PT1581649E - Agentes de ligação que inibem a miostatina - Google Patents

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PT1581649E
PT1581649E PT03814258T PT03814258T PT1581649E PT 1581649 E PT1581649 E PT 1581649E PT 03814258 T PT03814258 T PT 03814258T PT 03814258 T PT03814258 T PT 03814258T PT 1581649 E PT1581649 E PT 1581649E
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myostatin
seq
gly
peptide
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Hq Han
Thomas Charles Boone
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Description

1
DESCRIÇÃO "AGENTES DE LIGAÇÃO QUE INIBEM A MIOSTATINA"
CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a factores de crescimento e em particular ao factor de crescimento miostatina e agentes que se ligam a miostatina e inibem a sua actividade.
ANTECEDENTES A miostatina, também conhecida como factor de crescimento/diferenciação 8 (GDF-8), é um membro da família do factor de crescimento transformante-B (TGF-β) conhecido por estar envolvido na regulação de massa do músculo esquelético. A maioria dos membros da família TGF-p-GDF é expressa de maneira não específica em muitos tipos de tecido e exerce uma variedade de acções pleitróficas. No entanto, a miostatina é amplamente expressa nas células de tecido de músculo esquelético em desenvolvimento e adulto e desempenha um papel essencial no controlo negativo do crescimento do músculo esquelético (McPherron et al. Nature (Londres) 387, 83-90 (1997)). Estudos recentes, no entanto, indicam que baixos níveis de expressão de miostatina podem ser medidos nos tecidos cardíaco, adiposo e pré-adiposo. A proteína miostatina tem sido altamente conservada evolutivamente (McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)) . A região C terminal biologicamente activa de miostatina tem 100 por cento de identidade de sequência com as sequências de seres humanos, ratinho, rato, vaca, galinha, e peru. A função da miostatina também parece ser igualmente conservada entre as espécies, isto é evidente a partir dos fenótipos de animais que têm uma mutação no gene da miostatina. Duas raças de gado, a Belgian Blue (Hanset R., Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use for improve Beef Production, eds, King, j.w.G. & Menissier, F. 2 (Nijhoff, The Hague, Países Baixos) pp. 437-449) e a Piedmontese (Masoero, G. & Poujardieu, B, Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use for improve Beef Production., eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, The Hague, Países Baixos) pp. 450-459) são caracterizadas por um fenótipo de "musculatura dupla" e aumento em massa muscular. Estas raças mostraram conter mutações na região codificante do gene da miostatina (McPherron et al. (1997) supra) . Além disso, ratinhos que contêm uma deleção direccionada do gene que codifica a miostatina (Mstn) demonstram um aumento dramático em massa muscular sem um aumento correspondente em gordura. Os músculos individuais de ratinhos Mstn -/- pesam de aproximadamente 100 a 200 por cento mais que aqueles de animais de controlo como um resultado de hipertrofia e hiperplasia da fibra muscular (Zimmers et al. Science 296, 1486 (2002)). A administração de miostatina a certas estirpes de ratinhos tem mostrado que cria uma condição similar a distúrbios de atrofia muscular encontrados associados a cancro, SIDA, e distrofia muscular, por exemplo. A miostatina administrada como células CHO produtoras de miostatina a ratinhos sem pêlo atímicos resultou num efeito de emagrecimento com um alto grau de perda de peso, um diminuição de tanto como 50% de massa do músculo esquelético além de perda de gordura, e hipoglicemia grave (Zimmers et al. supra). A perda de miostatina parece resultar na retenção de massa muscular e redução em acumulação de gordura com envelhecimento. Foi mostrado que aumentos relacionados com a idade em massa de tecido adiposo e diminuição em massa muscular foram proporcionais aos níveis de miostatina, como é determinado por uma comparação de gordura e massa muscular em Mstn +/+ quando comparado com ratinhos adultos knockout Mstn _/~ (McFerron et al. J. Clin. Invest 109, 595 (2002)). Os ratinhos Mstn -/- mostraram acumulação de 3 gordura diminuída com idade em comparação com ratinhos Mstn + /+.
Além disso, a miostatina pode desempenhar um papel na manutenção de níveis de glicose no sangue e pode influenciar o desenvolvimento de diabetes em certos casos. É conhecido que, por exemplo, a resistência do músculo esquelético à captação de glicose estimulada por insulina é a manifestação mais precoce conhecida de diabetes mellitus não dependente de insulina (tipo 2) (Corregan et al. Endocrinology 128:1682 (1991)). Foi mostrado agora que a ausência de miostatina parcialmente atenua os fenótipos obesos e de diabetes de dois modelos de ratinho, o aguti amarelo letal (AY) (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994)), e obeso (Lepob/ob) . A acumulação de gordura e o peso corporal total do ratinho mutante duplo Ay/a, Mstn foi dramaticamente reduzida em comparação com o ratinho Ay/a Mstn +/+ (McFerron et al., (2002) supra). Além disso, os níveis de glicose no sangue nos ratinhos Ay/a, Mstn -/- foi dramaticamente menor que em ratinhos Ay/a Mstn +/+ após carga de glicose exógena, indicando que a ausência de miostatina melhorou o metabolismo da glicose. De maneira similar ratinhos Lepob/ob Mstn -/- mostraram acumulação de gordura diminuída quando comparado com a fenótipo Lepob/ob Mstn +/+.
Portanto, existe uma evidência considerável a partir dos fenótipos de animais com sobre-expressão e knockout que a miostatina pode desempenhar um papel contribuindo para um número de distúrbios metabólicos incluindo distúrbios que resultam em atrofia muscular, diabetes, obesidade e hiperglicemia. A publicação de patente internacional WO 02/09641 divulga péptidos capazes de se ligarem a miostatina que são úteis para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com a miostatina, incluindo diabetes tipo II e obesidade. 4
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção dirige-se aos agentes de ligação que se ligam a miostatina e inibem a sua actividade. Os agentes de ligação compreendem pelo menos um péptido capaz de ligar-se a miostatina. Os péptidos de ligação a miostatina têm entre 10 e 50 aminoácidos de comprimento, preferentemente entre 10 e 30 aminoácidos de comprimento, e mais preferentemente entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento. O péptido de ligação a miostatina utilizado no contexto da presente invenção compreende a sequência de aminoácidos WMCPP (SEQ ID NO: 633). O péptido de ligação a miostatina compreende a sequência Cbib2wb3WMCPP (SEQ ID NO: 353), em que bi é seleccionado de qualquer um dos aminoácidos T, I, ou R; b2 é seleccionado de qualquer um de R, S, Q; b3 é seleccionado de qualquer um de P, R e Q, e em que o péptido da presente invenção tem entre 10 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
Numa forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção compreendem ainda pelo menos um veiculo tal como um polímero ou um domínio Fc, e podem compreender ainda pelo menos uma sequência de linker. Nesta forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção são construídos de modo que pelo menos um péptido de ligação a miostatina é unido a pelo menos um veículo. O péptido ou péptidos são unidos, directamente ou indirectamente através de uma sequência linker, ao veículo no terminal N, terminal C ou numa cadeia lateral de aminoácido do péptido. Nesta forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção têm a seguinte estrutura generalizada: (X1)a-F1-(X2)b, ou multímeros do mesmo; em que F1 é um veículo; e X1 e X2 são cada um independentemente seleccionados de - (L1) c-P1; 5 - (L1) c-P1- (L2) d-P2 ; -(I1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3; e -(L1)C-P1-(L2)d-P2-(L3)e -P3-(L4)f-P4; em que P1, P2, P3, e P4 são péptidos capazes de ligar-se a miostatina; e L1, L2, L3, e L4 são cada um linkers; e a, b, c, d, e, e f são cada um independentemente 0 ou 1, com a condição de que pelo menos um de a e b seja 1, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
Em diversas formas de realização de agentes de ligação que têm esta estrutura generalizada, os péptidos P1, P2, P3, e P4 são independentemente seleccionados de um ou mais de qualquer dos péptidos, e cada compreende as sequências de SEQ ID NO: 353.
Numa forma de realização adicional, os agentes de ligação compreendem péptidos fusionados a um domínio Fc, ou directamente ou indirectamente, deste modo proporcionando pepticorpos. Os pepticorpos da presente invenção exibem uma alta afinidade de ligação para miostatina e podem inibir a actividade de miostatina como demonstrado tanto in vitro utilizando ensaios à base de células como em animais. A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico que compreendem polinucleótidos que codificam os péptidos, pepticorpos, e variantes de péptido e pepticorpo e derivados da presente invenção. A presente invenção proporciona composições farmaceuticamente aceitáveis que compreendem um ou mais agentes de ligação da presente invenção.
Os agentes de ligação da presente invenção inibem a actividade de miostatina in vitro e in vivo. Os agentes de ligação da presente invenção aumentam a massa muscular magra num animal tratado e diminui a massa adiposa como uma percentagem de peso corporal do animal. Os agentes de ligação a miostatina da presente invenção aumentam a força muscular em modelos animais tratados. 6 A presente divulgação proporciona métodos de inibição da actividade de miostatina em animais incluindo seres humanos pela administração de uma dosagem eficaz de um ou mais agentes de ligação ao sujeito. A presente divulgação proporciona métodos de aumento de massa muscular magra em animais incluindo seres humanos pela administração de uma dosagem eficaz de um ou mais agentes de ligação. A presente divulgação proporciona ainda métodos de tratamento de distúrbios relacionados com a miostatina pela administração de uma dosagem terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes de ligação a miostatina numa composição farmaceuticamente aceitável a um indivíduo. A presente divulgação proporciona métodos de tratamento de distúrbios de atrofia muscular incluindo distrofia muscular, atrofia muscular devido a cancro, SIDA, artrite reumatóide, insuficiência renal, uremia, insuficiência cardíaca crónica, sarcopenia relacionada com a idade, repouso em cama prolongado, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, fractura óssea. A presente divulgação também proporciona métodos de tratamento de distúrbios metabólicos incluindo obesidade, diabetes, hiperglicemia, e perda óssea. A presente invenção também proporciona a utilização da invenção para aumentar a massa muscular em animais para alimentação pela administração de uma dosagem eficaz de um ou mais agentes de ligação a miostatina ao animal. A presente invenção proporciona ensaios que utilizam um ou mais agentes de ligação a miostatina para identificar e quantificar miostatina numa amostra. Os ensaios podem ser ensaios de diagnóstico para medir ou monitorizar níveis de miostatina em indivíduos com um distúrbio ou doença relacionado com a miostatina.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 7 A Figura 1 mostra a actividade de miostatina como medida pela actividade de luciferase expressa (eixo y) versus a concentração (eixo x) para o péptido TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (Seq ID No: 32) e o pepticorpo(pb) TN8-19 para determinar a CI50 para cada um utilizando o ensaio de luciferase C2C12 pMARE descrito nos Exemplos a seguir. 0 pepticorpo tem um valor de Ci5o inferior em comparação com o péptido. A Figura 2 é um gráfico mostrando o aumento em peso corporal total para ratinhos CDl nu/nu tratados com dosagens crescentes do pepticorpo lx mTN8-19-21 ao longo de um período de catorze dias em comparação com ratinhos tratados com um controlo de huFc, como é descrito no Exemplo 8. A Figura 3A mostra o aumento na massa da massa muscular do gastrocnémio na necropsia dos ratinhos tratados na Figura 2 (Exemplo 8) . A Figura 3B mostra o aumento em massa magra como determinado por meio de RMN no dia 0 em comparação com o dia 13 da experiência descrita no Exemplo 8. A Figura 4 mostra o aumento em massa corporal magra como para ratinhos CDl nu/nu tratados com injecções bissemanais de dosagens crescentes de pepticorpo lx mTN8-19-32 como determinado por meio de RMN no dia 0 e no dia 13 da experiência descrita no Exemplo 8. A Figura 5A mostra o aumento em peso corporal para ratinhos CDl nu/nu tratados com injecções bissemanais de lx mTN8-19-7 em comparação com 2x mTN8-19-7 e 0 animal de controlo durante 35 dias como é descrito no Exemplo 8. A Figura 5B mostra o aumento em peso de carcaça magra na necropsia para as versões lx e 2x a 1 mg/kg e 3 mg/kg em comparação com os animais que recebem o veículo (huFc) (controlos). A Figura 6A mostra o aumento em massa muscular magra versus peso corporal para ratinhos mdx envelhecidos tratados com pepticorpo lx mTN88-19-33 maturado por afinidade ou veiculo com huFc a 10 mg/kg subcutaneamente em dias alternados durante três meses. A Figura 6B mostra a mudança em massa adiposa em comparação com o peso corporal como determinado por meio de RMN para os mesmos ratinhos após 3 meses de tratamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona agentes de ligação capazes de ligar-se a miostatina e inibir sua actividade. Os agentes de ligação a miostatina podem ser utilizados em ensaios, para identificar, quantificar, ou monitorizar o nivel de miostatina num animal. Os agentes de ligação a miostatina da presente invenção reduzem actividade de miostatina. Os agentes de ligação a miostatina da presente invenção aumentam a massa muscular magra em animais, diminuição massa adiposa como uma percentagem de peso corporal, e aumentam resistência muscular. Os agentes de ligação a miostatina da presente invenção podem ser utilizados para tratar uma variedade de distúrbios metabólicos em que miostatina desempenha um papel, incluindo distúrbios de atrofia muscular tal como distrofias musculares, atrofia muscular devido a cancro, SIDA, artrite reumatóide, insuficiência renal, uremia, insuficiência cardiaca crónica, repouso em cama prolongado, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, e sarcopenia relacionada com a idade bem como outros distúrbios metabólicos incluindo diabetes, obesidade, hiperglicemia, e perda óssea, pela administração de um dosagem terapêutica de um ou mais agentes de ligação numa composição farmaceuticamente aceitável a um sujeito. Miostatina A miostatina, um factor de crescimento também conhecido como GDF-8, é conhecido por ser um regulador negativo de tecido músculo esquelético. A miostatina é 9 sintetizada como uma pré-proproteina inactiva que é activada por meio de clivagem proteolitica (Zimmers et al., supra (2002)). A proteína precursora é clivada para produzir um pró-domínio NH2 terminal inactivo e uma proteína COOH terminal de aproximadamente 109 aminoácidos na forma de um homodímero de aproximadamente 25 kDa, que é a forma activa, matura (zimmers et al, supra (2002)). Acredita-se agora que o dímero maturo circula no sangue como um complexo latente inactivo ligado ao pró-péptido (Zimmers et al, supra (2002).
Como é utilizado no presente documento o termo "miostatina de comprimento completo" refere-se à sequência de pré-proproteina humana de comprimento completo descrita em McPherron et al. supra (1997), bem como polipéptidos de comprimento completo relacionados incluindo variantes alélicas e homólogos inter-espécies que se descrevem também em McPherron et al. (1997). Como é utilizado no presente documento, o termo "pró-domínio" ou "pró-péptido" refere-se à proteína terminal NH2 inactiva que é eliminada por clivagem para libertar a proteína terminal COOH activa. Como é utilizado no presente documento o termo "miostatina" ou "miostatina matura" refere-se ao polipéptido de terminal COOH biologicamente activo maturo, em forma monomérica, dimérica, multimérica ou outra forma. A "miostatina" ou "miostatina matura" também se refere a fragmentos da miostatina matura biologicamente activa, bem como polipéptidos relacionados incluindo variantes alélicas, variantes splice, e péptidos e polipéptidos de fusão. Reportou-se que a proteína de terminal COOH de miostatina matura tem 100% de identidade de sequência entre muitas espécies incluindo ser humano, ratinho, galinha, porcina, peru, e rato (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)). A miostatina pode ou pode não incluir resíduos terminais adicionais tais como sequências de alvejamento, ou resíduos 10 de metionina e lisina e /ou sequências etiqueta ou de proteína de fusão, dependendo de como for preparado.
Como é utilizado no presente documento o termo "capaz de se ligar à miostatina" ou "que tem uma afinidade de ligação para miostatina" refere-se a um agente de ligação ou péptido que se liga a miostatina como é demonstrado por meio do ensaio ELiSA-fago, os ensaios BlAcone® ou KinExA™ descritos nos Exemplos a seguir.
Como é utilizado no presente documento, o termo "capaz de modificar a actividade de miostatina" refere-se à acção de um agente como ou um agonista ou um antagonista em relação a pelo menos uma actividade biológica de miostatina. Como é utilizado no presente documento, "agonista" ou actividade "mimética" refere-se a um agente que tem actividade biológica comparável a uma proteína que interage com a proteína de interesse, como é descrito, por exemplo, no pedido internacional WO 01/83525, depositado em 2 de Maio de 2001.
Como é utilizado no presente documento, o termo "inibir a actividade de miostatina" ou "que tem actividade antagonista" refere-se à capacidade de um péptido ou agente de ligação de reduzir ou bloquear a actividade de miostatina ou sinalização como é demonstrado ou ensaios in vitro tais como, por exemplo, ensaio de actividade de miostatina à base de células C2C12 PARE ou por meio dr testes em animais in vivo como é descrito a seguir.
Estrutura de Agentes de Ligação a Miostatina
Numa forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção compreendem pelo menos um péptido de ligação a miostatina covalentemente unido a pelo menos um veículo tal como um polímero ou um domínio Fc. A união dos péptidos de ligação a miostatina a pelo menos um veículo é destinada a aumentar a efectividade do agente de ligação como um agente terapêutico por meio do aumento da 11 actividade biológica do agente e/ou da diminuição da degradação in vivo, do aumento da semivida in vivo, da redução da toxicidade ou imunogenicidade in vivo. Os agentes de ligação da presente invenção podem compreender ainda uma sequência linker que liga o péptido e o veiculo. 0 péptido ou péptidos são unidos directamente ou indirectamente através de uma sequência linker ao veiculo no terminal N, terminal C ou numa cadeia lateral de aminoácido do péptido. Nesta forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção têm a seguinte estrutura: (X1)a-F1-(X2)b, ou multimeros do mesmo; em que F1 é um veiculo; e X1 e X2 são cada um independentemente seleccionados de ~ (L1) c-P1; _ (L1) c-P1- (L2) d-P2; -(L^c-PML^d-PML^c-P3; e -(L1)c-P1- (L2)d-P2-(L3)c -P3-(L4)f-P4; em que P1, P2, P3, e P4 são péptidos capazes de se ligar a miostatina; e L1, L2, L3, e L4 são cada um linkers; e a, b, c, d, e, e f são cada um independentemente 0 ou 1, com a condição de que pelo menos um de a e b seja 1.
Qualquer péptido que contém um resíduo cisteinilo pode ser reticulado com outro péptido que contém Cys, qualquer um dos quais ou ambos podem ser ligados a um veículo. Qualquer péptido que tem mais de um resíduo Cys pode formar uma ligação dissulfeto intrapéptido, também.
Numa forma de realização, o veículo é um domínio Fc, definido a seguir. Esta forma de realização é referida como um "pepticorpo". Como é utilizado no presente documento, o termo "pepticorpo" refere-se a uma molécula que compreende um domínio Fc de anticorpo unido a pelo menos um péptido. A produção de pepticorpos é geralmente descrita em publicação PCT WO 00/24782, publicada em 4 de Maio de 2000, 12 pepticorpos exemplares são proporcionados como configurações lx e 2x com um cópia e duas cópias do péptido (unidos em tandem) respectivamente, como é descrito nos Exemplos a seguir. Péptido
Como é utilizado no presente documento o termo "péptido" refere-se a moléculas de aproximadamente 5 a aproximadamente 90 aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Os péptidos da presente invenção têm entre 10 e 50 aminoácidos de comprimento, mais preferentemente entre aproximadamente 10 e 30 aminoácidos de comprimento, e o mais preferentemente entre aproximadamente 10 e 25 aminoácidos de comprimento, e são capazes de ligar-se à proteína miostatina.
Os péptidos da presente invenção podem compreender parte de uma sequência de proteínas de ocorrência natural, podem ser sequências aleatorizadas derivadas de proteínas de ocorrência natural, ou podem ser inteiramente sequências aleatorizadas. Os péptidos da presente invenção podem ser gerados por meio de quaisquer métodos conhecidos na técnica incluindo síntese química, digestão de proteínas, ou tecnologia recombinante. Apresentação em fago (phage display) e rastreio de ARN-péptido, e outras técnicas de rastreio por afinidade são em particular úteis para gerar péptidos capazes de ligar-se a miostatina. A tecnologia de apresentação em fago é descrita, por exemplo, em Scott et al. Science 249: 386 (1990); Devlin et al., Science 249: 404 (1990); Patente U.S. N° 5.223.409, expedida em 29 de Junho de 1993; Patente U.S. N° 5.733.731, expedida em 31 de Março de 1998; Patente U.S. N° 5.498.530, expedida em 12 de Março de 1996; Patente U.S. N° 5.432.018, expedida em 11 de Julho de 1995; Patente U.S. N° 5.338.665, expedida em 16 de Agosto de 1994; Patente U.S. N° 5.922.545, expedida em 13 de Julho de 1999; documento 13 WO96/40987, publicado em 19 de Dezembro de 1996; e documento WO 98/15833, publicado em 16 de Abril de 1998, Utilizando bibliotecas de fago, sequências de péptido aleatórias são apresentadas por fusão com proteínas de envoltório de fago filamentoso. Tipicamente, os péptidos apresentados são eluídos por afinidade ou especificamente ou de maneira não específica contra a molécula alvo. Os fagos retidos podem ser enriquecidos por séries sucessivas de purificação por afinidade e repropagação. Os péptidos melhor ligados são seleccionados para análise adicional, por exemplo, utilizando ELISA de fago, descrito a seguir, e então são sequenciados. Opcionalmente, bibliotecas de mutagénese podem ser criadas e rastreadas para optimizar adicionalmente a sequência dos melhores ligadores (Lowman, Ann Rev Biophys Biomol Struct 26:401-24 (1997)).
Outros métodos de geração dos péptidos de ligação a miostatina incluem técnicas de selecção por afinidade adicionais conhecidas na técnica. Uma biblioteca de péptidos pode ser fusionada na terminação carboxilo do repressor lac e expressa em E.coli. Outro método com base em E. coli permite exibir na membrana externa da célula por fusão com uma lipoproteína associada a peptidoglicano (PAL). A seguir no presente documento, estes e métodos relacionados são colectivamente referidos como "apresentação em E. coli." Em outro método, a tradução de ARN aleatório é parada antes da libertação do ribossoma, resultando numa biblioteca de polipéptidos com seu ARN associado ainda unidos. A seguir no presente documento, este e métodos relacionados são colectivamente referidos como "apresentação em ribossoma". Outros métodos utilizam ligação química de péptidos a ARN. veja-se, por exemplo, Roberts e Szostak, Proc Natl Acad Sei USA, 94: 12297-303 (1997). A seguir no presente documento, este e métodos relacionados são colectivamente referidos como "rastreio de ARN-péptido". Métodos de rastreio de dois híbridos em 14 levedura também podem ser utilizados para identificar péptidos da invenção que se ligam a miostatina. Além disso, bibliotecas de péptidos derivados quimicamente têm sido desenvolvidas em que péptidos são imobilizados em materiais não biológicos, estáveis, tais como hastes de polietileno ou resinas permeáveis a solvente. Outra biblioteca de péptidos derivados quimicamente utiliza fotolitografia para rastrear péptidos imobilizados em lâminas de vidro. A seguir no presente documento, estes e métodos relacionados são colectivamente referidos como "rastreio químico de péptido". Rastreio químico de péptido pode ser vantajoso em que permite a utilização de D-aminoácidos e outros análogos, bem como elementos não peptídicos. Tanto métodos biológicos como químicos são revisados em Wells e Lowman, Curr Opiri Biotechnol 3: 355-62 (1992).
Adicionalmente, péptidos seleccionados capazes de ligar miostatina podem ser melhorados adicionalmente através da utilização de "desenho racional". Nesta abordagem, mudanças graduais são feitas a uma sequência de péptido e o efeito da substituição na afinidade de ligação ou especificidade do péptido ou alguma outra propriedade do péptido é observada num ensaio apropriado. Um exemplo desta técnica consiste em substituir um resíduo único de uma vez com alanina, referidos como um "percurso de alanina (alanine walk)" ou um "rastreio de alanina". Quando dois resíduos são substituídos, é referido como um "percurso duplo de alanina (double alanine walk)''. 0 péptido resultante que contém substituições de aminoácido é testado para a actividade potenciada ou alguma propriedade vantajosa adicional.
Além disso, a análise da estrutura de uma interacção proteína-proteína pode também ser utilizada para sugerir péptidos que imitam a interacção de uma proteína maior. Em uma análise deste tipo, a estrutura cristalina de uma proteína pode sugerir a identidade e orientação relativa de 15 resíduos críticos da proteína, a partir dos quais um péptido pode ser desenhado. Veja-se, por exemplo, Takasaki et ai., Nature Biotech 15:1266 (1977). Estes métodos podem também ser utilizados para investigar a interacção entre uma proteína e péptidos alvejados seleccionados pela apresentação em fago ou outros processos de selecção por afinidade deste modo sugerindo modificações adicionais de péptidos para aumentar a afinidade de ligação e a capacidade do péptido para inibir a actividade da proteína.
Numa forma de realização, os péptidos da presente invenção são gerados como família de péptidos relacionados. Péptidos exemplares são representados pela SEQ ID NO: la 132. Estes péptidos exemplares foram derivados através de um processo de selecção em que os melhores ligadores gerados pela tecnologia de apresentação em fago foram analisados adicionalmente por meio de ELISA de fago para obter péptidos candidatos por uma técnica de selecção por afinidade tal como tecnologia de apresentação em fago como é descrito no presente documento. No entanto, os péptidos da presente invenção podem ser produzidos por meio de qualquer número de métodos conhecidos incluindo síntese química como é descrito a seguir.
Os péptidos da presente invenção podem ser melhorados adicionalmente por meio do processo de "maturação por afinidade". Este procedimento é dirigido para aumentar a afinidade ou a actividade dos péptidos e pepticorpos da presente invenção utilizando apresentação em fago ou outras tecnologias de selecção. Com base numa sequência consenso, a apresentação de bibliotecas de fago secundárias dirigidas, por exemplo, podem ser geradas em que os aminoácidos "core" (determinados a partir da sequência consenso) são mantidos constantes ou são predispostos em frequência de ocorrência. Alternativamente, uma sequência de péptido individual pode ser utilizada para gerar uma biblioteca de apresentação em fago dirigida, predisposta. A 16 selecção (panning) de tais bibliotecas sob condições mais restringentes pode render péptidos com ligação potenciada a miostatina, ligação selectiva a miostatina, ou com alguma propriedade adicional desejada. No entanto, os péptidos que têm as sequências maturadas por afinidade podem então ser produzidos por meio de qualquer número de métodos conhecidos incluindo síntese química ou de maneira recombinante. Estes péptidos são utilizados para gerar agentes de ligação tal como pepticorpos de diversas configurações que exibem maior actividade inibidora em ensaios a base de células e ensaios in vivo. 0 Exemplo 6 a seguir descreve a maturação por afinidade dos péptidos de ''primeira série" descritos anteriormente para produzir péptidos maturados por afinidade. Pepticorpos maturados por afinidade exemplares são apresentados nos Quadros IV e V. Os pepticorpos lx e 2x resultantes feitos a partir destes péptidos foram então caracterizados adicionalmente para afinidade de ligação, capacidade para neutralizar actividade de miostatina, especificidade a miostatina como oposição a outros membros da família ΤΝίβ, e para actividade adicional in vitro e in vivo, como é descrito a seguir. Péptidos e pepticorpos maturados por afinidade são referidos pelo prefixo "m" antes do seu nome de família para distinguir os mesmos dos péptidos de primeira série da mesma família. Péptidos de primeira série exemplares escolhidos para maturação por afinidade adicional de acordo com a presente invenção incluíram os seguintes péptidos: TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 33), e os péptidos lineares Linear-2 MEMLD-SLFELLKDMVPISKA (SEQ ID NO: 104), Linear-15 HHGWNILRKCSAPQWFEAWV (SEQ ID NO: 117), Linear-17, RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEQ ID NO: 119), Linear-20 YRBMSMLEGILDVLERLQHY (SEQ ID NO: 122), Linear-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEQ ID NO: 123), Linear-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEQ ID NO: 126). As famílias 17 maturadas por afinidade de cada um destes são apresentadas a seguir nos Quadros IV e V.
