vaso de reação; (b) adição de uma amostra biológica ao vaso dereação; (c) adição de um agente de detecção ao vaso de reação; e (d) de-tecção de um complexo de agente de modulação de GDF-8 / proteína GDF-8 associado com a superfície do vaso de reação, pelo que detectando o a-gente de modulação de GDF-8 exógeno na amostra biológica. Em modali-dades preferidas deste processo, a proteína GDF-8 madura compreendeuma porção biotina e contata a superfície via a porção biotina. Em modalida-des adicionais, a razão molar de porção biotina para proteína GDF-8 é me-nos que cerca de 5:1 ou a razão molar de porção biotina para proteína GDF- 8 madura está entre cerca de 0,5:1 e cerca de 4:1.

Agentes de modulação de GDF-8, como inibidores de GDF-8,podem ser detectados nos processos aqui providos, e eles também podemser usados nos processos da invenção. Assim, em algumas modalidades, oagente de detecção é um inibidor de GDF-8. Em certas modalidades, o a-gente de detecção é escolhido de um anticorpo que se liga especificamenteao agente de modulação de GDF-8 e a uma proteína GDF-8 rotulada. Emadicionais modalidades, o agente de detecção é um anticorpo que se ligaespecificamente à região constante de uma imunoglobulina, incluindo umaimunoglobulina humana.

Em outras modalidades, um processo para detectar um agentede modulação de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica é provido quecompreende: (a) contato de um agente de captura com uma superfície deum vaso de reação, onde o agente de capturar é escolhido de uma proteínaGDF-8 e uma proteína que se liga especificamente a uma proteína GDF-8;(b) adição de uma amostra biológica ao vaso de reação; (c) adição de umagente de detecção ao vaso de reação; e (d) detecção de um complexo deagente de modulação de GDF-8 /agente de captura associado com a super-fície do vaso de reação, pelo que detectando um agente de modulação deGDF-8 exógeno na amostra biológica.

Ainda, um processo para detectar um agente de modulação deGDF-8 em uma amostra biológica é provido que compreende: (a) contato deum receptor de GDF-8 com uma superfície de pelo menos primeiro e segun-do vasos de reação; (b) adição de uma amostra biológica e uma proteínaGDF-8 ao primeiro vaso de reação; (c) adição de uma amostra controle euma proteína GDF-8 ao segundo vaso de reação; (d) adição de um rotuladordetectável aos primeiro e segundo vasos de reação; e (e) comparando o si-nal detectável de rotulador no primeiro vaso de reação ao segundo vaso dereação, pelo que detectando o agente de modulação de GDF-8 na amostrabiológica.

Em uma outra realização, um processo para detectar um agentede modulação de GDF-8 em uma amostra biológica humana é provido. Estamodalidadecompreende (a) adição de uma amostra biológica a um ensaio invitro para uma atividade de GDF-8; (b) detecção de modulação da atividadede GDF-8; e (c) comparação de modulação da atividade de GDF-8 na pre-sença da amostra biológica teste a partir do candidato à modulação da ativi-dade de GDF-8 na presença de uma amostra biológica controle, pelo quedetectando um agente de modulação de GDF-8 exógeno.

Em uma modalidadepreferida, um processo para detectar MYO-029 em uma amostra biológica é descrito, compreendendo: (a) contato deum dímero proteína GDF-8 madura biotinilada com uma superfície de umvaso de reação, onde a proteína GDF-8 compreende uma razão média debiotina para dímero GDF-8 de menos que 5:1; (b) adição de uma amostrabiológica ao vaso de reação; (c) adição de um anticorpo rotulado que se ligaespecificamente a uma imunoglobulina humana ao vaso de reação; e (d)detecção de um complexo de MYO-029 / proteína GDF-8 biotinilada associ-ado com a superfície do vaso de reação, pelo que detectando MYO-029 naamostra biológica.

Adicionais objetos e vantagens da invenção serão mostrados emparte na descrição que se segue, e em parte serão óbvios a partir da descri-ção, ou podem ser entendidos através de prática da invenção. Os objetos evantagens da invenção serão realizados e obtidos por meio dos elementos ecombinações particularmente destacados nas reivindicações apensas.

O resumo anterior e a seguinte descrição não são restritivos dainvenção como reivindicada.Breve Descrição das Seqüências

Seqüências de ADN e aminoácidos (AA) de GDF-8, MYO-029, efragmentos scFv relevantes, domínios VH e VL, e regiões de determinaçãode complementaridade (CDR) são mostradas nas Listagem de Seqüências esão enumeradas como listadas na Tabela 1.

Tabela 1

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Descrição Detalhada

Esta invenção refere-se a processos para detecção de agentesde modulação de GDF-8 em animais, incluindo seres humanos, que derivamalgum benefício a partir da modulação de pelo menos uma atividade deGDF-8. Processos para detecção de presença de agente de modulação deGDF-8 exógeno tal como um inibidor de GDF-8 são aqui providos. Em parti-cular, processos para avaliar a presença e/ou quantidade de um inibidor deGDF-8 em uma amostra biológica a partir de um indivíduo ao qual o inibidorde GDF-8 foi ou é suspeito de ter sido administrado são providos.

Quando um agente de modulação de GDF-8 é administrado aum indivíduo, processos para detecção de agente de modulação de GDF-8exógeno são úteis para determinação de presença e/ou quantidade do agen-te em uma amostra biológica. Os processos também podem permitir avalia-ção de um regime terapêutico, ajuste de dosagem do agente, ou avaliar asfármaco-cinéticas ou biodispònibilidade do agente, por exemplo.

De modo que a presente invenção possa ser mais facilmenteentendida, certos termos são primeiro definidos. Adicionais definições sãomostradas por toda a descrição detalhada.

O termo "GDF-8" refere-se a um específico fator de crescimentoe diferenciação-8. O termo refere-se à forma precursora não-processada deinteiro comprimento de GDF-8 assim como as formas pró-peptídeo e maduraresultantes de clivagem pós-translacional. A menos que de outro modo es-pecificado como "inativa", uma "proteína GDF-8" retém uma ou mais ativida-des biológicas de GDF-8. O termo também refere-se a quaisquer fragmentose variantes de GDF-8 que mantêm pelo menos uma atividade biológica as-sociada com GDF-8 madura, como aqui discutida, incluindo seqüências queforam modificadas. A seqüência de aminoácidos de GDF-8 humana maduraé provida em SEQ ID NO:1, e a seqüência de GDF-8 humana de inteirocomprimento, precursora, é provida em SEQ ID NO:2. A presente invençãorefere-se a GDF-8 de todas as espécies vertebradas, incluindo, mas nãolimitada a, humana, bovina, galinha, camundongo, rato, suíno, ovino, peru,babuíno, e peixe (para informação de seqüência, vide, por exemplo, McPher-ron etal., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 94:12457-12461 (1997)).

O termo "GDF-8 madura" refere-se à porção carbóxi terminal daproteína precursora de GDF-8. Dependendo das condições, a GDF-8 madu-ra pode estar presente como um monômero, homodímero, e/ou em um com-plexo latente GDF-8, por exemplo. Em sua forma biologicamente ativa, aGDF-8 madura é também referida como "GDF-8 ativa". O termo também re-fere-se a quaisquer fragmentos e variantes de GDF-8 que mantêm pelo me-nos uma atividade biológica associada com GDF-8 madura, como aqui dis-cutido, incluindo seqüência que foram modificadas.

O termo "pró-peptídeo de GDF-8" refere-se à porção amino ter-minal da proteína precursora de GDF-8. O pró-peptídeo GDF-8 é capaz deligação ao domínio de ligação de pró-peptídeo sobre a GDF-8 madura. Opró-peptídeo GDF-8 forma um complexo com o homodímero de GDF-8 ma-dura. É acreditado que dois pró-peptídeos GDF-8 se associam com duasmoléculas de GDF-8 madura no homodímero para formar um complexo te-tramérico inativo, chamado um complexo latente. O complexo latente podeincluir outros inibidores GDF no lugar de ou em adição a um ou mais dospró-peptídeos GDF-8.

O termo "atividade de GDF-8" refere-se a uma ou mais ativida-des fisiologicamente reguladoras de crescimento ou morfogenéticas associ-adas com proteína GDF-8 ativa. Por exemplo, GDF-8 ativa é um reguladornegativo massa muscular de esqueleto. GDF-8 ativa também pode modulara produção de enzimas específicas de músculo (por exemplo, creatina cina-se), estimular a proliferação de mioblasto, e modular diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos. "Atividade de GDF-8" inclui "atividade de ligaçãode GDF-8". Por exemplo, GDF-8 madura liga-se especificamente à porçãopró-peptídeo de GDF-8, a ActRIlB, a um receptor de GDF-8, a activina, afolistatina, a proteínas contendo domínio folistatina, a GASP-1, e a outrasproteínas. Um inibidor de GDF-8, tal como um anticorpo ou sua porção, podereduzir uma ou mais destas atividades de ligação. Procedimentos exempla-res para medição de atividade de GDF-8 in vivo e in vitro são mostradas a-baixo.

O termo "agente de modulação de GDF-8" inclui qualquer agen-te capaz de modular atividade, expressão, processamento ou secreção deGDF-8, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável. Agentes que au-mentam uma ou mais atividades de GDF-8 e agentes que diminuem uma oumais atividades de GDF-8 são abrangidos pelo termo. O termo "inibidor deGDF-8" inclui qualquer agente capaz de afetar atividade, expressão, proces-samento, ou secreção de GDF-8, ou um seu derivado farmaceuticamenteaceitável. Um inibidor de GDF-8 reduz uma ou mais atividades associadascom GDF-8. Em certas modalidades, um inibidor de GDF-8 afetará ligaçãode GDF-8 a um ou mais de seus parceiros de ligação fisiológica, incluindo,mas não limitado a um receptor (por exemplo, ActRIlB), uma proteína con-tendo domínio folistatina (por exemplo, folistatina, FLRG, GASP-1, GASP-2),ou uma proteína GDF-8 tal como o pró-peptídeo GDF-8 e seus derivados emutantes. Tais inibidores de GDF-8 incluem, por exemplo, anticorpos que seligam especificamente a GDF-8 (incluindo MYO-029, MYO-028, MYO-022,Já-16, e seus fragmentos e derivados), anticorpos que se ligam especifica-mente a um receptor de GDF-8, receptores solúveis modificados (incluindoproteínas de fusão receptoras, como a fusão ActRNB-Fc), outras proteínasque se ligam especificamente a GDF-8 (tal como o pró-peptídeo GDF-8, mu-tantes e derivados do pró-peptídeo GDF-8, folistatina, proteínas contendodomínio folistatina, e fusões Fc destas proteínas), proteínas de ligação aoreceptor de GDF-8 e fusões Fc destas proteínas, e miméticos são incluídos.Inibidores não-protéicos (como ácidos nucléicos) também são abrangidospelo termo inibidor de GDF-8. Inibidores de GDF-8 incluem proteínas, anti-corpos, peptídeos, peptidomiméticos, ribozimas, oligonucleotídeos anti-sentido, ARN de fita dupla, ARNsi (por exemplo, para ARNi), e outras molé-culas pequenas, que inibem especificamente GDF-8. Tais inibidores são di-tos "inibirem", "reduzirem", ou "neutralizarem" a atividade biológica de GDF-8, e são descritos em mais detalhes abaixo.

Um inibidor de GDF-8 "inibirá", "reduzirá" ou "neutralizará" pelomenos uma atividade biológica de GDF-8, tal como atividade fisiológica, re-guladora de crescimento ou morfo-genética associada com proteína GDF-8ativa. Por exemplo, GDF-8 é um regulador negativo de crescimento de mús-culo de esqueleto. Um inibidor de GDF-8 pode aumentar massa muscular,aumentar resistência muscular, modular os níveis de enzimas específicas demúsculo (por exemplo, creatina cinase), estimular proliferação de mioblasto,modular diferenciação de pré-adipócito para adipócitos, diminuir acumulaçãode gordura, diminuir níveis de triglicerídeos em soro, diminuir níveis de co-lesterol no soro, modular metabolismo de glicose, e/ou reduzir hiperglicemia.

Os termos "inibir", "inibidor", e seus cognatos referem-se a umaredução em uma ou mais atividades de GDF-8 através de um inibidor deGDF-8, em relação à atividade de GDF-8 na ausência do mesmo inibidor. Aredução em atividade é preferivelmente pelo menos cerca de 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou maior. Em certas modalidades, a ativi-dade de GDF-8, quando afetada por um ou mais dos inibidores presente-mente mostrados, é reduzida pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%,86% ou 88%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 92%, 94%, 96%, 98%ou 99%, e mesmo mais preferivelmente pelo menos 95% a 100%. Os termos"neutralizar", "neutralizando" e seus cognatos referem-se a uma redução deuma ou mais das atividades de GDF-8 por pelo menos 80%, 85%, 90%, ou95%. Inibição de atividade de GDF-8 pode ser medida, por exemplo, em en-saios de gene repórter (RGA) pGL3(CAGA)i2 como descrito em Thies et al.,Growth Factors 18:251-259 (2001) ou em ensaios de receptor ActRIlB comoilustrado abaixo.

O termo "anticorpo", como aqui usado, é qualquer polipeptídeocompreendendo um sítio de ligação de antígeno, tal como uma imunoglobu-lina ou um seu fragmento, e abrange qualquer polipeptídeo compreendendoum sítio de ligação de antígeno independente da fonte, espécies de origem,processo de produção, e características. Como exemplos não-limitantes, otermo "anticorpo" inclui anticorpos sintéticos, humanos, orangotango, maca-co, primata, camundongo, rato, cabra, cão, ovelha, e galinha. O termo incluimas não é limitado a anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos,poliespecíficos, não-específicos, humanizados, de cadeia simples, quiméri-cos, sintéticos, recombinantes, híbridos mutantes, e enxertados com CDR.Para os propósitos da presente invenção, "anticorpo" também inclui frag-mentos de anticorpos, a menos que de outro modo estabelecido (tal comoquando precedido pela palavra "intacto"). Fragmentos de anticorpos exem-plares incluem Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, e outros fragmentos de anti-corpos que retêm função de ligação de antígeno. Tipicamente, tais fragmen-tos compreendem um domínio de ligação de antígeno. Como será reconhe-cido por aqueles versados na técnica, qualquer uma de tais moléculas, porexemplo, um anticorpo "humano", pode ser engenheirada (por exemplo, "delinha germe") para diminuir sua imunogenicidade, aumentar sua afinidade,alterar sua especificidade, ou para outros propósitos.

Anticorpos podem ser fabricados, por exemplo, por meios tradi-cionais técnicos de hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495-499 (1975)),processos de ADN recombinante (patente US 4.816.567), ou técnicas demostra de fago usando bibliotecas de anticorpos (Clackson et al., Nature352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). Paravárias outras técnicas de produção de anticorpos, vide Antibody Engineering(Borrebaeck ed., Oxford University Press 1995) and Antibodies: A LaboratoryManual (Harlow et aí., eds., Cold spring Harbor Laboratory, 1988).

O termo "domínio de ligação de antígeno" refere-se à parte deuma molécula de anticorpo que compreende a área especificamente ligandoa ou complementar a uma parte ou o todo de um antígeno. Onde um antíge-no é grande, um anticorpo pode se ligar somente a uma particular parte doantígeno. O "epitopo" ou "determinante antigênico" é uma porção de umamolécula de antígeno que está envolvida em específicas interações com odomínio de ligação de antígeno de um anticorpo. Um domínio de ligação deantígeno pode ser provido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo(por exemplo, um fragmento de anticorpo Fd consistindo em um domínioVh). Em certas modalidades, um domínio de ligação de antígeno compreen-de uma região variável de cadeia leve (Vl) de anticorpo e um região variávelde cadeia pesada (VH) de anticorpo (patente US 5.565.332).

Os termos "ligação específica", "liga especificamente", ou simila-res, significam que duas ou mais moléculas formam um complexo que émensurável sob condições de ensaio ou fisiológicas e é seletivo. Um anti-corpo ou outro inibidor é dito "ligar-se especificamente" a uma proteína se,sob condições selecionadas apropriadamente, tal ligação não é substanci-almente inibida, enquanto ao mesmo tempo ligação não-específica é inibida.Ligação específica pode ser caracterizada por uma afinidade relativamentealta e é seletiva para o composto ou proteína. Ligação não-específica usu-almente tem uma baixa afinidade. Tipicamente, a ligação é considerada es-pecífica quando a constante de afinidade Ka é pelo menos cerca de 106 M"1,ou preferivelmente pelo menos cerca de 107, 108, 109, ou 1010 M"1. Certosprocessos requerem alta afinidade para ligação específicas, enquanto outrosprocessos, como um ensaio de ressonância plasmon de superfície, podemdetectar complexos menos estáveis e interações de baixa afinidade. Se ne-cessário, ligação não-específica pode ser reduzida sem afetar substancial-mente ligação específica através de variação de condições de ligação. Taiscondições são conhecidas na técnica, e aqueles versados usando técnicasrotineiras podem selecionar apropriadas condições. As condições são usu-almente definidas em termos de concentração dos parceiros de ligação, re-sistência iônica da solução, temperatura, tempo permitido para ligação, con-centração de moléculas não-relacionadas (por exemplo, detergentes, tenso-ativos, albumina de soro, caseína de leite), etc. Condições de ligação exem-plares são mostradas abaixo.

O termo "isolado" refere-se a uma molécula que é substancial-mente livre de seu ambiente natural. Por exemplo, uma proteína isolada ésubstancialmente livre de material celular ou outras proteínas da fonte detecido ou células da qual ela é derivada. O termo refere-se a preparações,onde a proteína isolada é suficientemente pura para ser administrada comouma composição terapêutica, ou pelo menos 70% a 80% (peso / peso) pura,mais preferivelmente, pelo menos 80%-90% (peso / peso) pura, mesmo maispreferivelmente, 90-95% pura; e, mais preferivelmente, pelo menos 95%,96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% (peso / peso) pura.

O termo "individual" refere-se a qualquer animal vertebrado, in-cluindo um mamífero, pássaro, réptil, anfíbio, ou peixe. O termo mamíferoinclui qualquer animal classificado como tal, macho ou fêmea, incluindo se-res humanos, primatas não-humanos, macacos, cães, cavalos, gatos, ove-lha, porcos, cabras, gado, etc. Exemplos de animais não-mamíferos incluemgalinha, peru, pato, ganso, peixe, salmão, peixe gato, bass, rã, e truta. Umindivíduo pode ser escolhido de seres humanos, atletas, ou animais domés-ticos, de corrida, de esportes, de zoológico, gado, domesticados, por exem-plo.

O termo "dose eficaz", ou "quantidade eficaz", refere-se a umadosagem ou nível que é suficiente para melhorar sintomas clínicos de, ouobter um desejado resultado biológico (por exemplo, aumento de massamuscular, resistência muscular, e/ou densidade óssea) em indivíduos, inclu-indo indivíduos tendo um distúrbio associado com GDF-8. Tal quantidadedeve ser suficiente para reduzir a atividade de GDF-8 associada com regula-ção negativa de massa muscular de esqueleto e densidade óssea, por e-xemplo. Resultados terapêuticos e sintomas clínicos podem incluir reduçãoem gordura de corpo, aumento em massa muscular, aperfeiçoados indicado-res cardiovasculares, ou aperfeiçoada regulação de metabolismo de glicose.Um inibidor de GDF-8 pode aumentar massa muscular, aumentar resistênciamuscular, aumentar peso de corpo, modular os níveis de enzimas específi-cas de músculo (por exemplo, creatina cinase), e/ou estimular proliferaçãode mioblasto, por exemplo. Em uma modalidadepreferida, um inibidor deGDF-8 reduz manifestações clínicas de um distúrbio associado com GDF-8.Um agente de modulação de GDF-8 pode afetar diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos, diminuir acumulação de gordura ou teor de gordu-ra de corpo, diminuir níveis de triglicerídeo no soro, diminuir níveis de coles-terol no soro, modular metabolismo de glicose, modular densidade óssea,alterar a razão de músculo para gordura em um indivíduo, e/ou reduzir hi-perglicemia, por exemplo. Um inibidor de GDF-8 também pode ser adminis-trado a um indivíduo de modo a aumentar massa muscular, para aperfeiçoarperformance atlética, ou para aumentar ou acelerar crescimento, incluindocrescimento de músculo. A quantidade eficaz pode ser determinada comodescrito nas seções subseqüentes. Uma "quantidade terapeuticamente efi-caz" de um inibidor de GDF-8 refere-se a uma quantidade que é eficaz, comadministração de dose simples ou múltipla a um indivíduo (tal como um serhumano) em tratamento, prevenção, cura, retardo, redução de seriedade de,ou melhora de pelo menos um sintoma de um distúrbio ou distúrbio recorren-te, ou prolongamento de sobrevivência do sujeito além daquela esperada naausência de tal tratamento.

