ITMI20110535A1 - Sistema di analisi per l'analisi chimica quantitativa di campioni, in particolare in ambito medico, con calibrazione della risposta strumentale della strumentazione utilizzata per rilevare i dati quantitativi degli analiti presenti nei campioni anali - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“SISTEMA DI ANALISI PER L’ANALISI CHIMICA QUANTITATIVA DI CAMPIONI, IN PARTICOLARE IN AMBITO MEDICO, CON CALIBRAZIONE DELLA RISPOSTA STRUMENTALE DELLA STRUMENTAZIONE UTILIZZATA PER RILEVARE I DATI QUANTITATIVI DEGLI ANALITI PRESENTI NEI CAMPIONI ANALIZZATI, E CORRISPONDENTE METODOâ€

Campo dell’invenzione

La presente invenzione riguarda in generale il campo dei sistemi e delle apparecchiature per l’analisi chimica quantitativa di campioni, tipicamente ma non esclusivamente in ambito medico, e più da vicino essa si riferisce a un sistema di analisi, per l’analisi chimica quantitativa di campioni, che si caratterizza per un nuovo e vantaggioso sistema di calibrazione per calibrare la risposta strumentale della specifica strumentazione o apparecchiatura che à ̈ utilizzata, nell’ambito del sistema di analisi, per rilevare le quantità degli analiti di interesse presenti nei vari campioni analizzati.

L’invenzione riguarda anche un corrispondente metodo per l’analisi quantitativa di campioni, in particolare in ambito medico, con calibrazione della risposta strumentale della specifica strumentazione o apparecchiatura utilizzata per rilevare i dati quantitativi degli analiti di interesse presenti nei vari campioni analizzati.

Sfondo dell’invenzione e stato della tecnica nota

Come à ̈ noto, la moderna chimica analitica, nella sua applicazione pratica, richiede in modo sempre più intensivo l’analisi quantitativa di sostanze e composti, organici ed inorganici.

In questo contesto, la tecnica attuale, come appare anche dalla letteratura tecnica e scientifica e dall’informazione brevettuale concernente lo specifico settore della chimica analitica quantitativa, offre una ampia varietà di sistemi, procedimenti, e soluzioni, a loro volta basati su diverse tecnologie e sull’impiego di differenti tipi di strumenti e apparecchiature, per l’analisi quantitativa di sostanze, molecole e composti, organici e inorganici, di varia natura e tipologia, presenti in campioni da analizzare.

Al riguardo, si citano ad esempio le seguenti pubblicazioni:

- Cristoni S. et al. Mass Spectrom Rev. 2003 Nov-Dec;22(6):

369-406;

- Mass Spectrom Rev. 2007 Sep-Oct;26(5):645-56.

Comunque, indipendentemente dalla strumentazione e dalle specifiche apparecchiature che sono materialmente utilizzate per rilevare il dato quantitativo, ovvero la quantità degli analiti di interesse presenti nel campione o nei vari campioni analizzati, i diversi procedimenti e sistemi, al momento noti, per eseguire queste analisi quantitative presentano alcune fasi, caratteristiche ed elementi in comune.

In particolare, un’operazione essenziale, che à ̈ praticamente presente e condivisa da tutti i sistemi e procedimenti noti per l’analisi quantitativa degli analiti presenti in un campione, à ̈ ravvisabile in una preliminare calibrazione della risposta strumentale della strumentazione e delle apparecchiature che sono effettivamente utilizzate per rilevare le quantità degli analiti nei campioni analizzati.

Inoltre un altro punto comune ai sistemi, attualmente noti, di analisi chimica quantitativa risiede nel fatto che questa preliminare calibrazione strumentale à ̈ usualmente realizzata tramite l’uso di composti di interesse noti, ovvero di standard analitici commerciali, disponibili nel commercio, costituiti da sostanze e/o composti che riproducono e contengono in concentrazione e composizione nota gli analiti di interesse presenti nel campione da analizzare quantitativamente.

Questa calibrazione si rende di fatto necessaria in quanto le risposte strumentali delle apparecchiature e della strumentazione utilizzate in queste analisi quantitative possono variare da macchina a macchina, anche quando le macchine sono accomunate da marca e modello provenienti dalla stessa casa produttrice.

In altre parole à ̈ opportuno e spesso necessario uniformare e calibrare la risposta della specifica strumentazione utilizzata, mediante l'ausilio degli standard analitici commerciali prima menzionati, in modo da ottenere dei dati quantitativi, relativi agli analiti presenti nel campione, che siano il più possibile precisi ed affidabili.

Questa calibrazione può essere realizzata in vari modi e sistemi ed ha per l’appunto lo scopo, come si à ̈ soliti dire in questo campo, di “calibrare†la risposta strumentale della strumentazione che sarà utilizzata per l’analisi quantitativa del campione.

Ad esempio, il sistema di calibrazione, dopo avere rilevato su questi standard analitici commerciali, tramite una apposita strumentazione di rilevazione, una serie di dati quantitativi relativi all’analita contenuto nello standard commerciale, costruisce a partire da questi dati una curva di calibrazione, riportando in un diagramma i valori noti della concentrazione dell’analita sull'asse delle ascisse e quelli dell’intensità del corrispondente segnale emesso dalla strumentazione di rilevazione sull’asse delle ordinate.

In particolare, il campo di variazione della concentrazione dell’analita presente in questi standard o composti di interesse, utilizzati in questa fase di calibrazione, à ̈ scelto in modo che vi sia una relazione lineare tra l’intensità del segnale di risposta della strumentazione e la concentrazione dello stesso analita.

Quindi la quantità esatta dell’analita o degli analiti di interesse, aventi una concentrazione ignota, contenuti nel campione di riferimento o matrice, viene determinata analizzando tramite la strumentazione il campione ed estrapolando i valori di concentrazione dell’analita presenti nel campione da quelli dell’intensità del corrispondente segnale emesso dalla strumentazione, utilizzando la retta di calibrazione precedentemente costruita, che correla le due grandezze.

Più precisamente, sono stati sviluppati diversi metodi e varianti, riassumibili nelle seguenti due categorie A e B, per la calibrazione strumentale della risposta della specifica strumentazione che à ̈ utilizzata per rilevare le quantità degli analiti presenti nel campione.

A. Metodo delle aggiunte successive

Questo metodo prevede l’analisi diretta di un campione Y, a sua volta tipicamente costituito da una soluzione contenente il composto o analita di interesse X con concentrazione incognita [x], e si articola attraverso le seguenti fasi.

All’inizio l'analizzatore rileva per l’analita X un segnale, di intensità Ix, che viene riportato in ordinata su un grafico CS (Concentrazione vs. Segnale), e convenzionalmente accoppiato, in ascissa, con un valore della concentrazione [x] dell’analita X pari a zero, cioà ̈ [x]=0.

Quindi, al fine di ottenere l’analisi quantitativa della soluzione iniziale Y, si aggiungono ad essa quantità note e crescenti di uno standard commerciale dell’analita X ed ad ogni aggiunta si esegue un’analisi specifica, ovvero si rileva l’intensità del corrispondente segnale.

Si riportano quindi nel grafico CS i vari valori delle concentrazioni delle aggiunte e i valori delle intensità dei corrispondenti segnali, risultati dall’analisi.

A questo punto ci si assicura, osservando il grafico risultante, che la risposta dell’analizzatore sia lineare, e in caso affermativo si esegue un’interpolazione lineare dei punti indicati sul grafico in modo da ricavare la concentrazione dell’analita di interesse X nel campione Y dal punto di intersezione della retta così ottenuta con l'asse delle ascisse.

Lo svantaggio principale di questo primo metodo ed approccio à ̈ un elevato errore del dato quantitativo ottenuto, che rende questo metodo non consigliabile in molti ambiti analitici, quali ad esempio quello delle analisi clinico diagnostiche, forensi, quantitative di farmaci, pesticidi e di altri composti, tenendo anche presente che l’elenco non à ̈ esaustivo.

B. Metodo delle diluizioni isotopiche

Questo metodo à ̈ utilizzato prevalentemente nel settore delle analisi quantitative che utilizzano la spettrometria di massa e si articola nel modo seguente.

Inizialmente si aggiunge alla soluzione del campione da analizzare un composto o standard commerciale che abbia la stessa formula del composto o analita di interesse, ma che presenti alcuni elementi sostituiti con i relativi isotopi non radioattivi, ovvero con elementi caratterizzati dal medesimo numero atomico Z ma differente numero di massa A (la sostituzione più comune prevede lo scambio di atomi di idrogeno<1>H, con atomi di deuterio

<2>H).

In questo modo si varia il peso molecolare del composto standard.

Inoltre la quantità di composto standard, che à ̈ aggiunta alla soluzione campione, à ̈ stabilita in modo che la sua concentrazione in tale soluzione campione sia certamente superiore a quella dell'analita di interesse.

