CN101137906A - 对gdf-8调节剂的免疫应答的检测 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了检测生物样品中的GDF-8调节剂,例如,MYO-029的抗体的方法。还包括检测GDF-8调节剂的免疫应答的方法。特别是,本文提供了评估对GDF-8调节剂,例如GDF-8抑制剂在动物,包括人中的免疫应答的方法。
Description
相关案例
本申请要求享有2005年3月23日提交的美国临时申请No.60/664,643的优先权,该内容以其整体引入作为参考。
背景技术
生长和分化因子-8(GDF-8),也被称为肌肉生长抑制素(myostatin),是分泌蛋白并且是结构相关的生长因子中的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员。这个超家族的成员拥有生理学上重要的生长调控和形态发生的功能(Kingsley等人,Genes Dev.8:133-146(1994);Hoodless等人,Curr.Topics Microbiol.Immunol.228:235-272(1998))。同样的,它们享有共同的结构组成,包括用于分泌的短肽信号和由高度保守的蛋白质水解切割位点从有生物活性的羧基端部分分离的氨基端部分。
人GDF-8作为375个氨基酸长的前体蛋白被合成,其包括氨基端的前肽部分和羧基端的成熟部分。前肽是从成熟的GDF-8第266位的精氨酸切割下来的。作为二硫键连接的同型二聚体,成熟的GDF-8蛋白具有活性。蛋白酶解加工之后,通常认为两个GDF-8前肽与GDF-8成熟结构域的二聚体保持非共价结合,以维持GDF-8处于潜伏的、无活性状态(Lee等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:9306-9311(2001);Thies等人,GrowthFactors18:251-259(2001))。还已知其它一些蛋白质可以结合到成熟的GDF-8上并抑制其生物活性。这些抑制性蛋白质包括促滤泡素抑制素和促滤泡素抑制素相关蛋白,包括GASP-1(Gamer等人,Dev.Biol.208:222-232(1999);美国专利公布号2003-0180306-A1;美国专利公布号2003-0162714-A1)。
来自多物种的推断的氨基酸序列的比对表明,GDF-8在进化的全过程中高度保守(McPherron等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.。94:12457-12461(1997))。事实上,人、小鼠、大鼠、猪和鸡的GDF-8在C-末端区域序列100%相同。在狒狒、牛和羊的GDF-8中,上述序列仅有3个氨基酸不一致。斑马鱼的GDF-8差异较大,但仍与人类88%相同。
GDF-8是骨骼肌积聚的负调节剂,它在发育过程中的和成体的骨骼肌中高表达。GDF-8在转基因小鼠中的无效突变,以骨骼肌的显著肥大和增生为特征(McPherron等人,Nature387:83-90(1997))。在自然发生的牛的GDF-8突变中,骨骼肌量的类似增加也同样显著(Ashmore等人,Growth38:501-507(1974);Swatland等人,J.Anim.Sci.38:752-757(1994);McPherron等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.94:12457-12461(1997);Kambadur等人,Genome Res.7:910-915(1997))。研究还显示,人类HIV感染相关的肌肉萎缩伴随GDF-8蛋白表达的增高(Gonzalez-Cadavid等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.95:14938-43(1998))。除此之外,GDF-8可以调节肌肉特异性酶的产生(例如,肌酸激酶)和调节成肌细胞增殖(WO00/43781)。
抑制GDF-8活性的治疗剂可以用于治疗人或动物那些肌肉组织的增加将对治疗有益的病症。此外,可以期望在例如家畜类动物中增加肌肉量或肌肉强度,或加快生长或增加肌肉组织的量。因此,施用调节GDF-8的生物活性的因子作为药物,例如用来增加肌肉量,或用来治疗脂肪组织的、肌肉的、代谢的和骨相关的疾病,有相当大的意义。
个体在经历使用例如生物产品治疗时遇到的一种有害的负效应是对治疗剂的免疫应答。对于个体施用GDF-8调节剂可以使该个体产生与GDF-8调节剂特异性结合的抗体。此种免疫应答可能对健康产生严重的后果。由GDF-8调节剂在体内施用导致免疫复合物的形成可能影响该试剂的生物学分布和清除率。这些复合物可能包含施用的结合于循环免疫球蛋白上的GDF-8调节剂,或其部分。一般来说,免疫复合物的形成减少了可用于治疗目的的治疗剂量并且可能导致施用的试剂在非靶组织中滞留。在一些案例中,循环免疫复合物可能在例如肝脏和肾脏等非靶组织中蓄积(并且潜在地损害)。
大量的GDF-8调节剂,包括GDF-8活性抑制剂能够在个体内触发免疫应答。MYO-029是完全的人抗体,其在美国专利公布号2004-0142382中有更详尽的描述。MYO-029能够高亲和力结合成熟的GDF-8,抑制GDF-8的体内和体外活性,并且GDF-8活性的抑制与骨骼肌量和骨密度的调节相关。给小鼠施用MYO-029可以促进其肌肉量的增加。
检测特异性结合GDF-8调节剂(例如生物产品)的抗体的方法是所期望的。尤其需要允许对针对GDF-8调节剂(包括GDF-8抑制剂和抗GDF-8抗体)的免疫应答进行检测和/或定量的方法。这些方法允许,例如,检测GDF-8调节剂的抗体、检测对试剂免疫应答的存在、监测或优化治疗的过程和评估治疗的候选方案。
发明概述
本发明涉及在生物样品中检测特异性结合GDF-8调节剂的抗体的方法。包括检测对GDF-8调节剂的免疫应答的方法。具体来说,在此处提供了对动物中,包括人类中对GDF-8调节剂,例如GDF-8抑制剂的免疫应答的评估方法。在一个实施方案中,提供了检测GDF-8调节剂(例如MYO-029)的抗体存在的方法。具体来说,提供了评估抗体(包括中和抗体)的存在和/或数量的方法,这些抗体与来自施用了GDF-8调节剂的个体的生物样品中的GDF-8调节剂特异性结合。
在一个实施方案中,提供了检测生物样品中特异性结合GDF-8调节剂的抗体的方法,该方法包括如下步骤:(a)向GDF-8活性的体外测定的反应容器中加入GDF-8调节剂;(b)向GDF-8活性的体外测定的反应容器中加入生物样品;(c)检测通过生物样品对GDF-8活性的改变;并且(d)将生物样品存在时GDF-8活性的改变与仅GDF-8调节剂存在时GDF-8活性的改变进行比较。在某些实施方案中,该体外测定是报道基因测定。在其它实施方案中,该体外测定是检测特异性结合GDF-8调节剂的测定,例如免疫测定法。
在某些实施方案中,提供了在生物样品中检测特异性结合MYO-029的抗体的方法,包括如下步骤:(a)在反应容器中提供包含报道基因构建体的宿主细胞,其中该构建体包含GDF-8应答控制元件和报道基因;(b)在容器中加入足够量的成熟GDF-8蛋白以激活报道基因表达;(c)在步骤(b)容器中加入足够量的MYO-029以改变报道基因的GDF-8激活;(d)在步骤(c)反应容器中加入生物样品;和(e)在生物样品存在和缺失的情况下检测报道基因的表达。
在一个实施方案中,提供了检测生物样品中GDF-8调节剂的抗体的方法,包括:(a)将GDF-8调节剂与反应容器的表面接触;(b)向反应容器中加入生物样品;(c)向反应容器中加入检测剂;和(d)检测结合在反应容器表面的GDF-8调节剂/抗体复合物。有时候,检测剂是步骤(a)中的GDF-8调节剂和可检测的标签。有时候检测剂是标记的GDF-8蛋白。
在另一个实施方案中,提供了检测生物样品中GDF-8抑制剂的抗体的方法。该方法包括:(a)将第一种GDF-8抑制剂与反应容器的表面接触;(b)反应容器中加入生物制品;(c)反应容器中加入标记的第二种GDF-8抑制剂;和(d)检测结合在反应容器表面的标记的GDF-8抑制剂。在一些实施方案中第一种GDF-8抑制剂与第二种GDF-8抑制剂是相同的。在一些实施方案中第一种GDF-8抑制剂是特异结合GDF-8的抗体。在一些实施方案中第二种GDF-8抑制剂是特异结合GDF-8的抗体。在另一些实施方案中,GDF-8抑制剂优先结合GDF-8而非BMP-11。
在另一个实施方案中,提供了检测生物样品中特异性结合MYO-029的抗体的方法,包括(a)将分离的MYO-029与反应容器的表面接触;(b)将生物样品加入反应容器;(c)将标记的MYO-029加入反应容器;和(d)检测结合在反应容器表面上的标记的MYO-029。
这里还提供了检测生物样品中特异性结合MYO-029的抗体的方法作为具体的实施方案。该实施方案的方法包括:(a)将分离出的MYO-029与反应容器的表面相接触;(b)向反应容器中加入生物样品;(c)向反应容器中加入标记的GDF-8;和(d)检测在生物样品存在或缺少的情况下,与容器表面结合的标记的GDF-8。
在另一个实施方案中,提供了评估对第一种GDF-8抑制剂的个体免疫应答的方法,包括:(a)将第一种GDF-8抑制剂与反应容器的表面接触;(b)向反应容器中加入生物样品;(c)向反应容器中加入标记的第二种GDF-8抑制剂;和(d)检测与反应容器表面结合的标记的第二种GDF-8抑制剂/抗体复合物,其中标记复合物的发现表明对第一种GDF-8抑制剂的免疫应答。
在另一个实施方案中,提供了评估对第一种GDF-8抑制剂的个体免疫应答的方法。该方法包括:(a)将GDF-8抑制剂与反应容器的表面相接触;(b)向反应容器中加入生物样品;(c)向反应容器中加入标记的GDF-8蛋白;和(d)比较测试样品中与容器表面结合的标记的GDF-8蛋白的量和在对照样品中与容器表面结合的标记的GDF-8蛋白的量,其中与对照样品相比在测试样品中标记复合物水平下降的发现表明对GDF-8抑制剂的免疫应答。
在具体的实施方案中,从特异性结合GDF-8的抗体、特异性结合GDF-8结合配偶体的抗体、可溶性的GDF-8受体、ActRIIB蛋白、包含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质、促滤泡素抑制素蛋白、GASP-1蛋白、GDF-8蛋白、GDF-8前肽、非蛋白质抑制剂、核酸和小分子中选择GDF-8调节剂。在一些优选的实施方案中,GDF-8调节剂是GDF-8抑制剂。在一些优选的实施方案中,GDF-8调节剂是与GDF-8特异性结合的抗体,例如MYO-029。
在某些实施方案中,生物样品来自哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类。在一些优选的实施方案中,生物样品来自人类。在具体的实施方案中,从血清、血液、血浆、活体解剖样品,组织样品、细胞悬液、唾液、口腔液、脑脊液、羊膜液、奶、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、泪液、胃液、滑液和黏液中选择生物样品。一些优选的实施方案中,生物样品是血清、血液或血浆。
在多个其它的实施方案中,从酶、附加表位、放射标签、生物素、染料、荧光标签和发光标签中选择标签。在其中标签是酶的实施方案中,该方法可能还包括加入在酶存在的情况下改变颜色、发光或荧光的底物。在说明性实施方案中,该标签是生物素,并且该方法还包括加入抗生物素蛋白-酶缀合物。在一个特定的实施方案中,该方法还包括加入在酶存在的情况下改变颜色、发光或荧光的底物。
本发明另外的方面和实施方案部分将在下文描述中提及,部分为可以从该描述中显而易见的,或者可以在本发明的实践过程中学到。如在权利要求中提供的,这一概述和以下描述并非旨在限制本发明。
序列简述
GDF-8、MYO-029和相关的scFv片段、VH和VL结构域以及互补决定区(CDR)的DNA和氨基酸(AA)序列在序列表中提及并且在表一中列举。
表1
SEQ ID NO | |
成熟人类GDF-8的氨基酸序列 | 1 |
人类GDF-8前体的氨基酸序列 | 2 |
MYO-029scFv的DNA序列 | 3 |
MYO-029scFv的氨基酸序列 | 4 |
MYO-029VH的DNA序列 | 5 |
MYO-029VH的氨基酸序列 | 6 |
MYO-029VL的DNA序列 | 7 |
MYO-029VL的氨基酸序列 | 8 |
MYO-029scFv种系化的DNA序列 | 9 |
MYO-029scFv种系化的氨基酸序列 | 10 |
MYO-029VH种系化的DNA序列 | 11 |
MYO-029VH种系化的氨基酸序列 | 12 |
MYO-029VL种系化的DNA序列 | 13 |
MYO-029VL种系化的氨基酸序列 | 14 |
MYO-029H1的氨基酸序列 | 15 |
MYO-029H2的氨基酸序列 | 16 |
MYO-029H3的氨基酸序列 | 17 |
MYO-029L1的氨基酸序列 | 18 |
SEQ ID NO | |
MYO-029L2的氨基酸序列 | 19 |
MYO-029L3的氨基酸序列 | 20 |
附图说明
图一举例说明了本发明方法的一个实施方案。其中GDF-8调节剂是MYO-029,检测剂是生物素酰化的MYO-029。
图二举例说明了本发明方法的一个实施方案,其中GDF-8调节剂是MYO-029。检测剂是生物酰化的GDF-8。
发明详述
本发明涉及检测生物样品中特异性结合GDF-8调节剂的抗体的方法。包括检测对GDF-8调节剂的免疫应答的方法。具体来说,此处提供了评估在动物,包括人类对外源性的GDF-8调节剂的免疫应答的方法。在一个实施方案中,提供了检测GDF-8调节剂(例如MYO-029)的中和抗体存在的方法。具体来说是提供了对来自施用了GDF-8调节剂的个体的生物样品中,特异性结合GDF-8调节剂的抗体的存在和/或数量的评估方法。
当对个体施用GDF-8调节剂的时候,对施用GDF-8调节剂的免疫应答的检测方法可以用于确定在生物样品中特异性结合GDF-8调节剂的抗体的存在和/或范围。本方法还允许例如评估治疗方案、跟踪治疗的过程、评估GDF-8调节剂的适用性、鉴定治疗的候选方案或剂量的调节。本方法还可能允许GDF-8调节剂滥用的鉴定。
为了使本发明更容易理解,这里定义了一些术语。其它定义将在全文的详细描述中提及。