Um "distúrbio associado com GDF-8" é um distúrbio ou condiçãoonde um sujeito pode se beneficiar da administração de um modulador deGDF-8, tal como um inibidor de GDF-8. Distúrbios associados com GDF-8incluem distúrbios médicos tais como um distúrbio relacionado com músculo,distúrbio neuromuscular, distúrbio de tecido adiposo, distúrbio metabólico, oudistúrbio relacionado com osso.

Administração de um inibidor de GDF-8 pode ser "terapêutica"quando o inibidor é administrado a um indivíduo para tratar um distúrbio, queinclui melhora e/ou prevenção de sintomas do distúrbio. Usos terapêuticosincluem a administração de um inibidor de GDF-8 a um indivíduo tendo umdistúrbio médico ou que por último pode adquirir o distúrbio, de modo a pre-venir, curar, retardar, reduzir a seriedade, ou melhoras um ou mais sintomasde um distúrbio ou distúrbio recorrente, ou de modo a prolongar a sobrevi-vência de um sujeito além daquela esperada na ausência de tal tratamento.Um inibidor de GDF-8 também pode ser administrado a um indivíduo de mo-do a aumentar a massa muscular, para aperfeiçoar performance atlética, oupara aumentar ou acelerar crescimento, incluindo crescimento de músculo.Na ausência ou risco de um distúrbio médico associado com GDF-8, taisprocessos de aperfeiçoamento de performance para administração de uminibidor de GDF-8 a um indivíduo são genericamente julgados "não-terapêuticos", como aqui definidos.

Uma "amostra biológica" é material biológico coletado de umindivíduo, tal como células, tecidos, órgãos, fluidos, e outras espécies clíni-cas e amostras. Amostras biológicas exemplares incluem soro, sangue, eplasma.

O termo "vaso de reação" refere-se a um recipiente no qual umaassociação entre um agente de modulação de GDF-8 e um anticorpo podeocorrer e ser detectada. Uma "superfície" é a parte exterior de qualquer sóli-do (tal como, por exemplo, vidro, celulose, poliacrilamida, nylon, poliestireno,cloreto de polivinila, sulfato de dextrano, ou polipropileno tratado) à qual umagente de modulação de GDF-8 pode ser direta ou indiretamente "contata-do", ou "revestido". Uma "superfície de um vaso de reação" pode ser umaparte do próprio vaso, ou a superfície pode estar no vaso de reação. Umasuperfície tal como poliestireno, por exemplo, pode ser submetida a trata-mento químico ou de radiação para mudar as propriedades de ligação desua superfície. Superfícies de baixa ligação, ligação média, alta ligação, a-minadas e ativadas são abrangidas pelo termo. Um agente de modulação deGDF-8 pode ser diretamente contatado com ma superfície, por exemplo, a-través de adsorção física ou ligação covalente à superfície, ou ele pode sercontatado indiretamente, por exemplo, através de uma interação com umasubstância ou metade que é diretamente contatada com a superfície.

O termo "agente de captura" como aqui usado, refere-se a umamolécula, tal como uma proteína, por exemplo, que é usada em um ensaioimuno para ligar-se especificamente a uma proteína alvo, tal como um agen-te de modulação de GDF-8 ou a própria GDF-8. Um agente de captura apro-priado para os presentes processos liga-se especificamente ao agente demodulação de GDF-8 e/ou a proteína GDF-8. Por exemplo, um agente decaptura pode ser uma proteína GDF-8, incluindo um dímero GDF-8 maduro,ou uma proteína que liga-se especificamente a uma proteína GDF-8. Simi-larmente, um agente de captura pode ser um agente de modulação de GDF-8 ou uma proteína que se liga especificamente a um agente de modulaçãode GDF-8.

Um "agente de detecção" é uma proteína ou molécula pequenaque permite detecção de um agente de modulação de GDF-8 ou um com-plexo. Em uma modalidadepreferida, o agente de detecção se liga especifi-camente a um agente de modulação de GDF-8. Um agente de detecção op-cionalmente pode compreender um rotulador detectável. Um agente de de-tecção também pode ser ele próprio detectado por uma substância compre-endendo um rotulador detectável. Agentes de modulação de GDF-8 detecta-dos pelos processos aqui providos também podem ser usados nos proces-sos para detecção de outros agentes de modulação de GDF-8, por exemplo.O termo "rotulador" refere-se a uma molécula que, através desua natureza química, prove um sinal analiticamente identificável que permi-te a detecção de uma interação molecular. Uma proteína, incluindo um anti-corpo, tem um rotulador detectável se ela está covalente ou não-covalentemente ligada a uma molécula que pode ser detectada diretamente(por exemplo, por meio de um cromóforo, fluoróforo ou rádioisótopo) ou indi-retamente (por exemplo, por meio de catalise de uma reação produzindo umproduto colorido, luminescente ou fluorescente).

Processos para detectar um agente de modulação de GDF-8 emuma amostra biológica, onde o agente de modulação de GDF-8 é capaz demodular uma ou mais atividades de GDF-8 são aqui descritos. Especifica-mente, processos para detectar inibidores de GDF-8 em amostras biológicassão providos. São providos processos que abrangem a detecção de um a-gente de modulação de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica de umindivíduo tendo ou em risco de desenvolver um distúrbio associado comGDF-8, ou em uma amostra biológica de um indivíduo saudável que abusoupotencialmente da mesma.

As técnicas aqui providas também são capazes de detectaremou quantificarem certos agentes de modulação de GDF-8 endógenos, talcomo para o diagnóstico de uma doença associada com GDF-8.

Estes processos são especialmente apropriados para detecçãode baixos níveis de um agente de modulação de GDF-8 em uma amostrabiológica complexa, tal como soro, sangue, ou plasma. Os processos podemser usados para detecção de vários agentes de modulação de GDF-8, e po-dem ser usados em indivíduos não-sintomáticos, sintomáticos ou saudáveis,por exemplo.

Agentes de Modulação de GDF-8 Exógenos

Um agente de modulação de GDF-8, como aqui provido, é capazde modular atividade, expressão, processamento, ou secreção de GDF-8, ouum seu derivado farmaceuticamente aceitável. Um agente de modulação deGDF-8 pode aumentar ou diminuir uma ou mais atividades de GDF-8. Agen-tes que diminuem uma ou mais atividades de GDF-8 são inibidores de GDF-8. Embora inibidores de GDF-8 sejam administrados para aumento de mas-sa muscular e para tratar um distúrbio ou condição relacionada com múscu-lo, um modulador de GDF-8, incluindo um inibidor de GDF-8, pode ser usadopara tratar distúrbios de adipócitos, distúrbios relacionados com metabolismode glicose, ou distúrbios ósseos, por exemplo. Dímero GDF-8 maduro ocor-rendo naturalmente é expressamente excluído da definição de um agente demodulação de GDF-8, como aqui descrito. Variantes e formas modificadasde GDF-8 que são alteradas a partir de GDF-8 nativa e que modulam umaatividade de GDF-8, entretanto, são incluídas dentro do significado do termoagente de modulação de GDF-8. Este pedido de patente não pretende a-branger a detecção de miostatina (GDF-8).

Derivados biológicos de um agente de modulação de GDF-8 sãoabrangidos pelo termo, tal como formas modificadas do agente que estãopresentes em uma amostra biológica após administração do agente a umindivíduo. Em certas modalidades, os processos para detecção de um agen-te de modulação de GDF-8 compreendem processos que detectam a pre-sença de um agente de modulação de GDF-8 em uma amostra biológicaatravés de avaliação de presença de um ou mais derivados biológicos, me-tabólitos, ou produto metabólitos do agente de modulação de GDF-8.

Um agente de modulação de GDF-8 é "exógeno" se ele é intro-duzido a partir ou produzido fora do organismo a partir do qual a amostrabiológica ou material biológico é obtido. Um agente de modulação de GDF-8exógeno pode ser diretamente introduzido em um indivíduo, tal como atravésde administração do agente para o indivíduo, ou um agente de modulaçãode GDF-8 exógeno pode ser indiretamente introduzido para o organismo.Um agente de modulação de GDF-8 exógeno é indiretamente introduzidopara um organismo, por exemplo, se ele é administrado em uma forma pre-cursora, ou se ele é uma proteína que é sintetizada dentro do organismo apartir de um ADN ou ARN que foi introduzido para o animal ou seu ancestral.

Agentes de modulação de GDF-8 exógenos podem ser diferen-ciados de agentes de modulação de GDF-8 endógenos através de proces-sos explorando propriedades do agente GDF-8 que não estão presentes emfatores endógenos de acordo com processos que são aqui descritos e co-nhecidos na técnica. Por exemplo, um agente de modulação de GDF-8 podeser identificado por sua estrutura, afinidade ou atividade. Por exemplo, MYO-029, MYO-028, MYO-022, JÁ-16 e outros anticorpos monoclonais que seligam especificamente a uma proteína GDF-8, compreendem particularesseqüências de aminoácidos e reconhecem um ou mais epitopos distintos deGDF-8. Estes agentes podem ser identificados pela adição de um epitopopeptídeo rotulado, por exemplo, um peptídeo biotinilado, que é especifica-mente ligado pelo agente de modulação de GDF-8. Por exemplo, epitopospeptídeo para MYO-029 são mostrados na patente US Ne 2004/0142382 A1,e podem ser usados para identificar agente MYO-029 exógeno detectadopor um processo aqui provido. Similarmente, epitopos peptídeos de JÁ-16são mostrado na patente US N9 2003/0138422 A1. Anticorpos anti-idiotipostambém podem ser usados para diferenciar um agente anticorpo exógeno,por exemplo. Também, anticorpos específicos para um agente de modula-ção de GDF-8 exógeno podem ser fabricados através de técnicas bem-conhecidas de mostra de fago ou imunização. Anticorpos específicos MYO-029 são aqui providos, assim como são processos de fabricação dos mes-mos, por exemplo, no Exemplo 5.

Ainda, um agente administrado exogenamente pode ser distin-guido de seu agente contraparte ocorrendo naturalmente usando análise defluorescência (vide, patente US Ne 6.680.207, por exemplo). Em adição, a-gente de modulação de GDF-8 exógeno pode ser distinguido de fatores en-dógenos através dos processos de patente US Ne 6.573.055, por exemplo,que reconhece diferenças em padrões de glicosilação baseado no tipo decélula fonte. Um produto biológico produzido recombinantemente tal comoum anticorpo terapêutico (incluindo MYO-029, MYO-028, MYO-022, ou JÁ-16) ou outra proteína glicosilada compreenderá cadeias laterais de carboi-drato, estruturas de cadeia açúcar, ou glicopeptídeos que dependem da li-nha de célula ou condições de cultura nas quais a proteína é produzida. An-ticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, peptídeo, nucleotídeo, ou ou-tras substâncias que permitem detecção de uma característica distinta deum agente de modulação de GDF-8 exógeno também podem ser usadospara identificar um agente exógeno.

Os agentes de modulação de GDF-8 são detectados através deprocessos da invenção após administração de agente, incluindo administra-ção de uma dosagem eficaz do agente. O agente pode ser administrado emuma dosagem de cerca de 50 ng/kg a cerca de 20 mg/kg, incluindo de cercade 2,5 mg/kg, dependendo da severidade dos sintomas e a progressão dadoença, e pode ser tão alta como 200 mg/kg. Um médico selecionará umadosagem que é suficiente para reduzir a atividade de proteínas GDF-8 paraobter um desejado resultado biológico, tal como aumento de massa muscu-lar de esqueleto, aumento de resistência.ou redução de um ou mais sinto-mas da doença associada com GDF-8. Genericamente, uma quantidade te-rapeuticamente eficaz pode variar com a idade do sujeito, peso, condiçãofísica, e sexo, assim como a severidade da condição médica no sujeito. Adosagem pode ser determinada por um médico e também pode ser determi-nada através de análises de eficácia terapêutica e toxidez usando procedi-mentos farmacêuticos padrões em culturas de células ou animais experi-mentais (por exemplo, LD50, ED50, índice terapêutico) e ajustada, quandonecessário, para adequar efeitos observados do tratamento. A dose eficazapropriada é selecionada por um médico tratando a partir das seguintes fai-xas exemplares: cerca de 50 ng/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kga cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 |ig/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1p.g/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1 (ig/kg a cerca de 1 mg/kg, cerca de10 M-g/kg a cerca de 1 mg/kg, cerca de 10 |ig/kg a cerca de 100 |ig/kg, cercade 100 jig/kg a cerca de 1 mg/kg, e cerca de 500 ng/kg a cerca de 5 mg/kg,cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, e cerca de 5 mg/kg a cerca de 200mg/kg. Uma dose simples pode ser introduzida, ou dosagem pode ser contí-nua, periódica ou intermitente. Doses podem ser providas, por exemplo, emintervalos diários, semi-semanais, semanais, bissemanais, mensais, ou bi-mensais. O agente de modulação de GDF-8 a ser detectado é administradoatravés de meios tópicos, orais, intravenosos, intraperitoneais, intramuscula-res, intracavidade, subcutâneos ou transdérmicos, por exemplo.Devido vários agentes de modulação de GDF-8 tais como inibi-dores de GDF-8 podem ser usados nos processos da invenção para detec-ção de um agente de modulação de GDF-8, inibidores de GDF-8 conhecidossão descritos ainda em detalhes após descrição dos processos reivindica-dos. Ainda, como pode ser apreciado por aqueles versados na técnica, a-gentes de detecção usados para detecção de agente de modulação de GDF-8 variam com a estrutura daquele agente. Assim, adicionais meios para de-tecção de conhecidos agentes de modulação de GDF-8, incluindo inibidoresde GDF-8, são providos com, e são aparentes a partir da, descrição detalha-da da mesma.

A presente invenção é direcionada a processos para detecçãode presença de um agente de modulação de GDF-8, e, mais especificamen-te, a processos para quantificar níveis de agentes de modulação de GDF-8,incluindo inibidores de GDF-8, em uma amostra biológica de um indivíduo.Os processos são especialmente apropriados para uso para avaliação decurso de terapia com um agente de modulação de GDF-8, avaliação de fár-maco-cinéticas ou biodisponibilidade do agente, medição de níveis de umagente em uma amostra biológica de um indivíduo, e/ou para detecção deadministração de um agente que modula atividade de GDF-8 a um indivíduo.Em uma realização, os processos detectam a presença em uma amostrabiológica de MYO-029, um anticorpo monoclonal neutralizante que se ligaespecificamente a GDF-8.Identificação de Candidatos

Um indivíduo recebendo tratamento para um distúrbio associadocom GDF-8 com um agente de modulação de GDF-8 é um candidato paraos processos aqui providos para detecção de agente de modulação de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica do indivíduo. Ainda, um indivíduo comum distúrbio associado a GDF-8, ou um indivíduo em risco de desenvolvi-mento de um distúrbio associado com GDF-8 ou um distúrbio relacionadocom músculo, pode ser um candidato para os processos aqui providos.

Em certas modalidades, um indivíduo que é identificado comorecebendo agente de modulação de GDF-8, por exemplo, em uma quantida-de eficaz, será um candidato para os presentes processos. Um indivíduosofrendo terapia com um agente de modulação de GDF-8 pode ter níveis doagente de modulação de GDF-8 que mudam durante o curso de terapia, peloque impactando a eficácia do tratamento. Ainda, antes de tratamento de umdistúrbio associado com GDF-8 com um agente de modulação de GDF-8,apropriados candidatos para administração de um agente de modulação deGDF-8 podem ser identificados com os processos aqui providos, quandopode ser desejável detectar e controlar variações individuais em depuraçãode fármaco ou biodisponibilidade associada com a administração de um a-gente de modulação de GDF-8.

Um indivíduo tendo, ou em risco de desenvolvimento, de um dis-túrbio relacionado com músculo, é um candidato para os processos aquiprovidos. Inibição de atividade de GDF-8 aumenta tecido muscular em indi-víduos, incluindo aqueles sofrendo de distúrbios relacionados com músculos.Um número de distúrbios são associados com tecido muscular de funcionali-dade prejudicada, por exemplo, distrofias musculares, esclerose lateral a-miotrófica (ALS), atrofia de músculo, atrofia de órgão, fragilidade, doençapulmonar obstrutiva congestiva, insuficiência cardíaca, sarcopenia, caquexia,e síndromes de debilitantes de músculos causadas por outras doenças econdições.

Distúrbios relacionados a músculo incluem, por exemplo, distro-fias musculares, esclerose lateral amiotrófica (ALS), sarcopenia, caquexia,declínio de músculo, atrofia muscular, ou degeneração muscular, incluindodeclínio, atrofia, ou fragilidade. Distrofias musculares incluem, por exemplo,pseudo-hipertrófica, facioescápulo humeral, e distrofias musculares demembro - cintura. Distrofias musculares exemplares incluem distrofia mus-cular de Duchenne (Leyden-Mõbius), distrofia muscular de Becker, distrofiamuscular de Emery Dreifuss, distrofia muscular de membro - cintura, sín-drome de espinha rígida, síndrome de Ullrich, distrofia muscular de Fukuya-ma, síndrome de Walker Warburg, doença de músculo olho cérebro, distrofiamuscular facioescápulo humeral (Landouzy-Dejerine), distrofia muscularcongênita, distrofia miotônica (doença de Steinert), miotonia congênita, edoença de Gowers. Degeneração de músculo associada com ou secundáriapara uma outra doença ou condição tal como doença cardiovascular, atrofiade órgão, insuficiência de órgão, câncer, síndrome de deficiência imunoad-quirida (AIDS), descanso no leito, imobilização, prolongada falta de uso, ououtra doença ou condição é também incluído no termo.

Indivíduos com perda de músculo ou declínio de músculo asso-ciado com distúrbios cardiovasculares também são candidatos para os pro-cessos aqui providos. Exemplos de distúrbios cardiovasculares incluem do-ença de artéria coronária (aterosclerose), angina (incluindo angina aguda eangina instável), ataque cardíaco, acidente vascular cerebral (incluindo aci-dente vascular cerebral isquêmico), doenças cardiovasculares associadascom hipertensão, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva,doença de artéria coronária, hipertensão, hiperlipidemia, doença arterial peri-férica, e doença vascular periférica. Exemplos de distúrbios de metabolismode insulina incluem condições associadas com homeostase aberrante deglicose, diabetes tipo 2, pré-diabetes, tolerância a glicose prejudicada, disli-pidemia, síndrome metabólica (por exemplo, síndrome X), e resistência ainsulina induzida por trauma como queimaduras ou desequilíbrio de nitrogê-nio.

Um indivíduo tendo, ou em risco de desenvolvimento de tecidoadiposo, distúrbio ou condição metabólica, ou relacionada a osso também éum candidato para um processo como reivindicado. Tais distúrbios ou condi-ções incluem aquelas associadas com homeostase de glicose tal como, porexemplo, desenvolvimento de diabetes tipo 2, tolerância a glicose prejudica-da, síndromes metabólicas (por exemplo, síndrome X), resistência a insulinainduzida por trauma, tais como queimaduras ou desequilíbrio de nitrogênio, edistúrbios de tecido adiposo (por exemplo, obesidade) (Kim et al., Biochem.Biophys. Res. Comm. 281:902-906 (2001)). Por exemplo, GDF-8 moduladiferenciação de pré-adipócito a adipócito (Id.) e inibe formação de adipóci-tos a partir de células precursoras mesenquimais e pré-adipócitos (Rebba-pragada et al., Mol. Cell Bio. 23:7230-7242 (2003)). Acumulação de gorduraé reduzida em ambos, camundongos nocaute GDF-8 e em camundongosadultos tipo selvagem nos quais proteína GDF-8 foi sistematicamente admi-nistrada (McPherron et al., J. Clinicai Invest. 109:595-601 (2002); Zimmers etal., Science 296:1486-1488 (2002)). Distúrbios ou condições associadascom perda de osso incluem osteoporose e osteoartrite, especialmente nasmulheres mais velhas e/ou pós-menopausa, osteoporose induzida por glu-cocorticóide, osteopenia, osteoartrite, e fraturas relacionadas com osteopo-rose. Em adição, doenças de osso metabólicas e distúrbios caracterizadospor baixa massa de osso são incluídas, tais como aquelas devidas a terapiaglucocorticóide crônica, insuficiência prematura de gônada, supressão deandrogênio, deficiência de vitamina D, hiper paratiroidismo secundário, defi-ciências nutricionais, e anorexia nervosa.