Veículos
Como é utilizado no presente documento o termo "veiculo" refere-se a uma molécula que pode ser unida a um ou mais péptidos da presente invenção. Preferentemente, veículos conferem pelo menos uma propriedade desejada nos agentes de ligação da presente invenção. Péptidos sozinhos provavelmente serão removidos in vivo ou por meio de filtração renal, por meio de mecanismos de clarificação celular no sistema retículo-endotelial, ou por meio de degradação proteolítica. A união a um veículo melhora o valor terapêutico de um agente de ligação pela redução da degradação do agente de ligação e/ou aumento da semivida, redução da toxicidade, redução da imunogenicidade, e/ou aumento da actividade biológica do agente de ligação.
Veículos exemplares incluem domínios de Fc; polímeros lineares tais como polietilenoglicol (PEG), polilisina, dextrano; um polímero de cadeia ramificada (veja-se por exemplo a Patente U.S. N° 4.289.872 concedida a Denkenwalter et ai., expedida em 15 de Setembro de 1981; Patente U.S. N° 5.229.490 concedida a Tam, expedida em 20 de Julho de 1993; documento WO 93/21259 de Frechet et al., publicada em 28 de Outubro de 1993); um lípido; um grupo colesterol (tal como um esteróide); um hidrato de carbono ou oligossacárido; ou qualquer proteína, polipéptido ou péptido natural ou sintético que liga a um receptor selvagem.
Numa forma de realização, os agentes de ligação a miostatina da presente invenção têm pelo menos um péptido unido a pelo menos um veículo (F1, F2) através da terminação N, terminação C ou uma cadeia lateral de um dos resíduos de aminoácido do(s) péptido(s). Veículos múltiplos podem também ser utilizados; tal como um domínio Fc a cada 18 terminação ou um domínio Fc numa terminação e um grupo PEG na outra terminação ou uma cadeia lateral.
Um domínio Fc é um veículo preferido. Como é utilizado no presente documento, o termo "domínio Fc" abrange sequências e moléculas de Fc nativo e variante de Fc como definido a seguir. Como é utilizado no presente documento o termo "Fc nativo" refere-se a um fragmento de ligação a não antigénio de um anticorpo ou a sequência de aminoácidos de aquele fragmento que é produzido por meio de técnicas de ADN recombinante ou por meio de clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Um Fc preferido é um Fc totalmente humano e pode se originar a partir de qualquer das imunoglobulinas, tal como IgGl e lgG2. No entanto, moléculas de Fc que são parcialmente humanas, ou originar de espécies não humanas são também incluídas no presente documento. Moléculas de Fc nativas são feitas de polipéptidos monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas por meio de associação covalente (isto é, ligações dissulfeto) e não covalente. 0 número de ligações dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativas varia desde 1 até 4 dependendo de classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, igAl, lgGA2) . um exemplo de uma Fc nativa é um dímero ligado por dissulfeto que resulta da digestão com papaína de um IgG (veja-se Ellison et al. (1982), Nucl Acids Res 10: 4071-9). O termo "Fc nativa" como é utilizado no presente documento é utilizado para referir-se as formas monomérica, dimérica, e multimérica.
Como é utilizado no presente documento, o termo "variante de Fc" refere-se a um forma modificada de uma sequência de Fc nativa com a condição de que a ligação ao receptor selvagem é mantida, como é descrito, por exemplo, no documento WO 97/34631 e documento WO 96/32478. As variantes de Fc podem ser construídas por exemplo, 19 substituindo ou deletando residuos, inserindo resíduos ou truncando porções que contêm o local. Os resíduos inseridos ou substituídos pode também ser aminoácidos alterados, tal como peptidomiméticos ou D-aminoácidos. As variantes de Fc podem ser desejáveis por um número de razões, muitas das quais são descritas a seguir. As variantes de Fc exemplares incluem moléculas e sequências em que: 1. Locais envolvidos em formação de ligação dissulfeto são removidos. Tal remoção pode evitar a reacção com outras proteínas que contêm cisteína presentes na célula hospedeira utilizada para produzir a moléculas da invenção. Para este propósito, o segmento que contém cisteína na terminação N podem ser truncado ou resíduos de cisteína podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos (por exemplo, alanilo, serilo). Mesmo quando resíduos de cisteína são removidos, os domínios de Fc de cadeia única ainda podem formar um domínio Fc dimérico que é mantido junto não covalentemente. 2. Uma Fc nativa é modificada para torná-la mais compatível com uma célula hospedeira seleccionada. Por exemplo, um pode remover a sequência de PA próxima a terminação N de um Fc nativa típica, que pode ser reconhecida por uma enzima digestiva em E. coli tal como prolina iminopeptidase. Um pode também adicionar um resíduo metionilo N terminal, especialmente quando a molécula é expressa de maneira recombinante num célula bacteriana tal como E. coli. 3. Uma porção da terminação N de uma Fc nativa é removida para prevenir heterogeneidade da terminação N quando expressa numa célula hospedeira seleccionada. Para este propósito, um pode deletar qualquer um dos primeiros 20 resíduos de aminoácido na terminação N, em particular aqueles nas posições 1, 2, 3, 4 e 5. 4. Um ou mais locais de glicosilação são removidos. Resíduos que são tipicamente glicosilados (por exemplo, 20 asparagina) podem conferir resposta citolítica. Tais residuos podem ser deletados ou substituídos com resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina). 5. Locais envolvidos em interacção com complemento, tal como o local de ligação a Clq, são removidos. Por exemplo, um pode deletar ou substituir a sequência EKK de igGl humana. O recrutamento de complemento pode não ser vantajoso para as moléculas desta invenção e assim podem ser evitadas com uma variante de Fc deste tipo. 6. São removidos locais que afectam a ligação a receptores de Fc diferentes de um receptor selvagem. Uma Fc nativa pode ter locais para interacção com certas células brancas do sangue que não são requeridas para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos. 7. O local ADCC é removido. Os locais ADCC são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Molec Immunol 29 (5):633-9 (1992) com respeito a locais ADCC em IgGl. Este locais, também, não são requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos. 8. Quando a Fc nativa é derivada de um anticorpo não humano, a Fc nativa pode ser humanizada. Tipicamente, para humanizar uma Fc nativa, um substituirá resíduos seleccionados na Fc nativa não humana com resíduos que são normalmente encontrados em Fc nativa humana. Técnicas para humanização de anticorpos são bem conhecidas na técnica. O termo "domínio Fc" inclui moléculas em forma monomérica ou multimérica, ou digerida a partir de anticorpo completo ou produzidos por outros meios. Como é utilizado no presente documento o termo "multímero" como aplicado a domínios de Fc ou moléculas que compreendem domínios de Fc refere-se a moléculas que têm duas ou mais cadeias de polipéptido associadas covalentemente, não covalentemente, ou tanto por interacções covalente como não 21 covalente. Moléculas de IgG tipicamente formam dimeros; IgM, pentámeros; IgD, dimeros; e IgA, monómeros, dimeros, trimeros, ou tetrámeros. Multimeros podem ser formados pela exploração da sequência e actividade que resulta fonte de Ig nativa da Fc ou pela derivatização de uma Fc nativa deste tipo. O termo "dímero" como aplicado a dominios de Fc ou moléculas que compreendem domínios de Fc refere-se a moléculas que têm duas cadeias polipeptídicas associadas covalentemente ou não covalentemente.
Adicionalmente, um veículo alternativo de acordo com a presente invenção é uma proteína, polipéptido, péptido, anticorpo, fragmento de anticorpo, ou molécula pequena (por exemplo, um composto peptidomimético) de não domínio Fc capaz de ligar-se a um receptor selvagem. Por exemplo, um poderia utilizar como um veículo um polipéptido como é descrito na Patente U.S. N° 5.739.277, expedida em 14 de Abril de 1998 concedida a Presta et al. Péptidos poderiam também ser seleccionados pela apresentação em fago para ligação ao receptor selvagem de FcRn. Tal compostos de ligação de receptor selvagem são também incluídos dentro do significado de "veículo" e estão dentro do âmbito desta invenção. Tais veículos deveriam ser seleccionados para semivida aumentada (por exemplo, evitando sequências reconhecidas por proteases) e imunogenicidade diminuída (por exemplo, favorecendo sequências não imunogénicas, como descoberto em humanização de anticorpo).
Além disso, veículos de polímeros podem também ser utilizados para construir os agentes de ligação da presente invenção. Diversos meios para unir fracções químicas úteis como veículos são actualmente disponíveis, veja-se, por exemplo, Publicação internacional de Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes ("PCT") N° WO 96/11953, titulado "N-Temnnally Quimically Modified Protein Compositions and Methods," esta Publicação PCT divulga, entre outras coisas, 22 a união selectiva de polímeros solúveis em água à terminação N de proteínas.
Um preferido veículo de polímero é polietilenoglicol (PEG) . 0 grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. 0 peso molecular médio do PEG preferentemente variará desde aproximadamente 2 kDa até aproximadamente 100 kDa, mais preferentemente desde aproximadamente 5 kDa até aproximadamente 50 kDa, o mais preferentemente desde aproximadamente 5 kDa até aproximadamente 10 kDa. Os Grupos de PEG geralmente estarão unidos aos compostos da invenção via acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reactivo na fracção de PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reactivo no composto inventivo (por exemplo, um grupo aldeído, amino ou éster) . Uma estratégia útil para a PEGuilação de péptidos sintéticos consiste em combinar, através da formação de uma ligação de conjugado em solução, um péptido e uma fracção de PEG, cada um portando uma funcionalidade especial que é mutuamente reactiva em relação ao outro. Os péptidos podem ser facilmente preparados com convencional síntese de fase sólida como conhecido na técnica. Os péptidos são "pré-activados" com um grupo funcional apropriado num local específico. Os precursores são purificados e totalmente caracterizados antes de reagir com a fracção de PEG. Ligação do péptido com PEG usualmente ocorre em fase aquosa e podem ser facilmente monitorizada por meio de HPLC analítica de fase reversa. Os péptidos PEGuilados podem ser facilmente purificados por meio de HPLC preparativa e caracterizados por HPLC analítica, análise de aminoácido e espectrometria de massas por dessorção laser.
Polímeros de polissacárido são outro tipo de polímero solúvel em água que pode ser utilizado para modificação de proteína. Dextranos são polímeros de polissacárido compreendido de subunidades de glicose individuais 23 predominantemente ligado por ligações 1-6. 0 próprio dextrano está disponível em muitos intervalos de peso molecular, e é facilmente disponível em pesos moleculares desde aproximadamente 1 kDa até aproximadamente 70 kDa. Dextrano é um polímero solúvel em água adequado para utilização na presente invenção como um veículo por si mesmo ou em combinação com outro veículo (por exemplo, Fc). Veja-se, por exemplo, o documento WO 96/11953 e o documento WO 96/05309. A utilização de dextrano conjugado a imunoglobulinas terapêuticas ou de diagnóstico foi reportada; veja-se, por exemplo, Publicação de Patente Europeia N° 0 315 456, Dextrano de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa é preferido quando o dextrano é utilizado como um veículo de acordo com a presente invenção.
Linkers
Os agentes linkers da presente invenção podem opcionalmente compreender ainda um grupo "linker". Linkers servem primariamente como um espaçador entre um péptido e um veículo ou entre dois péptidos dos agentes de ligação da presente invenção. Numa forma de realização, o linker é composto de aminoácidos ligados juntos por ligações peptídicas, preferentemente desde 1 até 20 aminoácidos ligados por ligações peptídicas, em que os aminoácidos são seleccionados dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Um ou mais destes aminoácidos podem ser glicosilados, como é entendido por aqueles na técnica. Numa forma de realização, os 1 a 20 aminoácidos são seleccionados de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Preferentemente, um linker é composto de uma maioria de aminoácidos que são não bloqueados estericamente, tais como glicina e alanina. Assim, linkers exemplares são poliglicinas (em particular (Gly)5, (Gly)8), poli(Gly-Ala), e polialaninas. Como é utilizado no presente documento, a designação "g" refere-se a linkers homopeptídicos de 24 glicina. Como é mostrado no em Quadro II, "gn" refere-se a um linker 5x gly na terminação N, enquanto "gc" refere-se a linker 5x gly na terminação C. Combinações de Gly e Ala são também preferidas. Uma sequência linker exemplar útil para construir os agentes de ligação da presente invenção é a seguinte: gsgsatggsgstassgsgsatg (Seq ID No: 305). Esta sequência linker é referida como a sequência "k" ou lk. As designações "kc", como encontrada no Quadro II, refere-se ao linker k na terminação C, enquanto a designação "kn", refere-se ao k linker na terminação N.
Os linkers da presente invenção podem também ser linkers não peptidicos. Por exemplo, podem ser utilizados linkers de alquilo tais como -NH- (CH2) S-C (O) -, em que s = 2-20. Estes linkers de alquilo podem ser substituídos adicionalmente por qualquer grupo não bloqueado estericamente tal como alquilo de cadeia curta (por exemplo, Ci-C6), acilo de cadeia curta, halogéneo (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc. Um linker não peptídico exemplar é um linker de PEG, e tem um peso molecular de 100 a 5000 kDa, preferentemente de 100 a 500 kDa. Os linkers peptidicos podem ser alterados para formar derivados da mesma maneira como anteriormente.
Agentes de Ligação Exemplares
Os agentes de ligação da presente invenção compreendem pelo menos um péptido capaz de ligar-se a miostatina. O péptido de ligação a miostatina da presente invenção compreende a sequência de aminoácidos Cbib2wb3MMCPP (SEQ ID NO: 353), em que bi é seleccionado de qualquer um dos aminoácidos T, I, ou R; b2 é seleccionado de qualquer um de R, S, Q; b3 é seleccionado de qualquer um de P, Re Q, e em que o péptido tem entre 10 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
Numa forma de realização relacionada o péptido de ligação a miostatina compreende a fórmula: 25 did2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WMCPP diodndi2di3 (SEQ ID NO: 355), em que di está ausente ou qualquer aminoácido; d2 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; d3 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; d4 está ausente ou qualquer aminoácido; d5 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; d6 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico; d7 é seleccionado de qualquer um dos aminoácidos T, I, ou R; ds é seleccionado de qualquer um de R, S, Q; d9 é seleccionado de qualquer um de P, R e Q, e dio a di3 é seleccionado de qualquer aminoácido, e em que o péptido tem entre 20 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
Formas de realização adicionais de agentes de ligação compreendem pelo menos um dos seguintes péptidos: (1) um péptido capaz de ligar-se a miostatina, em que o péptido compreende a sequência WYeie2Ye3G, (SEQ ID NO: 356) em que ei é P, S ou Y, e2 é C ou Q, e e3 é G ou H, em que o péptido tem entre 7 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo. (2) um péptido capaz de ligar-se a miostatina, em que o péptido compreende a sequência f lEMLf 2SLf 3f 4LL, (SEQ ID NO: 455), em que fj é M ou I, f2 é qualquer aminoácido, f3 é L ou F, f4 é E, Q ou D; 26 e em que o péptido tem entre 7 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo. (3) um péptido capaz de ligar-se a miostatina em que o péptido compreende a sequência Lgig2LLg3g4L, (SEQ ID NO: 456) , em que gi é Q, D ou E, g2 é S, Q, D ou E, g3 é qualquer aminoácido, g4 é L, W, F, ou Y, e em que o péptido tem entre 8 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo. (4) um péptido capaz de ligar-se a miostatina, em que o péptido compreende a sequência hih2h3h4h5h6h7h8h9 (SEQ ID NO: 457) , em que hi é R ou D, h2 é qualquer aminoácido, h3 é Um, T S ou Q, h4 é L ou M, h5 é L ou S, h6 é qualquer aminoácido, h7 é F ou E, h8 é W, F ou C, h9 é L, F, M ou K, e em que o péptido tem entre 9 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
Numa forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção compreendem ainda pelo menos um veiculo tal como um polímero ou um domínio Fc, e podem compreender ainda pelo menos uma sequência linker. Nesta forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção são construídos de modo que pelo menos um péptido de ligação a miostatina é covalentemente unido a pelo menos um veículo. O péptido ou péptidos são unidos directamente ou indirectamente através de uma sequência linker, ao veículo na terminação N, terminação C ou uma cadeia lateral de 27 aminoácido do péptido. Nesta forma de realização, os agentes de ligação da presente invenção têm a seguinte estrutura genérica: (X1) a-F1- (X2)b, ou multimeros do mesmo; em que F1 é um veículo; e X1 e X2 são cada um independentemente seleccionados de -(L4)c- P1; -(l^c-pMl 2)d -P2; hU 1 1 0 1 2)d-P2-(L3)e-P3; e -(L1)c-P1- (L2)d-P2-(L3)e -P3-(L4)f-P4; em que P1, P2, P3, e P4 são péptidos capazes de ligar-se a miostatina; e L1, L2, L3, e L4 são cada um linkers; e a, b, c, d, e, e f são cada um independentemente 0 ou 1, com a condição de que pelo menos um de a e b seja 1.
Numa forma de realização dos agentes de ligação que têm esta estrutura generalizada, os péptidos P1, P2, P3, e P4 podem ser seleccionados de um ou mais de qualquer dos péptidos que compreende as sequências proporcionadas anteriormente. Péptidos P1, P2, P3, e P4 podem ser seleccionados de um ou mais péptidos que compreendem qualquer das seguintes sequências: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456, OU SEQ ID NO: 457.
Numa forma de realização adicional, os veículos de agentes de ligação que têm a fórmula geral acima são domínios de Fc. Os péptidos são portanto fusionados a um domínio Fc, ou directamente ou indirectamente, deste modo proporcionando pepticorpos. Os pepticorpos da presente invenção exibem uma alta afinidade de ligação para miostatina e podem inibir a actividade de miostatina como é demonstrado por meio de ensaios in vitro e testes in vivo em animais proporcionados no presente documento. 28 A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico que compreendem polinucleótidos que codificam os péptidos da presente invenção. Apresentam-se a seguir sequências nucleotidicas exemplificativas.
Variantes e Derivados de Péptidos e Pepticorpos
Os agentes de ligação da presente invenção também abrangem variantes e derivados dos péptidos e pepticorpos descrito no presente documento. Uma vez que ambos os péptidos e pepticorpos da presente invenção podem ser descrito em termos de sua sequência de aminoácidos, os termos "variantes" e "derivados" podem ser ditos para aplicar a um péptido sozinho, ou um péptido como um componente de um pepticorpo.
Variantes de péptido e pepticorpo também incluem péptidos e pepticorpos maturos em que sequências líder ou de sinal são removidas, e as proteínas resultantes que têm resíduos amino terminal adicionais, cujos aminoácidos podem ser naturais ou não naturais. Pepticorpos com um resíduo metionilo adicional na posição de aminoácido -1 (Met-1-pepticorpo) são contemplados, como são pepticorpos com resíduos de metionina e lisina adicionais nas posições -2 e -1 (Met^-Lys-1-) . Variantes que têm resíduos de Met, Met-Lys, Lys adicionais (ou um ou mais resíduos básicos, em geral) são em particular úteis para produção de proteína recombinante potenciada em célula bacteriana hospedeiras.
Variantes de péptido ou pepticorpo da presente invenção também incluem péptidos que têm adicionais resíduos de aminoácido que surgem da utilização de sistemas de expressão específicos. Por exemplo, a utilização de vectores comercialmente disponíveis que expressam um polipéptido desejado como parte de produto de fusão glutationa-S-transferase (GST) proporciona o polipéptido desejado que tem um resíduo de glicina adicional na posição de aminoácido 1 após clivagem do componente de GST do 29 polipéptido desejado. Variantes que resultam da expressão em outros sistemas de vector são também contemplados, incluindo aqueles em que caudas de histidina são incorporadas na sequência de aminoácidos, geralmente na terminação carboxi e/ou amino da sequência.
Num exemplo, variantes insercionais são proporcionadas em que um ou mais resíduos de aminoácido, ou aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, são adicionados a uma sequência de aminoácidos de péptido. Inserções são localizadas em uma ou ambas as terminações da proteína. Variantes insercionais com resíduos adicionais em uma ou ambas as terminações pode incluir, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo etiquetas ou marcadores de aminoácido. Variantes insercionais incluem péptidos em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionadas à sequência de aminoácidos de péptido.
Variantes insercionais também incluem proteínas de fusão em que as terminações amino e/ou carboxi do péptido ou pepticorpo são fusionadas a outro polipéptido, um fragmento do mesmo ou aminoácidos que não são geralmente reconhecidos por ser parte de qualquer sequência de proteína específicas. Os exemplos de tais proteínas de fusão são polipéptidos imunogénicos, proteínas com semividas de circulação longas, tal como imunoglobulina regiões constantes, proteínas marcadoras, proteínas ou polipéptidos que facilitam a purificação do péptido ou pepticorpo desejado, e sequências polipeptídicas que promovem a formação de proteínas multiméricas (tal como motivos zíper de leucina que são úteis em formação de dímeros/estabilidade).
Este tipo de variante insercional geralmente tem toda ou uma porção substancial da molécula nativa, ligada ma terminação N ou C, a todo ou uma porção de um segundo polipéptido. Por exemplo, as proteínas de fusão tipicamente empregam sequências líder de outras espécies para permitir 30 a expressão recombinante de uma proteína num hospedeiro heterólogo. Outra proteína de fusão útil inclui a adição de um domínio imunologicamente activo, tal como um epítopo de anticorpo, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A inclusão de um local de clivagem em ou próximo da junção de fusão facilitará a remoção do polipéptido estranho após a purificação. Outras fusões úteis incluem ligação de domínios funcionais, tais como locais activos de enzimas, domínios de glicosilação, sinais de alvejamento celular ou regiões transmembrana.
Existem diversos sistemas de expressão de proteína de fusão comercialmente disponíveis que podem ser utilizados na presente invenção. Os sistemas particularmente úteis incluem, mas não são limitados a, o sistema glutationa-S-transferase (GST) (Pharmacia), o sistema de proteína de ligação a maltose (NEB, Beverley, MA), o sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), e o sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estes sistemas são capazes de produzir péptidos e/ou pepticorpos recombinantes que portam somente um número pequeno de aminoácidos adicionais, que são improváveis de afectar significativamente a actividade do péptido ou pepticorpo. Por exemplo, tanto o sistema FLAG como o sistema 6xHis adicionam somente sequências curtas, ambos os quais são conhecidos por serem pobremente antigénicos e que não afectam adversamente o dobramento de um polipéptido a sua conformação nativa. Outra fusão de terminação N que é contemplada por ser útil é a fusão de um dipéptido Met-Lys na região da terminação N da proteína ou péptidos. Tal fusão pode produzir aumentos benéficos na expressão ou actividade da proteína. Outros sistemas de fusão produzem híbridos de polipéptidos onde é desejável excindir o parceiro de fusão do péptido ou pepticorpo desejado. Numa forma de realização, o parceiro de fusão é ligado ao pepticorpo recombinante por uma sequência de péptido que contém uma 31 sequência de reconhecimento especifico para uma protease. Os exemplos de sequências adequadas são aquelas reconhecidas pela protease do virus da gravura do tabaco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ou Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA). A invenção também proporciona polipéptidos de fusão que compreendem todo ou parte de um péptido ou pepticorpo da presente invenção, em combinação com factor de tecido truncado (tTF) . 0 tTF é um agente de alvejamento vascular que consiste em uma forma truncada de uma proteína que induz a coagulação humana que age como um agente de coágulo de vaso sanguíneo de tumor, como é descrito nas Patentes U.S. Nos.: 5.877.289; 6.004.555; 6.132.729; 6.132.730; 6.156,321; e Patente europeia No. EP 0988056. A fusão de tTF ao pepticorpo ou péptido anti-miostatina facilita a distribuição de antagonistas anti-miostatina a células alvo, por exemplo, células músculo esquelético, células de músculo cardíaco, fibroblastos, pré-adipócitos, e possivelmente adipócitos. A identidade e a similaridade de péptidos relacionados e pepticorpos podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não são limitados a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jersey (1994); Sequence Analysis Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Iniciador, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova Iorque (1991); e Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).
Os métodos preferidos para determinar a relação ou percentagem de identidade de dois péptidos ou polipéptidos, 32 ou um polipéptido e um péptido, são desenhados para dar a maior combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em publicamente disponível programa de computador. Preferido programa de computador métodos para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não são limitados a, o pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et ai., J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990)). O programa BLASTX está publicamente disponível da National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Betesda, MD 20894; Altschul et al, supra (1990)). O algoritmo Smith Waterman bem conhecido pode também ser utilizado para determinar a identidade.
Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar na combinação de somente uma região curta das duas sequências, e esta região pequena e alinhada pode ter uma identidade de sequência muito alta mesmo embora não exista relação significativa entre as duas sequências de comprimento total. Em consequência, em certas formas de realização, o método de alinhamento seleccionado resultará num alinhamento que mede pelo menos dez por cento do comprimento total do polipéptido alvo a ser comparado, isto é, pelo menos 40 aminoácidos contíguos onde sequências de pelo menos 400 aminoácidos estão a ser comparados, 30 aminoácidos contíguos onde sequências de pelo menos 300 a aproximadamente 400 aminoácidos estão a ser comparados, pelo menos 20 aminoácidos contíguos onde sequências de 200 a aproximadamente 300 aminoácidos estão a ser comparados, e pelo menos 10 aminoácidos contíguos onde sequências de aproximadamente 100 a 200 aminoácidos estão a ser comparados. Por exemplo, utilizando o algoritmo de 33 computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipéptidos para os quais a percentagem de identidade de sequência é para ser determinada são alinhados para o emparelhamento óptimo dos seus aminoácidos respectivos (a "extensão emparelhada", como determinado pelo algoritmo) . Em certas formas de realização, uma penalidade de abertura de espaço (que é tipicamente calculada como 3X a média diagonal; a "média diagonal" é a média da diagonal da matriz de comparação sendo utilizada; a "diagonal" é a contagem ou número atribuído a cada emparelhamento de aminoácidos perfeito pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de espaço (que é usualmente 1/10 vezes a penalidade de abertura de espaço), bem como uma matriz de comparação tal como PAM 250 ou BLOSUM 62 são utilizadas em conjunto com o algoritmo. Em certas formas de realização, uma matriz de comparação padrão (veja-se Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89:10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62) é também utilizada pelo algoritmo.