A questo scopo, si valuta il rapporto fra l’intensità dei rispettivi due segnali, considerando che i composti sostituiti forniscono la stessa risposta strumentale di quelli privi di marcatori isotopici, per cui ciò che varia fra di loro à ̈ solamente il rapporto massa-carica m/z.

Pertanto si ottengono due cosiddetti picchi coeluiti, rispettivamente dello standard e dell’analita d’interesse, con il secondo picco certamente inferiore al primo per ampiezza.

Quindi, mettendo in rapporto le due aree, definite da questi due picchi, si ricava un fattore di concentrazione, a partire dal quale si diluisce la soluzione campione fino a quando il segnale dell'analita d’interesse à ̈ pari a quello del composto standard sostituito.

Il verificarsi di questa circostanza, che indica una parità di concentrazioni tra l’analita ed il relativo standard, sarà segnalata dalla comparsa di due picchi identici.

A questo punto il fattore di diluizione, usato per eguagliare i due picchi, moltiplicato per la concentrazione nota dello standard, fornisce la concentrazione reale del composto o analita di interesse nella soluzione campione.

Lo svantaggio principale di questo secondo metodo ed approccio risiede nel fatto che richiede l'ausilio di standard isotopici estremamente costosi, così da limitare l’effettivo utilizzo di questo secondo metodo solo a quei centri che processino abitualmente una grande mole di campioni quali ospedali, centri analitici forensi, laboratori dedicati al controllo qualità ed altri ad essi rapportabili.

Per chiarezza la Fig. 5 schematizza e riassume la situazione attuale, quale prima presentata, ovvero le operazioni ed i numerosi passaggi manuali, attualmente previsti nella tecnica nota, che un operatore deve compiere per preparare il campione da analizzare quantitativamente, calibrare prima dell’analisi di ogni campione la specifica strumentazione che sarà utilizzata per fare l’analisi, ed infine effettuare l’analisi vera e propria del campione tramite la strumentazione, una volta calibrata, così da ottenere i dati quantitativi del campione analizzato.

Un campione Y, contenente un analita di interesse [x], Ã ̈ opportunamente diluito, in una fase preliminare F1, in una soluzione campione Y1 adatta ad essere analizzata quantitativamente.

Sempre in una fase preliminare, la strumentazione, in particolare comprendente uno spettrometro di massa, destinata ad essere usata per analizzare quantitativamente la soluzione campione Y1, à ̈ calibrata impiegando standard commerciali o industriali SI[x], specifici per l’analita di interesse [x], come schematizzato da una fase di calibrazione F2.

Quindi, come schematizzato da una fase F3, la soluzione campione Y1 à ̈ analizzata tramite la strumentazione di analisi, ovvero allo spettrometro di massa, una volta calibrato, che pertanto fornisce all’operatore il risultato dell’analisi, ovvero il dato quantitativo dell’analita di interesse [x] presente nel campione analizzato Y, come schematizzato da una fase finale F4.

In alcuni casi lo standard SI[x] può essere aggiunto alla soluzione campione Y1 al fine di eseguire una cosiddetta calibrazione “in matrice†, come schematizzato da una fase F2’.

È importante notare come la calibrazione dello strumentazione utilizzata per le analisi debba essere ripetuta ogni volta, ovvero debba essere eseguita prima dell’analisi di ogni singolo campione, e questo, come già detto, costituisce un notevole inconveniente che affligge la tecnica nota.

Sommario dell’invenzione

Pertanto, uno scopo primario della presente invenzione à ̈ proporre e realizzare un sistema di analisi per l’analisi quantitativa di campioni, tipicamente ma non esclusivamente in ambito medico, il quale innovi sensibilmente rispetto ai sistemi di analisi attualmente noti ed applicati, ed in particolare sia tale da non richiedere, a differenza dei sistemi noti, durante l’esecuzione delle analisi dei campioni e prima di ognuna di esse, il continuo uso di standard analitici commerciali al fine di calibrare la risposta della strumentazione che à ̈ predisposta nel sistema di analisi per rilevare la quantità degli analiti di interesse presenti nei vari campioni da analizzare.

Il suddetto scopo si può considerare pienamente raggiunti dal sistema per l’analisi chimica quantitativa di campioni e dal corrispondente metodo aventi le caratteristiche definite rispettivamente dalla rivendicazioni indipendenti 1 e 9.

Forme particolari di realizzazione della presente invenzione sono inoltre definite dalle rivendicazioni dipendenti.

Come apparirà chiaramente nel seguito della descrizione, i concetti essenziali e le linee guida che hanno guidato lo sviluppo e sono pertanto alla base del sistema per l’analisi di campioni conforme alla presente invenzione si possono riassumere nel modo seguente.

1) Preparazione iniziale di una matrice o soluzione campione di tipo universale, ovvero di una matrice ottenuta diluendo il campione originale da analizzare in una soluzione di diluizione universale, al fine di standardizzare e rendere riproducibili nel tempo le caratteristiche chimico-fisiche della matrice in modo tale da massimizzare, standardizzare e rendere riproducibile nel tempo anche la risposta strumentale della macchina, strumentazione o apparecchiatura che à ̈ usata per rilevare i dati quantitativi degli analiti presenti nei campioni analizzati.

2) Acquisizione preliminare di un dato strumentale per ogni analita e matrice, utilizzando standard analitici commerciali, al fine di ricavare gli specifici fattori di risposta che legano le varie parti del sistema costituito da analita, matrice e macchina di rilevazione quantitativa dell’analita.

3) Creazione di una speciale base dati, contenente in particolare dati e parametri di calibrazione destinati ad essere usati, nel corso delle analisi di più campioni, sia per elaborare i dati acquisiti dal sistema di analisi e sia per calibrare con precisione il segnale ovvero la risposta strumentale della specifica apparecchiatura di rilevazione che à ̈ utilizzata per rilevare gli analiti di interesse nei campioni analizzati, per cui questa base dati fa sì che non si debba più ricorrere al continuo e costoso ausilio di standard commerciali per calibrare l’apparecchiatura di rilevazione.

A questo riguardo, si sottolinea che, nello stato attuale della tecnica, non esiste un’apparecchiatura o sistema per l’analisi chimica quantitativa di campioni che si interfacci con un base dati per estrarre da essa dati utili ai fini della quantificazione assoluta molecolare dell’analita o degli analiti presenti nei campioni da analizzare, al fine di non dovere calibrare ogni volta, prima dell’analisi di ogni campione, la strumentazione per la rilevazione quantitativa di tale analita o analiti.

Pertanto l'innovazione principale che caratterizza la presente invenzione risiede nella disponibilità ed utilizzo di una tale speciale base dati, ed anche nell’utilizzo di una sorgente ionica del tipo USIS o SACI in combinazione con uno spettrometro di massa tradizionale, come più avanti meglio descritto.

Infatti l’utilizzo di queste due sorgenti ioniche à ̈ fondamentale in quanto permette di massimizzare la sensibilità degli spettrometri di massa, aumentando l'accuratezza quantitativa dell'analisi, dal momento che maggiore à ̈ la sensibilità analitica maggiore sarà la stabilità del segnale e conseguentemente la qualità e precisione del dato quantitativo ottenuto.

Inoltre il sistema di analisi dell’invenzione include, come parte essenziale ed ulteriore innovazione, un sistema di controllo atto a controllare costantemente nel corso delle analisi alcuni parametri, verificandone la conformità, indicativi sia del cosiddetto “effetto matrice†, ovvero dell’effetto, nel campione analizzato, derivante dalla sua matrice originale o composizione molecolare, e sia della variazione della risposta strumentale della strumentazione o apparecchiatura che à ̈ adibita a rilevare la quantità degli analiti nei campioni analizzati.

Più precisamente le diverse variabili che sono monitorate nel sistema di analisi dell’invenzione sono processate in modo da determinare due coefficienti che sono memorizzati nella base dati, ovvero:

a) un coefficiente di monitoraggio K che può essere preso come riferimento per monitorare la stabilità e la variabilità nel tempo del segnale strumentale generato dalla strumentazione per la rilevazione quantitativa degli analiti; e

b) un coefficiente di valutazione K1 che può essere preso come riferimento per valutare, nel campione analizzato, il rispettivo effetto matrice derivante dalla sua matrice originale o composizione molecolare.

Come meglio spiegato nel seguito, questo coefficiente K1 à ̈ indicativo della variazione di pendenza della retta che si ottiene analizzando volumi crescenti del campione e riportando in un grafico i corrispondenti segnali generati dell’analita di interesse presente nel campione analizzato.