Ainda, um indivíduo exibindo um aumento em massa de múscu-lo, tal como um aumento em tamanho de célula de músculo (hipertrofia) ounúmero de células de músculo (hiperplasia) pode ser um candidato para umprocesso para detecção de agente de modulação de GDF-8 exógeno. Oaumento pode ser em fibras de músculo tipo 1 e/ou tipo 2 de um mamíferoou outro animal. Processos para medir um aumento em massa de músculosão bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, músculo pode ser medidoantes e após administração de um agente de modulação de GDF-8 usandotécnicas padrões como pesagem sob água. Um aumento em tamanho demúsculo pode ser evidenciado por ganho de peso de pelo menos cerca de5%, 10%, 20%, ou mais. Outras tecnologias não-invasivas podem ser usa-das, incluindo formação de imagem de ressonância magnética (MRI) ou tec-nologia de absortimetria (absorptiometry) de raio-x de energia dual, por e-xemplo. Atletas, incluindo atletas profissionais, são candidatos para os pro-cessos.

Um indivíduo que tomou ou é suspeito de tomar um agente demodulação de GDF-8 al como, por exemplo, MYO-029, por razões de aper-feiçoamento de performance é um candidato para estes processos. Em ou-tras modalidades, um indivíduo tal como uma vaca ou outro animal de cria-ção é um candidato para um processo aqui provido, quando pode ser dese-jável detectar a administração de um agente de modulação de GDF-8 exó-geno em uma amostra biológica de um tal animal. Por exemplo, um agenteexógeno pode ser administrado para aumentar crescimento ou massa detecido de músculo (ou para reduzir o teor de gordura de carne) em animaisde criação.

Em uma primeira modalidade, um processo para detectar umagente de modulação de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica é provi-do, o processo compreendendo: adição de uma amostra biológica teste deum indivíduo a um ensaio in vitro para uma atividade de GDF-8, detecção demodulação da atividade de GDF-8, e comparando a modulação da atividadede GDF-8 na presença da amostra biológica teste à modulação da atividadede GDF-8 na presença de uma amostra biológica controle, pelo que detec-tando a presença do agente de modulação de GDF-8 exógeno na amostrabiológica. Em certas modalidades, os processos ainda compreendem quanti-ficação de nível do agente de modulação de GDF-8 na amostra biológicaatravés de comparação de modulação de atividade de GDF-8 através deamostra biológica teste para uma pluralidade de amostras controles, cadauma compreendendo uma conhecida concentração do agente de modulaçãode GDF-8.

Em certas modalidades, o ensaio in vitro mede uma ou mais ati-vidades morfogenéticas ou fisiologicamente reguladoras de crescimento as-sociadas com proteína GDF-8 ativa. Ensaios in vitro para detectar modula-ção de uma atividade de GDF-8 são bem-conhecidos na técnica, e podemser escolhidos de um ensaio baseado em célula ou ensaio livre de célula (talcomo, por exemplo, um ensaio para medir modulação de transcrição, repli-cação ou impedir ciclo de célula) ou um ensaio de ligação (tal como, por e-xemplo, um ensaio imuno, um ensaio de ressonância plasmon de superfície,imunoprecipitação, ou um ensaio radioimune). Por exemplo, GDF-8 ativa éum regulador negativo de massa de músculo de esqueleto, ela modula aprodução de enzimas específicas de músculo (por exemplo, creatina cinase),estimula proliferação de mioblasto e modula diferenciação de pré-adipócitopara adipócito. Em alguns processos, seleção de agentes de modulação deGDF-8 a partir de agentes de modulação de BMP-11 é realizada. Ensaiosbaseados em células e isentos de células para uma atividade de GDF-8 sãoconhecidos na técnica e são descritos infra.

Uma amostra biológica, tal como uma amostra biológica teste,compreende material biológico de pelo menos um indivíduo. Em modalida-des preferidas, o indivíduo está sofrendo terapia com um agente de modula-ção de GDF-8. Em outras modalidades preferidas, o indivíduo é um candida-to para administração de um agente de modulação de GDF-8. Ainda em mo-dalidades, o indivíduo é um mamífero, pássaro, réptil ou peixe. Em modali-dades particulares, a amostra biológica é escolhida a partir de soro, sangue,plasma, amostra de biópsia, amostra de tecido, suspensão de células, sali-va, fluido oral, fluido cérebroespinhal, fluido amniótico, leite, colostro, secre-ção de glândula mamaria, linfa, urina, suor, fluido lacrimal, fluido gástrico,fluido sinovial, e muco. Em modalidades preferidas, a amostra biológica éum fluido. Em algumas modalidades preferidas, a amostra biológica é esco-lhida de sangue, soro e plasma. Êm específicas modalidades, a amostra bio-lógica é soro, tal como soro humano, primata, macaco, rato ou camundongo.

Em outras modalidades, a amostra biológica é isolada de umindivíduo ou indivíduos e opcionalmente tratada antes de testes. Por exem-plo, a amostra biológica também pode ser usada como coletada ou apósdiluição com um diluente apropriado. Diluições são otimizadas para reduzire/ou eliminar interferência de matriz com o ensaio. O diluente não é particu-larmente restrito mas pode compreender soro, incluindo, por exemplo, sorohumano, água deionizada ou vários tampões tendo uma ação tampão dentroda faixa de cerca de pH 5 a cerca de pH 9, preferivelmente cerca de pH 6,5a cerca de pH 8,5 (por exemplo, tampão citrato, tampão fosfato, tampão Tris,tampão acetato, ou tampão borato). Em algumas modalidades preferidas, odiluente compreende soro humano normal. O diluente pode compreenderuma concentração constante de uma amostra biológica controle, por exem-plo, para reduzir variabilidade devido a efeitos de matriz com crescente dilui-ção da amostra biológica teste.

O tampão de diluição opcionalmente pode compreender umaquantidade constante de uma amostra biológica controle, escolhida para cor-responder à amostra biológica teste, por exemplo, para controlar os efeitosde fundo ou interferência da matriz de amostra. Em uma realização, umaamostra teste de soro humano é diluída em tampão THST (300 fiUcavidade)(Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, contendo glicina 1,0 mM, NaCI 0,5 M, e Tween 200,05% v/v (J.T.Baker)) 1:8 vezes, e diluições da amostra teste além de 8 ve-zes são preparadas em THST plus soro humano 12,5%. Também, uma a-mostra pode ser diluída aproximadamente 2, 4, 8, 16, 32, 64, ou 128 vezesou mais. Em outras modalidades, uma amostra teste é diluída serialmente1:1,5 ou 1:1,6 para obter uma faixa de pontos de dados que permita verifica-ção de linearidade de diluição e efeitos de matriz. Para preferidas matrizesde amostra biológica, uma diluição pode ser selecionada na qual condiçõesrelacionadas a interferência de matriz e sensitividade de ensaio são otimiza-das.

Em algumas modalidades, a amostra pode ser opcionalmentefracionada ou concentrada usando processos bem-conhecidos e então adi-cionada a um processo aqui provido para detectar um agente de modulaçãode GDF-8. Fracionamento ou concentração pode ser usado, por exemplo, seinterferência de matriz limita detecção de um agente de modulação de GDF-8 no ensaio. Técnicas de fracionamento e concentração, incluem, mas nãosão limitadas a, centrifugação, precipitação com sulfato de amônio, precipi-tação com polietileno glicol, precipitação com ácido tricloro acético (TCA),técnicas de afinidade (tal como imuno precipitação com uma resina conjuga-da a um específico parceiro de ligação tal como um anticorpo, isto é, um an-ticorpo Fc anti-humano, proteína A ou proteína G, por exemplo), técnicascromatográficas, e outras técnicas de separação. Em modalidades preferi-das, a amostra biológica não é fracionada ou concentrada antes de detecçãode um agente de modulação de GDF-8.

Uma amostra biológica pode ser coletada de um indivíduo sim-ples, ou uma amostra pode ser tomada antes, durante ou após administra-ção de um agente de modulação de GDF-8. Por exemplo uma amostra podeser obtida de um indivíduo 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, ou mais diasapós administração de um agente de modulação de GDF-8. Uma amostratambém pode ser obtida 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, ou mais semanas apósadministração de um agente de modulação de GDF-8. A cronometragem decoleta de amostra pode ser otimizada para aumentar detecção de um agentede modulação de GDF-8, ou para detectar biodisponibilidade alterada doagente.

O agente de modulação de GDF-8 detectado pelos processosaqui providos pode ser um anticorpo que se liga especificamente a uma pro-teína GDF-8, e em uma modalidadepreferida, o agente de modulação deGDF-8 é MYO-029. Em certas modalidades, o agente de modulação deGDF-8 a ser detectado é escolhido de: um anticorpo, um anticorpo que seliga especificamente a GDF-8; um anticorpo que se liga especificamente aum parceiro de ligação de GDF-8, um receptor de GDF-8, uma proteína Ac-tRUB, uma proteína contendo domínio folistatina, uma proteína folistatina,uma proteína GASP-1, uma proteína GDF-8, um pró-peptídeo GDF-8, uminibidor não-protéico, e uma molécula pequena (ainda descrita em detalhesacima).

Como pode ser facilmente visível para aqueles versados na téc-nica, o agente de modulação de GDF-8 é detectável com um agente de de-tecção que é selecionado baseado no ensaio in vitro e o agente de modula-ção de GDF-8 a ser detectado (vide abaixo). Onde o ensaio in vitro é umensaio de gene repórter, o agente de detecção é preferivelmente um produtode gene repórter, tal como uma enzima ou proteína compreendendo um ro-tulador tal como um rotulador epitopo. Apropriadas enzimas incluem peroxi-dase (por exemplo, peroxidase de raiz forte), fosfatase alcalina, glicose oxi-dase, beta-galactosidase, e outras proteínas capazes de catalise de umareação para produzir um produto colorido, luminescente, ou fluorescente, porexemplo. Onde o ensaio in vitro é um ensaio de ligação, tal como, por exem-plo, um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), o agente de detec-ção associará diferentemente com uma proteína de captura e uma proteínade captura em complexo com o agente de modulação de GDF-8 detectadopelos processos aqui providos. Um agente de detecção pode ser uma prote-ína, por exemplo, um anticorpo, que se liga especificamente a um agente demodulação de GDF-8 ou a um complexo de agente de modulação de GDF-8: proteína de captura. Alternativamente, um agente de detecção pode seruma proteína que afeta a ligação do agente de modulação de GDF-8 à pro-teína de captura.

Ensaio de Gene Repórter

Em um aspecto, o ensaio in vitro é um ensaio de gene repórter(RGA) (vide, Thies et al., Growth Factors 18:251-259 (2001)). Em certas mo-dalidades, um RGA compreende as etapas de: (a) provimento de uma célulahospedeira compreendendo uma construção de gene repórter em um vasode reação, onde a construção compreende um elemento controle responsivoa GDF-8 e um gene repórter; (b) adição de uma amostra biológica ao vasode reação; e (c) detecção de expressão de gene repórter na célula na pre-sença e ausência da amostra biológica, pelo que detectando um agente demodulação de GDF-8 exógeno. Em certas modalidades, o processo com-preende ainda a etapa de adição de um substrato que muda de cor, lumi-nescência, ou fluorescência na presença do gene repórter.

Uma célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, tal co-mo de um humano, mamífero ou outro animal. Em uma modalidadepreferida,a célula hospedeira é uma linha de células, tal como uma linha de célulaseucarióticas, uma linha de células mamíferas, ou uma linha de células decâncer, incluindo uma linha de células de rabdossarcoma. A construção degene repórter pode ser transiente ou estavelmente introduzida na célulahospedeira através de quaisquer meios conhecidos na técnica, incluindotransfecção, eletroporação, e similares. A construção de gene repórter com-preende um elemento controle responsivo a GDF-8 (tal como seqüênciaspromotoras e/ou aperfeiçoadoras), e um gene repórter em associação opera-tiva com o elemento controle (vide, por exemplo, patente US 2003/0138422,e referências ali descritas).

Por exemplo, para demonstrar a atividade de GDF-8, um ensaiode gene repórter foi desenvolvido usando um vetor repórter pGL3(CAGA)i2expressando luciferase. A quantidade de proteína GDF-8 adicionada ao en-saio pode ser titulada para otimização. Uma quantidade de proteína GDF-8 éselecionada que é suficiente para produzir 40, 50, 60, 70, 80, ou 90% de ati-vação máxima de construção repórter. Proteína GDF-8 pode ser adicionadaem 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, ou 200 ng/mL, porexemplo. Usando uma quantidade constante de proteína GDF-8, o agentede modulação de GDF-8 pode ser titulado para preparar uma titulação con-trole de modulação de atividade de GDF-8. Por exemplo, um agente de mo-dulação de GDF-8 tal como MYO-029 pode ser testado em concentraçõesselecionadas de 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,150, 200, 500, ou 1000 ng/mL, por exemplo. Em modalidades preferidas,uma titulação de agente de modulação de GDF-8 estenderá a faixa linear deinibição no ensaio.

Células são então tratadas com ou sem 10 ng/mL de GDF-8, porexemplo, e com ou sem a amostra biológica teste em meios McCoy 5A comglutamina, estreptomicina, penicilina, e 1 mg/mL de albumina de soro bovinopor 6 horas a 37°C. Em certas modalidades, conhecidos controles de agentede modulação de GDF-8 são corridos em paralelo usando concentrações de10 pM a 50 u.M, aproximadamente. Concentrações exemplares incluem 10pM, 50 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 |iM, 5 u.M, 10u.M e 50 fiM de agente de modulação de GDF-8. Em modalidades preferi-das, a quantidade de agente de modulação de GDF-8 na amostra teste écomparada a uma titulação controle de quantidades conhecidas do agente, epelo que quantificada. Proteína de gene repórter, tal como uma enzima quecataliza a conversão de um substrato a uma molécula colorimétrica, fluores-cente ou luminescente pode ser quantificada nas células tratadas usandotécnicas bem-conhecidas.

Ensaios de Ligação

Em certas modalidades, o ensaio in vitro mede uma atividade deligação de GDF-8. Um ensaio in vitro pode detectar um agente de modula-ção de GDF-8 exógeno que se liga a uma proteína GDF-8 ou um agente quese liga a um parceiro de ligação de GDF-8, tal como uma proteína que seliga especificamente a GDF-8. Por exemplo, GDF-8 madurase liga especifi-camente à região pró-peptídeo de GDF-8, a ActRMB, a um receptor de GDF-8, a folistatina, a proteínas contendo domínio folistatina, a GASP-1, e a ou-tras proteínas. Em uma modalidadeparticular, um agente de modulação deGDF-8 tal como um anticorpo ou sua porção, reduz uma ou mais destas ati-vidades de ligação e este efeito sobre ligação é detectado. Em certas moda-lidades, a específica ligação de um agente de modulação de GDF-8 a umaproteína GDF-8, por exemplo, é detectada. Em alguns casos, uma proteínade captura para um ensaio de ligação in vitro é escolhida de uma proteínaGDF-8 ou uma proteína que se liga especificamente a GDF-8. Em certasmodalidades, a ligação de um agente de modulação de GDF-8 à proteína decaptura é medida em um ELISA. Em algumas modalidades, a ligação da pro-teína de captura a uma segunda proteína (tal como GDF-8) é medida napresença e ausência da amostra biológica teste. A ligação pode ser obser-vada com um agente de detecção. Em certas modalidades preferidas, de-tecção compreende tecnologia de ressonância plasmon de superfície, opcio-nalmente incluindo espectroscopia de fluorescência plasmon de superfície(SPFS), por exemplo, com espectroscopia plasmon de superfície (SPS). De-tecção de intensidade de fluorescência de uma molécula rotulada, por e-xemplo, um agente de detecção rotulado fluorescentemente, em adição àrefletividade SPS, aperfeiçoa a sensitividade em certas modalidades envol-vendo detecção SPS. Procedimentos SPS padrões também são incluídos.Em algumas modalidades, incluindo ensaios em um formato de ensaio deligação direta, um formato ponte (onde o agente de modulação de GDF-8pode se ligar simultaneamente a GDF-8 fase sólida e, por exemplo, GDF-8biotinilada de fase líquida, por exemplo), ou em um formato competitivo.

Em um ensaio de ligação, um agente de detecção reconhecerá ese ligará ao agente de modulação de GDF-8 exógeno, por exemplo, e podeser usado sozinho ou em combinação com outros reagentes para gerar umpraticável sinal dose - resposta que pode ser utilizado para detecção de ini-bidores de GDF-8, por exemplo. Em certas modalidades, o agente de detec-ção usado para detectar um agente de modulação de GDF-8 é específicopara um particular agente de modulação de GDF-8 ou grupo de agentes demodulação de GDF-8. Por exemplo, em uma modalidadepreferida, um anti-corpo que se liga especificamente a uma seqüência de imunoglobulina hu-mana é usado para detectar o agente de modulação de GDF-8 baseado emanticorpo humano, MYO-029.

Em um exemplo específico, vide, por exemplo, Exemplo 1, o re-agente de detecção preferido é um conjugado de IgG anti-humana camun-dongo - peroxidase de raiz forte; entretanto, qualquer reagente capaz dereconhecer e ligar IgG humana genericamente, ou a lgG1 humana com ca-deias leves lambda, ou ao idiotipo ou alótipo de MYO-029 especificamente,pode ser usado como uma base para detecção de MYO-029.

Em outras modalidades, tal como quando o ensaio in vitro medeligação competitiva (por exemplo, um ELISA competitivo), um agente de de-tecção pode ser uma proteína GDF-8 rotulada, incluindo um dimero GDF-8madura biotinilada. Uma proteína GDF-8 rotulada também pode ser o agentede detecção, por exemplo, para detectar um agente de modulação de GDF-8(tal como, por exemplo, o anticorpo MYO-029) que compreende uma oumais metades de ligação de GDF-8.

Em outras modalidades, um agente de detecção um anticorpoque se liga especificamente ao agente de modulação de GDF-8. Em algunsexemplos, um agente de detecção é um anticorpo que se liga especifica-mente a GDF-8 madura, tal com o MYO-029, MYO-028, MYO-022, ou JA-16.Em modalidades onde o agente de modulação de GDF-8 é um anticorpohumano, o agente de detecção pode ser um anticorpo que se liga especifi-camente ao agente de modulação de GDF-8, tal como uma Ig anti-humana,incluindo um anticorpo Fc anti-humano camundongo. Em um ELISA, o com-plexo será detectado com um rotulador enzima.Ensaios Imuno

Em uma realização, a presente invenção compreende um ensaiode ligação onde uma proteína GDF-8, tal como dimero GDF-8 madura ououtro agente de captura, é contatada com uma superfície de um vaso dereação, uma amostra biológica é adicionada, e um agente de detecção éadicionado, pelo que detectando um agente de modulação de GDF-8 exóge-no na amostra biológica.Mais especificamente, a presente invenção compreende um pro-cesso para detecção de um agente de modulação de GDF-8 exógeno emuma amostra biológica tal como soro, que compreende as seguintes etapas:(a) contato de um agente de captura com uma superfície de um vaso de rea-ção, (b) adição de uma amostra biológica ao vaso de reação, (c) adição deum agente de detecção ao vaso de reação, e (d) detecção de um complexode agente de captura / agente de modulação de GDF-8 associado com asuperfície do vaso de reação.

Em etapa (a) a proteína de captura, tal como proteína GDF-8, éimobilizada sobre a superfície sólida de um vaso de reação, por exemplo,sendo covalente ou não-covalentemente ligada à superfície. A superfíciesólida é tipicamente vidro ou um polímero, tal como, por exemplo, celulose,sulfato de dextrano, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloreto de polivinila,ou polipropileno e pode estar na forma de uma pérola, incluindo uma pérolamagnética ou paramagnética. Imobilização dos ligantes sobre a superfíciepode ser obtida através de ligação covalente ou através de interações não-covalentes, como adsorção física. Processos de ligação covalente incluemacoplamento com um agente de reticulação como glutaraldeído, isocianatode hexa metileno, um agente contendo sulfo, um peptídeo, um agente alqui-lante, ou um reagente similar. Em modalidades preferidas, a GDF-8 é umdímero GDF-8 madura. Em outros aspectos preferidos, a proteína GDF-8madura é biotinilada e a superfície do vaso de reação é revestida (por e-xemplo, via adsorção) com avidina ou estreptavidina. Em certas modalida-des, os processos aqui providos compreendem uso de um dímero de GDF-8madura biotinilada que retém pelo menos uma atividade de GDF-8.

