MX2007011405A - Deteccion de una respuesta inmune para agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8). - Google Patents

Abstract

Esta descripcion proporciona metodos para la deteccion de anticuerpos para un agente modulador de GDF-8 tales como por ejemplo, MYO-029, en una muestra biologica. Tambien se incluyen metodos para detectar una respuesta inmune a un agente modulador de GDF-8. En particular, se proporcionan en la presente metodos para evaluar una respuesta inmune en animales, incluyendo humanos, a un agente modulador de GDF-8 tal como un inhibidor GDF-8.

Description

DETECCIÓN DE UNA RESPUESTA INMUNE PARA AGENTES MODULADORES DE CRECIMIENTO Y LA DIFERENCIACIÓN DEL FACTOR 8(GDF 8) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona al crecimiento y la diferenciación del factor 8 (GDF-8) , también conocido como miostatina, es una proteína secretada y un miembro de la superfamilia del factor beta de crecimiento transformante (TGF-ß) de factores de crecimiento estructuralmente relacionados. Los miembros de esta superfamilia poseen propiedades morfogenéticas y reguladoras del crecimiento fisiológicamente importantes (Kingsley et al., Genes Dev. 8:133-146 (1994) ; Hoodless et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-272 (1998)) . Similarmente, comparte una organización estructural común que incluye una señal de péptido corta para secreción y una porción de terminal amino separada de una porción carboxi -terminal bioactiva por un sitio de desdoblamiento proteolítico altamente conservado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El GDF-8 humano se sintetiza como una proteína precursora grande de 375 aminoácidos que incluye una porción dé propéptido de terminal amino y una porción madura de terminal carboxi. El propéptido se desdobla del GDF-8 maduro a Arg-266. La proteína GDF-8 madura se activa como un Ref. : 185442 jhomodímero ligado a disulfuro. Después del procesado proteolitico, se considera que dos propéptidos GDF-8 se mantienen en complejo no covalente con el dimero de dominio maduro GDF-8, manteniendo GDF-8 en un estado inactivo, 'latente (Lee et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 98:9306-9311 (2001); Thies et al., Growth Factors 18:251-259 (2001)). Otras proteínas también se conocen por enlazarse al GDF-8 maduro e inhibir su actividad biológica. Tales proteínas inhibidoras incluyen folistatina y proteínas relacionadas con folistatina, incluyendo GASP-1 (Gamer et al., Dev. Biol. '208:222-232 (1999)); Pub. de Patente E.U.A. No. 2003-0180306-Al; Pub. de Patente E.U.A. No. 2003-0162714-A1) . Una alineación de secuencias de aminoácido deducidas de varias especies demuestra que GDF-8 está altamente conservado a través de la evolución (McPherron et al., Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 94:12457-12461 (1997)). De hecho, las secuencias de GDF-8 humanos, ratón, rata, porcino, y pollo son 100% idénticas en la región de terminal C. El GDF-8 en babuinos, bovinos, y ovinos, las secuencias difieren por solamente tres laminoácidos . El GDF-8 de pez cebra es más diferente, pero todavía es el 88% idéntico al humano. 1 GDF-8 es un regulador negativo de la masa de músculo esquelético, que se expresa altamente en el músculo iesquelético en desarrollo y en adulto. La mutación nula de ¡GDF-8 en ratones transgénicos se caracteriza por una hipertrofia e hiperplasia marcada del músculo esquelético '(McPherron et al., Nature 387:83-90 (1997)). Los incrementos Isimilares en la masa del músculo esquelético son evidentes en I mutaciones que se presentan naturalmente de GDF-8 en el ganado (Ashmore et al., Growth 38:501-507 (1974); Swatland et al., J. Anim. Sci. 38:752-757 (1994); McPherron et al., Proc. ,Nat. Acad. Sci. U.S.A. 94:12457-12461 (1997); Kambadur et ¡al., Genome res. 7:910-915 (1997)). Los estudios también han ¡mostrado que el desgaste muscular asociado con la infección 'del VIH en humanos se acompaña por incrementos en la expresión de la proteína GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95:14938-43 (1998)). Además, GDF-8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina cinasa) y modular la proliferación celular de mioblastos (WO 00/43781). ! Los agentes terapéuticos que inhiben la actividad de 'GDF-8 pueden usarse para tratar trastornos humanos o animales en los cuales un incremento en el tejido muscular seria benéfico terapéuticamente. Además, puede ser deseable para .incrementar la masa muscular o resistencia muscular, o para ¡incrementar la masa del tejido muscular o crecimiento en por 'ejemplo, animales de ganado. De esta manera, hay un interés considerable en administrar factores que regulen la actividad biológica de GDF-8 como un farmacéutico, por ejemplo, para incrementar la masa muscular, o para tratar tejido adiposo, 'muscular, metabólico y trastornos relacionados con el hueso.

Un efecto colateral perjudicial encontrado en individuos ¡que experimentan terapia con, por ejemplo, un producto ¡ biológico es una respuesta inmune para el agente terapéutico. La administración de un agente modulador GDF-8 a un individuo puede provocar al individuo desarrollo de anticuerpos que específicamente enlazan al agente modulador GDF-8. Tal ¡respuesta inmune puede tener varias consecuencias de salud.

La formación de complejos inmunes como un resultado de 'administración in vivo de un agente modulador GDF-8 puede afectar la relación de biodistribución y liberación del agente. Tales complejos pueden comprender la administración del agente modulador GDF-8, o una porción del mismo, enlazando a las inmunoglobulinas circulantes. En general, la formación de complejos inmunes reduce la cantidad de agente (terapéutico disponible para propósitos terapéuticos y pueden ¡resultar en retención del agente administrado en tejidos no objetivos. En algunos casos, los complejos inmunes circulantes pueden acumular en (y dañar potencialmente) tejidos no objetivo tales como el hígado y el riñon. Existen un número de agentes moduladores GDF-8 capaces de disparar una respuesta inmune en un individuo, incluyendo inhibidores de la actividad GDF-8. MYO-029 es un anticuerpo completamente humano que se describe además en detalle en la -Pub. de Patente E.U.A. No. 2004-0142382. El MYO-029 es capaz de enlazar GDF-8 maduro con alta afinidad, inhibir la actividad GDF-8 in vitro e in vivo, e inhibir la actividad GDF-8 asociada j con la regulación negativa de la masa de músculo esquelético y densidad del hueso. El MYO-029 promueve el incremento en la masa ¡muscular cuando se administra a ratones. Los métodos para detectar un anticuerpo que enlaza específicamente a un agente modulador de GDF-8, tal como un ¡producto biológico, son deseables. En particular, los métodos 'permiten la detección y/o cuantificación de una respuesta 'inmune para los agentes moduladores de GDF-8, incluyendo inhibidores GDF-8 y anticuerpos anti-GDF-8 son necesarios.

Tales métodos permiten, por ejemplo, detectar anticuerpos para un agente modulador de GDF-8, detectar la presencia de una respuesta inmune al agente, monitorear u optimizar el curso de la terapia, y evaluar los candidatos para el ¡tratamiento .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ' Esta invención se refiere a métodos para detectar ¡anticuerpos que enlazan específicamente a un agente modulador de ¡GDF-8 en una muestra biológica. Se incluyen los métodos para 'detectar una respuesta inmune para un agente modulador de GDF-8. En particular, los métodos para evaluar una respuesta inmune en animales, incluyendo humanos, a un agente modulador de GDF-8 tales como un inhibidor GDF-8 se proporcionan en la presente. En una modalidad, los métodos para detectar la presencia de un ,anticuerpo para un agente modulador GDF-8 tales como MYO-029 se ¡proporcionan. En particular, se proporcionan los métodos para ¡evaluar la presencia y/o cantidad de anticuerpos, incluyendo anticuerpos neutralizantes, que enlazan específicamente a un agente modulador de GDF-8 en una muestra biológica de un individuo para los cuales un agente modulador de GDF-8 se ha administrado. En una modalidad, se proporciona un método para detectar un anticuerpo que específicamente enlaza a un agente modulador de GDF-8 en una muestra biológica, en el cual el método comprende las etapas de: (a) agregar el agente modulador de GDF-8 a un ensayo in vitro para una actividad de GDF-8 en un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al ensayo in vitro para una actividad GDF-8 en el recipiente de reacción; (c) detectar la modulación de la actividad de GDF-8 por la muestra biológica; y (d) comparar la modulación de la actividad de GDF-8 en presencia de la muestra biológica para la modulación de la actividad de GDF-8 en presencia del agente modulador de GDF-8 solo. En ciertas modalidades, el ensayo in vitro es un ensayo para detectar el enlace específico al agente modulador de GDF-8, tales como un inmunoensayo, por ejemplo. En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para detectar un anticuerpo que se enlaza específicamente a MYO- 029 en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una célula hospedera que comprende el constructo de gen indicador en un recipiente de reacción, en donde el constructo comprende un elemento de control que responde a GDF-8 y un gen indicador; (b) agregar una cantidad de proteina GDF-8 madura al recipiente suficiente para la expresión activada del gen indicador; (c) agregar una cantidad de MYO-029 al recipiente de la etapa (b) suficiente para modular la activación de GDF-8 del gen indicador; (d) agregar una muestra biológica al recipiente de reacción de la etapa (c) ; y (e) detectar la expresión del gen indicador en presencia y ausencia de la muestra biológica. En una modalidad, se proporcionan métodos para la detección de anticuerpos que se enlazan específicamente a un agente modulador de GDF-8 en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un agente modulador de GDF-8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar un agente de detección al recipiente de reacción; y (d) detectar un complejo agente/anticuerpo modulador de GDF-8 asociada con la superficie del recipiente de reacción. En algunos casos, el agente de detección es el agente modulador de GDF-8 de la etapa (a) y una etiqueta detectable. En algunos casos, el agente de detección es una proteina GDF-8 etiquetada.

En otra modalidad, se proporcionan métodos para detectar un anticuerpo a un inhibidor GDF-8 en una muestra biológica.

¡Los métodos comprenden: (a) poner en contacto un primer inhibidor GDF-8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar un segundo inhibidor GDF-8 etiquetada al recipiente de reacción; y (d) detectar el inhibidor GDF-8 ¡etiquetada asociada con la superficie. En algunas modalidades, el primer inhibidor GDF-8 y el segundo inhibidor ¡GDF-8 son los mismos. En algunas modalidades, el primer inhibidor GDF-8 es un anticuerpo que enlaza específicamente a GDF-8. En algunas modalidades, el segundo inhibidor GDF-8 es un anticuerpo que enlaza específicamente a GDF-8. Todavía en ¡modalidades adicionales, un inhibidor GDF-8 enlaza preferiblemente a GDF-8 sobre BMP-11. : En una modalidad adicional, se proporcionan métodos para :detectar un anticuerpo que enlaza específicamente a MYO-029 en ¡una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto MYO-,029 aislado con una superficie de un recipiente de reacción; (b) ¡agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) 'agregar MYO-029 etiquetado al recipiente de reacción; y (d) ¡detectar MYO-029 etiquetado asociado con la superficie. Los métodos para detectar un anticuerpo que enlaza específicamente a MYO-029 en una muestra biológica también se proporcionan como una modalidad específica. Los métodos de •esta modalidad comprenden: (a) poner en contacto MYO-029 aislado con una superficie de un recipiente de reacción; (b) ¡agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar GDF-8 etiquetada al recipiente de reacción; y (d) detectar GDF-8 etiquetada asociado con la superficie en presencia o ausencia de la muestra biológica. En otra modalidad, se proporcionan métodos para evaluar ¡una respuesta inmune individual a un primer inhibidor GDF-8, 'que comprende: (a) poner en contacto un primer inhibidor GDF-'8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar un segundo inhibidor GDF-8 etiquetada al recipiente de reacción; y (d) detectar un segundo complejo inhibidor/anticuerpo GDF-8 etiquetada asociada con la superficie, en donde la detección del complejo etiquetado ¡indica una respuesta inmune al primer inhibidor GDF-8. ! En una modalidad adicional, se proporcionan métodos para evaluar una respuesta inmune individual para un primer inhibidor GDF-8. Estos métodos comprenden: (a) poner en contacto un inhibidor GDF-8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar una proteína inhibidora ?GDF-8 etiquetada al recipiente de reacción; y (d) comparar la .cantidad de proteína GDF-8 etiquetada asociada con la superficie en la muestra de prueba a una cantidad de proteína ?GDF-8 etiquetada asociada con la superficie en una muestra de control, en donde la detección de un nivel disminuido de complejo etiquetado en la muestra de prueba como se compara 'Con la muestra de control indica una respuesta inmune al inhibidor GDF-8. En modalidades particulares, el agente modulador de GDF-8 se elige de un anticuerpo que se enlaza específicamente al ,GDF-8, un anticuerpo que se enlaza específicamente a un compañero de enlace de GDF-8, un receptor GDF-8 soluble, una 'proteína ActRIIB; una proteína que contiene el dominio de folistatina; una proteina de folistatina; una proteína GASP- 1, una proteína GDF-8, un propéptido GDF-8, un inhibidor no proteinico, un ácido nucleico, y una molécula pequeña. En algunas modalidades preferidas, el agente que modula GDF-8 es un inhibidor GDF-8. En algunas modalidades preferidas, el .agente modulador de GDF-8 es un anticuerpo que se enlaza .específicamente a GDF-8 tales como, por ejemplo MYO-029. En ciertas modalidades, la muestra biológica es de un mamífero, pájaro, reptil, o pez. En algunas modalidades .preferidas, la muestra biológica es de un humano. En modalidades particulares, la muestra biológica se elige de suero, sangre, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, .suspensión celular, saliva, fluido oral, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, leche, calostro, secreción de glándula mamaria, linfa, orina, sudor, fluido lagrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, y moco. En algunas modalidades preferidas, la muestra biológica es suero, sangre o plasma. En diversas otras modalidades, la etiqueta se elige de una enzima, un epítopo tag, una radioetiqueta, biotina, un pigmento, una etiqueta tag fluorescente, y una etiqueta luminiscente. En modalidades en donde la etiqueta es una .enzima, los métodos pueden comprender además agregar un ¡substrato que cambia el color, luminiscencia, o fluorescencia ¡en presencia de la enzima. En modalidades ilustrativas, la etiqueta es biotina, y el método comprende además agregar un ^conjugado de enzima y avidina. En una modalidad específica, el método comprende además un substrato que cambia el color, luminiscencia o fluorescencia en presencia de la enzima. Los aspectos y modalidades adicionales de la invención se establecerán en parte en la descripción la cual sigue, y ,en parte serán aparentes de la descripción, o pueden 'aprenderse por la práctica de la invención. Esta breve ¡descripción de la invención y la siguiente descripción no se pretenden para restringir la invención, como se proporciona en la reivindicaciones.