Em certas formas de realização, por exemplo, os parâmetros para uma comparação de sequência de polipéptido podem ser feita com os seguintes: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., supra (1992); Penalidade de espaço: 12; Penalidade de comprimento de espaço: 4; Limiar de Similaridade: 0, junto com sem penalidade para espaços de extremidade.
Em certas formas de realização, os parâmetros for sequência de molécula de polinucleótido (como oposição a uma sequência de aminoácidos) comparações podem ser feitas com os seguintes: Algoritmo: Needleman et al., supra (1970); Matriz de comparação: emparelhamentos = +10, mal 34 emparelhamento = 0; Penalidade de espaço: 50: Penalidade de comprimento de espaço: 3
Outros algoritmos, penalidades de abertura de espaço, penalidades de extensão de espaço, matrizes de comparação, limiares de similaridade, etc. exemplares podem ser utilizados, incluindo aqueles expostos no Program Manual, wisconsin Package, Versão 9, Setembro de 1997. As escolhas particulares a serem feitas serão aparentes para aqueles peritos na especialidade e dependerá da comparação especifica a ser feita, tal como ADN-a-ADN, proteína-a-proteina, proteina-a-ADN; e adicionalmente, se a comparação é entre pares dados de sequências (em cujo caso GAP ou BestFit são geralmente preferidos) ou entre uma sequência e um base de dados grande de sequências (em cujo caso FASTA ou BLASTA são preferidos).
Estreoisómeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais (ocorrência natural), aminoácidos de ocorrência não natural tais como aminoácidos a-, disubstituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, e outros aminoácidos não convencionais pode também ser componentes adequados para os péptidos da presente invenção. Os exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural incluir, por exemplo: ácido aminoadipico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido aminobutírico, ácido piperidinico, ácido aminocapróico, ácido aminoheptanóico, ácido aminoisobutirico, ácido aminopimélico, ácido diaminobutirico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxi-lisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleticina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, oritina, 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,Ν-trimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina, e 35 outros aminoácidos e aminoácidos similares (por exemplo, 4-hidroxiprolina).
Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes (sobrepostas) com base em propriedades de cadeia lateral comum: 1) hidrofóbica neutra : Met, Ala, Vai, Leu, Ile, Pro, Trp, Met, Phe; 2) polar neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin. Tyr, Gly; 3) ácida: Asp, Glu; 4) básica: His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromática: Tip, Tyr, Phe.
Em certas formas de realização, variantes de péptido ou pepticorpo incluem variantes de glicosilação em que um ou mais locais de glicosilação tais como um local de glicosilação ligado em N, foi adicionada ao pepticorpo. Um local de glicosilação ligado em N é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo de aminoácido excepto prolina. A substituição ou a adição de resíduos de aminoácido para criar esta sequência proporciona um novo local potencial para a adição de uma cadeia de hidrato de carbono ligada em N. Alternativamente, substituições que eliminam esta sequência removerão uma cadeia de hidrato de carbono ligada em N existente. Também é proporcionado um rearranjo de cadeias de hidrato de carbono ligadas em N em que um ou mais locais de glicosilação ligados em N (tipicamente aqueles que são de ocorrência natural) são eliminados e um ou mais locais novos ligados em N são criados. A invenção também proporciona "derivados" dos péptidos ou pepticorpos da presente invenção. Como é utilizado no presente documento o termo "derivado" refere-se a modificações diferentes de, ou além de, inserções, 36 deleções, ou substituições de resíduos de aminoácido que retêm a capacidade de ligar a miostatina.
Preferentemente, as modificações feitas aos péptidos da presente invenção para produzir derivados são de natureza covalente, e incluem, por exemplo, ligação química com polímeros, lípidos, outras fracções orgânicas e inorgânicas. Os derivados da invenção podem ser preparados para aumentar semivida de circulação de um pepticorpo, ou podem ser desenhado para melhorar a capacidade de alvejamento para o pepticorpo a células, tecido, ou órgãos desejados. A invenção abrange ainda agentes de ligação derivados covalentemente modificados para incluir uma ou mais uniões a polímero solúvel em água, tais como polietilenoglicol, polioxietileno glicol, ou polipropileno glicol, como é descrito nas Patente U.S. Nos.: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; e 4.179.337. Ainda outros polímeros úteis conhecidos na técnica incluem monometoxi-polietilenoglicol, dextrano, celulose, ou outros polímeros a base de hidrato de carbono, poli-(N-vinil prirrolidona)-polietilenoglicol, propileno glicol homopolímeros, um co-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, bem como misturas destes polímeros. Particularmente preferidos são pepticorpos covalentemente modificados com polietilenoglicol (PEG) subunidades. Polímeros solúveis em água podem ser ligados a posições específicas, por exemplo na terminação amino dos pepticorpos, ou unido de maneira aleatória a um ou mais cadeias laterais do polipéptido. A utilização de PEG para melhorar a capacidade terapêutica para agentes de ligação, por exemplo, pepticorpos, e para anticorpos humanizados em particular, é descrito ma Patente US N° 6. 133. 426 concedida a Gonzales et ai., expedida em 17 de Outubro de 2000. 37 A invenção também contempla derivatizar a porção de péptido e/ou veículo dos agentes de ligação a miostatina. Tais derivados pode melhorar a solubilidade, absorção, semivida biológica, e similares dos compostos. As fracções podem alternativamente eliminar ou atenuar qualquer efeito secundário indesejável dos compostos e similares. Derivados exemplares incluem compostos em que: 1. 0 derivado ou alguma porção do mesmo é cíclico. Por exemplo, a porção de péptido pode ser modificada para conter dois ou mais resíduos Cys (por exemplo, no linker), que poderia ciciar pela formação de ligação dissulfeto. 2. 0 derivado é reticulado ou é tornado capaz de reticulação entre moléculas. Por exemplo, a porção de péptido pode ser modificada para conter um resíduo Cys e deste modo ser capaz de formar uma ligação dissulfeto intermolecular com uma molécula semelhante. 0 derivado pode também ser reticulado através de sua terminação C. 3. Um ou mais ligações (uniões) peptidil [-C(0)NR-] é substituída por uma ligação não peptidil. Ligações não peptidil exemplares são -CH2-carbamato [-CH2-OC(0)NR-], fosfonato, - CH2-sulfonamida [-CH2-S(0)2NR-], ureia [-NHC (O)NH-], -CH2-amina secundária, e péptido alquilado [-C(0)NR6- em que R6 é alquilo de cadeia curta] . 4. A terminação N é derivatizada. Tipicamente, a terminação N pode ser acilada ou modificada a um amina substituída. Grupos derivados de terminação N exemplares incluir -NRRi (diferentes de -NH2), -NRC(0)R2, NRC (0) ORi, -NRS(0)2Ri, -NHC(0)NHRi, succinimida, ou benziloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-), em que R e Rl são cada um independentemente hidrogénio ou alquilo de cadeia curta e em que o anel fenilo pode ser substituído com 1 a 3 substituintes seleccionados do grupo que consiste em alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, cloro, e bromo. 38 5. A terminação C livre é derivatizada. Tipicamente, a terminação C é esterifiçada ou amidada. Por exemplo, um pode utilizar métodos descritos na técnica para adicionar (NH-CH2-CH2-NH2)2 a compostos desta invenção na terminação C. Do mesmo modo, um pode utilizar métodos descritos na técnica para adicionar -NH2, (ou "coberta" com um grupo -NH2) a compostos desta invenção na terminação C. Grupos derivados de terminação C exemplares incluem, por exemplo, -C(0)R2 em que R2 é alcoxi de cadeia curta ou -NR3R4 em que R3 e R4 são independentemente hidrogénio ou alquilo Ci-Cg (preferentemente alquilo C4-C4) . 6. Uma ligação dissulfeto é substituída com outro, preferentemente mais estável, fracção de reticulação (por exemplo, um alquileno). Veja-se, por exemplo, Bhatnagar et al., J Med Chem 39: 3814-9 (1996), Alberts et al., Thirteenth Am Pep Symp, 357-9 (1993). 7. Um ou mais resíduos de aminoácido individuais são modificados. Diversos agentes de derivatização são conhecido por reagir especificamente com resíduos de cadeias laterais ou terminais seleccionados, como é descrito em detalhe a seguir.
Os resíduos lisinilo e resíduos amino terminais podem reagir-se com anidridos succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico, que invertem a carga dos resíduos lisinilo. Outros reagentes adequados para derivatizar resíduos que contêm alfa-amino incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metilo; fosfato de piroxidal; piroxidai; cloroborohidrido; ácido trinitrobenzenossulfónico; O-metilisoureia; 2,4 pentanediona; e reacção catalisada por transaminase com glicoxilato.
Os resíduos de arginilo podem ser modificados por meio de reacção com qualquer um ou combinação de vários reagentes convencionais, incluindo fenilglioxal, 2,3- 39 butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, e ninhidrina. Derivatização de resíduos de arginilo requer que a reacção seja realizada em condições alcalinas devido a alta pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina bem como o grupo epsilon-amino arginina. A modificação específica de resíduos tirosilo tem sido estudada extensivamente, com particular interesse em marcadores espectrais de introdução nos resíduos tirosilo por meio de reacção com compostos diazónio aromáticos ou tetranitrometano. 0 mais comummente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são utilizados para formar espécies 0-acetilo tirosilo e derivados 3-nitro, respectivamente.
Grupos de cadeia lateral de carboxilo (aspartilo ou glutamilo) podem ser selectivamente modificados por meio de reacção com carbodiimidas (R'-N=C=N-R') tal como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos aspartilo e glutamilo podem ser convertidos a resíduos asparaginilo e glutaminilo por meio de reacção com iões amónio.
Os resíduos glutaminilo e asparaginilo podem ser desamidados aos resíduos glutamilo e aspartilo correspondentes. Alternativamente, estes resíduos são desamidados sob condições suavemente ácidas. Qualquer forma destes resíduos está dentro do âmbito desta invenção.
Resíduos cisteinilo podem ser substituídos por resíduos de aminoácido ou outras fracções ou para eliminar ligação dissulfeto ou, de modo inverso, para estabilizar reticulação. Veja-se, por exemplo, Bhatnagar et al., {supra). A derivatização com agentes bifuncionais é útil para reticulação dos péptidos ou seus derivados funcionais a uma matriz de suporte insolúvel em água ou a outros veículos macromoleculares. Agentes de reticulação comummente 40 utilizados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo disuccinimidilo ésteres tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivatização tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rendem intermediários fotoactiváveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz. Alternativamente, matrizes insolúveis em água reactivas tais como hidratos de carbono activados por brometo de cianogénio e os substratos reactivos descritos nas Patentes U.S. Nos. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; e 4.330.440 são empregados para imobilização de proteina.
Grupos de hidrato de carbono (oligossacárido) podem ser unidos de maneira conveniente a locais que são conhecidos por serem locais de glicosilação em proteínas. Geralmente, oligossacáridos ligados em O são unidos a resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto oligossacáridos ligados em N são unidos a resíduos de asparagina (Asn) quando são parte da sequência Asn-X-Ser/Thr, onde X podem ser qualquer aminoácido excepto prolina. X é preferentemente um dos 19 aminoácidos de ocorrência natural diferentes de prolina. As estruturas de oligossacáridos ligados em O e ligados em N e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é comummente encontrado em ambos é ácido N-acetilneuramínico (referidos como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente o resíduo terminal de ambos os oligossacáridos ligados em O e ligados em N, em virtude de sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas aos compostos glicosilados. Tal(is) local(is) pode(m) ser incorporado(s) no linker dos compostos desta invenção e são preferentemente glicosilados por uma célula durante 41 produção recombinante do compostos polipéptídicos (por exemplo, em células de mamíferos tais como CHO, BHK, COS) . No entanto, tal locais podem ser adicionalmente glicosilados por meio de procedimentos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na técnica.
Outras modificações possíveis incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, oxidação do átomo de enxofre em Cys, metilação dos grupos alfa-amino de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina [veja-se, por exemplo, Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983)].
Os compostos da presente invenção também podem ser mudados ao nível ADN. A sequência de ADN de qualquer porção do composto pode ser mudada por codões mais compatíveis com a célula hospedeira escolhida. Para E. coli, que é a célula hospedeira preferida, codões optimizados são conhecidos na técnica. Os codões podem ser substituídos para eliminar locais de restrição ou para incluir locais de restrição silenciosos, que podem ajudar no processamento do ADN na célula hospedeira seleccionada. 0 veículo, linker e sequências de ADN de péptido podem ser modificados para incluir qualquer das mudanças de sequência anteriores.
Derivados adicionais incluem análogos não peptídicos que proporcionam uma estrutura estabilizada ou biodegradação reduzida, são também contemplados. Análogos miméticos de péptido podem ser preparados com base num péptido inibidor seleccionado pela substituição de um ou mais resíduos por fracções não peptídicas. Preferentemente, as fracções não peptídicas permitem que o péptido retenha sua conformação natural, ou estabilize uma conformação preferida, por exemplo, bioactiva, que retenha a capacidade de reconhecer e ligar miostatina. Num aspecto, o análogo/mimético resultante exibe afinidade aumentada de ligação para miostatina. Um exemplo de métodos para a 42 preparação de análogos miméticos de não péptido a partir de péptidos é descrita em Nachman et al., Regul Pept 57:359-370(1995). Se for desejado, os péptidos da invenção podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação, amidação, carboxilação, ou fosforilação, ou pela criação de sais de adição de ácido, amidas, ésteres, em particular ésteres C terminais, e derivados N-acilo dos péptidos da invenção. Os pepticorpos também podem ser modificados para criar derivados de péptido pela formação de complexos covalentes ou não covalentes com outras fracções. Os complexos Ligados covalentemente podem ser preparados por ligação a fracções químicas a grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos que compreende os pepticorpos, ou na terminação N ou C.
Em particular, é antecipado que os péptidos podem ser conjugados a um grupo repórter, incluindo, mas não limitado a um radiomarcador, um marcador fluorescente, uma enzima (por exemplo, que catalisa uma reacção colorimétrica ou fluorométrica), um substrato, uma matriz sólida, ou um portador (por exemplo, biotina ou avidina). A invenção em consequência proporciona uma molécula que compreende uma molécula de pepticorpo, em que a molécula preferentemente compreende ainda um grupo repórter seleccionado do grupo que consiste em um radiomarcador, um marcador fluorescente, uma enzima, um substrato, uma matriz sólida, e um portador. Tais marcadores são bem conhecidos por aqueles peritos na especialidade, por exemplo, marcadores de biotina são em particular contemplados. A utilização de tais marcadores é bem conhecida por aqueles peritos na especialidade e é descrita em, por exemplo, Patente U.S. Nos. 3.817.837; 3.850.752; 3.996.345; e 4.277.437. Outros marcadores que serão úteis incluem, mas não são limitados a marcadores radioactivos, marcadores fluorescentes e marcadores quimioluminescentes. As patentes U.S. referentes a utilização de tais marcadores incluem, por exemplo, as 43
Patentes U.S. Nos. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; e 3.996.345. Quaisquer dos pepticorpos da presente invenção podem compreender um, dois, ou mais de qualquer destes marcadores. Métodos de Fabrico de Péptidos e Pepticorpos
Os péptidos da presente invenção podem ser gerados utilizando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, tais péptidos podem ser sintetizados em solução ou num suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. Diversos sintetizadores automáticos estão comercialmente disponíveis e podem ser utilizados de acordo com protocolos conhecidos. Veja-se, por exemplo, Stewart e Young (supra)} Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merricampo, Science 232:341-347 (1986); Barany e Merricampo, The Peptides, Gross e Meienhofer, eds, Academic Press, Nova Iorque, 1-284; Barany et al., Int J Pep Proteína Res, 30:705-739 (1987); e Patente U.S. N° 5.424.398, Métodos de síntese de péptido em fase sólida utilizam um copoli(estireno-divinilbenzeno) que contêm 0,1-1,0 mM aminas/g de polímero. Estes métodos para a síntese de péptidos utilizam a protecção de butiloxicarbonilo (t-BOC) ou 9-fluorenilmetiloxi-carbonilo (FMOC) de grupos alfa-amino. Ambos os métodos envolvem sínteses por etapas por meio da qual um único aminoácido é adicionado a cada etapa partindo da terminação C do péptido (Veja-se, Coligan et al., Curr Prot Immunol, Wiley Interscience, 1991, Unidade 9) . Na conclusão da síntese química, o péptido sintético pode ser desprotegido para remover os grupos de bloqueio de aminoácido t-BOC ou FMOC e clivado do polímero por meio de tratamento com ácido a temperatura reduzida (por exemplo, HF líquido-10% de anisol durante aproximadamente 0,25 a aproximadamente 1 horas a 0°C). Após a evaporação dos reagentes, os péptidos são extraídos do polímero com 1% de solução de ácido acético que é então liofilizado para 44 proporcionar o material bruto. Este pode ser purificado normalmente por meio de tais técnicas como filtração em gel em Sephadex G-15 utilizando 5% de ácido acético como um solvente. A liofilização de fracções apropriadas da coluna proporcionará os péptidos ou derivados de péptido homogéneos, gue então podem ser caracterizados por tal técnicas padrão como análise de aminoácido, cromatografia de camada fina, cromatografia liquida de alta eficiência, espectroscopia de absorção de ultravioleta, rotação molar, solubilidade, e quantificado pela degradação de fase sólida de Edman.
As técnicas de apresentação em fago podem ser em particular efectivas na identificação dos péptidos da presente invenção como foi descrito anteriormente. Brevemente, uma biblioteca de fagos é preparada (utilizando, por exemplo, ml 13, fd, ou fago lambda), exibindo insertos desde 4 até aproximadamente 80 resíduos de aminoácido. Os insertos podem representar, por exemplo, um arranjo predisposto ou completamente degenerado. Insertos que portam fago que se ligam ao antigénio desejado são seleccionados e este processo é repetido através de vários ciclos de resselecção de fago que se ligam ao antigénio desejado. O sequenciamento de ADN é conduzido para identificar as sequências dos péptidos expressos. A porção linear mínima da sequência que se liga ao antigénio desejado pode ser determinada desta maneira. O procedimento podem ser repetido utilizando um biblioteca predisposta que contêm insertos que contêm parte ou todo da porção linear mínima mais um ou mais adicional resíduos degenerados a montante ou a jusante do mesmo. Estas técnicas podem identificar péptidos da invenção com ainda maior afinidade de ligação para miostatina que os agentes já identificados no presente documento. Não obstante, a maneira em que os péptidos são preparados, uma molécula de ácido nucleico que codifica 45 cada tal péptido pode ser gerada utilizando procedimentos de ADN recombinante padrão. A sequência de nucleótido de tal moléculas pode ser manipulada como seja apropriado sem mudar a sequência de aminoácidos que codificam considerando a degeneração do código de ácido nucleico, bem como considerando a preferência de codão em células hospedeiras particulares. A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de polinucleótidoss que codifica os péptidos e pepticorpos da presente invenção. Estas moléculas de ácido nucleico incluem vectores e construções que contêm polinucleótidos que codificam os péptidos e pepticorpos da presente invenção, bem como variantes e derivados de péptido e pepticorpo. Moléculas de ácido nucleico exemplares são proporcionadas nos Exemplos a seguir. Técnicas de ADN recombinante também proporcionam um método conveniente para preparar pepticorpos de comprimento completo e outras agentes de ligação de polipéptido grandes da presente invenção, ou fragmentos do mesmo. Um polinucleótido que codifica o pepticorpo ou fragmento pode ser inserido num vector de expressão, que por sua vez pode ser inserido numa célula hospedeira para a produção dos agentes de ligação da presente invenção. A preparação de pepticorpos exemplares da presente invenção é descrita no Exemplo 2 a seguir.
Uma variedade de sistemas vector de expressão/hospedeiro podem ser utilizados para expressar os péptidos e pepticorpos da invenção. Estes sistemas incluem, mas não são limitados a microrganismos tais como bactérias transformadas com bacteriófago recombinante, vectores de expressão de ADN em plasmídeo ou cosmídeo; levedura transformada com vectores de expressão em levedura; sistemas de célula de insecto infectados com vectores de expressão em virus (por exemplo, baculovirus); sistemas de 46 célula vegetal transfectados com vectores de expressão em vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão em bactéria (por exemplo, plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de célula animal. Uma linha de célula hospedeira preferida é E.coli estirpe 2596 (ATCC n° 202174), utilizado para expressão de pepticorpos como é descrito a seguir no Exemplo 2. As células de mamíferos que são úteis em produção de proteína recombinantes incluem, mas não são limitados a células VERO, células HeLa, linhas de célula Ovário de hamster chinês (CHO), células COS (tal como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 e 293. O termo "vector de expressão" refere-se a um plasmídeo, fago, vírus ou vector, para expressar um polipéptido a partir de uma sequência de polinucleótidos. Um vector de expressão pode compreender uma unidade transcricional que compreende uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos que têm um papel regulador em expressão génica, por exemplo, promotores ou estimuladores, (2) uma estrutura ou sequência que codifica o agente de ligação que é transcrito em ARNm e traduzido em proteína, e (3) sequências iniciação e terminação de transcrição apropriadas. Unidades estruturais pretendidas para a utilização em sistemas de levedura ou eucariótico de expressão preferentemente incluem uma sequência líder que permite a secreção extracelular de proteína traduzida por uma célula hospedeira. Alternativamente, onde a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, pode incluir um resíduo metionilo amino terminal. Este resíduo pode ou não pode ser clivado subsequentemente da proteína recombinante expressa para proporcionar um produto de péptido final.
Por exemplo, os péptidos e pepticorpos podem ser expressos de maneira recombinante em levedura utilizando um 47 sistema de expressão comercialmente disponível, por exemplo, o sistema de expressão Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), seguindo as instruções do fabricante. Este sistema também se baseia na sequência pré-proalfa para dirigir a secreção, mas transcrição do inserto é dirigida pelo promotor álcool oxidase (A0X1) após indução por metanol. 0 péptido secretado é purificado a partir do meio de crescimento de levedura utilizando os métodos utilizados para purificar o péptido a partir de sobrenadantes de células bacterianas e de mamíferos.
Alternativamente, o cDNA que codifica o péptido e pepticorpos podem ser clonado no vector de expressão de baculovírus pVLl393 (PharMingen, San Diego, CA). Este vector pode ser utilizado de acordo com as orientações do fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda em meios sF9 livre de proteína e para produzir proteína recombinante. A proteína recombinante pode ser purificada e concentrada a partir dos meios utilizando uma coluna de heparina-Sepharose (Pharmacia).
Alternativamente, o péptido ou pepticorpo pode ser expresso num sistema de insecto. Sistemas de insecto para a expressão de proteína são bem conhecidos por aqueles peritos na especialidade. Num tal sistema, vírus da polihedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) podem ser utilizados como um vector para expressar genes estranhos em células Spodoptera frugiperda ou em Trichoplusia larvae. A sequência codificante de péptido pode ser clonada numa região não essencial do vírus, tais como o gene da polihedrina, e colocada sob controlo do promotor polihedrina. A inserção bem sucedida do péptido tornará o gene da polihedrina inactivo e produzem vírus recombinante que não possui coberta de proteína de coberta. Os vírus recombinantes podem ser utilizados para infectar células de S. frugiperda ou Trichoplusia larvae em que o péptido é expresso (Smith et al., J Virol 46: 584 (1983); 48
Engelhard et al., Proc Nat Acad Sei (USA) 91: 3224-7 (1994) ) .
Em outro exemplo, a sequência de ADN que eodifica o péptido pode ser amplificada por meio de PCR e clonado num vector apropriado, por exemplo, pGEX-3X (Pharmacia). 0 vector pGEX é desenhado para produzir uma proteína de fusão que compreende glutationa-S-transferase (GST), codificada pelo vector, e uma proteína codificada por um fragmento de ADN inserido no local de clonagem do vector. Os iniciadores para PCR podem ser gerados para incluir, por exemplo, um local de clivagem apropriado. Onde a fraeção de fusão é utilizado unicamente para facilitar a expressão ou é de outra forma não desejável como uma união ao péptido de interesse, a proteína de fusão recombinante pode então ser clivada a partir da porção GST da proteína de fusão. A construção de péptido de agente de ligação pGEX-3x/específico é transformada em células E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA), e transformantes individuais isolados e crescidos. ADN de plasmídeo de transformantes individuais podem ser purificados e parcialmente sequenciados utilizando um sequenciador automático para confirmar a presença do agente de ligação específico desejado que codifica o inserto de ácido nucleico na orientação apropriada. A proteína de fusão, que podem ser produzida como um corpo de inclusão insolúvel nas bactérias, pode ser purificada como segue. Células hospedeiras são colhidas por meio de centrifugação; lavadas em 0,15 M de NaCl, 10 mM de Tris, pH 8, 1 mM de EDTA; e tratadas com 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos a temperatura ambiente. O lisado pode ser clarificado por meio de sonicação, e os detritos celulares podem ser precipitados por meio de centrifugação durante 10 minutos a 12, 000 X g. O precipitado que contém a proteína de fusão pode ser ressuspenso em 50 mM de Tris, pH 8, e 10 mM de 49 EDTA, colocado em camadas sobre 50% de glicerol, e centrifugado durante 30 min. a 6000 X g. O precipitado pode ser ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato padrão (PBS) livre de Mg++ e Ca++. A proteína de fusão pode ser purificada adicionalmente fraccionando o precipitado ressuspenso num SDS-PAGE desnaturante (Sambrook et al., supra). O gel pode ser embebido em 0,4 M de KC1 para visualizar a proteína, que pode ser excindida e electroeluída em tampão de corrida em gel que não possui SDS. Se a GST/proteína de fusão é produzida em bactérias como um proteína solúvel, a mesma pode ser purificada utilizando o GST Purification Module (Pharmacia). A proteína de fusão pode ser submetida a digestão para clivar a GST do péptido da invenção. A reacção de digestão (20-40 mg de proteína de fusão, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg, Sigma) em 0,5 ml de PBS podem ser incubados durante 16-48 h a temperatura ambiente e carregados num gel de SDS-PAGE desnaturante para fraccionar os produtos de reacção. O gel pode ser embebido em 0,4 M de KC1 para visualizar a bandas de proteína. A identidade da banda de proteína correspondente ao esperado peso molecular do péptido pode ser confirmado por análise de sequência de aminoácidos utilizando um sequenciador automático (Applied Biosystems Modelo 473A, Foster City, CA). Alternativamente, a identidade pode ser confirmada realizando HPLC e/ou espectrometria de massas dos péptidos.