Estes processos surgem da descoberta de que GDF-8 madurabiotinilada é um agente de captura mais eficaz que proteína GDF-8 maduraadsorvida a uma superfície de um vaso de reação. Ainda, GDF-8 madura éinesperadamente sensível a biotinilaçao de grupos amina primária, comosobre resíduos lisina. GDF-8 hiperbiotinilada, quando biotinilada com rea-gentes de biotinilaçao específicos de amina, é menos ativa ou inativa com-parada a GDF-8 sem biotina. O número de metades biotina incorporadasnos grupos amina por dímero de GDF-8 madura foi verificado ser crítico parapreparações que retêm atividade de GDF-8. Por exemplo, atividades ligantesde MYO-029 e ActRHB são reduzidas em preparações hiperbiotiniladas. Porisso, preparações de GDF-8 madura biotinilada tendo menos que cinco rnolsde biotina por mol de dímero de GDF-8 são preferidas. Em modalidades al-ternativas, proteínas podem ser biotiniladas sobre sulfidrilas, carboxilas e/oucarboidratos. Compostos biotina fotorreativos que se ligam não-especificamente ou reagem com fotoativação também são disponíveis.

Em certos processos aqui providos, GDF-8 é um reagente debiotinilação específico de amina biotinilado como um complexo latente, esubseqüentemente GDF-8 madura é isolada do complexo. Nestes proces-sos, a quantidade de biotina incorporada no dímero de GDF-8 madura é oti-mizada para reter atividade biológica, por exemplo, para evitar inativação desítio de ligação de receptor. Proteína GDF-8 também pode ser biotiniladasobre superfície de resíduos cisteína (ou superfície de grupos tiol) usandoum reagente de biotinilação específico sulfidrila. Adicionalmente, processospara biotinilar carboidratos envolvendo pré-tratamento oxidante para geraraldeídos reativos e o uso de reagentes hidrazida biotina, por exemplo, sãoconhecidos na técnica e podem ser otimizados para proteínas aqui descritas,incluindo proteína GDF-8 madura, otimamente em forma modificada. Ainda,reagentes de biotinilação reativos com carboxila e reações que permitembiotinilação via resíduos aspartato e glutamato, por exemplo, podem ser u-sados. Como pode ser visível para aqueles versados na técnica, as razõesmolares ótimas de biotina para dímero de GDF-8 irão variar com o procedi-mento de biotinilação e reagente utilizado. Por exemplo, um técnico versadoapreciará como otimizar uma preparação de GDF-8 biotinilada ativa usandoos processos aqui descritos em combinação com conhecidos procedimentosde biotinilação, para produção de uma proteína GDF-8 madura biotiniladaque tem diferentes razões molares ótimas de biotina para dímero de GDF-8,enquanto retendo pelo menos uma atividade GDF-8.

Em algumas modalidades, proteína GDF-8 madura é biotiniladacom reagentes de biotinilação específicos de amina. Por exemplo, prepara-ções GDF-8 podem ser biotiniladas sobre resíduos lisina e/ou términos ami-no. Proteína GDF-8 madura, funcional pode ser biotinilada como parte de umcomplexo de látex, e subseqüentemente GDF-8 madura é isolada do com-plexo, por exemplo, como mostrado no Exemplo 3. Em uma preparação al-ternativa, proteína GDF-8 no complexo latente é produzida e isolada de a-cordo com o ensaio de Exemplo 1 de patente US N- 2004/0142382 A1. Ocomplexo latente é subseqüentemente biotinilado usando técnicas bem-conhecidas e/ou como aqui descritas.

Vários reagentes de biotinilação são capazes de eficiente mar-cação de proteínas, incluindo um complexo latente de GDF-8. Razões mola-res de derivado de biotina para complexo latente de GDF-8 na reação po-dem ser cerca de 10, 15, 20, 40, ou 80 para 1, e composição de reagente etempos de reação de concentração, e temperaturas podem ser variados pa-ra ajuste de quantidade de biotina incorporada na reação. Por exemplo, saise outros agentes podem ser opcionalmente otimizados. Em uma realização,o dímero de GDF-8 madura é biotinilado em associação com a porção depró-peptídeo terminal amino de GDF-8 para evitar inativação de dímero ma-duro durante a reação de biotinilação.

Derivados de biotina são bem-conhecidos e disponíveis na téc-nica. Modificações de biotina incluem braços espaçadores variáveis, modifi-cações para afetarem solubilidade, e/ou grupos reativos, por exemplo, parapermitir clivagem da porção biotina. Succinimidil ésteres de biotina e seusderivados, incluindo sulfo succinimidil ésteres solúveis em água podem serusados para biotinilação de GDF-8 sobre resíduos lisina, por exemplo. Paraquantificar a biotina incorporada, por exmeplo, técnicas de tamanho e analí-ticas bem-conhecidas são usadas, incluindo cromatografia líquida de altapressão de fase reversa, espectroscopia de massa, etc. Adicionalmente, kitscomerciais para quantificação de biotina através de ensaios colorimétricosou fluorimétricos, por exemplo, são disponíveis (vide, por exemplo, EZ® Bio-tin Quantitation Kit, Pierce, utilizando HABA (ácido 2-(4'-hidroxi azo benzeno)benzóico)).

Ainda um procedimento de biotinilação exemplar inclui biotinila-ção de complexo latente de GDF-8 em uma razão de 15 ou 20 rnols de EZ-link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Cat. N9 21217) para 1 mol do complexo deGDF-8 por 2 horas a 2-8°C (vide, por exemplo, Exemplo 3 de patente US N92004/0142382 A1). A reação pode ser terminada por queda do pH usandoTFA 0,5% e então o complexo é submetido a cromatografia sobre uma colu-na C4 Júpiter 250 x 4,6 mm (Phenomenex), separando GDF-8 madura depró-peptídeo GDF-8. Frações de GDF-8 maduras biotiniladas eluídas comum gradiente de TFA/CH3CN são reunidas, concentradas e quantificadas porMicroBCA® protein Assay Reagent Kit (Pierce, Cat. N9 23235), ou usandooutras técnicas de isolamento e concentração bem-conhecidas.

Em uma modalidadepreferida, um ensaio de ligação in vitrocompreende um agente de captura de proteína GDF-8 biotinilada, e a prote-ína GDF-8 contata a superfície do vaso de reação através de interação daporção biotina com avidina sobre a superfície do vaso de reação. Em algu-mas modalidades, a razão molar de porção biotina para proteína GDF-8 ma-dura está entre cerca de 0,5:1 e cerca de 4:1. Em outras modalidades, a ra-zão média de biotina para dímero GDF-8 é menos que cerca de 5 para 1,menos que cerca de 2 para 1, ou menos que cerca de 1 para 1. A razão debiotina para proteína GDF-8 madura foi medida para ser uma mistura de ra-zões molares de 0 a 3 em preparações de GDF-8 ativa, com a maioria dasmoléculas estando em cerca de 1:1. O modo para a razão de biotina paraproteína GDF-8 madura pode ser menos que ou aproximadamente 1,2, 3, 4,ou 5, por exemplo. Em algumas modalidades, a preparação de GDF-8 ma-dura biotinilada inclui menos que cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 rnols de biotina pormol de dímero GDF-8 maduro. A razão média ou mediana de biotina paraproteína GDF-8 madura pode ser menos que ou aproximadamente 0,5, 0,75,1, 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 7, 8, ou 9, por exemplo. Outrosagentes de captura e detecção também podem ser rotulados por biotinila-ção. Por exemplo, MYO-029 biotinilado pode ser biotinilado até uma razãode pelo menos (ou menos que) 10:1, 20:1, ou maior, por exemplo. Opcio-nalmente, um outro agente de captura pode ser usado.

Após contato de agente de captura à superfície do vaso de rea-ção, o vaso de reação é lavado para remoção de agente de captura não-ligado antes de adição da amostra biológica. Em algumas modalidades ovaso de reação é lavado com um tampão com pH entre cerca de 5 e cercade 9, tal como tampão citrato, tampão fosfato, tampão Tris ou tampão aceta-to. Opcionalmente, concentração detergente ou resistência iônica pode seradicionada. Interações não-específicas são minimizadas com uma etapa debloqueio, onde um tampão compreendendo pelo menos um agente de blo-queio, tal como uma proteína que não se liga especificamente ao alvo é adi-cionado ao vaso de reação. Em outras modalidades, detergentes podem seradicionados, tais como detergentes iônicos ou não-iônicos. Tampões de blo-queio podem compreender soro, albumina de soro bovino, leite, caseína,gelatina, e/ou detergentes não-iônicos, por exemplo. Em algumas modalida-des o vaso de reação é lavado com um tampão com um pH entre cerca de 5e cerca de 9, tal como tampão citrato, tampão fosfato, tampão Tris, ou tam-pão acetato.

Em etapa (b) uma amostra biológica é adicionada ao vaso dereação. Em algumas modalidades preferidas da invenção, a amostra biológi-ca é escolhida de sangue, soro e plasma. A amostra biológica pode ser usa-da como coletada ou após diluição com um diluente apropriado. O diluentenão é particularmente restrito mas inclui água deionizada e vários tampõestendo uma ação tamponante dentro da faixa de cerca de pH 5 a cerca de pH9, preferivelmente cerca de pH 6,5 a cerca de pH 8,5 (por exemplo, tampãocitrato, tampão fosfato, tampão Tris, tampão acetato, ou tampão borato).

Uma alíquota da amostra a ser testada é contatada com o agen-te de captura imobilizado e incubada por um período de tempo suficiente(por exemplo, 2-120 minutos) e sob condições apropriadas (por exemplo,23°C) para permitir ligação de um agente de modulação de GDF-8 presentena amostra à proteína imobilizada, tal como dímero de GDF-8 madura bioti-nilada. A reação de proteína GDF-8 / agente de modulação de GDF-8 não éparticularmente restrita mas pode ser conduzida sob as condições em usorotineiro para ensaios imunes convencionais. Um procedimento típico com-preende incubação ou permissão para suportar um sistema de reação com-preendendo o agente de detecção e agente de modulação de GDF-8 generi-camente em uma temperatura não acima de 45°C, preferivelmente entre cer-ca de 4°C e cerca de 40°C, mais preferivelmente entre cerca de 20°C e cer-ca de 40°C, ou por entre cerca de 0,5 e 24 horas, preferivelmente entre cer-ca de 1 e cerca de 2 horas. O solvente não é particularmente restrito contan-to que ele não interfira com a reação, e assim inclui, mas não está limitado a,tampões entre cerca de pH 5 e cerca de pH 9, como o tampão citrato, tam-pão fosfato, tampão Tris, e tampão acetato. Detergentes opcionalmente po-dem estar presentes.

Etapa (c) compreende adição de um agente de detecção ao va-so de reação. Seguindo o período de incubação, o complexo imobilizado deagente de modulação de GDF-8 / agente de captura é em algumas modali-dades, lavado com tampão para remoção de solutos não-ligados antes deetapa (c). Em outras modalidades um ensaio simultâneo é realizado, peloque etapas (b) e (c) ocorrem simultaneamente.

Quando a etapa (c) é conduzida após etapa (b), um procedimen-to típico compreende incubação ou permissão de repouso de um sistema dereação compreendendo o agente de detecção e o agente de modulação deGDF-8 genericamente em uma temperatura não acima de 45°C, preferivel-mente entre cerca de 4°C e cerca de 40°C, mais preferivelmente entre cercade 25°C e cerca de 40°C por entre cerca de 0,5 e 40 horas, preferivelmenteentre cerca de 1 e cerca de 20 horas. O solvente não é particularmente res-trito contanto que ele não interfira com a reação, e assim inclui, mas não élimitado a, tampões entre cerca de pH 5 e cerca de pH 9, como tampão citra-to, tampão fosfato, tampão Tris, e tampão acetato.

O agente de detecção é uma molécula, opcionalmente rotuladacom um rotulador detectável como descrito acima. O agente de detecçãoestá preferivelmente em excesso de modo que essencialmente todo agentede modulação de GDF-8 exógeno alvo que possa estar presente na amostrabiológica será ligado. Detecção pode ser qualitativa ou quantitativa. Em al-gumas modalidades, o agente de detecção compreenderá um rotulador queserá facilmente detectado por meios visuais sem o auxílio de instrumentos.O agente de detecção também pode ser detectado com instrumentos. Emprocessos tais como ressonância plasmon de superfície, ligação de um a-gente de modulação de GDF-8 a um agente de captura é detectada sem aadição de um rotulador, por exemplo.

O agente de detecção é imobilizado através de ligação específi-ca a um agente de modulação de GDF-8 exógeno, por exemplo. Em umarealização, o agente de detecção é um anticorpo IgG anti-humano conjugadoa peroxidase de raiz forte. A presença ou ausência do agente exógeno emuma amostra é avaliada através de medição de atividade de rotulador, quepode depender do tipo de rotulador usado para medir o agente de detecção.

Em algumas modalidades, um rotulador "direto" pode ser qual-quer molécula ligada ou conjugada a um específico membro de ligação queé capaz de produzir espontaneamente um sinal detectável sem a adição dereagentes auxiliares. Alguns exemplos incluem um rádioisótopo (por exem-plo, 125l, 3H, 14C), um metal pesado, um fluoróforo (por exemplo, luciferase,proteína fluorescente verde, isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato detetra metil rodamina), 1-N-(2,2,6,6-tetra metil-1-oxil-4-piperidil)-5-N-(asparta-to)-2,4-dinitro benzeno), um corante (por exemplo, ficocianina, ficoeritrina,vermelho Texas, o-ftalaldeído), moléculas luminescentes, incluindo molécu-las quimioluminescentes e bioluminescentes, partículas de ouro coloidais,partículas de prata coloidais, outras partículas de metais coloidais, Európio,partículas de corante de poliestireno, partículas coloridas diminutas comosoluções coloidais de corantes, e partículas de látex coloridas.Muitas taissubstâncias são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica.

Em algumas modalidades, o rotulador é uma enzima tal como,por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase (por exemplo, peroxidase de raizforte), glicose oxidase, ou beta-galactosidase. Os substratos a serem usadoscom as enzimas específicas são genericamente escolhidas para a produção,na presença da correspondente enzima, de uma mudança detectável emcor, fluorescencia ou luminescencia. A enzima é genericamente conjugadaao agente de detecção por glutaraldeído ou reticulaçao com periodato. Emcertas modalidades o agente de detecção é um anticorpo conjugado comperoxidase, tal como um anticorpo monoclonal que se liga especificamenteao agente de modulação de GDF-8ou que se liga especificamente a umcomplexo que inclui o agente de modulação, ou à proteína GDF-8. Comoserá facilmente reconhecido, entretanto, existe uma ampla variedade de dife-rentes técnicas de conjugação, e são aplicáveis a uma variedade de agentesde detecção (mostrados acima), e são facilmente disponíveis para o técnicoversado.

Em uma modalidadepreferida, o anticorpo rotulado com enzimaé adicionado ao complexo de agente de captura / agente de modulação deGDF-8, e deixado ligar. O excesso de reagente é lavado, e a solução con-tendo um apropriado substrato é então adicionada ao vaso de reação. Osubstrato sofre uma reação catalisada com enzima resultando em uma mu-dança espectrofotometricamente mensurável que é indicativa da quantidadede agente presente na amostra.

Peroxidase, quando incubada com substratos solúveis (por ex-meplo, 3,3',5,5'-tetra metil benzidina (TMB), o-fenileno diamina (OPD), sulfo-nato de 2,2'-azino-di-[3-etil benztiazolina] (ABTS), fosfato de p-nitro fenila,luminol, polifenóis, ésteres de acridina, e luciferina), resulta em uma mudan-ça cromogênica ou luminescente no substrato que pode ser espectroscopi-camente detectada. Tipicamente, após um período de incubação fixado como substrato, a reação é rapidamente resfriada (por exemplo, por acidulação),e o resultado é quantificado através de medição de densidade ótica (absor-bância) ou luminescência. Resultados de absorbância podem ser compara-dos com os valores OD na faixa linear para reações cromogênicas, e ensai-os imuno luminescentes são medidos em unidades relativas de luz (RLU).Ainda como uma alternativa, qualquer combinação de reagentes que resulteem ligação e a geração de um sinal dose-resposta praticável pode ser usada(por exemplo, agentes rádio rotulados, reagentes enzima / substrato, ou sis-temas de amplificação de detecção utilizando biotina / avidina, por exemplo).

Ainda em outras modalidades, o rotulador é biotina, um hápten,ou um rotulador epitopo (por exemplo, rotulador - histidina, rotulador - HA(peptídeo hemaglutinina), proteína de ligação de maltose, AviTag®, glutatio-na-S-transferase), que pode ser detectado através de adição de um agentede detecção rotulado que interage com o rotulador associado com o comple-xo de agente de modulação de GDF-8. Um agente de detecção rotulado combiotina ("biotinilado") pode ser detectado através de sua interação com umconjugado de enzima - avidina, por exemplo, peroxidase de raiz forte - avi-dina, após incubação seqüencial com o conjugado de enzima - avidina e umapropriado substrato cromogênico ou fluorogênico.

Na etapa (d) um complexo de agente de modulação de GDF-8associado com a superfície do vaso de reação é detectado por avaliaçãoqualitativa ou quantitativa do sinal do rotulador. O rotulador pode ser medidodiretamente, por exemplo, através de fluorescência ou luminescência, ouindiretamente, via adição de um substrato. O rotulador também pode sermedido, seguindo incubação com um reagente adicional.

Em uma modalidadena qual o rotulador é biotina, uma enzimaconjugada com avidina (que é em algumas modalidades preferidas peroxi-dase de raiz forte), é adicionada em uma etapa subseqüente. O conjugadode avidina se liga ao agente de detecção imobilizado. Excesso de conjugadode avidina é lavado. Um substrato da enzima é então adicionado, resultandoem uma mudança mensurável em, por exemplo, cor, fluorescência, ou lumi-nescência. Em algumas modalidades o substrato de peroxidase de raiz forteé 3,3',5,5'-tetra metil benzidina.

Em outras modalidades, este processo permite a detecção emuma amostra biológica complexa de um agente de modulação de GDF-8 quese liga especificamente com folistatina, vários receptores de ligação de GDF-8, activina, pró-peptídeo GDF-8, ou outros agentes de modulação de GDF-8em amostras biológicas. Em certas modalidades, a proteína que se liga es-pecificamente a GDF-8 (por exemplo, escolhida da lista precedente) é o a-gente de captura, e o agente de captura está imobilizado sobre uma superfí-cie do vaso de reação. Em uma modalidadepreferida, este processo permitea detecção de um agente de modulação de GDF-8 exógeno em uma amos-tra biológica de um indivíduo, baseado em competição ou interferência comuma interação de GDF-8 madura com um ou mais parceiros de ligação es-pecíficos (vide abaixo).

O agente de detecção em etapas (c) e (d) é, em algumas moda-lidades, um anticorpo, tal como anticorpo Ig anti-humano camundongo, comodescrito no Exemplo 1. Em uma modalidadepreferida, o processo para de-tectar um agente de modulação de GDF-8 exógeno em uma amostra bioló-gica compreende: (a) contato de uma proteína GDF-8 madura com uma su-perfície de um vaso de reação; (b) adição de uma amostra biológica ao vasode reação; (c) adição de um agente de detecção ao vaso de reação; e (d)detecção de um complexo de proteína GDF-8 / agente de modulação deGDF-8 associado com a superfície do vaso de reação. Em um aspecto pre-ferido, a proteína GDF-8 madura compreende uma porção biotina e contataa superfície via a porção biotina. Em um aspecto preferido, a razão molar deporção biotina para proteína GDF-8 madura está entre cerca de 0,5:1 e 4:1.Ainda em um aspecto preferido, o agente de modulação de GDF-8 é MYO-029.