Breve Descripción De Las Secuencias El ADN y las secuencias de aminoácido (AA) de GDF-8, MYO-029, y fragmentos scFv relevantes, dominios VH y VL, y regiones que determinan la complementariedad (CDR) se establecen en el Listado de Secuencias y se enumeran como se enlista en la tabla 1. Tabla 1 SEQ ID NO Secuencia de AA de GDF-8 humano maduro 1 Secuencia de AA de precursor GDF-8 humano 2 Secuencia de ADN de MYO-029 scFv 3 Secuencia de AA de MYO-029 scFv 4 Secuencia de ADN de MYO-029 VH 5 Secuencia de AA de MYO-029 VH 6 Secuencia de ADN de MYO-029 VL 7 Secuencia de AA de MYO-029 VL 8 Secuencia de ADN de linea germen de MYO-029 scFv 9 Secuencia de AA de línea germen de MYO-029 scFv 10 Secuencia de ADN de línea germen VH 11 Secuencia de AA de línea germen de MYO-029 VH 12 Secuencia de ADN de línea germen de MYO-029 VL 13 Secuencia de AA de línea germen de MYO-029 VL 14 Secuencia de AA de MYO-029 Hl 15 Secuencia de AA de MYO-029 H2 16 Secuencia de AA de MYO-029 H3 17 Secuencia de AA de MYO-029 Ll 18 Secuencia de AA de MYO-029 L2 19 Secuencia de AA de MYO-029 L3 20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ilustra una modalidad del método de la i 'invención, en donde el agente modulador de GDF-8 es MYO-029, 'y el agente de detección es MYO-029 biotinilado. La figura 2 ilustra una modalidad del método de la invención, en donde el agente modulador de GDF-8 es MYO-029 y el agente de detección es GDF-8 biotinilado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN ' Esta invención se refiere a métodos para detectar anticuerpos que se enlazan específicamente a un agente modulador GDF-8 en una muestra biológica. Se proporcionan métodos para detectar una respuesta inmune a un agente modulador de GDF-8. En particular, se proporcionan en la presente métodos para evaluar una respuesta inmune en animales, incluyendo humanos, hasta un agente modulador de ¡GDF-8 exógeno, tales como un inhibidor GDF-8. En una •modalidad, se proporcionan los métodos para detectar la 'presencia de un anticuerpo neutralizante hasta un agente i modulador GDF-8, por ejemplo, MYO-029. En particular, se proporcionan métodos para evaluar la presencia y/o cantidad 'de anticuerpos que se enlazan específicamente a un agente ¡modulador GDF-8 en una muestra biológica de un individuo a ,los cuales el agente modulador GDF-8 se ha administrado. Cuando un agente modulador de GDF-8 se administra a un individuo, los métodos para detectar una respuesta inmune al ¡agente modulador GDF-8 administrado son útiles para determinar la presencia y/o la extensión de anticuerpos que ¡se enlazan específicamente al agente modulador GDF-8 en una muestra biológica. Los métodos también permiten que se evalúe un régimen terapéutico, para rastrear el curso de la terapia, para evaluar la conveniencia de un agente modulador GDF-8, para identificar un candidato para la terapia, o para ajustar la dosis del agente, por ejemplo. Los métodos pueden permitir 'además la identificación de un agente modulador GDF-8. Con objeto de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se definen primero. Las definiciones adicionales se establecen a través de la ¡descripción detallada. ' El término "GDF-8" se refiere a un crecimiento I ¡específico y diferenciación del factor-8. El término se refiere a la forma precursora no procesada de longitud completa de GDF-8 así como las formas maduras y propéptidos resultantes del desdoblamiento post-traduccional . A menos de !que se especifique de otra manera como "inactivo, " una "proteína GDF-8" retiene una o más actividades biológicas GDF-8. El término también se refiere a cualquier fragmento y variantes de GDF-8 que mantienen al menos una actividad biológica asociada con el GDF-8 maduro, como se discute en la 'presente, incluyendo secuencias que se han modificado. La secuencia de aminoácido del GDF-8 humano maduro se proporciona en la SEQ ID N0:1, y el precursor, la secuencia GDF-8 humana de longitud completa se proporciona en SEQ ID NO: 2. La presente invención se refiere al GDF-8 de todas las especies de vertebrados incluyendo, pero no limitado a, humanos, bovinos, pollos, ratones, ratas, porcinos, ovinos, ¡pavos, babuinos, y peces (para la información de secuencia, ¡ver, por ejemplo, McPherron et al., Proc. Nat. Acad. Sci. ¡U.S.A. 94:12457-12461 (1997)). ' El término "GDF-8 maduro" se refiere a la proteína que se desdobla del dominio de terminal carboxi de la proteína precursora de GDF-8. Dependiendo de las condiciones, el GDF-8 maduro puede presentarse como un monómero, homodímero, y/o en un complejo latente de GDF-8. En esta forma biológicamente 'activa, el GDF-8 maduro también puede referirse como el "GDF-8 activo". El término también se refiere a cualesquiera fragmentos y variantes de GDF-8 que mantienen al menos una actividad biológica asociada con el GDF-8 maduro, como se discute en la presente, incluyendo secuencias que sean modificado. El término "Propéptido GDF-8" se refiere al polipéptido que se desdobla del dominio de terminal amino de la proteína precursora de GDF-8. El Propéptido GDF-8 es capaz de enlazar al dominio de enlace del propéptido en el GDF-8 maduro. El 'propéptido GDF-8 forma un complejo con el homodímero GDF-8 .maduro. Se cree que dos propéptidos GDF-8 asociados con dos ¡moléculas del GDF-8 maduro en el homodímero parar formar un .complejo tetramérico inactivo, llamado complejo latente. El .complejo latente puede incluir otros inhibidores GDF en lugar !de o en adición a uno o más de los propéptidos GDF-8. I El término "actividad GDF-8" se refiere a una o más actividades morfogenéticas o fisiológicamente reguladoras del .crecimiento asociadas con la proteina GDF-8 activa. Por ejemplo, el GDF-8 activo es un regulador negativo de la masa 'del músculo esquelético. El GDF-8 activo puede también ! 'modular la producción de las enzimas especificas de músculo (por ejemplo, creatina cinasa) , proliferación estimulada por mioblasto, y modula la diferenciación del preadipocito a los adipocitos. La "actividad GDF-8" incluye "actividad del ienlace GDF-8". Por ejemplo, el GDF-8 maduro enlaza específicamente a la región del propéptido de GDF-8, a ActRIIB, a un receptor GDF-8, a la activina, a la folistatina, a las proteínas que contienen el dominio de folistatina, a la GASP-1, y a otras proteínas. Un inhibidor ¡GDF-8, tal como un anticuerpo o porción del mismo, puede ¡reducir una o más de estas actividades de enlace. Los ¡procedimientos ejemplares para medir la actividad GDF-8 in Ivivo e in vitro se establecen a continuación. El término "agente modulador de GDF-8" incluye cualquier ¡agente capaz de modular la actividad, expresión, proceso o secreción de GDF-8, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo. Los agentes que incrementan una o más actividades ¡GDF-8 y agentes que disminuyen una o más actividades GDF-8 se ¡abarcan por el término. El término "Inhibidor GDF-8" incluye i ¡cualquier agente capaz de afectar la actividad, expresión, proceso de GDF-8, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo. Un inhibidor GDF-8 reduce una o más actividades ,asociadas con GDF-8. En ciertas modalidades, un inhibidor ^DF-8 deberá afectar el enlace de GDF-8 a uno o más de sus 'compañeros de enlace fisiológicos, incluyendo, pero no i 'limitando a un receptor (por ejemplo, ActRIIB) , un dominio de folistatina que contiene la proteína (por ejemplo, folistatina, FLRG, GASP-1, GASP-2), o una proteína GDF-8 tal como el propéptido GDF-8 y mutantes y derivados de los mismos. Tales inhibidores GDF-8 incluyen, por ejemplo, ¡anticuerpos que se enlazan específicamente a GDF-8 ¡(incluyendo MYO-029, MYO-028, MYO-022, JA-16, y fragmentos y ¡derivados de los mismos), anticuerpos que se enlazan ¡específicamente a un receptor GDF-8, (ver, por ejemplo, 'Patente de E.U.A. No. 6,656,475, Patente de E.U.A. No. 2004/0077053-A1) , receptores solubles modificados (incluyendo proteínas de fusión del receptor, tales como la proteína de fusión ActRIIB-Fc) , otras proteínas que enlazan específicamente a GDF-8 (tal como el propéptido GDF-8, .mutantes y derivados del propéptido GDF-8, folistatina, proteínas que contienen el dominio de folistatina, y fusiones Fe de estas proteínas) , enlace de proteínas al receptor GDF-8 y fusiones Fe de estas proteínas, e imitadores se incluyen. Los inhibidores no proteínicos (tales como ácidos nucleicos) también se abarcan por el término inhibidor GDF-8. Los inhibidores GDF-8 incluyen proteínas, anticuerpos, péptidos, péptidoimitadores, ribozimas, oligonucleótidos anti-sentido, ARN de hebra doble, ARNsi (por ejemplo, para ARNi), y otras moléculas pequeñas, las cuales inhiben específicamente el GDF-8. Tales inhibidores se dice que son para "inhibir," "reducir," o "neutralizar" la actividad biológica de GDF-8, y se describen en más detalle a continuación. Un "inhibidor GDF-8" deberá "inhibir", "neutralizar", o "reducir" al menos una actividad biológica de GDF-8, tal como una actividad fisiológica, reguladora del crecimiento o .morfogenética asociada con la proteina GDF-8 activa. Por ejemplo, GDF-8 es un regulador negativo del crecimiento del músculo esquelético. Un inhibidor GDF-8 puede incrementar la masa muscular, incrementar la resistencia muscular, modular los niveles de las enzimas especificas del músculo (por ejemplo, creatina cinasa), la proliferación estimulada por mioblasto y modula la diferenciación del preadipocito a los adipocitos, disminuye la acumulación de grasa, disminuye los niveles de triglicéridos en el suero, disminuye los niveles de colesterol en el suero, modula el metabolismo de la glucosa, y/o reduce la hiperglicemia . También, GDF-8 bloquea la expresión inducida por insulina de GLUT4, y bloquea la ¡diferenciación mediada por insulina de preadipocitos. I ¡ Los términos "inhibir, " "inhibidor, " y sus similares se i refieren a una reducción en una o más actividades de GDF-8 i por un inhibidor GDF-8, relativo a la actividad de GDF-8 en la ausencia del mismo inhibidor. La reducción en la actividad ¡es preferiblemente al menos alrededor de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o más. En ciertas modalidades, la actividad de GDF-8, cuando se afecta por uno o más de los inhibidores descritos en la presente, se reduce al menos 50%, .preferiblemente al menos 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, '74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86%, ó 88%, más preferiblemente al menos 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ó 99%, y aun más preferiblemente al menos 95% hasta 100% con relación a una .proteína GDF-8 en ausencia del inhibidor GDF-8. Los términos ."neutralizar, " "neutralizante, " y sus similares se refieren a ¡una reducción de una o más actividades GDF-8 por al menos 80%, 85%, 90%, ó 95%. La inhibición de la actividad GDF-8 puede medirse por ejemplo, en los ensayos del gen indicador 'pGL3 (CAGA) 12 (RGA) como se describe en Thies et al., Growth Factors 18:251-259 (2001) o en ensayos del receptor ActRIIB ¡como se ilustra a continuación. El término "anticuerpo," como se usa en la presente, es ¡cualquier polipéptido que comprende un sitio de enlace al 'antígeno, tal como una inmunoglobulina o un fragmento del mismo, y abarca cualquier polipéptido que comprende un sitio ¡de enlace al antígeno independientemente de la fuente, i ¡especies de origen, método de producción y características. Como ejemplos no limitantes, el término "anticuerpo" incluye .anticuerpos sintéticos, humanos, orangután, mono, primate, .ratones, ratas, cabra, perro, oveja, y pollo. El término ¡incluye pero no se limita a anticuerpos policlonales, 'monoclonales, monoespecificos, poliespecificos, no 'específicos, humanizados, cadenas sencillas, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, e CDR- injertado. Para los propósitos de la presente invención, el "anticuerpo" también incluye fragmentos de anticuerpo, a menos de que se establezca de otra manera (tal como cuando ¡precede por la palabra "intacto"). Los fragmentos ejemplares de anticuerpos incluyen Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, y otros fragmentos de anticuerpos que retienen la función de .enlace al antígeno. Típicamente, tales fragmentos comprenden un dominio de enlace al antígeno. Se deberá reconocer por ¡aquellos de habilidad en el arte, que cualquiera de tales moléculas, por ejemplo, un anticuerpo "humano", se puede preparar por ingeniería (por ejemplo "línea germinal") para disminuir su inmunogenicidad, incrementar su afinidad, alterar su especificidad, o para otros propósitos. Los anticuerpos pueden hacerse, por ejemplo, por medio de técnicas de hibridoma tradicionales (Kohler et al., Nature 256:495-499 (1975)), métodos de ADN recombinantes (Patente de ¡E.U.A. No. 4,816,567), o técnicas que exhiben del fago usando ¡colecciones de anticuerpos (Clac son et al., Nature 352:624-¡628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). i Para diversas otras técnicas de producción del anticuerpo, ver Antibodies: A Laboratory Manual, (Harlow et al., eds., .Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). El término "dominio de enlace al antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende el área específicamente enlazada a o complementaria a una parte o todo de un antígeno. Donde un antígeno es grande, un anticuerpo puede solamente enlazar a una parte particular del 'antígeno. El "epítopo" o "determinante antigénico" es una ¡porción de una molécula de antigeno que se involucra en las ¡interacciones específicas con el dominio de enlace al ¡antigeno de un anticuerpo. Un dominio de enlace al antígeno ¡puede proporcionarse por uno o más dominios variables del .anticuerpo (por ejemplo, un fragmento del anticuerpo Fd consiste de un dominio VH) . En ciertas modalidades, un ¡dominio de enlace al antígeno comprende una región variable 'de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de ¡cadena pesada del anticuerpo (VH) (Patente de E.U.A. No. ¡5,565,332) . : Los términos "enlace específico, " "específicamente ¡enlazado," o similares, significan que dos o más moléculas forman un complejo que se mide bajo condiciones fisiológicas ó de ensayo y es selectivo. Un anticuerpo u otro inhibidor es "específicamente enlazado" a una proteína si, bajo ¡condiciones apropiadamente seleccionadas, tal enlace no se I ¡inhibe substancialmente, mientras que al mismo tiempo el ¡enlace no específico se inhibe. El enlace específico puede caracterizarse por una afinidad relativamente alta y es selectivo para el compuesto o proteína. El enlace no 'específico usualmente tiene una baja afinidad. Típicamente, el enlace es considerado específico cuando el constante de afinidad Ka es al menos alrededor de 106 M'1, o preferiblemente al menos alrededor de 107, 108, 109, ó 1010 M" 1. Ciertos métodos requieren alta afinidad para el enlace específico, mientras que otros métodos, tales como un ensayo de resonancia del plasmon de la superficie, puede detectar menos complejos estables y bajas interacciones de afinidad. Si es necesario, el enlace no específico puede reducirse dentro del enlace específico substancialmente afectado por ¡variar las condiciones de enlace. Tales condiciones son bien conocidas en el arte, y alguien de habilidad en el arte puede usar técnicas de rutina que pueden seleccionar condiciones apropiadas. Las condiciones se definen usualmente en los términos de concentración de los compañeros de enlace, resistencia iónica de la solución, temperatura, tiempo permitido para el enlace, concentración de moléculas no relacionadas (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de .leche), etc. Las condiciones de enlace ejemplares se ¡establecen en los Ejemplos. El término "aislado" se refiere a una molécula que es ¡substancialmente libre de su ambiente natural. Por ejemplo, ¡una proteína aislada es substancialmente libre de material ¡celular u otras proteínas de la fuente celular o tejido del cual se derivan. El término se refiere a preparaciones donde ,1a proteína aislada es suficientemente pura para 'administrarse como una composición terapéutica, o al menos 70% hasta 80% (p/p) puro, más preferiblemente, al menos 80%-90% (p/p) puro, aun más preferiblemente, 90-95% puro; y, más preferiblemente, al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% (p/p) puro. El término "individuo" se refiere a cualquier animal ¡vertebrado, incluyendo un mamífero, ave, reptil, anfibio, o ¡pez. El término "mamífero" incluye cualquier animal ¡clasificado tal como, macho o hembra, incluyendo humanos, ¡primates no humanos, monos, perros, caballos, gatos, ovejas, ¡cerdos, cabras, ganado, etc. Los ejemplos de animales no mamíferos incluyen pollos, pavos, patos, gansos, peces, •salmones, bagres, róbalos, ranas, y truchas. Un individuo puede elegirse de humanos, atletas, o animales domesticados, ¡ganado, zoológico, deportivos, carreras, o mascotas, por ejemplo . ¡ El término "dosis efectiva," o "cantidad efectiva," se i 'refiere a una dosis o nivel que es suficiente para aliviar los síntomas clínicos de, o lleva a cabo un resultado biológico deseado (por ejemplo, incrementando la masa •muscular, fuerza muscular, y/o densidad del hueso) en .individuos, incluyendo individuos que tienen un trastorno ¡asociado con GDF-8. Tal cantidad deberá ser suficiente para 'reducir la actividad de GDF-8 asociada con la regulación 'negativa de la masa del músculo esquelético y densidad del hueso, por ejemplo. El resultado terapéutico y síntomas clínicos pueden incluir la reducción de la grasa corporal, incremento en la masa muscular, mejora en los indicadores cardiovasculares, o mejora de la regulación del metabolismo de glucosa. Un inhibidor GDF-8 puede incrementar la masa ¡muscular, incrementar la resistencia muscular, modular los niveles de las enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina cinasa), y/o proliferación estimulada por mioblasto, por ejemplo. En una modalidad preferida, un 'inhibidor GDF-8 reduce las manifestaciones clínicas de un trastorno asociado con GDF-8. Un agente modulador de GDF-8 puede modular la diferenciación del preadipocito a los adipocitos, disminuye la acumulación de grasa, disminuye los niveles de triglicéridos en el suero, disminuye los niveles de colesterol en el suero, modula el metabolismo de la 'glucosa, modula la densidad del hueso y reduce la hiperglicemia, por ejemplo. Un inhibidor GDF-8 puede también administrarse a un individuo en el orden para incrementar la ¡masa muscular, para mejorar el desempeño atlético, o para I I'incrementar o acelerar el crecimiento, incluyendo crecimiento del músculo. La cantidad efectiva puede determinarse como se describe en las secciones posteriores. ,Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un inhibidor 'GDF-8 se refiere a una cantidad la cual es efectiva, durante 'la administración de dosis sencillas o múltiples a un individuo (tal como un humano) para tratar, prevenir, presentar, detener, reducir la severidad de, o aliviar al menos un síntoma de un trastorno o trastorno repetitivo, o ¡prolongar la supervivencia del sujeto más allá de lo esperado en la ausencia de tal tratamiento. Un "trastorno asociado con GDF-8" es un trastorno o ¡condición en el cual un sujeto deberá beneficiarse de la ¡administración de un modulador GDF-8, tal como un inhibidor GDF-8. Los trastornos asociados con GDF-8 incluyen trastornos médicos tales como un trastorno o condición neuromuscular o ¡relacionado con el músculo, o un tejido adiposo, trastorno o 'condición relacionado con el hueso o metabólico. ¡ La administración de un inhibidor GDF-8 puede ser ¡"terapéutica" cuando el inhibidor se administra a un individuo para tratar un trastorno, el cual incluye aliviar ¡y/o la prevención de síntomas o del trastorno. Los usos I ¡ Iterapéuticos incluyen la administración de un agente modulador de GDF-8 a un individuo que tiene un trastorno I médico o quien finalmente puede adquirir el trastorno, con I I ¡objeto de prevenir, curar, detener, reducir la severidad de, i ,o aliviar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno repetitivo, o con objeto de prolongar la supervivencia del sujeto más allá de lo esperado en la ausencia de tal tratamiento. Un inhibidor GDF-8 puede incrementar la masa muscular, resistencia muscular, modular los niveles de i 'enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina cinasa) , y la proliferación estimulada por mioblasto, por ejemplo. Un agente modulador de GDF-8 puede modular la 'diferenciación de preadipocito para adipositos, disminuye la 'acumulación de grasa, disminuye los niveles de triglicéridos ¡en el suero, disminuye los niveles de colesterol en el suero, ¡modula el metabolismo de la glucosa, modula la densidad del .hueso, y reduce la hiperglicemia, por ejemplo. Un inhibidor ¡GDF-8 también puede administrar a un individuo en orden para 'incrementar la masa muscular, para mejorar el desempeño ¡atlético, o para incrementar o acelerar el crecimiento, 'incluyendo crecimiento del músculo. El término "altamente severas" o de "alta severidad" ¡describe condiciones para la hibridización y lavado usados ¡para determinar la interacciones del ácido nucleico-ácido nucleico. Tales condiciones son conocidas por aquellos de habilidad en el arte y pueden encontrarse en, por ejemplo, Wiley et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Ambas condiciones acuosas y no acuosas como se describe en el arte pueden usarse. Un ejemplo de condiciones de hibridización altamente severas es la hibridización en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45°C, seguido por al menos un lavado en 0.2X SSC, 0.1 % sulfato de dodecilo de sodio (SDS) 'a 50°C. Otros ejemplos de condiciones de hibridización altamente severas incluyen la hibridización en 6X SSC a alrededor de 45°C (o 50°C, 60°C, ó 65°C) seguido por al menos 'un lavado en 0.2X SSC, 0.1 % SDS a alrededor de 55°C, 60°C, o 65°C. Las condiciones altamente severas pueden también se de i'hibridización en 0.5M fosfato de sodio, 7% SDS a 65°C, seguido por al menos un lavado a 0.2X SSC, 1 % SDS a 65°C (ver también, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . i ¡ La frases "substancialmente idéntico" o "substancialmente similar" significa que el aminoácido relevante o secuencia de nucleótido, tal como de los inhibidores GDF-8 de la invención, serán idénticos para o tener diferencias no substanciales (a través de substituciones de aminoácido conservadas) en comparación con las secuencias las cuales se describen. El nucleótido o polipéptidos de la invención incluyen, por ejemplo, aquellos que son al menos alrededor de 60&, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticos en secuencia a las moléculas de ácido nucleido y polipéptidos descritos . Para polipéptidos, al menos 20, 30, 50, 100, o más ¡aminoácidos serán comparados entre el polipéptido original y el polipéptido variante que es substancialmente idéntico al 'original. Para ácidos nucleicos, al menos 50, 100, 150, 300 o más nucleótidos serán comparados entre el ácido nucleico original y el ácido nucleico variante que es substancialmente idéntico al original. De esta manera, una variante puede ser substancialmente idéntico en una región o regiones, pero divergente en otras, mientras todavía cumplan con la definición de "substancialmente idénticos." El porcentaje de identidad entre dos secuencias se determina por algoritmos ¡alineados estándar tales como, por ejemplo, Basic Local .Alignment Tool (BLAST) descrito en Altschul et al., J. Mol. ¡Biol. 215:403-410 (1990), el algoritmo de Needleman et al., ¡J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970), o el algoritmo de Meyers et ¡al., Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988). El término "variante" se refiere a secuencias de nucleótido y aminoácido que son substancialmente idénticas o similares a las secuencias de nucleótido o aminoácido de, por ejemplo, los inhibidores GDF-8 proporcionados, respectivamente. Las variantes pueden presentarse naturalmente, por ejemplo, secuencias de nucleótido no humano y humano que se presentan naturalmente, por ser generan artificialmente. Los ejemplos de variantes son aquellos que resultan de empalme alternativo del ARNm, incluyendo tanto variante de empalme 3' y 5' , mutaciones de punto y otras ¡mutaciones, o desdoblamiento proteolítico de las proteínas. ¡Las variantes incluyen moléculas de ácido nucleico o ¡fragmentos de los mismos y secuencias de aminoácidos y fragmentos de los mismos, que son substancialmente idénticos o similares a otros ácidos nucleicos (o su hebra complementaria cuando se alinean óptimamente (con inserciones o eliminaciones apropiadas) o secuencias de aminoácido respectivamente. En una modalidad, es al menos alrededor de ¡60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, ,97%, 98% ó 99% idéntico entre una molécula o proteína de .ácido nucleico de la invención y otra molécula o proteína de .ácido nucleico respectivamente, cuando óptimamente se ¡alinean. Adicionalmente, las variantes incluyen proteínas o ¡polipéptidos que muestran actividad GDF-8 o inhiben la 'actividad GDF-8, como se discute en esta solicitud. ¡ Una "muestra biológica" es material biológico 'recolectado de un individuo, tal como células, tejidos, órganos, fluidos. Las muestras biológicas ejemplares incluyen ¡suero , sangre y plasma . i I El término "recipiente de reacción" se refiere a un ¡recipiente en el cual un ensayo in vitro tal como una ¡reacción de asociación entre un agente modulador de GDF-8 y I ¡un anticuerpo puede presentarse y ser detectado. Una ."superficie" es la parte exterior de cualquier sólido (tal ¡como, por ejemplo, cristales, celulosa, poliacrilamida, ¡nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo, sulfato de ¡dextrano, o polipropileno tratado) en la cual un agente 'modulador de GDF-8 puede directamente o indirectamente ¡"ponerse en contacto," "inmovilizarse," o "recubrirse." Una ."superficie de un recipiente de reacción" puede ser una parte ¡del mismo recipiente, o la superficie puede estar en el i ¡recipiente de reacción. Una superficie tal como poliestireno, por ejemplo, puede someterse a tratamiento químico o de .radiación para cambiar las propiedades de enlace de su ¡superficie. Las superficies de enlace medio, enlace alto, ¡aminado y activado se abarcan por el término. Un agente ¡modulador de GDF-8 puede ponerse directamente en contacto con ¡una superficie, por ejemplo, por absorción física o enlace ¡covalente a la superficie, o este puede ponerse ¡indirectamente en contacto, por ejemplo, a través de una ¡interacción con una sustancia o porción que se pone directamente en contacto con la superficie. ' El término "agente de captura" como se usa en la presente, se refiere a una molécula, tal como una proteína, por ejemplo, que se usa en un inmunoensayo para enlazar específicamente a una proteína objetivo, tal como un agente modulador de GDF-8 o GDF-8 por el mismo. Un agente de captura adecuado para los presentes métodos enlaza específicamente al agente modulador de GDF-8 y/o a la proteína GDF-8. Por ejemplo, un agente de captura puede ser una proteína GDF-8, incluyendo un dímero GDF-8 maduro, o una proteína que enlaza específicamente a una proteína GDF-8. Similarmente, un agente ¡de captura puede ser un agente modulador de GDF-8 o una proteína que enlaza específicamente a un agente modulador de ¡GDF-8. Un "agente de detección" es una proteína o molécula pequeña que se enlaza específicamente a un anticuerpo para un agente modulador de GDF-8. Un agente de detección puede ¡opcionalmente comprender una etiqueta detectable. Un agente ¡de detección puede también por sí mismo detectarse por un ¡agente de detección que comprende una etiqueta detectable. El término "etiqueta" se refiere a una molécula la cual, por su ¡naturaleza química, proporciona una señal analíticamente ¡identificable la cual permite la detección de una interacción molecular. Una proteina, incluyendo un anticuerpo, tiene una ¡etiqueta detectable si este es un enlace covalente o no ¡covalente a una molécula que puede directamente detectarse '(por ejemplo, por medio de una cromóforo, fluoróforo o ¡radioisótopo) o indirectamente (por ej emplo, por medio de ¡catalizar una reacción que produce un producto coloreado, i iluminiscente o fluorescente) . La presente invención se refiere a métodos para detectar ¡una respuesta inmune para un agente modulador GDF-8 asi como •métodos para detectar anticuerpos para un agente modulador 'GDF-8 en una muestra biológica. En una modalidad, los métodos para detectar anticuerpos, en particular anticuerpos capaces de enlazar a constituyentes de agentes moduladores de GDF-8 terapéuticos in vivo, incluyendo inhibidores GDF-8. En algunas modalidades, los ensayos detectan anticuerpos neutralizantes, tales como anticuerpos que inhiben la acción del agente modulador de GDF-8. En una modalidad particular, los ensayos detectan anticuerpos que inhiben el enlace de 'MYO-029 hasta GDF-8. Los métodos son útiles para evaluar la ¡conveniencia de pacientes humanos para recibir anticuerpos ¡terapéuticos, u otros agentes moduladores de GDF-8, por 'ejemplo, que inhiben una actividad biológica de GDF-8. En una .modalidad específica, los métodos detectan la presencia de ¡anticuerpos de una muestra biológica para MYP-029. ¡ Un individuo con un trastorno asociado a GDF-8, un 'individuo con riesgo para desarrollar un trastorno asociado .con GDF-8, un individuo que experimenta terapia con un agente ¡modulador de GDF-8, y un individuo el cual es un candidato ¡para la administración de un agente modulador de GDF-8, puede 'ser un candidato para los métodos proporcionados en la 'presente. Los métodos de la invención pueden detectar o ¡prevenir una respuesta inmune eliminada, y/o evaluar la ¡eficacia, estabilidad biológica, o conveniencia de uso de un 'agente modulador de GDF-8. Un individuo que tiene, o está en riesgo de desarrollar, I un trastorno asociado con GDF-8 tal como un trastorno 'relacionado con el músculo o un trastorno neuromuscular es un candidato para los métodos proporcionados en la presente. La inhibición de la actividad GDF-8 incremente el tejido 'muscular en individuos, incluyendo aquellos que sufren de 'trastornos relacionados con el músculo. Un número de trastornos se asocian con funcionalidad deteriorada del músculo o tejido del nervio, por ejemplo, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), sarcopenia, caquexia, .desgaste muscular, atrofia muscular o degeneración muscular, ¡incluyendo desgaste, atrofia, o debilidad. Las distrofias ¡musculares incluyen, por ejemplo, distrofias musculares ¡pseudohipertrófica, facioescapulohumeral, y de cintura y .extremidades. Las distrofias musculares ejemplares incluyen distrofia muscular de Duchenne (Leyden-Mobius) , distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Emery Dreifuss, distrofia muscular de cintura y extremidades, síndrome de columna rígida, síndrome de Ullrich, distrofia muscular de 'Fukuyama, síndrome de Walker Warburg, enfermedad del músculo del ojo y cerebro, distrofia muscular facioescapulohumeral I ¡ (Landouzy-Dejerine) , distrofia muscular congénita, distrofia ¡miotónica (enfermedad de Steinert) , miotonia congénita, y i 'enfermedad de Gowers. , Un trastorno muscular asociado con GDF-8 también incluye I .una elección de trastorno de degeneración del músculo asociado con enfermedad cardiovascular, o secundaria a otra ¡enfermedad o condición tal como atrofia de órgano, insuficiencia de órgano, cáncer, síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA), reposo en cama, inmovilización, carencia prolongada de uso, u otra enfermedad o condición también se incluye en el término. Un individuo que tiene, o está en riesgo de desarrollar, trastornos de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad), trastornos cardiovasculares (cuando se asocia con ,1a perdida de músculo o desgaste del músculo) , y trastornos de metabolismo de insulina pueden ser un candidato.