术语“GDF-8”指特异性的生长和分化因子-8。该术语指的是全长的GDF-8的未加工的前体形式还有翻译后切割产生的成熟形式和前肽形式。除非另外说明为“无活性的”,“GDF-8蛋白”保留一种或多种GDF-8生物活性。如此处所讨论的,该术语还指,保留了至少一种与成熟GDF-8相关生物活性的GDF-8的任何片段和变体,包括修饰了的序列。在SEQ ID NO:1中提供了成熟的人GDF-8的氨基酸序列,并且在SEQ ID NO:2.中提供了其前体,全长的人GDF-8序列。本发明涉及来自所有脊椎动物的GDF-8,包括而不限于,人类、牛、鸡、小鼠、大鼠、猪、绵羊、火鸡、狒狒和鱼(序列信息参见,例如,McPherron等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.94:12457-12461(1997))。
术语“成熟的GDF-8”指的是从GDF-8前体蛋白的羧基端结构域切割下来的蛋白质。GDF-8可以以单体、同型二聚体、和/或在GDF-8潜在的复合物中的形式存在,依条件而定。在其生物活性形式中,成熟的GDF-8也指“有活性的GDF-8”。如此处所讨论的,该术语还指,保留了至少一种与成熟的GDF-8相关的生物活性的任何GDF-8的片段和变体,包括修饰了的序列。
术语“GDF-8前肽”指从GDF-8前体蛋白的氨基端结构域切割下来的多肽。GDF-8前肽能够结合成熟的GDF-8上的前肽结合结构域。GDF-8前肽与成熟的GDF-8同型二聚体形成复合物。通常认为两个GDF-8前体与同型二聚体中两分子的成熟GDF-8结合形成无活性的四聚体复合物,称为潜在的复合物。潜在的复合物可能包括取代或附加至一个或多个GDF-8前体的其它的GDF抑制剂。
术语“GDF-8活性”指一种或多种与有活性的GDF-8蛋白相关的生理上的生长调控或形态发生的活性。例如有活性的GDF-8是骨骼肌量的负调节物。有活性的GDF-8还可以调节肌肉特异性酶(例如,肌酸激酶)的生成、刺激成肌细胞增殖和调节前体脂肪细胞分化为脂肪细胞。″GDF-8活性″包括“GDF-8结合活性”。例如,成熟的GDF-8特异性结合于GDF-8的前肽区域、ActRIIB、GDF-8受体、activin、促滤泡素抑制素、包含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质、GASP-1和其它蛋白质。GDF-8抑制剂例如抗体或其部分,可能降低一种或多种这些结合活性。在体内和体外测量GDF-8活性的示范步骤在下文提出。
术语“GDF-8调节剂”包括能够调节GDF-8的活性、表达、加工或分泌的任何试剂,或其药用可接受的衍生物。该术语包括增加一种或多种GDF-8活性的试剂和降低一种或多种GDF-8活性的试剂。术语“GDF-8抑制剂”包括能够影响GDF-8活性、表达、加工或分泌的任何试剂,或其药用可接受的衍生物。GDF-8抑制剂降低一种或多种与GDF-8相关的活性。在某些实施方案中,GDF-8抑制剂将影响GDF-8与一个或多个其生理结合配偶体的结合,这些配偶体包括但不局限于受体(例如ActRIIB)、包含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质(例如促滤泡素抑制素、FLRG、GASP-1、GASP-2)或GDF-8蛋白(例如GDF-8前肽及其突变体和衍生物)。此类GDF-8抑制剂包括,例如,特异性结合GDF-8的抗体(包括MYO-029、MYO-028、MYO-022、JA-16及其片段和衍生物)、特异性结合GDF-8受体的抗体(见,例如,美国专利号6,656,475,???美国专利公布号2004/0077053-A1)、修饰的可溶性受体(包括受体融合蛋白,例如ActRIIB-Fc融合蛋白)、其它特异性结合GDF-8的蛋白质(例如GDF-8前肽,GDF-8前肽的突变体和衍生物、促滤泡素抑制素、包含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质、还有这些蛋白质的Fc段融合体)、还包括结合GDF-8受体的蛋白质和这些蛋白质的Fc段融合体,还有其模拟物。术语GDF-8抑制剂还包括非蛋白质抑制剂(例如核酸)。GDF-8抑制剂包括蛋白质、抗体、肽、肽模拟物、核酶、反义寡核苷酸、双链RNA、siRNA(例如用作RNAi)和特异性抑制GDF-8的其它小分子。这些抑制剂指“抑制”、“减少”或“中和”GDF-8的生物活性,下文将更详细地描述。
“GDF-8抑制剂”将“抑制”、“中和”或“降低”GDF-8的至少一种生物活性,例如与有活性的GDF-8蛋白相关的生理、生长调控、或形态发生的活性。例如GDF-8是骨骼肌生长的负调节剂。GDF-8抑制剂可以增加肌肉量、提高肌肉强度、调节肌肉特异性酶的水平(例如,肌酸激酶)、刺激成肌细胞增殖、调节前体脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程、减少脂肪蓄积、降低血清三酰甘油水平、降低血清胆固醇水平、调节葡萄糖代谢和降低高血糖。还有,GDF-8阻断胰岛素诱导的GLUT4的表达,并且阻断胰岛素介导的前体脂肪细胞分化。
术语“抑制”、“抑制性的”及其相关术语指与缺乏GDF-8抑制剂时GDF-8的活性相比,由GDF-8抑制剂对一种或多种GDF-8活性的降低。活性的降低优选至少大约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在某些实施方案中,与缺乏GDF-8抑制剂时的GDF-8蛋白相比,在一种或多种目前已公开的抑制剂的存在下,GDF-8的活性至少下降了50%,优选至少60%、62%、64%、66%、68%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%或88%,更优选至少90%、92%、94%、96%、98%或99%,并且甚至更优选至少95%到100%。术语“中和”、“中和的”及其相关术语指的是降低一种或多种GDF-8活性至少80%、85%、90%或95%。可以如Thies等人,Growth Factors18:251-259(2001)所述,在pGL3(CAGA)12报道基因测定(RGA)中或在下文举例说明的ActRIIB受体测定中测量对GDF-8活性的抑制。
此处应用的术语“抗体”,是包含抗原结合位点的任何多肽,例如免疫球蛋白或其片段,并且包括包含抗原结合位点的任何多肽,而不考虑其来源、起源的物种、产生的方法和特性。在非限定性实例中,术语“抗体”包括合成的、人、猩猩、猴、灵长类、小鼠、大鼠、山羊、狗、绵羊和鸡的抗体。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单一特异性的、多特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂种的、突变的和CDR移植抗体。出于本发明的目的,除非另有说明(例如当前面有词语“完整的”),抗体还包括抗体片段。示例性抗体片段包括Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗体结合结构域的其它抗体片段。典型的,这些片段包含抗原结合结构域。如本领域的技术人员所公认的,可以设计(例如“种系化”)任何此类分子,例如,“人”抗体,来降低它的免疫原性、增加它的亲和力、改变它的特异性或为了其它目的。
例如,通过传统的杂交瘤技术(Kohler等人,Nature256:495-499(1975))、重组DNA法(美国专利号4,816,567)或应用抗体文库的噬菌体呈现技术(Clackson等人,Nature352:624-628(1991);Marks等人,J.MoI.Biol.222:581-597(1991))可以制备抗体。多种其它的抗体制备技术,参见Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow等人编辑,Cold SpringHarbor Laboratory,1988。
术语“抗原结合结构域”指抗体分子的部分,其包含特异性结合或互补于部分或全部抗原的区域。当抗原较大的时候,抗体可能只结合抗原的特定部分。“表位”或“抗原决定簇”是参与与抗体的抗原结合结构域的特异性相互作用的抗原分子的部分。一个或多个抗体的可变结构域(例如,由VH结构域构成的Fd抗体片段)可能提供抗原结合结构域。在某些实施方案中,抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)(美国专利号5,565,332)。
术语“特异性结合”、“特定结合”等等,指的是两个或多个分子形成在生理的或测定条件下可以测量的复合物并且是选择性的。在恰当选择的条件下,如果此种结合基本不被抑制,而同时抑制了非特异性结合,抗体或其它抑制剂被称为“特异性结合”于蛋白质。特异性结合以相对的高亲和力为特征并且对化合物或蛋白质有选择性。非特异性结合通常亲和力较低。典型的,当亲和常数Ka至少大约106M,或优选至少大约107、108、109或1010M,认为结合是特异的。某些方法需要特异性结合的高亲和力,而其它的方法,例如表面胞质团共振测定可以检测稳定性较低的复合物和较低亲和力的相互作用。如果需要,通过改变结合条件,可以减少非特异性结合而在基本不影响特异性结合。这些条件在本领域均已知,并且技术工人应用常规技术可以选择恰当的条件。该条件通常根据结合配偶体的浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、无关分子的浓度(例如,血清清蛋白、乳酪蛋白)等等进行限定。示例性的结合条件将在实施例中提及。
术语“分离的”指基本从其所在的自然环境游离的分子。例如,分离蛋白质基本没有细胞物质或来自该蛋白质来源的细胞或组织的其它蛋白质。该术语指其中分离蛋白质的纯度足以作为治疗组合物使用的制备,或至少70%到80%(重量/重量)纯度,更优选至少80%-90%(重量/重量)纯度,甚至更优选至少90%-95%纯度,和最优选至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(重量/重量)纯度。
术语“个体”指的是任何脊椎动物,包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼类。术语“哺乳动物”包括任何归为此类的雄性或雌性动物,包括人类、非人灵长类、猴、狗、马、猫、绵羊、猪、山羊、牛等等。非哺乳类动物的实例包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鱼类、鲑鱼、鲶鱼、鲈鱼、蛙类和鳟鱼。可以从例如人的运动员中挑选个体,或从驯养的、家畜类的、动物园饲养的、运动的、竞技的动物或宠物中挑选个体。
术语“有效剂量”或“有效量”指在个体(包括患有GDF-8相关疾病的个体)中足以减轻临床症状或获得想要的生物结果(例如,增加肌肉量,肌肉强度和/或骨密度)的剂量或水平。这样的剂量足以下调例如与骨骼肌量和骨密度负调控相关的GDF-8活性。治疗结果和临床症状可能包括身体脂肪的减少、肌肉量的增加、心血管指标的改善或葡萄糖代谢的调控的改善。例如,GDF-8抑制剂能够增加肌肉量、肌肉强度,调节肌肉特异性酶(例如,肌酸激酶)的水平,和/或刺激成肌细胞增殖。在优选的实施方案中,GDF-8抑制剂减少GDF-8相关病症的临床表现。GDF-8调节剂能够调节前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化、减少脂肪蓄积、降低血清三酰甘油水平、降低血清胆固醇水平、调节葡萄糖代谢、调节骨密度和降低高血糖。还可以对个体施用GDF-8抑制剂用来增加肌肉量、提高运动成绩、或增加或加速生长,包括肌肉生长。如接下来的章节所描述,可以确定其有效量。GDF-8抑制剂的“治疗有效量”指,对个体(例如人)在治疗、预防、治愈、推迟、缓解病症的严重性或减轻病症或复发病症的至少一种症状,或延长受试者的存活期使其超过不用此类治疗的期望值方面,关于单剂或多剂施用的有效量。
“GDF-8相关病症”指的是受试者可以从GDF-8调节剂,例如GDF-8抑制剂的施用中获益的病症或状况。GDF-8相关病症包括内科病症,例如肌肉相关的或神经肌肉的病症或状况,或脂肪组织的、代谢的、或骨相关的病症或状况。
当对个体施用抑制剂以治疗病症的时候,GDF-8抑制剂的施用可能是治疗性的,包括症状或病症的缓解和/或预防。治疗性的用途包括对患有内科病症的个体或最终有可能患此病症的个体,为了治疗、预防、治愈、推迟、缓解病症的严重性、或减轻病症或复发病症的至少一种症状,或延长患者的存活期使其超过不用此类治疗的期望值,而施用GDF-8调节剂。例如,GDF-8抑制剂能够增加肌肉量、肌肉强度、调节肌肉特异性酶的水平(例如,肌酸激酶)和刺激成肌细胞增殖。例如,GDF-8调节剂能够调节前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化、减少脂肪蓄积、降低血清三酰甘油水平、降低血清胆固醇水平、调节葡萄糖代谢、调节骨密度和降低高血糖。对个体施用GDF-8抑制剂还可以用来增加肌肉量、提高运动成绩、或增加或加速生长,包括肌肉的生长。
术语“高度严谨”或“高度的严谨性”描述了用于确定核酸-核酸相互作用的杂交和洗脱的条件。这些条件是本领域的技术人员公知的,并且可以从例如Wiley等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6(1989)中找到这些条件。如本技术所描述的,可以应用有水和无水的条件。高度严谨的杂交条件的一个实例是在大约45
℃,6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交,接下来在50℃在0.2×SSC,0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)中进行至少一次洗脱。高度严谨的杂交反应条件的其它实例包括在大约45℃(或50℃、60℃或65℃),6×SSC中进行杂交,接下来在大约55℃、60℃或65℃,在0.2×SSC、0.1%SDS中进行至少一次洗脱。高度严谨的条件还可以在65℃,0.5M磷酸钠、7%SDS中进行杂交,接下来在65℃,0.2×SSC、1%SDS中进行至少一次洗脱(也参见,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory出版,1989)。
术语“基本相同”或“基本相似”意味着相关的氨基酸或核苷酸序列,例如本发明中GDF-8抑制剂中的相关的氨基酸或核苷酸序列,与已公布的序列相比,是完全相同或有非本质的差别(通过保守的氨基酸的置换)。本发明的核苷酸和多肽包括,例如,在序列上与已公开的核酸分子和多肽至少有大约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的那些。