Ainda em uma realização, um processo para detectar um agentede modulação de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica é provido com-preendendo: (a) contato de um agente de captura com uma superfície de umvaso de reação, onde o agente de captura é escolhido de uma proteínaGDF-8 e uma proteína que se liga especificamente a uma proteína GDF-8;(b) adição de uma amostra biológica ao vaso de reação; (c) adição de umagente de detecção ao vaso de reação; e (d) detecção de um complexo deagente de captura / agente de modulação de GDF-8 associado com a super-fície do vaso de reação, pelo que detectando um agente de modulação deGDF-8 exógeno na amostra biológica. Ainda em uma outra realização, umprocesso para detectar um agente de modulação de GDF-8 em uma amostrabiológica é provido, o processo compreendendo: (a) Contato de um receptorde GDF-8 com uma superfície de um primeiro e um segundo vaso de rea-ção; (b) adição de uma amostra biológica e uma proteína GDF-8 ao primeirovaso de reação de (a); (c) adição de uma amostra controle e uma proteínaGDF-8 ao segundo vaso de reação de (a); (d) adição de um rotulador detec-tável ao primeiro e segundo vaso de reação; e (e) comparando o sinal derotulador detectável no primeiro vaso de reação ao sinal no segundo vaso dereação, pelo que detectando o agente de modulação de GDF-8 na amostrabiológica.

Elisa Competitivo

Ainda em modalidades da invenção, o ensaio imuno in vitro é umELISA competitivo. Em um processo aqui provido, o ensaio imuno compre-ende as etapas de: (a) contato de um receptor de GDF-8 solúvel com umasuperfície de um vaso de reação; (b) adição de uma amostra biológica aovaso de reação; (c) adição de uma proteína GDF-8 rotulada ao vaso de rea-ção; e (d) detecção de quantidade de complexo de receptor de GDF-8 / pro-teína GDF-8 rotulada associada com a superfície na presença e ausência daamostra biológica, onde uma redução na quantidade de complexo de recep-tor de GDF-8 / proteína GDF-8 rotulada na presença da amostra biológicadetecta um agente de modulação de GDF-8 exógeno na amostra biológica.Em certas modalidades, o processo ainda compreende a etapa de incuba-ção de amostra biológica com uma proteína GDF-8 rotulada antes de adiçãode amostra ao vaso de reação. Em modalidades adicionais, uma proteínaGDF-8 biotinilada, por exemplo, como descrito acima, pode ser usada comoo agente de detecção.

Inibidores de GDF-8

Um agente de modulação de GDF-8, incluindo um inibidor deGDF-8, pode ser detectado através de processos aqui providos. Ele tambémpode ser usado nos processos, por exemplo, como um agente de detecçãoem um ensaio de ligação. Inibidores de GDF-8 podem interagir com a pró-pria GDF-8. Alternativamente, inibidores podem interagir com um receptor deGDF-8 (tal como ActRMB) ou outro parceiro de ligação ou podem atuar indi-retamente. Inibidores de GDF-8 são um subconjunto de agentes de modula-ção de GDF-8, e incluem anticorpos (contra, por exemplo, GDF-8 e/ou umreceptor de GDF-8), receptores solúveis, outras proteínas (incluindo aquelasque se ligam a GDF-8 e/ou receptor de GDF-8), formas modificadas deGDF-8 ou seus fragmentos, pró-peptídeos, peptídeos, e miméticos de todosestes inibidores. Inibidores não-protéicos incluem, por exemplo, ácidos nu-cléicos.

Será entendido por aqueles versados na técnica que certos ami-noácidos em uma seqüência de qualquer proteína podem ser substituídospor outros aminoácidos sem afetar adversamente a atividade da proteína. Éassim contemplado que várias mudanças podem ser feitas nas seqüênciasde aminoácidos dos agentes de modulação de GDF-8 e inibidores de GDF-8da invenção, ou seqüências de ADN codificando os mesmos, sem apreciávelperda de sua atividade ou utilidade biológica. Tais mudanças podem incluir,mas não são limitadas a, supressões, inserções, truncações e substituições.

A seqüência primária de um aminoácido ou agente baseado emnucleotídeo ou inibidor pode diferir de uma seqüência referência. Por exem-plo, uma seqüência de nucleotídeos pode se associar com uma seqüênciarelacionada sob condições "altamente rigorosas" ou "de alta rigorosidade"para hibridização e lavagem. Tais condições são conhecidas por aquelesversados na técnica e podem ser encontradas em, por exemplo, "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.Ambas condições aquosas e não-aquosas como descrito na técnica podemser usadas. Um exemplo de condições de hibridização altamente rigorosas éhibridização em 6X cloreto de sódio / citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C,seguido por pelo menos uma lavagem em 0,2X SSC, dodecil sulfato de só-dio 0,1% (SDS) a 50°C. Outros exemplos de condições de hibridização dealta rigorosidade incluem hibridização em 6X SSC em cerca de 45°C (ou50°C, 60°C, ou 65°C) seguido por pelo menos uma lavagem em 0,2X SSC,SDS 0,1% a cerca de 55°C, 60°C ou 65°C. Condições altamente rigorosastambém podem ser hibridização em fosfato de sódio 0,5 M, SDS 7% a 65°C,seguido por pelo menos uma lavagem em 0,2X SSC, SDS 1% a 65°C.

Aqueles versados na técnica reconhecerão que um agente demodulação de GDF-8 protéico ou inibidor de GDF-8 pode conter um númerode alterações conservantes para sua seqüência de aminoácidos sem altera-ção de suas propriedades biológicas. Modificações conservantes de amino-ácidos são baseadas na similaridade relativa dos substituintes de cadeialateral de aminoácido, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, car-ga, tamanho, e similares. Substituições conservantes exemplares são bem-conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glu-tamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leu-cina e isoleucina. Além disso, fragmentos funcionais de um agente de modu-lação de GDF-8 protéico ou inibidor de GDF-8 são aqui providos. É esperadoque tais fragmentos possam se ligar especificamente a GDF-8 e/ou inibiruma atividade de GDF-8. Em uma modalidadeda invenção, um agente demodulação de GDF-8, ou um seu fragmento funcional, se liga especifica-mente a GDF-8 madura ou um seu fragmento, se em forma monomérica,forma de dímero ativo, ou complexada em um complexo latente de GDF-8.

Quando referindo a uma seqüência de aminoácido ou ácido nu-cléico, a frase "substancialmente idêntica" ou "substancialmente similar" sig-nifica que a seqüência de aminoácido ou nucleotídeo relevante, tal como dosinibidores de GDF-8 da invenção, será idêntica a ou têm diferenças nãosubstanciais (através de substituições conservadas de aminoácidos) emcomparação com as seqüências que são mostradas. Nucleotídeo e polipep-tídeos da invenção incluem, por exemplo, aqueles que são pelo menos cercade 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, ou 99% idênticos em seqüência a moléculas de ácido nucléico epolipeptídeos mostrados.

Para polipeptídeos, pelo menos 20, 30, 50, 100, ou mais amino-ácidos serão comparados entre o polipeptídeo original e o polipeptídeo vari-ante que é substancialmente idêntico ao original. Para ácidos nucléicos, pelomenos 50, 100, 150, 300, ou mais nucleotídeos serão comparados entre oácido nucléico original e o ácido nucléico variante que é substancialmenteidêntico ao original. Alternativamente, pode ser feita uma comparação sobrepelo menos 60%, 70%, 80%, 90% da seqüência de ácido nucléico ou ami-noácido original. Assim, uma variante pode ser substancialmente idêntica emuma região ou regiões, mas divergente em outras. Porcentagem de identi-dade entre duas seqüências é determinada através de algoritmos de alinha-mento padrão como, por exemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) des-crito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), o algoritmo de Nee-dleman et al., J. Mol. BioL 48:444-453 (1970), ou o algoritmo de Meyers etal., Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988).

O termo "variante" refere-se a seqüências de aminoácido e nu-cleotídeo que são substancialmente idênticas ou similares às seqüências deaminoácidos e nucleotídeos de inibidores de GDF-8 (assim como própriaGDF-8) providas, respectivamente. Variantes podem ser de ocorrência natu-ral, por exemplo, seqüências de nucleotídeos não-humanas e humanas o-correndo naturalmente, ou podem ser geradas artificialmente. Exemplos devariantes são aquelas resultantes de união alternativa do ARNm, incluindoambas variantes unidas 3' e 5', mutações de ponto e outras mutações, ouclivagem proteolítica das proteínas. Variantes incluem moléculas de ácidonucléico ou seus fragmentos e seqüências de aminoácidos e seus fragmen-tos, que são substancialmente idênticos ou similares a outros ácidos nucléi-cos (ou suas fitas complementares quando elas são otimamente alinhadas(com apropriadas inserções ou supressões) ou seqüências de aminoácidos,respectivamente. Em uma realização, há pelo menos cerca de 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade entre umamolécula de ácido nucléico ou proteína da invenção e uma outra moléculade ácido nucléico ou proteína, respectivamente, quando otimamente alinha-da. Alternativamente, um epitopo inteiro pode ser inserido em uma moléculanão-homóloga. Adicionalmente, variantes incluem proteínas ou polipeptídeosque exibem atividade de GDF-8 ou inibem atividade de GDF-8, como discu-tido neste pedido de patente.

Os inibidores de GDF-8 podem ser glicosilados, pegilados, ouligados a um outro polímero não-protéico. Os inibidores de GDF-8 da inven-ção podem ser modificados para terem um padrão de glicosilação alterado(isto é, alterado do padrão de glicosilação nativo ou original). Como aqui u-sado, "alterado" significa tendo uma ou mais metades carboidrato modifica-das, e/ou tendo um ou mais sítios de glicosilação alterados no inibidor origi-nal. Adição de sítios de glicosilação aos inibidores de GDF-8 pode ser reali-zada através de alteração de seqüência de aminoácidos para conter se-qüências consenso de sítio de glicosilação bem-conhecidas na técnica. Umoutro meio de aumento de número de metades carboidrato é através de a-coplamento químico ou enzimático de glicosídeos aos resíduos de aminoá-cidos do inibidor. Estes processos são descritos em WO 87/05330, e em A-plin et al., Crit. Rev. Biochem. 22:259-306 (1981). Remoção de quaisquermetades carboidrato sobre o receptor pode ser realizada química ou enzima-ticamente como descrito por Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys.259:52 (1987); Edge et al., Anal. Biochem. 118:131 (1981); e por Thotakuraet al., Meth. Enzymol. 138:350 (1987).

1. Anticorpos

Anticorpos que inibem atividade de GDF-8 estão dentro do es-copo dos agentes de modulação de GDF-8 aqui providos. Anticorpos podemser obtidos, por exemplo, através de tradicionais técnicas de hibridoma (Ko-hler et al., Nature, 256:495-499 (1975)), processos de ADN recombinante(patente US N2 4.816.567), ou técnicas de mostra de fago usando bibliote-cas de anticorpos (Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al.,J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)). Para várias outras técnicas de produçãode anticorpos, vide, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, (Harlowet al., eds., Cold spring Harbor Laboratory, 1988); e Antibody Engineering,2nd ed., (Borrebaeck, ed., Oxford University Press 1995). Anticorpos podemser inteiramente humanos ou humanizados. Em certas modalidades, anti-corpos podem ter uma região Fc mutada ou alterada como descrito em seções subseqüentes.

A afinidade de anticorpos de acordo com esta invenção podeestar entre 106 M"1 e 1011 M'1, e pode estar entre 108 M"1 e 1010 M~\ por e-xemplo. Os anticorpos da invenção podem inibir atividade de GDF-8 in vitroou in vivo. Os anticorpos mostrados podem inibir atividade de GDF-8 associ-ada com regulação negativa de massa de músculo de esqueleto e densida-de de osso e/ou pode afetar depuração ou biodisponibilidade de GDF-8.

2. Anticorpos Contra GDF-8

Anticorpos que são agentes de modulação de GDF-8 podem seligar à própria proteína GDF-8. Em modalidades particulares, os anticorposse ligam especificamente a uma proteína GDF-8 ou complexo de receptor deGDF-8 / GDF-8. Tais anticorpos podem ser capazes de ligação a GDF-8madura com alta afinidade, e podem ligar a proteína madura se em sua for-ma monomérica, forma de dímero ativo, ou complexada em um complexolatente de GDF-8. Em modalidades preferidas, os anticorpos que se ligam aproteína GDF-8 são anticorpos neutralizantes. Em certas modalidades, anti-corpos GDF-8 bloqueiam a ligação de GDF-8 a seu receptor, por exemplo,como medido em um ensaio de ligação competitivo. Anticorpos para se-qüências de GDF-8 são discutidos em patentes US N- 5.827.733 e6.096.506, por exemplo.

A. MYO-029. MYO-028. e MYO-022

Os anticorpos MYO-029, MYO-028, e MYO-022 podem ser usa-dos nos processos da invenção, e estes anticorpos são descritos ainda emdetalhes na patente US NQ 2004/0142382-A1, porções relevantes da qualsão aqui incorporadas por referência incluindo seqüência, estrutura, frag-mento, ligação, atividade biológica, e informação de epitopo de antígeno pa-ra os anticorpos, por exemplo. Por exemplo, características de certos anti-corpos neutralizantes, incluindo MYO-029, são descritas na patente US Ns2004/0142382-A1 em parágrafos 54-90, e reivindicações 1-42. Estes anti-corpos são capazes de ligação com GDF-8 madura com alta afinidade, ini-bindo atividade de GDF-8 in vitro e in vivo como demonstrado, por exemplo,através de inibição de ligação de ActRIlB e ensaios de gene repórter, e ini-bindo atividade de GDF-8 associada com regulação negativa de massa demúsculo de esqueleto e densidade de osso.

Seqüências de ADN e aminoácido (AA) de anticorpos MYO-029,MYO-028, e MYO-022, seus fragmentos scFv, domínios VH e VL, e CDRssão mostradas nas Listagens de Seqüências (MYO-029) e descrição de pa-tente US N9 2004/0142382-A1 (MYO-029, MYO-028, e MYO-022). As se-qüências de cadeias leves e pesadas excluindo os domínios Vh e VL sãoidênticas em MYO-029, MYO-028, e MYO-022. Em uma modalidadepreferi-da, seqüências de MYO-029 são mostradas como SEQ ID NOs:3-20.B. JA-16

O anticorpo JA-16 se liga a uma proteína GDF-8 madura comomostrado em SEQ ID NO:1, e é descrito ainda em detalhes em L-A Whitte-more et ai., Biochem. And Biophys. Res. Commun. 300:965-971 (2003), as-sim como em patente US N9 2003/0138422-A1, porções relevantes de cada(incluindo seqüência, estrutura, fragmento, ligação, atividade biológica, eepitopo antígeno, por exemplo), são aqui incorporadas por referência. Emparticular, inibidores de anticorpos de patente US Ne 2003/0138422-A1, sãodescritos em parágrafos 56-70, 93-110, e reivindicações 1-54, por exemplo.

3. Anticorpos Contra Um Receptor de GDF-8

Anticorpos que se ligam a um receptor de GDF-8 estão dentrodo escopo dos agentes de modulação de GDF-8 detectados com os proces-sos desta invenção. Estes anticorpos podem afetar a ligação de GDF-8 aseu receptor, ou eles bloqueiam a atividade do receptor após ligação deGDF-8. Anticorpos podem ser desenvolvidos contra a inteira proteína recep-tora, ou contra somente o domínio extracelular. Anticorpos podem ser de-senvolvidos contra ActRIlB, variantes de ActRNB, e outros receptores paraGDF-8 (vide, por exemplo, patente US N9 2004/0223966-A1; patente US Ne2004/0077053-A1; WO 00/43781).

4. Receptores Solúveis Modificados

Receptores solúveis modificados de GDF-8, que são eles pró-prios agentes de modulação de GDF-8 podem ser usados na invenção paradetecção de outros agentes de modulação de GDF-8. Receptores solúveispodem compreender todo ou parte do domínio extracelular de um receptorde GDF-8, tal como ActRIlB ou ActRIlA que se liga a GDF-8 em ensaiosbem-conhecidos na técnica (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:9306-9311 (2001)). Receptores tipo II ativina são altamente conservados, e formassolúveis recombinantes dos mesmos são providas em Attisano et al., Mol.And Cell Biol. 16:1066 (1996); Woodruff, Pharmacology 55:953 (1998); e R &D Systmes Cat. NQ 339-R (uma quimera Act RIIB-Fc humana), por exemplo.Propriedades funcionais e estruturais de receptor de GDF-8, assim comoensaios para a atividade do mesmo são providos, por exemplo, nas patentesUS Ne 6 656 475 e 6 696 260, e patente US Ne 2004/0077053-A1. Ainda,receptores de ativina, incluindo receptores de ativina tipo II, são providos,por exemplo, na patente US N9 6.835.544, descrevendo os domínios de liga-ção de ligante extracelulares dos mesmos.

Tais receptores podem ser produzidos recombinantemente ouatravés de clivagem química ou enzimática do receptor intacto. Os recepto-res solúveis modificados da invenção reduzem a habilidade de GDF-8 ativarreceptor de GDF-8 nativa no corpo e inibe atividade de GDF-8. As seqüên-cias para o receptor ActRMB, incluindo descrição do domínio extracelular,fragmentos específicos e variantes do receptor são mostrados na patenteUS Ne 6.656.475, por exemplo.

A. Fusões de Receptor

Os receptores solúveis modificados da invenção podem ser fei-tos mais estáveis através de fusão a uma outra proteína ou porção de umaoutra proteína. Estabilidade aumentada é vantajosa para terapêuticos parapermitir administração de uma dose menor ou em intervalos menos freqüen-tes. Fusão a pelo menos uma porção de uma imunoglobulina, tal como aregião constante de um anticorpo, opcionalmente um fragmento Fc de umaimunoglobulina, pode aumentar a estabilidade de um receptor solúvel modi-ficado ou outras proteínas da invenção. (Vide, por exemplo, Spiekermann etal., J. Exp. Med. 96:303-310 (2002)).

B. Fusões ActRMB Fc

Inibidores de fusão ActRMB Fc, descritos ainda em detalhes empatente US Ne 2004/0223966-A1, porções relevantes da qual são aqui incor-poradas por referência, compreendem um receptor tipo II ativina modificadoActRIlB que se liga a GDF-8 e inibe sua atividade in vitro e in vivo. Em parti-cular, os polipeptídeos de fusão ActRMB inibem a atividade de GDF-8 asso-ciada com regulação negativa de massa de músculo de esqueleto e densi-dade de osso. Os polipeptídeos de fusão ActRMB dos processos aqui provi-dos são solúveis e possuem propriedades fármaco-cinéticas que os tornamadequados para uso terapêutico, por exemplo, estendida meia-vida circulató-ria e/ou aperfeiçoada proteção a partir de degradação proteolítica.

Polipeptídeos de fusão ActRMB podem ser usados, por exemplo,nos processos da invenção para detecção de agentes de modulação deGDF-8. Estes polipeptídeos compreendem uma primeira seqüência de ami-noácidos derivada do domínio extracelular de ActRMB e porção estabilizanteou segunda seqüência de aminoácidos. A primeira seqüência de aminoáci-dos é derivada de todo ou uma porção do domínio extracelular de ActRMB eé capaz de ligação específica de GDF-8. Em algumas modalidades, uma talporção do domínio extracelular de ActRIlB também pode ligar especifica-mente BMP-11 e/ou ativina, ou outros fatores de crescimento. Em certasmodalidades, ActRMB é um fragmento ou truncação do receptor intacto, tan-to quanto a seqüência encurtada seja capaz de ligar especificamente GDF-8.

A porção estabilizante, pode ser uma seqüência de aminoácidosderivada da região constante de um anticorpo, particularmente a porção Fc,ou uma mutação de uma tal seqüência. Em algumas modalidades, a se-qüência de aminoácidos é derivada da porção Fc de uma IgG. Em modali-dades relacionadas, a porção Fc é derivada de IgG que é lgG1, lgG4, ou umoutro isotipo de IgG. Em uma modalidadeparticular, a segunda seqüência deaminoácidos compreende a porção Fc de lgG1 humana, onde a porção Fcde lgG1 humana foi modificada para minimizar a função efetora da porçãoFc. Tais modificações incluem mudança de específicos resíduos de aminoá-cidos que podem alterar uma função efetora tal como ligação de receptor deFc (Lund et al., J. Immun., 147:2657-2662 (1991); e Morgan et al., Immuno-logy, 86:319-324 (1995)), ou mudança de espécies a partir das quais a regi-ão constante é derivada. Anticorpos podem ter mutações na região CH2 dacadeia pesada que reduzem função efetora, isto é, ativação de complementoe ligação de receptor de Fc. Por exemplo, anticorpos podem ter mutaçõestais como aquelas descritas nas patentes US Ne 5.624.821 e 5.648.260. Nacadeia pesada lgG1 ou lgG2, por exemplo, tais mutações podem ser feitasem resíduos de aminoácidos correspondendo a aminoácidos 234 e 237 naseqüência de inteiro comprimento de lgG1 ou lgG2. Anticorpos também po-dem ter mutações que estabilizam a ligação dissulfeto entre as duas cadeiaspesadas de uma imunoglobulina, tais como mutações na região articuladade lgG4, como mostrado em Angal et al., Mol. Immunol. 30:105-108 (1993).