Vantaggi dell’invenzione

Il sistema per l’analisi quantitativa di sostanze e composti chimici presenti in campioni da analizzare, conforme alla presente invenzione, à ̈ previsto per essere identificato, in particolare nel commercio, con l’acronimo PROSAD (derivato dall’inglese PROgressive Sample Dosage), ed esibisce numerosi e rilevanti vantaggi, in parte già annunciati nella precedente introduzione, rispetto ai sistemi di analisi per l’analisi chimica quantitativa di campioni, al momento noti ed applicati, in particolare in ambito medico.

Nel seguito alcuni di questi vantaggi, corrispondenti ai vari aspetti del sistema di analisi dell’invenzione, saranno brevemente presentati, a puro titolo esemplificativo, e messi in rapporto con i sistemi di analisi attualmente noti e in uso.

Innanzitutto il sistema di analisi dell’invenzione si presenta particolarmente vantaggioso in relazione al sistema di calibrazione, da esso adottato, per calibrare la strumentazione di rilevazione utilizzata, all’interno dello stesso sistema di analisi, per rilevare la quantità degli analiti di interesse nei vari campioni da analizzare, in particolare in ambito medico e nel caso in cui tale strumentazione di rilevazione sia costituita da uno spettrometro di massa.

Infatti, come in parte già evidenziato, un fattore che accomuna tutti i metodi di analisi oggi esistenti che impiegano la spettrometria di massa à ̈ l’utilizzo di standard analitici commerciali prima di ogni singola analisi, ovvero prima dell’analisi di un particolare analita o categoria di analiti presenti nel campione, al fine di calibrare la risposta strumentale dello spettrometro di massa.

Ora la presente invenzione, ovvero il PROSAD, à ̈ stata sviluppata proprio per consentire la standardizzazione delle risposte strumentali dello spettrometro di massa, ovvero per renderle precise, affidabili e riproducibili nel tempo, senza dovere continuamente usare, nel corso e nell’esecuzione delle analisi quantitative dei vari campioni e al variare del tipo di analita di interesse presente in essi, questi standard analitici commerciali.

Riassumendo, il PROSAD consente di ottenere i seguenti quattro ordini di vantaggi.

Vantaggio Economico

Un primo vantaggio à ̈ di ordine economico in quanto con il PROSAD gli standard commerciali non vengono più utilizzati ad ogni analisi, ma solo nella fase iniziale di acquisizione dei dati necessari per creare e strutturare una opportuna base dati, quindi con notevole risparmio nel costo degli standard stessi;

Vantaggio Strutturale

Il vantaggio strutturale deriva dal fatto che, come già precisato, ogni standard commerciale corrisponde ad una ed una sola molecola d’interesse, limitando così la possibilità di analisi ad una singola molecola.

Invece il sistema PROSAD, standardizzando la risposta strumentale di molti analiti, rende possibile l’analisi sia qualitativa sia quantitativa di più molecole d’interesse contemporaneamente.

Ancora il PROSAD va incontro all’esigenza di semplificare le procedure analitiche per la preparazione dei campioni, che, attualmente, ogni qualvolta si desideri monitorare un nuovo analita o uno stesso analita presente in differenti matrici, richiedono solitamente lo sviluppo, per ogni composto, di una preparazione specifica e di corrispondenti metodi analitici.

Vantaggio Temporale

Il risparmio in termini di tempo offerto da PROSAD à ̈ evidente, ed à ̈ composto dalla somma di tre fattori.

Vi à ̈ infatti un primo risparmio di tempo nello sviluppo e la validazione di metodologie specifiche ogni qualvolta si approcci un nuovo analita, un secondo risparmio nella preparazione di ogni singolo campione, ed un terzo risparmio nel tempo macchina necessario all’analisi di numerose molecole d’interesse per singolo campione.

In sintesi, con il PROSAD, la metodologia per la preparazione dei campioni da sottoporre all’analisi risulta unica, più breve e notevolmente semplificata, ed inoltre à ̈ possibile, come prima detto, analizzare simultaneamente più sostanze d’interesse;

Vantaggio qualitativo

Il vantaggio qualitativo, che costituisce un altro notevole vantaggio, deriva dalla maggiore accuratezza del dato quantitativo ottenuto con il PROSAD.

Infatti, limitando sia i passaggi e le operazioni manuali da parte dell’operatore di laboratorio sia il numero di analisi/campione, il PROSAD elimina una quota sostanziale dell’errore di misura e strumentale gravante sul dato finale, che, quindi, risulterà più preciso.

Inoltre, la speciale configurazione e tipologia delle apparecchiature che sono utilizzate dal PROSAD, in particolare includenti sorgenti ioniche in grado di massimizzare la sensibilità dello spettrometro di massa, contribuiscono ulteriormente a incrementare la qualità e esattezza del dato analitico ottenuto.

Infine, un’ulteriore vantaggioso contributo à ̈ dato dall’elevata precisione del sistema di elaborazione dei dati che à ̈ incluso nel PROSAD.

A questo riguardo, à ̈ risultato da numerose prove effettuate che il dato ottenuto tramite il PROSAD à ̈ mediamente più preciso del 10% rispetto alle metodologie di analisi tradizionali.

Breve descrizione dei disegni

Questi ed altri scopi, caratteristiche e vantaggi del sistema per l’analisi quantitativa di campioni secondo la presente invenzione risulteranno in modo chiaro ed evidente dalla seguente descrizione di una sua forma preferita di realizzazione, fatta a titolo esemplificativo e non limitativo, con riferimento agli annessi disegni, di cui:

Fig. 1 à ̈ uno schema funzionale a blocchi che rappresenta in modo estremamente sintetico le parti essenziali di un sistema di analisi, conforme alla presente invenzione, per l’analisi chimica quantitativa di campioni, preferibilmente ma non esclusivamente in ambito medico;

Fig. 2 à ̈ uno schema funzionale a blocchi che rappresenta in modo più dettagliato le varie parti del sistema di analisi di campioni di Fig. 1;

Fig. 3 à ̈ uno schema a blocchi, più dettagliato, della parte del sistema di analisi di Fig. 1 che concerne specificatamente la preparazione dei campioni da analizzare;

Fig. 4 à ̈ uno diagramma di flusso che illustra l’operazione di calibrazione strumentale della specifica apparecchiatura di rilevazione che à ̈ utilizzata, nel sistema di analisi dell’invenzione di Figg. 1 e 2, per rilevare quantitativamente gli analiti di interesse presenti nei campioni analizzati; e Fig. 5 à ̈ uno schema a blocchi di un sistema di analisi e di un rispettivo sistema di calibrazione strumentale della strumentazione di analisi utilizzata, secondo la tecnica nota.

Descrizione di una forma preferita di realizzazione dell’invenzione La Fig. 1 mostra in forma estremamente schematica un sistema di analisi, conforme alla presente invenzione e indicato nel complesso con 10, per l’analisi chimica quantitativa di campioni, ed anche denominato “PROSAD†, come prima precisato, dal suo acronimo PROgressive SAmple Dosage.

L’impiego di questo sistema di analisi 10 à ̈ preferibilmente, anche se non esclusivamente, nel campo medico, ad esempio per effettuare l’analisi chimica quantitativa di analiti di interesse contenuti in matrici biologiche, come meglio specificato nel seguito, anche con specifici esempi di applicazione relativi a campioni costituiti da urina o plasma umano.

Nel suo complesso (Fig. 2) il sistema di analisi 10 dell’invenzione, ovvero il PROSAD, à ̈ costituito sostanzialmente dalle seguenti tre parti fondamentali, che interagiscono e cooperano reciprocamente, ovvero:

- una prima parte, schematizzata con un blocco 20, che corrisponde a una fase preliminare di preparazione del campione o dei campioni destinati ad essere analizzati quantitativamente tramite il sistema di analisi 10;

- una seconda parte, schematizzata con un blocco 30, che corrisponde a una specifica apparecchiatura di rilevazione dedicata, chiamata nel seguito anche semplicemente apparecchiatura di rilevazione, avente la funzione, nell’ambito nel sistema di analisi 10, di rilevare durante una fase di rilevazione le quantità dell’analita o degli analiti di interesse presenti nel campione/i che sono analizzati; e

- una terza parte, schematizzata con un blocco 40, che corrisponde a un sistema di elaborazione avente la funzione di elaborare, durante una fase di elaborazione, i dati quantitativi Q rilevati dall’apparecchiatura dedicata 30 al fine di determinare i risultati finali R dell’analisi, ovvero i dati quantitativi degli analiti di interesse presenti nel campione/i analizzati.

Come più avanti meglio spiegato, il sistema di elaborazione 40 à ̈ associato anche con un innovativo sistema di calibrazione, indicato generalmente con 50, della risposta strumentale dell’apparecchiatura di rilevazione dedicata 30.