Alternativamente, uma sequência de ADN que codifica o péptido pode ser clonada num plasmídeo que contém um promotor desejado e, opcionalmente, uma sequência líder (Better et al., Science 240:1041-43 (1988)). A sequência desta construção pode ser confirmada por sequenciamento automático. O plasmídeo então pode ser transformado em E. coli estirpe MC1061 utilizando procedimentos padrão empregando a incubação em CaCl2 e tratamento de choque térmico das bactérias (Sambrook et al., supra). As 50 bactérias transformadas podem ser crescidas em meio LB complementado com carbenicilina, e a produção da proteina expressa podem ser induzida por crescimento num meio adequado. Se está presente, a sequência lider pode efectuar a secreção do péptido e ser clivada durante a secreção.
Sistemas de hospedeiro mamífero para a expressão de péptidos recombinantes e pepticorpos são bem conhecidos por aqueles peritos na especialidade. As estirpes de célula hospedeira podem ser escolhidos para uma capacidade particular para processar a proteína expressa ou produzir certas modificações pós-tradução que serão úteis em proporcionar actividade de proteína. Tal modificações da proteína incluem, mas não são limitados a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Diferentes células hospedeiras tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, e similares têm maquinaria celular específica e mecanismos característicos para tais actividades e pós-traducionais podem ser escolhidos para assegurar a correcta modificação e processamento da proteína estranha introduzida. É preferível que células transformadas sejam utilizadas para produção proteína de alto rendimento de longo prazo. Uma vez que tais células são transformadas com vectores que contêm marcadores seleccionáveis bem como o cassete de expressão desejado, as células podem ser permitidas que cresçam durante 1-2 dias em meios enriquecidos antes de que sejam trocadas para meios selectivos. O marcador seleccionável é desenhado para permitir o crescimento e recuperação de células que expressam de maneira bem sucedida as sequências introduzidas. Agrupamentos resistentes de células transformadas estáveis podem ser proliferadas utilizando técnicas de cultura de tecido apropriada para a linha celular empregada. 51 Vários sistemas de selecção podem ser utilizados para recuperar as células que foram transformadas para a produção de proteína recombinante. Tais sistemas de selecção incluem, mas não são limitados a, genes de HSV timidina quinase, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase, em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Também, resistência anti-metabolito pode ser utilizada como a base de selecção para dhfr que confere resistência a metotrexato; gpt que confere resistência a ácido micofenólico; neo que confere resistência ao aminoglicósido G418 e confere resistência a clorsulfuron; e hygro que confere resistência a higromicina. Adicional selectable genes que podem ser úteis incluir trpB, que permite a células utilizar indol em lugar de triptofano, ou hisD, que permite a células utilizar histinol em lugar de histidina. Marcadores que dão uma indicação visual para a identificação de transformantes incluem antocianinas, β-glucuronidase e seu substrato, GUS, e luciferase e seu substrato, luciferina.
Purificação e Redobramento de Agentes de ligação
Em alguns casos, os agentes de ligação tal como os péptidos e/ou pepticorpos desta invenção pode necessitar ser "redobrados" e oxidados num estrutura terciária apropriada e ligações dissulfeto geradas a fim de ser biologicamente activa. 0 redobramento pode ser conseguido utilizando um número de procedimentos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, exposição do agente de polipéptido solubilizado a um pH usualmente acima de 7 na presença de um agente caotrópico. A selecção de caótropo é similar às escolhas utilizadas para a solubilização do corpo de inclusão, no entanto um caótropo é tipicamente utilizado numa concentração mais baixa. Agentes caotrópicos exemplares são guanidina e ureia. Na maioria dos casos, a solução de redobramento/oxidação 52 também conterá um agente de redução mais sua forma oxidados numa razão específica para gerar um potencial redox particular que permite que o embaralhamento de dissulfeto para a formação de pontes de cisteína. Alguns pares redox comummente utilizados incluem cisteína/cistamina, glutationa/ditiobisGSH, cloreto cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT, e 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. Em muitos casos, um co-solvente podem ser utilizado para aumentar a eficiência do redobramento. Co-solventes comummente utilizados incluem glicerol, polietilenoglicol de diversos pesos moleculares, e arginina.
Pode ser desejável purificar os péptidos e pepticorpos da presente invenção. Técnicas de purificação de proteína são bem conhecidas por aqueles peritos na especialidade. Estas técnicas envolvem, num nível, o fraccionamento bruto das fracções proteináceas e não proteináceas. Tendo separado o péptido e/ou pepticorpo das outras proteínas, o péptido ou polipéptido de interesse pode ser purificado adicionalmente utilizando técnicas cromatográficas e electroforéticas para conseguir a purificação parcial ou complete (ou purificação ate a homogeneidade). Os métodos analíticos em particular adequados para a preparação de pepticorpos e péptidos ou a presente invenção são cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão; electroforese em gel de poliacrilamida; enfoque isoelétrico. Um método particularmente eficiente de purificar péptidos é cromatografia líquida de proteína rápida ou mesmo HPLC.
Certos aspectos da presente invenção referem-se à purificação, e em particular formas de realização, a purificação substancial, de um pepticorpo ou péptido da presente invenção. 0 termo "pepticorpo ou péptido purificados" como é utilizado no presente documento, tem a intenção de se referir a uma composição, que pode ser isolada de outros componentes, em que o pepticorpo ou 53 péptido é purificado a qualquer grau relativa a seu estado obtenível de forma natural. Um péptido ou pepticorpo purificado portanto também se refere a um pepticorpo ou péptido que é livre do ambiente em que pode ocorrer de forma natural.
Geralmente, "purificada" se referirá a uma composição de péptido ou pepticorpo que foi submetida a fraccionamento para remover diversos outros componentes, e cuja composição substancialmente retém sua actividade biológica expressa. Onde o termo "substancialmente purificada" é utilizado, esta designação se referirá a um composição de péptido ou pepticorpo em que o pepticorpo ou péptido forma o principal componente da composição, tal como constituindo aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% ou mais das proteínas na composição.
Diversos métodos para quantificar o grau de purificação do péptido ou pepticorpo serão conhecidos por aqueles peritos na especialidade a luz da presente divulgação. Estes incluem, por exemplo, determinar a actividade de ligação especifica de uma fracção nativa, ou calcular a quantidade de péptido ou pepticorpo dentro de uma fracção por meio de análise de SDS/PAGE. Um método preferido para calcular a pureza de uma fracção de péptido ou pepticorpo é calcular a actividade de ligação da fracção, para compará-la à actividade de ligação do extracto inicial, e assim calcular o grau de purificação, no presente documento calculado por um "número de vezes de purificação." As unidades reais utilizadas para representar a quantidade de actividade de ligação irá, obviamente, depender da técnica de ensaio particular escolhida para seguir a purificação e se ou não o pepticorpo ou péptido exibem um actividade de ligação detectável.
Diversas técnicas adequadas para utilização em purificação serão bem conhecidas por aqueles peritos na 54 especialidade. Estas incluem, por exemplo, precipitação com sulfato de amónio, PEG, anticorpos (imunoprecipitação) e similares ou por desnaturação térmica, seguida por meio de centrifugação; etapas de cromatografia tais como cromatografia de afinidade (por exemplo, Protein-A-Sepharose), permuta iónica, filtração em gel, fase reversa, hidroxilapatita e cromatografia de afinidade; enfoque isoelétrico; electroforese em gel; e combinações de tal e outras técnicas. Como é geralmente conhecido na técnica, acredita-se que a ordem de condução das diversas etapas de purificação pode ser mudada, ou que certas etapas podem ser omitidas, e ainda resultar num método adequado para a preparação de um agente de ligação substancialmente purificado. Não existe um requerimento geral que os agentes de ligação da presente invenção sempre sejam proporcionados em seu estado mais purificado. De facto, é contemplado que produtos do agente de ligação menos substancialmente purificados terão utilidade em certas formas de realização. A purificação parcial podem ser conseguida utilizando menos etapas de purificação em combinação, ou utilizando diferentes formas do mesmo esquema geral de purificação. Por exemplo, é apreciado que um cromatografia de coluna de permuta catiónica realizada utilizando um aparelho de HPLC geralmente resultará numa quantidade de "vezes" superior de purificação que a mesma técnica utilizando um sistema de cromatografia de baixa pressão. Métodos que exibem um menos grau de purificação relativa pode ter vantagens em recuperação total do péptido ou pepticorpo, ou na manutenção actividade de ligação do péptido ou pepticorpo. É conhecido que a migração de um péptido ou polipéptido pode variar, algumas vezes significativamente, com diferentes condições de SDS/PAGE (Capaldi et al., Biochem Biophys Res Comm, 76: 425 (1977)). Portanto, será apreciado que sob condições de electroforese diferentes, os 55 pesos moleculares aparentes de produtos de expressão de agente de ligação purificados ou parcialmente purificados pode variar.
Actividade de Agentes de ligação a miostatina
Após a construção dos agentes de ligação da presente invenção, os mesmos são testadas para sua capacidade de se ligar a miostatina e inibem ou bloquear a actividade de miostatina. Qualquer número de ensaios ou testes em animal podem ser utilizados para determinar a capacidade do agente para inibir ou bloquear actividade de miostatina. Diversos ensaios utilizados para caracterizar os péptidos e pepticorpos da presente invenção são descritos nos Exemplos a seguir. Um ensaio é o ensaio C2C12 pMARE-luc que utiliza uma linha celular sensivel a miostatina (mioblastos C2C12) transfectada com um vector repórter de luciferase que contém elementos de resposta a miostatina/activina (MARE). Os pepticorpos exemplares são ensaiados por meio de pré-incubação de uma série de diluições de pepticorpo com miostatina, e então expondo as células à mistura de incubação. A actividade de luciferase resultante é determinada, e uma curva de titulação é gerada a partir da série de diluições de pepticorpo. A CI50 (a concentração de pepticorpo para conseguir 50% de inibição da actividade de miostatina como medida pela actividade de luciferase) foi então determinada. Um segundo ensaio descrito a seguir é um ensaio BIAcore® para determinar os parâmetros cinéticos ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação), e KD (constante do equilíbrio de dissociação) para os agentes de ligação a miostatina. Constantes do equilíbrio de dissociação inferiores (KD, expressa em nM) indicaram uma afinidade superior do pepticorpo para miostatina. Ensaios adicionais incluem ensaios de bloqueio, para determinar se um agente de ligação tal como um pepticorpo é neutralizante (previne a ligação de miostatina a seu receptor), ou não neutralizante (não previne a 56 ligação de miostatina a seu receptor); ensaios de selectividade, que determinam se os agentes de ligação da presente invenção ligam selectivamente a miostatina e não a outros membros da familia TGFp; e KinEx A™ ensaios ou ensaios de equilíbrio a base de solução, que também determina KD e são considerados que são mais sensíveis em algumas circunstâncias. Estes ensaios são descritos no Exemplo 3. A Figura 1 mostra a ΟΙ50 de um péptido em comparação com a CI50 da forma de pepticorpo do péptido. Isto demonstra que o pepticorpo é significativamente mais efectivo em inibir a actividade de miostatina que o péptido sozinho. Além disso, pepticorpos maturados por afinidade geralmente exibem valores de Ci5o e KD melhorados em comparação com os péptidos e pepticorpos de origem. Os valores de CI50 para um número de pepticorpos maturados por afinidade exemplares são mostrados no Quadro VII. 0 Exemplo 7 a seguir. Adicionalmente, em alguns casos, fazendo uma versão 2x de um pepticorpo, onde dois péptidos são unidos em tandem, aumentam a actividade do pepticorpo tanto in vitro como in vivo.
As actividades In vivo são demonstradas nos Exemplos a seguir. As actividades dos agentes de ligação incluem a actividade anabólica aumentando a massa muscular magra em modelos animais, bem como diminuição da massa adiposa em relação a peso corporal total em modelos animais tratados, e aumento de resistência muscular em modelos animais. Utilizações dos agentes de ligação a miostatina
Os agentes de ligação a miostatina da presente invenção ligam-se a miostatina e bloqueiam ou inibem a sinalização de miostatina dentro de células alvejadas. A presente invenção proporciona reagentes para utilização na redução da quantidade ou actividade de miostatina num animal pela administração de uma dosagem efectiva de um ou mais agentes de ligação a miostatina ao animal. Num 57 aspecto, a presente invenção proporciona reagentes para utilização em tratamento de distúrbios relacionados a miostatina num animal que compreende a administração de uma dosagem efectiva de um ou mais agentes de ligação ao animal. Estes distúrbios relacionados a miostatina incluem, mas não são limitados a diversas formas de atrofia muscular, bem como distúrbios metabólicos tais como diabetes e distúrbios relacionados, e doenças degenerativas do osso tais como osteoporose.
Como é mostrado no Exemplo 8 a seguir, pepticorpos exemplares da presente invenção dramaticamente aumentam a massa muscular magra no modelo de ratinho CDl nu/nu. Esta in vivo actividade correlaciona-se à ligação in vitro e actividade inibidora descrita a seguir para os mesmos pepticorpos.
Distúrbios de atrofia muscular incluem distrofias tais como distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progressiva, distrofia muscular de tipo Becker, distrofia muscular Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Erb, e distrofia muscular neuroaxonal infantil. Por exemplo, bloqueando a miostatina através da utilização de anticorpos in vivo melhorados o fenótipo distrófico do modelo de ratinho mdx de distrofia muscular de Duchenne (Bogdanovich et al, Nature 420, 28 (2002)). Os pepticorpos da presente invenção aumentam a massa muscular magra como uma percentagem de peso corporal e diminuem a massa adiposa como percentagem de peso corporal quando foram administrados a um modelo de ratinho mdx envelhecido.
Os distúrbios de atrofia muscular adicionais surgem de doenças crónicas tal como esclerose lateral amiotrófica, doença pulmonar obstrutiva congestiva, cancro, SIDA, insuficiência renal, e artrite reumatóide. Por exemplo, caquexia ou atrofia muscular e perda de peso corporal foi induzida em ratinhos sem pêlo atimicos por um miostatina administrada sistemicamente (Zimmers et al., supra). Em 58 outro exemplo, encontrou-se que concentrações em soro e intramuscular de proteína imunoreactiva a miostatina são aumentadas em homens que exibem atrofia muscular relacionada com SIDA e foi inversamente relacionada com massa livre de gordura (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)). Patologias adicionais que resultam em atrofia muscular pode surgir da inactividade devido a deficiência tal como confinamento numa cadeira de rodas, repouso prolongado na cama devido a acidente vascular cerebral, indisposição, lesão da medula espinhal, fractura óssea ou traumatismo, e atrofia muscular num ambiente de microgravidade (voo espacial). Por exemplo, encontrou-se que a proteína imunoreactiva a miostatina em plasma foi aumenta após repouso em cama prolongado (Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2):11(1999). Encontrou-se também que os músculos de ratos expostos a um ambiente de microgravidade durante um voo de lançadeira espacial expressou uma quantidade aumentada de miostatina em comparação com os músculos de ratos que foram não expostos (Lalani et al., J.Endocrin 167 (3):417-28 (2000)).
Além disso, aumentos relacionados com a idade em razões de gordura em relação a músculo, e atrofia muscular relacionada com a idade parece estar relacionada a miostatina. Por exemplo, a proteína imunoreactiva a miostatina em soro média aumentou com idade em grupos de homens e mulheres jovens (19-35 anos de idade), de meia idade (36-75 anos de idade), e idosos (76-92 anos de idade), enquanto a massa muscular média e massa livre de gordura diminuíram com idade nestes grupos (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). Também foi mostrado que o silenciamento do gene da miostatina em ratinhos aumentou a miogénese e diminuiu a adipogénese (Lin et al., Biochem Biophys Res Commun 291(3):701-6 (2002), que resulta em adultos com massa muscular aumentada e acumulação de gordura e secreção de leptina diminuída. Pepticorpos 59 exemplares melhoram a razão massa muscular magra em relação à gordura em ratinhos mdx envelhecidos como é mostrado a seguir.
Além disso, encontrou-se agora que miostatina é expressa em baixos níveis em músculo cardíaco e expressão é regulada positivamente após cardiomiócitos após enfarte (Sharma et al., J Célula Physiol. 180 (1):1-9 (1999)). Portanto, a redução dos níveis de miostatina no músculo cardíaco pode melhorar a recuperação de músculo cardíaco após enfarte. A miostatina também parece influenciar os distúrbios metabólicos incluindo diabetes tipo 2, diabetes mellitus não dependente de insulina, hiperglicemia, e obesidade. Por exemplo, a ausência de miostatina foi mostrada para melhorar os fenótipos obeso e diabético de dois modelos de ratinhos (Yen et al. supra). Foi demonstrado nos Exemplos a seguir que a diminuição de actividade de miostatina pela administração dos inibidores da presente invenção diminuirá a razão gordura em relação a músculo num animal, incluindo modelos animais envelhecidos. Portanto, a diminuição de composição de gordura pela administração dos inibidores da presente invenção melhorará diabetes, obesidade, e condições hiperglicémicas em animais.
Além disso, o aumento de massa muscular pela redução de níveis de miostatina pode melhorar resistência óssea e reduzem osteoporose e outras doenças ósseas degenerativas. Encontrou-se, por exemplo, que ratinhos deficientes em miostatina mostraram conteúdo mineral e densidade do úmero do ratinho aumentados e conteúdo mineral aumentado de ambos os ossos trabecular e cortical nas regiões onde os músculos se unem, bem como massa muscular aumentada (Hamrick et al. Calcif Tecido Int 71(1):63-8 (2002)). A presente invenção também proporciona métodos e reagentes para aumentar a massa muscular em animais para alimentação pela administração de uma dosagem efectiva do 60 agente de ligação a miostatina ao animal. Uma vez que o polipéptido de miostatina C terminal maturo é idêntico em todas espécies testadas, seria de se esperar que os agentes de ligação a miostatina sejam efectivo para aumentar a massa muscular e reduzir gordura em qualquer espécie agriculturalmente importante incluindo gado, galinha, perus, e porcos.
Os agentes de ligação da presente invenção podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos para potenciar seus efeitos terapêuticos ou diminuição de potenciais efeitos secundários. Os agentes de ligação da presente invenção possuem um ou mais desejável, mas inesperada combinação de propriedades para melhorar o valor terapêutico dos agentes. Estas propriedades incluem actividade aumentada, solubilidade aumentada, degradação reduzida, semivida aumentada, toxicidade reduzida, e imunogenicidade reduzida. Assim os agentes de ligação da presente invenção são úteis para regimes de tratamento estendidos. Além disso, as propriedades de hidrofilicidade e hidrofobicidade dos compostos da invenção são bem equilibrados, deste modo potenciando sua utilidade para utilizações tanto in vitro como especialmente in vivo. Especificamente, os compostos da invenção têm um apropriado grau de solubilidade em meios aquosos que permite a absorção e biodisponibilidade no corpo, enquanto também têm um grau de solubilidade em lipidos que permite aos compostos atravessar a membrana celular a um local de acção putativo, tal como uma massa muscular particular.
Os agentes de ligação da presente invenção são úteis para tratar um "sujeito" ou qualquer animal, incluindo seres humanos, quando são administrados numa dosagem efectiva numa composição adequada.
Além disso, os agentes de ligação a miostatina da presente invenção são úteis para detectar e quantificar 61 miostatina num número de ensaios. Estes ensaios são descritos em mais detalhe a seguir.
Em geral, os agentes de ligação da presente invenção são úteis como agentes de captura para ligar e imobilizar miostatina numa variedade de ensaios, similares a aqueles descritos, por exemplo, em Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., Nova Iorque (1993). 0 agente de ligação pode ser marcado de alguma maneira ou pode reagir com uma terceira molécula tal como um anticorpo anti-agente de ligação que é marcado para permitir que a miostatina seja detectada e quantificada. Por exemplo, um agente de ligação ou uma terceira molécula podem ser modificados com um fracção detectável, tal como biotina, que então pode ser ligada por uma quarta molécula, tal como estreptavidina marcada com enzima, ou outras proteínas. (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585(1997)).
Ao longo de qualquer ensaio particular, etapas de incubação e/ou lavagem podem ser requeridas após cada combinação de reagentes. Etapas de incubação podem variar desde aproximadamente 5 segundos até várias horas, preferentemente desde aproximadamente 5 minutos até aproximadamente 24 horas. No entanto, tempo de incubação dependerá do formado do ensaio, volume de solução, concentrações, e similares. Usualmente, os ensaios serão levados a cabo a temperatura ambiente, embora possam ser conduzidos ao longo de um intervalo de temperaturas.
Ensaios de ligação não competitivos:
Os ensaios de ligação podem ser do tipo não competitivo em que a quantidade de miostatina capturada é directamente medida. Por exemplo, num preferido ensaio "sanduíche", o agente de ligação pode ser ligado directamente a um substrato sólido onde é imobilizado. Estes agentes imobilizados então ligam-se a miostatina presente na amostra de teste. A miostatina imobilizada é 62 então ligada com um agente de marcação, tal como um anticorpo marcado contra miostatina, que pode ser detectado. Em outro preferido ensaio "sanduíche", um segundo agente específico para o agente de ligação pode ser adicionado que contém um fracção detectável, tal como biotina, a qual que uma terceira molécula marcada pode ligar-se especificamente, tal como estreptavidina. (Veja-se, Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988).
Ensaios de ligação competitivos:
Ensaios de ligação podem ser do tipo competitivo. A quantidade de miostatina presente na amostra é medida indirectamente medindo a quantidade de miostatina deslocada, ou retirada por competição, de um agente de ligação pela miostatina presente na amostra. Num ensaio de ligação competitivo preferido, uma quantidade conhecida de miostatina, usualmente marcada, é adicionada à amostra e a amostra é então colocada em contacto com o agente de ligação. A quantidade de miostatina marcada ligada ao agente de ligação é inversamente proporcional à concentração de miostatina presente na amostra, (seguindo os protocolos encontrados em, por exemplo Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, pp. 579-583, supra).
Em outro ensaio de ligação competitivo preferido, o agente de ligação é imobilizado num substrato sólido. A quantidade de miostatina ligada ao agente de ligação pode ser determinada ou medindo a quantidade de miostatina presente num complexo miostatina/agente de ligação, ou alternativamente medindo a quantidade de miostatina não complexada restante.
Outros Ensaios de ligação A presente invenção também proporciona métodos Western blot para detectar ou quantificar a presença de miostatina numa amostra. A técnica geralmente compreende 63 separar proteínas amostra por meio de electroforese em gel com base no peso molecular e transferir as proteínas a um suporte sólido adequado, tal como filtro de nitrocelulose, um filtro de nylon, ou filtro de nylon derivatizado. A amostra é incubada com os agentes de ligação ou fragmentos dos mesmos que se ligam a miostatina e o complexo resultante é detectado. Estes de ligação podem ser directamente marcados ou alternativamente podem ser subsequentemente detectados utilizando anticorpos marcados que especificamente se ligam ao agente de ligação.
Ensaios de diagnóstico
Os agentes de ligação ou fragmentos do mesmo da presente invenção podem ser úteis para o diagnóstico de condições ou doenças caracterizadas por quantidades aumentadas de miostatina. Ensaios de diagnóstico para altos níveis de miostatina incluem métodos que utilizam um agente de ligação e um marcador para detectar miostatina em fluidos corporais humanos, extractos de células ou extractos de tecido específico. Por exemplo, níveis em soro de miostatina podem ser medidos num indivíduo ao longo do tempo para determinar o surgimento de atrofia muscular associada a envelhecimento ou inactividade, como é descrito, por exemplo, em Yarasheski et al., supra. Níveis aumentados de miostatina foram mostrados para correlacionar com massa muscular diminuída média e massa livre de gordura em grupos de homens e mulheres de idades crescentes (Yarasheski et al., supra). Os agentes de ligação da presente invenção podem ser úteis para monitorizar aumentos ou diminuições nos níveis de miostatina com um dado indivíduo ao longo do tempo, por exemplo. Os agentes de ligação podem ser utilizados em tais ensaios com ou sem modificação. Num ensaio de diagnóstico preferido, os agentes de ligação serão marcados unindo, por exemplo, um marcador ou uma molécula repórter. Uma ampla variedade de marcadores e moléculas repórter são conhecidas, algumas das 64 quais já foram descritas no presente documento. Em particular, a presente invenção é útil para o diagnóstico de doença humana.
Uma variedade de protocolos para medir proteínas miostatina utilizando agentes de ligação de miostatina é conhecida na técnica.
Exemplos incluem ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e classificação de células activadas fluorescentes (FACS).
Para aplicações de diagnóstico, em certas formas de realização os agentes de ligação da presente invenção tipicamente serão marcados com uma fracção detectável. A fracção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, ou directamente ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a fracção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ou luciferina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, pgalactosidase, ou peroxidase do rábano (Bayer et al., Met Enz, 184: 138 (1990)).
Composições farmacêuticas
Composições farmacêuticas de agentes de ligação a miostatina tal como pepticorpos descrito no presente documento estão dentro do âmbito da presente invenção. Tais composições compreendem uma quantidade efectiva terapeuticamente ou profilaticamente de um agente de ligação a miostatina, fragmento, variante, ou derivado do mesmo como é descrito no presente documento, em mistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização preferida, as composições farmacêuticas compreendem agentes de ligação antagonistas que inibem miostatina parcialmente ou completamente em mistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, os agentes 65 de ligação a miostatina serão suficientemente purificados para administração a um animal. A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, limpidez, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou libertação, adsorção ou penetração da composição. Materiais de formulação adequados incluem, mas não são limitados a, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfeto de sódio ou hidrogeno-sulfeto fr sódio); tampões (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, outras ácidos orgânicos); agentes de carga (tal como manitol ou glicina), agentes quelantes (tal como ácido etilenodiamina-tetraacético (EDTA)); agentes complexantes (tal como cafeína, polivinilprirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); recheios; monossacáridos; dissacáridos e outros hidratos de carbono (tal como glicose, manose, ou dextrinas); proteínas (tal como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas); corantes; agentes aromatizantes e de diluição; agentes emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de baixo peso molecular; contraiões formadores de sal (tal como sódio); conservantes (tais como, cloreto de benzalcónio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogénio); solventes (tal como glicerina, propileno glicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcar (tal como manitol ou sorbitol); agente de suspensão; tensioactivos ou agentes humectantes (tal como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tais como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores da 66 estabilidade (sacarose ou sorbitol); agentes potenciadores da tonicidade (tal como haletos de metal alcalino (preferentemente cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); distribuição veículos; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). A composição farmacêutica óptima será determinado por um perito na especialidade dependendo de, por exemplo, a via de administração pretendida, formato de distribuição, e a dosagem desejada. Veja-se por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, a taxa de libertação in vivo, e taxa de depuração in vivo do agente de ligação. O veículo ou portador primário numa composição farmacêutica pode ser de natureza ou aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou portador adequado pode ser água para injecção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente complementado com outras materiais comuns em composições para parentérica administração. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina de soro são veículos exemplares adicionais. Outras composições farmacêuticas exemplares compreendem tampão Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, ou tampão acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pode ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado. Portanto, numa forma de realização da presente invenção, as composições de agente de ligação podem ser preparados para armazenagem misturando a composição seleccionada que têm o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de um torta liofilizada ou uma solução aquosa. Além disso, o produto de agente de ligação pode ser formulado como um 67 liofilizado utilizando excipientes apropriados tais como sacarose.
As composições farmacêuticas podem ser seleccionadas para administração parentérica. Alternativamente, as composições podem ser seleccionadas para administração por inalação ou entérica tal como oralmente, por via auricular, oftalmicamente, rectalmente, ou vaginalmente. A preparação de tal composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da pericia na especialidade.