对于多肽,在最初多肽和与最初多肽基本上相同的变体多肽之间比较至少20、30、50、100或更多的氨基酸。对于核酸,在最初核酸和与最初核酸本质上相同的变体核酸之间比较至少50、100、150、300或更多的核苷酸。因此,变体可以在一个或多个区域基本相同,但在其它部分有差异,而仍然符合“基本相同”的定义。通过标准比对算法,诸如例如Altschul等人,J.MoI.Biol.,215:403-410(1990)描述的局部对比基础工具(BLAST)、Needleman等人,J.MoI.Biol.,48:444-453(1970)中的算法、或Meyers等人,Comput Appl,Biosci.,4:11-17(1988)中的算法,可以确定两个序列的同一性百分数。
术语“变体”指分别与例如提供的GDF-8抑制剂的核苷酸和氨基酸序列基本相同或相似的核苷酸和氨基酸序列。变体可以是自然存在的,例如自然存在的人或非人的氨基酸序列,或人造产生的。变体的实例是从mRNA选择性剪接(包括3’和5’剪接的变体)、点突变和其它突变,或蛋白质的蛋白酶剪切产生的那些。变体包括核酸分子或其片段还有氨基酸序列及其片段,分别与其它核酸分子(或当用适当的插入或缺失优化其比对的时候,它们的互补链)或氨基酸序列基本相同或相似。在一个实施方案中,在优化比对的时候,分别在本发明的核酸分子或蛋白质与另一核酸分子或蛋白质之间,有至少大约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。除此之外,如在本申请中所讨论的,变体包括呈现GDF-8活性或抑制GDF-8活性的蛋白质或多肽。
生物样品是从个体中收集的生物材料,例如细胞、组织、器官或体液。示例性生物样品包括血清、血液和血浆。
术语“反应容器”指容器,在其中可以发生和检测体外测定,例如GDF-8调节剂和抗体之间的结合反应。“表面”是指可以直接或间接“接触”、“固定”、或“包被”GDF-8调节剂的任何固体(诸如,例如,玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯、硫酸葡聚糖或处理过的聚丙烯)的外侧部分。“反应容器的表面”可以是反应容器自身的一部分,或可以是反应容器内的表面。例如,聚苯乙烯的表面可以接受化学或放射处理以改变其表面的结合特性。该术语还包括中度结合、高度结合、胺化的和活化的表面。GDF-8调节剂能够直接与表面接触,例如,通过物理吸附或共价结合到表面,或者间接的接触,例如,通过与直接接触表面的物质或部分的相互作用。
此处所用到的术语“捕获剂”,指分子,例如蛋白质,例如,其用于对靶蛋白(例如GDF-8调节剂或GDF-8自身)的特异性结合的免疫测定中。适合瞬时方法的捕获剂特异性结合于GDF-8调节剂和/或GDF-8蛋白。例如,捕获剂可以是GDF-8蛋白,包括成熟的GDF-8二聚体,或特异性结???合GDF-8蛋白的蛋白质。相似地,捕获剂可以是GDF-8调节剂或特异性结合GDF-8调节剂的蛋白质。
“检测剂”是与GDF-8调节剂的抗体特异性结合的蛋白质或小分子。检测剂可以任选的包含可检测的标签的试剂。通过包含可检测标签的检测剂也可以检测到检测剂自身。术语“标签”指由其化学特点提供了分析可辨认的信号使能够检测分子间相互作用的分子。蛋白质,包括抗体,如果可以共价或非共价结合到可以直接(例如,通过生色团、荧光团或放射性同位素)或间接(例如,通过催化产生有色、发光或荧光产物的反应)检测到的分子上,就具有了可检测的标签。
本发明涉及在生物样品中检测对GDF-8调节剂的免疫应答的方法和检测GDF-8调节剂的抗体的方法。在一个实施方案中,检测抗体的方法,特别是能够结合于体内治疗用的GDF-8调节剂(包括GDF-8抑制剂)组分的抗体。在一些实施方案中,该测定检测中和抗体,例如抑制GDF-8调节剂作用的抗体。在特定的实施方案中,该测定法检测抑制MYO-029结合到GDF-8上的抗体。该方法在评估人类患者接受治疗性抗体,或其它GDF-8调节剂,例如抑制GDF-8的生物活性的GDF-8调节剂的适用度上,是有用的。在具体实施方案中,这些方法用于检测在生物样品中MYO-029的抗体的存在。
患有GDF-8相关病症的个体、具有发展为GDF-8相关病症风险的个体、正在经历GDF-8调节剂治疗的个体和成为GDF-8调节剂的施用候选对象个体,是此处提供方法的候选对象。本发明的方法可以检测或预防有害的免疫应答,和/或评估GDF-8调节剂应用的效力、生物稳定性或适合性。
患有或有风险发展为GDF-8相关病症,例如肌肉相关病症或神经肌肉病症的个体,是使用此处提供方法的候选对象。GDF-8活性的抑制增加个体(包括那些患有肌肉相关病症的个体)中的肌肉组织。许多病症与肌肉或神经组织的机能上的损害相关,例如,肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、肌肉减少症、恶病质、肌肉废用(muscle wasting)、肌肉萎缩或肌肉退化(包括废用、萎缩和脆弱性增加)。肌营养不良包括,例如,假肥大性肌营养不良、面肩胛臂的肌营养不良和肢带肌营养不良。肌营养不良的例子包括迪谢内肌营养不良(Leyden-M_bius)、Becker肌营养不良、埃-德肌营养不良、肢带肌营养不良、强直性脊柱综合症、Ullrich综合症、福山型肌营养不良、沃-瓦综合症、肌肉视脑疾病、面肩肱肌肌营养不良(Landouzy-Dejerine)、先天性肌营养不良、肌强直性营养不良(斯太纳特氏病)、先天性肌强直和高尔斯病。
GDF-8相关的肌肉病症还包括选自与心血管疾病相关的肌肉退化、或继发于另一疾病或状况例如器官萎缩、器官衰竭、癌症、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、卧床、制动、长期缺乏运动的病症,或其它疾病或状况也包括在该术语中。
患有或有风险发展为脂肪组织病症(例如,肥胖症)、心血管疾病(当与肌肉丧失与肌肉废用相关时)和胰岛素代谢疾病的个体可能成为候选对象。同样的,患有或有风险发展为骨丧失相关的病症,包括骨质疏松症(特别是在中年以上或绝经后的妇女中)、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、骨量减少、骨关节炎、骨质疏松症相关的骨折的个体,是本文方法的候选对象。其它GDF-8相关的状况还包括代谢性骨病和以低骨量为特征的病症,例如那些由于长期糖皮质激素治疗、性腺早衰、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏和神经性厌食症而造成的骨量丧失。
心血管疾病的实例包括冠状动脉疾病(动脉粥样硬化)、心绞痛(包括急性心绞痛和不稳定性心绞痛)、心脏病发作、中风(包括局部缺血性中风)、高血压相关的心血管疾病、心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压、高脂血症、外周动脉疾病和外周血管疾病。胰岛素代谢病症的实例包括与糖代谢自稳异常、II型糖尿病、前驱糖尿病、葡萄糖耐量降低、血脂障碍、代谢综合症(例如,X综合症)和由外伤(例如烧伤或氮失恒)诱导的胰岛素抗性相关的状况。
此外,渴望增加肌肉量或肌肉强度的个体,例如想要提高运动成绩,或在家畜类动物中加快生长或增加肌肉量,是使用本文提供方法的候选对象。个体表现出肌肉量的增长,例如肌肉细胞大小的增加(肥大)或肌肉细胞数量的增加(增生)可以是使用检测外源性GDF-8调节剂抗体的方法的候选对象。该增长可以发生在哺乳动物或其它动物的I型或II型肌肉纤维。测量肌肉量增长的方法是本领域所公知的。例如应用标准技术例如水下测重,可以在GDF-8调节剂的施用前后对肌肉进行测量。可以通过获得至少大约5%、10%、20%或更多的重量增加来证明肌肉大小的增长。
在一个实施方案中,本发明包括检测在来自至少一个个体的生物样品中特异性结合GDF-8调节剂的抗体的方法,该方法包括如下步骤:(a)向体外测定GDF-8活性的反应容器中加入GDF-8调节剂;(b)向体外测定GDF-8活性的反应容器中加入生物样品;(c)检测生物样品对GDF-8活性的调节;并且(d)将存在生物样品时GDF-8活性的改变与仅存在GDF-8调节剂时GDF-8活性的改变进行比较。在某些实施方案中,体外测定是检测抗体与GDF-8试剂结合的免疫测定法,例如以酶联免疫吸附测定(ELISA)法。在一个实施方案中,检测剂是具有可检测标签的GDF-8调节剂,应用该试剂可以检测对GDF-8试剂的结合。在另一个实施方案中,检测剂是标记的GDF-8蛋白。在另一个实施方案中,体外测定是对GDF-8活性基于细胞的测定,诸如,例如报道基因测定。
在某些实施方案中,体外测定衡量一种或多种与有活性的GDF-8蛋白相关的生理上的生长调控或形态发生的活性。可以从基于细胞的测定或无细胞的测定(诸如,例如,测量转录、复制或细胞周期阻滞的调节的测定)或结合测定(诸如,例如,免疫测定、表面胞质团共振测定、免疫沉淀、或放射免疫测定)中选择检测GDF-8活性改变的体外测定法。例如,有活性的GDF-8是骨骼肌量的负调节剂,它调节肌肉特异性酶(例如,肌酸激酶)的产生、刺激成肌细胞增殖并且调节前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化。在一些方法中,实行了从BMP-11调节剂中选择GDF-8调节剂。基于细胞和无细胞的GDF-8活性测定是本领域所公知的,并且在下文做了描述。
结合测定
在一个实施方案中,本发明包括在从一个或多个病人的取样中选出的生物样品中检测抗体存在的方法,其包含如下步骤:(a)将GDF-8调节剂与反应容器的表面接触;(b)向反应容器中加入生物样品;(c)向反应容器中加入检测剂;和(d)检测结合在反应容器表面的GDF-8调节剂/抗体复合物。图一和图二中描绘了两个实施方案。
在某些实施方案中的步骤(a)中,将GDF-8调节剂与反应容器的表面接触,例如通过共价或非共价结合到其表面上。该接触可以是直接的或间接的。有代表性的固体表面是玻璃或聚合物,诸如,例如,纤维素、硫酸葡聚糖、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯、或聚丙烯,并且以珠的形式出现,包括磁性珠和顺磁珠。可以,例如通过影响表面结合特性的化学处理或放射处理修饰该表面。通过共价或非共价的相互作用例如物理吸附可以实现配体在表面上的固定。GDF-8调节剂,例如MYO-029,可以直接吸附到反应容器的表面。在其它的实施方案中,通过共价结合到试剂上的生物素分子和与反应容器表面接触的抗生物素蛋白分子的相互作用,使GDF-8调节剂可以与反应容器的表面结合。共价结合法包括与交联剂(例如戊二醛、六亚甲基异氰酸酯)、含磺基试剂、肽、烷化剂或相似的试剂偶联。在一些优选的实施方案中,GDF-8调节剂是特异性结合GDF-8的抗体、特异性结合GDF-8的单克隆抗体,针对GDF-8、MYO-029、MYO-028、MYO-022或JA-16、或上述任一的片段的中和抗体。例如在美国专利公布号2004/0142382-A1和2003/0138422-A1中已经提出了这些GDF-8抑制剂的结构和功能的特性,并且除了整体文献,在此处还特别引入那些部分作为参考。具体来说,在美国专利公布号2004/0142382-A1中第54-90段和权利要求1-42中,描述了某些中和抗体(包括MYO-029)的特性。类似地,在第56-70、93-110段和权利要求1-54中描述了美国专利公布号2003/0138422-A1的抗体抑制剂。
在某些实施方案中,将GDF-8调节剂与反应容器的表面接触之后,在加入样品之前,清洗反应容器以除去未结合的GDF-8调节剂。通过阻断步骤可以使非特异性相互作用最小化,其中将至少含有一种阻断试剂(例如并不特异性结合靶标的蛋白质)的缓冲液加入反应容器。在其它的实施方案中,可以加入去污剂,例如离子型或非离子型的去污剂。封闭缓冲液可能包括例如血清、牛血清清蛋白、奶、酪蛋白、明胶和/或非离子型去污剂。在一些实施方案中用pH值在大约5到9之间的缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或乙酸盐缓冲液)清洗反应容器。
某些实施方案包括步骤(b),其中将生物样品加入反应容器中。可以从血清、血液、血浆、活体解剖样品、组织样品、细胞悬液、唾液、口腔液、脑脊液、羊膜液、奶、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗和泪液中选择待测的生物样品。在优选的实施方案中,生物样品是流体。在一些优选的实施方案中,从血液、血清和血浆中选择生物样品。在具体的实施方案中,生物样品是血清,例如人、猴、大鼠或小鼠的血清。
在其它实施方案中,从一个或多个个体中分离生物样品并且在检测前进行有选择的处理。生物样品可以经收集使用或在用适合的稀释液稀释后使用。稀释法的优化可以减少和/或消除基质对测定的干扰。稀释液没有特别的限制但是可能包括去离子水或多种缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、乙酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液),所述缓冲液具有缓冲液活性的pH值范围在大约5-9,优选PH值在大约6.5-8.5。在一些优选的实施方案中,稀释液包含正常人的血清。稀释液可能包含恒定浓度的选出的与待测生物样品相对应的对照生物样品,例如为样品基质的背景效应或干扰作对照。
在一个实施方案中,将人血清待测样品使用THST(50mM Tris-HCl,pH8.0,含有1.0mM甘氨酸、0.5M NaCl、和0.05%(体积/体积)吐温20_)缓冲液以1∶8倍稀释,并且在THST加入12.5%的人类血清中制备超过8倍稀释的待测样品。可以以大约2、4、8、16、32、64或128倍稀释样品。在其他的实施方案中,为获得可证明的稀释线性和载体效应的数据点范围,按1∶1.5或1∶1.6连续稀释待测样品。对于优选的生物样品基质,可以选择能够优化基质干扰和测定敏感度的稀释。
在一些实施方案中,可以应用众所周知的方法任选的分级分离或浓缩该样品,然后按此处提供的检测GDF-8调节剂的方法加入样品。例如,如果在测定中基质干扰限制了GDF-8调节剂的检测,可以应用分级分离(包括纯化)或者浓缩法。分级分离和浓缩技术,包括但不局限于,离心、硫酸胺沉淀、聚乙醇沉淀、三氯乙酸(TCA)沉淀、亲和技术(例如,用与特异性结合的配偶体,例如抗体,即抗人Fc抗体、A蛋白或G蛋白缀合的树脂进行免疫沉淀)、层析技术和其他分离技术。在优选的实施方案中,在检测GDF-8调节剂之前,不分级分离或浓缩生物样品。
可以从未处理的个体收集生物样品,或在GDF-8调节剂施用之前、过程中或之后收集样品。例如,可以在施用GDF-8调节剂1、2、4、6、8、10、12、15、20、25、30或更多天数后从个体中获得样品。也可以在施用GDF-8调节剂1、2、3、4、6、8、10、12、16或更多周后从个体中获得样品。大量的循环GDF-8调节剂可能妨碍在此处提供方法的某些实施方案中对试剂抗体的检测(见,例如,实施例7),优化样品收集的时间可以减少来自GDF-8调节剂的干扰。还通过检测延长的时间点来检测抗体应答的持续性。在一些情况下,长达一年或以上的时间点是适合的。