Queste tre parti 20, 30 e 40 del sistema di analisi 10 saranno ora descritte in modo dettagliato

Fase preliminare di preparazione del campione da analizzare

La prima parte 20, corrispondente come detto ad una fase preliminare di preparazione del campione, comprende alcune specifiche operazioni che sono eseguite su un campione originale da analizzare, indicato con A e schematizzato in Fig. 2, al fine di normalizzare l’effetto matrice derivante dalla sua specifica composizione molecolare.

In proposito si ricorda che preparare il campione da analizzare in modo da ridurre il rispettivo effetto matrice finale ad un valore standardizzabile e riproducibile, à ̈ essenziale per la validità del dato analitico che sarà ottenuto, dal momento che gli effetti matrice sono un fenomeno ben noto che può essere causa di notevoli problemi e criticità nella caratterizzazione quantitativa del campione (si veda al riguardo la pubblicazione Cristoni S. et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 2006; 20(16):2376-82).

Ad esempio à ̈ stato possibile rilevare che, in presenza di un elevato effetto matrice nel campione analizzato, l'errore analitico può raggiungere livelli superiori al 50% del valore reale del dato di interesse (si veda Cristoni S. et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 2006;20(16):2376-82).

Nel dettaglio e con riferimento allo schema di Fig. 3 la procedura seguita in questa fase di preparazione del campione à ̈ la seguente.

a) Inizialmente si prepara la soluzione di diluizione universale SDU, standard ed applicabile a qualsiasi matrice complessa, diluendo ad esempio in 900 microlitri di una soluzione di bicarbonato d’ammonio 100 millimolare (NH4HCO3, 100 mM) 100 microlitri di una soluzione contenente 1000 ppm di caffeina, 1000 ppm di testosterone e 1000 ppm di progesterone, che costituiscono i tre calibranti interni del sistema chimico, ottenendo così un volume finale di 1 millilitro.

b) Poi la soluzione di diluizione universale SDU viene ricostituita con del plasma liofilizzato, in opportune proporzioni, in modo da ottenere una soluzione finale stabilizzata a pH = 8.

c) A questo punto, il campione originale A, contenente gli analiti d’interesse, ad esempio [x], [y], [z], viene diluito in un rapporto 1:1 nella soluzione di diluizione universale SDU, standard ed applicabile a qualsiasi matrice complessa.

Si procede quindi alla normalizzazione dell’effetto matrice.

d) A questo scopo, si prepara una soluzione di diluizione aggiungendo a 99 parti di acetonitrile puro AC una parte di acido formico AF (99%+1%);

e) Quindi una parte della soluzione contenente il plasma à ̈ diluita in nove parti della soluzione a base di acetonitrile (rapporto di diluizione 1:10), per cui si ottiene l’istantanea precipitazione delle proteine di elevato peso molecolare contenute nella soluzione plasma campione.

f) Si centrifuga poi la soluzione così ottenuta, ad esempio a 13.000 rpm per 1 minuto, dopodiché si prelevano ad esempio 200 microlitri del surnatante, che costituiscono la soluzione campione A1destinata ad essere analizzata per mezzo della specifica apparecchiatura di rilevazione 30.

L’obiettivo primario di questa procedura preparatoria, diretta a costituire una matrice analitica standard o normalizzata, à ̈ quello di uniformare e normalizzare le proprietà chimico fisiche della soluzione da sottoporre all’analisi, in modo da evitare i singolari e specifici effetti matrice dovuti alla composizione specifica di campioni originali di diversa natura.

Una tale normalizzazione à ̈ per l’appunto resa possibile dalle caratteristiche della soluzione che viene preparata in questa fase di preparazione 20, sia mediante un tamponamento del pH ad un valore vicino alla neutralità (pH = 8), tale da non favorire né la protonazione né la deprotonazione degli analiti di interesse, e sia creando, grazie all’utilizzo di plasma liofilizzato, un ambiente chimico-fisico complesso avente un effetto matrice in grado di mascherare quello del campione originale, così da produrre un unico effetto matrice riproducibile e prevedibile, per la successiva fase di elaborazione, da parte del sistema 40, dei dati rilevati dall’apparecchiatura 30.

In alternativa al processo di precipitazione prima descritto ai punti “d†ed “e†, à ̈ possibile eseguire una preparazione che prevede l’utilizzo di filtri del cosiddetto tipo a “cut off†molecolare.

In questo caso il processo alternativo prevede le seguenti fasi.

a) Inizialmente si prepara la soluzione di diluizione universale SDU, standard ed applicabile a qualsiasi matrice complessa, diluendo ad esempio in 900 microlitri di una soluzione di bicarbonato d’ammonio 100 millimolare (NH4HCO3, 100 mM) 100 microlitri di una soluzione contenente 1000 ppm di caffeina, 1000 ppm di testosterone e 1000 ppm di progesterone, che costituiscono i tre calibranti interni del sistema chimico, ottenendo così un volume finale di 1 millilitro.

b) Poi la soluzione di diluizione universale SDU viene ricostituita con del plasma liofilizzato, in opportune proporzioni, in modo da ottenere una soluzione finale stabilizzata a pH = 8.

c) A questo punto, il campione originale A, contenente gli analiti d’interesse, ad esempio [x], [y], [z], viene diluito in un rapporto 1:1 nella soluzione di diluizione universale SDU standard, ricostituita in plasma ed applicabile a qualsiasi matrice complessa.

Si procede quindi alla normalizzazione dell’effetto matrice.

d’) La soluzione SDU così ottenuta viene immessa in una provetta Eppendorf dotata di un filtro a cut off molecolare, in grado cioà ̈ di impedire il passaggio tra le sue trame di sostanze aventi un peso molecolare superiore ad un limite prestabilito (ad esempio 3000 Da, 5000 Da o 10.000 Da). Tale limite va identificato volta per volta in riferimento alle condizioni analitiche imposte dalla matrice analizzata e dalle caratteristiche degli analiti d’interesse.

f) Si centrifuga poi la soluzione così ottenuta, ad esempio a 13.000 rpm per 1 minuto, dopodiché si prelevano ad esempio 200 microlitri della soluzione filtrata ottenuta, che costituiscono la soluzione campione A1destinata ad essere analizzata per mezzo della specifica apparecchiatura di rilevazione 30.

Apparecchiatura dedicata per l’analisi e il rilievo quantitativo del campione

L’apparecchiatura di rilevazione dedicata, corrispondente alla parte 30 del sistema di analisi 10 dell’invenzione, ovvero del PROSAD, ed avente la funzione di rilevare le quantità dell’analita o degli analiti di interesse presenti nel campione che viene analizzato, à ̈ essenzialmente costituita da un sistema cromatografico 31, attraverso il quale il campione A1 da analizzare à ̈ iniettato nell’apparecchiatura di rilevazione 30; una sorgente ionica o di ionizzazione 32 atta a ricevere dal sistema cromatografico SC e a ionizzare il campione A1 da analizzare; ed un analizzatore di spettrometria di massa o spettrometro di massa 33 atto a ricevere gli ioni I, del campione A1, prodotti dalla sorgente di ionizzazione 32 ed a sottoporli ad un esame spettrometrico al fine di rilevare la quantità degli analiti di interesse presenti nello stesso campione A1, come indicato nello schema di Fig. 2.

Il dato quantitativo Q, quale rilevato dallo spettrometro di massa 33, dell’analita o degli analiti di interesse [x], [y], [z] presenti nel campione A1, viene poi inviato al sistema di elaborazione 40 per essere opportunamente elaborato al fine di fornire il risultato finale R dell’analisi chimica quantitativa, ovvero il dato quantitativo dell’analita o degli analiti presenti nel campione analizzato.

Il sistema cromatografico 31 à ̈ costituito a sua volta da una pompa HPLC e da una colonna cromatografica, il cui calibro à ̈ selezionato di volta per volta in base alle esigenze di analisi contingenti.

Nell’uso il sistema cromatografico 31 à ̈ predisposto per iniettare rapidamente nella sorgente di ionizzazione 32 determinati volumi del campione A1 da analizzare, in rapida successione fra di loro, così da consentire una veloce esecuzione delle analisi.

Per quanto riguarda la sorgente ionica 32, le configurazioni possibili nel PROSAD prevedono l’impiego di una sorgente ionica a scelta tra una sorgente ionica basata sulla tecnica SACI (Surface Activated Chemical Ionization a cui si riferisce il brevetto Internazionale n. WO 2004/034011 a nome Cristoni S. et al.), e una sorgente ionica basata sulla tecnica USIS (Universal Soft Ionization Source a cui si riferisce il brevetto internazionale WO 2007/131682 a nome Cristoni).