Os componentes da formulação são presentes em concentrações que são aceitáveis para o local de administração. Por exemplo, tampões são utilizados para manter a composição a pH fisiológico ou a pH ligeiramente baixo, tipicamente dentro de um intervalo de pH de desde aproximadamente 5 até aproximadamente 8.
Quando a administração parentérica é contemplada, as composições terapêuticas para utilização nesta invenção podem ser na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável livre de pirogénio que compreende o agente de ligação desejado num veiculo farmaceuticamente aceitável. Um veiculo em particular adequado para injecção parentérica é água destilada estéril em que um agente de ligação é formulado como uma solução estéril, isotónica, conservada apropriadamente. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tal como microesferas injectáveis, partículas bio-erodíveis, compostos poliméricos (poliácido láctico, ácido poliglicólico), pérolas, ou lipossomas, que proporciona a libertação controlada ou sustentada do produto que pode então ser distribuído via uma injecção depot. 0 ácido hialurónico pode também ser utilizado, e este pode ter o efeito de que promover duração sustentada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos de distribuição de fármaco implantáveis. 68
Em outro aspecto, formulações farmacêuticas adequadas para administração parentérica podem ser formuladas em soluções aquosas, preferentemente em tampões fisiologicamente compatível tais como solução de Hank, solução de ringer, ou solução salina fisiologicamente tamponada. Suspensões de injecção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol, ou dextrano. Adicionalmente, suspensões dos compostos activos podem ser preparados como suspensões de injecção oleosa apropriada. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordos, tais como óleo de gergelim, ou ésteres de ácido gordo sintéticos, tais como oleato de etilo, triglicerídeos, ou lipossomas. Polímeros de amino não lipídicos policatiónicos podem também ser utilizados para distribuição. Opcionalmente, a suspensão pode também conter adequados estabilizantes ou agentes para aumentar a solubilidade dos compostos e permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Numa outra forma de realização, uma composição farmacêutica podem ser formulada para inalação. Por exemplo, um agente de ligação pode ser formulado como um pó seco para inalação. Soluções de inalação de polipéptido ou molécula de ácido nucleico podem também ser formuladas com um propulsor para distribuição aerossol. Em ainda uma outra forma de realização, soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é adicionalmente descrita no depósito PCT No. PCT/US94/001875, que descreve distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas. É também contemplado que certas formulações podem ser administradas oralmente. Numa forma de realização da presente invenção, moléculas de agente de ligação que são administradas deste modo podem ser formuladas com ou sem aqueles portadores costumeiramente utilizado na composição de formas farmacêuticas sólidas tais como comprimidos e 69 cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser desenhada para libertar a porção active da formulação no ponto no tracto gastrointestinal quando biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistemica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da molécula do agente de ligação. Diluentes, aromatizantes, ceras com baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agente de suspensão, agentes desintegrantes de comprimido, e ligadores pode também ser empregados.
Composições farmacêuticas para administração oral podem também ser formuladas utilizando portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para administração oral. Tais portadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões, e similares, para ingestão pelo paciente.
Preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas através de combinação compostos activos com excipiente sólido e processamento da resultante mistura de grânulos (opcionalmente, após trituração) para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Auxiliares adequados podem ser adicionados, se for desejado. Excipientes adequados incluem hidrato de carbono ou recheios de proteína, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, e sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata, ou outras plantas; celulose, tal como metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, ou carboximetilcelulose de sódio; gomas, incluindo arábica e tragacanto; e proteínas, tais como gelatina e colagénio. Se for desejado, agentes desintegrantes ou solubilizantes podem ser adicionados, tal como a polivinil prirrolidona reticulada, agar, e ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio. Núcleos de drageia podem ser utilizados em conjunto com revestimentos adequados, tais como soluções de açúcar, 70 concentradas que pode também conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenoglicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solvente. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drageia para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade de composto activo, isto é, dosagem.
Preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente também incluem cápsulas duras feitas de gelatina, bem como cápsulas moles, seladas feitas de gelatina e um revestimento, tal como glicerol ou sorbitol. Cápsulas duras podem conter ingredientes activos misturados com recheios ou ligadores, tais como lactose ou amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, líquidos, ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizantes.
Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade efectiva de agente de ligação numa mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para o fabrico de comprimidos. Dissolvendo os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, soluções podem ser preparadas em forma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, mas não são limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tal como amido, gelatina, ou goma arábica; ou agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.
Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para aqueles peritos na especialidade, incluindo formulações envolvendo moléculas do agente de ligação em formulações de distribuição sustentada ou controlada. Técnicas para formular uma variedade de outros meios de distribuição sustentada ou controlada, tais como portadores 71 em lipossoma, bio-erodíveis micropartículas ou pérolas porosas e injecções depot, são também conhecidas a aqueles peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, o documento PCT/US93/00829 que descreve libertação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a distribuição de composições farmacêuticas. Exemplos adicionais de preparações de libertação sustentada incluem matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos formados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Matrizes de libertação sustentada pode incluir poliésteres, hidrogéis, poliláctidos (documento U.S. 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech.,12: 98-105(1982)), acetato de etileno vinilo (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). As composições de libertação sustentada também incluem lipossomas, que podem ser preparados por meio de qualquer de diversos métodos conhecidos na técnica. Veja-se , por exemplo, Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949. A composição farmacêutica a ser utilizada para administração in vivo tipicamente deve ser estéril. Isto pode ser conseguido por meio de filtração através de membranas de filtração estéreis. Onde a composição é liofilizada, esterilização utilizando este método pode ser conduzida ou antes de ou depois da liofilização e reconstituição. A composição para administração parentérica pode ser armazenada em forma liofilizado ou em solução. Além disso, composições parentéricas geralmente são colocadas num recipiente que têm uma porta de aceso estéril, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou 72 frasco que têm uma tampa furável por uma agulha de injecção hipodérmica.
Uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, podem ser armazenada em frascos estéreis como um solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou um desidratado ou pó liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas ou numa forma pronta para utilização ou numa forma (por exemplo, liofilizado) que requer reconstituição antes da administração.
Numa forma de realização específica, a presente invenção é dirigida a kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Os kits podem cada um conter ambos um primeiro recipiente que tem uma proteína seca e um segundo recipiente que têm um formulação aquosa. Também estão incluídos dentro do escopo desta invenção kits que contêm seringas únicas e de multi-câmaras pré-carregadas (por exemplo, seringas de líquidos e lioseringas).
Uma quantidade efectiva de uma composição farmacêutica para ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, dos objectivos e contexto terapêuticos. Um perito na especialidade apreciará que os níveis de dosagem apropriados para tratamento assim variarão dependendo, em parte, da molécula administrada, a indicação para que a molécula do agente de ligação é sendo utilizada, a via de administração, e o tamanho (peso corporal, superfície do corpo ou tamanho do órgão) e condição (a idade e saúde geral) do paciente. Em consequência, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico óptimo. Uma dosagem típica pode variar desde aproximadamente 0,1 mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados anteriormente. Em outras formas de realização, a dosagem pode variar desde 0,1 mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg; ou de 1 mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg; ou 5 mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg. 73
Para qualquer composto, a dose terapeuticamente efectiva podem ser estimada inicialmente ou em ensaios de cultura de célula ou em modelos animais tais como ratinhos, ratos, coelhos, cães, porcos, ou macacos. Um modelo animal pode também ser utilizado para determinar o intervalo de concentração apropriado e a via de administração. Tal informação então pode ser utilizada para determinar doses e vias para administração úteis em seres humanos. A dosagem exacta será determinada em luz de factores relacionados ao sujeito que requer tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar niveis suficientes do composto activo ou para manter o efeito desejado. Factores que podem ser levados em consideração incluem a gravidade da estado de doença, a saúde geral do sujeito, a idade, peso, e género do sujeito, tempo e frequência de administração, combinação(ões) de fármaco, sensibilidades de reacção, e resposta a terapêutica. Composições farmacêuticas de longa acção podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana, ou bissemanalmente dependendo da semivida e taxa de depuração da formulação particular. A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da molécula do agente de ligação na formulação utilizada. Tipicamente, uma composição é administrada até que uma dosagem é alcançada que consegue o efeito desejado. A composição pode portanto ser administrada como um única dose, ou como múltiplas doses (na mesma ou diferentes concentrações/dosagens) ao longo do tempo, ou como uma infusão continua. Refinamento adicional da dosagem apropriada é feito rotineiramente. Dosagens apropriadas podem ser determinadas através da utilização de dados de dose-resposta apropriados. A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, oralmente, através de injecção por vias intravenosa, 74 intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intraarterial, intraportal, intralesional, meios intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, uretral, vaginal, ou rectal, por sistemas de libertação sustentada ou por dispositivos de implantação. Onde desejada, as composições podem ser administrados por injecção em bolus ou continuamente por infusão, ou por dispositivo de implantação.
Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode ser administrada localmente via implantação de uma membrana, esponja, ou material outro apropriado no gual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Onde um dispositivo de implantação é utilizado, o dispositivo pode ser implantado em gualguer tecido ou órgão adeguado, e a distribuição da molécula desejada podem ser via difusão, bolus de libertação no tempo, ou administração continua.
Em alguns casos, pode ser desejável utilizar composições farmacêuticas de uma ex vivo. Em tais casos, células, tecidos, ou órgãos gue foram do paciente são expostos às composições farmacêuticas após o gue as células, tecidos e/ou órgãos são subseguentemente implantadas de volta no paciente.
Em outros casos, um agente de ligação da presente invenção tal como um pepticorpo podem ser distribuídos implantando certas células gue foram modificadas por engenharia genética, utilizando métodos tais como agueles descritos no presente documento, para expressar e secretar o polipéptido. Tal células podem ser células animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas, ou xenogénicas. Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas. A fim de diminuir a oportunidade de uma resposta imune, as células podem ser encapsuladas para evitar infiltração de tecidos circundantes. Os materiais 75 encapsulamento são tipicamente inclusões ou membranas biocompatíveis, semi-permeáveis poliméricas que permitem a libertação do(s) produto(s) de proteína, mas previnem a destruição da células pelo sistema imune do paciente ou por outros factores prejudiciais dos tecidos circundantes.
Composições farmacêuticas que contêm os agentes de ligação da presente invenção são administradas a um sujeito para tratar qualquer distúrbio relacionado a miostatina. Estes incluem distúrbios de atrofia muscular incluindo, mas não limitado a distrofia muscular, atrofia muscular em cancro, SIDA, atrofia muscular, artrite reumatóide, insuficiência renal/uremia, insuficiência cardíaca crónica, repouso em cama prolongado, lesão da medula espinhal, acidente vascular cerebral, e envelhecimento relacionado a sarcopenia. Em adição a composições são administrados para tratar obesidade, diabetes, hiperglicemia, e aumentar densidade óssea, A invenção tendo sido descrita, os seguintes exemplos são oferecidos como forma de ilustração, e não limitação. Somente estes péptidos mencionados nos Exemplos que compreendem as sequências de aminoácidos como expostas na SEQ ID NO : 353 são formas de realização da presente invenção. Todos os outros péptidos são mencionados para propósitos de ilustração somente.
Exemplo 1
Identificação de péptidos de ligação a miostatina
Três bibliotecas de fago filamentosos, TN8-IX (5X1O9 transformantes independentes), TN12-I (1,4X109 transformantes independentes), e linear (2,3X109 transformantes independentes) (Dyax Corp.) foram utilizadas para seleccionar para fago de ligação a miostatina. Cada biblioteca foi incubada sobre superfícies revestidas com miostatina e submetida a diferentes condições de selecção: eluição não específica, e eluição específica utilizando 76 quimera de receptor IIB/Fc de activina humana recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), ou eluição de pró-péptido de miostatina como será descrito a seguir. Para todas as três bibliotecas, os fagos foram eluidos de uma maneira não especifica para a primeira série de selecção, enquanto o receptor e a pró-miostatina foram utilizados na segunda e terceira séries de selecção. Os procedimentos de selecção foram levados a cabo como será descrito a seguir. Preparação de miostatina A proteina miostatina foi produzida de maneira recombinante na E. coli K-12 estirpe 2596 (ATCC n° 202174) como segue. Os polinucleótidos que codificam a molécula de pró-miostatina humana foram clonados no vector de expressão pAMG21 (ATCC No. 98113), que foi derivado do vector de expressão pCFMl656 (ATCC No. 69576) e o sistema de vector de expressão descrito na Patente dos Estados Unidos No. 4.710.473, seguindo o procedimento descrito no Pedido de Patente Internacional Publicado WO 00/24782. Os polinucleótidos que codificam pró-miostatina foram obtidos de um vector de expressão de mamíferos. A região codificante foi amplificada utilizando um método de PCR padrão e os seguintes iniciadores de PCR para introduzir o local de restrição para NdeI e BamRI. iniciador 5 ' : 5 ' -GAGAGAGAGCATATGAATGAGAACAGTGAGCAAAAAG-3 ' (Seq ID No: 292) iniciador 3': 5'-AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC-3' (Seq ID No: 293) O produto de PCR e o vector foram digeridos com ambas as enzimas, misturadas e ligadas. O produto da ligação foi transformado em E. coli estirpe n°2596. As colónias individuais foram verificadas microscopicamente para expressão de proteina recombinante na forma de corpos de inclusão. O plasmideo foi isolado e sequenciado através da região codificante do gene recombinante para verificar fidelidade genética. 77 A pasta bacteriana foi gerada a partir de uma fermentação de 10 L utilizando um método descontinuo a 37°C. A cultura foi induzida com HSL numa densidade celular de 9,6 D06oo e colhida seis horas depois numa densidade de 104 D06oo· A pasta foi armazenada a -80°C. A pasta de E. coli que expressa a pró-miostatina foi lisada num microfluidificador a 16.000 psi, centrifugada para isolar a fracção de corpo de inclusão insolúvel. Os corpos de inclusão foram ressuspensos em cloridrato de guanidina que contém ditiotreitol e solubilizados a temperatura ambiente. Isto foi então diluído 30 vezes num tampão aquoso. A pró-miostatina redobrada foi então concentrada e permutada em tampão em 20 mM de Tris pH 8,0, e aplicada a uma coluna de permuta aniónica. A coluna de permuta aniónica foi eluída com um gradiente crescente de cloreto de sódio. As fracções que contêm pró-miostatina foram agrupadas. A pró-miostatina produzida em E.coli não possui os primeiros 23 aminoácidos e começa com uma metionina antes do resíduo 24 asparagina. Para produzir a miostatina matura, a pró-miostatina agrupada foi enzimaticamente clivada entre o pró-péptido e miostatina matura C terminal. A mistura resultante foi então aplicada a uma coluna C4-rpHPLC utilizando um gradiente crescente de acetonitrilo que contém 0,1% de ácido trifluoroacético. As fracções que contêm miostatina matura foram agrupadas e secas num speed-vac. A miostatina matura recombinante produzida de E. coli foi testada no ensaio à base de mioblasto C2C12 descrito a seguir e encontrou-se totalmente activa quando em comparação com miostatina murina recombinante comercialmente produzida num sistema de células de mamíferos (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota). A miostatina matura produzida por E.coli foi utilizada nos ensaios de apresentação em fagos e rastreio descritos a seguir.
Preparação de Tubos Revestidos com Miostatina 78 A miostatina foi imobilizada em Tubos Inumano” de 5 ml (NUNC) numa concentração de 8 ug de proteína miostatina em 1 ml de 0,1 M de tampão de carbonato de sódio (pH 9,6). O Tubo Immuno revestido com miostatina foi incubado com agitação orbital durante 1 hora a temperatura ambiente. O Tubo Immuno” revestido com miostatina foi então bloqueado por meio da adição de 5 ml de 2% de leite-PBS e incubando a temperatura ambiente durante 1 hora com rotação. O Tubo ΓΜ ,
Immuno revestido com miostatina resultante foi então lavado três vezes com PBS antes de ser submetido aos procedimentos de selecção. Os Tubos Immuno™ adicionais foram também preparados para selecções negativas (não miostatina). Para cada condição de selecção, de cinco a dez
TM
Tubos Immuno foram submetidos ao procedimento anterior excepto que os Tubos Immuno” foram revestidos com 1 ml de 2% de BSA-PBS ao invés de proteína miostatina.
Selecção Negativa
Para cada condição de selecção, aproximadamente 100 equivalentes de biblioteca aleatórios para bibliotecas de TN8-IX e TN12-I (5X1011 pfu para TN8-IX, e l,4XlOn pfu para TN12-I) e aproximadamente 10 equivalentes de biblioteca aleatórios para a biblioteca linear (2,3X1010 pfu) foram aliquotados da biblioteca stock e diluídos até 1 ml com PBST (PBS com 0,05% de Tween-20) . O 1 ml de stock de biblioteca diluído foi adicionado a um Tubo Immuno” preparado para a selecção negativa, e incubado durante 10 minutos a temperatura ambiente com agitação orbital. O sobrenadante de fago foi extraído e adicionado ao segundo Tubo Immuno” para outra etapa de selecção negativa. Neste sentido, cinco a dez etapas de selecção negativa foram realizadas.
Selecção para Ligação a Miostatina
Após a última etapa de selecção negativa anterior, o sobrenadante de fago foi adicionado aos Tubos Immuno™ revestidos com miostatina preparados. O Tubo Immuno™ foi 79 incubado com agitação orbital durante uma hora a temperatura ambiente, permitindo ao fago especifico ligar-se a miostatina. Depois, o sobrenadante foi descartado, o Tubo immuno™ foi lavado aproximadamente 15 vezes com 2% de leite-PBS, 10 vezes com PBST e duas vezes com PBS para as três séries de selecção com todas as três bibliotecas (TN8-lx, TN12-I, e Bibliotecas lineares) excepto que para a segunda série de selecções com bibliotecas TN8-IX e TN12-I, o Tubo Immuno™ foi lavado aproximadamente 14 vezes com 2% de leite-PBS, duas vezes com 2% de BSA-PBS, 10 vezes com PBST e uma vez com PBS.
Eluição não específica
Após a última etapa de lavagem, os fagos ligados foram eluídos do Tubo immuno™ por meio da adição de 1 ml de 100 mM de solução de trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) com 10 minutos de incubação com agitação orbital. 0 pH da solução que contém fago foi então neutralizado com 0,5 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,5).
Eluição de receptor (Receptor de Activina Humana) de fago ligado
Para a série 2 e 3, após a última etapa de lavagem, os fagos ligados foram eluídos do Tubo Immuno™ por meio da adição de 1 ml de 1 mM de proteína de receptor (quimera de receptor IIB/Fc de activina humana recombinante, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) com uma incubação de 1 hora para cada condição.
Eluição do pró-péptido de fago ligado
Para a série 2 e 3, após a última etapa de lavagem, os fagos ligados foram eluídos do Tubo Immune” por meio da adição de 1 ml de 1 mM de proteína de pró-péptido (feito como foi descrito anteriormente) com uma incubação de 1 hora para cada condição.
Amplificação de Fagos A cultura fresca de E.coli. (XL-1 Blue MRF') foi crescida até D0600 = 0,5 em meios LB que contêm 12,5 ug/ml 80 tetraciclina. Para cada condição de selecção, 20 ml desta cultura foi arrefecida em gelo e centrifugada. 0 precipitado de bactérias foi ressuspenso em 1 ml da solução de sais A min.
Cada mistura de métodos de eluição diferentes foi adicionada a uma amostra de bactérias concentrada e incubada a 37°C durante 15 minutos. 2 ml de meios NZCYM (2x NZCYM, 50 ug/ml de Ampicilina) foram adicionados a cada mistura e incubados a 37°C durante 15 minutos. A solução de 4 ml resultante foi colocada em placa numa placa de agar NZCYM grande que contém 50 ug/ml de ampicilina e incubada durante a noite a 37°C.
Cada uma das misturas de bactérias/fago que foi crescida durante a noite numa placa de agar NZCYM grande foi raspada em 35 ml de meios LB, e a placa de agar foi enxaguada em seguida com 35 ml de meios LB adicionais. A mistura de bactérias/fago resultante em meios LB foi centrifugada para precipitar as bactérias para fora. 50 ul do sobrenadante de fago foi transferido a um tubo fresco, e 12,5 ml de solução PEG (20% de PEG8000, 3,5 M de acetato de amónio) foram adicionados e incubados em gelo durante 2 horas para precipitar os fagos. Os fagos precipitados foram centrifugados para baixo e ressuspensos em 6 ml do tampão de ressuspensão de fago (250 mM de NaCl, 100 mM de Tris pH 8, 1 mM de EDTA). Esta solução de fago foi purificada ainda retirando por centrifugação as bactérias remanescentes e precipitando o fago para o segundo tempo por meio da adição de 1,5 ml da solução PEG. Após uma etapa de centrifugação, o fago precipitado foi ressuspenso em 400 ul de PBS. Esta solução foi submetida a uma centrifugação final para retirar os detritos de bactérias remanescentes. A preparação de fago resultante foi titulada por um ensaio de formação em placa padrão (Molecular Cloning, Maniatis et al., 3a Edição). Séries adicionais de selecção e amplificação 81
Na segunda série, o fago amplificado (1011 pfu) da primeira série foi utilizado como o fago de entrada para realizar as etapas de selecção e amplificação. 0 fago amplificado (1011 pfu) da segunda série por sua vez foi utilizado como o fago de entrada para realizar a terceira série de selecção e amplificação. Após as etapas de eluição da terceira série, uma fracção pequena do fago eluido foi colocada em placas como no ensaio de formação em placa anterior. As placas individuais foram escolhidas e colocadas em placas de microtitulo de 96 poços que contêm 100 ul de tampão TE em cada poço. Estas placas mestre foram incubadas a 4°C durante a noite para permitir a eluição dos fagos no TE tampão.
Análise Clonal ELISA de fago
Os clones de fago foram submetidos a ELISA de fago e então sequenciados. As sequências foram classificadas como será discutido a seguir. ELISA de fago foi realizada como segue. Uma cultura XL-1 Blue MRF' de E. Coli foi crescida até que a DC>6oo atingisse 0,5. 30 ul desta cultura foi aliquotada em cada poço de uma placa de microtitulo de 96 poços. 10 ul de fago eluido foi adicionado a cada poço e permitido que infecte bactérias durante 15 min a temperatura ambiente. Aproximadamente 120 ul de meios LB que contêm 12,5 ug/ml de tetraciclina e 50 ug/ml de ampicilina foram adicionados a cada poço. A placa de microtitulo foi então incubada com agitação durante a noite a 37°C. A proteína miostatina (2 ug/ml em 0,1 M de tampão de carbonato de sódio, pH 9,6) foi permitida que revistisse sobre placas Maxisorp™ de 96 poços (nunc) durante a noite a 4°C. Como um controlo, uma placa Maxisorp™ separada foi revestida com 2% de BSA preparados em PBS.
No dia seguinte, o líquido nas placas Maxisorp™ revestidas com proteínas foi descartado, lavado três vezes 82 com PBS e cada poço foi bloqueado com 300 ul de 2% de solução de leite a temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de leite foi descartada, e os poços foram lavados três vezes com a solução de PBS. Após a última etapa de lavagem, aproximadamente 50 ul de PBST-4% de leite foram adicionados a cada poço das placas Maxisorp™ revestidas com proteína. Aproximadamente 50 ul de culturas crescidas durante a noite de cada poço na placa de microtítulo de 96 poços foram transferidos aos poços correspondentes das placas revestidas com miostatina bem como as placas revestidas com BSA a 2% de controlo. 100 ul da mistura nos dois tipos de placas foram incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. O líquido foi descartado das placas , TM ,
Maxisorp , e os poços foram lavados aproximadamente tres vezes com PBST seguido por duas vezes com PBS. O anticorpo anti-Ml3 conjugado com HRP (Amersham Pharmacia Biotech) foi diluído a aproximadamente 1:7.500, e 100 ul da solução diluída foram adicionados a cada poço das placas Maxisorp™ durante 1 hora de incubação a temperatura ambiente. O líquido foi descartado de novo e os poços foram lavados aproximadamente três vezes com PBST seguido por duas vezes com PBS. 100 ul de substrato quimioluminescente LumiGlo™ (KPL) foram adicionados a cada poço das placas Maxisorp™ e incubados durante aproximadamente 5 minutos para que a reacção ocorra. A unidade quimioluminescente das placas Maxisorp™ foi lida num leitor de placas (Lab System). Sequenciamento dos clones de faqo
Para cada clone de fago, o molde de sequenciamento foi preparado por um método PCR. O seguinte par de oligonucleótidos foi utilizado para amplificar um fragmento de 500 nucleótidos: iniciador n° 1: 5'- CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3' (Seq ID No: 294) e iniciador n° 2: 5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3' (Seq ID No: 295). A seguinte mistura foi preparada para cada clone.
Reagentes
Volume (pL) 83 / tubo H20 destilada 26,25 50% de glicerol 10 10PCR Tampão (c/s MgCl2) 5 25 mM de MgCl2 4 10 mM de mistura de dNTP 1 100 mM de iniciador 1 0,25 100 mM de iniciador 2 0,25 polimerase Taq 0,25 Fago em te (secção 4) 3 Volume de reacção final 50
Um termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem) foi utilizado para executar o seguinte programa: [94 °C durante 5 min; 94 °C durante 30 seg, 55 °C durante 30 sec, 72°C durante 45 seg.] x30 ciclos; 72°C durante 7 min; arrefecimento até 4°C. O produto de PCR de cada reacção foi clarificado utilizando o kit de Purificação QIAquick Multiwell PCR (Qiagen), seguindo o protocolo do fabricante. O produto clarificado de PCR foi verificado executando 10 ul de cada reacção PCR misturados com 1 ul de corante (10X corante de carga em gel de agarose BBXS) num 1% de gel de agarose. O produto remanescente foi então sequenciado utilizando o Sequenciador ABI 377 (Perkin Elmer) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante.
Classificação das Sequências e Análise
As sequências de péptido que foram traduzidas das sequências de nucleótidos foram correlacionadas a dados de ELISA. Os clones que mostraram unidades quimioluminescentes altas nos poços revestidos com miostatina e unidades quimioluminescentes baixas nos poços revestidos com BSA a 2% foram identificados. As sequências que ocorreram múltiplas vezes foram identificadas. As sequências candidatas escolhidas com base nestes critérios foram submetidas a análise adicional como pepticorpos. 84
Aproximadamente 1200 clones individuais foram analisados. Destes aproximadamente 132 péptidos foram escolhidos para gerar os pepticorpos da presente invenção. Estes são mostrados no Quadro I a seguir. Os péptidos que têm a SEQ ID NO: la 129 foram utilizados para gerar pepticorpos do mesmo nome. Os péptidos que têm a SEQ ID NO: 130 a 141 mostrada no Quadro 1 compreendem dois ou mais péptidos da SEQ ID NO: la 132 unidos por uma sequência linker. SEQ ID NO: 130 a 141 foram também utilizados para gerar pepticorpos do mesmo nome.