在某些实施方案中,将待测样品的等分试样与固定化的抗原接触并且在适合条件下(例如23℃)孵育足够长的一段时间(例如,2-120分钟,1-4小时)以允许任何抗体与样品中存在的GDF-8调节剂结合,并且允许形成抗体/GDF-8调节剂复合物。在其它实施方案中,GDF-8调节剂/抗体反应没有特别的限制,可以在常规免疫测定法例行应用的条件下进行。经典的步骤包括孵育或允许建立包含抗体和GDF-8调节剂的反应系统,一般其温度不超过45℃,优选在大约4℃和大约40℃之间,特别优选在大约23℃到大约40℃之间,时间大约在0.5到40小时之间,优选大约在1到20小时之间。优选的实施方案中,选择避免干扰反应或其检测的反应缓冲液。因此,实施方案包括但并不局限于,pH值在大约5到9之间的缓冲液,例如,柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液和乙酸盐缓冲液。
在某些实施方案中,步骤(c)包括向反应容器中加入检测剂。孵育一段时间后,在一些实施方案中,在步骤(c)之前,用缓冲液清洗GDF-8调节剂的固定化抗体以除去未结合的溶质。在其他实施方案中,执行相似的测定,由此同时进行步骤(b)和步骤(c)。
在特定的实施方案中,在步骤(b)后执行步骤(c),操作可能包括孵育或允许建立包括抗体和GDF-8调节剂的反应系统,其温度一般不超过45℃,优选在大约4℃和大约40℃之间,更优选在大约25℃到大约40℃之间,时间在大约0.5到40小时之间,优选在大约1到20小时之间。在某些实施方案中,选择不干扰反应或其检测的反应缓冲液。因此实施方案包括但不局限于,pH值在大约5到9之间的缓冲液,例如,柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液和乙酸盐缓冲液。
在某些实施方案中,检测剂是能够特异性结合抗体的分子,所述抗体特异性结合GDF-8调节剂。在一些实施方案中,检测剂包含可检测的标签。优选的检测剂包括某些免疫球蛋白和可以结合人免疫球蛋白序列的试剂(包括羊抗人抗体、A蛋白、G蛋白等等),例如免疫球蛋白的恒定区。包括特异性结合GDF-8调节剂的免疫球蛋白。由于MYO-029是具有λ轻链的人IgG1免疫球蛋白,在多种实施方案中,检测剂包括能够与具有λ轻链的人IgG1免疫球蛋白结合的试剂。在其他的实施方案中,包括结合具有λ轻链的非人IgG1免疫球蛋白的试剂。在多种实施方案中,检测是定量或者定性的。在一些实施方案中,不需要任何工具的帮助通过肉眼即可检测到标签。
在优选的实施方案中,检测剂诸如MYO-029或成熟的GDF-8二聚体是生物素酰化的。如在实施例12中提出的用胺特异性试剂生物素酰化有功能、成熟的GDF-8蛋白。相似地,在备选的制备中,根据美国专利公布号2004/0142382A1实施例1的测定生产和分离潜在复合物中的GDF-8蛋白。接下来应用众所周知技术和/或此处描述的方法生物素酰化潜在的复合物。
成熟的GDF-8对最初胺基团的生物素酰化异常敏感,例如在赖氨基残基上的生物素酰化。当使用胺特异性生物素酰化试剂生物素酰化时,高生物素酰化的GDF-8,与无生物素的GDF-8相比,活性降低或失活。为了在生物素酰化后保留有功能的、成熟GDF-8蛋白,发现掺入成熟GDF-8制剂的胺基团上的生物素的量至关重要。例如MYO-29和ActRIIB结合活性在高生物素酰化制剂中减低。因此,优选每摩尔GDF-8二聚体具有低于5摩尔生物素的胺生物素酰化的成熟GDF-8制剂。在备选的实施方案中,蛋白质可能是在巯基、羧基或碳水化合物上生物素酰化的。非特异性结合或由于光活化而反应的光敏的生物素化合物也同样适用。
在此处提供的某些实施方案中,GDF-8作为潜在的复合物被胺特异性生物素酰化试剂生物素酰化,并且接下来从复合物中分离出成熟的GDF-8。这些方法中,优化掺入成熟的GDF-8二聚体的生物素的量以保持其生物活性,例如以避免使其受体结合位点失活。应用巯基特异性生物酰化试剂也可以在表面半胱氨酸残基(或表面巯基)上生物素酰化GDF-8蛋白。此外,生物素酰化碳水化合物的方法包括氧化预处理以产生活性醛,并且例如生物素酰肼试剂的用途是本领域所公知的,且可以为了此处所述蛋白质(包括成熟的GDF-8蛋白,优选修饰的形式)优化这些方法。此外可以应用能够经由例如天冬氨酸和谷氨酸残基生物素酰化的羧基反应生物素酰化试剂和反应。对本领域技术人员显而易见的是,最佳的生物素与GDF-8二聚体的摩尔比值将随生物素酰化操作和应用的试剂而改变。例如熟练的技术人员将理解如何应用此处描述的方法与已知的生物素酰化操作组合,优化有活性的生物素酰化的GDF-8制备,以生产具有不同最佳生物素与GDF-8二聚体摩尔比值的生物素酰化的成熟GDF-8蛋白,而保留至少一种GDF-8活性。
多种生物素酰化试剂能够有效的标记蛋白质,包括GDF-8潜在的复合物。反应中生物素衍生物与GDF-8潜在的复合物的摩尔比值可以是大约10、15、20、40或80比1,并且可以改变试剂的组成和浓缩反应的时间和温度以调节加入该反应的生物素的量。例如,可以有选择的优化盐和其它试剂。在实施方案中,生物素酰化的成熟的GDF-8二聚体与GDF-8的氨基端前肽部分缔合,以避免在生物素酰化反应过程中,成熟的二聚体失活。生物素衍生物为本领域所公知并且在本领域可以应用。生物素的修饰包括可变的间隔臂的修饰、影响可溶性的修饰和/或反应基团的修饰,例???如使允许生物素部分的切割。生物素的琥珀酰亚胺基酯和其衍生物,包括水溶性琥珀酰亚胺基酯可以用于例如在半胱氨酸残基上的GDF-8的生物素酰化。为了确定掺入的生物素的量,可以应用例如众所周知的分析和分筛(sizing)技术,例如反相高压液相层析、质谱等等。此外,可以利用应用例如比色测定或荧光测定定量生物素的商业化试剂盒(参见,例如,利用HABA(2-(4’-羟基偶氮苯)-苯甲酸的EZTM生物素定量试剂盒,Pierce))。
另一个示例性的生物素酰化操作,例如,包括在2-8℃将GDF-8潜在的复合物,以15或20摩尔的EZ-连接磺基-NHS-生物素(Pierce)比1摩尔的GDF-8复合物的比率,进行生物素酰化2小时(参见,例如美国专利公布号2004/0142382A1的实施例3)。通过应用0.5%TFA降低pH值可以中止该反应,并且然后将该复合物用于层析,在C4Jupiter250×4.6mm柱(Phenomenex)上从GDF-8前肽中分离成熟的GDF-8。将使用TFA/CH3CN梯度洗脱的生物素酰化的成熟的GDF-8级份汇集、浓缩,并且用MicroBCATM蛋白质测定试剂盒(Pierce)定量,或应用其它众所周知的分离和浓缩的技术。
在优选的实施方案中,体外结合测定包括生物素酰化的GDF-8蛋白捕获剂,并且通过生物素部分与反应容器表面的抗生物素蛋白的相互作用使GDF-8蛋白接触反应容器的表面。在一些实施方案中,在生物素酰化的成熟的GDF-8蛋白中,生物素部分与成熟的GDF-8蛋白的摩尔比值在约0.5∶1到约4∶1之间。在其他的实施方案中,生物素与GDF-8二聚体的平均比值小于约5∶1、小于约2∶1或小于约1∶1。在有活性的GDF-8制剂中,测量的生物素与成熟的GDF-8蛋白比例为摩尔比例为0-3的混合物,大多数分子的摩尔比率在约1∶1。在一些实施方案中,生物素酰化的成熟GDF-8制剂包括每摩尔成熟的GDF-8二聚体中小于约1、2、3、4或5摩尔的生物素。例如,生物素与成熟的GDF-8蛋白的平均或中值比率可以低于或近似等于0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8或9。例如,生物素与成熟的GDF-8蛋白的比例可以低于或近似等于1、2、3、4或5。还可以通过生物素酰化标记其他的检测和捕获剂。例如,生物素酰化的MY-029的生物素酰化比例可以高达至少(或小于)10∶1、20∶1或更高。在优选的实施方案中,生物素酰化的成熟GDF-8蛋白制剂的平均摩尔比例在大约1到3摩尔的生物素比1摩尔的成熟GDF-8二聚体。任选的,可以应用其他捕获剂。
在一个实施方案中,生物素酰化的MYO-029是检测结合于固定在反应容器(例如96孔板)表面的MYO-029的抗MYO-029抗体的检测剂。以相似的方式,通过使用这些材料和它们各自的生物素酰化的形式替换MYO-029和生物素酰化的MYO-029,这些方法中还包括检测促滤泡素抑制素、多种GDF-8结合受体、activin或GDF-8前肽的抗体的ELISA实验。此外,任何能够识别和结合针对抗GDF-8抑制剂形成的抗体的试剂(无论单独使用或者与其他试剂结合使用以产生可操作的剂量应答信号),可以用于GDF-8抑制剂抗体的检测。这些试剂可用于直接结合测定方式(特别是对那些非人来源的样品)或用于竞争方式(下文描述)。
在另一个实施方案中,通过与特异性结合GDF-8调节剂而络合的抗体特异性结合而使检测剂络合(“桥联”)。分析物抗体的多效价性使该桥联测定成为可能。在某些实施方案中,通过测量标签的活性可以评估样品中靶标抗体的存在或缺失或其含量,这依赖于在检测剂的标记中使用的标记试剂。
在一些实施方案中,“直接”标签可以是结合或缀合到特异性结合成员上的任何分子,这些成员在不加辅助试剂的情况下能够自发的产生可检测的信号。一些实例包括放射性同位素、(例如125I、3H、14C)、重金属、荧光团(例如,荧光素酶、绿色荧光蛋白、荧光素异硫氰酸盐、四甲基若丹明异硫氰酸盐、1-N-(2,2,6,6-四甲基-1-氧基-4-哌啶基)-5-N-(天冬氨酸)-2,4-二硝基苯)、染料(例如,藻青素、藻红素、德克萨斯红、邻苯二醛)、发光分子(包括化学发光的和生物发光的分子)、胶态金颗粒、胶态银颗粒、其它的胶态金属颗粒、铕、聚苯乙烯染料颗粒、微型有色颗粒例如染料溶胶和有色乳胶颗粒。许多此类物质对本领域技术人员来说是众所周知的。
在某些情况下,标签可以是酶类,例如碱性磷酸酶、过氧化物酶(例如,辣根过氧化物酶)、葡萄糖氧化酶或β-半乳糖苷酶。在多种实施方案中,选择可以与特异性酶一起使用的底物用于在相应的酶存在的情况下,产生在颜色、荧光或发光中可检测到的改变。通过戊二醛或还原性胺化交联可以将该酶缀合到GDF-8调节剂。但是,由于要易于识别,存在广泛多种的不同缀合技术并且易于为技术人员所利用。
在特定的实施方案中,向GDF-8调节剂/抗体复合物中加入生物素酰化的和/或酶标记的检测剂,例如抗体,并且使其结合。洗掉过量的试剂,然后向反应容器中加入含有适当底物的溶液。底物经历酶促反应导致分光光度可以测量的改变,这种改变能够指示样品中存在的抗体的量。
过氧化物酶当与可溶性底物(例如,3,3′,5,5′四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)、2,2’-连氮基-二[3-乙基-苯噻唑啉]磺酸盐(ABTS)、对位硝基苯基磷酸盐、鲁米诺、多酚、吖啶酯类和荧光素)一起孵育的时候,在底物中产生可光谱检测的生色或发光的改变。典型地,在与底物一起孵育固定的时间之后,淬灭该反应(例如,通过酸化作用),然后通过测量光密度(吸收)或发光对结果进行定量。可以将吸光度结果与在生色反应的线性范围内的OD值进行比较,并且用相对光单位(RLU)进行发光免疫测定。作为另一备选,可以应用导致结合和产生可操作的剂量应答信号的试剂(例如,放射标记试剂、酶/底物试剂或应用例如生物素/抗生物素蛋白的检测放大系统)的任何组合。
在其它的实施方案中,标签是生物素、半抗原或附加表位(例如,组氨酸标签、HA-标签(血凝素肽)、麦芽糖结合蛋白、AviTag_或谷胱甘肽-S-转移酶),其可以通过加入与GDF-8调节剂复合物结合的标签相互作用的标签检测剂被检测到。通过与抗生物素蛋白-酶(例如,抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶复合物)的相互作用,在与抗生物素蛋白-酶缀合物和适合的生色或生荧光的底物顺序孵育缀合后,可以检测到生物素标记的(“生物素酰化的”)检测剂。在特定的实施方案中,也可以应用铕标记的链霉抗生物素检测生物素酰化的GDF-8调节剂。
在某些实施方案的步骤(d)中,通过对标签信号的定性或定量评价,检测与反应容器表面结合的GDF-8调节剂/抗体复合物。在一些情况下,直接,例如通过荧光或发光测量标签,或间接的,通过加入底物测量标签。在其它情况下,在与另外的试剂一起孵育后测量标签。在标签为生物素的实施方案中,可以在接下来的步骤中加入抗生物素蛋白缀合物(在一些优选的实施方案中,例如辣根过氧化物酶)。在一个特定的实施方案中,抗生物素蛋白缀合物可以结合于固定化的检测剂。洗掉过多的抗生物素蛋白缀合物。然后加入酶的底物,在例如颜色、荧光或发光上产生可测量的改变。在一些实施方案中,辣根过氧化物酶的底物是3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一些实施方案中(例如在图1中描绘的实施方案),步骤(c)和步骤(d)中的检测剂是第二种标记的GDF-8调节剂。GDF-8调节剂可以是抗体,包括特异性结合GDF-8的抗体,特异性结合GDF-8结合配偶体的抗体、GDF-8受体、ActRIIB蛋白、含促滤泡素抑制素结构域的蛋白质、促滤泡素抑制素蛋白、GASP蛋白、GDF-8蛋白、GDF-8前肽、非蛋白抑制剂和小分子。在一些实施方案中,检测剂是与在反应容器表面未标记的第一种GDF-8调节剂相同的GDF-8调节剂。在一些优选的实施方案中,GDF-8调节剂是MYO-029。
在某些实施方案中,本发明的方法使能够检测特异性结合生物样品中的促滤泡素抑制素、多种GDF-8受体、activin、GDF-8前肽或其他的GDF-8调节剂的生物样品中的抗体。在其他的实施方案中,本方法使能够在个体生物样品中检测针对施用的GDF-8调节剂的抗体。
在一些实施方案中(例如图2所描述的),在步骤(c)和步骤(d)中的检测剂是用检测剂标记的GDF-8。在一些优选的实施方案中检测剂包含生物素。本发明的方法还包括在生物样品中检测特异性结合促滤泡素抑制素、多种GDF-8受体、activin、GDF-8前肽或其他的GDF-8调节剂的生物样品中抗体的方法。在其他的实施方案中,该方法使检测个体生物样品中施用的治疗性GDF-8调节剂的抗体成为可能。
本发明提供了评估个体对第一种GDF-8抑制剂的免疫应答的方法,该方法包括(a)将第一种GDF-8抑制剂与反应容器表面接触;(b)向反应容器中加入生物样品;(c)反应容器中加入标记的第二种GDF-8抑制剂;和(d)检测标记的与表面结合的第二种GDF-8抑制剂/抗体复合物,其中标记的复合物的发现表明对第一种GDF-8抑制剂的免疫应答。在一些优选的实施方案中,第一种GDF-8抑制剂是MYO-029。在一些优选的实施方案中,第二种GDF-8抑制剂是MYO-029。