Em certas modalidades, a porção estabilizante está ligada aoterminus-C ou terminus-N da seqüência receptora, com ou sem estar ligadapor uma seqüência ligante. O exato comprimento e seqüência do ligante esua orientação em relação às seqüências ligadas podem variar. O ligantepode compreender 2, 10, 20, 30, ou mais aminoácidos e é selecionado ba-seado nas propriedades desejadas tais como solubilidade, comprimento eseparação estérea, imunogenicidade, etc. Em certas modalidades, o ligantepode compreender uma seqüência de um sítio de clivagem proteolítica, talcomo o sítio de clivagem enterocinase ou outras seqüências funcionais úteis,por exemplo, para purificação, detecção, ou modificação da proteína de fu-são. Aqueles versados na técnica podem facilmente aplicar tal tecnologia aoutros agentes de modulação de GDF-8 protéicos como aqui descritos, cri-ando várias proteínas de fusão.

5. Outras Proteínas

Outras proteínas que inibem atividade de GDF-8 podem ser de-tectadas nos processos aqui providos. Tais proteínas podem interagir com aprópria GDF-8, inibindo sua atividade ou ligação a seu receptor. Alternativa-mente, inibidores podem interagir com um receptor de GDF-8 (tal como Ac-tRIlB) e podem ser eficazs nos processos de detecção da invenção se elesbloqueiam a ligação de GDF-8 a seu receptor ou se eles bloqueiam a ativi-dade do receptor após ligação de GDF-8. Inibidores, é claro, podem interagircom ambas, GDF-8 e seu receptor. Inibidores também podem afetar a ativi-dade de GDF-8 de outras maneiras, tal como através de inibição de metalo-protease que cliva um pró-peptídeo GDF-8 inibidor para inativar o mesmo(vide, por exemplo, patente US NQ 2004/0138118-A1).

A. Proteínas que se ligam especificamente a GDF-8

Proteínas que se ligam a GDF-8 e inibem sua atividade ou afe-tam sua depuração são aceitáveis para uso nos processos da invenção.Embora algumas proteínas sejam conhecidas, proteínas adicionais podemser isoladas usando os vários ensaios como o ensaio de ligação de ActRIlB,ensaios imuno, ou ensaios de gene repórter aqui descritos. Amostras de pro-teínas podem ser selecionadas, assim como bibliotecas de proteínas.

B. Pró-peptídeo GDF-8Pró-peptídeo GDF-8 pode ser usado como um inibidor de GDF-8. Devido a pró-peptídeos GDF-8 ocorrendo naturalmente terem uma meia-vida in vivo curta pelo que reduzindo sua eficácia como inibidores farmaco-lógicos de atividade de GDF-8, um inibidor de pró-peptídeo de GDF-8 incluiformas modificadas e estabilizadas de pró-peptídeos GDF-8 tendo aperfei-çoadas propriedades fármaco - cinéticas, especificamente uma meia-vidacirculatória aumentada. Vide, patente US N- 2003/0104406-A1, porções re-levantes das quais são aqui incorporadas por referência.

Tais pró-peptídeos GDF modificados incluem proteínas de fusãocompreendendo um pró-peptídeo e uma região Fc de uma molécula de IgG(como uma proteína estabilizante). Estes inibidores de GDF podem compre-ender um pró-peptídeo GDF (por exemplo, como mostrado em SEQ ID NO:5ou 11) ou um fragmento ou variante do dito pró-peptídeo que retém uma oumais atividades biológicas de um pró-peptídeo GDF. Pró-peptídeos GDF-8usados nos processos da invenção podem ser produzidos sinteticamente,derivados de pró-peptídeos GDF-8 ocorrendo naturalmente (nativos), ou se-rem produzidos recombinantemente, usando qualquer um de uma variedadede reagentes, células hospedeiras e processos que são bem-conhecidos natécnica de engenharia genética. Em uma realização, o pró-peptídeo GDF-8modificado compreende um pró-peptídeo GDF-8 humano ligado covalente-mente a uma molécula de IgG ou seu fragmento do mesmo. O pró-peptídeoGDF-8 pode estar ligado diretamente à região Fc da molécula IgG, ou ligadoà região Fc da molécula IgG por meio de um peptídeo ligante. Ainda proteí-nas que se ligam a GDF-8, incluindo pró-peptídeos de GDF-8 são providasem WO 00/43781.

C. Proteínas contendo domínio folistatina e folistanina

Proteínas compreendendo pelo menos um domínio folistatinamodulam o nível ou atividade de fator de crescimento e diferenciação-8(GDF-8), e podem ser usadas para tratamento de distúrbios que são relacio-nadas à modulação do nível ou atividade de GDF-8. Ambas, a própria folista-tina e proteínas contendo domínio foiistatina (descritas nas patentes US N92003/0162714-A1 e 2003/0180306-A1), relevantes porções de ambas asquais são aqui incorporadas por referência) podem ser usadas na invenção(vide também, Lee etal., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 98:9306-9311 (2001)).Administração destas proteínas a um ser humano ou um animal pode serdetectada usando os processos da invenção.

Proteínas contendo pelo menos um domínio folistatina se ligarãoa, e inibirão GDF-8. Exemplos de proteínas tendo pelo menos um domíniofolistatina incluem, mas não são limitados à folistatina, gene relacionado si-milar à folistatina (FLRG), FRP (flik, tsc 36), agrins, osteonectina (SPARC,BM40), hevina (SC1, mast9, QR1), IGFBP7 (mac25), e U19878. GASP1 eGASP2 são outros exemplos de proteínas compreendendo pelo menos umdomínio folistatina.

Um domínio folistatina, como estabelecido acima, é definido co-mo um domínio de aminoácido ou um domínio de nucleotídeo codificandoum domínio de aminoácido, caracterizado por repetições ricas em cisteína.Um domínio folistatina tipicamente abrange uma extensão de 65-90 aminoá-cidos e contém 10 resíduos cisteína conservados e uma região similar a do-mínios de inibidor de serina protease. Em geral, as regiões de laço entre osresíduos de cisteína exibem variabilidade de seqüência em domínios folista-tina, mas alguma conservação é evidente. O laço entre a quarta e quintacisteínas é usualmente pequeno, contendo somente 1 ou 2 aminoácidos. Osaminoácidos no laço entre a sétima e oitava cisteínas são genericamente osmais altamente conservados contendo uma seqüência consenso de (G,A)-(S,N)-(S,N,T)-(D,N)-(G,N) seguida por um motivo (T,S)-Y. A região entre anona e a décima cisteínas genericamente contém um motivo contendo doisresíduos hidrofóbicos (especificamente V, I, ou L) separados por um outroaminoácido.

Uma proteína contendo domínio folistatina compreenderá pelomenos um, mas possivelmente mais de um, domínio folistatina. O termotambém refere-se a quaisquer variantes de tais proteínas (incluindo fragmen-tos; proteínas com substituição, mutações de adição ou supressão; e proteí-nas de fusão) que mantêm as conhecidas atividades biológicas associadascom as proteínas nativas, especialmente aquelas pertencendo a atividade deligação GDF-8, incluindo seqüências que foram modificadas com mudançasconservantes ou não-conservantes para a seqüência de aminoácidos. Estasproteínas podem ser derivadas de qualquer fonte, natural ou sintética. A pro-teína pode ser humana ou derivadas de quaisquer fontes animais, incluindo,mas não limitado a, bovino, galinha, murina, rato, suíno, ovino, peru, babuínoe peixe.

Proteínas compreendendo pelo menos um domínio folistatina,que pode se ligar a GDF-8, podem ser isoladas usando uma variedade deprocessos. Por exemplo, pode-se usar purificação de afinidade usando GDF-8. Em adição, pode-se usar uma seleção de baixa rigorosidade de uma bibli-oteca de ADNc, ou uso de técnicas de PCR degenerada usando uma sondadirecionada para um domínio folistatina. À medida que mais dados genômi-cos tornam-se disponíveis, a busca de similaridade usando um número deprogramas de análises e perfil de seqüência, como MotifSearch (GeneticsComputer Group, Madison, Wl), ProfileSearch (GCG), e BLAST (NCBI) podeser usada para encontrar novas proteínas contendo significante homologiacom conhecidos domínios folistatina.

D. Ligação de Proteínas a Receptor de GDF-8

Proteínas que se ligam a um receptor de GDF-8 (tal como ActRI-IB) e inibem a ligação de GDF-8 ao receptor ou a atividade do próprio recep-tor são aceitáveis para uso nos processos da invenção para detecção deagentes de modulação de GDF-8. Tais proteínas podem ser isoladas usan-do-se técnicas de seleção e o ensaio de ligação de ActRHB ou ensaios degene repórter aqui descritos. Amostras de proteínas podem ser seleciona-das, assim como bibliotecas de proteínas.

E. Fusões Com Quaisquer das Proteínas Ligando a GDF-8 ou Receptor deGDF-8

Proteínas de fusão de qualquer uma das proteínas que se ligama GDF-8 ou um receptor de GDF-8 podem ser tornadas mais estáveis atra-vés de fusão a uma outra proteína ou porção de uma outra proteína. Modifi-cação de um agente de modulação de GDF-8 para aumentar estabilidade évantajoso para terapêutica na medida em que elas podem ser administradasem menor dose ou em intervalos menos freqüentes. Fusão a pelo menosuma porção de uma imunoglobulina, tal como a região constante, opcional-mente um fragmento Fc de uma imunoglobulina, pode aumentar a estabili-dade destas proteínas. A preparação de tais proteínas de fusão é bem-conhecida na técnica e pode ser facilmente realizada, (vide, por exemplo,Gerburg Spiekermann (2002) J. Exp. Med., 96:303-310).

Um inibidor de fusão Fc pró-peptídeo GDF-8, descrito em maio-res detalhes em patente US N9 2003/0104406-A1, porções relevantes asquais são aqui incorporadas por referência, compreende um polipeptídeoclivado do domínio amino terminal da proteína precursora de GDF-8, ligadocovalentemente com a região Fc de uma molécula IgG ou fragmento domesmo.

O inibidor de fusão Fc pró-peptídeo GDF-8 compreende um pró-peptídeo GDF-8 humano ou um mutante de pró-peptídeo GDF-8, e a regiãoFc de uma lgG1, uma lgG4, ou uma lgG1 modificada para reduzida funçãoefetora. O pró-peptídeo GDF-8 pode ser modificado para inclusão de modifi-cações estabilizantes.

F. Inibidores de Ativação de Protease do Complexo Latente de GDF-8

Inibidores de ativação de protease do complexo latente de GDF-8 são descritos na patente US N9 2004/0138118 A1, porções relevantes daqual são aqui incorporadas por referência. Certas proteases clivam o pró-peptídeo, tanto em uma forma livre ou quando ele está associado a um di-mero GDF-8 madura, tornando o mesmo impróprio para ligação e inibe aatividade do dimero de GDF-8 madura. Como tal, as proteases podem con-verter um pequeno complexo latente (GDF-8 madura associada a e inibidapor pró-peptídeo) em GDF-8 ativa. Uma vez que o pró-peptídeo tenha sidoclivado ele não pode se ligar a e inativar o dimero de GDF-8 madura. Inibido-res de ativação de protease do complexo latente pequeno de GDF-8 aperfei-çoarão ligação de pró-peptídeo a dímeros de GDF-8 madura e inibirão ativi-dade de GDF-8. Estes inibidores podem se ligar competitivamente com pro-tease, evitando que a mesma se ligue ao complexo latente nativo, ou elespodem também se ligar ao dimero de GDF-8 madura criando um complexode dímero maduro - inibidor inativo.

Metaloproteases são exemplificadas pela família BMP-1/TLD demetaloproteases, que inclui pelo menos quatro proteínas de mamífero, BMP-1 (Wozney et al., Science 242:1528-1534, 1988), Tolloid mamífero (mTLD;Takahara et al., J. Biol. Chem. 269:32572-32578, 1994), Tolloid-similar-1 demamífero (mTLL-1; Takahara et al., Genomics 34:157-165, 1996), e Tolloid-similar-2 (mTLL-2; Scott et al., Devei. Biol. 213:283-300, 1999), cada umadas quais é aqui incorporada por referência.

Vários agentes de modulação de GDF-8 inibidor metaloprotease,são descritos na patente US N9 2004/0138118 Al, incluindo agentes basea-dos em anticorpo, ácido nucléico e peptídeo, e são aqui incorporados porreferência. Inibidores de ativação de protease do latente pequeno de GDF-8tais como agentes que inibem atividade de metaloprotease podem incluirqualquer tipo de molécula, incluindo, por exemplo, um peptídeo, derivado depeptídeo como um hidroxamato de peptídeo ou um peptídeo fosfínico, oupeptóide e pode ser identificado através de ensaios de seleção de patenteUS N9 2004/0138118 A1 (vide também, patente US N9 2005/0043232 A1).

Agentes particulares que inibem ativação de protease do com-plexo latente pequeno de GDF-8 incluem peptídeos que competem para aenzima metaloprotease com o pró-peptídeo GDF-8. Estes peptídeos podemcompreender uma porção do pró-peptídeo, uma porção do polipeptídeoGDF-8 de inteiro comprimento contendo a porção de pró-peptídeo, ou umderivado de um polipeptídeo GDF-8 tendo uma mutação de um sítio de cli-vagem para a metaloprotease. Como descrito nas publicações de patenteUS acima, em uma realização, um derivado de uma porção de peptídeo deGDF-8 é um peptídeo que corresponde a um pró-peptídeo de GDF-8. Emum aspecto desta realização, o derivado é um pró-peptídeo tendo uma mu-tação do sítio de clivagem de metaloprotease, por exemplo, uma substitui-ção, supressão, ou inserção de um aminoácido no, ou em suficiente proximi-dade ao sítio de clivagem de modo que a metaloprotease tenha alterada aatividade de clivagem com relação ao agente peptídeo. Peptídeos modifica-dos ou derivados podem ter aperfeiçoada estabilidade para uma protease,um agente oxidante ou outro material reativo que o peptídeo possa encontrarem um ambiente biológico, e pode incluir, por exemplo, as modificaçõesdescritas acima.

Anticorpos inibidores contra as enzimas metaloproteases, assimcomo anticorpos que se ligam especificamente a tal peptídeo e agentes demodulação de GDF-8 baseados em anticorpo, também podem ser usadosnesta invenção e podem ser facilmente gerados através de técnicas conhe-cidas.

Agentes peptídeos podem ser de aproximadamente 10, 20, 30,40, ou 50 resíduos de aminoácidos ou mais em comprimento, contendo se-qüências de pró-peptídeo GDF-8 mutante ou tipo selvagem, ou seus deriva-dos. Por exemplo, peptídeos tendo uma ou mais mudanças de aminoácidosna posição P1 (justo à montante do sítio de clivagem de metaloprotease) ouposição P1' (justo à jusante do sítio de clivagem de metaloprotease) podemser alteradas. Em certos agentes de modulação de GDF-8, uma substituiçãode ácido aspártico para alanina na posição P1' (correspondendo a posição76 de SEQ ID NO:2) é incluída em um peptídeo que é de 10, 20, 30, 40 e 50aminoácidos de comprimento em relação a seqüência de pró-peptídeo GDF-8 tipo selvagem (patente US Ne 2004/0138118 Ai).

Agentes de modulação de GDF-8 podem ser detectados e/ouidentificados, por exemplo, em um ensaio de gene repórter, captura de GDF-8, ELISA de ligação competitiva, como aqui descrito. Agentes de detecçãoexemplares que detectarão tais agentes de modulação de GDF-8 que modu-lam ativação de metaloprotease do complexo latente de GDF-8 incluem, masnão são limitados a, anticorpos para os agentes, proteína GDF-8 madura, ousuas porções que se ligam a um agente baseado em peptídeo, e seqüênciasde metaloprotease compreendendo a porção de ligação de substrato de umaou mais metaloproteases da família BMP-1/TLD de metaloproteases, tal co-mo pode ser usado em um ensaio de competição.6. Miméticos de Inibidores de GDF-8

Miméticos dos inibidores de GDF-8 usados nos processos dainvenção também podem ser detectados pelos processos aqui descritos.Qualquer análogo sintético destes inibidores de GDF-8, especialmente aque-les com aperfeiçoadas características in vitro tal como tendo uma meia-vidamais longa, ou sendo menos facilmente degradado pelo sistema digestório,é útil.

Miméticos de anticorpos contra GDF-8, anticorpos contra recep-tor de GDF-8, receptores modificados e fusões de receptores, e outras prote-ínas de ligação a GDF-8 tal como pró-peptídeo GDF-8, pró-peptídeo GDF-8mutado, folistatina e proteínas contendo domínio folistatina, e suas fusões Fcpodem todos ser usados na invenção.

Estes miméticos serão eficazs na invenção se eles bloqueiam aatividade de GDF-8, por exemplo, se eles bloqueiam a ligação de GDF-8 aseu receptor. Miméticos que são mais eficazs nesta invenção terão a propri-edade de ligarem-se especificamente a GDF-8 ou o complexo de receptor deGDF-8 / GDF-8. Tais miméticos podem ser capazes de ligação com GDF-8madura com alta afinidade, e podem se ligar à proteína madura se ela estáem forma monomérica, forma de dímero ativa, ou complexada em um com-plexo latente de GDF-8. Os miméticos da invenção podem inibir atividade deGDF-8 in vitro e in vivo como demonstrado, por exemplo, através de inibiçãode ligação de ActRMB e ensaios de gene repórter. Ainda, os miméticos mos-trados ainda inibem atividade de GDF-8 associada à regulação negativa demassa de músculos de esqueleto e densidade óssea.

7. Inibidores Não-Protéicos

Inibidores não-protéicos incluem, por exemplo, ácidos nucléicos.

A. Ácidos Nucléicos

Os termos "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo", e "ácido nucléi-co" referem-se a ácido desoxirribonucléico (ADN), onde apropriado, a ácidoribonucléico (ARN), ou peptídeo ácido nucléico (PNA). O termo também de-ve ser entendido incluir análogos nucleotídeos, e polinucleotídeos simples oude fita dupla (por exemplo, siRNA). Exemplos de polinucleotídeos incluem,mas não são limitados a, ADN plasmídeo ou seus fragmentos, ADN ou ARNviral, ARN anti-sentido, etc. O termo "ADN plasmídeo" refere-se a ADN defita dupla que é circular. "Anti-sentido" como aqui usado, refere-se a ácidonucléico capaz de hibridização a uma porção de uma região codificante e/ounão-codificante de ARNm em virtude de complementaridade de seqüência,pelo que interferindo com tradução a partir do ARNm. Os termos "siRNA" eRNAi" referem-se a um ácido nucléico que é um ARN de cadeia dupla quetem a habilidade de induzir degradação de ARNm pelo que "silenciando"expressão de gene. Tipicamente, siRNA é pelo menos 15-50 nucleotídeosde comprimento, por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30nucleotídeos de comprimento.

Ácidos nucléicos que podem bloquear uma atividade de GDF-8podem ser detectados, por exemplo, através de processos aqui providos.Tais inibidores podem codificar proteínas que interagem com a própria GDF-8. Alternativamente, tais inibidores podem codificar proteínas que interagemcom uma proteína GDF-8 ou receptor de GDF-8 (tal como ActRIlB) e podeexpressar inibidores de GDF-8 da invenção. Alternativamente, ácidos nucléi-cos anti-sentido podem ser usados para inibição de produção de GDF-8 ouum receptor de GDF-8 (tal como ActRIlB). Seqüências anti-sentido podeminteragir com seqüências codificantes complementares para perturbar fun-ção, o que pode servir para inibir GDF-8 ou produção de receptor de GDF-8.