As sequências consenso foram determinadas para o grupo derivado de TN-8 de péptidos. Estes são como segue: KDXCXXWHWMCKPX (Seq ID No: 142) WXXCXXXGFWCXNX (Seq ID No: 143) IXGCXWWDXXCYXX (Seq ID No: 144) XXWCVSPXWFCXXX (Seq ID No: 145) XXXCPWFAXXCVDW (Seq ID No: 146)
Para todas as sequências consenso anteriores, as "sequências core" sublinhadas de cada sequência consenso são o aminoácido que sempre ocorrem nessa posição. "X" refere-se a qualquer aminoácido de ocorrência natural ou modificado. As duas cisteinas contidas com as sequências core foram aminoácidos fixos na biblioteca TN8-IX.
QUADRO I
NOME DO PEPTICORPO SEQ.ID No SEQUÊNCIA PEPTÍDICA Miostatina-TN8-Conl 1 KDKCKMWHWMCKPP Miostatina-TN8-Con2 2 KDLCAMWHWMCKPP Miostatina-TN8-Con3 3 KDLCKMWKWMCKPP Miostatina-TN8-Con4 4 KDLCKMWHWMCKPK Miostatina-TN8-Con5 5 WYPCYEFHFWCYDL Miostatina-TN8-Con6 6 WYPCYEGHFWCYDL Miostatina-TN8-Con7 7 IFGCKWWDVQCYQF Miostatina-TN8-Con8 8 IFGCKWWDVDCYQF 85
Miostatina-TN8-Con9 9 ADWCVSPNWFCMVM Miostatina-TN8-ConlO 10 HKFCPWWALFCWDF Miostatina-TN8-l 11 KDLCKMWHWMCKPP Miostatina-TN8-2 12 IDKCAIWGWMCPPL 86(continuação)
NOME DO PEPTICORPO SEQ.ID No SEQUÊNCIA PEPTÍDICA Miostatina-TN8-3 13 WYPCGEFGMWCLNV Miostatina-TN8-4 14 WFTCLWNCDNE Miostatina-TN8-5 15 HTPCPWFAPLCVEW Miostatina-TN8-6 16 KEWCWRWKWMCKPE Miostatina-TN8-7 17 FETCPSWAYFCLDI Miostatina-TN8-8 18 AYKCEANDWGCWWL Miostatina-TN8-9 19 NSWCEDQWHRCWWL Miostatina-TN8-10 20 WSACYAGHFWCYDL Miostatina-TN8-ll 21 ANWCVSPNWFCMVM Miostatina-TN8-12 22 WTECYQQEFWCWNL Miostatina-TN8-13 23 ENTCERWKWMCPPK Miostatina-TN8-14 24 WLPCHQEGFWCMNF Miostatina-TN8-15 25 STMCSQWHWMCNPF Miostatina-TN8-16 26 IFGCHWWDVDCYQF Miostatina-TN8-17 27 IYGCKWWDIQCYDI Miostatina-TN8-18 28 PDWCIDPDWWCKFW Miostatina-TN8-19 29 QGHCTRWPWMCPPY Miostatina-TN8-20 30 WQECYREGFWCLQT Miostatina-TN8-21 31 WFDCYGPGFKCWSP Miostatina-TN8-22 32 GVRCPKGHLWCLYP Miostatina-TN8-23 33 HWACGYWPWSCKWV Miostatina-TN8-24 34 GPACHSPWWWCVFG Miostatina-TN8-25 35 TTWCISPMWFCSQQ Miostatina-TN8-26 36 HKFCPPWAIFCWDF Miostatina-TN8-27 37 PDWCVSPRWYCNMW Miostatina-TN8-28 38 VWKCHWFGMDCEPT Miostatina-TN8-29 39 KKHCQIWTWMCAPK Miostatina-TN8-30 40 WFQCGSTLFWCYNL Miostatina-TN8-31 41 WSPCYDHYFYCYTI Miostatina-TN8-32 42 SWMCGFFKEVCMWV 87(continuação)
NOME DO PEPTICORPO SEQ.ID SEQUÊNCIA PEPTÍDICA No Miostatina-TN8-33 43 EMLCMIHPVFCNPH Miostatina-TN8-34 44 LKTCNLWPWMCPPL Miostatina-TN8-35 45 WGCKWYEA WCYNK Miostatina-TN8-36 46 PIHCTQWAWMCPPT Miostatina-TN8-37 47 DSNCPWYFLSCVIF Miostatina-TN8-38 48 HIWCNLAMMKCVEM Miostatina-TN8-39 49 NLQCIYFZGKCIYF Miostatina-TN8-40 50 AWRCMWFSDVCTPG Miostatina-TN8-41 51 WFRCFLDADWCTSV Miostatina-TN8-42 52 EKICQMWSWMCAPP Miostatina-TN8-43 53 WFYCHLNKSECTEP Miostatina-TN8-44 54 FWRCAIGIDKCKRV Miostatina-TN8-45 55 NLGCKWYEVWCFTY Miostatina-TN8-46 56 IDLCNMWDGMCYPP Miostatina-TN8-47 57 EMPCNIWGWMCPPV Miostatina-TN12-l 58 WFRCVLTGIVDWSECFGL Miostatina-TN12-2 59 GFSCTFGLDEFYVDCSPF Miostatina-TN12-3 60 LPWCHDQVNADWGFCMLW Miostatina-TN12-4 61 YPTCSEKFWIYGQTCVLW Miostatina-TNl2-5 62 LGPCPIHHGPWPQYCVYW Miostatina-TN12-6 63 PFPCETHQISWLGHCLSF Miostatina-TN12-7 64 HWGCEDLMWSWHPLCRRP Miostatina-TN12-8 65 LPLCDADMMPTIGF CVAY Miostatina-TNl2-9 6 6 SHWCETTFWMNYAKCVHA Miostatina-TN12-10 67 LPKCTHVPFDQGGFCLWY Miostatina-TNl2-l1 68 FSSCWSPVSRQDMFCVFY Miostatina-TN12-13 69 SHKCEYSGWLQPLCYRP Miostatina-TNl2-14 70 PWWCQDNYVQHMLHCDSP Miostatina-TN12-15 71 WFRCMLMNSFDAFQCVSY Miostatina-TNl2-16 72 PDACRDQPWYMFMGCMLG (continuação)
NOME DO PEPTICORPO SEQ.ID SEQUÊNCIA PEPTÍDICA No Miostatina-TN12-17 73 FLACFVEFELCFDS Miostatina-TN12-18 74 SAYCITTESDPYVLCVPL Miostatina-TN12-19 75 PSICESYSTMWLPMCQHN Miostatina-TN12-20 76 WLDCHDDSWAWTKMCRSH Miostatina-TN12-21 77 YLNCVMMNTSPFVECVFN Miostatina-TNl2-22 78 YPWCDGFMIQQGITCMFY Miostatina-TN12-23 79 FDYCTWLNGFKDWKCWSR Miostatina-TNl2-24 80 LPLCNLKEISHVQACVLF Miostatina-TN12-25 81 SPECAFARWLGIEQCQRD Miostatina-TN12-26 82 YPQCFNLHLLEWTECDWF Miostatina-TN12-27 83 RWRCEIYDSEFLPKCWFF Miostatina-TNl2-28 84 LVGCDNVWHRCKLF Miostatina-TN12-29 85 AGWCHVWGEMFGMGCSAL Miostatina-TN12-30 86 HHECEWMARWMSLDCVGL Miostatina-TN12-31 87 FPMCGIAGMKDFDFCVWY Miostatina-TN12-32 88 RDDCTFWPEWLWKLCERP Miostatina-TN12-33 89 YNFCSYLFGVSKEACQLP Miostatina-TN12-34 90 AHWCEQGPWRYGNICMAY Miostatina-TN12-35 91 NLVCGKISAWGDEACARA Miostatina-TNl2-36 92 HNVCTIMGPSMKWFCWND Miostatina-TN12-37 93 NDLCAMWGWRNTIWCQNS Miostatina-TN12-38 94 PPFCQNDNDMLQSLCKLL Miostatina-TN12-39 95 WYDCNVPNELLSGLCRLF Miostatina-TN12-40 96 YGDCDQNHWMWPFRCLSL Miostatina-TN12-41 97 GWMCHFDLHDWGATCQPD Miostatina-TNl2-42 98 YFHCMFGGHEFEVHCESF Miostatina-TN12-43 99 AYWCWHGQCVRF Miostatina-Linear-1 100 SEHWTFTDWDGNEWWVRPF Miostatina-Linear-2 101 MEMLDSLFELLKDMVPISKA Miostatina-Linear-3 102 SPPEEALMEWLGWQYGKFT 89(continuação)
NOME DO PEPTICORPO SEQ.ID No SEQUÊNCIA PEPTÍDICA Miostatina-Linear-4 103 SPENLLNDLYILMTKQEWYG Miostatina-Linear-5 104 FHWEEGIPFHWTPYSYDRM Miostatina-Linear-6 105 KRLLEQFMNDLAELVSGHS Miostatina-Linear-7 106 DTRDALFQEFYEFVRSRLVI Miostatina-Linear-8 107 RMSAAPRPLTYRDIMDQYWH Miostatina-Linear-9 108 NDKAHFFEMFMFDVHNFVES Miostatina-Linear-10 109 QTQAQKIDGLWELLQSIRNQ Miostatina-Linear-11 110 MLSEFEEFLGNLVHRQEA Miostatina-Linear-12 111 YTPKMGSEWTSFWHNRIHYL Miostatina-Linear-13 112 LNDTLLRELKMVLNSLSDMK Miostatina-Linear-14 113 FDVERDLMRWLEGFMQSAAT Miostatina-Linear-15 114 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV Miostatina-Linear-16 115 VESLHQLQMWLDQKLASGPH Miostatina-Linear-17 116 RATLLKDFWQLVEGYGDN Miostatina-Linear-18 117 EELLREFYRFVSAFDY Miostatina-Linear-19 118 GLLDEFSHFIAEQFYQMPGG Miostatina-Linear-20 119 YREMSMLEGLLDVLERLQHY Miostatina-Linear-21 120 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ Miostatina-Linear-22 121 WREHFLNSDYIRDKLIAIDG Miostatina-Linear-23 122 QFPFYVFDDLPAQLEYWIA Miostatina-Linear-24 123 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN Miostatina-Linear-25 124 EALFQNFFRDVLTLSEREY Miostatina-Linear-26 125 QYWEQQWMTYFRENGLHVQY Miostatina-Linear-27 126 NQRMMLEDLWRIMTPMFGRS Miostatina-Linear-29 127 FLDELKAELSRHYALDDLDE Miostatina-Linear-30 128 GKLIEGLLNELMQLETFMPD Miostatina-Linear-31 129 ILLLDEYKKDWKSWF Miostatina-2xTN8-19 kc 130 QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRWPWM CPPY 90 (continuação)
NOME DO PEPTICORPO SEQ.ID No SEQUÊNCIA PEPTÍDICA Miostatina-2xTN8-con6 131 WYPCYEGHFWCYDLGSGSTASSG SGSATGWYPCYEGHFWCYDL Miostatina-2xTN8-5 kc 132 HTPCPWFAPLCVEWGSGSATGGSG STASSGSGSATGHTPCPWFAPLCVEW Miostatina-2xTN8-18 kc 133 PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGS GS TAS S GS GSATGP DWCIDP DWWCKFW Miostatina-2xTN8-ll kc 134 ANWCVS PNWF CMVMGS GSATGG SGSTASSGSGSATGANWCVSPNWFCMVM Miostatina-2xTN8-25 kc 135 PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGS GS TAS S GS GSATGP DWCIDP DWWCKFW Miostatina-2xTN8-2 3 kc 136 HWACGYWPWS CKWVGS GSAT GG SGSTASSGSGSATGHWACGYWPW SCKWV Miostatina-TN8-29-19 kc 137 KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRWPWM CPPY Miostatina-TN8-19-29 kc 138 QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGS GSTASSGSGSATGKKHCQIWTWM CAPK Miostatina-TN8-29-19 kn 139 KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGS GSTASSGSGSATGQGHCTRWPWM CPPY Miostatina-TN8-29-19 CO 1 140 KKHCQIWTWMCAPKGGGGGGGG QGHCTRWPWMCPPY Miostatina-TN8-19-29 1 o 141 QGHCTRWPWMCPPYGGGGGGKK HCQIWTWMCAPK
Exemplo 2
Geração de pepticorpos
Construção de ADN que codifica proteínas de fusão péptido-Fc
Os péptidos capazes de ligar-se a miostatina foram utilizadas em separado ou em combinação uma com a outra para construir proteínas de fusão em que um péptido foi fusionado ao domínio Fc de igGl humana. A sequência de 91 aminoácidos da porção Fc de cada pepticorpo é como segue (da terminação amino a terminação carboxilo): dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcwvdv SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENN YKTTPPVL DSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (Seq ID No: 296) 0 péptido foi fusionado na configuração N (péptido foi unido à terminação N da região Fc), a configuração C (péptido foi unido à terminação C da região Fc), ou a configuração N,C (péptido unido tanto na terminação N como na C da região Fc). Os vectores separados foram utilizados para expressar a fusões da terminação N e fusões terminação C. Cada pepticorpo foi construído por pares de anelamento de oligonucleótidos ("oligos") ao ácido nucleico do fago seleccionado para gerar uma sequência de nucleótidos de cadeia dupla que codifica o péptido. Estas moléculas de polinucleótidos foram construídas como fragmentos Apah a Xho I. Os fragmentos foram ligados em ou the vector da terminação N pAMG21-Fc para a orientação terminação N, ou o vector da aterminação C pAMG21-Fc para a orientação terminação C que foi digerido anteriormente com ApaLI e Xhol. As misturas de ligação resultantes foram transformadas por electroporação em E. coli estirpe 2596 ou células 4167 (uma variante hsdR- de estirpe de células 2596) utilizando procedimentos padrão. Os clones foram rastreados para a capacidade para produzir o produto de proteína recombinante e para possuir a fusão de gene que têm uma sequência de nucleótidos correcta. Um único tal clone foi seleccionado para cada um dos péptidos modificados.
Muitas das construções foram criadas utilizando um vector alternativo designado pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc. Este vector é similar ao vector descrito anteriormente excepto que a digestão do vector foi realizada com BsmBI. Algumas construções de sequências de péptido fusionadas em ambas as 92 extremidades da Fc. Nesses casos, o vector foi um compósito de pAMG2l-2xBs-N(ZeoR) Fc e pAMG21-2xBs-C-Fc.
Construção de pAMG21 0 plasmideo de expressão pAMG21 (ATCC No. 98113) é derivado do vector de expressão pCFMl656 (ATCC No. 69576) e o sistema de vector de expressão descrito na Patente dos Estados Unidos No. 4.710.473, seguindo o procedimento descrito no Pedido de Patente Internacional Publicado WO 00/24782, a totalidade das quais são incorporadas no presente documento por referência.
Vector de terminação N Fc O vector de terminação N Fc foi construído utilizando o vector pAMG21 Fc_GIy5_ Tpo como um molde. Um 5' PCR iniciador (a seguir) foi desenhado para retirar a sequência de péptido Tpo em pAMG Tpo Gly5 e substitui-la com um polilinker que contém locais ApaLI e Xhol. Utilizando este vector como um molde, o PCR foi realizado com Expand Long Polimerase, utilizando o seguinte iniciador 5' e um iniciador 3' universal: iniciador 5' 5’-ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAA CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA-3 ’ (Seq Π) No: 297) iniciador 3': 5'-GGTCATTACTGGACCGGATC-3' (Seq ID No: 298) O produto de PCR resultante foi purificado em gel e digerido com enzimas de restrição NdeI e SsrGI. Tanto o plasmideo como o polinucleótido que codifica o péptido de interesse juntos com seu linker foram purificados em gel utilizando colunas de giro de purificação em gel Qiagen (Chatsworth, CA) . O plasmideo e o inserto foram então ligados utilizando procedimentos de ligação padrão, e a mistura de ligação resultante foi transformada em células de E. coli (estirpe 2596). Os clones únicos foram 93 seleccionados e o sequenciamento de ADN foi realizado. Um clone correcto foi identificado e isto foi utilizado como uma fonte de vector para os péptidos modificados descritos no presente documento.
Construção de Vector de terminação C Fc 0 vector de terminação C Fc foi construído utilizando o vector pAMG21 Fc_Gly5_ Tpo como um molde. Um iniciador 3' de PCR foi desenhado para retirar a sequência de péptido Tpo e substituí-la com um polilinker que contém locais ApaLl e Xhol. 0 PCR foi realizado com Expand Long
Polimerase utilizando um iniciador 5' universal e o iniciador 3'. iniciador 5': 5’-CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3' (Seq ID No: 299) iniciador 3' TTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC-3’ (Seq ID No: 300) O produto de PCR resultante foi purificado em qel e digerido com enzimas de restrição BsrGI e BamEI. Tanto o plasmídeo como o polinucleótido que codifica cada um dos péptidos de interesse com seu linker foram purificados em gel via colunas de giro de purificação em gel Qiagen. 0 plasmídeo e o inserto foram então ligados utilizando procedimentos de ligação padrão, e a mistura de ligação resultante foi transformada em células de E. coli (estirpe 2596). A estirpe 2596 (ATCC n° 202174) é uma estirpe de E. coli K-12 modificada para conter o promotor lux e dois repressores sensíveis a temperatura lambda, o cl857s7 e o repressor lac IQ. Os clones únicos foram seleccionados e Sequenciamento de ADN foi realizado. Um clone correcto foi identificado e utilizado como uma donte de cada pepticorpo descrito no presente documento.
Expressão em E. coli. 94
As culturas de cada das construções de fusão pAMG21-Fc em E. coli estirpe 2596 foram crescidas a 37°C em meio Terrific Broth (Veja-se Tartof e Hobbs, "Improved media for growing plasmid e cosmid clones", Betesda Research Labs Focus, Volume 9, página 12, 1987, citado na referência mencionada anteriormente Sambrook et al.). A indução de expressão de produto de gene do promotor luxPR foi alcançada seguindo a adição do autoindutor sintético, N-(3-oxohex-anoil)-DL-homoserina lactona, ao meio de cultura até uma concentração final de 20 nanogramas por mililitro (ng/ml). As culturas foram incubadas a 37°C durante seis horas adicionais. As culturas bacterianas foram então examinadas por microscopia para a presença de corpos de inclusão e colhidas por centrifugação. Os corpos de inclusão refractéis foram observados em culturas induzidas, indicando que as fusões-Fc foram mais provavelmente produzidas na fracção insolúvel em E. coli. As células precipitadas foram lisadas directamente por ressuspensão em tampão de amostra Laemmli que contém 10% de β- mercaptoetanol e então analisadas por SDS-PAGE. Na maioria dos casos, uma intensa banda corada com coomassie do peso molecular apropriado foi observada num gel de SDS-PAGE. Dobramento e purificação de pepticorpos
As células foram quebradas em água (1/10 volume por volume) por homogeneização em alta pressão (3 passagens a 15.000 PSI) e corpos de inclusão foram colhidos por centrifugação (4000 RPM em J-6B durante 30 minutos). Os corpos de inclusão foram solubilizados em 6 M de guanidina, 50 mM de Tris, 8 mM de DTT, pH 8,0 durante 1 hora numa razão 1/10 a temperatura ambiente. A mistura solubilizada foi diluída 25 vezes em 4 M de ureia, 20% de glicerol, 50 mM de Tris, 160 mM de arginina, 3 mM de cisteína, 1 mM de cistamina, pH 8,5. A mistura foi incubada durante a noite no frio. A mistura foi então dializada contra 10 mM de Tris pH 8,5, 50 mM de NaCl, 1,5 M de ureia. Após uma diálise 95 durante a noite o pH do dialisado foi ajustado a pH 5 com ácido acético. 0 precipitato foi removido por centrifugação e o sobrenadante foi carregado numa coluna SP-Sepharose Fast Flow equilibrada em 10 mM de NaAc, 50 mM de NaCl, pH 5, 4°C). Após a carga, a coluna foi lavada à linha de base com 10 mM de NaAc, 50 mM de NaCl, pH 5,2. A coluna foi desenvolvida com um gradiente de volume de coluna 20 de 50 mM -500 mM de NaCl no tampão acetato. Alternativamente, após a lavagem à linha de base, a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de 10 mM de fosfato de sódio pH 7,0 e a coluna desenvolvida com um gradiente de volume de coluna 15 de 0-400 mM de NaCl em tampão fosfato. As fracções de coluna foram analisadas por SDS-PAGE. As fracções que contêm pepticorpo dimérico foram agrupadas. As fracções foram também analisadas por filtração em gel para determinar se qualquer agregado estava presente. Vários pepticorpos foram preparados dos péptidos do Quadro I. Os péptidos foram unidos à molécula Fc igGl humana para formar os pepticorpos no Quadro II. Em relação aos pepticorpos no Quadro II, a configuração C indica que o péptido nomeado foi unido às terminações C da Fc. A configuração N indica que o péptido nomeado foi unido às terminações N da Fc. A configuração N,C indica que um péptido foi unido às terminações N e um nas terminações C de cada molécula Fc. A 2x designação indica que os dois péptidos nomeados foram unidos em tandem um ao outro e também unidos nas terminações N ou C, ou ambas as N,C da Fc, separados pelo linker indicado. Dois péptidos unidos em tandem separados por um linker, são indicados, por exemplo, como Miostatina-TN8-29-19-8g, que indica que o péptido TN8-29 é unido via um linker (gly)8 ao péptido TN8-19. 0(s) péptido(s) foram unidos à Fc via uma sequência linker (gly)5 a menos que de outro modo especificado. Em alguns exemplos, o(s) péptido(s) foram unidos via um k linker. O linker designado k ou lk refere-se à sequência linker 96 gsgsatggsgstassgsgsatg (Seq ID No: 301), com kc referindo-se ao linker unido à terminação C da Fc, e kn referindo-se ao linker unido à terminação N da Fc. No Quadro II a seguir, a coluna 4 refere-se à sequência linker que conecta a Fc ao primeiro péptido e a quinta coluna refere-se à configuração N ou C ou ambas.
Uma vez que a molécula Fc dimeriza em solução, um pepticorpo construído de modo a ter um péptido será na verdade um dímero com duas cópias do péptido e duas moléculas Fc, e a versão 2X que têm dois péptidos em tandem será na verdade um dímero com quatro cópias do péptido e duas moléculas Fc.
Uma vez que os pepticorpos dados no Quadro II sejam expressos em E. coli, o primeiro resíduo de aminoácido é Met (M) . Portanto, os pepticorpos na configuração N são Met-péptido-linker-Fc, ou Met-péptido-linker-péptido-linker-Fc, por exemplo. Os pepticorpos na configuração C são dispostos como Met-Fc-linker-péptido ou Met-Fc-linker-péptido-linker-péptido, por exemplo. Os pepticorpos na configuração C,N são uma combinação de ambos, por exemplo, Met-péptido-linker-Fc-linker-péptido.
As sequências de nucleótidos que codificam pepticorpos exemplares são proporcionadas a seguir no Quadro II. A sequência de polinucleótidoss que codifica um pepticorpo exemplar da presente invenção inclui uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de polipéptido Fc tal como a seguinte: 97
5 ’ -GACAAAACTCACAC ATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTC
CTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCA
TGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG
AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA
ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG
GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTAC
AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC
TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA
TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA
GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG
GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT
TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACG
TCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA-3 ’ (Seq ID No: 301)
Além disso, os polinucleótidos que codificam o linker ggggg tal como o seguinte são incluídos: 5'-GGTGGAGGTGGTGGT-3' (Seq ID No: 302) O polinucleótido que codifica o pepticorpo também inclui o codão que codifica a metionina ATG e um codão de terminação tal como TAA.