此外,提供了评估个体对GDF-8调节剂免疫应答的方法。在一个实施方案中,评估个体对第一种GDF-8调节剂免疫应答的方法包括:(a)使GDF-8抑制剂与反应容器表面相接触;(b)向反应容器中加入生物样品;(c)向反应容器中加入标记的GDF-8蛋白和(d)在测试样品与对照样品中比较与表面相连的标记的GDF-8蛋白量,其中标记复合物水平下降的发现表明对GDF-8抑制剂的免疫应答。在一些优选的实施方案中,第一种GDF-8抑制剂是MYO-029。
报道基因测定
在某些其他的实施方案中,体外测定是报道基因测定(RGA)(参见,例如Thies等人,Growth Factors18:251-259(2001))。在某些实施方案中,RGA包含如下步骤:(a)在反应容器中提供包含报道基因构建体的宿主细胞,其中该构建体包括GDF-8应答控制元件和报道基因;(b)向容器中加入足够量的成熟GDF-8蛋白以激活报道基因表达;(c)向步骤(b)的容器中加入足够量的GDF-8调节剂以调节报道基因的GDF-8激活;(d)向反应容器中加入生物样品;和(e)在生物样品存在和缺失的情况下在细胞中检测报道基因的表达。在一些实施方案中,该方法包括另一个步骤,即加入在报道基因存在下改变颜色、发光或荧光的底物。
宿主细胞可以是来自人、哺乳动物或其他动物的真核细胞。在优选的实施方案中,宿主细胞是细胞系,例如真核细胞系、哺乳动物细胞系或癌细胞系,包括横纹肌肉瘤细胞系。运用一些本领域已知的方法,包括转染、电穿孔等等,可以将报道基因构建体瞬时或稳定的引入宿主细胞。报道基因构建体包括GDF-8应答控制元件,例如启动子和/或增强子序列以及能够与控制元件有效结合的报道基因(例如,能够表达例如酶的检测剂)(参见美国专利公布号2003/0138422和那里描述的参考))。在优选的实施方案中,酶催化底物转化为,例如生色的、荧光的或发光的分子,并且如上所述,可以通过测量底物至可检测的产物的转化评估报道基因表达的量。
例如,为了证明GDF-8的活性,发展了应用表达荧光素酶的报道载体pGL3(CAGA)12的报道基因测定(RGA)。可以通过滴定测定优化加入测定的GDF-8蛋白的量。所选GDF-8蛋白量应该足以产生最大报道构建体激活量的40%、50%、60%、70%、80%、或90%的激活。例如,可以加入0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000ng/mL的GDF-8蛋白。应用恒量的GDF-8蛋白,可以滴定GDF-8调节剂以准备GDF-8活性调节的滴定。例如,可以以选自例如0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000ng/mL的浓度检测GDF-8调节剂(例如MYO-029)。在优选的试验方案中,GDF-8调节剂的滴定应包被测定中抑制的线性范围。为了鉴定抑制GDF-8调节剂的生物活性的抗体,加入反应中的试剂量足够抑制至少例如50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的GDF-8蛋白活性。所选MYO-029的量提供至少对GDF-8蛋白介导的活性的大约50%的抑制,并且在反应中滴定生物样品。任选的,选择抑制GDF-8信号大约80%的MYO-029的量。然后加入单一量或多个量的生物样品,以鉴定例如在报道基因测定中生物样品中的抗体克服GDF-8调节剂效应的能力。在优选的实施方案中,在加入测定之前,将试剂与待测样品预孵育。为了改变加入的生物样品量,使用,例如,约1∶4、1∶5、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45和/或1∶50倍稀释。任选的,可以按上文所述浓缩或分级分离生物样品。
然后例如,使用或不用10ng/mL的GDF-8处理细胞,并且该细胞处理条件为在待测生物样品存在或不存在的情况下,在带有谷氨酰胺、链霉素、青霉素和1mg/mL牛血清清蛋白的McCoy′s5A培养基中于37℃,6小时。在某些实施方案中,应用大约为从10pM到50μM的浓度,进行GDF-8调节剂的平行对照。浓度的举例包括10pM、50pM、100pM、1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、1μM、5μM、10μM和50μM的GDF-8调节剂。在优选的实施方案中,在待测样品中GDF-8调节剂的量与已知量的试剂的对照滴定进行比较,并且藉此进行定量。可以应用众所周知的技术在处理过的细胞中对荧光素酶进行定量。备选的,可以应用应答GDF-8调节剂的报道构建体,任选的包含不同于荧光素酶的检测标记。
尽管本公开指检测能够结合靶标GDF-8调节剂的抗体的优选实施方案,应该认识到,可以应用本发明的方法检测多种靶标物质的抗体。同样的,尽管本发明的公开指检测和/或监控人中的抗球蛋白产生与体内施用诊断或治疗性药品的关系,应该认识到本方法学也可以适用于其他申请中的用途以及物种。
实施例
实施例1:用生物素酰化的MYO-029检测MYO-029抗体的测定
在对GDF-8调节剂,例如MYO-029的免疫应答的特征描述中可以执行三种测定:筛选、滴定和特异性测定。证实阳性结果(例如检测对MYO-029的免疫应答)的方案最初涉及以筛选测定方式检测所有样品。对筛选出的阴性样品产生少于分界点的OD值,报道为阴性,并且不再做进一步的检测。对筛选出的阳性样品,即产生大于或等于分界点的OD值的样品,接下来以滴定和特异性测定检测。
一种抗MYO-029抗体酶联免疫吸附测定(ELISA)是为筛选、滴定和特异性测定发展的特例。该实施方案是为检测中和GDF-8调节抗体MYO-029的抗体而设计的桥联测定。已经对大鼠、猴、小鼠、兔和人血清样品进行了抗MYO-029抗体的ELISA操作。在本测定中,MYO-029吸附到微量滴定板的孔上。生物素酰化的MYO-029与稀释了的血清样品共孵育(以允许任何GDF-8调节剂特异性免疫球蛋白在吸收的MYO-029和生物素酰化的MYO-029之间桥联),并且将其加入该测定。用抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物检测桥联的生物素酰化的MYO-029,当加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)过氧化物酶底物时,该缀合物在平板的孔中产生有色溶液。每孔的OD值直接与结合的生物素酰化的MYO-029的量成比例,并且通过分光光度法确定。
在每个板进行阳性和阴性对照以监测测定执行。将样品的OD值与平板分界点的OD值进行比较来确定是否存在MYO-029的特异性抗体。分界点的OD值定义为阴性对照OD值的平均值的2倍。对于人和兔血清样品,分界点1/OD定义为阴性对照1/OD(分别为正常人或正常兔血清,1∶8稀释)的平均值的1.2倍。以筛选的方式初次检测样品时于1∶8和1∶16稀释样品。用滴定方式重分析任何产生大于或等于分界点的OD值的样品以获得其效价(样品从1∶8倍稀释开始连续进行1∶2的稀释)。抗体的效价定义为产生等于分界点OD值的OD值的样品稀释倍数的倒数。记录该效价的对数值。为了鉴别阳性结果和证实MYO-029抗体的特异性,可以进行特异性测定。ELISA实验中,在没有包被MYO-029的平板上(孔中只加入包被缓冲液),检测在效价方式中的阳性样品。
根据如下的指导方案,证实在效价方式中阳性并且在特异性方式中阴性的样品的抗-MYO-029抗体阳性:1)筛选-阴性的样品报告为阴性并且不再进一步检测;2)筛选-阳性的样品用效价和特异性ELISA继续检测;3)对于效价方式阳性的样品最终的取样结果依赖于特异性的结果;4)尽管特异性阳性样品可能是阳性,依赖于特异性结果的大小,认为特异性阴性的样品为阳性(见以下)。
实施例2:用生物素酰化的MYO-029筛选抗MYO-029抗体的测定
用在本实施例中描述的筛选测定方法初次检测生物样品。在样品分析的前一天,用100μL/孔的包被溶液(0.5μg/mL MYO-029溶于100mM碳酸盐缓冲液中,PH值9.6)包被96孔微量滴定ELISA平板的每个孔(高亲和力,Costar)。用封口膜覆盖平板并且在2-8℃孵育过夜(16-20小时)。接下来的一天,用300μL/孔THST清洗缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0,含有1.0mM甘氨酸,0.5M NaCl和0.05%(体积/体积)吐温20_),用自动平板清洗器清洗平板两次。
然后加入封闭缓冲液(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水+4%(重量/体积)脱脂奶粉;200μL每孔)并且用封口膜覆盖平板,室温孵育1.5-3.0小时。然后用洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤平板四次,第二次洗涤平板后翻转平板。洗涤后的平板可以立即在测定中使用,也可以在2-8℃密封和储存最多四天,其中的第一天定义为封闭日。
室温下融化人类血清样品并彻底地混合。制备1∶25倍稀释于PBST(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水+0.05%(重量/体积)吐温20???)的初始稀释液并且随后1∶3倍稀释于PBST+4%(体积/体积)常规人类血清的稀释液。向平板的孔中转移样品溶液,一式两份(50μL/孔)。向每个平板孔中加入生物素酰化的MYO-029(参见实施例12)(50μL/孔)。(阳性和阴性对照在下面的实施例中进一步描述。)用平板封口膜覆盖平板并且在平板摇床上在室温孵育2小时±10分钟。然后用300μL/孔洗涤缓冲液冲洗平板4次,第二次洗涤后翻转平板。
然后每个平板孔加入以PBST稀释至1∶50000的抗生物素蛋白D-HRP(Vector Laboratories,Burlingame,CA)最终稀释液(100μL/孔)。覆盖平板并且在平板摇床上于室温孵育1小时±10分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤平板6次(300μL/孔),第三次洗涤后倒置平板。
然后在室温,向平板的每个孔中加入辣根过氧化物酶底物TMB(BioFXLaboratories(Randallstown,MD))溶液(100μL/孔)。在暗室中室温孵育平板大约12±1分钟,然后按照与底物加入相同的顺序,向平板每个孔中加入0.18M的硫酸(100μL/孔)中止反应。
在波长为450纳米处比较样品的OD值与平板的分界点OD值以确定是否存在MYO-029的特异性抗体。分界点OD值定义为阴性对照平均值的1.5倍,阴性对照是以1∶25稀释的正常人血清。用Molecular DevicesSpectra Ma×250平板读数器测量在中止反应后30分钟之内于450纳米的光吸收。
对于本测定,阴性对照的平均值小于0.150。应用实施例7中的反应式以平板分界点OD值(分界点定义为阴性对照OD值的平均值的1.5倍)为基础确定阳性对照的平均效价。
筛选-阴性的样品产生小于分界点的OD值,报道为阴性,它的效价小于1.40,并且不再做进一步的检测。筛选-阳性的样品,样品产生大于或等于分界点的OD值,接下来用滴定和特异性测定检测。
实施例3:对照
阴性对照
常规考虑因素-使用汇集的正常人血清(例如,来自BioreclamationInc.(Hicksville,NY))作为阴性对照。在实验的当天通过使用PBST以1∶25稀释室温血清制备阴性对照溶液。
批内测定差异(Intra-assay Variability)-通过分析每个平板上16个重复的孔,确定OD值和阴性对照溶液的分界点值的批内测定差异(CV)。对三天的检测进行评估。为了产生批内分析的精确的结果,独立的分析每个平板获得的数据。从第1、2和3天获得的分界点值的平均值分别是0.087、0.077、和0.072。其相应的CV值分别是18.7%、6.4%和3.7%。阴性对照OD值的CV值(每平板16个重复)范围在2.2%和13.3%之间。
批间测定差异(Inter-assay Variability)-确定OD值和阴性对照溶液的分界点值的批间测定差异(CV)。发现平均分界点OD值和相应的CV值分别是0.089和25.0%。发现阴性对照的平均OD值和相应的CV值分别是0.060和25.0%。在每个平板上阴性对照的16个OD值重复的CV值范围在2.2%和13.3%之间。
阳性对照
常规考虑因素-将亲和纯化的山羊抗人IgG抗体(KPL,Gaithesburg,MD)用作MYO-029桥联ELISA测定的阳性对照。在实验当天通过在0.5mL纯净水和0.5mL甘油的混合物中再水合1mg山羊抗人IgG制备阳性对照贮存液。稀释贮存液为500ng/mL于PBS+0.1%BSA中或500ng/mL于PBS+0.1%BSA中。
稀释线性-对阳性对照溶液进行稀释线性检测。用最初的1∶25、1∶75、1∶225、1∶675和1∶2025的阳性对照起始稀释液制备5种检测溶液。结果证明在所有对5个阳性对照可以测算出的效价值之间的CV值是1.6%。本测试中没有检测到非线性的趋势。
批内测定差异-确定阳性对照溶液的OD值和效价值的批内测定差异。在同一平板上多次检测阳性对照(批内测定),每个平板包含5个独立的阳性对照滴定。执行本测试,第一天总共用4块平板,第二天总共用2块平板,第三天总共用4块平板。在不同的3天评估批内测定差异。独立分析每个平板获得的数据以产生批内测定精确的结果。
应用每天对所有平板检测获得的数据确定阳性对照的最大OD值和效价值的平板间差异。获得的对数效价的批内测定(平板内)CV值不超过2.2%。对所有检测的平板应用独立阳性对照对数效价,在第1、2和3天获得CV值分别是12.4%、1.7%和1.5%。通过阳性对照在所有检测的平板产生的最大OD值而获得的CV值在第1、2和3天分别是18.9%、2.8%和3.2%。
在批内测定评估的第三天对4个平板阳性对照的每种稀释分析其OD值的平均SD值和CV值。该CV值范围2.8%和4.7%之间,完成阳性对照滴定的滴定谱。没有前带效应的迹象。
批间测定差异-为确定阳性对照OD值和滴度值的随机的批间测定差异,在20个平板上分析对照溶液6天。对于每个平板,在最终的数据分析过程中,应用一系列的阳性对照重复(在每个平板的相同位置)。对于阳性对照溶液,平均对数效价和对数效价的CV值分别是3.37和6.6%,平均最大OD值和最大OD值的CV值分别是2.137和11.9%。
制剂-在含有0.1%BSA的去离子水中制备阳性对照工作贮存溶液(500ng/mL)用于评估。应用以去离子水+0.1%BSA制备的工作贮存液进行所有的确认。由于PBS是理想的稀释液,随后相继以含0.1%BSA的PBS制备阳性对照工作贮存溶液。通过分析在相同平板上进行的两种不同的贮存溶液制备的阳性对照,执行对两种溶液的对数效价和最大OD值的比较。未观察到阳性对照在对数效价有显著差异(数据未显示)。最大OD值和效价值的差异可以认为在测定的差异之内。以PBS+0.1%BSA制备工作贮存溶液并在-70℃贮存长达一年。