Infine l’analizzatore di spettrometria di massa 33 incluso nell’apparecchiatura di rilevazione 30 può essere uno strumento a bassa risoluzione (quale del tipo a trappola ionica, singolo quadrupolo, triplo quadrupolo, ecc.; vedi Cristoni S. et al. Mass Spectrom Rev. 2003 Nov-Dec; 22(6):369-406), oppure ad alta risoluzione (ad esempio del tipo FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance), TOM (Time Of Flight), orbitrap, ecc; vedi Cristoni S. et al. Mass Spectrom Rev. 2003 Nov-Dec;22(6):369-406).

Tra gli analizzatori di spettrometria di massa a bassa risoluzione del tipo a trappola ionica o triplo quadrupolo, Ã ̈ di solito preferibile il triplo quadrupolo per la sua miglior accuratezza e precisione nell'analisi quantitativa dei dati.

Mentre, tra gli analizzatori ad alta risoluzione, i preferiti sono l'analizzatore orbitrap e l’analizzatore a tempo di volo, e ancora, fra questi due, quello a tempo di volo, che risulta offrire prestazioni superiori in termini di precisione ed accuratezza del dato quantitativo rilevato.

Il valore aggiunto ed i vantaggi dell'apparecchiatura di rilevazione 30, impiegata nel sistema di analisi dell’invenzione 10, sono ovviamente determinati dall'utilizzo di sorgenti di ionizzazione 32 basate sulla tecnica SACI od USIS.

In particolare la tecnica SACI (Surface Activated Chemical Ionization) introduce le seguenti due rilevanti e vantaggiose modificazioni rispetto alle sorgenti ioniche finora maggiormente utilizzate, per la ionizzazione di composti a pressione atmosferica, del tipo ESI (ElectroSpray Ionisation) ed APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization).

a) l'inserzione di una superficie metallica nella camera di ionizzazione, che permette una migliore efficienza di ionizzazione dei composti.

Infatti questa superficie metallica polarizza il solvente neutro variandone l’affinità protonica e migliorando l’efficienza di ionizzazione dell’analita mediante.

b) l’applicazione, su tale superficie metallica, di un basso potenziale elettrico (50 V) che trattiene le molecole del solvente che non raggiungono l’analizzatore, e quindi determina una notevole diminuzione del rumore chimico.

La tecnica USIS sfrutta lo stesso principio della sorgente SACI, ma in più prevede vantaggiosamente un effetto fotoelettrico aggiuntivo di emissione elettronica da parte di una piastra polarizzata mediante l’applicazione di irradiazione UV.

Infatti l’emissione di questi elettroni per effetto fotoelettrico attiva reazioni ione-molecola che portano alla ionizzazione dei composti non polari o apolari in aggiunta a quelli polari.

Pertanto sotto questo aspetto una sorgente ionica USIS Ã ̈ preferibile in quanto permette di analizzare un numero maggiore di composti, ovvero anche quelli apolari, rispetto a una sorgente SACI.

Comunque entrambi i tipi di sorgente ionica SACI e USIS esibiscono una proprietà fondamentale, utile ai fini dell'efficienza del sistema PROSAD, consistente nella capacità di fornire un dato quantitativo stabile, dal momento che la ionizzazione del campione da analizzare avviene sempre a voltaggi inferiori rispetto a quelli impiegati dalle sorgenti ioniche tradizionali (< 900 V anziché 3000 - 4000 V) quali ad esempio del tipo ESI ed APCI.

Questo consente di ridurre la resa di ionizzazione del solvente cromatografico, coeluente e veicolo dell’analita nella colonna, con conseguente calo del rumore strumentale.

Infatti l’esposizione del solvente cromatografico a potenziali ionizzanti elevati provoca, come à ̈ noto, la formazione di grappoli o “cluster†molecolari carichi, in grado di produrre un aumento del rumore chimico strumentale una volta raggiunto l’analizzatore.

La riduzione del rumore di fondo ottenuta mediante le sorgenti SACI ed USIS consente quindi di ottenere un segnale maggiormente stabile riducendo le interferenze strumentali e, di conseguenza, di ottenere anche una maggior precisione nella misura del dato quantitativo.

In generale la configurazione dell’apparecchiatura di rilevazione 30 e delle parti di cui à ̈ composta à ̈ definita in funzione delle specifiche esigenze e tipologie di analisi che devono essere fatte.

In ogni caso qualunque sia la configurazione dell’apparecchiatura di rilevazione 30, che à ̈ scelta ed adottata nell’ambito del PROSAD, essa dovrà essere impostata e calibrata durante una fase di calibrazione, al fine di ottenere dalle analisi quantitative effettuate sui campioni dei risultati corretti e riproducibili, come dettagliatamente descritto nel seguito.

Sistema di elaborazione dei dati quantitativi rilevati dall’apparecchiatura di rilevazione

La parte 40, corrispondente al sistema di elaborazione del sistema di analisi 10 dell’invenzione, comprende, come schematizzato in Fig. 2:

una stazione locale di lavoro 42 associata con l’apparecchiatura di rilevazione 30 per ricevere i dati quantitativi Q, rilevati da quest’ultima, degli analiti di interesse presenti nei campioni analizzati,

- una unità remota di calcolo 43, atta a cooperare con la stazione locale di lavoro 42, e

- una base dati 41 associata con l’unità remota di calcolo 43 e contenente uno o più dati e coefficienti correttivi e di controllo atti a calibrare e correggere la risposta strumentale dell’apparecchiatura di rilevazione 30 usata per rilevare i dati quantitativi degli analiti di interesse presenti nei vari campioni analizzati.

L’unità remota di calcolo 43 a sua volta può essere parte di una più ampia rete di risorse di calcolo, ad esempio di un cosiddetto “cloud computing†, così da non gravare sulle prestazioni della stazione locale di lavoro 42.

In dettaglio l’unità remota di calcolo 43 comprende un generale programma di funzionamento o software SW che a sua volta include uno specifico programma di calcolo, o algoritmo 44, specificatamente sviluppato per il PROSAD, il quale à ̈ previsto per cooperare con la base dati 41 al fine di determinare i risultati finali R delle analisi, ovvero le quantità degli analiti di interesse presenti nei vari campioni analizzati, come più avanti meglio descritto.

Nel funzionamento la stazione di lavoro 42 trasmette all’unità remota 43 i dati quantitativi Q, quali rilevati dall’apparecchiatura di rilevazione 30, degli analiti di interesse [x], [y], [z] presenti nei campioni analizzati.

Nello stesso tempo la stazione locale di lavoro 42 invia all’unità remota di calcolo 43 una richiesta diretta ad attivare la quantificazione degli analiti di interesse, quali impostati dall’operatore, presenti nel campione in analisi.

In risposta a tale richiesta, l’unità remota di calcolo 43 estrae dalla base dati 41 i coefficienti correttivi e i controllo necessari per la corretta quantificazione degli analiti, e calcola, tramite lo specifico algoritmo 44 del PROSAD e tenendo conto di tali coefficienti correttivi e di controllo, il risultato finale R dell’analisi, ovvero il dato quantitativo dell’analita di interesse presente nel campione analizzato.

Questo risultato R à ̈ poi trasmesso dall’unità remota di calcolo 43 alla stazione locale di lavoro 42, che lo visualizza in uscita verso un operatore, come schematizzato in Fig. 2.

Base dati inclusa nel sistema di elaborazione dati e calibrazione della risposta strumentale dell’apparecchiatura di rilevazione

Uno dei punti che qualificano il sistema di analisi 10 dell’invenzione e lo differenziano dai sistemi noti per l’analisi chimica quantitativa à ̈ costituito, come già anticipato, dalla base dati o database 41, inclusa nel sistema di elaborazione 40, e dal suo speciale contenuto ed uso ai fini della calibrazione della risposta strumentale dell’apparecchiatura di rilevazione 30, della standardizzazione e quantificazione dei dati elaborati dal sistema di elaborazione 40, ed infine del calcolo finale dei dati quantitativi, da fornire come risultato finale R dell’analisi, degli analiti di interesse presenti nei campioni analizzati.

In particolare, questa base dati 41 contiene uno o più coefficienti correttivi e di controllo idonei a calibrare la risposta strumentale dell’apparecchiatura di rilevazione 30, ovvero a correggere opportunamente i dati quantitativi, rilevati da quest’ultima, degli analiti di interesse presenti nei vari campioni analizzati.

Le caratteristiche di questa innovativa base dati 41, parte essenziale del sistema di analisi chimica quantitativa della presente invenzione, risulteranno chiare dalla seguente dettagliata descrizione che descrive sia le modalità in cui questa base dati 41 à ̈ preliminarmente definita, e i dati e le informazioni in essa contenuti sono determinati ed acquisiti, e sia le modalità in cui questa base dati 41 e i rispettivi dati, una volta definiti, operano e sono utilizzati nell’ambito del sistema di analisi 10 e del relativo sistema di elaborazione 40.