Os ácidos nucléicos para uso na invenção são identificados, porexemplo, usando o ensaio de ligação de ActRIlB e ensaios de gene repórterdescritos acima. Agentes de detecção para agentes de modulação de GDF-8baseados em nucleotídeos incluirão, por exemplo, nucleotídeos complemen-tares ou anticorpos que se ligam especificamente ao agente.

Embora a exposição da presente invenção refira-se a modalida-des preferidas para detecção de agentes de modulação de GDF-8 capazesde ligação com uma proteína GDF-8, é reconhecido que agentes de modula-ção de GDF-8 que modulam outras atividades de GDF-8 podem ser detecta-dos usando os processos da presente invenção. Similarmente, embora aexposição da presente invenção seja direcionada para detecção e/ou moni-toração de níveis de agente de modulação de GDF-8 em seres humanos eoutros mamíferos em conexão com administração in vivo de produtos diag-nósticos ou terapêuticos, será reconhecido que a metodologia pode ser a-daptada para uso também em outras aplicações e espécies.

Os exemplos que se seguem proporcionam modalidades ilustra-tivas da invenção. Aqueles versados na técnica reconhecerão as numerosasmodificações e variações que podem ser feitas sem alteração de espírito ouescopo da presente invenção. Tais modificações e variações são abrangidasno escopo da invenção. Os exemplos de modo algum limitam a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Para detectar MYO-029 em uma amostra de soro humano, umELISA foi realizado como se segue. Estreptavidina foi adsorvida adicionan-do-se primeiramente solução de revestimento de estreptavidina (100u.L/cavidade) (5 |a.g/mL ImmunoPure streptavidin (Pierce) em tampão de car-bonato / bicarbonato 0,1 M, pH 9,6) às cavidades de uma placa de 96 cavi-dades (microtitulação de fundo plano, de alta ligação) (Costar, Cat. N9 3590).A placa foi coberta com filme de selagem e incubada a 2-8°C por toda noite.Usando um lavador de placa automático, a placa foi lavada quatro vezes(4X) com tampão THST (300 ^L/cavidade) (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, conten-do glicina 1,0 mM, NaCI 0,5 M, e Tween 20 0,05% v/v (J.T.Baker)), reverten-do a orientação da placa após a segunda lavagem. Para bloqueio, 200 (xL detampão de bloqueio (albumina bovina 1% (sigma), azida de sódio 0,02% emPBS (Dulbeccos)) foram adicionados a cada cavidade. A placa foi cobertacom filme de selagem e incubada por 1 -2 horas em temperatura ambiente eentão lavada como acima. Solução de GDF-8 biotinilada (razão molar debiotina : GDF-8 entre 0:1 e 3:1) (100 jiL / cavidade) (0,5 |ig/mL em tampãoTHST) foi adicionada a cada uma das cavidades da placa. A placa foi seladae incubada em temperatura ambiente com agitação por 2 horas +/-15 minutos.

Padrões de calibração de MYO-029 foram preparados em 90,0,60,0, 40,0, 26,7, 17,8, 11,9, 7,90, 5,27, e 3,51 ng/mL em tampão THST. Umasolução calibradora de trabalho de MYO-029 foi preparada de 1080 ng/mLde MYO-029 em soro humano normal (Bioreclamation, Inc.). O estoque de1080 ng/mL foi primeiro diluído 8 vezes em tampão de ensaio (tampão THST+ 4% de leite seco sem gordura), e então uma série de diluições de 1,5 vezdo resultante padrão de 135 ng/mL foi preparada em THST + 4% de leiteseco sem gordura + 12,5% de soro humano normal para render as concen-trações de padrão de calibração. Padrões de calibração de MYO-029 prepa-rados cobrindo a faixa de 3,51 a 135 ng/mL são equivalentes a 28,1 a 1080ng/mL em soro humano 100%. Para soro humano, a diluição mínima deter-minada foi 1:8. Padrões de controle de qualidade de MYO-029 foram prepa-rados separadamente em duplicata em 135, 270, e 540 ng/mL em THST +4% de leite seco sem gordura + 12,5% de soro humano normal.

Amostras testes foram diluídas 8 vezes com tampão THST + 4%de leite seco sem gordura (40 |iL de amostra com 280 ^iL de tampão). Dilui-ções maiores que 8 vezes foram primeiro diluídas 1:8 em tampão THST +4% de leite seco sem gordura e então ainda diluídas em tampão THST + 4%de leite seco sem gordura + 12,5% de soro humano).

A placa com GDF-8 biotinilada imobilizada foi lavada quatro ve-zes (4X) com tampão THST (300 fiL/cavidade), revertendo a placa após asegunda lavagem. Os padrões de calibração (acima) foram adicionados (100ulVcavidade) para duplicata para cavidades na placa, incluindo brancos du-plicatas de tampão THST + 4% de leite seco sem gordura + 12,5% de sorohumano normal (100 (j.L/cavidade), e amostras de controle de qualidade du-plicatas (100 ^.L/cavidade). Amostras testes (100 ^L/cavidade) foram adicio-nadas em duplicatas à cavidades de placa restantes.

A placa foi coberta com filme de selagem e incubada sobre umagitador de placa por 2 horas +/-10 minutos em temperatura ambiente. Pararemoção de proteína não-ligada, a placa foi lavada quatro vezes (4X) comtampão THST (300 uL/cavidade), revertendo a placa após a segunda lava-gem.

Solução de IgG-HRP anti-humana de camundongo (100uL/cavidade) (Southern Biotechnology Associates, Inc.) foi adicionada emuma diluição de trabalho determinada para cada batelada. Por exemplo, umadiluição de 1:60 000 deste agente de detecção em THST foi ótima para umlote de IgG-HRP anti-humana. A placa foi incubada sobre um agitador deplaca em temperatura ambiente por 1 hora +/- 10 minutos e então lavadaquatro vezes (4X) com tampão THST (300 ^L/cavidade), revertendo a placaapós a segunda lavagem.

Para detectar agente de detecção imobilizado, solução substratode 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (100 ^L/cavidade) (BioFX Laboratori-es) foi adicionada a cada uma das cavidades de placa. A placa foi incubadano escuro em temperatura ambiente por aproximadamente 9-12 minutos, eentão ácido sulfúrico 0,18 M (100 |iL / cavidade) foi adicionado a cada umadas cavidades de placa na mesma ordem como a adição de substrato. Den-sidade ótica foi lida em um comprimento de onda de 450 nm.

Concentrações de amostra teste e controle de qualidade foramdeterminadas por interpolação a partir da curva padrão que é adaptada comfunção logística de 4-parâmetros usando o Drug Metabolism Laboratory In-formation Management System (Watson), version 7.0.1. Concentrações deamostras são determinadas usando a seguinte função:

<formula>formula see original document page 66</formula>

onde y = sinal (OD); x = concentração; a = sinal em concentra-ção zero; d = sinal em concentração infinita; c = concentração resultante emsinal em aproximadamente ponto médio entre a e d; b = inclinação em, ouao redor de c. Dados exemplares de titulação de calibração e controle dequalidade são providos na Tabela 1. Nestes dados concentrações de amos-tra foram calculadas com: y = 1,827 para média de alta Q1,2; x = 67,8186; a= 0,101805; d = 3,74133; c = 72,8445; b = 1,45512.

Fatores de diluição foram alimentados para determinação deconcentração final nas amostras testes. A variabilidade (CV) dos padrões decalibração foi menos que ou igual a 7,5% sobre a faixa de 7,90-90,0 ng/mLem soro humano 12,5%, mostrando análise qantitativa de níveis de MYO-029 exógeno entre cerca de 720 e 60 ng/mL em soro humano 100%.

Para amostras de soro não-humano, incluindo amostras de sorode camundongo, rato, macaco, e coelho, o ensaio foi realizado com menoresmodificações. Estes dados demonstraram a sensitividade e especificidadedo ensaio imune para MYO-029 em múltiplas matrizes de fundo. Níveis dediluição de soro capazes de serviço para ser humano, camundongo, rato,macaco e coelho foram determinados serem pelo menos 1:8, 1:4, 1:4, 1:8, e1:4, respectivamente.Tabela 1

<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table>Exemplo 2

Linearidade de Diluição: A linearidade de diluição do processofoi avaliada através de análise de uma amostra de soro humano spikedMYO-029 em 11 diluições diferentes. A amostra de 54000 ng/mL foi inicial-mente diluída 1:8 em tampão THST + 4% de leite seco sem gordura seguidopor uma série de diluições (1:2) em tampão THST + 4% de leite seco semgordura + 12,5% de soro humano. As diluições foram pretendidas estaremacima, dentro, e abaixo da faixa de ensaio. Os vieses para diluições foramdeterminados, com os vieses das amostras que caem dentro da faixa quanti-tativa do ensaio variando de -9,7% a -0,4%. Uma tendência nos vieses nãofoi observada. As concentrações observadas diminuíram como esperado, enão houve evidência de um efeito prozona.

Especificidade: potencial interferência não-específica a partir dematriz de amostra (ou efeito matriz) foi investigado por meio de um experi-mento de dopagem / recuperação usando 10 diferentes lotes de soro huma-no (doadores individuais) nas concentrações dopadas de 540 ng/mL. Interfe-rência de miostatina endógena (GDF-8) foi avaliada por formação de pico deGDF-8 em 0, 1,2, 10, e 1000 ng/mL em amostras de validação contendoMYO-029 (132, 265, e 529 ng/mL). Níveis de GDF-8 endógenos são pensa-dos serem menos que 1 ng/mL. Os resultados para as amostras de soro in-dividuais com e sem formação de pico de MYO-029 são mostradas na Tabe-la 2. Nas concentrações dopadas de 540 ng/mL, 9 dos 10 soros tiveramconcentrações médias observadas dentro de 20% da concentração espera-da. Com nova análise de soros ng 1, o valor estava dentro de 15% da con-centração esperada. Nas concentrações dopadas de 135 ng/mL, 8 dos 10soros tiveram concentrações médias observadas dentro de 20% da concen-tração esperada. Com nova análise dos soros ne 3, o valor estava dentro de15% da concentração esperada. A alta porcentagem de viés para soros nQ 1foi confirmada com nova análise onde o valor foi ainda maior que 20% daconcentração esperada. Sem a adição de MYO-029, todos os 10 soros tive-ram concentrações observadas de MYO-029 de menos que o limite inferiorde quantificação (isto é, menos que 63,2 ng/mL em soro humano 100%). Osdados indicam uma ausência de um significante efeito matriz.

Tabela 2 Efeito Matriz Para A Quantificação De MYO-029 em Soro Humano 100%

<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table>

Ainda, os resultados da recuperação de MYO-029 na presençade GDF-8 foram corridos em duplicata e quantificados. Nenhum efeito sobrea habilidade do ELISA para detectar MYO-029 foi observado quando qual-quer uma das amostras de MYO-029 foi co-incubada com GDF-8 em 0, 1, 2,ou 10 ng/mL. As concentrações observadas estavam dentro de 20% dosvalores esperados. Quando amostras de MYO-029 foram co-incubadas comGDF-8 em 1000 ng/mL, as concentrações observadas de MYO-029 foram <40% (viés) da concentração esperada. Entretanto, uma vez que GDF-8 podeestar presente em <1 ng/mL, os dados sugerem que GDF-8 circulante nãodeve comprometer a sensitividade do ensaio. Em um experimento no qual 2mg/kg de MYO-029 foram administrados subcutaneamente em ratos, MYO-029 foi detectado e quantificado como se segue:Tabela 3: Detecção de MYO-029 Após Administração

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Neste experimento os seguintes parâmetros de curva foram obtidos: Min. = 0,117195; Max. = 3,73079; Inclinação = 1,53126; Ed50 = 58, 7133; e quadrado-R = 9988.Exemplo 4

GDF-8 foi biotinilada como se segue. GDF-8 de inteiro comprimento foi expressa em um processo de biorreator de cultura de célula CHO de batelada alimentada, provendo a forma de complexo latente de GDF-8. A cultura de células colhida foi clarificada usando filtração microporosa de fluxo normal e então concentrada e diafiltrada usando ultrafiltração de fluxo tan-gencial. Esta reunião de retidos foi então carregada sobre cromatografia de afinidade de metal imobilizado Ni2+-NTA (IMAC) onde o complexo de GDF-8 é capturado. Eluição ocorreu com um gradiente linear de Na2HP04 50 mM, NaCI 300 mM, imidazol 20-500 mM sobre volumes de 5 colunas. O pico resultante então sofreu diálise por meio de troca de tampão para permitir remoção de imidazol derivado de IMAC e para colocar um apropriado tampão no local para a reação de biotinilação.

A preparação de complexo de látex foi então biotinilada. Uma razão molar alvo de sulfo-NHS-LC-biotina para complexo de GDF-8 de 14:1 foi usada na reação. Razões de reagente para substrato de 10:1, 15:1, e 20:1 também foram testadas, por exemplo. Reagente biotina sólido (EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin, Pierce Biotechnology) foi dissolvido em sulfóxido de dime-tila (DMSO) em 200 g/L antes de ser adicionado à amostra de complexo de GDF-8. A reação é realizada com uma concentração de complexo de GDF-8 de menos que 1,5 g/L em Na2HP04 100 mM, NaCI 150 mM, pH 7,2, a 4°C, por 120 minutos. A mistura de reação foi suavemente misturada no início da reação e protegida da luz durante o curso da reação. A reação foi interrompida pela adição de etanol amina 0,5% (v/v) ou Tris 1000 mM 5,0% (v/v).

Este complexo de GDF-8 biotinilada foi então trocada com tampão por meio de diálise em um tampão de alta concentração caotrópica, baixo pH (uréia 6000 mM, NaCI 300 mM, H3P04 50 mM, pH = 2,5). Dissociação do complexo ocorre com protonação em pH baixo. Neste tampão, o complexo dissocia e solubiliza nos pró-peptídeos e dímeros maduros. Também, biotina livre é removida durante a diálise. Essa reunião de retentados foi então carregada em cromatografia de exclusão de tamanho de alta performance, onde a forma de dímero maduro de GDF-8 é separada dos propeptídeos edo monômero residual.

Essa porção contendo a forma de dímero maduro, biotinilado, de GDF-8 foi então ainda processada em cromatografia de fase reversa, de alta performance, de butila, usando 0-90% (v/v) de CH3CN, 0,1% (v/v) de CF3C02H, pH = 2,0, gradiente linear, em 5 volumes de coluna. O pico dessa primeira etapa foi trocado com tampão, via diálise, em um tampão de formulação de baixo pH (0,1% (v/v) de CF3C02H, pH = 2,0).

O dímero GDF-8, maduro, biotinilado, foi avaliado quanto à retenção de função, por exemplo, sua atividade em ligação e ensaios de gene repórter. A proteína de GDF-8, maduro, biotinilado, foi também medida por cromatografia líquida de alta performance de fase reversa/espectrométria de massa de tempo de vôo quádruplo com ionização por eletrospray (RP-HPLC/ESI-QTOF-MS), e a preparação continha uma mistura de razões mo-lares de aproximadamente 0-3, com a maior parte das moléculas estando em 1:1. Razões molares alvo mais alta têm rendido medições tão altas quanto 9:1, por ajuste das condições bem-conhecidas da técnica.

MYO-029 é biotinilado usando um ensaio similar, e pode ser u-sado nos métodos descritos aqui. Essencialmente, MYO-029 isolado é diluído, trocado com tampão, e então biotinilado. As condições de reação e de armazenagem são as mesmas que para GDF-8, exceto por um poucos parâmetros. O valor de concentração de MYO-029 varia de 10-24 g/L. Uma razão molar de sulfo-NHS-LC-biotina alvo (Pierce) para MYO-029 na reação de biotinilação é de 40:1, que rende uma razão molar medida de 8-11. Isso é medido por ensaio de espectrometria A6oo nm com avidina: HABA (Immuno-Pure Avidin and HABA, Pierce). Usando diálise, esse reagente é então trocado com tampão em um tampão de formulação de pH neutro, com baixo teor de sal (NaCI 137 mM, KCI 1mM, Na2HP04 8mM, KH2P04 3mM pH = 7,2).

Exemplo 4

Em uma modalidade dos métodos fornecidos aqui, um agente modulador de GDF-8 é detectado com ELISA de ligação competitiva. Nesse ensaio, agentes que bloqueiam a ligação de GDF-8 para ActRIlB (um outroparceiro de ligação de GDF-8, tal como receptor de GDF-8) são identificados e quantificados. Esse ensaio inclui as etapas de contatar um parceiro de ligação de GDF-8 como um agente de captura a uma superfície, adicionar GDF-8 em presença e ausência de uma amostra biológica, e detectar a formação de complexo.

Em uma modalidade particular, o complexo latente de GDF é biotinilado em uma razão de 20 mmols de Ez-link-NHS-Biotin (Pierce) para 1 mol do GDF-8 por 2 horas em gelo. A reação é terminada por redução do pH usando TFA a 0,5% e o complexo é submetido à cromatografia em uma coluna (Phenomenex) C4 Júpiter de 250 x 4,6 mm para separar GDF-8 maduro de propeptídeo de GDF-8. Frações de GDF-8 maduro, biotinilado, eluídas com um gradiente de TFA/CH3CN são reunidas, concentradas e quantificadas por Kit de Reagente para Ensaio de proteína MicroBCA (Pierce).

A quimera ActRIlB-Fc recombinante (R&D Systems) é revestida em placas de ensaio, de fundo plano, de 96 poços (Costar) em 1 fig/mL em tampão de carbonato de sódio 0,2M, durante a noite, a 4°C. As placas foram então bloqueadas com 1 mg/mL de albumina sérica bovina e lavadas de a-cordo com o protocolo ELISA padrão. Alíquotas de 100 [iL de GDF-8 biotinilado em várias concentrações (tal como 10 ng/mL) com ou sem um inibidor de GDF-8 (tal como em concentrações variando de 10"11M a 10"7M) podem ser adicionadas à placa ELISA bloqueada, incubadas por 1 hora, lavadas, e a quantidade de GDF-8 ligado detectada por estreptavidina-raiz forte peroxi-dase (SA-HRP, BD PharMingen) seguida por adição de TMB (KPL, Gai-thersburG, MD, Cat. N° 50-76-04). Medições colorimétricas podem ser realizadas em 450 nm em uma leitora de microplaca. Exemplo 5 Ensaio de Gene Repórter

Um agente modulador de GDF-8 é detectado em um ensaio de gene repórter (RGA) com base em célula para atividade biológica de GDF-8.

A linhagem de célula de rabdomiossarcoma humano A204 foi usada, na qual A204 (ATCC HTB-82) foi estavelmente transfectada com uma construção de gene repórter, pGL3(CAGA)i2 (descrita na publicação dos Pedidos de Patente US NQ 2003/0138422 A1 e US NQ 2004/0142383 A1)usando técnicas bem-conhecidas. Alternativamente, células A204 são tran-sientemente transfectadas com pGL3(CAGA)i2 usando o reagente de trans-fecção FuGENE.TM 6 (Boehringer Manheim, Alemanha). Depois da trans-fecção, as células foram cultivadas em placas de 98 poços em meio de Mc-Coy 5A suplementado com glutamina 2mM, estreptomicina 100 U/mL, 100 |ig/ml_ de penicilina e 10% de soro de bezerro fetal por 16 horas. As células foram tratadas com ou sem uma quantidade constante de proteína de GDF-8 maduro (75 ng/mL) e uma série de diluições de controle positivo em meios de McCoy 5A com glutamina, estreptomicina, penicilina, e 10% de soro de bezerro fetal por 6 h, a 37°C, para controles. Opcionalmente, uma quantidade de GDF-8 é selecionada a qual proporciona aproximadamente 80% do sinal máximo de luciferase. MYO-029 foi pré-incubado com o GDF-8, por 1 hora, à temperatura ambiente, e então as proteínas são adicionadas ao RGA. MYO-029 foi ensaiado em concentrações variando de 0,1 pM a 10 nM para gerar uma titulação de controle positivo do agente modulador de GDF-8. A luciferase foi quantificada nas células tratadas usando o Sistema de Ensaio de Luciferase (Promega). Nesse ensaio, 75 ng/mL de GDF-8 proporciona 89% de ativação enquanto 400 ng/mL de MYO-029 proporciona 80% de inibição da construção do gene repórter.