实施例4:在未暴露群体中的反应性
应用实施例1的操作,3天检测25个个体的正常血清样品3次(n=75个结果)以分析OD值的统计学分布和以基于统计学的分析确定分界点值。
3天中被分析的25个样品的样品OD值的平均值是0.058,这与在相同平板中分析的阴性对照的平均OD值相同。这表明阴性对照的表现能够代表正常个体样品的表现,并且可以用来标准化平板之间的OD值分界点。因此通过将平板的阴性对照平均OD值乘以倍增因子n(其基于对25个正常样品的估计的第95百分点衍生而来)可以计算个体平板的分界点。
通过分析产生的OD值的集合和确定包括95%的这些值的足够高的OD值,获得该95%百分点的非参数估计(0.081)。样品平均值的95%百分点与阴性对照OD值的比值是1.39。由于这一评估是在短时间内(连续的三天)应用有限的被测样品组进行,对于从多个位置收集并且经历了较长时间的临床研究样品的特性中差异可期望更大。考虑到研究样品预期较高的差异,并且出于方便考虑,将用于平板分界点值计算的倍增因子n从1.39到1.5上舍入。
实施例5:灵敏度测定
亲和纯化的山羊抗人IgG被用于制备阳性对照溶液,因此以初始阳性对照试剂的浓度及其效价值为依据计算其测定灵敏度。在本测定中,阳性对照试剂的起始浓度是500ng/mL。在进行上述评估中获得的,以PBS+0.1%BSA制备的阳性对照溶液的平均效价值是4680。应用如下的方程式确定该测定的灵敏度为107pg/mL(500ng/mL/4680):
灵敏度=阳性对照溶液的起始浓度/阳性对照效价值
实施例6:药物干扰的检测
使用多个量的MYO-029掺入阳性对照溶液以产生0.01、0.1、1.0和10μg/mL的药物终浓度,之后以PBST连续3倍的稀释(1∶75、1∶225、1∶675、1∶2025、1∶6075、1∶18225和1∶54675)。在表2中显示了效价和最大OD值。
表2
测定条件 | 对数效价 | 对数效价%差异 | 最大OD值 | 最大OD值%差异 |
没有掺入掺入0.01μg/mL MYO-029掺入0.1μg/mL MYO-029掺入1.0μg/mL MYO-029掺入10μg/mL MYO-029 | 3.122.832.16<1.40<1.40 | -9.3-30.8NANA | 2.4601.1940.1890.0790.061 | -51.5-92.3-96.8-97.5 |
结果显示,在样品中0.1μg/mL和更高浓度的MYO-029显著影响阳性对照的表现。MYO-029浓度为0.01μg/mL时,观察到最大OD值的下降。由于抗体应答的异质性,样品中发现的MYO-029的干扰可能与阳性对照检测的干扰不同。
实施例7:滴度测定
最初在1∶25和1∶75倍稀释液中用筛选方法检测样品。应用滴定和特异性测定重分析任何产生大于或等于分界点OD值的样品(如果产生大于或等于分界点OD值的样品是给药后样品,与相应的给药前样品一起进行)。可以同时或顺序的执行样品的效价和特异性测定。为了获得抗体的效价,首先用PBST+4%人类血清1∶25倍稀释样品,然后用PBST+4%人类血清从1∶25开始连续的进行1∶3倍稀释直至获得1∶54675倍稀释。每个样品进行一式两份测定。基本如实施例2中所述执行本测定。
将产生OD值等于分界点的样品稀释倍数的倒数定义为已知样品的效价。应用下边的方程式1,用内插法测算数字的效价值,其中ODcp是分界点OD值,OD1是在稀释系列中分界点OD值上邻的样品OD值,OD2是在稀释系列中分界点OD值下邻的样品OD值,DilnOD1是OD1的样品稀释倍数的倒数,DilnOD2是OD2的样品稀释倍数的倒数。
效价值的对数值报告为最终的结果。
例如,在下面表3中显示大鼠血清样品的分析,ODcp=0.252、DilnOD1=675和Diln OD2=2025,并且未知样品的对数效价是3.29。应用Watson LIMS系统分析原始数据。
表三
阳性对照(PC) | 均值PC | 阴性对照(NC) | 均值NC | 未知样品 | 未知样品均值 | |||
2.974 | 2.882 | 2.928 | 0.121 | 0.122 | 0.126 | 1.684 | 1.678 | 1.681 |
1.402 | 1.400 | 1.401 | 0.129 | 0.129 | 1.665 | 1.678 | 1.672 | |
0.610 | 0.676 | 0.643 | 0.129 | 0.132 | 1.150 | 1.149 | 1.150 | |
0.330 | 0.334 | 0.332 | 0.120 | 0.130 | 0.440 | 0.506 | 0.473 | |
0.209 | 0.197 | 0.203 | 0.116 | 0.128 | 0.258 | 0.216 | 0.237 | |
0.164 | 0.197 | 0.181 | 0.125 | 0.119 | 0.187 | 0.148 | 0.168 | |
0.151 | 0.146 | 0.148 | 0.126 | 0.120 | 0.144 | 0.121 | 0.132 | |
0.140 | 0.153 | 0.147 | 0.131 | 0.141 | 0.139 | 0.133 | 0.136 |
实施例8:特异性测定
最初在1∶25和1∶75倍稀释液中用筛选方法检测样品。检测阳性的样品。为了证实MYO-029抗体的特异性,在没有用MYO-029包被的平板上(只向孔中加入包被缓冲液)检测筛选方法或滴定方法中阳性的样品。
用PBST+4%人类血清从1∶25开始连续的进行1∶3倍稀释最终获得1∶54675倍稀释液。重复测定每个样品。如实施例1中所述执行本测定方法。在样品分析的前一天,用100μL/孔的包被溶液(100mM碳酸氢盐缓冲液中,PH值9.6)包被96孔微量滴定ELISA平板的每个孔(Costar)。用封口膜覆盖平板并且在2-8℃孵育过夜(16-20小时)。一天后,以300μL/孔THST洗涤缓冲液用自动平板洗涤器洗涤平板两次。
然后加入封闭缓冲液(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水+4%(重量/体积)脱脂奶粉;200μL每孔)并且用封口膜覆盖平板,室温孵育1.5-3.0小时。然后用洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤平板四次,第二次洗涤平板后翻转平板。洗涤后的平板可以立即在测定中使用,也可以在2-8℃密封并且储存最多四天,其中的第一天定义为封闭日。
在室温下融化样品并彻底地混合。制备用PBST(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水+0.05%(重量/体积)吐温20_)以1∶25稀释的初始稀释液并且随后用PBST+4%(体积/体积)以1∶3倍稀释的正常人血清的稀释液。向每个平板孔中加入生物素酰化的MYO-029(50μL/孔),一式两份。(阳性和阴性对照在下面的实施例中进一步描述。)将样品溶液(50μL/孔)转移到平板的孔中,一式两份。用平板封口膜覆盖平板并在平板摇床于室温孵育2小时±10分钟。然后用300μL/孔洗涤缓冲液冲洗平板4次,第二次洗涤后翻转平板。
然后向每个平板孔中加入抗生物素蛋白D-HRP(VectorLaboratories,Burlingame,CA)溶液(100μL/孔)。盖上平板并且在平板摇床于室温孵育1小时±10分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤平板6次(300μL/孔),第三次洗涤后倒置平板。
然后在室温,向平板的每个孔(100μL/孔)中加入辣根过氧化物酶底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB底物;BioFX Laboratories(Randallstown,MD))溶液。在暗室中室温孵育平板大约12±1分钟之后,按照与加入底物相同的顺序,向平板每个孔中加入0.18M的硫酸(100μL/孔)以中止反应。比较样品的OD值与平板分界点OD值以确定是否来自滴定测定的信号检测到了MYO-029的特异性抗体。分界点OD值定义为阴性对照平均值的1.5倍。中止反应后,测量30分钟内的450纳米光吸收。
滴定-阳性样品的最终样品结果依赖特异性结果(例如,特异性阴性的样品视为阳性)。在滴定方法中为阳性和特异性方法中为阴性的样品被确认为抗-MYO-029抗体阳性。特异性阳性的样品可以视为或不视为阳性,其依赖特异性结果的量值。
实施例9:样品评估
基于以下表格,评估效价和特异性测定的结果。在重复效价测定产生的结果与最初的结果不一致的情况下,默认最初的结果。
表四:样品评估
筛选结果(对数效价) | 滴定结果(对数效价) | 重复测定滴定结果(对数效价) | 相应的平板特异性结果(对数效价) | 报告的结果(对数效价) |
<1.40 | NA | NA | NA | 阴性(<1.40) |
≥1.40且≤1.88 | <1.40 | NA | NA | 阴性(<1.40) |
≥1.40且<0.48超过ScR | NA | <1.40 | 阳性(TR) | |
≥1.40且TR≥0.48超过SR | 阳性(TR) | |||
≥1.40且TR<0.48超过SR | 阴性(<1.40) | |||
≥1.40且≥0.48超过ScR.重复滴度测定 | <1.40 | <1.40 | 阳性(TR) | |
≥1.40且TR≥0.48超过SR | 阳性(TR) | |||
≥1.40且TR<0.48超过SR | 阴性(<1.40) | |||
≥1.40 | <1.40 | 阳性(RTR) | ||
≥1.40且RTR≥0.48超过SR | 阳性(RTR) | |||
≥1.40且RTR<0.48超过SR | 阴性(<1.40) | |||
>1.88 | <1.40重复滴度测定 | <1.40 | NA | 阴性(<1.40) |
≥1.40 | <1.40 | 阳性(RTR) | ||
≥1.40且RTR≥0.48超过SR | 阳性(RTR) | |||
≥1.40且RTR<0.48超过SR | 阴性(<1.40) | |||
≥1.40 | NA | <1.40 | 阳性(TR) | |
≥1.40且TR≥0.48超过SR | 阳性(TR) | |||
≥1.40且TR<0.48超过SR | 阴性(<1.40) | |||
NA=不适用,ScR=筛选结果,TR=滴定结果,RTR=重复测定滴定结果,SR=特异性测定结果。 |
依据给药前和给药后样品结果的比较,确定是否在受试者出现抗MYO-029的抗体。如果给药前取样是阴性,并且相应的给药后取样是阳性,认为受试者是免疫应答阳性。如果给药前给药后样品测试均为阳性,当给药后样品效价值比确定的相应的给药前样品的效价值高至少一个稀释因子(3倍)时,称受试者为免疫应答阳性。
实施例10:用生物素酰化的GDF-8检测抗MYO-029的抗体
为了检测抑制生物素酰化的GDF-8与MYO-029的结合的抗体,在样品分析的前一天,用每孔100μL包被溶液(6μg/mLMYO-029溶于100mM碳酸氢盐溶液,pH9.6)包被96孔微定量ELISA平板(Costar)的每个孔。备选的,可以应用0.5μg/mL的MYO-029。用封口膜覆盖平板并在2-8℃孵育过夜(16-22小时)。接下来的一天,用自动平板洗涤器以300μL/孔洗涤缓冲液,洗涤平板两次。
然后加入封闭缓冲液(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水+1%(重量/体积)牛血清清蛋白;250μL/孔)并且用封口膜覆盖平板,室温孵育1.5-3.0小时。然后用300μL/孔THST(50mM Tris-HCl,pH8.0,含有1.0mM甘氨酸、0.5M NaCl和0.05%(体积/体积)吐温20_)洗涤缓冲液洗涤平板四次,第二次洗涤平板后,翻转平板。洗涤后的平板或者可以在测定中立即使用或在2-8℃密封并且储存直至四天,其中的第一天定义为封闭日。
于室温融化样品并彻底混合。在THST中以1∶8初始稀释并且接着进行一次在THST中的1∶2稀释。将样品溶液(100μL/孔)转移至平板中,一式两份。备选的,对原始样品在PBST(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水+0.05%(重量/体积)吐温20_)中进行1∶25倍稀释后,接下来进行1∶3稀释,转移50μL/孔。
在THST中融化并且以1∶8稀释阳性对照贮存溶液(兔抗-MYO-029抗血清,按1∶6.25稀释掺入正常人血清)。随后,在含有12.5%汇集的正常人血清的THST中接下来进行连续的2倍稀释,产生了1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024的阳性对照稀释液系列。向平板孔中转移阳性对照溶液(100μl/孔),一式两份。用平板封口膜覆盖平板,在平板摇床上于室温孵育2小时±10分钟。然后用300μL/孔THST洗涤缓冲液洗涤平板4次,第二次洗涤后倒置平板。
然后向每个平板孔中加入生物素酰化的GDF-8(见实施例12)(35ng/mL溶液100μL/孔)。用平板封口膜覆盖平板并且在平板摇床于室温孵育1.5小时±10分钟。然后用300μL/孔洗涤缓冲液冲洗平板4次,第二次洗涤后倒置平板。
然后向每个平板孔中加入抗生物素蛋白-HRP(Pierce,Rockford,IL)溶液(100μL/孔)。备选的,可以应用抗生物素蛋白D-HRP(VectorLaboratories,Burlingame,CA)。盖上平板并且在平板摇床于室温孵育40分钟或1小时。用洗涤缓冲液(300μL/孔)洗涤平板4次,第二次洗涤后倒转平板。
然后在室温,向平板的每个孔中加入辣根过氧化物酶底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB底物;BioFX Laboratories,Randallstown,MD)溶液(100μL/孔)。在暗室中室温孵育平板大约10分钟之后,按照与底物加入相同的顺序,向平板每个孔中加入0.18M的硫酸(100μL/孔)中止反应。在反应终止30分钟之内,用分光光度计在450纳米对光密度进行读数,并且将OD值转换为OD值的倒数用于分析。
实施例11:效价的确定和数据分析