Portanto, a estrutura do primeiro pepticorpo no Quadro II é TN8-Conl com uma configuração C e um linker (gly)5 é como segue: M-Fc-GGGGG-KDKCKMWHWMCKPP (Seq ID No: 303). Os polinucleótidos exemplares que codificam este pepticorpo seria:
5'- ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAA
CTCCrGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC
TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCC
ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC
ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT
GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG
TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC
ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCC
CCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC
CCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC
TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGAGAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGG 98 AACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTAAGACAA ATGCAAAATGTGGCACTGGATGTGCAAACCGCCG-3' (Seq ID No: 304)
QUADRO II
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina- TN8-conl KDKCKMWHWMCKPP AAAGACAAATGCAAAATGTGGCACTG GATGTQCAAACCGCCG (Seq. ID No: 147) 5 gly C Miostatina- TN8-con2 KDLCAMWHWMCKPP AAAG ACCTGTGCGCT ATGTGGCACTG GATGTGCAAACCGCCG (Seq. ID No: 148) 5 gly C Miostatina- TN8-con3 KDLCKMWKWMCKPP AAAGACCTGTGCGCT ATGTGGCACTG GATGTGCAAACCGCCG (Seq. ID No: 148) 5 gly c Miostatina- TN8-con4 KDLCKMWHWMCKPK AAAGACCTGTGCAAAATGTGGCACTG GATGTGCAAACCGAAA (Seq ID No: 150) 5 gly c Miostatina- TN8-con5 WYPCYEFHFWCYDL TGGTACCCGTGCTACGAATTCCACTTC TGGTGCTACGACCTG (Seq Π) No: 151) 5 gly c Miostatina- TN8-con5 WYPCYEFHFWCYDL TGGTACCCGTGCTACGAATTCCACTTC TGGTGCTACGACCTG (Seq ID No: 152) 5 gly N Miostatina- TN8-con6 WYPCYEGHFWCYDL TGGTACCCGTGCTACGAAGGTCACTT CTGGTGCTACGACCTG (Seq ID No: 153) 5 gly C Miostatina- TN8-con6 WYPCYEGHFWCYDL TGGTACCCGTGCTACGAAGGTCACTT CTGGTGCTACGACCTG (Seq ED No: 154) 5 gly N 99 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina- TN8-con7 IFGCKWWDVQCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT TCAGTGCTACCAGTTC (Seq ID No: 155) 5 gly C Miostatina- TN8-con8 IFGCKWWDVDCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT TGACTGCTACCAGTTC (Seq ID No: 156) 5 gly C Miostatina- TN8-con8 IFGCKWWDVDCYQF ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGACGT TGACTGCTACCAGTTC (Seq ID No: 157) 5 gly N Miostatina- TN8-con9 ADWCVSPNWFCMVM GCTGACTGGTGCGTTTCCCCGAACTG GTTCTGCATGGTTATG (Seq ID No: 158) 5 gly C Miostatina-TN8-con 10 HKFCPWWALFCWDF CACAAATTCTGCCCGTGGTGGGCTCT GTTCTGCTGGGACTTC (Seq ID No: 159) 5 gly C Miostatina- TN8-1 KDLCKMWHWMCKPP AAAGACCTGTGCAAAATGTGGCACTG GATGTGCAAACCGCCG (Seq ID No: 160 5 gly C Miostatina- TN8-2 IDKCAIWGWMCPPL ATCGACAAATGCGCTATCTGGGGTTG GATGTGCCCGCCGCTG (Seq ED No: 161) 5 gly c Miostatina- TN8-3 WYPCGEFGMWCLNV TGGTACCCGTGCGGTGAATTCGGTAT GTGGTGCCTGAACGTT (Seq ID No: 162) 5 gly c Miostatina- TN8-4 WFTCLWNCDNE TGGTTCACCTGCCTGTGGAACTGCGA CAACGAA (Seq ID No; 163) 5 gly c Miostatina- TN8-5 HTPCPWFAPLCVEW CACACCCCGTGCCCGTGGTTCGCTCC GCTGTGCGTTGAATGG (Seq ED No: 164) 5 gly c Miostatina- TN8-6 KEWCWRWKWMCKPE AAAGAATGGTGCTGGCGTTGGAAATG GATGTGCAAACCGGAA (SeqlDNo: 165) 5 gly c 100 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nudeótidos (Seq ID No) Miostatina- TN8-7 FETCPSWAYFCLDI TTCGAAACCTGCCCGTCCTGGGCTTA CTTCTGCCTGGACATC (SeqlDNo: 166) 5 gly C Miostatina- TN8-7 FETCPSWAYFCLDI TTCGAAACCTGCCCGTCCTGGGCTTA CTTCTGCCTGGACATC (SeqlDNo: 167) 5 gly N Miostatina- TN-8-8 AYKCEANDWGCWWL GCTTACAAATGCGAAGCTAACGACTG GGGTTGCTGGTGGCTG (SeqlDNo: 168) 5 gly C Miostatina- TN8-9 NSWCEDQWHRCWWL AACTCCTGGTGCGAAGACCAGTGGCA CCGTTGCTGGTGGCTG (SeqlDNo: 169) 5 gly C Miostatina- TN8-10 WSACYAGHFWCYDL TGGTCCGCTTGCT ACGCTGGTCACTTC TGGTGCTACGACCTG (Seq ID No: 170) 5 gly c Miostatina- TN8-11 ANWCVSPNWFCMVM GCTAACTGGTGCGTTTCCCCGAACTG GTTCTGCATGGTTATG (Seq IDNo: 171) 5 gly c Miostatina- TN8-12 WTECYQQEFWCWNL TGGACCGAATGCTACCAGCAGGAATT CTGGTGCTGGAACCTG (SeqlDNo: 172) 5 gly c Miostatina- TN8-13 ENTCERWKWMCPPK GAAAACACCTGCGAACGTTGGAAATG GATGTGCCCGCCGAAA (SeqlDNo: '173) 5 gly c Miostatina- TN8-14 WLPCHQEGFWCMNF TGGCTGCCGTGCCACCAGGAAGGTTT iCTGGTGCATGAACTTC (Seq Π) No: 174) 5 gly c Miostatina- TN8-15 STMCSQWHWMCNPF TCCACCATGTGCTCCCAGTGGCACTG GATGTGCAACCCGTTC (Seq ID No: 175) 5 gly c 101 (continuação)
Nome do peptlcorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina- TN8-16 IFGCHWWDVDCYQF ATCTTCGGTTGCCACTGGTGGGACGT TGACTGCTACCAGTTC (Seq ID No: 176) 5 gly C Miostatina- TN8-17 IYGCKWWDIQCYDI ATCTÁCGGTTGCAAATGGTGGGACAT CCAGTGCTACGACATC (SeqEDNo: 177) 5 gly C Miostatina- TN8-18 PDWCIDPDWWCKFW CCGGACTGGTGCATCGATCCGGACTG GTGGTGCAAATTCTGG (SeqlDNo: 178) 5 gly c Miostatina- TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY CAGGGTCACTGCACCCGTTGGCCGTG GATGTGCCCGCCGTAC (SeqlDNo: 179) 5 gly c Miostatina- TN8-20 WQECYREGFWCLQT TGGC AGG AATGCT ACCGTGAAGGTTT CTGGTGCCTGCAGACC (Seq ID No: 180) 5 gly c Miostatina- TN8-21 WFDCYGPGFKCWSP TGGTTCGACTGCTACGGTCCGGGTTTC AAATGCTGGTCCCCG (Sea IDNo: 181) 5 gly c Miostatina- TN8-22 GVRCPKGHLWCLYP GGTGTTCGTTGCCCGAAAGGTCACCT GTGGTGCCTGTACCCG (Sea Π) No: 182) 5 gly c Miostatina- TN8-23 HWACGYWPWSCKWV CACTGGGCTTGGGGTTACTGGCCGTG GTCCTGCAAATGGGTT (Seq ID No: 183) 5 gly c Miostatina- TN8-24 GPACHSPWWWCVFG GGTCCGGCTTGCCACTCCCCGTGGTG GTGGTGCGTTTTCGGT (Seq E> No: 184) 5 gly c Miostatina- TN8-25 TTWCISPMWFCSQQ ACCACCTGGTGCATCTCCCCGATGTG GTTCTGCTCCCAGCAG (Seq ID No: 185) 5 gly c 102 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina- TN8-26 HKFCPPWAIFCWDF CACAAATTCTGCCCGCCGTGGGCTAT CTTCTGCTGGGACTTC (Seo ID No: 186) 5 gly N Miostatina- TN8-27 PDWCVSPRWYCNMW CCGGACTGGTGCGTITCCCCGCGTTG GTACTGCAACATGTGG (SeqlDNo: 187) 5 gly N Miostatina- TN8-28 VWKC HWFGMDCEPT GTTTGG A AATGCC ACTGGTTCGGT AT GGACTGCGAACCGACC (SeqlDNo: 188) 5 gly N Miostatina- TN8-29 KKHCQIWTWMCAPK AAAAAACACTGCCAGATCTGGACCTG GATGTGCGCTCCGAAA (Seq ID No: 189) 5 gly N Miostatina- TN8-30 WFQCGSTLFWCYNL TGGTTCCAGTGCGGTTCCACCCTGTTC TGGTGCTACAACCTG (SeolDNo: 190) 5 gly N Miostatina- TN8-31 WSPCYDHYFYCYTI TGGTCCCCGTGCTACGACCACTACTTC TACTGCTACACCATC (SeolDNo: 191) 5 gly N Miostatina- TN8-32 SWMCGFFKEVCMWV TCCTGGATGTGCGGTTTCTTCAAAGA AGTTTGCATGTGGGTT (Seq DD No: 192) 5 gly N Miostatina- TN8-33 EMLCMIHPVFCNPH GAAATGCTGTGCATGATCCACCCGGT TTTCTGCAACCCGCAC (SeqlDNo: 193) 5 gly N Miostatina- TN8-34 LKTCNLWPWMCPPL CTGAAAACCTGCAACCTGTGGCCGTG GATGTGCCCGCCGCTG (SeqlDNo: 194) 5 gly N Miostatina- TN8-35 WGCKWYEAWCYNK GTTGTTGGTTGCAAATGGTACGAAGC TTGGTGCTACAACAAA (SeqlDNo: 195) 5 gly N 103 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina- TN8-36 PIHCTQWAWMCPPT CCGATCCACTGCACCCAGTGGGCTTG GATGTGCCCGCCGACC {Seq ID No: 196) 5 gly N Miostatina- TN8-37 DSNCPWYFLSCVIF GACTCCAACTGCCCGTGGTACTTCCT GTCCTGCGTTATCTTC {SeqlDNo: 197) 5 gly N Miostatina- TN8-38 HIWCNLAMMKCVEM C ACATCTGGTGCAACCTGGCT ATGAT GAAATGCGTTGAAATG (Seq ID No: 198) 5 gly N Miostatina- TN8-39 NLQCIYFLGKCIYF AACCTGCAGTGCATCTACTTCCTGGG TAAATGCATCTACTTC (Seq ID No: 199) 5 gly N Miostatina- TN8-40 AWRCMWFSDVCTPG GCTTGGCGTTGCATGTGGTTCTCCGAC GTTTGCACCCCGGGT (Seq ED No: 200) 5 gly N Miostatina- TN8-41 WFRCFLDADWCTSV TGGTTTCGTTGTTTTCTTGATGCTGAT TGGTGTACTTCTGTT (Sea ID No: 201) 5 gly N Miostatina- TN8-42 EKICQMWSWMCAPP GAAAAAATTTGTCAAATGTGGTCTTG GATGTGTGCTCCACCA (SeqlDNo: 202) 5 gly N Miostatina- TN8-43 WFYCHLNKSECTEP TGGTTTTATTGTC AT CTTAAT A AAT CT 5 gly N GAATGTACTGAACCA (Seq ID No: 2Õ3)~ Miostatina- TN8-44 FWRCAIGIDKCKRV ITTTGGCGTTGTGCrATTGGTATTGÃT AAATGT AAACGTGTT (Seq ED No: 204) 5 gly N Miostatina- TN8-45 NLGCKWYEVWCFTY AATCTTGGTTGTAAATGGTATGAAGT TTGGTGTTTTACTTAT (Sea ID No: 205) 5 gly N 104 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina- TN8-46 IDLCNMWDGMCYPP ATTGATCTTTGTAATATGTGGGATGGT !ATGTGTTATCCACCA (Seq ID No: 206) 5 gly N Miostatina- TN8-47 EMPCNIWGWMCPPV GAAATGCCATGTAATATTTGGGGTTG GATGTGTCCACCAGTT (Seq ID No: 207) 5 gly N Miostatina- TN12-1 WE RCVLTGIVDWSECF GL TGGTTCCGTTGCGTTCTGACCGGTATC GTTGACTGGTCCGAATGCTTCGGTCT G (Seq ID No: 208) 5 gly N Miostatina- TN12-2 GFSCTFGLDEFYVDCSF GGTTTCTCCTGCACCTTCGGTCTGGAC GAATTCT ACGTTGACTGCTCCCCGTTC (Seq ID No: 209) 5 gly N Miostatina- TN12-3 LPWCHDQVNADWGFC MLW CTGCCGTGGTGCCACGACCAGGTTAA CGCTGACTGGGGTTTCTGCATGCTGT GG (Seq ID No: 210) 5 gly N Miostatina- TN12-4 YPTCSEKFWIYGQTC VLW TACCCGACCTGCTCCGAAAAATTCTG GATCTACGGTCAGACGTGCGTTCTGT GG (Seq ID No: 211) 5 gly N Miostatina- TN12-5 LGPCPIHHGPWPQYCV YW CTGGGTCCGTGCCCGATCCACCACGG. TCCGTGGCCGCAGTACTGCGTTTACT GG (Seq ID No: 212) 5 gly N Miostatina- TN12-6 PFPCETHQISWLGHGLS CCGTTCCCGTGCGAAACCCACCAGAT CTCCTGGCTGGGTCACTGCCTGTCCTT C (Sea ID No: 213) 5 gly N Miostatina- TN12-7 HWGCEDLMWSWHPLC RRP CACTGGGGTTGCGAAGACCTGATGTG GTCCTGGCACCCGCTGTGCCGTCGTC CG (Seq ID No: 214) 5 gly N 105 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (Seq pepticorpo ID No) Miostatina- LPLCDADMMPTIGFCV CTGCCGCTGTGCGACGCTGACATGAT GCCGACCATCGG'riTCTGCGTTGCTTA 5 gly N TN12-8 AY C (Seq ED No: 215) Miostatina- SHWCETTFWMNYAKC TCCCACTGGTGCGAAACCACCTTCTG 5 gly N GATGAACTACGCTAAATGCGTTCACG TN12-9 VHA ÇT (Seq ED No: 216) Miostatina- LPKCTHVPFDQGGFCL CTGCCGAAATGCACCCACGTTCCGTT iCGACCAGGGTGGTTTCTGCCTGTGGT 5 gly N TN12-10 WY ÍAC (Seq ID No: 217) Miostatina- FSSCWSPVSRQDMFCV TTCTCCTCCTGCTGGTCCCCGGTTTCC CGTCAGGACATGTTCTGCGTTTTCTAC 5 gly N TN12-11 FY (Seq ID No: 218) Miostatina- SHKCEYSGWLQPLCYR TCCCACAAATGCGAATACTCCGGTTG GCTGCAGCCGCTGTGCTACCGTCCG 5 gly N TN12-13 (Seq ID No: 219) Miostatina- PWWC QDNYVQHMLH CCGTGGTGGTGCCAGGACAACTACGT TCAGC AC AT GCT GC ACTGCG ACTCCC 5 gly N TN12-14 CDSP !CG (Seq ID No: 220) Miostatina- WFRCMLMNSFDAFQC TGGTTCCGTTGCATGCTGATGAACTCC TTCGACGCTTTCCAGTGCGTTTCCTAC 5 gly N TN12-15 VSY (Seq Π> No: 221) Miostatina- PDACRDQPWYMFMGC CCGGACGCTTGCCGTGACCAGCCGTG GTACATGTTCATGGGTTGCATGCTGG 5 gly N TN12-16 MLG GT (Seq ID No: 222) Miostatina- FLACFVEFELCFDS TTCCTGGCTTGCTTCGTTGAATTCGAA 5 gly N TN12-17 CTGTGCTTCGACTCC (Seq Π> No: 223) Miostatina- SAYC11TE SDPYVLCVP TCCGCTTACTGCATCATCACCGAATCC GACCCGTACGTTCTGTGCGTTCCGCTG 5 gly N TN12-18 (Seq ID No: 224) 106 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID pepticorpo No) Miostatina- PSICESYSTMWLPMCQ CCGTCCATCTGCGAATCCTACTCCACC ATGTGGCTGCCGATGTGCCAGCACAA 5 gly N TN12-19 HN C (Seq ID No: 225) Miostatina- WLDCHDDSWAWTKM TGGCTGGACTGCCACGACGACTCCTG GGCTTGGACCAAAAT GTGCCGTTCCC 5 gly N TN12-20 CRSH AC (Sea Π) No: 226) Miostatina- YLNCVMMNTSPFVECF TACCTGAACTGCGTTATGATGAACAC CTCCCCGTTCGTTGAATGCGTTTTCAA 5 gly N TN12-21 N C (Seq ID No: 227) Miostatina- YPWC DGFMIQQGITCM TACCCGTGGTGCGACGGTTTCATGAT CCAGCAGGGTATCACCTGCATGTTCT 5 gly N TN12-22 FY AC (Seq ID No: 228) Miostatina- FDYCTWLNGFKDWKC TTCGACTACTGCACCTGGCTGAACGG TTTCAAAGACTGGAAATGCTGGTCCC 5 gly N TN12-23 WSR GT (Seq ID No: 229) Miostatina- LPLCNLKEISHVQACV CTGCCGCTGTGCAACCTGAAAGAAAT CTCCCACGTTCAGGCTTGCGTTCTGTT 5 gly N TN12-24 L C (Seq ID No: 230) Miostatina- SPECAFARWLGffiQC TCCCCGGAATGCGCTTTCGCTCGTTGG CTGGGTATCGAACAGTGCCAGCGTGA 5 gly N TN12-25 Q RD C (Seq ID No: 231) Miostatina- YPQCFNLHLLEWTECD TACCCGCAGTGCTTCAACCTGCACCT GCTGGAATGGACCGAATGCGACTGGT 5 gly N TN12-26 WF TC (Seq ID No: 232) Miostatina- RWRCEIYDSEFLPKCW CGTTGGCGTTGCGAAATCTACGACTC CGAATTCCTGCCGAAATGCTGGTTCTT 5 gly N TN12-27 FF C (Seq ID No: 233) Miostatina- LVGCDNVWHRCKLF CTGGTTGGTTGCGACAACGTTTGGCA CCGTTGCAAACTGTTC (SeqlDNo: 5 gly N TN12-28 234) Miostatina- AGWCHVWGEMFGMG GCTGGTTGGTGCCACGTTTGGGGTGA AATGTTCGGT ATGGGTT GCTCCGCTCT 5 gly N TN12-29 CSAL G (SeqlDNo:235) Miostatina- HHECEWMARWMSLD CACCACGAATGCGAATGGATGGCTCG TTGGATGTCCCTGGACTGCGTTGGTCT 5 gly N TN12-30 CVGL G (Sea ID No: 236) 107 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (Seq peptlcorpo ID No) Miostatina- FPMCGIAGMKDFDFCV TTCCCGATGTGCGGTATCGCTGGTAT gly N GAAAGACTTCGACTTCTGCGTTTGGT TN12-31 WY AC (Seq ID No: 237) . Miostatina- RDDCTFWPEWLWKLC CCTGATGATTGTACTTTTrGGCCAGAA TGGCTTTGGAAACTTTGTGAACGTCC 5 gly N TN12-32 ERP A (Seq ID No: 238) Miostatina- YNFCSYLFGVSKEACQ rATAATTTTTGTTCTT ATCTTTTTGGTG ITTCT AAAGA AGCTTGTC AACTTCCA 5 gly N TN12-33 LP (Seq ID No: 239) Miostatina- AHWCEQGPWRYGNIC GCTCATTGGTGTGAACAAGGTCCATG GCGTTATGGTAATATTTGTATGGCTTA 5 gly C TN12-34 MAY T (Seq ID No: 240) Miostatina- NLVCGKISAWGDEACA AATGTTGTTTGTGGTAAAATTTCTGCT TGGGGTGATGAAGCTTGTGCTCGTGC 5 gly N TN12-35 RA T (Seq ID No: 241) Miostatina- HNVCTIMGPSMKWFC CATAATGTTTGTACTATTATGGGTCCA 5 gly N C TN12-36 WND TCTATGAAATGGTTTTGITGGAATGAT (Seq ID No: 242) Miostatina- ND LGAMWGWRNTIWC AATGATCTTTGTGCTATGTGGGGTrGG CGT AATACTATTTGGTGTC AAAATTCT 5 gly N C TN12-37 ONS (Seq ID No: 243) Miostatina- PPFCQNDNDMLQSLCK CCACCATTTTGTCAAAATGATAATGA T ATGCTTC AATCTCTTTGTAAACTTCT 5 gly N TN12-38 LL T (Seq ID No: 244) Miostatina- WYDCNVPNELLSGLCR TGGTATGATTGTAATGTTCCAAATGA ACTTCTITCTGGTCTITGTCGTCTTTTT 5 gly N TN12-39 LF (Seq ID No: 245) Miostatina- YGDCDQNHWMWPFTC TATGGTGATTGTGATCAAAATCATTG GATGTGGCCATTTACTTGTCTTTCTCT 5 gly N C TN12-40 LSL T (Seq ID No: 246) 108 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nudeótidos (Seq pepticorpo ID No) Miostatina- GWMCHFDLHDWGAT GGTTGGATGTGTCATTTTGATCTTCAT GATTGGGGTGCTACTTGTCAACCAGA 5 gly N TN12-41 CQPD T (Seq ©No: 247) Miostatina- YFHCMFGGHEFEVHCE TATTTTCATTGTATGTTTGGTGGTCAT GAATTTGAAGTTCATTGTGAATCTTTT 5 gly N C TN12-42 SF (Seq ©No: 248) Miostatina- AYWCWHGQCVRF GCTTATTGGTGTTGGCATGGTCAATGT GTTCGTTTT (Seq©No: 249) 5 gly N TN12-43 Miostatina- SEHWTFTDWDGNEW TCCGAACACTGGACCTTCACCGACTG GGACGGTAACGAATGGTGGGTTCGTC 5 gly N Linear-1 WVRPF CGTTC (Seq©No:250) Miostatina- MEMLDSLFELLKDMVP ATGGAAATGCTGGACTCCCTGTTCGA ACTGCTGAAAGACATGGTTCCGATCT 5 gly N Linear-2 ISKA CCAAAGCT (Seq © No: 251) Miostatina- SPPEEALMEWLGWQY TCCCCGCCGGAAGAAGCTCTGATGGA ATGGCTGGGTTGGCAGTACGGTAAAT 5 gly N Linear-3 GKFT TCACC (Seo © No: 252) Miostatina- SPENLLNDLYILMTKQ TCCCCGGAAAACCTGCTGAACGACCT GTACATCCTGATGACCAAACAGGAAT 5 gly N Linear-4 EWYG GGTACGGT (Seo©No:253) Miostatina- FHWEEGEPFHWTPYS TTCCACTGGGAAGAAGGTATCCCGTT CCACGTTGTTACCCCGTACTCCTACGA 5 gly N Linear-5 YDRM CCGTATG (Seq©No: 254) Miostatina- KRLLEQFMNDLAELVS AAACGTCTGCTGGAACAGTTCATGAA CGACCTGGCTGAACTGGTTTCCGGTC 5 gly N Linear-6 GHS ACTCC (Seq©No:255) Miostatina- DTRDALFQEFYEFVRS GACACCCGTGACGCTCTGTTCCAGGA ATTCTACGAATTCGTTCGTTCCCGTCT 5 gly N Linear-7 RLVI GGTTATC (Seq©No:256) Miostatina- RMSAAPRPLTYRDIMD CGTATGTCCGCTGCTCCGCGTCCGCXG ACCTACCGTGACATCATGGACCAGTA 5 gly N Linear-8 QYWH CTGGCAC (Seq © No: 257) 109 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (Seq pepticorpo ID No) Miostatina- NDKAHFFEMFMFDVH aacgacaaagctcacttcttcgaaat GTTCATGTTCGACGTTCACAACTTCGT 5 gly N Linear-9 NFVES TGAATCC (Seq Id No: 258) Miostatina- QTQAQKIDGLWELLQS CAGACCCAGGCTCAGAAAATCGACGG TCTGTGGGAACTGCTGCAGTCCATCC 5 gly N Linear-10 IRNQ GTAACCAG (Seo ID No: 259) Miostatina- MLSEFEEFLGNLVHRQ ATGCTGTCCGAATTCGAAGAATTCCT GGGTAACCTGGTTCACCGTCAGGAAG 5 gly N Linear-11 EA CT (Seq ID No: 260) Miostatina- YTPKMGSEWTSFWHN rACACCCCGAAAATGGGTTCCGAATG 5 gly N Linear-12 RIHYL GACCTCCTTCTGGCACAACCGTATCC ACTACCTG (Seq ID No: 261) Miostatina- LNDTLLRELKMVLNSL CTGAACGACACCCTGCTGCGTGAACT G AAAATGGTTCTGAACTCCCTGTCCG 5 gly N Linear-13 SDMK ACATGAAA (SeqlDNo: 262) Miostatina- FDVERDLMRWLEGFM TTCGACGTTGAACGTGACCTGATGCG TTGGCTGGAAGGTTTCATGCAGTCCG 5 gly N Linear-14 QSAAT CTGCTACC (Seo ID No: 263) Miostatina- HHGWNYLRKGSAPQW CACCACGGTTGGAACTACCTGCGTAA AGGTTCCGCTCCGCAGTGGTTCGAAG 5 gly N Linear-15 FEAWV CTTGGGTT (Seq ID No: 264) Miostatina- VESLHQLQMWLDQKL GTTGAATCCCTGCACCAGCTGCAGAT GTGGCTGGACCAGAAACTGGCTTCCG 5 gly N Linear-16 ASGPH GTCCGCAC (Seq ID No: 265) Miostatina- RATLLKDFWQLVEGY CGTGCTACCCTGCTGAAAGACTTCTG GCAGCTGGTTGAAGGTTACGGTGACA 5 gly N Linear-17 GDN AC (SeqlDNo:266) Miostatina- EELLREFYRFVSAFDY GAAGAACTGCTGCGTGAATTCTACCG ITrCGTTTCCGCTTTCGACTAC (Seq ID 5 gly N Linear-18 No: 267) 110 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (Seq pepticorpo ID No) Miostatina- GLLDEFSHFIAEQFYQ GGTCTGCTGGACGAATTCTCCCACTTC ATCGCTGAAC AGTTCT ACC AGATGCC 5 gly N Linear-19 MPGG GGGTGGT (Sea ID No: 268Ί Miostatina- YREMSMLEGLLDVLER rACCGTGAAATGTCCATGCTGGAAGG FCTGCTGGACGTTCTGGAACGTCTGC 5 gly N Linear-20 LQHY AGCACTAC (Sea ED No: 269) Miostatina- HNSSQMLLSELMLVG CACAACTCCTCCCAGATGCTGCTGTC CGAACTGATCATGCTGGTTGGTTCCA 5 gly N Linear-21 SMMQ TGATGCAG (Sea Π) No: 270) Miostatina- WREHFLNSDYIRDKLI rGGCGTGAACACTTCCTGAACTCCGA 7TACATCCGTGACAAACTGATCGCTA 5 gly N Linear-22 AIDG rCGACGGT (Seq Π) No: 271) Miostatina- QFPFYVFDDLPAQLEY CAGTTCCCGTTCTACGTTTTCGACGAC CTGCCGGCTCAGCTGGAATACTGGAT 5 gly N Linear-23 WIA CGCT (Sea ID No: 272) Miostatina- EFFHWLHNHRSEVNH GAATTCTTCCACTGGCTGCACAACCA CCGTTCCGAAGTTAACCACTGGCTGG 5 gly N Linear-24 WLDMN ACATGAAC (Seq ID No: 273) Miostatina- EALFQNFFRDVLTLSER GAAGCTCTTTTTCAAAATTTTTTTCGT GATGTTCTT ACTCTTTCTGAACGTGA A 5 gly N C Linear-25 EY ΓΑΤ (Seq ID No: 274) Miostatina- QYWEQQWMTYFRENG CAATATTGGGAACAACAATGGATGAC ITATTTTCGTGAAAATGGTCTTCATGT 5 gly N Linear -26 LHVQY Γ0ΑΑΤΑΤ (Seq ID No: 27S) Miostatina- NQRMMLEDLWRTMTP AATCAACGTATGATGCTTGAAGATCT TTGGCGTATTATGACTCCAATGTTTGG 5 gly N C Linear-27 MFGRS TCGTTCT (Seq ID No: 276) Miostatina- FLDELKAELSRHYALD TTTCTTGATGAACTT AAAGCTGAACTT TCTCGTC ATT ATGCTCTTGATGATCTT 5 gly N Linear-29 DLDE GATGAA (Seq ID No: 277) 111 (continuação)
Nome do peptlcorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina- Linear-30 GKLIEGLLNELMQLETF MPD GGTAAACTTATTGAAGGTCTTCTTAAT GAACTTATGCAACTTGAAACTTTTATG CCAGAT (Seq ID No: 278) 5 gly N C Miostatina- Linear-31 ILLLDEYKKDWKSWF ATTCTTCTTCTTGATGAATATAAAAAA GATTGGAAATCTTGGTTT (Seq ID No: 279) 5 gly N Miostatina-2XTN8-19 kc QGHCTRWPWMCPPYG SGSATGGSGSTASSGSG SATGQGHCTRWPWMC PPY CAGGGCCACTGTACrCGCTGGCCGTG GATGTGCCCGCCGTACGGTTCTGGTT CCGCTACCGGTGGTTCTGGTTCCACTG CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCTACTG GTCAGGGTCACTGCACTCGTTGGCCA TGGATGTGTCCACCGTAT (Seq ID No: 280) lk N Miostatina- 2XTN8-CON6 WYPCYEGHFWCYDLG SGSTASSGSGSATGWY PCYEGHFWCYDL TGGTATCCGTGTTATGAGGGTCACTTC TGGTGCTACGATCrGGGTTCTGGTTCC ACTGCTTCTTCTGGTTCCGGTTCGGCT ACTGGTTGGTACCCGTGCTACGAAGG TCACTTTTGGTGTTATGATCTG (SeqED No: 281) 5 gly C Miostatina-2XTN8-5 kc HTPCPWFAPLCVEWGS GSATGGSGSTASSGSGS ATGHTPCPWFAPLCVE W CACACTCCGTGTCCGTGGTTTGCTCCG CTGTGCGTTGAATGGGGTTCTGGTTCC GCTACTGGTGGTTCCGGTTCCACTGCT TCTTCTGGTTCCGGTTCTGCAACTGGT CACACCCCGTGCCCGTGGTTTGCACC GCTGTGTGTAGAGTGG (SeqEDNo: 282) lk C 112 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID pepticorpo No) Miostatina-2XTN8-18 kc PDWCIDPDWWCKFWG |SGSATGGSGSTASSGSG [SATGP DWCIDP DWWC jKFW CCGGATTGGTGTATCGACCCGGACTG GTGGTGCAA ATTCT GGGGTTCTGGTTC CGCTACCGGTGGTTCCGGTTCCACTG CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCAACTG GTCCGGACTGGTGCATCGACCCGGAT TGGTGGTGT AAATTTTGG (Seq ID No: 283) lk C Miostatina-2XTN8-11 kc ANWCVSPNWFCMVM GSGSATGGSGSTASSGS GSATGANWCVSPNWF CMVM [CCGGATTGGTGTATCGACCCGGACTG GTGGTGCAAATTCTGGGGTTCTGGTTC CGCTACCGGTGGTTCCGGTTCCACTG CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCAACTG GTCCGGACTGGTGCATCGACCCGGAT TGGTGGTGT AAATTTTGG (SeqlDNo; 1284) lk C Miostatina-2XTN8-25 kc PDWCIDPDWWCKFWG SGSATGGSGSTASSGSG SATGPDWCIDPDWWC KFW ACCACTTGGTGCATCTCTCCGATGTG GTTCTGCTCTCAGCAGGGTTCTGGTTC CACTGCTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGC AACTGGT ACT ACTTGGTGT ATCTCTCC AATGTGGTTTTGTTCTCAGCAA (Seq ID No: 285) lk C Miostatina-2XTN8-23 kc HWACGYWPWSCKWV GSGSATGGSGSTASSGS GSATGHWACGYWPWS CKWV CACTGGGCATGTGGCTATTGGCCGTG GTCCTGCAAATGGGTTGGTTCTGGTTC [CGCTACCGGTGGTTCCGGTTCCACTG CTTCTTCTGGTTCCGGTTCTGCAACTG iGTCACTGGGCTTGCGGTTACTGGCCG iTGGTCTTGT AAATGGGTT (Seq ED No: Í286) lk C Miostatina- TN8-29-19 kc KKHCQIWTWMCAPKG SGSATGGSGSTASSGSG SATGQGHCTRWPWMC PPY AAAAAACACTGTCAGATCTGGACTTG GATGTGCGCTCCGAAAGGTTCTGGTT CCGCTACCGGTGGTTCTGGTTCCACTG CTTCTTCTGGTTCCGGTTCCGCTACTG GTCAGGGTCACTGCACTCGTTGGCCA TGGATGTGTCCGCCGTAT (SeqlDNo: 287) lk C 113 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (Seq ID No) Miostatina-TN8-19-29 kc QGHCTRWPWMCPPYG SGSATGGSGSTASSGSG SATGKKHCQIWTWMC APK CAGGGTCACTGCACCCGTTGGCCGTG GATGTGCCCGCCGTACGGTTCTGGTT CCGCTACCGGTGGTTCTGGTTCCACTG CITCITCTGGTTCCGGTTCTGCTACTG GTAAAAAACACTGCCAGATCTGGACT TGGATGTGCGCTCCGAAA (SeqJDNo: 288) lk c Miostatina-TN8-29-19 kn KKHCQIWTWMCAPKG SGSATGGSGSTASSGSG SATGQGHCTRWPWMC PPY AAAAAACACTGTCAGATCTGGACTTG GATGTGCGCTCCGAAAGGTTCTGGTT CCGCTACCGGTGGTTCTGGTTCCACTG CTTCTTCTGGTTCCGGTTCCGCTACTG GTCAGGGTCACTGCACTCGTTGGCCA TGGATGTGTCCGCCGTAT (Seq ID No: 289) lk N Miostatina-TN8-29-19-8g KKHCQIWTWMCAPKG GGGGGGGQGHCTRWP WMCPPY AAAAAACACTGCCAGATCTGGACTTG GATGTGCGCTCCGAAAGGTGGTGGTG GTGGTGGCGGTGGCCAGGGTCACTGC ACCCGTTGGCCGTGGATGTGTCCGCC GTAT (Seq tt> No: 290) 8 gly C Miostatina-TN8-19-29-6gc QGHCTRWPWMCPPYG GGGGGKKHCQIWTWM CAPK CAGGGTCACTGCACCCGTTGGCCGTG GATGTGCCCGCCGTACGGTGGTGGTG GTGGTGGCAAAAAACACTGCCAGATC TGGACTTGGATGTGCGCYCCGAAA (Seq ID No: 291) 6 gly c
Exemplo 3 Ensaios In vitro
Ensaio de Actividade de Miostatina à base de Células C2C12
Este ensaio demonstra a capacidade de neutralização da miostatina do inibidor que está a ser testado por meio da medição da extensão da ligação de miostatina ao seu receptor é inibida.