Em reações paralelas, as células são tratadas com e sem 75 ng/mL de proteína de GDF-8 maduro e com e sem amostras biológicas de teste. Soro humano é obtido de indivíduos que estão se submetendo ao tratamento com MY-029, e diluído 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, e 1:40 de tampão. Para diluições abaixo de 1:10, o soro da amostra de teste é ainda diluída em um tampão contendo 10% de soro humano (Bioreclamation, Inc.).

Exemplo 6: Anticorpos para MYO-029

Anticorpos neutralizadores para MYO-029, incluindo anticorpos para o sítio de ligação de antígeno de MYO-029, foram desenvolvidos como a seguir: Coelhos foram imunizados com ou MYO-029 intacto ou fragmento de proteína de MYO-029 compreendendo o sítio de ligação de MYO-029. A digestão da protease foi realizada para remover a porção de Fc do anticorpo de MYO-029 de modo a evitar a produção de uma forte resposta imune nocoelho à região constante deste anticorpo humano. Dois coelhos foram imunizados tanto com o MYO-029 intacto, quanto com o digerido. Sangrias foram testadas para neutralizar a atividade usando ensaios de ligação de li-gante. Esse procedimento produziu anticorpos neutralizadores. Todos os quatro animais desenvolveram bons resultados de título de anticorpo e um soro de coelho de controle positivo foi produzido reunindo-se as sangrias de todos os quatro animais.

Todas as publicações, patentes, e seqüências biológicas citadas nessa exposição são incorporadas a título de referência em sua totalidade. Na medida em que o material incorporado, a título de referência, está em contradição ou está inconsistente com o presente relatório descritivo, o presente relatório descritivo substitui qualquer de tal material. A citação de quaisquer referências aqui não significa que tais referências sejam técnicas anteriores para a presente invenção.

A menos que de outro modo indicado, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, cultura de células, condições de tratamento, e assim por diante usados no relatório descrito, inclusive nas reivindicações, são para serem entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Por conseguinte, a menos que de outro modo indicado ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadas as quais a presente invenção procura obter. A menos que de outro modo indicado, o termo "pelo menos" que precede uma série de elementos é para ser entendido como referindo-se a cada elemento na série. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes, usando não mais que experimentação de rotina, de verificarem muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. Tais equivalentes devem ser englobados pelas seguintes reivindicações.

As modalidades dentro do relatório descritivo proporcionam uma ilustração da invenção e não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da invenção. O técnico especializado reconhece que muitas outras modalidades são englobadas pela invenção. Outras modalidades da inven-ção tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir de consideração ao relatório descritivo e prática da invenção mostrada aqui. Pretende-se que o relatório descritivo e exemplos sejam considerados apenas como exemplificativos, com o verdadeiro escopo e espírito da invenção sendo indicados pelas seguintes reivindicações.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Wyeth

<120> DETECÇÃO DE AGENTES MODULADORES DE GDF-8

<130> 08702.0149-00304

<150> 60/664,400 <151> 2005-03-23

<160> 20

<170> Patenteln versão 3.1

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Vai Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie 20 25 30

lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45

Phe Vai Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Vai His Gln Ala 50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80

Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln lie lie Tyr Gly 85 90 95

Lys lie Pro Ala Met Vai Vai Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105

<210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Humano

<400> 2

Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Vai Tyr lie Tyr Leu Phe Met Leu lie 15 10 15

Vai Ala Gly Pro Vai Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30

Vai Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45

Lys Ser Ser Arg lie Glu Ala lie Lys lie Gln lie Leu Ser Lys Leu 50 55 60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn lie Ser Lys Asp Vai lie Arg Gln Leu 65 70 "75 80

Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu lie Asp Gln Tyr Asp Vai 85 90 95

Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110

Ala Thr Thr Glu Thr lie lie Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125

Met Gln Vai Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140

Lys lie Gln Tyr Asn Lys Vai Vai Lys Ala Gln Leu Trp lie Tyr Leu 145 " 150 155 " 160

Arg Pro Vai Glu Thr Pro Thr Thr Vai Phe Vai Gln lie Leu Arg Leu 165 170 175

lie Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly lie Arg Ser Leu 180 185 190

Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly lie Trp Gln Ser lie Asp Vai 195 200 205

Lys Thr Vai Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220

lie Glu lie Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Vai Thr 225 230 " 235 240

Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Vai Lys 245 250 255

Vai Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270

Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai 275 280 285

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320

Tyr Pro His Thr His Leu Vai His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr 340 345 350

Phe Asn Gly Lys Glu Gln lie lie Tyr Gly Lys lie Pro Ala Met Vai 355 360 365

Vai Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag tcctgcaagg catctggata caccttcacc cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg atggagctga gcagcctgag atctgaggac aactgggggt tcgacccctg gggccaggga ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ccaccctcag tgtccgtgtc tccaggacag ctgggggaca aatttgtttc ctggtatcag atctatgacg atacccagcg gccctcaggg gggaacacag ccactctgac catcagcggg tgtcaggcgt gggacagcag cttcgtattc gcggccgcac atcatcatca ccatcac

<210> 4

<211> 249

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Vai 130 135 140

Ser Vai Ser Pro Gly Gln Thr Ala Thr He Thr Cys Ser Gly His Ala 145 150 155 160

gtgaagaagc ctggggcctc agctactata tgcactgggt atcaacccta gtggtggtag accagggaca cgtccacgag acggccgtgt attactgtgc accctggtca ccgtctcgag ggaagtgcac tttcctatga acagccacca ttacctgctc cagggatcag gccagtcccc atccctgggc gattctctgg acccaggcta tggatgaggc ggcggaggga ccaaggtcac

agtgaaggtt 60

gcgacaggcc 120

cacaagctac 180

caçagtctac 240

gagagacgag 300

tggaggcggc 360

gctgactcag 420

tggacatgca 480

tgtattggtc 540

ctccaactct 600

tgactatttt 660

cgtcctaggt 720 747

Leu Gly Asp Lys Phe Vai Ser Trp Tyr Gln Gln Gly Ser Gly Gln Ser 165 170 175Pro Vai Leu Vai lie Tyr Asp Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly lie Pro 180 185 190

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie 195 200 205

Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp 210 215 220

Asp Ser Ser Phe Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu Gly 225 230 235 240

Ala Ala Ala His His His His His His 245

<211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 5

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc "agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300

aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t 351

<210> 6

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Glv Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 " 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115<210> 7

<211> 315

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccaccatt 60

acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gggatcaggc 120

cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgggcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg actatttttg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc 300

aaggtcaccg tccta 315

<210> 8

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Vai Ser 1 5 10

Vai Ser Pro Gly Gln 15

Thr Ala Thr lie Thr Cys Ser Gly Kis Ala Leu 20 25

Gly Asp Lys Phe Vai 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Gly Ser Gly Gln Ser Pro 35 40

Vai Leu Vai lie Tyr 45

Asp Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly lie Pro Gly 50 55

Arg Phe Ser Gly Ser 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Gly Thr Gln Ala Met 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp Asp 85 90

Ser Ser Phe Vai Phe 95

Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu 100 105

<210> 9

<211> 747

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

caggtgcagc tcctgcaagg cctggacaag gcacagaagt atggagctga aactgggggt ggttcaggcg ccaccctcag ctgggggaca atctatgacg gggaacacag tgtcaggcgt

tggtgcaatc catctggata ggcttgagtg tccagggcag gcagcctgag tcgacccctg gaggtggctc tgtccgtgtc aatttgtttc atacccagcg ccactctgac gggacagcag

tggggctgag caccttcacc gatgggaata agtcacc.atg atctgaggac gggccaggga tggcggtggc tccaggacag ctggtatcag gccctcaggg catcagcggg cttcgtattc

gtgaagaagc agctactata atcaacccta accagggaca acggccgtgt accctggtca ggaagtgcac acagccagca cagaagccag atccctgagc acccaggcta ggcggággga

ctggggcctc tgcactgggt gtggtggtag cgtocacgag attactgtgc ccgtctcgag tttcctatga ttacctgctc gccagtcccc gattctctgg tggatgaggc ccaaggtcac

agtgaaggtt gcgacaggcc cacaagctac cacagtctac gagagacgag tggaggcggc gctgactcag tggacatgca tgtattggtc ctccaactct tgactattac cgtcctaggt

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720gcggccgcac atcaccatca ccatcac

<210> 10

<211> 249

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 " 25 30

Tyr Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Vai 130 135 140

Ser Vai Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Ala 145 150 155 160

Leu Gly Asp Lys Phe Vai Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 165 170 175

Pro Vai Leu Vai lie Tyr Asp Asp Thr Gln Arg Pro Ser Gly lie Pro 180 185 190

Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie 195 200 205

Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp 210 215 220

Asp Ser Ser Phe Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Thr Vai Leu Gly 225 230 235 240

Ala Ala Ala His His His His His His 245

<210> 11

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 11

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtág cacaagctac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300

aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t 351

<210> 12

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Gln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Vai Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 13

<211> 315

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccagcatt 60

acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gaagccaggc 120

cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240

gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc 300

aaggtcaccg tccta 315

<210> 14

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Claims (63)

1. Método para detectar um agente modulador de GDF-8 exóge-no em uma amostra biológica, em que o método compreende:(a) adicionar a amostra biológica de um indivíduo a ser testado a um ensaio in vitro para atividade de GDF-8;(b) detectar a modulação da atividade de GDF-8; e(c) comparar a modulação da atividade de GDF-8 em presença da amostra biológica com a modulação da atividade de DGF-8 em presença de uma amostra de controle biológico;detectando, assim, a presença do agente modulador de GDF-8 endógeno na amostra biológica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda quantificar o nível de agente modulador de GDF-8 na amostra biológica por comparação da modulação da atividade de GDF-8 pelo amostra biológica de um indivíduo com uma pluralidade de amostras de controle, cada uma compreendendo uma concentração conhecida do agente modulador de GDF-8.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,em que a amostra biológica compreende uma amostra de um indivíduo a quem um agente modulador de GDF-8 tenha sido ou é suspeito de ter sido administrado.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o indivíduo é um mamífero, pássaro, réptil, ou peixe.

5. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que o indivíduo é um mamífero.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que o mamífero é um ser humano.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que a amostra biológica é escolhida de soro, sangue, plasma, amostra para biópsia, amostra tecidual, suspensão de células, saliva, fluido oral, fluido cerebrospinal, líquido amniótico, leite, colostro, secreção de glândula mamaria, linfa, urina, suor, fluido lacrimal, fluido gástrico, fluido sinovial e muco.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que a amostrabiológica é selecionada de soro, sangue, e plasma.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente modulador de GDF-8 é um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína GDF-8.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que o agentemodulador GDF-8 é MYO-029.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o ensaio in vitro é um imunoensaio.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o imunoensaio compreende:(a) contatar a proteína GDF-8 com uma superfície de um vaso de reação, em que a proteína GDF-8 é um dímero de proteína de GDF-8 maduro;(b) adicionar a amostra biológica ao vaso de reação; (c) adicionar um agente de detecção; e(d) detectar um complexo de agente modulador de GDF-8/proteína de GDF-8 associado à superfície do vaso de reação.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, em que a proteína GDF-8 compreende uma porção biotina e contata a superfície por meio da porção biotina.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que a razão molar de porção biotina para proteína GDF-8 é menor que cerca de 5:1, e em que o dímero de GDF-8 maduro é biotinilado como parte de um complexo de GDF-8 latente.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a razãomolar de porção biotina para proteína GDF-8 está entre 0,5:1 e cerca de 4:1.

16. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que a avidina ou estreptavidina é adsorvida na superfície do vaso de reação antes da adição da proteína de GDF-8.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o imunoensaio compreende:(a) contatar um receptor de GDF-8 solúvel com uma superfíciede um vaso de reação;(b) adicionar a amostra biológica ao vaso de reação;(c) adicionar uma proteína de GDF-8 rotulada ao vaso de reação; e(d) detectar a quantidade de complexo de proteína de GDF-8rotulada/receptor de GDF-8 associado à superfície em presença e ausência da amostra biológica,em que uma redução da quantidade do complexo de proteína GDF-8 rotulada/receptor de GDF-8 em presença da amostra biológica detecta um agente modulador de GDF-8 exógeno na amostra biológica.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, que compreende ainda a etapa de incubar a amostra biológica coma proteína GDF-8 rotulada antes de adicionar a amostra ao vaso de reação.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que a proteína GDF-8 rotulada compreende uma porção biotina.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que a razão molar de porção biotina para a proteína GDF-8 é menor que cerca de 5:1.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que a razão molar de porção biotina para proteína GDF-8 está entre cerca de 0,5:1 e cerca de 4:1.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o ensaio in vitro é uma ensaio de gene repórter com base em célula.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, que compreende ainda:(a) proporcionar uma célula hospedeira que compreende uma construção de gene repórter em um vaso de reação, em que a construção compreende um elemento de controle responsivo e um gene repórter;(b) adicionar a amostra biológica ao vaso de reação; e(c) detectar a expressão de gene repórter na célula em presença e ausência da amostra biológica,detectando assim um agente modulador de GDF-8 exógeno.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, compreendendoainda um substrato que altera cor, luminescência, ou fluorescencia em presença do gene repórter.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente modulador de GDF-8 é selecionado de:(a) um anticorpo que especificamente se liga ao GDF-8;(b) um anticorpo que especificamente se liga a um parceiro de ligação de GDF-8;(c) um receptor de GDF-8;(d) uma proteína ActRIlB;(e) uma proteína contendo domínio de folistatina;(f) uma proteína folistatina;(g) uma proteína de GASP-i;(h) uma proteína de GDF-8;(i) um propeptídeo de GDF-8; (j) um inibidor não protéico; e(k) uma pequena molécula.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que o agente modulador de GDF-8 é um anticorpo que se liga especificamente a GDF-8.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que o agente modulador de GDF-8 é MYO-029.

28. Método para detectar um agente modulador de GDF-8 em uma amostra biológica, em que o método compreende:(a) contatar uma proteína de GDF-8 maduro com uma superfície de um vaso de reação; (b) adicionar uma amostra biológica ao vaso de reação;(c) adicionar um agente de detecção ao vaso de reação;(d) detectar um complexo de agente modulador de GDF-8/proteína de GDF-8 associado à superfície do vaso de reação, detectando assim o agente modulador de GDF-8 na amostra biológica.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a proteína de GDF-8 maduro compreende uma porção biotina e contata a superfície por meio da porção biotina.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que a razão molar de porção biotina para proteína GDF-8 é menor que cerca de 5:1.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que a razão molar de porção biotina para proteína de GDF-8 maduro está entre cerca de 0,5:1 e cerca de 4:1.

32. Método, de acordo com a reivindicação 29, em que avidina ou estreptavidina é adsorvida na superfície do vaso de reação antes da adição da proteína de GDF-8.

33. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que o agente modulador de GDF-8 é um anticorpo que se liga especificamente ao GDF-8.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, em que o anticorpo é MYO-029.

36. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que o agente de detecção é selecionado de um anticorpo que se liga especificamente ao agente modulador de GDF-8 e uma proteína de GDF-8 rotulada.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, em que o agente de detecção é um anticorpo que se liga especificamente à região constante de uma imunoglobulina.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, em que a imunoglobulina é uma imunoglobulina humana.

39. Método, de acordo com a reivindicação 28, que compreende ainda quantificar o nível do agente modulador de GDF-8 na amostra biológica por comparação da modulação da atividade de GDF-8 pela amostra biológica de teste a uma pluralidade de amostras de controle, cada uma compreendendo uma concentração conhecida do agente modulador de GDF-8.

40. Método, de acordo com a reivindicação 28, que compreende ainda identificar o agente modulador de GDF-8 exógeno.

41. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a amostra biológica compreende uma amostra de um indivíduo a quem um agente modulador de GDF-8 tem sido ou é suspeito de ter sido administrado.

42. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a amostra biológica é de um mamífero, pássaro, réptil, ou peixe.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, em que a amostra biológica é de um mamífero.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que o mamífero é um ser humano.

45. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a amostra biológica é selecionada de soro, sangue, plasma, amostra para biópsia, amostra tecidual, suspensão de células, saliva, fluido oral, fluido cerebroespinai, líquido amniótico, leite, colostro, secreção de glândula mamaria, linfa, urina, suor, fluido lacrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, e muco.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, em que a amostra biológica é selecionada de soro, sangue, e plasma.

47. Método para detectar um agente modulador de GDF-8 exógeno em uma amostra biológica, em que o método compreende:(a) contatar um agente de captura com uma superfície de um vaso de reação, em que o agente de captura é selecionado de uma proteína GDF-8 e uma proteína que se liga especificamente a uma proteína GDF-8;(b) adicionar a amostra biológica ao vaso de reação;(c) adicionar um agente de detecção ao vaso de reação; e(d) detectar um complexo de agente modulador de GDF-8/agente de captura associado à superfície do vaso de reação, detectando assim um agente modulador de GDF-8 exógeno na amostra biológica.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que o agentede captura é uma proteína de GDF-8 maduro que compreende uma porção biotina.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que a razão molar da porção biotina para proteína de GDF-8 é menor que cerca de 5:1.

50. Método de acordo com a reivindicação 48, em que a razãomolar da porção de biotina para proteína GDF-8 madura está entre cerca de 0,5:1 e cerca de 4:1.

51. Método, de acordo com a reivindicação 47, em que o agente de captura é uma proteína que se liga especificamente a uma proteína de GDF-8 selecionado de:(a) um anticorpo que se liga especificamente a GDF-8;(b) um receptor de GDF-8 solúvel;(c) uma proteína ActRMB;(d) uma proteína contendo um domínio de folistatina;(e) uma proteína folistatina(f) uma proteína de GASP-1; e (h) uma propeptídeo de GDF-8.

52. Método para detectar um agente modulador de GDF-8 em uma amostra biológica, em que o método compreende:(a) contatar um receptor de GDF-8 com uma superfície de pelo menos um primeiro e um segundo vaso de reação;(b) adicionar a amostra biológica e uma proteína de GDF-8 ao primeiro vaso de reação de (a);(c) adicionar uma amostra de controle e uma proteína de GDF-8 ao segundo vaso de reação de (a);(d) adicionar um rotulador detectável aos primeiro e segundo vaso de reação; e(e) comparar o sinal de rotulador detectável no primeiro vaso de reação com o segundo vaso de reação,detectando assim o agente modulador de GDF-8 na amostra biológica.

53. Método para detectar um agente modulador de GDF-8 em uma amostra biológica humana, em que o método compreende:(a) identificar um candidato humano para administração de um agente modulador de GDF-8;(b) proporcionar uma amostra biológica do candidato;(c) adicionar a amostra biológica a um ensaio in vitro para atividade de GDF-8;(d) detectar a modulação da atividade GDF-8; e(e) comparar a modulação da atividade de GDF-8 em presençada amostra biológica de teste do candidato com a modulação da atividade de GDF-8 em presença de uma amostra biológica de controle, detectando assim um agente modulador de GDF-8 exógeno.

54. Método para detectar MYO-029 em uma amostra biológica, que compreende:(a) contatar um dimero de proteína de GDF-8 maduro, biotinila-do, com uma superfície de um vaso de reação, em que a proteína de GDF-8 compreende uma razão média de biotina para dimero de GDF-8 de menos que 5:1;(b) adicionar a amostra biológica ao vaso de reação;(c) adicionar um anticorpo rotulado que se liga especificamente a uma imunoglobulina humana ao vaso de reação; e(d) detectar um complexo de MYO-029/proteína de GDF-8 bioti-nilado associado à superfície do vaso de reação,detectando assim um MYO-029 na amostra biológica.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que o rotulador é selecionado de uma enzima, um rotulador de epitopo, um radiorotula-dor, um corante, um rotulador fluorescente, e um rotulador luminescente.

56. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que a razão de biotina para dimero de GDF-8 é de cerca de 0,5:1 a 4:1.

57. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que a amostra biológica compreende uma amostra de um indivíduo a quem um agente modulador de GDF-8 tenha sido ou é suspeito de ter sido administrado.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, em que o indivíduo é um mamífero, pássaro, réptil, ou peixe.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, em que o indivíduo é um mamífero.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, em que o mamífero é um ser humano.

61. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que a amostra biológica é selecionada de soro, sangue, plasma, amostra para biópsia, amostra tecidual, suspensão de células, saliva, fluido oral, fluido cerebroes-pinai, líquido amniótico, leite, colostro, secreção de glândula mamaria, linfa, urina, suor, fluido lacrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, e muco.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, em que a amostra biológica é selecionada de soro, sangue, e plasma.

63. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que o anticorpo rotulado se liga especificamente à região constante de uma imunoglo-bulina humana.