¡Similarmente, los individuos que tienen, o están en riesgo ¡de desarrollar, un trastorno asociado con la pérdida ósea, ¡incluyen osteoporosis, especialmente en las mujeres en edad ¡avanzada y/o post-menopáusica, osteoporosis inducida por ¡glucocorticoides, osteopenia, osteoartritis, y fracturas relacionadas por la osteoporosis son candidatos por los 'métodos en la presente. Otras condiciones asociadas con GDF-.8 incluyen enfermedades y trastornos de hueso metabólicos que se caracterizan por la pérdida de masa ósea, tal como i ¡aquellas debido a la terapia de glucocorticoide crónica , ¡insuficiencia de la gónada prematura , supresión de ¡andrógenos , deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo i ¡secundario, deficiencias nutricionales, y anorexia nerviosa.

Los ejemplos de trastornos cardiovasculares incluyen enfermedad arterial coronaria (ateroesclerosis), angina ¡(incluyendo angina aguda y angina inestable), ataque ¡cardiaco, apoplejía (incluyendo apoplejía isquémica), 'hipertensión asociada con enfermedades cardiovasculares, 'insuficiencia cardiaca, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedad arterial coronaria, hipertensión, hiperlipidemia, enfermedad arterial periférica, y enfermedad vascular periférica. Los ejemplos de trastornos del metabolismo de insulina incluyen condiciones asociadas con homeostasis de .glucosa aberrante, diabetes tipo 2, prediabetes, tolerancia a 'la glucosa deteriorada, dislipidemia, síndrome metabólico . (por ejemplo, síndrome X), y resistencia a la insulina .inducida por trauma tal como quemaduras o desequilibrio de nitrógeno. Además, un individuo que desea incrementar la masa muscular o resistencia muscular, por ejemplo para mejorar el desempeño atlético o para incrementar el crecimiento o masa del tejido muscular en animales de ganado, es un candidato ¡para un método proporcionado en la presente. Un individuo exhibe un incremento en la masa muscular, tal como un ¡incremento en el tamaño celular muscular (hipertrofia) o i 'número celular de músculo (hiperplasia) puede ser un 'candidato para un método para detectar un anticuerpo para un agente exógeno que modula el GDF-8. El incremento puede ser en las fibras del músculo de tipo 1 y/o tipo 2 de un mamífero ,u otro animal. Los métodos para medir un incremento en la ¡masa muscular son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, el ¡músculo puede medirse antes de y después de la administración 'de un aqente modulador de GDF-8 usando técnicas estándar tales como pesado subacuático. Un incremento en el tamaño muscular puede ser evidente por el aumento de peso de al .menos alrededor de 5%, 10%, 20%, o más. En una modalidad, la presente invención comprende un ¡método para detectar un anticuerpo que específicamente enlaza 'a un agente modulador de GDF-8 en una muestra biológica de al .menos un individuo, la cual comprende las etapas de: (a) ¡agregar el agente modulador de GDF-8 a un ensayo in vitro .para una actividad de GDF-8 en un recipiente de reacción; (b) ¡agregar la muestra biológica al ensayo in vitro para una ¡actividad GDF-8 en el recipiente de reacción; (c) detectar la ¡modulación de la actividad de GDF-8 por la muestra biológica; y (d) comparar la modulación de la actividad de GDF-8 en presencia de la muestra biológica para la modulación de la actividad de GDF-8 en presencia del agente modulador de GDF-8 solo. En ciertas modalidades, el ensayo in vitro es un inmunoensayo para detectar el enlace del anticuerpos al 'agente modulador de GDF-8, por ejemplo, en un formato de ¡ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) . En una modalidad, el enlace al agente GDF-8 se detecta con un agente I ¡de detección que es el agente modulador de GDF-8 con una ^etiqueta detectable. En otra modalidad, el agente de ¡detección es una proteína GDF-8 etiquetada. En otra modalidad, el ensayo in vitro es un ensayo basado en células 'para la actividad de GDF-8 tales como, por ejemplo, un ensayo 'del gen indicador. En ciertas modalidades, el ensayo in vitro mide una o más actividades morfogenéticas o fisiológicamente reguladoras del 'crecimiento asociadas con la proteína GDF-8 activa. Los 'ensayos in vitro para detectar la modulación de una actividad ¡GDF-8 pueden elegirse de un ensayo basado en células o ensayo ¡libre de células (tal como, por ejemplo, un ensayo para medir ¡la modulación de la transcripción, replicación o arresto de ¡ciclo celular) o un ensayo de enlace (tal como, por ejemplo, 'un inmunoensayo, un ensayo de resonancia del plasmon de la 'Superficie, inmunoprecipitación, o un ensayo radioinmune) . Por ¡ejemplo, el GDF-8 activo es un regulador negativo de la masa ¡del músculo esquelético, este modula la producción de las ¡enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina ¡cinasa) , estimula la proliferación del mioblasto, y modula la diferenciación del preadipocito a los adipocitos. En algunos i métodos, la selección de los agentes que modulan el GDF-8 a partir de los agentes que modulan el BMP-11 se llevó a cabo. Los ensayos basados en células y libres de células para una actividad GDF-8 son conocidos en el arte y se describen infra.