在上面的筛选测定中检测为阳性的样品(实施例10),通过在THST中以1∶2稀释测试样品,接下来在含有12.5%汇集的正常人血清的THST中连续进行7次1∶8的系列稀释,产生1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512和1∶1024的最终稀释液,以确定效价。将产生的1/OD等于分界点的样品的稀释倍数的倒数定义为已知样品的效价。测定法的分界点定义为阴性对照1/OD值的平均值的1.2倍;并且是基于来自正常人个体的血清样品组中观察到的1/OD值的第95个百分点。应用下边的方程式,用内插法测算效价值,其中ODcp是分界点OD值,OD1是在稀释系列中分界点OD值上邻的样品OD值,OD2是在稀释系列中分界点OD值下邻的样品OD值,DilnOD1是OD1的样品稀释倍数的倒数,DilnOD2是OD2的样品稀释倍数的倒数。
应用以下表格评估效价和特异性测定结果。在重复的效价测定产生与最初结果不一致的结果的情况下,默认最初的结果。
表五
筛选结果(对数效价) | 滴定结果(对数效价) | 重复滴定结果(对数效价) | 相应的平板特异性结果(对数效价) | 报道的结果(对数效价) |
<0.903 | NA | NA | NA | 阴性(<0.903) |
≥0.903且≤1.50 | <0.903 | NA | NA | 阴性(<0.903) |
≥0.903且<0.60超过ScR | NA | <0.903 | 阳性(TR) | |
≥0.903且TR≥0.60超过SR | 阳性(TR) | |||
≥0.903且TR<0.60超过SR | 阴性(<0.903) | |||
≥0.903且≥0.60超过ScR.Repeattiter assay. | <0.903 | <0.903 | 阳性(TR) | |
≥0.903且TR≥0.60超过SR | 阳性(TR) | |||
≥0.903且TR<0.60超过SR | 阴性(<0.903) | |||
≥0.903 | <0.903 | 阳性(RTR) | ||
≥1.50且RTR≥0.60超过SR | 阳性(RTR) | |||
≥1.50且RTR<0.60超过SR | 阴性(<0.903) | |||
>1.50 | <0.903Repeattiter assay. | <0.903 | NA | 阴性(<0.903) |
≥0.903 | <1.40 | 阳性(RTR) | ||
≥0.903且RTR≥0.60超过SR | 阳性(RTR) | |||
≥0.903且RTR<0.60超过SR | 阴性(<0.903) | |||
≥0.903 | NA | <0.903 | 阳性(TR) | |
≥0.903且TR≥0.60超过SR | 阳性(TR) | |||
≥0.903且TR<0.60超过SR | 阴性(<0.903) | |||
NA=不适用,ScR=筛选结果,TR=滴定结果,RTR=重复滴定测定结果,SR=特异性分析结果。 |
实施例12:生物素酰化
用如下方法生物素酰化GDF-8。在补料分配CHO细胞培养生物反应器处理中,表达全长的GDF-8,提供GDF-8潜在的复合物形式。应用正常流量的微孔过滤对收获的细胞培养进行净化,然后应用切向流超滤进行浓缩和渗滤。然后将存留的混合物上样到捕获GDF-8复合物的Ni2+-NTA固定化金属亲和层析(IMAC)上。用50mM Na2HPO4、300mM NaCl、20-500mM咪唑进行超过5个柱容的线性梯度洗脱。然后结果峰进行缓冲液交换,通过透析除去来自IMAC的咪唑,并且用生物素酰化反应的适当缓冲液取而代之。
然后生物素酰化潜在的复合物制剂。在该反应中应用的靶标硫代-NHS-LC-生物素和GDF-8复合物的分子摩尔比例为14∶1。例如,还检测了试剂与底物的比例为10∶1、15∶1和20∶1。在加入GDF-8复合物样品之前,在二甲基亚砜(DMSO)中溶解固态生物素试剂(EZ-连接硫代-NHS-生物素,Pierce Biotechnology)至200g/L。在100mM Na2HPO4、150mMNaCl、pH7.2中,以低于1.5g/L的GDF-8复合物浓度于4℃实施本反应120分钟。在反应的开始轻轻混合反应混合物并且在反应的过程中避光。通过加入0.5%(体积/体积)乙醇胺或5.0%(体积/体积)1M的Tris终止该反应。
然后经过透析至低PH值、高离液剂浓度缓冲液(6000mM尿素、300mM NaCl、50mM H3PO4,pH=2.5),对该生物素酰化的GDF-8复合物进行缓冲液交换。在低PH值中发生质子化作用使复合物解离。在该缓冲液中,复合物解离和溶解为前肽和成熟的二聚体。在透析中也除去了游离的生物素。然后将该存留的混合物上样到高性能的大小排阻层析上,其中从前肽和残留单体中分离出成熟的GDF-8二聚体形式。
这一级分包含生物素酰化的成熟的GDF-8二聚体形式,随后在丁基高效反相层析对其进一步处理,应用0-90%(体积/体积)CH3CN、0.1%(体积/体积)CF3CO2H,pH=2.0的溶液进行5个柱容以上的线性梯度洗脱。来自本步骤的峰通过透析为低PH值制剂缓冲液(0.1%(体积/体积)CF3CO2H,pH=2.0)交换缓冲液。
对生物素酰化的成熟的GDF-8二聚体保留的功能,例如其结合和在报道基因测定中的活性进行评估。通过反相高效液像层析/电喷射离子化四极飞行时间质谱(RP-HPLC/ESI-QTOF-MS)测量生物素酰化的成熟GDF-8蛋白,并且该制剂包含摩尔比值大约为0-3的混合物,多数分子的摩尔比值为1∶1。通过调整本领域众所周知的条件,更高的靶标摩尔比值产生高达9∶1的测量结果。
运用相同的测定生物素酰化MYO-029,并且MYO-029可以用于此处描述的方法中。必要时,稀释、缓冲液交换然后生物素酰化分离的MYO-029。除了几个参数,其反应和贮存条件与GDF-8相同。MYO-029的浓度值范围在10-24g/L之间。在生物素酰化反应中靶标硫代-NHS-LC-生物素与MYO-029的摩尔比值是40∶1,其产生的测量摩尔比值为8-11。用抗生物素蛋白:HABA A600纳米分光光度测定(ImmunoPure抗生物素蛋白和HABA,Pierce)进行测量。然后应用透析,将该试剂交换缓冲液为低盐、中性PH值制剂缓冲液(137mM NaCI、1mM KCI、8mM Na2HPO4、3mM KH2PO4、pH=7.2)。
实施例13:报道基因测定
在以细胞为基础的测定GDF-8生物活性的报道基因测定(RGA)中,检???测特异性结合GDF-8调节剂的抗体。通过如下测定检测抑制GDF-8调节剂的活性的抗体,例如中和MYO-029活性的抗体。
应用了人横纹肌肉瘤细胞系A204pCAGA,其中应用众所周知的技术用报道基因构建体pGL3(CAGA)12(描述于美国专利公布号2003/0138422A1和2004/0142382A1)稳定转染A204(ATCC HTB-82)。或者,可以应用FuGENE.TM.6转染试剂(Boehringer Manheim,德国)用pGL3(CAGA)12瞬时转染A204细胞。转染后于补充了2mM谷氨酰胺、100U/mL链霉素、100μg/mL青霉素和10%胎牛血清的McCoy′s5A培养基中,在96孔板培养细胞16小时。使用或不用在含有谷氨酰胺、链霉素、青霉素和10%胎牛血清的McCoy′s5A培养基中的恒量(75ng/mL)的成熟GDF-8蛋白、恒量(400ng/mL)的MYO-029、以及阳性对照的稀释系列于37℃处理细胞6小时用于对照。任选的,选择提供大约80%的最大荧光素酶信号的GDF-8的量。MYO-029从6.25ng/mL浓缩到400ng/mL(5.9nM到375nM),与GDF-8一起在室温预孵育1小时。然后在RGA中加入蛋白质。阳性对照GDF-8调节剂的抗体与MYO-029一起孵育,并在RGA中进行测定。任选的,选择抑制大约80%GDF-8信号的MYO-029的量。应用萤光素酶测定系统(Promega)对处理过的细胞进行萤光素酶定量。在本测定中75
ng/mL的GDF-8产生80%的激活,而400ng/mL的MYO-029提供报道基因构建体80%的抑制。
在平行反应中,用和不用75ng/mL的成熟GDF-8蛋白、MYO-029(或其他GDF-8调节剂)、以及待测生物样品处理细胞。从经历MYO-029治疗的个体获得人血清并且在缓冲液中以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶40稀释人类血清。对于低于1∶10的稀释液,在含有10%人血清(Bioreclamation,Inc.)的缓冲液中进一步稀释待测样品血清。
以已公布的GDF-8应答报道基因测定(美国专利公布号2003/0138422A1)为依据,执行基于有功能的细胞的测定如下:在本测定中,在存在或缺失人血清样品的情况下,用400ng/mL的MYO-029(375nM)与75
ng/mL的GDF-8预孵育,并且将其加入用PGL3(pCAGA)12细胞转移的A204细胞。以1∶20稀释人血清样品,并且与包含例如以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200和1∶6400稀释的兔抗MYO-029多克隆血清的阳性对照进行比较。本测定既可以将人血清样品或阳性对照兔抗体与MYO-029接着是GDF-8混合在一起,并且直接加入在RGA中的细胞;或者将人血清样品或阳性对照兔抗体与MYO-029预孵育一小时后加入在RGA中的细胞,然后向样品孔中加入GDF-8。
MYO-029中和抗体的阳性对照开发如下。用完整的MYO-029或包含MYO-029结合位点的MYO-029蛋白片段免疫兔。为了避免在兔中产生对该人抗体恒定区的强免疫应答,进行消化除去MYO-029抗体的Fc部分。用完整的或消化过的MYO-029免疫两只兔。应用配体结合测定检测血样的中和活性。所有四只动物均产生了优良的抗体效价结果,并且用四只动物的混合血样制备的对照兔血清。
在本公开中所有引用的出版物、专利和生物序列以其整体引入作为参考。对于引入作为参考的材料与本说明书矛盾或不一致的内容,本说明书将代替任何此类材料。此处任何参考的引用并非承认此类参考是本发明的现有技术。
除非另作说明,在所有情况下,在说明书,包括权利要求书中应用的成分、细胞培养物、处理条件等等的所有数字表达量将理解为用术语“大约”修饰。也就是除非另作说明,数字参数是近似值,并且可能根据想要的从本发明获得的特性而改变。除非另作说明,在一系列元素前面的术语“至少”被理解为指在该系列中的每个元素。本领域的技术人员将理解或仅仅应用常规的实验方法能够确定可产生与此处描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案包括在以下的权利要求中。
中的实施方案提供了本发明实施方案的举例说明,并不能理解为对本发明范围的限制。熟练的技术人员容易理解,本发明包括了许多其他的实施方案。对于本领域的技术人员而言,通过对此处公开的本发明的说明书和操作的考虑,本发明的其他实施方案是显而易见的。将说明书和实施例仅应被看作是由以下权利要求指明的具有本发明的真正的范围和精华的例证。
序列表
<110>惠氏公司
<120>对GDF-8调节剂的免疫应答的检测
<130>08702.0159-00304
<150>60/664,643
<151>2005-03-23
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
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<213>人
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<210>20
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<400>20
Claims (66)
1.检测生物样品中特异性结合GDF-8调节剂的抗体的方法,包括:
(a)向GDF-8活性体外测定的反应容器中加入GDF-8调节剂;
(b)向GDF-8活性体外测定的反应容器中加入生物样品;
(c)检测生物样品对GDF-8活性的调节;和
(d)将存在生物样品时GDF-8活性的改变与仅存在GDF-8调节剂时GDF-8活性的改变进行比较。
2.权利要求1的方法,其中体外测定是免疫测定,包括:
(a)使GDF-8调节剂与反应容器的表面接触;
(b)随后向反应容器加入生物样品;
(c)向反应容器加入检测剂;和
(d)检测与表面缔合的GDF-8调节剂/抗体复合物。
3.权利要求2的方法,其中检测剂是带有可检测标签的GDF-8调节剂。
4.权利要求2的方法,其中检测剂是标记的GDF-8蛋白。
5.权利要求4的方法,其中标签是生物素。
6.权利要求5的方法,其中掺入的生物素的摩尔量与试剂的摩尔量的比率小于5∶1。
7.权利要求5的方法,其中生物素与试剂的比率在大约0.5∶1到4∶1之间。
8.检测生物样品中特异性结合GDF-8调节剂的抗体的方法,包括:
(a)使GDF-8调节剂与反应容器的表面接触;
(b)向反应容器加入生物样品;
(c)向反应容器加入检测剂;和
(d)检测与反应容器表面缔合的GDF-8调节剂/抗体复合物。
9.权利要求8的方法,其中检测剂是带有可检测标签的步骤(a)的GDF-8调节剂。
10.权利要求8的方法,其中检测剂是标记的GDF-8蛋白。
11.权利要求10的方法,其中通过比较在测试样品中和在对照样品中的GDF-8调节剂/标记的GDF-8蛋白复合物的水平检测GDF-8调节剂/抗体复合物。
12.权利要求8的方法,其中GDF-8调节剂是GDF-8抑制剂。
13.权利要求12的方法,其中GDF-8抑制剂是抗体。
14.权利要求13的方法,其中抗体特异性结合GDF-8。
15.权利要求14的方法,其中抗体是MYO-029。
16.权利要求8的方法,其中GDF-8调节剂选自:
(a)特异性结合GDF-8的抗体;
(b)特异性结合GDF-8结合配偶体的抗体;
(c)可溶性GDF-8受体;
(d)ActRIIB蛋白;
(e)含有促滤泡素抑制素结构域的蛋白质;
(f)促滤泡素抑制素蛋白;
(g)GASP-1蛋白;
(h)GDF-8蛋白;
(i)GDF-8前肽;
(j)非蛋白抑制剂;
(k)核酸;和
(I)小分子。
17.权利要求8的方法,其中生物样品来自哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类。
18.权利要求17的方法,其中生物样品来自哺乳动物。
19.权利要求18的方法,其中哺乳动物是人。
20.权利要求8的方法,其中生物样品选自血清、血液、血浆、活体解剖样品、组织样品、细胞悬液、唾液、口腔液、脑脊液、羊膜液、奶、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、泪液、胃液、滑液和黏液。
21.权利要求20的方法,其中生物样品选自血清、血液和血浆。