1. La base dati 41 à ̈ inizialmente creata e definita durante una fase preliminare, che precede l'effettiva analisi dei campioni, annotando ed acquisendo specifici dati e informazioni che sono direttamente legati allo specifico modello e/o esemplare di spettrometro di massa 33 destinato ad essere utilizzato per analizzare inizialmente il campione A e successivamente altri campioni, schematizzati e indicati con A-1, A-2, A-3, … A-n in Fig. 2, nel sistema di analisi 10 dell’invenzione.

2. In particolare l’operatore, utilizzando gli standard commerciali di impostazione (in particolare reserpina due molecole da selezionarsi di volta in volta, in base alla specifica applicazione e il tipo di analisi da effettuare), esegue tramite lo spettrometro 33 alcuni spettri preliminari, che vengono in questo modo acquisiti e memorizzati nella base dati 41 per essere usati nella successiva valutazione e calibrazione della risposta dello spettrometro 33.

Le stesse operazioni definite ai punti 1 e 2 possono essere eseguite anche per acquisire nella base dati 41 gli spettri di massa ottenuti analizzando gli standard commerciali con diverse marche e modelli di spettrometri, in modo da definire nella base dati 41 una libreria di dati relativi a più marche e modello di spettrometri di massa.

3. In questo modo, prima di effettuare l’analisi dei campioni di interesse, la risposta strumentale dello spettrometro 33 à ̈ ottimizzata e massimizzata sul segnale della reserpina, con il risultato di ottenere uno spettro riproducibile.

Infatti questa fase di ottimizzazione della risposta strumentale dello spettrometro 33 e della sua ottica, essendo realizzata utilizzando sempre lo stesso composto, assicura che l’intensità del segnale dello standard commerciale e quella corrispondente agli altri rapporti massa-carica m/z, a parità di concentrazione, siano sempre riproducibili.

4. Quindi i dati che sono stati ottenuti in forma di intensità dei segnali di massa delle molecole standard o di calibrazione, sono confrontati con i relativi dati sperimentali, specifici per marca e modello di strumento, ovvero di spettrometro, utilizzato, che sono stati precedentemente rilevati ed inseriti, quale riferimento, nella base dati 41.

A questo scopo si calcola il coefficiente correttivo K = I0/I, specifico per marca e modello di spettrometro utilizzato, quale risultato del rapporto tra il segnale teorico I0, relativo alle sostanze calibranti, e quello campionato I, relativo alla marca e al modello dello specifico spettrometro di massa utilizzato per le analisi.

In particolare il segnale I à ̈ selezionato fra quelli già disponibili nella base dati 41 ed ottenuti utilizzando diverse marche e modelli di spettrometri, secondo la procedura indicata ai punti 1 e 2.

Anche questo coefficiente K Ã ̈ acquisito e memorizzato nella base dati 41.

Il coefficiente K, per come à ̈ calcolato, risulta indicativo della similarità degli spettri, e quindi della risposta strumentale della specifica apparecchiatura di rilevazione 30 utilizzata per le analisi, e per essere accettabile deve tendere al valore unitario, con uno scarto massimo tollerabile del 10%, ovvero K=1±0,1.

Il rapporto K = I0/ I rappresenta anche un parametro indicativo del sistema di rilevazione, e per questa ragione à ̈ previsto per essere monitorato ad ogni analisi, al fine di valutare in termini quantitativi la fluttuazione nel tempo della risposta strumentale e, quando necessario, di correggerla opportunamente.

Pertanto la verifica della costanza di K e di ogni sua eventuale variazione nel tempo costituisce una prima verifica o “check-point†del funzionamento dell’apparecchiatura di rilevazione 30.

5. Successivamente, i valori di intensità del segnale degli analiti di interesse sono campionati, mediante l’analisi dei relativi standard commerciali alla concentrazione di 1 ppm ciascuno.

6. Se lo standard della molecola d’interesse mostra un segnale di intensità caratterizzato da un rapporto segnale-rumore S/N (Signal-to-Noise ratio) < 100, l’analita à ̈ considerato non analizzabile mediante il PROSAD.

Questo accorgimento à ̈ essenziale sia per limitare la quota d’errore intrinseca alla tecnologia di spettrometria di massa, sia per incrementare nello stesso tempo la precisione e l’accuratezza dei dati ottenuti.

Nel caso invece in cui il rapporto S/N sia > 100, il segnale Ixdell’analita d’interesse viene rapportato al coefficiente K precedentemente calcolato ed acquisito dalla base dati 41.

<7. Si determina pertanto un coefficiente correttivo C = V>*<(I>x *<K) = V>*<[I>x *<(I>0</I)], dove V rappresenta una variabile specifica dello strumento>analizzatore, ovvero dello spettrometro 33, utilizzato, per cui questo coefficiente C à ̈ caratteristico sia della macchina analizzatrice e sia dello specifico composto o analita d’interesse, e viene anch’esso acquisito e memorizzato nella base dati 41.

8. A questo punto, ovvero una volta determinato ed acquisito da parte della base dati 41 il coefficiente C, si può procedere con l’acquisizione e rilevazione dei dati quantitativi del campione da analizzare.

Pertanto, come primo passo, si deve considerare l’effetto matrice del sistema, ed a questo scopo si eseguono quattro analisi rapide di volumi crescenti di campione (ad esempio 5, 10, 15, 20 microlitri).

9. Quindi l’intensità dei segnali dell’analita di interesse à ̈ posta in un grafico in funzione del volume di campione iniettato, tramite il sistema cromatografico 31, nello spettrometro di massa 33 per essere analizzato quantitativamente.

10. Poi si estrapola da questo grafico il coefficiente di pendenza lineare K1, che rappresenta un parametro caratteristico del sistema oggetto dell’analisi.

11. A questo punto, lo speciale algoritmo 44, che à ̈ stato sviluppato per il PROSAD ed à ̈ provvisto nell’unità remota di calcolo 43, monitora l'analisi in corso ed in particolare verifica che il coefficiente K1 non vari.

Questa verifica, se positiva, ovvero nel caso in cui K1 non vari e quindi rimanga costante, indica che l'effetto matrice à ̈ riproducibile per il sistema selezionato in analisi.

12. Si ricava quindi un ulteriore coefficiente C1 = K1*C = K1*<[V>*<(K>*<I>x<)], dove I>x<à ̈, come prima specificato, l’intensità del segnale>dell’analita di interesse.

Pertanto, a questo punto, se l'algoritmo 44 del PROSAD verifica la conformità di K e K1 entro una definita tolleranza sperimentale, il valore della concentrazione dell’analita di interesse à ̈ calcolabile in modo proporzionale dal valore di Ix.

In pratica, supponendo che i coefficienti di controllo K e K1 siano all’interno del campo di tolleranza prestabilito, se Cp à ̈ la concentrazione incognita da determinare dell’analita di interesse e Ip à ̈ l'intensità nota del segnale generato da tale concentrazione incognita, la concentrazione incognita dell’analita, ovvero il risultato dell’analisi quantitativa dell’analita di interesse presente nel campione, à ̈ data da Cp = C1*Ip / Ix.

Da quanto sopra descritto, à ̈ chiaro che la base dati 41 svolge, nell’ambito del sistema di elaborazione 40 e del più generale sistema di analisi quantitativa 10, la funzione fondamentale di calibrare la risposta strumentale della specifica apparecchiatura di rilevazione 30, ovvero dello spettrometro di massa 33, che à ̈ effettivamente utilizzato nel sistema di analisi 10 per rilevare i dati quantitativi dell’analita o degli analiti presenti nel campione A1.

In altre parole i dati e i coefficienti correttivi e di controllo che sono contenuti e definiscono questa base dati 41 sono usati per determinare i dati quantitativi effettivi, da fornire all’operatore come risultato finale dell’analisi, degli analiti di interesse presenti nel campione analizzato, calibrando e correggendo opportunamente i dati quantitativi rilevati dalla stessa apparecchiatura di rilevazione 30.

Per una più completa informazione e a integrazione della precedente descrizione, questo sistema di calibrazione 50, che à ̈ parte essenziale del sistema di analisi 10 dell’invenzione e svolge la funzione di calibrare la risposta strumentale dello spettrometro di massa 33, à ̈ rappresentato, in forma di metodo ovvero di una successione di fasi operative 51-58, nel diagramma di flusso di Fig. 4.

In particolare, come si può osservare da tale diagramma di flusso, le fasi 51 e 52 indicano le fasi preliminari in cui il sistema di calibrazione 50 rileva quantitativamente, per mezzo della stessa specifica apparecchiatura di rilevazione che sarà utilizzata per analizzare quantitativamente i campioni, gli standard commerciali degli analiti di interesse, ed usa questi dati quantitativi, così rilevati, per definire preliminarmente una base dati contenenti dati e coefficienti correttivi e di controllo utili per la calibrazione strumentale di tale specifica apparecchiatura.