¡Ensayos de enlace En una modalidad, la presente invención comprende un método para detectar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica seleccionada de una o más muestras de pacientes, las cuales comprenden las siguientes etapas: (a) poner en contacto el agente modulador de GDF-8 con una .superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al ensayo al recipiente de reacción; (c) ¡agregar un agente de detección al recipiente de reacción; y !(d) detectar un complejo agente/anticuerpo modulador de GDF-8 i ¡asociado con la superficie del recipiente de reacción. Dos modalidades se describen en las figuras 1 y 2. En la etapa (a) de ciertas modalidades, el agente modulador de GDR-8 se pone en contacto con la superficie de un recipiente de reacción, por ejemplo ya sea por ser un enlace covalente o no covalente a la superficie. El contacto .puede ser directo o indirecto. La superficie sólida es 'típicamente cristal o un polímero, tal como, por ejemplo, ¡celulosa, sulfato de dextrano, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno y puede ser en la forma de una perla, incluyendo una perla magnética o paramagnética. La superficie puede modificarse, por ejemplo por tratamiento químico o de radiación para afectar las características de enlace de la superficie. La inmovilización de los ligandos en la superficie puede llevarse a cabo por .interacciones covalentes o no covalentes, tales como absorción fisica. En agente modulador de GDF-8, por ejemplo, 'MYO-029, pueden adsorberse directamente a la superficie de un ¡recipiente de reacción. En otras modalidades, un agente 'modulador de GDF-8 puede asociarse con una superficie de recipiente de reacción por medio de la interacción de una molécula de biotina, covalentemente enlazado al agente, con una molécula de avidina, tener contacto con la superficie del recipiente de reacción. Los métodos de enlace covalente incluyen acoplamiento con un agente de reticulación tal como glutaraldehído, isocianato de hexametileno, un agente que contiene sulfo, un péptido, un agente alquilante, o un reactivo similar. En algunas modalidades preferidas, el agente modulador de GDF-8 es un anticuerpo que enlaza 'específicamente a GDF-8, un anticuerpo monoclonal que 'específicamente enlaza a GDF-8, un anticuerpo neutralizante para GDF-8, MYO-029, MYO-028, MYO-022, o JA-16, o un 'fragmento de cualquiera de los mismos. Las características estructurales y funcionales de estos inhibidores GDF-8 se establecen, por ejemplo en la Pub. de Patente de E.U.A. Nos. 2004/0142382-A1 y 2003/0138422-A1, y aquellas porciones se incorporan específicamente en la presente para referencia, además para incorporación de los documentos enteros. En particular, las características de ciertos anticuerpos neutralizantes, incluyendo MYO-029, se describen en la Pub. de Patente de E.U.A No. 2004 /0142382-A1 en los párrafos 54- 90, y reivindicaciones 1-42. Similarmente, los inhibidores de 'anticuerpo de la Pub. de Patente de E.U.A. No. 2003/0138422-'Al, se describen en los párrafos 56-70, 93-110, y reivindicaciones 1-54. En ciertas modalidades, después de poner en contacto el agente modulador de GDF-8 con la superficie del recipiente de reacción, el recipiente de reacción se lava para remover el agente modulador de GDF-8 no enlazado previo a la adición de la muestra biológica. Las interacciones no específicas se minimizan con una etapa de bloqueo, en donde una solución amortiguadora comprende al menos un agente de bloqueo, tal .como una proteína que no se enlaza específicamente al ¡objetivo se agrega al recipiente de reacción. En otras ¡modalidades, los detergentes pueden agregarse, tal como detergentes iónicos o no iónicos. Las soluciones .amortiguadoras de bloqueo pueden comprender suero, albúmina de suero de bovino, leche, caseína, gelatina, y/o detergentes no iónicos, por ejemplo. En algunas modalidades, el recipiente de reacción se lava con una solución amortiguadora con pH entre alrededor de 5 y alrededor de 9, tal como una ¡solución amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de ¡fosfato, solución amortiguadora Tris o solución amortiguadora ¡de acetato. I i Ciertas modalidades comprenden la etapa (b) , en la cual (una muestra biológica se agrega al recipiente de reacción. La 'muestra para probarse puede elegirse a partir de suero, sangre, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, 'suspensión celular, saliva, fluido oral, fluido ¡cerebroespinal, fluido amniótico, leche, calostro, secreción de la glándula mamaria, linfa, orina, sudor y fluido lagrimal. En modalidades preferidas, la muestra biológica es un fluido. En algunas modalidades preferidas, la muestra biológica se elige a partir de la sangre, suero, y plasma. En las modalidades específicas, la muestra biológica es suero, tales como suero de humanos, monos, ratas o ratones. En otras modalidades, la muestra biológica se aisla de un individuo o individuos y opcionalmente se trata previo a la prueba. La muestra biológica puede también usarse como se ¡recolecta o después de la dilución con un diluyente adecuado. ¡Las diluciones se optimizaron para reducir y/o eliminar la .interferencia de matriz con el ensayo. El diluyente ¡particularmente no se restringe pero puede comprender agua ¡desionizada o diversas soluciones amortiguadoras que tienen 'una solución amortiguadora de acción dentro del rango de i ¡alrededor de pH 5 hasta alrededor de pH 9 , preferiblemente I 'alrededor de pH 6.5 hasta alrededor de pH 8.5, (por ejemplo, I 'solución amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de i fosfato, solución amortiguadora Tris, solución amortiguadora de acetato, o solución amortiguadora de borato) . En algunas modalidades preferidas, el diluyente comprende suero de 'humano normal. El diluyente puede comprender una concentración constante de una muestra de control biológica, 'elegida para corresponder a la muestra de prueba biológica, por ejemplo, para control de efectos de respaldo o interferencia de la matriz de muestra. En una modalidad, una muestra de prueba del suero humano 'se diluye en solución amortiguadora THST (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, que contiene 1.0 mM glicina, 0.5 M NaCl, y 0.05% (v/v) .Tween 20®) 1:8 veces, y diluciones de la muestra de prueba ¡más allá de 8 veces se prepararon en THST más 12.5% de suero humano. Una muestra puede diluirse aproximadamente 2, 4, 8, ¡16, 32, 64, ó 128 veces o más. En otras modalidades, una muestra de prueba es diluida en serie 1:1.5 ó 1:1.6 para ¡obtener un rango de puntos de datos que permiten la ¡verificación de diluciones lineales y efectos de matriz. Para ¡las matrices de muestras biológicas preferidas, una dilución puede seleccionarse en la cual la interferencia de matriz y .sensibilidad de ensayo se optimizan.

En algunas modalidades, la muestra puede opcionalmente fraccionarse o concentrarse usando métodos bien conocidos y luego agregarse a un método proporcionado en la presente para detectar un agente modulador de GDF-8. El fraccionamiento (incluyendo purificación) o concentración puede usarse, por ejemplo, si la matriz interfiere en los limites de detección de un agente modulador de GDF-8 en el ensayo. Las técnicas de fraccionamiento y concentración, incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, precipitación de sulfato de amonio, ¡precipitación de polietilen glicol, precipitación (TCA) del ácido tricloroacético, técnicas de afinidad (tales como inmunoprecipitación con un conjugado de resina a un compañero de enlace específico tal como un anticuerpo, esto es, un anticuerpo Fe anti-humano, proteína A o proteína G, por ejemplo) , técnicas de cromatografía, y otras técnicas de separación. En modalidades preferidas, la muestra biológica no se fracciona o concentra previo a la detección de un agente modulador de GDF-8. Una muestra biológica puede recolectarse de un individuo ,sin tratar, o una muestra puede tomarse antes, durante o después de la administración de un agente modulador de GDF-8. ,Por ejemplo una muestra puede obtenerse de un individuo 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, o más días después de la administración de un agente modulador de GDF-8. Una muestra ¡puede también obtenerse 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, o más semanas después de la administración de un agente modulador de GDF-8. Una cantidades substanciales de agente modulador de GDF-8 circulante puede comprometer la detección de anticuerpos al agente en ciertas modalidades de los métodos proporcionados en la presente (ver, por ejemplo, Ejemplo 7), 'la programación de que la colección de la muestra puede optimizarse para reducir la interferencia de un agente modulador de GDF-8. La persistencia de una respuesta de 'anticuerpo también se prueba para examinar los puntos de 'tiempo extendidos. En algunos casos, los puntos de tiempo de hasta un año o mayor son apropiados. En ciertas modalidades, una alícuota de la muestra a probarse se pone en contacto con el antígeno inmovilizado y se incuba durante un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 2-120 minutos, 1-4 horas) y bajo condiciones .adecuadas (por ejemplo, 23°C) para permitir el enlace de cualquier anticuerpo al agente modulador de GDF-8 presente en la muestra y se permite para formar complejo de agente que modula GDF-8/anticuerpo . En otras modalidades, la reacción agente/anticuerpo que modula el GDF-8 no se restringe particularmente pero puede conducirse bajo condiciones en el 'uso de la rutina para inmunoensayos convencionales. Un .procedimiento típico comprende incubar o permitir mantener un sistema de reacción que comprende el anticuerpo y agente ¡modulador de GDF-8 generalmente a una temperatura de no más de 45°C, preferiblemente entre alrededor de 4°C y alrededor ' ¡de 40°C, más preferiblemente entre alrededor de 23°C y ¡alrededor de 40°C por entre alrededor de 0.5 y 40 horas, preferiblemente entre alrededor de 1 y alrededor de 20 horas. En modalidades preferidas, la solución amortiguadora de reacción se selecciona para evitar la interferencia con la reacción o la detección del mismo. Por lo tanto, las modalidades incluyen, pero no se limitan a, soluciones .amortiguadoras a entre alrededor de pH 5 y alrededor de pH 9, ¡tal como una solución amortiguadora de citrato, solución 'amortiguadora de fosfato, solución amortiguadora Tris y .solución amortiguadora de acetato. En ciertas modalidades, la etapa (c) comprende agregar un agente de detección al recipiente de reacción. Siguiendo el periodo de incubación, el anticuerpo inmovilizado hasta agente modulador de GDF-8 es, en algunas modalidades, se lava con solución amortiguadora para remover los solutos libres antes de la etapa (c) . En otras modalidades un ensayo simultáneo se llevo a cabo, por ello las etapas (b) y (c) se .presentan concurrentemente. En modalidades particulares, en las cuales la etapa (c) se conduce después de etapa (b) , un procedimiento puede 'comprender incubar o permitir mantener un sistema de reacción ¡que comprende el agente de detección y anticuerpo ¡generalmente a una temperatura de no más de 45°C, ¡preferiblemente entre alrededor de 4°C y alrededor de 40°C, ¡más preferiblemente entre alrededor de 25°C y alrededor de I ?40°C por entre alrededor de 0.5 y 40 horas, preferiblemente I ¡entre alrededor de 1 y alrededor de 20 horas . En ciertas i modalidades, la solución amortiguadora de reacción se ' ¡selecciona por que no interfiere con la reacción o la ¡detección del mismo. Por lo tanto, las modalidades, incluyen, ¡pero no se limita a, soluciones amortiguadoras entre ¡alrededor de pH 5 y alrededor de pH 9, tal como una solución I 'amortiguadora de citrato, solución amortiguadora de fosfato, 'solución amortiguadora Tris y solución amortiguadora de acetato. En ciertas modalidades, el agente de detección es una molécula que puede enlazarse específicamente a un anticuerpo .que específicamente enlaza a un agente modulador de GDF-8. en algunas modalidades, el agente de detección comprende una etiqueta detectable. Los agentes de detección preferidos incluyen ciertas inmunoglobulinas, y reactivos capaces de enlazar a secuencias de inmunoglobulina humano (incluyendo ¡anticuerpos anti-humano de cabra, proteina A, proteína G, etc.), por ejemplo, una porción constante de la inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas que enlazan específicamente a un agente modulador de GDF-8 se incluyen. Como MYO-029 es un IgGl humano con una cadena ligera lambda, en varias modalidades, los agentes de detección incluirán 'reactivos capaces de enlazar a inmunoglobulinas humanas con cadenas de ligera lambda. En otras modalidades un agente que enlaza a una inmunoglobulina IgGl no humano con cadenas igeras lambda se incluye. En diversas modalidades, la detección es cualitativa o es cuantitativa. En algunas modalidades, la etiqueta será detectable por medios visuales son la ayuda de instrumentos. En una modalidad preferida, el agente de detección tales como MYO-029 o dimero GDF-8 maduro es biotinilado. La 'proteína GDF-8 madura, funcional, por ejemplo, puede ¡biotinilarse con reactivos específicos de amina como se establece en el Ejemplo 12. Similarmente, en una preparación 'alternativa, la proteína GDF-8 en el complejo latente se produce y aisla de acuerdo al ensayo del Ejemplo 1 de la Pub. de Patente de E.U.A. No. 2004/0142382 Al. El complejo latente ¡se biotinila posteriormente usando técnicas bien conocidas y/o descritas en la presente. El GDF-8 maduro es inesperadamente sensible a la biotinilación de los grupos de amina primaria, tales como en los residuos de lisina. El GDF-8 hiperbiotinilado, cuando es ¡biotinilado con reactivos de biotinilación específicos de 'amina, es menos activo o inactivo como se compara al GDF-8 ¡dentro de la biotina. Para mantener la proteína GDF-8 madura, ¡funcional después de la biotinilación, la cantidad de biotina ¡incorporada en la preparación de GDF-8 maduro en los grupos de amina se encuentran para ser criticados. Por ejemplo, las ¡actividades de enlace MYO-029 y ActRIIB se reducen en las ¡preparaciones hiperbiotiniladas . Por lo tanto, las 'preparaciones GDF-8 maduras biotiniladas de amina tienen menos de cinco moles de biotina por mol del dímero GDF-8 se ¡prefieren. En modalidades alternativas, las proteínas pueden ¡ser biotiniladas en sulfhidrilos, carboxilos y/o ¡carbohidratos. Los compuestos de biotina fotoreactivos que no se enlazan específicamente o se hacen reaccionar durante la 'fotoactivación también están disponibles. En ciertos métodos proporcionados en la presente, el .GDF-8 biotinila un reactivo de biotinilación de amina específico como un complejo latente y posteriormente el GDF-8 maduro se aisla del complejo. En estos métodos, la cantidad de biotina incorporada en el dímero GDF-8 maduro se optimiza ¡para retener la actividad biológica, por ejemplo para evitar ,1a inactivación del sitio de enlace del receptor. La proteína GDF-8 puede también biotinilarse en los residuos de cisteina ,de la superficie (o grupos tiol de superficie) usando un ^reactivo de biotinilación especifico de sulfhidrilo. Adicionalmente, los métodos para carbohidratos biotinilados involucran el pretratamiento oxidante para generar los aldehidos del reactivo y el uso de reactivos de hidrazina de biotina, por ejemplo, son conocidos en el arte y pueden ser optimizados por las proteínas descritas en la presente, incluyendo la proteína GDF-8 madura, óptimamente en forma modificada. Además, los reactivos de biotinilación del .reactivo carboxilo y reacciones que permiten la biotinilación ¡por medio de los residuos de aspartato y glutamato, por ejemplo, pueden usarse. Como deberá apreciarse por alguien de habilidad en el arte, los relaciones molares óptimos de biotina para el dímero GDF-8 varían con el procedimiento de biotinilación y reactivo utilizado. Por ejemplo, alguien de habilidad en el arte deberá apreciar como optimizar una preparación del GDF-8 biotinilado activo usando los métodos descritos en la presente en combinación con procedimientos de biotinilación conocidos, para producir una proteína GDF-8 madura biotinilada que tiene relaciones molares óptimos ¡diferentes de la biotina para el dímero GDF-8, mientras 'mantiene al menos una actividad GDF-8. i Diversos reactivos de biotinilación son capaces de ¡etiquetar eficientemente las proteínas, incluyendo un .complejo de GDF-8 latente. Los relaciones molares del derivado de biotina al complejo de GDF-8 latente en la reacción pueden ser alrededor de 10, 15, 20, 40, u 80 hasta '1, y composición del reactivo y tiempos de reacción de la concentración y temperaturas pueden variar para ajustar la ¡cantidad de biotina incorporada en la reacción. Por ejemplo, ¡las sales y otros agentes pueden opcionalmente optimizarse. ¡En una modalidad, el dímero maduro GDF-8 se biotinila en ¡asociación con la porción de propéptido de terminal amino de 'GDF-8 para evitar la inactivación del dímero maduro durante .la reacción de biotinilación. Los derivados de biotina son 'bien conocidos y disponibles en el arte. Las modificaciones I de la biotina incluyen brazos espaciadores variables, modificaciones para afectar la solubilidad y/o grupos reactivos, por ejemplo, para permitir el desdoblamiento de la porción de biotina. Los esteres de succinimidilo de biotina y sus derivados, incluyen esteres de sulfosucinimidilo soluble 'en agua que pueden usarse para la biotinilación de GDF-8 en 'residuos de lisina, por ejemplo. Para cuantificar la cantidad de biotina incorporada, por ejemplo, las técnicas bien ¡conocidas analíticas y de tamaño se usan, incluyendo 'cromatografía líquida de presión alta de fase inversa, ¡espectroscopia de masa, etc. Adicionalmente, los kits ¡comerciales para cuantificar la biotina por ensayos ¡colorimétricos o fluorimétricos, por ejemplo, están I disponibles (ver, por ejemplo, EZ™ Biotin Quantitation Kit, ¡Pierce, utilizando HABA (ácido 2- (4 ' -hidroxiazo benceno) -¡benzoico) ) . Un procedimiento de biotinilación ejemplar adicional, por ejemplo, incluye el complejo latente de GDF-8 biotinilado en un rango de 15 ó 20 moles de sulfo-NHS-Biotina ligado a EZ (Pierce) hasta 1 mol del complejo GDF-8 durante 2 horas a 2-,8°C (ver, por ejemplo, el ejemplo 3 de la patente de E.U.A.