22.权利要求10的方法,其中标签选自酶、附加表位、放射标签、生物素、染料、荧光标签和发光标签。
23.权利要求22的方法,其中标签是生物素。
24.权利要求23的方法,其中掺入的生物素的摩尔量与检测剂的摩尔量的比率小于5∶1。
25.权利要求23的方法,其中生物素与试剂的比率在大约0.5∶1到4∶1之间。
26.权利要求23的方法,还包括加入抗生物素蛋白-酶缀合物。
27.权利要求26的方法,还包括加入在酶的存在下改变颜色、发光或荧光的底物。
28.检测生物样品中特异性结合GDF-8抑制剂的抗体的方法,包括:
(a)使第一种GDF-8抑制剂与反应容器的表面接触;
(b)向反应容器加入生物样品;
(c)向反应容器加入标记的第二种GDF-8抑制剂;和
(d)检测与表面缔合的标记的第二种GDF-8抑制剂。
29.权利要求28的方法,其中生物样品来自哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类。
30.权利要求29的方法,其中生物样品来自哺乳动物。
31.权利要求30的方法,其中哺乳动物是人。
32.权利要求28的方法,其中生物样品选自血清、血液、血浆、活体解剖样品、组织样品、细胞悬液、唾液、口腔液、脑脊液、羊膜液、奶、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、泪液、胃液、滑液和黏液。
33.权利要求32的方法,其中生物样品选自血清、血液和血浆。
34.权利要求28的方法,其中第一种GDF-8抑制剂与第二种GDF-8抑制剂相同。
35.权利要求28的方法,其中第一种GDF-8抑制剂是特异性结合GDF-8的抗体。
36.权利要求28的方法,其中第二种GDF-8抑制剂是特异性结合GDF-8的抗体。
37.权利要求28的方法,其中标签选自酶、附加表位、放射标签、生物素、染料、荧光标签和发光标签。
38.权利要求28的方法,其中标签是生物素。
39.权利要求38的方法,还包括加入抗生物素蛋白-酶缀合物。
40.权利要求39的方法,还包括加入在酶的存在下改变颜色、发光或荧光的底物。
41.检测生物样品中特异性结合MYO-029的抗体的方法,包括:
(a)使分离的MYO-029与反应容器的表面接触;
(b)向反应容器加入生物样品;
(c)向反应容器加入标记的MYO-029;和
(d)检测与表面缔合的标记的MYO-029。
42.检测生物样品中特异性结合MYO-029的抗体的方法,包括:
(a)在反应容器中提供包含报道基因构建体的宿主细胞,其中该构建体包含GDF-8应答控制元件和报道基因;
(b)向该容器中加入足量的成熟GDF-8蛋白以激活报道基因的表达;
(c)向步骤(b)的容器加入足量的MYO-029以调节报道基因的GDF-8激活;
(d)向步骤(c)的反应容器加入生物样品;和
(e)在生物样品的存在和缺失情况下检测报道基因表达。
43.权利要求41的方法,其中生物样品来自哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类。
44.权利要求43的方法,其中生物样品来自哺乳动物。
45.权利要求44的方法,其中哺乳动物是人。
46.权利要求41的方法,其中生物样品选自血清、血液、血浆、活体解剖样品、组织样品、细胞悬液、唾液、口腔液、脑脊液、羊膜液、奶、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、泪液、胃液、滑液和黏液。
47.权利要求46的方法,其中生物样品选自血清、血液和血浆。
48.权利要求41的方法,其中标签选自酶、附加表位、放射标签、生物素、染料、荧光标签和发光标签。
49.权利要求48的方法,其中标签是生物素。
50.权利要求49的方法,其中掺入的生物素的摩尔量与试剂的摩尔量的中位数比率至少为5∶1。
51.权利要求49的方法,其中生物素与试剂的中位数比率至少为10∶1。
52.权利要求49的方法,还包括加入抗生物素蛋白-酶缀合物。
53.权利要求52的方法,还包括加入在酶的存在下改变颜色、发光或荧光的底物。
54.检测生物样品中特异性结合MYO-029的抗体的方法,包括:
(a)使分离的MYO-029与反应容器的表面接触;
(b)向反应容器加入生物样品;
(c)向反应容器加入标记的GDF-8;和
(d)在生物样品存在或缺失的情况下检测与表面缔合的标记的GDF-8。
55.权利要求54的方法,其中生物样品来自哺乳动物、鸟类、爬行动物或鱼类。
56.权利要求55的方法,其中生物样品来自哺乳动物。
57.权利要求56的方法,其中哺乳动物是人。
58.权利要求54的方法,其中生物样品选自血清、血液、血浆、活体解剖样品、组织样品、细胞悬液、唾液、口腔液、脑脊液、羊膜液、奶、初乳、乳腺分泌物、淋巴、尿、汗、泪液、胃液、滑液和黏液。
59.权利要求54的方法,其中生物样品选自血清、血液和血浆。
60.权利要求54的方法,其中标签选自酶、附加表位、放射标签、生物素、染料、荧光标签和发光标签。
61.权利要求60的方法,其中标签是生物素。
62.权利要求61的方法,还包括加入抗生物素蛋白-酶缀合物。
63.权利要求62的方法,还包括加入在酶的存在下改变颜色、发光或荧光的底物。
64.评估个体对第一种GDF-8抑制剂的免疫应答的方法,该方法包括:
(a)使第一种GDF-8抑制剂与反应容器表面接触;
(b)向反应容器加入来自个体的生物样品;
(c)向反应容器加入标记的第二种GDF-8抑制剂;和
(d)检测与表面缔合的标记的第二种GDF-8抑制剂/抗体复合物,
其中标记的复合物的发现表明对第一种GDF-8抑制剂的免疫应答。
65.评估个体对第一种GDF-8抑制剂的免疫应答的方法,该方法包括:
(a)使GDF-8抑制剂与反应容器的表面相接触;
(b)向反应容器加入来自个体的生物样品;
(c)向反应容器加入标记的GDF-8蛋白;和
(d)比较在测试样品与对照样品中与表面缔合的标记的GDF-8蛋白的量,
其中标记的复合物水平下降的发现表明对GDF-8抑制剂的免疫应答。
66.评估个体对第一种GDF-8抑制剂的免疫应答的方法,该方法包括:
(a)在反应容器中提供包含报道基因构建体的宿主细胞,其中该构建体包括GDF-8应答控制元件和报道基因;
(b)向容器加入足量的成熟GDF-8蛋白以激活报道基因的表达;
(c)向步骤(b)的容器加入足量的MYO-029以调节报道基因的GDF-8激活;
(d)向步骤(c)的反应容器加入生物样品;和
(e)在生物样品存在和缺失的情况下检测报道基因表达。
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---|---|---|---|---|
WO1990006515A1 (en) * | 1988-12-09 | 1990-06-14 | Centocor, Inc. | Anti-idiotopic immunometric assay |
US5194596A (en) * | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
US5350836A (en) * | 1989-10-12 | 1994-09-27 | Ohio University | Growth hormone antagonists |
US6162896A (en) * | 1991-05-10 | 2000-12-19 | The Salk Institute For Biological Studies | Recombinant vertebrate activin receptors |
EP0690873B1 (en) * | 1993-03-19 | 2003-06-11 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 |
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KR100227406B1 (ko) * | 1993-05-12 | 1999-12-01 | 브루스 엠. 에이센 | Bmp-11 조성물 |
KR100329409B1 (ko) * | 1993-08-26 | 2002-03-20 | 브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저 | 인간 골 형태발생 단백질을 사용한 신경 재생법 |
WO1996001845A1 (en) * | 1994-07-08 | 1996-01-25 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-11 |
US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
AU753701B2 (en) * | 1997-04-21 | 2002-10-24 | Glycozyme, Inc. | Determination of recombinant glycosylated proteins and peptides in biological fluids |
US6696260B1 (en) * | 1997-08-01 | 2004-02-24 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins |
WO1999006559A1 (en) * | 1997-08-01 | 1999-02-11 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors |
US6656475B1 (en) * | 1997-08-01 | 2003-12-02 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same |
US5942420A (en) * | 1997-11-17 | 1999-08-24 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Molecules of the follistatin-related protein family and uses therefor |
US6369201B1 (en) * | 1998-02-19 | 2002-04-09 | Metamorphix International, Inc. | Myostatin multimers |
US6004937A (en) * | 1998-03-09 | 1999-12-21 | Genetics Institute, Inc. | Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11] |
ES2330062T3 (es) * | 1998-05-06 | 2009-12-03 | Metamorphix, Inc. | Procedimientos para tratar la diabetes por inhibicion de gdf-8. |
JP2003517580A (ja) * | 1999-01-21 | 2003-05-27 | メタモーフイクス・インコーポレーテツド | 増殖分化因子インヒビター及びそれらの用途 |
US6284882B1 (en) * | 1999-06-10 | 2001-09-04 | Abbott Laboratories | Myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof |
US6537644B1 (en) * | 1999-08-13 | 2003-03-25 | First Quality Nonwovens, Inc. | Nonwoven with non-symmetrical bonding configuration |
CA2747325A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
TWI329129B (en) * | 2001-02-08 | 2010-08-21 | Wyeth Corp | Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof |
US7320789B2 (en) * | 2001-09-26 | 2008-01-22 | Wyeth | Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof |
KR20040096592A (ko) * | 2002-02-21 | 2004-11-16 | 와이어쓰 | 폴리스타틴 도메인을 포함하는 단백질 |
IL163525A0 (en) * | 2002-02-21 | 2005-12-18 | Wyeth Corp | A follistatin domain containing protein |
AU2003252017A1 (en) * | 2002-07-19 | 2004-02-09 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for modulating agonist-induced downregulation of g protein-coupled receptors |
CA2498044A1 (en) * | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Wyeth | Metalloprotease activation of myostatin, and methods of modulating myostatin activity |
US7261893B2 (en) * | 2002-10-22 | 2007-08-28 | Wyeth | Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor |
US20040223966A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-11-11 | Wolfman Neil M. | ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor |
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Legal Events
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20080305 |