Quindi le fasi 53, 54 e 55 si riferiscono all’analisi quantitativa effettiva di un primo campione, in cui i risultati finali dell’analisi su questo primo campione, ovvero i dati quantitativi degli analiti di interesse presenti in esso, sono determinati processando e correggendo, tenendo conto dei dati e coefficienti correttivi e di controllo contenuti nella base dati, i dati quantitativi rilevati sul campione per mezzo di tale specifica apparecchiatura di rilevazione.

Infine le fasi 56, 57 e 58 si riferiscono ad analisi di campioni successivi, schematizzati ed indicati con A-1, A-2, A-3,… A-n in Fig. 2, in cui i risultati quantitativi di queste analisi successive sono ottenuti utilizzando i dati e coefficienti correttivi e di controllo precedentemente determinati ed acquisiti dalla base dati 41, quindi senza calibrare prima di ogni analisi l’apparecchiatura, ovvero lo spettrometro di massa, che sarà usata per la rilevazione quantitativa degli analiti nel campione, e quindi anche senza il continuo uso, come avviene nella tecnica attuale, degli standard commerciali degli analiti per fare tale calibrazione prima di ogni analisi.

Varianti ed evoluzioni del sistema di analisi dell’invenzione

Fermo restando i concetti di base delle presente invenzione, à ̈ anche chiaro che al sistema per l’analisi chimica quantitativa di campioni, fin qui descritta, possono apportarsi modifiche e ulteriori miglioramenti, senza per questo uscire dall’ambito della stessa invenzione.

Ad esempio, nell’ambito del sistema di elaborazione 40, la stazione di lavoro 42 e la base dati 41 possono cooperare direttamente fra di loro per scambiarsi dati e informazioni, quali in particolare i dati e i coefficienti correttivi K, C, K1 da usare per correggere i dati quantitativi Q rilevati dalla spettrometro di massa 33 e quindi determinare i dati quantitativi finali risultanti dall’analisi dei campioni, come indicato con linea tratteggiata in Fig. 2.

Inoltre à ̈ opportuno sottolineare che, sebbene il sistema di analisi dell’invenzione sia stato descritto facendo specifico e preferibile riferimento ad uno spettrometro di massa in combinazione con un sistema cromatografico, altre apparecchiature di rilevazione, differenti da uno spettrometro di massa e dal relativo sistema cromatografico, aventi sempre la finalità di rilevare quantitativamente gli analiti presenti nei campioni analizzati, possono essere adottate ed utilizzate all’interno del sistema di analisi ed essere pertanto associate con la rispettiva innovativa base dati, sempre restando all’interno del concetto generale della presente invenzione.

Infine, il sistema di analisi dell’invenzione, sempre mantenendo i rispettivi concetti e caratteristiche di base, può essere implementato in varie modalità, come anche essere associato con ulteriori dispositivi e apparecchiature al fine di incrementarne le prestazioni e migliorarne i risultati, sia dal punto di vista quantitativo che qualitativo.

Esempi di applicazione del sistema di analisi dell’invenzione

A integrazione della precedente descrizione, nel seguito saranno descritti alcuni specifici esempi di applicazione del sistema di analisi 10 (ovvero del PROSAD), conforme alla presente invenzione, per l’analisi chimica quantitativa di campioni, in particolare nell’ambito delle analisi mediche.

Esempio 1 - Analisi della cocaina e del suo metabolita

In questo esempio la tecnologia PROSAD Ã ̈ stata utilizzata ai fini della quantificazione della Cocaina e del suo metabolita Benzoyletgonina in campioni di urina.

È stato utilizzato un gradiente cromatografico binario costituito da: fase A) H2O 0.05% Acido Formico e fase B) CH3CN 0.05% di acido formico. Al tempo t=0 a cui avviene l’iniezione la %B à ̈ del 15%. Questa condizione à ̈ mantenuta per 2 minuti. Dopo tale intervallo temporale la %B à ̈ portata ad un valore del 70% in 8 minuti. Nei successivi 2 minuti sono ripristinate le condizioni iniziali. Il tempo di acquisizione strumentale à ̈ stato impostato a 24 minuti. È stata utilizzata una colonna cromatografica ThermolEctron C8 150x1 mm. Il potenziale della superficie, dell’electrospray e la temperatura della superficie erano pari rispettivamente a 50 V, 0 V e 110°C. Il flusso di gas di nebulizzazione era pari a 2 L/min.

Esempio 2 - Analisi del testosterone in campioni di plasma

Il sistema PROSAD Ã ̈ stato utilizzato ai fini del dosaggio del testosterone contenuto nel plasma umano.

È stato utilizzato un gradiente cromatografico binario costituito da: Fase A) H2O 0.05% Acido Formico e Fase B) CH3CN 0.05% di acido formico. Al tempo t=0 a cui avviene l’iniezione la %B à ̈ del 15%. Questa condizione à ̈ mantenuta per 2 minuti. Dopo tale intervallo temporale la %B à ̈ portata ad un valore del 70% in 8 minuti. Nei successivi 2 minuti sono ripristinate le condizioni iniziali. Il tempo di acquisizione strumentale à ̈ stato impostato a 24 minuti. È stata utilizzata una colonna cromatografica ThermolEctron C8 150x1 mm. Il potenziale della superficie, dell’electrospray e la temperatura della superficie erano pari a 50 V, 0 V e 110°C. Il flusso di gas di nebulizzazione era pari a 2 L/min.

Esempio 3 - Analisi di Tacrolimus in campioni di sangue intero

In questo esempio il sistema PROSAD Ã ̈ utilizzato ai fini del dosaggio di un immunosoppressore denominato Tacrolimus (farmaco anti rigetto) contenuto nel plasma umano.

È stato utilizzato un gradiente cromatografico binario costituito da: Fase A) H2O 0.05% Acido Formico e B) CH3CN 0.05% di acido formico.

Al tempo t=0 a cui avviene l’iniezione la %B à ̈ del 15%. Tale condizione à ̈ mantenuta per 2 minuti. Dopo tale intervallo temporale la %B à ̈ portata ad un valore del 70% in 8 minuti. Nei successivi 2 minuti sono ripristinate le condizioni iniziali. Il tempo di acquisizione strumentale à ̈ stato impostato a 24 minuti. È stata utilizzata una colonna cromatografica ThermolEctron C8 150x1 mm. Il potenziale della superficie e dell’electrospray e la temperatura della superficie erano pari rispettivamente a 50 V, 0 V e 110°C. Il flusso di gas di nebulizzazione era pari a 2 L/min.

Infine per completezza la seguente tabella indica, per ciascuno degli esempi di applicazione sopra descritti, l’errore % relativo alla precisione di misura e quello relativo all’accuratezza strumentale nella misurazione degli analiti di interesse utilizzando il sistema PROSAD dell’invenzione.

In particolare l’errore % relativo all’accuratezza strumentale à ̈ stato determinato rispetto al dato acquisito quantificando i campioni con il metodo della calibrazione lineare ed utilizzando, come composti aggiunti ai campioni, gli standard deuterati.

<Errore % relativo>Errore % relativo all’accuratezza della Compostialla precisionestrumentazione di rilevazione, ovvero dello spettrometro di massa