No. de publicación 2004/0142382 Al) . La reacción puede terminarse al bajar el pH usando 0.5% TFA y luego el complejo 'se sometió a cromatografía en una columna C4 Júpiter 250 x 4.6 mm (Phenomenex), separada del GDF-8 maduro del propéptido GDF-8. Las fracciones del GDF-8 maduro biotiniladas se eluyeron con un gradiente TFA/CH3CN se agruparon, se .concentraron y se cuantificaron por el kit de reactivo del ensayo de la proteína MicroBCA™ (Pierce), o usando otras técnicas de aislado y concentración. En una modalidad preferida, un ensayo de enlace in vitro comprende un agente de captura de la proteína GDF-8, y la proteína GDF-8 se pone en contacto con la superficie del recipiente de reacción a través de la interacción de la porción de biotina con avidina en la superficie del recipiente de reacción. En algunas modalidades, la relación ¡molar de la porción de biotina a la proteína GDF-8 madura esta entre alrededor de 0.5:1 y alrededor de 4:1 en la proteína GDF-8 madura biotinilada. En otras modalidades, la ¡relación media de biotina al dimero GDF-8 es menos de ¡alrededor de 5 hasta 1, menos de alrededor de 2 hasta 1, o menos de alrededor de 1 hasta 1. La relación de la biotina a ¡la proteína GDF-8 madura se mide hasta ser una mezcla de 'relaciones molares de 0 hasta 3 en preparaciones del GDF-8 activo, con la mayoría de las moléculas estando alrededor de 1:1. En algunas modalidades, la preparación del GDF-8 maduro biotinilado incluye menos de alrededor de 1, 2, 3, 4, ó 5 ¡moles de biotina por mol del dimero maduro GDF-8. La relación ¡media o mediada de la biotina a la proteína GDF-8 madura puede ser menos de o aproximadamente, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 7, 8, ó 9, por ejemplo. El modo para la relación de biotina a proteína GDF-8 maduro puede ser menos de o aproximadamente 1, 2, 3, 4, ó 5, ¡por ejemplo. Otros agentes de captura o detección pueden también ser etiquetados por la biotinilación. Por ejemplo, el 'MYO-029 biotinilado puede ser biotinilado hasta un rango de al menos (o menos de) 10:1, 20:1, o más, por ejemplo. En modalidades preferidas, la relación molar media de una preparación de proteína GDF-8 madura biotinilada es entre 'aproximadamente 1 y 3 moles de biotina hasta 1 mol de dímero ¡GDF-8 maduro. Opcionalmente, otro agente de captura puede ser ¡usado. En una modalidad, el MYO-029 biotinilado es un agente de detección para determinar anticuerpos anti-MYO-029 enlazados 'a MYO-029 inmovilizados en una superficie de un recipiente de ¡reacción, tales como una placa de 96 pozos. En una manera similar, los ELISA para detectar anticuerpos para foliestatina, diversos receptores GDF-8, activina, o propéptido GDF-8 se abarcan dentro de estos términos al substituir estos materiales y sus versiones biotiniladas respectivas por MYO-029 y MYO-029 biotinilado. Además, ¡cualquier reactivo que puede reconocer y enlazar a anticuerpos formados contra un inhibidor de GDF-8, si se usa solo o en combinación con otros reactivos para generar una ¡señal de respuesta de dosis práctica, puede utilizarse para ¡anticuerpos detectados para inhibidores de GDF-8. Estos reactivos pueden usarse en un formato de ensayo de enlace ¡directo (especialmente para muestras de origen no humano) o ¡en un formato competitivo (descrito a continuación) . En modalidades adicionales, el agente de detección se hace ¡por complejo por enlace específico a un anticuerpo que también se hace por complejo por enlace especifico a un agente .modulador de GDF-8 ("enlazado") . Este ensayo de enlace se hace posible por la multivalencia del anticuerpo analítico. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia del anticuerpo objetivo en una muestra o su contenido se evalúa al medir la actividad etiquetada, la cual depende del agente etiquetado 'usado en la etiqueta del agente de detección. En algunas modalidades, una etiqueta "directa" puede ser ¡cualquier molécula enlazada o conjugada a un miembro del enlace .específico el cual es capaz de producir espontáneamente una ¡señal detectable sin la adición de los reactivos auxiliares. lgunos ejemplos incluyen un radioisótopo (por ejemplo, 1 5I, I )3H, 14C) , un metal pesado, un fluoroforo (por ejemplo, luciferasa, proteína fluorescente verde, isotiocianato de fluoresceina, isotiocianato de tetrametilrodamina, 1-N- (2,2,6, 6-tetrametil-l-oxil-4-piperidil) -5-N- (aspartato) -2, 4-dinitrobenceno) , un pigmento (por ejemplo, ficocianina, ¡ficoeritrina, rojo texas, o-ftalaldehído) , moléculas de luminiscencia, incluyendo moléculas quimioluminiscentes y bioluminiscentes, partículas de oro coloidales, partículas de 'plata coloidales, otras partículas de metal coloidales, europio, partículas de pigmento de poliestireno, partículas .coloreadas al instante tales como pigmentos de sol, y particulas de látex coloreadas. Muchas de tales substancias son bien conocidas en el arte. En ciertas casos, la etiqueta puede ser una enzima tal como, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de raíz de rábano), oxidasa glucosa, o ß-galactosidasa . En diversas modalidades, los substratos pueden usarse con las enzimas específicas se eligen generalmente por ¡la producción, en la presencia de la enzima correspondiente, de un cambio detectable en el color, fluorescencia, o .luminiscencia. La enzima puede conjugarse al agente modulador ¡de GDF-8 por glutaraldehído o reticulación de aminación I ¡reductiva. Como se deberá fácilmente reconocer, sin embargo, ¡una amplia variedad de técnicas de conjugación diferentes ¡existen y son fácilmente disponibles por aquellos de habilidad en el arte. En una modalidad particular, el agente de detección que etiqueta la enzima y/o biotinilado tal como un anticuerpo se agrega al complejo del agente/anticuerpo que modula el GDF-8/agente, y permite el enlace. El exceso del reactivo se lava continuamente y una solución que contiene un substrato apropiado luego se agrega al recipiente de reacción. El substrato se 'somete a una reacción catalizada de la enzima resultado en un i 'cambio espectrofotométricamente medido que es indicativo de la cantidad del anticuerpo presente en la muestra. La peroxidasa, cuando se incuba con substratos solubles (por ejemplo, 3, 3 ',5, 5' tetrametilbenzidina (TMB), o-fenilen diamina (OPD) , 2, 2 ' -azino-di [3-etil-benztiazolina] sulfonato (ABTS) , para nitrofenil fosfato, luminol, polifenoles, esteres de acridina, y luciferina) , resulta en un cambio cromogénico o luminiscente en el substrato que puede detectarse espectroscópicamente. Típicamente, después de un periodo fijo de incubación con el substrato, la reacción se apaga (por ¡ejemplo, por acidificación) , y el resultado se cuantifica por ¡medir la densidad óptica (absorbancia) o luminiscencia. Los resultados de absorbancia pueden compararse con los valores OD en el rango lineal para las reacciones quimiogénicas, y los inmunoensayos luminiscentes se miden en unidades ligeras relativas (RLU) . Como una alternativa adicional, cualquier combinación de los reactivos que resultan en el enlace y la generación de una señal de dosis de respuesta practicable pueden usarse (por ejemplo, agentes de radioetiquetado, ¡reactivos de enzima/substrato, o sistema de amplificación de detección utilizando biotina/avidina, por ejemplo) . Todavía en otras modalidades, la etiqueta es biotina, un ihapteno, o una etiqueta de epítopo (por ejemplo, etiquetado de histidina, etiquetado de HA (péptido de hemaglutinina) , proteína de enlace de maltosa, AviTag®, o glutationa-S-transferasa) , la cual puede detectarse por la adición de un ¡agente de detención etiquetado que interactúa con la etiqueta 'asociada con el complejo del agente modulador de GDF-8. Un agente de detención etiquetado con biotina ("biotinilado") puede detectarse a través de su interacción con una enzima de 'avidina, por ejemplo, avidina-peroxidasa de raíz de rábano, conjugado después de la incubación secuencial con el conjugado de avidina-enzima y un substrato cromogénico o fluorogénico adecuado. Un agente modulador de GDF-8 biotinilado también puede detectarse con estreptavidina ¡etiquetada con europio, en modalidades particulares. En la etapa (d) de ciertas modalidades, un complejo de agente/anticuerpo que modula el GDF-8 asociado con la superficie del recipiente de reacción se detecta por la evaluación .cualitativa o cuantitativa de la señal de la etiqueta. En algunos casos, la etiqueta se mide directamente, por ejemplo, por fluorescencia o luminiscencia, o indirectamente, por medio de la adición de un substrato. En otros, la etiqueta se mide, seguido por la incubación con un reactivo adicional. En modalidades en las cuales la etiqueta es biotina, un conjugado de avidina (tal como peroxidasa de raíz de rábano en algunas 'modalidades preferidas), puede agregarse en una etapa posterior. ¡En una modalidad particular, el conjugado de avidina puede ¡enlazar al agente de detención inmovilizado. El exceso del ¡conj ugado de avidina se lava continuamente . Un substrato de la i ¡enzima luego se agrega, resultado en una cambio medido en, por .ejemplo, color, fluorescencia, o luminiscencia. En algunas modalidades el substrato de peroxidasa de raiz de rábano es 3,3' ,5,5' -tetrametilbenzidina . El agente de detección en las etapas (c) y (d) es, en algunas modalidades (por ejemplo, la modalidad detallada en la Figura 1), un agente modulador de GDF-8 etiquetado segundo. El agente modulador de GDF-8 puede ser un anticuerpo, incluyendo anticuerpo que se enlaza específicamente a GDF-8, un anticuerpo que se enlaza específicamente a un compañero de enlace a GDF-8, un receptor de GDF-8, una proteína ActRIIB, una proteína que contiene el dominio de foliestatina, una proteína de foliestatina, una proteína GASP-1, una proteína GDF-8, un propéptido GDF-8, un inhibidor no proteínico; y una molécula pequeña. En algunas modalidades el agente de detección es el mismo agente modulador de GDF-8 como el primer agente modulador de GDF-8 no etiquetado en la superficie del recipiente de reacción. En algunas modalidades preferidas, el agente modulador de GDF-8 es MYO-029. En ciertas modalidades, los métodos de la invención facilitan la detección de anticuerpos en una muestra biológica que específicamente se enlaza con la folistatina, diversos receptores del enlace GDF-8, activina, propéptido GDF-8, u otros agentes que modulan el GDF-8 en las muestras biológicas. En otras modalidades, los métodos facilitan la detección de anticuerpos para administrar el agente modulador de GDF-8 en una muestra biológica de un individuo. ¡ El agente de detección en la etapas (c) y (d) es, en ¡algunas modalidades (por ejemplo, como se describe en la 'Figura 2), GDF-8 etiquetado con un agente de detección. En algunas modalidades preferidas el agente de detección comprende biotina. Los métodos de esta invención también incluyen la detección de anticuerpos en una muestra biológica que se enlaza específicamente con foliestatina, diversos receptores de enlace de GDF-8, activina, propéptido GDF-8, u ¡otros agentes moduladores de GDF-8 en muestras biológicas. En .otras modalidades, este método facilita la detección de 'anticuerpos para administrar proteínas que modulan el GDF-8 en una muestra biológica de un individuo. ' La invención proporciona un método para evaluar una respuesta inmune individual para un primer inhibidor GDF-8 , .el método comprende: (a) poner en contacto un primer 'inhibidor GDF-8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar un segundo inhibidor GDF-8, etiquetado 'al recipiente de reacción; y (d) detectar un complejo 'inhibidor/anticuerpo de GDF-8 segundo, etiquetado asociado 'con la superficie, en donde la detección del complejo 'etiquetado indica una respuesta inmune para el primer 'inhibidor GDF-8. En algunas modalidades preferidas, el primer ¡inhibidor GDF-8 es MYO-029. En algunas modalidades ¡preferidas, el segundo inhibidor GDF-8 es MYO-029. Además, un método para evaluar una respuesta inmune individual para un agente modulador de GDF-8 es proporciona. En una modalidad, el método para evaluar una respuesta inmune individual para un primer inhibidor GDF-8, comprende: (a) poner en contacto un inhibidor GDF-8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar una proteina GDF-8 etiquetada al recipiente de reacción; y (d) comparar la ¡cantidad de proteína GDF-8 etiquetada asociada con la superficie en la muestra de prueba para una segunda muestra, en donde la detección de un nivel disminuido de complejo etiquetado indica una respuesta inmune para el inhibidor GDF-¡8. En algunas modalidades preferidas, el primer inhibidor GDF-8 es MYO-029. En algunas modalidades preferidas, el segundo inhibidor GDF-8 es MYO-029.

Ensayo del gen indicador En ciertas otras modalidades, el ensayo in vitro es un 'ensayo del gen indicador (RGA) (ver, por ejemplo, Thies et al., Growth Factors 18:251-259 (2001)). En ciertas modalidades, un RGA comprende las etapas de: (a) proporcionar una célula hospedera que comprende un constructo del gen indicador en un recipiente de reacción, en donde el constructo comprende un elemento de control de respuesta del ,GDF-8 y un gen indicador; (b) agregar una cantidad de proteína GDF-8 madura al recipiente suficiente para activar la expresión del gen indicador; (c) agregar una cantidad de 'un agente modulador de GDF-8 al recipiente de la etapa (b) suficiente para modular la activación de GDF-8 del gen indicador; (d) agregar una muestra biológica al recipiente de reacción; y (e) detectar la expresión del gen indicador en la célula en presencia y ausencia de la muestra biológica. En algunas modalidades, el método comprende además la etapa de agregar un substrato que cambia de color, luminiscencia, o fluorescencia en la presencia del gen indicador. Una célula hospedera puede ser una célula eucariótica de un humano, mamífero, u otro animal. En una modalidad preferida, ¡la célula hospedera es una línea celular, tal como una línea celular eucariótica, una línea celular de mamífero, o una línea celular de cáncer, incluyendo una línea celular de rabdosarcoma . El constructo del gen indicador puede ser introducido temporalmente o establemente en la célula hospedera por cualesquiera medios conocidos en el arte, incluyendo ¡transfección, electroporación, y similares . El constructo del i ¡gen indicador comprende un elemento de control de respuesta i 'GDF-8, tal como el promotor y/o secuencias aumentadoras, y un ¡gen indicador (por ejemplo, capaz de expresar un agente de ¡detección tal como una enzima) en asociación operativa con el 'elemento de control (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. de i ¡publicación 2003/0138422 , y referencias descritas en la 'presente ) . En modalidades preferidas , la enzima catalizará la ' conversión de un substrato a, por ejemplo, una molécula colorimétrica, fluorescente o luminiscente, y la molécula de la expresión del gen indicador se evaluará al medir la conversión de substrato para un producto detectable, como se describe arriba. Por ejemplo, para demostrar la actividad de GDF-8, un ensayo del gen indicador (RGA) se ha desarrollado usando un ¡vector indicador pGL3(CAGA)?2 que expresa la luciferasa. La cantidad de la proteína GDF-8 agregada al ensayo puede ser 'titulada para optimización. Una cantidad de la proteína GDF-8 'que se selecciona es suficiente para producir 40%, 50%, 60%, ¡70%, 80%, ó 90% de la activación del constructo del indicador ¡máximo. La proteína GDF-8 puede ser agregada a 0.05, 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó ¡1,000 ng/mL, por ejemplo. Usando una cantidad constante de la Iproteina GDF-8, el agente que modula el GDF-8 puede ser titulado para preparar una titulación de la modulación de la ¡actividad GDF-8. Por ejemplo, un agente modular de GDF-8 (tal ¡como MYO-029) puede ser probado a concentraciones ¡seleccionadas de 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, '90, 100, 150, 200, 500, ó 1,000 ng/mL, por ejemplo. En ¡modalidades preferidas, una titulación del agente modulador ¡de GDF-8 prolongara el rango lineal de inhibición en el ensayo. Para identificar un anticuerpo que inhibe una ¡actividad biológica de un agente modulador de GDF-8, una cantidad de agente se agrega a la reacción que es suficiente 'para inhibir la actividad de proteína GDF-8 por al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% por ejemplo. Una cantidad ,de MYO-029 se selecciona que proporciona al menos alrededor de 50% de inhibición de la actividad mediada por proteína, y la muestra biológica se titula en la reacción. Opcionalmente, ¡una cantidad de MYO-029 se selecciona que inhibe la señal ¡GDF-8 por aproximadamente 80%. La muestra biológica luego ¡puede agregarse en una o más cantidades, para identificar la ¡capacidad de un anticuerpo en la muestra para vencer el ¡efecto del agente modulador GDF-8 en el ensayo del gen indicador, por ejemplo. En modalidades preferidas, el agente ¡se pre-incuba con la muestra de prueba antes de la adición ¡del ensayo. Para variar las cantidades de la muestra ¡biológica que se agregan, las diluciones de aproximadamente 1:4, 1:5, 1:8, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 ¡y/o 1:50 se usan, por ejemplo. Opcionalmente, la muestra biológica puede concentrarse o fraccionarse como se describe arriba . Las células luego se tratan con o sin 10 ng/mL de GDF-8, ¡por ejemplo, y con o sin la muestra de prueba biológica en el ' ¡medio McCoy 5A con glutamina, estreptomicina, penicilina, y 1 i ¡mg/mL albúmina de suero de bovino durante 6 hrs a 37 ° C . En ¡ciertas modalidades , los controles del agente modulador de ' ' ¡GDF-8 se corren en paralelo usando concentraciones de 10 pM .hasta 50 µM, aproximadamente. Las concentraciones ejemplares 'incluyen 10 pM, 50 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 µM, 5 µM, 10 µM, y 50 µM del agente modulador de GDF-8. En modalidades preferidas, la cantidad de agente modulador GDF-8 en la muestra de prueba se compara a una titulación de control de las cantidades conocidas del agente y por ello cuantificarse . La luciferasa puede cuantificarse en las células tratadas usando técnicas bien conocidas. ¡Alternativamente, un constructo indicador que da respuesta para la modulación de GDF-8 puede usarse, opcionalmente comprende una marca de detección diferente a luciferasa. Aunque esta descripción se refiere a las modalidades preferidas para detectar anticuerpos que pueden enlazarse a un agente modulador objetivo GDF-8, se reconoce que los anticuerpos para una diversidad de sustancias objetivo se pueden detectar al usar los métodos de la presente invención.

Similarmente, aunque la descripción de la presente invención se dirige a la detección y/o monitoreo de producción de antiglobulina en humanos en conjunto con la administración in vivo de productos terapéuticos o de diagnóstico, se i reconocerá que la metodología se puede adaptar para su uso también en otras aplicaciones y especies.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Ensayos para la Detección de Anticuerpos para YO-029 con MYO-029 Biotinilado. ¡ Tres ensayos se pueden realizar en la caracterización de una respuesta inmune a un agente de modulación de GDF-8, tal como MYO-029; separación por exclusión, titulación, y ensayos ¡específicos. El protocolo para confirmar un resultado ¡positivo (por ejemplo, detección de una respuesta inmune para ¡MYO-029) inicialmente involucra la evaluación de todos los ¡ejemplos en el formato de ensayo de separación por exclusión. ¡Ejemplos negativos de separación, que generan un OD menor que el punto de corte, están reportados como negativos, y no son ¡más evaluados. Ejemplos positivos de separación por exclusión, esto es, muestras que generan un OD mayor que o igual al punto de corte, subsiguientemente se evalúan en titulación y ensayos específicos. Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de anticuerpo anti-MYO-029 es un ejemplo específico que se ha desarrollado para separación por exclusión, titulación, y ^ensayos específicos. Esta modalidad es un ensayo puente i ¡diseñado para detectar anticuerpos para la neutralización de i ?GDF-8 que modula el anticuerpo MYO-029. El procedimiento de ¡ELISA del anticuerpo MYO-029 se ha desarrollado para ratas, monos, ratones, conejos y muestras de suero humano. En este .ensayo, el MYO-029 se absorbe sobre pozos de una placa de microtítulo. El MYO-029 biotinilado es co-incubado con muestras de suero diluidas para permitir cualquiera de las inmunoglobulinas específicas de agente de modulación GDF-8 para hacer puente entre el MYO-029 absorbido y el biotinilado y agregado al ensayo. El MYO-029 biotinilado en puente se 'detecta por un conjugado de peroxidasa de avidina-raíz de rábano (HRP) que produce una solución de color en los pozos de la placa cuando se agrega el sustrato de peroxidasa ¡3, 3' , 5, 5' -tetrametilbencidina (MB) . El OD de cada pozo es directamente proporcional a la cantidad de MYO-029 'biotinilado enlazado y se determina espectrofotométricamente. ¡ Los controles positivos y negativos se corren en cada ¡placa para monitorear el desarrollo del ensayo. Los OD de las muestras se comparan con el OD del punto de corte de la placa para determinar si los anticuerpos específicos para MYO-029 •están presentes. El OD del punto de corte se define como dos -veces el promedio del OD de control negativo. Para muestras ¡de suero humano y de conejo, el 1/OD de punto de corte se define como 1.2 veces el promedio del 1/OD del control •negativo (suero humano normal o conejo normal, respectivamente, diluido 1:8). Las muestras son evaluadas inicialmente en un formato de selección por exclusión en diluciones de 1:8 y 1:16. Cualquier muestra que genera un OD mayor que o igual al punto de corte es analizado nuevamente en el formato de titulación (muestras diluidas en forma serial 1:2 que inicia desde 1:8) para obtener el título. El título de anticuerpo se define como la dilución recíproca de la muestra que genera un OD igual al OD de punto de corte. El logaritmo de ese título se reporta. Para identificar resultados positivos y confirmar especificidad de los anticuerpos para MYO-029, se puede realizar un ensayo de especificidad. Las muestras que son positivas en el formato de titulación se evalúan en el ELISA en placas que no han .sido recubiertas con MYO-029 (solamente se agregó solución ¡amortiguadora de recubrimiento a los pozos). 1 Las muestras que son positivas en el formato de titulación y negativas en el formato de especificidad se ¡confirman positivas para anticuerpos anti MYO-029, de acuerdo con las siguientes líneas de guía: 1) las muestras negativas de selección por exclusión se reportan como negativas y no se evaluaron más; 2) las muestras positivas de selección por exclusión se evalúan subsiguientemente en la titulación y ELISA de especificidad; 3) el resultado de la muestra final para una muestra positiva de titulación depende del resultado de la especificidad; 4) las muestras negativas de especificidad se consideran positivas (ver a continuación) mientras las muestras positivas de especificidad pueden ser ¡positivas, dependiendo de la magnitud del resultado de ¡especificidad.

Ejemplo 2 : Ensayos para Seleccionar por Exclusión para ¡Anticuerpos para M?O-029 con MYO-029 Biotinilado. Las muestras biológicas fueron evaluadas inicialmente en el formato de ensayo de selección por exclusión descrito en este ejemplo. Cada pozo de una placa ELISA de microtítulo de 96 pozos (alto enlace, Costar) se recubrió con 100 µl por pozo de solución de recubrimiento (0.5 µg/mL MYO-029 en 100 mM de solución amortiguadora de bicarbonato, pH 9.6) el dia anterior al análisis de muestra. La placa se recubrió con película de sellado e incubada a 2-8°C durante la noche (16-20 horas) . Al siguiente día, la placa se lavó dos veces con 300 µl/pozo de solución amortiguadora de lavado THST (50 mM 'Tris-HCl, pH 8.0, que contiene 1.0 mM de glicina, 0.5 M de 'NaCl, y 0.05% (v/v) Tween 20®) usando un lavador de placa automática . La solución amortiguadora de bloqueo (Dulbecco' s PBS + 4% (w/v) leche deshidratada sin grasa; 200 µl por pozo) se agregó luego y la placa se cubrió con película de sellado y 'se incubó a temperatura ambiente por 1.5-3.0 horas. La placa se lavó luego por cuatro veces con solución amortiguadora de lavado (300 µl/pozo), invirtiendo la placa después del .segundo lavado. La placa lavada fue luego, ya sea usada ¡inmediatamente en el ensayo o sellada y almacenada a 2-8 °C I por hasta cuatro días, donde el día 1 se definió como el día de bloqueo. Las muestras de suero humano fueron descongeladas a temperatura ambiente y mezcladas completamente. Las 'diluciones iniciales de 1:25 en PBST (PBS de Dulbecco + 0.05% (p/v) Tween 20®) y fue hecha una dilución 1:3 subsiguiente en PBST + 4% de suero humano normal. Las soluciones de muestra (50 µl/pozo) fueron transferida a pozos de la placa en duplicado. El MYO-029 biotinilado (ver Ejemplo 12) se agregó a cada uno de los pozos de la placa (50 µl/pozo) . Los ¡controles positivo y negativo se describen además en los ¡siguientes ejemplos). Las placas fueron recubiertas con película de sellado de placa e incubadas sobre un agitador de placa por 2 horas ± 10 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron luego lavadas cuatro veces con 300 µl/pozo de solución amortiguadora de lavado, invirtiendo la placa ¡después del segundo lavado. El Avidin D-HRP (Vector Laboratories, Burlingame, CA) diluido en PBST hasta una dilución final de 1:50,000 (100 µl/pozo) se agregó luego a cada uno de los pozos de la placa.

¡Las placas fueron cubiertas e incubadas sobre un agitador de ¡placa a temperatura ambiente por 1 hora ± 10 minutos. Las 'placas fueron luego lavadas seis veces con solución 'amortiguadora (300 µl/pozo) invirtiendo la placa después del .tercer lavado. Una solución del sustrato de peroxidasa de raíz de ¡rábano TMB (BioFX Laboratories (Randallstown, MD) ) , a ¡temperatura ambiente, se agregó luego a cada uno de los pozos 'de la placa (100 µl/pozo) . La placa se incubó en la oscuridad 'a temperatura ambiente por aproximadamente 12 ± 1 minutos antes de que la reacción fuera apagada por la adición de .ácido sulfúrico 0.18 M (100 µl/pozo) para cada uno de los .pozos de la placa en el mismo orden como aquel de la adición del sustrato. Los OD de las muestras en una longitud de onda de 450 nm ¡fueron comparados con el OD del punto de corte de la placa ¡para determinar si los anticuerpos específicos para MYO-029 'estaban presentes. El OD del punto de corte se definieron 'como 1.5 veces el promedio del control negativo el cual es 'Suero humano normal diluido 1:25. La absorbancia a 450 nm se midió con un lector de placa Molecular Devices Spectra Max 250 dentro de los 30 minutos después de apagar la reacción. Para el ensayo, el OD promedio del control negativo es <0.150. El titulo de control positivo promedio se determina .con base en el valor de OD de punto de corte de la placa (el punto de corte se define como 1.5 veces el promedio del OD ¡del control negativo) usando la ecuación en el Ejemplo 7. i Las muestras negativas de selección por exclusión, que 'generan un OD menor que el punto de corte, se reportan como negativas, con un concentración logarítmica < 1.40, y no se evalúan más. Las muestras positivas de selección por exclusión (muestras que generan un OD mayor que o igual al punto de corte), se evalúan subsiguientemente en la .titulación y ensayos de especificidad.

Ejemplo 3: Controles Control Negativo Consideraciones Generales - El suero humano normal acumulado (por ejemplo, de Bioreclamation Inc. (Hicksville, NY) ) se usó como un control negativo. La soluciones de 'Control negativo se prepararon en el día del experimento mediante dilución de suero a temperatura ambiente diluido 1:25 con PBST. Variabilidad intra-ensayos . La Variabilidad intra-ensayos (CV) para el OD y los valores del punto de corte de ¡la solución de control negativo se determinó por análisis de ¡los 16 pozos repetidos en cada placa. Se evaluaron tres días de análisis. Los datos obtenidos para cada placa fuero analizados independientemente con el propósito de generar resultados de precisión de ensayo intra. El promedio de los valores de punto de corte obtenidos de los días 1, 2 y 3 son 0.087, 0.077, y 0.072, respectivamente. Los valores CV que corresponden son 18.7, 6.4, y 3.7%. Los CV de valores OD de control negativos (16 réplicas por placa) estuvieron en el rango entre 2.2% y 13.3%. Variabilidad intra-ensayos . La Variabilidad intra-ensayos (CV) para el OD y los valores del punto de corte de la solución de control negativo se determinó. El promedio del OD de punto de corte y el valor de CV que corresponde se encontraron para ser 0.089 y 25.0%, respectivamente. Le OD promedio y el valor de CV que corresponde para el control negativo se encontró que son 0.060 y 25.0%, respectivamente. El valor de CV para las 16 réplicas de OD de control negativo en cada placa estuvieron en el rango de 2.2% y 13.3%.

Control Positivo Consideraciones Generales - El anticuerpo IgG anti humano de cabra purificado de afinidad (KPL, Gaithesburg, MD) se usó como un control positivo para el MYO-029 que hace el puente del ensayo de ELISA. Las soluciones de almacenamiento de control positivo se prepararon en el dia del experimento mediante rehidratación de 1 mg de IgG antihumano de cabra en una mezcla de 0.5 ml de agua purificada y 0.5 ml de glicerol. La solución de almacenamiento se diluyó a 500 ng/mL en PBS + 0.1% de BSA o 500 ng/mL en PBS + 0.1% BSA.

Linearidad en la dilución - Las pruebas de linearidad de dilución se llevaron a cabo para la solución de control positivo. Se prepararon cinco soluciones de prueba con diluciones de arranque inicial del control positivo de 1:25, 1:75, 1:225, 1:675, y 1:2025. Los resultados demostraron que el CV entre todos los valores del título que podrían ser .calculados para las cinco titulaciones de control positivos ¡evaluados fue 1.6%. No hubo tendencia hacia linearidad no detectada en la prueba. Variabilidad intra-ensayos . La Variabilidad intra-ensayos se determinó para el OD y los valores del título de las soluciones de control positivo. El control positivo fue evaluado múltiples veces en la misma placa (ensayo intra). Cada placa contenía 5 titulaciones de control positivo individual. La prueba se realizó usando un total de 4 placas ¡en el día 1, 2 placas en el día 2, y 4 placas en el día 3. La Variabilidad intra-ensayos se evaluó en tres días separados. Los datos obtenidos para cada placa fueron analizados 'independientemente con el propósito de generar resultados de precisión de ensayo intra. La variabilidad entre la placa del OD máximo y los valores del título para el control positivo se determinó empleado los datos obtenidos de todas las placas evaluadas por día. Los CV de ensayo intra (placa intra) obtenidos para las concentraciones de registro estuvieron entre 2.2%. Los valores de CV obtenidos que usan las concentraciones de 'registro de control positivo individual sobre todas las ¡placas evaluadas para los días 1, 2, y 3 son 12.4, 1.7, y 1.5%, respectivamente. Los valores CV obtenidos para el OD ¡máximo generado por el control positivo sobre todas las 'placas evaluadas para los días 1, 2, y 3 es 18.9, 2.8, y ¡3.2%, respectivamente. ¡ El SD y CV promedio de los valores de OD en cada .dilución del control positivo sobre 4 placas se analizaron por 3 días de la evaluación entre ensayos. Los valores de CV 'estuvieron en el rango entre 2.8% y 4.7%. Se realizó un perfil de titulación de la titulación de control positivo. No hubo evidencia de un efecto prozona. Variabilidad entre ensayos - Para determinar la variabilidad del ensayo inter aleatorio de los valores OD de control positivo y de título, las soluciones de control ¡fueron analizadas en 20 placas durante 6 días. Para cada ¡placa, un conjunto de duplicados de los controles positivos ¡(misma posición en cada placa) se usó durante el análisis de ¡datos finales. Para la solución de control positivo, el concentración logarítmica promedio y los valores CV del 'concentración logarítmica fueron 3.37 y 6.6% respectivamente. ¡El OD máximo promedio y los valores de CV para OD máximo 'fueron 2.137 y 11.9%, respectivamente. Formulación - La solución de reserva de trabajo de control positivo (500 ng/mL) se preparó inicialmente en agua desionizada con 0.1% BSA para evaluación. Todas las corridas ¡de validación se llevaron a cabo usando la reserva de trabajo preparada en agua desionizada + 0.1% BSA. La solución de reserva de trabajo de control positivo se preparó subsiguientemente en PBS con 0.1% de BSA puesto que el PBS ¡fue el diluente deseado. Una comparación de la concentración 'logarítmica y el OD máximo de ambas soluciones se realizó por 'análisis del control positivo preparado a partir de las dos iferentes soluciones de reserva en la misma corrida de placa. No se observó diferencia significante en las concentraciones de registro para el control positivo (datos no mostrados) . La diferencia en el OD máximo y el título numérico se puede considerar dentro de la variabilidad de ensayo. La solución de reserva de trabajo será preparada en 'el PBS + 0.1% BSA y almacenada a -70°C por hasta 1 año.

Ejemplo 4: Reactividad en la Población No Expuesta. Usando el procedimiento del Ejemplo 1, veinticinco ¡muestras de suero normales individuales fueron evaluadas tres veces durante 3 días (n=75 resultados) con el propósito de analizar la distribución estadística de los OD y determinar ¡un valor de punto de corte de ensayo basado estadísticamente.

El valor promedio de los OD de las muestras para las 25 muestras analizadas durante 3 días fue 0.058, lo cual es idéntico a aquel para el valor OD promedio para controles negativos analizados en las mismas placas. Esto indica que el desempeño del control negativo es representativo para desempeño de muestra individual ¡normal y se puede usar para normalizar los OD de i punto de corte entre placas. Por lo tanto el punto de ¡corte para placa individual se puede calcular ' ¡mediante multiplicar el OD promedio de control ,negativo de placa mediante un factor de multiplicación n que se derivó con base en percentil 95 estimado para las 25 muestras normales. El estimado no paramétrico del percentil al 95% se hizo mediante el análisis de la colección generada de los valores de OD y determinando un OD suficientemente alto para incluir 95% de los valores ¡(0.081) . La relación del percentil al 95% para el ¡promedio de las muestras y el OD de control negativo 'fue 1.39. Puesto que esta evaluación se realizó ¡usando un conjunto de muestra limitada se evaluó .durante un período de tiempo corto (3 días ¡consecutivos), la variabilidad en el desarrollo de ¡las muestras de estudio clínicas, recolectadas de ¡múltiples sitios y analizadas durante un periodo largo de tiempo, se espera que sean más amplias. Tomando la mayor variabilidad esperada de muestras de estudio en consideración y para conveniencia, el factor de multiplicación n a ser usado para cálculo del valor del punto de corte de la placa se redondeo de 1.39 a 1.5. El IgG antihumano de cabra purificado de afinidad se usó para la solución de control positiva. De ahí, la sensibilidad del ensayo se calculó con base en la concentración del reactivo de control positivo inicial y su título numérico. En el ensayo, la concentración de inicio del reactivo de control positivo fue 500 ng/mL. El valor del título promedio obtenido durante la evaluación hecha anteriormente para la solución de control positiva preparada en PBS + 0.1% BSA fue 4680. La sensibilidad del ensayo se determinó para ser de 107 pg/mL (500 ng/mL/4680) usando la siguiente ecuación: Sensibilidad = Concentración de Inicio de la solución de control positivo Titulo numérico de control positivo Ejemplo 6: Prueba de Interferencia de Fármaco. La solución de control positivo (1:25) se enriqueció con varias cantidades de MYO-029 para dar una concentración final del fármaco a 0.01, 0.1, 1.0 y 10 µg/mL antes de las diluciones de 3 múltiplos subsiguientes en PBST (1:75, 1:225, 1:675, 1:2025, 1:6075, 1:18225, y 1:54675). Las concentraciones y OD máximos se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 1 Condición de Concentración Concentración OD Max. OD Max. ¡ Ensayo log log % de % de diferencia diferencia Sin Enriquecer 3.12 2.460 Enriquecida a 2.83 -9.3 1.194 -51.5 0.01 µg/mL MYO-029 Enriquecida a 2.16 -30.8 0.189 -92.3 0.1 µg/mL MYO- 029 Enriquecida a <1.40 NA 0.079 -96.8 1.0 µg/mL MYO- 029 Enriquecida a <1.40 NA 0.061 -97.5 10 µg/mL MYO- 029 Los resultados mostraron que el desempeño del control positivo fue afectado significativamente a 0.1 µg/mL y concentraciones mayores de MYO-029 en la muestra. Se observó una caída en el OD máximo para la concentración de 0.01 µg/mL de MYO-029. Debido a la heterogeneidad de la respuesta de anticuerpo, la interferencia de MYO-029 encontrada en las muestras puede ser diferente de la interferencia detectada para el control positivo .