Cocaina 6 - 10 8 - 13

Benzoyletgonina 6 - 10 6 - 10

Testosterone 2 – 4 2 - 5

Tacrolimus 11 - 15 13 - 17

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Sistema di analisi (10) per l’analisi chimica quantitativa di campioni (A, A-1, A-2,.. A-n), in particolare ma non esclusivamente in ambito medico, comprendente: - una specifica strumentazione o apparecchiatura di rilevazione (30) atta a rilevare le quantità degli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti nei vari campioni (A, A-1, A-2,.. A-n) da analizzare, detta specifica apparecchiatura di rilevazione (30) a sua volta comprendendo preferibilmente un sistema cromatografico (31), una sorgente ionica (32) e uno spettrometro di massa (33), - un sistema di elaborazione dati (40, 44) atto a ricevere e ad elaborare i dati quantitativi (Q), quali rilevati da detta specifica apparecchiatura di rilevazione (30), degli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti nei vari campioni analizzati (A, A-1, A-2,…A-n); e - una base dati (41) associata con detto sistema di elaborazione (40); detto sistema di analisi (10) essendo caratterizzato da ciò che detto sistema di elaborazione dati (40) à ̈ previsto per determinare i dati quantitativi finali (R) degli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti in ogni campione analizzato (A, A-1, A-2,.. A-n), processando, tenendo conto di dati e di coefficienti correttivi e/o di controllo (K, C, K1) contenuti in detta base dati (41), i dati quantitativi (Q), quali rilevati da detta specifica apparecchiatura di rilevazione (30, 33), degli analiti di interesse presenti nel campione analizzato (A, A-1, A-2,.. A-n).
2. 2. Sistema di analisi (10) secondo la rivendicazione 1, in cui detti dati e detti coefficienti correttivi e/o di controllo (K, C), contenuti in detta base dati (41), sono determinati ed acquisiti da detta base dati (41) in una fase preliminare (51, 52) che precede l’effettiva analisi quantitativa (53-58) dei campioni (A, A-1, A-2,.. A-n) da parte del sistema analisi (10).
3. 3. Sistema di analisi (10) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui un primo (K) di detti coefficienti correttivi e/o di controllo, contenuti in detta base dati (41), à ̈ definito dalla seguente formula: K = I0/I, dove K à ̈ detto primo coefficiente correttivo e/o di controllo, I0à ̈ il segnale teorico corrispondente a determinate sostanze calibranti e I à ̈ il segnale ottenuto campionando e analizzando quantitativamente dette sostanze calibranti mediante detta specifica apparecchiatura di rilevazione destinata ad essere utilizzata per analizzare i campioni, per cui detto primo coefficiente correttivo e di controllo K à ̈ caratteristico della marca e del modello della specifica apparecchiatura di rilevazione, ovvero in particolare del rispettivo spettrometro di massa (33), utilizzata per analizzare quantitativamente i campioni, ed à ̈ inoltre atto ad essere preso come riferimento per monitorare la stabilità nel tempo del segnale strumentale generato da detta specifica apparecchiatura di rilevamento (30, 33).
4. 4. Sistema di analisi (10) secondo la rivendicazione 3, in cui un secondo (C) di detti coefficienti correttivi e/o di controllo, contenuti in detta base dati (41), à ̈ definito dalla seguente formula: <C = V>* (<I>x *<K), ovvero C = V>*<[I>x *<(I>0</I)],> dove C à ̈ detto secondo coefficiente correttivo e/o di controllo, V à ̈ una variabile strumentale specifica dell’apparecchiatura di rilevazione (30, 33) utilizzata, e Ixà ̈ il segnale ottenuto rilevando, mediante tale apparecchiatura di rilevazione (30, 33), i dati quantitativi di standard commerciali degli analiti di interesse che si vogliono quantificare nei campioni, per cui detto secondo coefficiente correttivo e/o di controllo C à ̈ caratteristico sia di detta specifica apparecchiatura di rilevazione (30) utilizzata per analizzare i campioni, e quindi anche del rispettivo spettrometro di massa (33), sia degli specifici analiti di interesse ([x], [y], [z]) che si vogliono quantificare nei campioni analizzati (A, A-1, A-2,.. A-n).
5. 5. Sistema di analisi (10) secondo la rivendicazione 4, in cui il risultato dell’analisi quantitativa dell’analita di interesse ([x], [y], [z]) presente nel campione analizzato à ̈ determinata dal sistema di elaborazione dati (40, 44) con la seguente formula: Cp = C1*Ip / Ix., dove Cp à ̈ la concentrazione incognita da determinare dell’analita di interesse ([x], [y], [z]), Ip à ̈ l'intensità nota del segnale generato da tale concentrazione incognita Cp, e C1 à ̈ un ulteriore coefficiente definito dalla seguente formula: <C1 = K1>*<C = K1>*<[V>*<(K>*<I>x<)],> dove K1 à ̈ un ulteriore terzo coefficiente di controllo idoneo a valutare nel campione analizzato il rispettivo effetto matrice ed indicativo della variazione di pendenza della retta che si ottiene analizzando volumi crescenti del campione e riportando in un grafico i corrispondenti segnali generati dell’analita di interesse ([x], [y], [z]) presente nel campione analizzato, in cui detta concentrazione incognita Cp à ̈ determinata dal sistema di elaborazione dati dopo aver verificato che i coefficienti di controllo K e K1 sono all’interno di un campo di tolleranza prestabilito.
6. 6. Sistema di analisi (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui i campioni (A1) da analizzare sono preparati in una iniziale fase preparatoria diluendo i campioni originali (A, A-1, A-2,.. A-n) in una soluzione di diluizione universale (SDU) al fine di minimizzare il rispettivo effetto matrice.
7. 7. Sistema di analisi (10) secondo la rivendicazione 1, in cui il rispettivo sistema di elaborazione (40) a sua volta comprende: - una stazione locale di lavoro (42) collegata direttamente con detta apparecchiatura di rilevazione (30) per ricevere i dati quantitativi (Q), rilevati da quest’ultima, degli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti nei campioni analizzati (A1), e - una unità remota di calcolo (43) contenente uno specifico programma di calcolo (44, algoritmo PROSAD), in cui detta stazione di lavoro (42) trasmette a detta unità remota (43) i dati quantitativi (Q), quali rilevati da detta apparecchiatura di rilevazione (30), degli analiti di interesse presenti nei campioni analizzati (A1), in cui detto specifico programma di calcolo (44, algoritmo PROSAD), associato con detta unita remota di calcolo (43), determina sulla base dei dati quantitativi (Q) rilevati da detta apparecchiatura di rilevazione (30) e tenendo conto dei dati correttivi (K, C, K1) contenuti in detta base dati (41) i risultati (R) delle analisi sui campioni, ovvero i dati quantitativi degli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti nei campioni analizzati, e in cui detta stazione locale di lavoro (42) riceve da detta unità remota di calcolo (43) e visualizza verso un operatore detti risultati (R), determinati mediante detto specifico programma di calcolo (44, algoritmo PROSAD), indicanti le quantità degli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti nei campioni analizzati.
8. 8. Metodo per l’analisi chimica quantitativa di campioni (A, A-1, A-2,.. A-n), in particolare in ambito medico, comprendente le seguenti fasi: - provvedere una specifica strumentazione o apparecchiatura di rilevazione (30) da usare per rilevare quantitativamente gli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti nei campioni che saranno analizzati, - definire preliminarmente, ovvero prima dell’effettiva analisi quantitativa dei campioni, una base dati (41) contenente dati e coefficienti correttivi e/o di controllo (K, C) da usare per calibrare la risposta strumentale di detta specifica apparecchiatura di rilevazione (30), - determinare i risultati (R) delle analisi sui campioni, ovvero i dati quantitativi finali (R) degli analiti di interesse ([x], [y], [z]) presenti in ogni campione analizzato (A, A1) processando, tenendo conto di detti dati e coefficienti correttivi e/o di controllo (K, C, K1) contenuti in detta base dati (41), i dati quantitativi (Q), quali rilevati da detta specifica apparecchiatura di rilevazione (30, 33), degli analiti di interesse nel campione analizzato (A, A1).
9. 9. Metodo per l’analisi chimica quantitativa di campioni secondo la rivendicazione 8, in cui la fase di definire preliminarmente detta base dati (41) comprende la fase di: - acquisire da parte di detta base dati (41) un primo coefficiente correttivo e/o di controllo (K) definito dalla seguente formula: K = I0/I, dove K à ̈ detto primo coefficiente correttivo e/o di controllo, I0à ̈ il segnale teorico corrispondente a determinate sostanze calibranti e l à ̈ il segnale ottenuto campionando e analizzando quantitativamente dette sostanze calibranti mediante detta specifica apparecchiatura di rilevazione destinata ad essere utilizzata per analizzare i campioni, per cui detto primo coefficiente correttivo e/o di controllo K, acquisito da detta base dati (41), à ̈ caratteristico della marca e del modello di detta specifica apparecchiatura di rilevazione (30, 33), utilizzata per analizzare i campioni, e inoltre comprende la fase di: - acquisire da parte di detta base dati (41) un secondo coefficiente correttivo e/o di controllo (C) definito dalla seguente formula: <C = V>*<(I>x *<K), ovvero C = V>*<[I>x *<(I>0</I)],>dove C à ̈ detto secondo coefficiente correttivo e/o di controllo, V à ̈ una variabile strumentale specifica dell’apparecchiatura di rilevazione (30, 33) utilizzata, e Ixà ̈ il segnale ottenuto rilevando, mediante tale apparecchiatura di rilevazione (30, 33), i dati quantitativi di standard commerciali degli analiti di interesse che si vogliono quantificare nei campioni, per cui detto secondo coefficiente correttivo e/o di controllo C, acquisito da detta base dati (41), à ̈ caratteristico sia della specifica apparecchiatura di rilevazione (30, 33) utilizzata per analizzare i campioni, sia degli specifici analiti di interesse ([x], [y], [z]) che si vogliono quantificare nei campioni analizzati (A, A-1, A-2,.. A-n).
10. 10. Metodo per l’analisi chimica quantitativa di campioni secondo la rivendicazione 8 o 9, comprendente ulteriormente la fase di preparare i campioni da analizzare quantitativamente diluendo i campioni originali (A, A-1, A-2,.. A-n) in una soluzione di diluizione universale (SDU) al fine di minimizzare il rispettivo effetto matrice.