Ejemplo 7: Ensayos de Titulación. Las muestras inicialmente se evalúan en un ¡formato de separación por exclusión en diluciones de 1:25 y 1:75. Cualquier muestra que genera un OD mayor .que o igual al punto de corte se vuelve a analizar en el titulo y ensayos específicos (junto con la muestra de predosis correspondiente, si la muestra que genera un OD mayor que o igual al punto de corte es una muestra de postdosis) . El título y los ensayos específicos para la muestra se pueden realizar simultáneamente o subsiguientemente. Para obtener el ¡título de anticuerpo, las muestras se diluyen primero 1:25 y luego diluidas en forma serial 1:3 con PBST + '4% de suero humano desde 1:25 para obtener diluciones ¡hasta 1:54,675. Cada muestra se ensaya en duplicado. 'La muestra se realiza esencialmente como se describe en el E j emplo 2. El título de una muestra dada se define como la dilución recíproca de la muestra que podría generar un valor de OD igual al punto de corte. Los valores ¡de titulo numérico se calculan mediante interpolación usando la Ecuación 1 a continuación, donde ODCA es el ¡OD del punto de corte, 0D1 es el valor de OD de la ¡muestra superior al OD del punto de corte en la serie de dilución, 0D2 es el valor de OD de la muestra debajo del OD de punto de corte en la serie de dilución, DilnODl es la dilución recíproca de la .muestra en OD1, y DilnOD2 es la dilución recíproca de la muestra en 0D2.

Ti ul dor El valor logarítmico del título numérico se reporta como el resultado final. ¡ l?g[ Titulador ] Por ejemplo, en el análisis de una muestra de suero de rata mostrado en la Tabla 3 a continuación, ODcp = 0.252, ¡Diln OD1 = 675, y Diln OD2 = 2025, y el concentración logarítmica de la muestra desconocida es 3.29. Los datos ¡crudos fueron analizados usando el sistema Watson LIMS.

Tabla 3 Ejemplo 8: Ensayo de Especificidad. Las muestras inicialmente se evaluaron en un formato de selección por exclusión en diluciones de 1:25 y 1:75. Las muestras positivas fueron evaluadas. Para confirmar la especificidad de los anticuerpos para MYO-029, muestras que ¡son positivas en el formato de separación por exclusión o titulación se evalúan en placas que no han sido recubiertas 'con MYO-029 (solamente se agrega solución amortiguadora de ¡recubrimiento a los pozos). ' Las muestras se diluyeron en serie a 1:3 con PBST + 4% de suero humano desde 1:25 para obtener diluciones hasta ¡1:54,675. Cada ejemplo se ensaya por duplicado. Los ensayos •se realizan como se describe en el Ejemplo 1. Cada pozo de 'una placa de ELISA de microtítulo de 96 pozos (Costar) se ¡recubrió con 100 µl por pozo de solución amortiguadora de recubrimiento (100 mM de solución amortiguadora de 'bicarbonato, pH 9.6) el día anterior al análisis de la muestra. La placa se recubrió con película de sellado y se incubó a 2-8°C durante la noche (16-20 horas). Al día siguiente, la placa se lavó dos veces con 300 µl/pozo de solución amortiguadora de lavado usando un lavador de placa automático . La solución amortiguadora de bloqueo (Dulbeccos PBS + 4% (p/v) de leche deshidratada sin grasa; 200 µl por pozo) se agregó luego y la placa se recubrió con película de sellado y se incubó a temperatura ambiente por 1.5-3.0 horas. La placa se lavó luego por cuatro horas con solución amortiguadora de lavado (300 µl/pozo), invirtiendo la placa después del segundo lavado. La placa lavada luego fue, ya sea, usada inmediatamente en el ensayo o sellada y almacenada a 2-8 °C ¡por hasta cuatro días, donde el día 1 se definió como el día de bloqueo. Las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente y mezcladas completamente. Se hicieron las diluciones iniciales de 1:25 en PBST (PBS de Dulbecco + 0.05% (p/v) Tween 20) y una dilución 1:3 subsiguiente en PBST + 4% (v/v) de suero humano normal. El MYO-029 biotinilado se agregó a .cada uno de los pozos de la placa (50 µl/pozo) en duplicado. ,(Los controles positivo y negativo se describen además en el siguiente ejemplo). Las soluciones de muestra (50 µl/pozo) fueron transferidas a los pozos de la placa por duplicado. Las placas se recubrieron con película de sellado de placa y se incubaron en el agitador de placa por 2 horas ± 10 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas cuatro 'veces con 300 µl/pozo de solución amortiguadora de lavado, se ¡invirtió la placa después del segundo lavado. La solución de Avidina D-HRP (Vector Laboratories, Burlingame, CA) (100 µl/pozo) se agregó luego a cada uno de los pozos de la placa. Las placas se cubrieron y se incubaron en un agitador de placa a temperatura ambiente por 1 hora ± 10 minutos. Las placas fueron luego lavadas seis veces con solución amortiguadora de lavado (300 µl/pozo), invirtiendo la placa después del tercer lavado. Una solución de sustrato de peroxidasa de raíz de rábano 3, 3, 5, 5' -tetrametilbencidina (sustrato de TMB; BioFX Laboratories (Randallstown, MD) ) , a temperatura ambiente, se ¡agregó luego a cada pozo de la placa (100 µl/pozo) . La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente por .aproximadamente 12 + 1 minuto antes de que la reacción se ¡apagara mediante la adición de 0.18 M de ácido sulfúrico (100 µl/pozo) a cada uno de los pozos de la placa en el mismo orden como aquel de la adición del sustrato. Los OD de las muestras se compararon con el OD del punto de corte de la placa para determinar si la señal del ensayo de titulación detecta anticuerpos específicos de MYO-029. El ¡OD del punto de corte se define como 1.5 veces el promedio •del control negativo. La absorbancia a 450 nm se midió dentro de los 30 minutos después del apagado de la reacción. El resultado de la muestra final para una muestra .positiva de titulación depende del resultado de especificidad (por ejemplo, las muestras negativas de especificidad se consideran positivas) . Las muestras que son positivas en el formato de titulación y negativas en el formato de especificidad se confirman positivas para anticuerpos anti-MYO-029. Las muestras positivas de especificidad pueden o no ser consideradas positivas, dependiendo de la magnitud del resultado de especificidad.

Ejemplo 9: Evaluación de Muestras. Los resultados del título y el ensayo de especificidad ¡se evaluaron con base en la siguiente tabla. En casos donde •una repetición del ensayo del título produce un resultado que ¡es incongruente con el resultado original, el correcto es el .resultado original.

Tabla 4. Evaluación de Muestra.

La determinación de si un anticuerpo para MYO-029 ha ocurrido en el sujeto se hace con base en la comparación de los resultados de las muestras pre y post dosis. Si las muestras predosis son negativas y las muestras post dosis que corresponden son positivas, el sujeto se considera que es positivo para una respuesta inmune. Si ambas muestras pre dosis y post dosis se evalúan positivas, el sujeto es llamado 'positivo para una respuesta inmune cuando el valor del título de la muestra post dosis es por lo menos un factor de dilución (e veces) mayor que el valor del título determinado .para la muestra predosis que corresponde.

Ejemplo 10: Detección de Anticuerpos para MYO-029 con GDF-8 Biotinilado. Para detectar anticuerpos que inhiben el enlace de GDF-8 biotinilado a MYO-029, cada pozo de una placa de ELISA de microtítulo de 96 pozos (Costar) se recubre con 100 µl por pozo de solución de recubrimiento (6 µg/mL de MYO-029 en 100 mM de solución amortiguadora de bicarbonato, pH 9.6) el día 'anterior al análisis de la muestra. Alternativamente, se ¡usaron 0.5 µg/mL de MYO-029. La placa se recubrió con película de sellado y se incubó a 2-8 °C durante la noche (16-22 horas) . Al siguiente día, la placa se lavó dos veces con 300 µl/pozo de solución amortiguadora de lavado usando un lavador de placa automático. La solución amortiguadora de bloqueo (PBS de Dulbecco + 1 % (p/v) albúmina de suero bovino; 250 µl por pozo) se •agregó luego, y la placa se recubrió con película de sellado y se incubó a temperatura ambiente por 1.5-3.0 horas. La placa se lavó luego por cuatro horas con 300 µl/pozo de THST de solución amortiguadora de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, ¡que contiene 1.0 mM de glicina, 0.5 M de NaCl, y 0.05% (v/v) i ¡Tween 20®), invirtiendo la placa después del segundo lavado.

¡La placa lavada luego, ya sea, se usó inmediatamente en el i 'ensayo o se selló y se almacenó a 2-8 °C por hasta cuatro i 'días, donde el día 1 se definió como el día de bloqueo. Las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente ?y se mezclaron completamente. Se hicieron las diluciones iniciales de 1:8 en THST y una dilución de 1:2 subsiguiente en THST. Las soluciones de la muestra (100 µl/pozo) fueron transferidas a los pozos de la placa en duplicado. Alternativamente, las diluciones de la muestra inicial de 1:25 en PBST (PBS de Dulbecco 0.05% p/v Tween 20) seguidas por una dilución 1:3 se hicieron, transfiriendo 50 µl/pozo. Se descongeló una solución de reserva de control positivo (antisuero anti MYO-029 de conejo, mezclada dentro del suero humano normal a dilución de 1:6.25) y se diluyó 1:8 en THST. Las diluciones seriales de dos múltiplos se hicieron subsiguientemente en THST que contiene 12.5% de suero humano normal acumulado, produciendo el siguiente conjunto de 'diluciones de control positivas: 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, ¡1:128, 1:256, 1:512, 1:1024. Las soluciones de control positivas (100 µl/pozo) fueron transferidas a pozos de placa ¡en duplicado. Las placas se recubrieron con película de ¡sellado y se incubaron en el agitador de placa por 2 horas ± .10 minutos a temperatura ambiente. Las placas fueron 'l ue g o l a va da s cu a t r o ve c e s con 3 0 0 µ l / po z o de ' ¡solución amortiguadora de lavado THST, invirtiendo la ¡placa después del segundo lavado. ' El GDF-8 biotinilado (ver Ejemplo 12) se agregó 'luego a cada uno de los pozos de la placa (100 iµl/pozo de una solución de 35 ng/mL) . Las placas se •recubrieron con película de sellado de placa y se incubaron en el agitador de placa por 1.5 horas ± 10 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego cuatro veces con 300 µl/pozo de solución amortiguadora de lavado, invirtiendo la placa después del segundo lavado. La solución de Avidina-HRP (Pierce, Rockford, IL) (100 µl/pozo) se agregó luego a cada uno de los pozos de la placa. La Avidina D-HRP (Vector Laboratories, Burlingame, CA) se usó alternativamente. Las placas fueron recubiertas e incubadas en un agitador de I ¡placa a temperatura ambiente por 40 minutos o una hora. Las placas se lavaron luego cuatro veces con ¡solución amortiguadora de lavado (300 µl/pozo), ¡invirtiendo la placa después del segundo lavado. ¡ Una solución de sustrato de peroxidasa 3, 3', 5,5'-'tetramet i lbencidina (substrato de TMB; BioFX Laboratories, Randall stown , MD), a temperatura ambiente, se agregó luego a cada pozo de la placa (100 µl/pozo) . La placa se incubó luego en la oscuridad a temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos antes de que la reacción se apagara por la adición de 0.18 M de ácido sulfúrico (100 µl/pozo) •para cada uno de los pozos de la placa en el mismo ,orden como aquel de la adición del sustrato. La ¡densidad óptica se leyó a 450 nm en un (espect rofotómet ro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) dentro de los 30 minutos de apagado, y los OD fueron transformados a 1/OD para análisis.

Ejemplo 11 : Determinación del Titulo y el Análisis de Datos. Para muestras de evaluación positiva en el ensayo .de separación por exclusión anterior (Ejemplo 10), el título se determinó mediante la dilución de las •muestras de prueba 1:2 en THST seguido por siete ¡diluciones seriales de 1:8 subsiguientes en THST que 'contiene 12.5% de suero humano normal acumulado, que .produce diluciones finales de 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024. El título de una muestra ¡dada se define como la dilución recíproca de la muestra que podría generar un valor de 1/OD igual al punto de corte. El punto de corte del ensayo se define como 1.2 veces el valor de 1/OD del control negativo promedio; y se basa en el percentil 95th de valores de 1/OD observados en un panel de muestras de 'suero de individuos humanos normales. Los valores del título numéricos se calculan por interpolación usando la ecuación de a continuación, donde ODcp es el OD del punto de corte, OD1 es el valor de OD de la muestra arriba del OD de punto de corte en las series de dilución, OD2 es el valor de OD de la muestra debajo del OD de punto de corte en las series de dilución, Diln OD1 es la dilución recíproca de la muestra en OD1, y DilnOD2 es la dilución recíproca de la muestra en OD2.

; Los resultados del título y el ensayo de especificidad fueron evaluados usando la siguiente tabla. En casos donde una repetición del ensayo del titulo produce un resultado que es incongruente con el resultado original, el correcto es el resultado original.

Tabla 5 Ejemplo 12: Biotinilación. El GDF-8 fue biotinilado como sigue. El GDF-8 de longitud completa se expresó en un proceso de bioreactor de cultivo de célula CHO de alimentación por lote, que proporciona el complejo latente a partir de GDF-8. La cosecha ¡del cultivo de la célula se clarificó usando filtración de ¡micro poro de flujo normal y luego se concentró y diafiltró ¡usando ultrafiltración de flujo tangencial. Este acumulado ¡concentrado se cargó luego sobre cromatografía de afinidad de Imetal inmovilizada Ni2+-NTA (IMAC) donde el complejo GDF-8 se ¡captura. La elución ocurrió con un gradiente linear de 50 mM •Na2HP04, 300 mM NaCIi 20-500 mM imidazol sobre 5 volúmenes de ¡columnas. El pico que resulta luego se somete a intercambio ¡de solución amortiguadora vía diálisis para permitir la 'remoción de imidazol derivado de IMAC y para poner una solución amortiguadora apropiada en el lugar para la reacción de biotinilación. La preparación del complejo latente fue luego biotinilado. Una relación molar del complejo sulfo-NHS-LC- ;biotina a GDF-8 objetivo de 14:1 se usó en la reacción. El reactivo para relaciones de sustrato de 10:1, 15:1, y 20:1 también se evaluó, por ejemplo. El reactivo de biotina sólido i , i (EZ-link Sulfo-NHS-Biotin, Pierce Biotechnology) se disolvió ¡en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a 200 g/L antes de que se i agregue a la muestra del complejo GDF-8. La reacción se realizó con una concentración del complejo GDF-8 de menos que 1.5 g/L en 100 mM Na2HP04, 150 mM NaCl, pH 7.2 , a 4°C, por 120 ¡minutos. La mezcla de reacción se mezcló suavemente al inicio de la reacción y se protegió de la luz durante el curso de la , reacción. La reacción se detuvo por adición de 0.5% (v/v) de ¡etanol amina ó 5 . 0% ( v/v) 1 M de Tris . i ! Este complejo GDF-8 biotinilado se intercambió de •solución amortiguadora luego vía diálisis en un pH bajo, la i Isolución amortiguadora de concentración de Chaotrope alta I ((6000 mM urea, 300 mM NaCl, 50 mM H3P0 , pH = 2.5). La ¡disociación del complejo ocurre con protonación a pH bajo. En ,esta solución amortiguadora, el complejo se disocia y ¡solubiliza en propéptidos y dímeros maduros. También, la 'biotina libre se remueve durante la diálisis. Este acumulado concentrado se carga luego sobre cromatografía de exclusión 'de tamaño de alto desempeño donde el dímero maduro de GDF-8 se separa de los propéptidos y el monómero residual. Esta fracción que comprende la forma de dímero madura biotinilada de GDF-8 se procesó luego más en cromatografía de fase inversa de alto desempeño de butilo usando un gradiente ¡linear de 0-90% (v/v) CH3CN, 0.1% (v/v) CF3C02H, pH = 2.0 ¡sobre 5 volúmenes de columna. El pico de este paso se 'intercambió de solución amortiguadora vía diálisis en una (Solución amortiguadora de formulación de pH bajo (0.1% (v/v) CF3C02H, pH = 2.0) . ¡ El dímero GDF-8 maduro biotinilado se evaluó para ¡retención de función, por ejemplo, su actividad en ensayos de ¡enlace y ensayos del gen reportado. La proteína de GDF-8 •madura biotinilada se midió mediante cromatografía líquida de ^alto desempeño de fase inversa/espectrometría de masa de tiempo de vuelo cuadruplo de ionización de electrorocío (RP- ¡HPLC/ESI-QTOF-MS) , y la preparación contiene una mezcla de ¡relaciones molares de aproximadamente 0-3, con la mayoría de las moléculas que están de 1:1. Las relaciones molares objetivo más altas has producido mediciones tan altas como 9:1 mediante ajuste de condiciones bien conocidas en la técnica . El MYO-029 es biotinilado usando un ensayo similar, y se puede usar en los métodos descritos en la presente. Esencialmente, el MYO-029 es biotinilado usando un ensayo similar, y se puede usar en los métodos descritos en la presente. Esencialmente, el MYO-029 aislado se diluye, se intercambia de solución amortiguadora, y luego es biotinilado. La reacción y las condiciones de almacenamiento son las mismas como para GDF-8, excepto para unos pocos iparámetros. Los rangos de valor de . concentración de MYO-029 'de 10-24 g/L. Una relación molar de sulfo-NHS-LC-biotina a •MYO-029 objetivo en la reacción de biotinilación es 40:1, lo cual produce una relación molar medida de 8-11. Esto se mide por un ensayo de espectrofotometría de avidina: HABA A6oo nm (ImmunoPure Avidin and HABA, Pierce). Usando diálisis, este ¡reactivo luego se intercambia de solución amortiguadora en •una sal baja, solución amortiguadora de formulación de pH neutral (137 mM NaCl, 1 mM KCl, 8 mM Na2HP04, 3 mM KH2P04, pH ¡= 7.2) .

Ejemplo 13: Ensayo de Gen indicador. Un anticuerpo que específicamente enlaza a un agente de modulación GDF-8 se detecta en ensayo de gen indicador (RGA) basado en células para actividad biológica de GDF-8. Los anticuerpos que inhiben la actividad de un agente de modulación GDF-8, tal como anticuerpos que neutralizan la .actividad de MYO-029, se detectan mediante el siguiente •ensayo . Se usó la línea de célula de rabdomiosarcoma humano A204pCAGA, en la cual A204 (ATCC HTB-82) fue transfectado establemente con un constructo de gen indicador, pGL3 (CAGA) 12 (descrito en la Patente de EUA Publicaciones Nos. 2003/0138422 Al y 2004/0142382 Al) usando técnicas bien conocidas. Alternativamente, las células A204 son transfectadas transientemente con pGL3(CAGA)i2 usando el ¡reactivo de transfección FuGENE.TM.ß (Boehringer Manheim, Alemania) . Después de la transfección, las células fueron cultivadas en placas de 96 pozos en medio de McCoy 5A 'Suplementado con 2 mM de glutamina, 100 U/mL de ¡estreptomicina, 100 µg/mL de penicilina y 10% de suero de becerro fetal por 16 horas. Las células fueron tratadas con o sin una cantidad constante (75 ng/mL de proteína GDF-8 ¡madura, una cantidad constante de (400 ng/mL) de MYO-029 y una serie de dilución de control positivo en medio de McCoy 5A con glutamina, estreptomicina, penicilina, y 10% de suero •de becerro fetal por 6 horas a 37°C para controles.

Opcionalmente, una cantidad de GDF-8 se selecciona que i proporciona aproximadamente 80% de la señal de luciferasa ¡máxima. El MYO-029 es preincubado con el GDF-8 a concentraciones de 6.25 ng/mL hasta 400 ng/mL (5.9 nM hasta 375 nM) por 1 hora a temperatura ambiente, y luego las proteínas se agregan en el RGA. Los anticuerpos de control positivo para el agente de modulación GDF-8 fueron incubados con MYO-029 y ensayados en el RGA. Opcionalmente, una 'cantidad de MYO-029 se selecciona tal que inhibe la señal de GDF-8 por aproximadamente 80%. La luciferasa fue cuantificada en las células tratadas usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa (Promega) . En este ensayo, 75 ng/mL de GDF-8 proporcionan activación del 80% mientras que 400 ng/mL de 'MYO-029 proporcionan inhibición del 80% del constructo de gen ¡indicador . En reacciones paralelas, las células se tratan con y sin ¡75 ng/mL de proteína GDF-8 madura, con y sin MYO-029 (u otro ¡agente de modulación GDF-8) y con y sin muestras biológicas :de evaluación. El suero humano se obtiene a partir de 'individuos que se someten a tratamiento de MYO-029, y se ¡diluye 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, y 1:40 en solución ¡amortiguadora. Para diluciones menores que 1:10, el suero de muestra de prueba se diluyó más en la solución amortiguadora ,que contiene 10% de suero humano (Bioreclamation, Inc.).

Un ensayo basado en células funcionales se realizó basado en un ensayo de gen indicador sensible al GDF-8 publicado (Patente de EUA Pub. No. 2003/0138422 Al) como .sigue: En este ensayo, 75 ng/mL de GDF-8 fueron preincubados con 400 ng/mL de MYO-029 (375 nM) y agregados a células A204 'transfectadas con células PGL3 (pCAGA) 12 en la presencia y ¡ausencia de una muestra de suero humano. La muestra de suero ihumano se diluyó 1 a 20, y se comparó con un control positivo ¡que comprende suero policlonal anti-MYO-029 de conejo diluido ¡1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, y 1:6400, por ejemplo. El ensayo puede ser corrido ya sea mezclando juntos la muestra de suero humano o anticuerpo de conejo de control positivo con MYO-029 luego GDF-8 y agregando directamente a las células en el RGA o muestras de suero humano de preincubación o anticuerpo de conejo de control positivo con ¡MYO-029 por 1 hora agregando a las células en el RGA luego agregando GDF-8 a los pozos de la muestra. • Un control positivo de anticuerpos de neutralización a ?MYO-029 se desarrolló como sigue. Los conejos fueron inmunizados ya sea con MYO-029 intacto o con fragmentos de ¡proteína MYO-029 que comprende el sitio de enlazamiento MYO-¡029. La digestión se realizó para remover la porción Fe del ¡anticuerpo MYO-029 con el propósito de evitar la generación de una respuesta inmune fuerte en el conejo a la región constante de este anticuerpo humano. Dos conejos fueron inmunizados ya sea con el MYO-029 intacto o el digerido. Los exudados fueron evaluados para actividad de neutralización ¡usando ensayos de enlazamiento de ligando. Los cuatro ¡animales desarrollaron buenos resultados de título de anticuerpo y se produjo un suero de conejo de control mediante acumulación de los exudados de los cuatro animales.

Todas las publicaciones, patentes, y secuencias 'biológicas citadas en este desglose están incorporadas por referencia en su totalidad. Para la extensión el material i 'incorporado por referencia contradice o es incosistente con la especificación presente, la especificación presente suprimirá cualquier material tal. La cita de cualquiera de las referencias en la presente no es una admisión de que tales referencias son técnica anterior a la presente .invención. ¡ A menos que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivo de células, •condiciones de tratamiento, y lo usado en la especificación, ¡que incluye reivindicaciones, se debe entender que son modificadas en todos los ejemplos mediante el término "alrededor". En consecuencia, a menos que se indique de otra .manera a lo contrario, los parámetros numéricos son 'aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades •deseadas buscadas para ser obtenidas por la presente ¡invención. A menos que se indique de otra manera, el término ¡"por lo menos" que precede una serie de elementos se debe •entender que se refiere a todo elemento en las series. ¡Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces 'de hacer determinaciones usando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes para las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Tales ;equivalentes se proyectan para estar abarcados por las ¡siguientes reivindicaciones. ¡ Las modalidades dentro de la especificación proporcionan una ilustración de las modalidades de la invención y no deben ser construidas para limitar el alcance de la invención. El técnico experto reconoce fácilmente que muchas otras modalidades se comprenden por la invención. Otras modalidades de la invención serán palpables para aquellos expertos en la 'técnica a partir de la consideración de la especificación y ¡la práctica de la invención descrita en la presente. Se proyecta que la especificación y ejemplos se consideren como •ejemplares solamente, con un alcance y espíritu verdaderos de ,1a invención que se indica mediante las siguientes ¡reivindicaciones. ¡ Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor ¡método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención

Claims (66)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes ¡ .reivindicaciones : 1. Un método para detectar un anticuerpo que enlaza específicamente a un agente modulador de GDF-8 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (a) agregar el agente modulador GDF-8 a un ensayo in vitro para una actividad GDF-8 en un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al ensayo in vitro para una actividad GDF-8 en el recipiente de reacción; (c) detectar la modulación de la actividad GDF-8 por la muestra biológica; y (d) comparar la modulación de la actividad GDF-8 en .presencia de la muestra biológica para la modulación de la •actividad GDF-8 en presencia del agente modulador de GDF-8 ¡solo.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ensayo in vitro es un inmunoensayo que comprende: (a) poner en contacto un agente modulador de GDF-8 con una superficie del recipiente de reacción; (b) agregar posteriormente la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar un agente de detección al recipiente de reacción; y (d) detectar un complejo agente/anticuerpo modulador de GDF-8 asociado con la superficie.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de detección es el agente modulador de GDF-8 con una etiqueta detectable.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de detección es una proteína ' GDF-8 etiquetada.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la etiqueta es biotina.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la relación molar de biotina incorporada en moles de agente es menos de 5:1.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, I caracterizado porque la relación molar de biotina al agente íes entre alrededor de 0.5:1 hasta 4:1. ¡
8. 8. Un método para detectar un anticuerpo que enlaza , específicamente a un agente modulador de GDF-8 en una muestra ¡biológica, caracterizado porque comprende: ¡ (a) poner en contacto el agente modulador de GDF-8 con 1 una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar un agente de detección al recipiente de reacción; y (d) detectar un complejo agente/anticuerpo modulador de •GDF-8 asociado con la superficie del recipiente de reacción.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente de detección es el agente ¡modulador de GDF-8 de la etapa (a) con una etiqueta detectable .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente de detección es una proteína GDF-8 etiquetada.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el complejo agente/anticuerpo modulador de GDF-8 se detecta al comparar los niveles de complejo de proteína GDF-8 etiquetada/agente modulador de GDF-8 en la ¡muestra de prueba a los niveles en una muestra de control.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8, 1 caracterizado porque el agente modulador de GDF-8 es un ¡ inhibidor GDF-8.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el inhibidor GDF-8 es un anticuerpo.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo enlaza especificamente a GDF-8.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anticuerpo es MYO-029.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 8, ¡ caracterizado porque el agente modulador de GDF-8 se elige I de: ! (a) un anticuerpo que enlaza especificamente a GDF-8; (b) un anticuerpo que enlaza específicamente a un •compañero que enlaza a GDF-8; (c) un receptor GDF-8 soluble; (d) una proteína ActRIIB; (e) una proteína que contiene dominio de foliestatina; (f) una proteína de foliestatina; ; (g) una proteína de GASP-1; (h) una proteína GDF-8; (i) un propéptido GDF-8; (j) un inhibidor no proteínico; ¡ (k) un ácido nucleico; y (1) una molécula pequeña, i
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero, ¡ave, reptil, o pez.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el mamífero es un humano. ¡
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, sangre, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, ¡suspensión celular, saliva, fluido oral, fluido ¡cerebroespinal, fluido amniótico, leche, calostro, secreción de glándula mamaria, linfa, orina, sudor, fluido lagrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, y moco.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, i sangre o plasma.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la etiqueta se elige de una enzima, un ¡epítopo tag, una radioetiqueta, biotina, un pigmento, una etiqueta tag fluorescente, y una etiqueta luminiscente.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la etiqueta es biotina.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, ' caracterizado porque la relación molar de biotina incorporada ¡en moles para el agente de detección es menor que 5:1.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, ¡ caracterizado porque la relación de biotina al agente es 'entre alrededor de 0.5:1 hasta 4:1.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, 1 caracterizado además porque comprende agregar un conjugado de •enzima y avidina.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, •caracterizado además porque comprende agregar un sustrato que cambia el color, luminescencia, o fluorescencia en presencia ¡de la enzima.
28. 28. Un método para detectar un anticuerpo que enlaza específicamente a un inhibidor GDF-8 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un primer inhibidor de GDF-8 con I una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de ¡reacción; (c) agregar un segundo inhibidor de GDF-8 etiquetado al .recipiente de reacción; y (d) detectar el segundo inhibidor de GDF-8 etiquetado asociado con la superficie.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero, ave, reptil, o pez.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, ; caracterizado porque el mamífero es un humano.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 28, ! caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, 'sangre, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, suspensión celular, saliva, fluido oral, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, leche, calostro, secreción !de glándula mamaria, linfa, orina, sudor, fluido lagrimal, ¡fluido gástrico, fluido sinovial, y moco. j
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, 'sangre o plasma.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el primer inhibidor de GDF-8 y el ¡segundo inhibidor GDF-8 son los mismos. '
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el primer inhibidor GDF-8 es un anticuerpo que enlaza específicamente a GDF-8.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el segundo inhibidor de GDF-8 es un anticuerpo que enlaza específicamente a GDF-8. !
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 28, ' caracterizado porque la etiqueta se elige de una enzima, un • epítopo tag, una radioetiqueta, biotina, un pigmento, una • etiqueta tag fluorescente, y una etiqueta luminiscente.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 28, 'caracterizado porque la etiqueta es biotina.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque comprende agregar un conjugado de •enzima y avidina.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque comprende agregar un sustrato que cambia el color, luminescencia, o fluorescencia en presencia de la enzima.
41. 41. Un método para detectar un anticuerpo que enlaza 'especificamente a MYO-029 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto MYO-029 aislado con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; (c) agregar MYO-029 etiquetado al recipiente de reacción; y (d) detectar MYO-0298 etiquetado asociado con la superficie .
42. 42. Un método para detectar un anticuerpo que enlaza ; especificamente a MYO-029 en una muestra biológica, .caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula hospedera que comprende un ¡constructo del gen indicador en un recipiente de reacción, en donde el constructo comprende un elemento de control de •respuesta del GDF-8 y un gen indicador; (b) agregar una cantidad de proteína GDF-8 madura al recipiente suficiente para activar la expresión del gen indicador; (c) agregar una cantidad de MYO-029 al recipiente de la 'etapa (b) suficiente para modular la activación del gen 'indicador; (d) agregar una muestra biológica al recipiente de reacción de la etapa (c) ; y ' (e) detectar la expresión del gen indicador en presencia 'y ausencia de la muestra biológica. i
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 41, •caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero, ave, reptil, o pez.
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el mamífero es un humano.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 41, ¡caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, ¡sangre, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, suspensión celular, saliva, fluido oral, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, leche, calostros, secreción ¡de glándula mamaria, linfa, orina, sudor, fluido lagrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, y moco.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, 'caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, •sangre o plasma.
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la etiqueta se elige de una enzima, un ¡epitopo tag, una radioetiqueta, biotina, un pigmento, una •etiqueta tag fluorescente, y una etiqueta luminiscente.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, I caracterizado porque la etiqueta es biotina. '
50. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la relación mediana de moles de biotina i incorporada para moles del agente de detección es menor que ¡5:1.
51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la relación mediana de biotina al agente es al menos de 10:1.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque comprende agregar un conjugado de enzima y avidina.
53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, ¡ caracterizado además porque comprende agregar un sustrato que cambia el color, luminiscencia, o fluorescencia en presencia de la enzima.
54. 54. Un método para detectar un anticuerpo que enlaza , específicamente a MYO-029 en una muestra biológica, ¡caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto MYO-029 aislado con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica al recipiente de reacción; ¡c) agregar GDF-8 etiquetado al recipiente de reacción; (d) detectar el GDF-8 etiquetado asociado con la superficie en presencia y ausencia de la muestra biológica.
55. 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero, ave, reptil, o pez.
56. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la muestra biológica es de un mamífero.
57. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el mamífero es un humano.
58. 58. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, sangre, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, suspensión celular, saliva, fluido oral, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, leche, calostro, secreción de glándula mamaria, linfa, orina, sudor, fluido lagrimal, fluido gástrico, fluido sinovial, y moco.
59. 59. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la muestra biológica se elige de suero, sangre o plasma.
60. 60. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la etiqueta se elige de una enzima, un epítopo tag, una radioetiqueta, biotina, un pigmento, una etiqueta tag fluorescente, y una etiqueta luminiscente. 1
61. 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la etiqueta es biotina.
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, ¡caracterizado además porque comprende agregar un conjugado de ¡enzima y avidina.
63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, ¡caracterizado además porque comprende agregar un sustrato que cambia el color, luminescencia, o fluorescencia en presencia de la enzima.
64. 64. Un método para evaluar una respuesta inmune individual para un primer inhibidor GDF-8, el método caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un primer inhibidor de GDF-8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica de un individuo al recipiente de reacción; (c) agregar un segundo inhibidor de GDF-8 etiquetado al recipiente de reacción; y (d) detectar un segundo complejo inhibidor de GDF-' 8/anticuerpo etiquetado asociado con la superficie, en donde la detección del complejo etiquetado indica una respuesta inmune al primer inhibidor GDF-8.
65. 65. Un método para evaluar una respuesta inmune individual para un primer inhibidor GDF-8, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto un inhibidor de GDF-8 con una superficie de un recipiente de reacción; (b) agregar la muestra biológica de un individuo al recipiente de reacción; (c) agregar una proteina de GDF-8 etiquetada al recipiente de reacción; y , (d) comparar la cantidad de proteína GDF-8 etiquetada asociada con la superficie en la muestra de prueba de una muestra de control, en donde la detección de un nivel disminuido de complejo ' etiquetado indica una respuesta inmune al inhibidor GDF-8.
66. 66. Un método para evaluar una respuesta inmune individual para un primer inhibidor GDF-8, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una célula hospedera que comprende un constructo del gen indicador en un recipiente de reacción, en donde el constructo comprende un elemento de control de respuesta del GDF-8 y un gen ¡ indicador; (b) agregar una cantidad de proteina GDF-8 madura al recipiente • suficiente para activar la expresión del gen indicador; (c) agregar una cantidad de MYO-029 al recipiente de la etapa (b) suficiente para modular la activación de GDF-8 del • gen indicador; (d) agregar una muestra biológica al recipiente de reacción de la etapa (c) ; y (e) detectar la expresión del gen indicador en presencia y ausencia de la muestra biológica.