Uma linha de células repórter respondedoras a miostatina foi gerada por transfecção de células de mioblasto C2C12 (ATCC No: CRL-1772) com uma construção pMARE-luc. A construção pMARE-luc foi feita pela clonagem de doze repetições da sequência CAGA, que representam os elementos de resposta a activina/miostatina (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) num vector repórter pLuc-MCS 114 (Stratagene cat n° 219087) a montante do TATA box. As células de mioblasto C2C12 expressam naturalmente receptores de resposta a activina/miostatina na sua superfície celular. Quando miostatina liga-se a receptores celulares, a via Smad é activada, e Smad fosforilada liga-se ao elemento de resposta (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), resultando na expressão do gene lucerase. A actividade de luciferase é então medida utilizando um kit de ensaio de repórter de luciferase comercial (cat n° E4550, Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. Uma linha estável de células C2C12 que foram transfectadas com pMARE-luc (C2C12/pMARE clone n° 44) foi utilizado para medir a actividade de miostatina de acordo com o seguinte procedimento.
Os números iguais das células repórter (C2C12/pMARE clone n° 44) foram colocados em placa em culturas de 96 poços. Uma primeira série de rastreio utilizando duas diluições de pepticorpos foi realizada com a concentração de miostatina fixada a 4 nM. A miostatina matura recombinante foi pré-incubada durante 2 horas a temperatura ambiente com pepticorpos a 40 nM e 400 nM respectivamente. A cultura de célula repórter foi tratada com a miostatina com ou sem pepticorpos durante seis horas. A actividade de miostatina foi medida pela determinação da actividade de luciferase nas culturas tratadas. Este ensaio foi utilizado para identificar inicialmente acertos de pepticorpo que inibiram a actividade de sinalização de miostatina no ensaio repórter. Subsequentemente, uma curva de titulação de nove pontos foi gerada com a concentração de miostatina fixada a 4 nM. A miostatina foi pré-incubada com cada uma das seguintes nove concentrações de pepticorpos: 0,04 mM, 0,4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM, 2 uM e 4 uM para duas horas antes de adicionar a mistura à cultura de célula repórter. Os valores de CI50 foram para um número de 115 pepticorpos exemplares são proporcionados nos Quadros III e para pepticorpos maturados por afinidade, no Quadro VIII. Ensaio BIAcore®
Uma análise de afinidade de cada pepticorpo de miostatina candidato foi realizada num BIAcore®3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), aparelho utilizando sensor chip CM5, e 0, 005 por cento de agente tensioactivo P20 (Biacore, Inc.) como tampão de corrida. Proteína miostatina matura recombinante foi imobilizada para um chip sensor de CM5 de grau de pesquisa (Biacore, Inc.) via os grupos amina primária utilizando o Kit Amine Coupling (Biacore, Inc.) de acordo com o protocolo sugerido do fabricante.
Os ensaios de ligação directa foram utilizados para rastrear e classificar os pepticorpos com relação a sua capacidade de ligar-se a miostatina imobilizada. Os ensaios de ligação foram levados a cabo por injecção de duas concentrações (40 e 400 nM) de cada pepticorpo de ligação a miostatina candidato à superfície de miostatina imobilizada numa taxa de fluxo de 50 ml/min durante 3 minutos. Após um tempo de dissociação de 3 minutos, a superfície foi regerada. As curvas de ligação foram comparadas quantitativamente para intensidade de sinal de ligação, bem como para taxas de dissociação. Os parâmetros cinéticos de ligação de pepticorpo incluindo ka (constante da taxa de associação), kd (constante da taxa de dissociação) e KD (constante de equilíbrio de dissociação) foram determinadas utilizando o programa de computador BIA evaluation 3.1 (Biacore, Inc.). Quanto menor as constantes de equilíbrio de dissociação (expressos em nM), maior a afinidade do pepticorpo para miostatina. Os exemplos de valores KD do pepticorpo são mostrados no Quadro iii e Quadro vi para os pepticorpos maturados por afinidade a seguir.
Ensaio de bloqueio sobre a superfície de ActRIIB/Fc
Os ensaios de bloqueio foram levados a cabo utilizando ActRIIB/Fc imobilizados (R&D Systems, 116
Minneapolis, MN) e miostatina na presença e ausência de pepticorpos com o sistema de ensaio BIAcore®. Os ensaios foram utilizados para classificar pepticorpos como não neutralizantes (aqueles que não previnem a ligação de miostatina a ActRIIB/Fc) ou neutralizantes (aqueles que não previnem a ligação de miostatina a ActRIIB/Fc). A ligação de miostatina-ActRUB/Fc de linha de base foi primeiro determinada na ausência de qualquer pepticorpo.
Para estudos de rastreio precoces, os pepticorpos foram diluidos a 4 nM, 40 nM, e 400 nM de tampão de amostra e incubado com 4 nM de miostatina (também diluído em tampão de amostra). O pepticorpo: misturas de ligando foram permitidas que atinjam o equilíbrio a temperatura ambiente (pelo menos 5 horas) e então foram injectados ao longo da superfície de ActRIIB/Fc imobilizada durante 20 a 30 minutos numa taxa de fluxo de 10 uL/min. Um aumento resposta de ligação (sobre ligação de controlo com não pepticorpo) indicou que o pepticorpo que se liga a miostatina foi não neutralizante. Uma resposta de ligação diminuída (em comparação ao controlo) indicou que o pepticorpo que se liga a miostatina bloqueou a ligação de miostatina a ActRIIB/Fc. Os pepticorpos seleccionados foram caracterizados adicionalmente utilizando o ensaio de bloqueio de uma série de concentração total a fim de derivar valores CI50 (para pepticorpos neutralizantes) ou EC50 (para pepticorpos não neutralizantes). As amostras de pepticorpo foram diluídas serialmente desde 200 nM até 0,05 mM em tampão de amostra e incubadas com 4 mM de miostatina a temperatura ambiente para atingir o equilíbrio (mínimo de cinco horas) antes de injectar-se sobre a superfície de ActRIIB/Fc imobilizado durante 20 a 30 minutos numa taxa de fluxo de 10 uL/min. Seguindo a injecção de amostra, o ligando ligado foi permitido que dissocie do receptor durante 3 minutos. Representando em gráfico o sinal de ligação versus concentração de pepticorpo, os valores de 117 CI50 para cada pepticorpo na presença de 4 nM de miostatina foram calculados. Encontrou-se, por exemplo, que os pepticorpos TN8-19, L2 e L17 inibem a actividade de miostatina em ensaio à base de células, mas a ligação de TN-8-19 não bloqueia as interacções de miostatina/ActRIIB/Fc, indicando que TN-8-19 se liga a um epitopo diferente daquele observado para os outros dois pepticorpos.
Ligação de Epitopo para pepticorpos
Um pepticorpo purificado foi imobilizado num chip BIAcore para capturar a miostatina antes da injecção de um segundo pepticorpo, e a quantidade do pepticorpo secundário ligado à miostatina capturada foi determinada. Somente pepticorpos com epítopos distintos irão ligar-se à miostatina capturada, permitindo assim a ligação de pepticorpos com propriedades de ligação de epitopo similares ou distintas. Por exemplo, mostrou-se que pepticorpos TN8-19 e L23 ligam-se a epítopos diferentes na miostatina.
Ensaios de Selectividade
Estes ensaios foram realizados utilizando tecnologia BIAcore®, para determinar a selectividade de ligação dos pepticorpos a outros membros da família ΤΰΕβ. ActRIIB/Fc, TGFpRii/Fc e BMPR-lA/Fc (todas obtidas de R & D Systems, Minneapolis, MN) foram acoplados covalentemente aos chips sensores de grau de pesquisa de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Por causa dos ensaios BIAcore detectarem mudanças no índice refractivo, a diferença entre a resposta detectada com a injecção sobre as superfícies de receptor imobilizado em comparação com a resposta detectada com a injecção sobre a superfície de controlo na ausência de qualquer pepticorpo representa a ligação real de Activina A, TGFpi, ΤΰΕβ3, e BMP4 aos receptores, respectivamente. Com a pré-incubação de pepticorpos e moléculas Τ6Γβ, uma mudança (aumento ou diminuição) em 118 resposta de ligação indica pepticorpo que se liga à familia TGFp de moléculas. Os pepticorpos da presente invenção todos ligam-se a miostatina, mas não a Activina A, TGFpl, TGFβ3, ou BMP4.
Ensaios de Equilíbrio KinEx A™
Os ensaios de ligação-equilíbrio baseado em Solução utilizando tecnologia KinExA™ (Sapidyne Instruments, Inc.) foram utilizados para determinar o equilíbrio de dissociação (KD) de miostatina que se liga a moléculas de pepticorpo. Este ensaio baseado em solução é considerado mais sensível que o ensaio BlAcore em alguns exemplos. Reacti-Gel™ 6X foi pré-revestido com aproximadamente 50 ug/ml de miostatina durante a noite, e então bloqueado com BSA. 30 pM e 100 pM de amostras de pepticorpo foram incubadas com diversas concentrações (0,5 pM a 5 nM) de miostatina em tampão de amostra a temperatura ambiente durante 8 horas antes de ser rodado através de pérolas revestidas com miostatina. A quantidade do pepticorpo ligado a pérola foi quantificado por anticorpo anti-humano-Fc marcado com fluorescência (Cy5) de cabra a 1 mg/ml em superbloqueio. O sinal de ligação é proporcional à concentração de pepticorpo livre em equilíbrio com uma dada concentração de miostatina. KD foi obtida da regressão não linear das curvas de competição utilizando um modelo de ligação homogénea de local único de curva dupla proporcionado no software KinEx A™ (Sapidyne Instruments, Inc.) .
Exemplo 4
Comparação de Inibidores de Miostatina A capacidade de três exemplares pepticorpos de primeira série de ligar a (KD) e inibir (CI50) foi comparada com os valores KD e CI50 obtidos para a proteína solúvel de receptor de fusão actRIIB/Fc (R &D Systems, Inc., Minneapolis, Minn.). Os valores CI50 foram determinados utilizando o ensaio à base de células pMARE luc descrito no 119
Exemplo 3 e os valores de KD foram determinados utilizando o ensaio Biacore® descrito no Exemplo 3.
QUADRO III
Inibidor CI50 (ΠΜ) KD (nM) ActRIIB/Fc ~83 ~7 2xTN8-19-kc ~2 TN8-19 ~23 ~2 TN8-29 ~2 6 ~60 TN12-34 ~30 Linear-20 ~11
Os pepticorpos têm um CI50 que é melhorado sobre o inibidor de receptor/Fc e afinidades de ligação que são comparáveis em dois pepticorpos com o receptor/Fc.
Exemplo 5
Comparação da Capacidade do Péptido e Pepticorpo para inibir a Miostatina A seguinte sequência de péptido: QGHCTRWPWMCPPY (TN8- 19) (SEQ ID NO: 33) foi utilizada para construir 0 correspondente pepticorpo TN8-19(pb) de acordo com 0 procedimento descrito no Exemplo 2 anterior. Tanto 0 péptido em separado como o pepticorpo foram rastreados para a actividade de inibição da miostatina utilizando o ensaio à base de C2C12 descrito no Exemplo 3 anterior. Pode ver-se a partir da Figura 1 que a Cl5o (concentração efectiva para inibição de cinquenta por cento de miostatina) para o pepticorpo é significativamente menor que essa do péptido, e assim a capacidade do péptido para inibir a actividade de miostatina foi substancialmente melhorada colocando-o na configuração do pepticorpo.
Exemplo 6
Geração de Péptidos e pepticorpos maturados por afinidade
Diversos péptidos de primeira série utilizados para a geração de pepticorpo foram escolhidos para a maturação por afinidade. Os péptidos seleccionados incluíram os 120 seguintes: ο TN8-19 constrito de cisteína, QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 33), e os péptidos lineares Linear-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEQ ID NO: 104); Linear-15 HHGWNILRKGSAPQW-FEAWV (SEQ. ID NO: 117); Linear-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEQ ID NO: 119); Linear-20 YREMSMLEGLLDV-LERLQHY (SEQ ID NO: 122), Linear-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEQ ID NO: 123), Linear-24 EFFHWLHNHR-SEVNHWLDMN (SEQ ID NO: 126). Com base numa sequência consenso, bibliotecas de apresentação em fagos secundárias direccionadas foram geradas em que os aminoácidos "core" (determinados a partir da sequência consenso) foram ou mantidos constantes ou predispostos em frequência de ocorrência. Alternativamente, uma sequência individual de péptido poderia ser utilizada para gerar uma biblioteca de apresentação em fagos predisposta e direccionada. A selecção de tais bibliotecas sob condições mais rigorosas pode render péptidos com ligação potenciada a miostatina, ligação selectiva a miostatina, ou com alguma propriedade adicional desejada.
Produção de oligos decifrados para bibliotecas
Os oligonucleótidos foram sintetizados num sintetizador ADN que foram "decifrados" em 91% nas sequências core, isto é, cada solução foi 91% da base (A, G, C, ou T) representada, e 3% de cada um dos outros 3 nucleótidos. Para a família TN8-19, por exemplo, um oligo decifrado em 91% utilizado para a construção de um biblioteca de fago secundária foi o seguinte:
5’-CAC AGT GCA CAG GGT NNK NNK NNK caK ggK caK tgK acK cgK tgK ccK tgK atK tgK ccK ccK taK NNK NNK NNK CAT TCT CTC GAG ATC A-3’ (SEQ ID NO: 634)
I em que "N" indica que cada um dos quatro nucleótidos A, T, C, e G foram igualmente representados, K indica que G e T foram igualmente representados, e a letra em minúsculas representa uma mistura de 91% da base indicada e 3% de cada 121 uma das outras bases. A família de oligonucleótidos preparados desta maneira foi amplificada por PCR como foi descrito anteriormente, ligada em vectores phagemid, por exemplo, um plasmídeo pCESl modificado (Dyax), ou qualquer vector phagemid disponível de acordo com o protocolo descrito anteriormente. As bibliotecas de fago secundárias geradas foram todas decifradas em 91% e tinham entre 1 e 6,5χ 109 transformantes independentes. As bibliotecas foram seleccionadas como foi descrito anteriormente, mas com os seguintes condições:
Selecção Série 1: Número do fago de entrada: Método de selecção: Selecção negativa: Revestimento de selecção: Tempo de ligação: Condições de lavagem: Condição de eluição: Selecção Série 2: Número do fago de entrada: Método de selecção: Selecção negativa: Revestimento de selecção: 1012 - 1013 ufc de phagemid selecção do Tubo Immuno Nunc 2 X com Tubos Immuno Nunc revestidos com 2% de BSA a 10 min. cada
Revestimento com 1 pg de Proteína miostatina em 1 ml de 0,1 M de tampão de carbonato de sódio (pH 9,6) 3 horas
6 X 2%-Leite-PBST; 6 X PBST; 2 X PBS
100 mM de eluição TEA 1011 ufc de phagemid Selecção do Tubo immuno Nunc 2 X com Tubos Immuno Nunc revestidos com 2% de BSA a 30 min. cada
Revestimento com 1 pg de 122
Proteína miostatina em 1 ml de 0,1 M de tampão de carbonato de sódio (pH9,6)
Tempo de ligação: Condições de lavagem:
Condição de eluição: Selecção Série 3: Número do fago de entrada: Método de selecção: Selecção negativa: Revestimento de selecção:
Tempo de ligação: Condições de lavagem:
Condição de eluição: 1 hora
15 X 2%-Leite-PBST, 1 X 2%-Leite-PBST durante 1 h, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X 2%-BSA-PBST durante 1 h, 10 X PBST e 3 X PBS
100 mM de eluição TEA 1010 ufc de phagemid selecção do Tubo Immuno Nunc 6 X com Tubos Immuno Nunc revestidos com 2% de BSA a 10 min. cada
Revestimento com 0,1 pg de Proteína miostatina em 1 ml de 0,1 M de tampão de carbonato de sódio (pH 9,6) 1 hora
15 X 2%-Leite-PBST, 1 X 2%-Leite-PBST durante 1 h, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X 2%-BSA-PBST durante 1 h, 10 X PBST e 3 X PBS
100 mM de eluição TEA A selecção da bibliotecas secundárias rendeu péptidos com ligação potenciada a miostatina. Os clones individuais seleccionados foram submetidos a ELISA de fago, como foi descrito anteriormente, e sequenciados. 123 A seguinte família TN8-19 maturada por afinidade de péptidos é mostrada no Quadro IV a seguir.
QUADRO IV
Peptobody maturado por afinidade SEQ ID NO: Sequência peptídica mTN8-19-l 305 VALHGQCTRWPWMCPPQREG mTN8-19-2 306 YPEQGLCTRWPWMCPPQTLA mTN8-19-3 307 GLNQGHCTRWPWMCPPQDSN mTN8-19-4 308 MITQGQCTRWPWMCPPQPSG mTN8-19-5 309 AGAQEHCTRWPWMCAPNDWI mTN8-19-6 310 GVN QGQCTRWRWMCPPNGWE mTN8-19-7 311 LADHGQCIRWPWMCPPEGWE mTN8-19-8 312 ILEQAQCTRWPWMCPPQRGG mTN8-19-9 313 TQTHAQCTRWPWMCPPQWEG mTN8-19-10 314 WTQGHCTLWPWMCPPQRWR mTN8-19-ll 315 IYPHDQCTRWPWMCPPQPYP mTN8-19-12 316 S YWQGQC TRWPWMCPPQWRG mTN8-19-13 317 MWQQGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-14 318 EFTQWHCTRWPWMCPPQRSQ mTN8-19-15 319 LDDQWQCTRWPWMCPPQGFS mTN8-19-16 320 YQTQGLCTRWPWMCPPQSQR mTN8-19-17 321 ESNQGQCTRWPWMCPPQGGW mTN8-19-l 322 WTDRGPCTRWPWMCPPQANG mTN8-19-19 323 VGTQGQCTRWPWMCPPYETG mTN8-19-20 324 PYEQGKCTRWPWMCPPYEVE mTN8-19-21 325 SEYQGLCTRWPWMCPPQGWK 124 (continuação)
Peptobody maturado por SEQ ID NO: Sequência peptidica afinidade mTN8-19-22 326 TFSQGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-23 327 PGAHDHCTRWPWMCPPQSRY mTN8-19-24 328 VAEEWHCRRWPWMCPPQDWR mTN8-19-25 329 VGTQGHCTRWPWMCPPQPAG mTN8-19-26 330 EEDQAHCRSWPWMCPPQGWV mTN8-19-27 331 ADTQGHCTRWPWMCPPQHWF mTN8-19-28 332 SGPQGHCTRWPWMCAPQGWF mTN8-19-29 333 TLVQGHCTRWPWMCPPQRWV mTN8-19-30 334 GMAHGKCTRWAWMCPPQSWK mTN8-19-31 335 ELYHGQCTRWPWMCPPQSWA mTN8-19-32 336 VADHGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-33 337 PESQGHCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19-34 338 IPAHGHCTRWPWMCPPQRWR mTN8-19-35 339 FTVHGHCTRWPWMCPPYGWV mTN8-19-36 340 PDFPGHCTRWRWMCPPQGWE mTN8-19-37 341 QLWQGPCTQWPWMCPPKGRY mTN8-19-38 342 HANDGHCTRWQWMCPPQWGG mTN8-19-39 343 ETDHGLCTRWPWMCPPYGAR mTN8-19-40 344 GTWQGLCTRWPWMCPPQGWQ mTN8-19 conl 345 VATQGQCTRWPWMCPPQGWG mTN8-19 con2 346 VATQGQCTRWPWMCPPQRWG mTN8 con6-l 347 QREWYPCYGGHLWCYDLHKA mTN8 con6-2 348 ISAWYSCYAGHFWCWDLKQK mTN8 con6-3 349 WTGWYQCYGGHLWCYDLRRK mTN8 con6-4 350 KTFWYPCYDGHFWCYNLKSS mTN8 con6-5 351 ESRWYPCYEGHLWCFDLTET A sequência consenso derivada da TN-8-19- 1 maturada afinidade através de Con2 (excluindo as sequências mTN8 con6) mostrada anteriormente é: Ca^WasWMCPP (SEQ ID NO: 352) . Todos estes péptidos compreendem a sequência WMCPP (SEQ ID NO: 633). Os aminoácidos sublinhados representam os 125 aminoácidos core presentes em todas as formas de realização, e ai, a2 e a3 são seleccionados a partir de um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico. Numa forma de realização desta sequência consenso, Cbib2Wb3WMCPP (SEQ ID NO: 353), bi é seleccionado de qualquer um dos aminoácidos T, I, ou R; b2 é seleccionado de qualquer um de R, S, Q; e b3 é seleccionado de qualquer um de P, R e Q. Todos os péptidos compreendem a sequência WMCPP (SEQ ID NO: 633) . Uma análise mais detalhada das sequências TN8 maturadas por afinidade que compreendem a SEQ ID NO: 352 proporciona a seguinte fórmula:
CiC2C3C4C5C6ÇC7C8WC9WMCPPcioCiiCi2Ci3 (SEQ ID NO: 354), em que:
Ci está ausente ou qualquer aminoácido; c2 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; c3 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; C4 está ausente ou qualquer aminoácido; c5 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; Cê está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico; c7 é um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico; c8 é um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico; c9 é um hidrofóbica neutra, polar neutra ou básica aminoácido; e em que
Cio a Ci3 é qualquer aminoácido.
Numa forma de realização da formulação anterior, b7 é seleccionado de qualquer um dos aminoácidos T, I, ou R; b8 é seleccionado de qualquer um de R, S, Q; e b9 é seleccionado de qualquer um de P, R e Q. Isto proporciona a seguinte sequência: did2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WMCPP diodndi2di3 (SEQ ID NO: 355) . 126 di está ausente ou qualquer aminoácido; d2 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; d3 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; d4 está ausente ou qualquer aminoácido; d5 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou ácido; d6 está ausente ou um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico; d7 é seleccionado de qualquer um dos aminoácidos T, I, ou R; d8 é seleccionado de qualquer um de R, S, Q; d9 é seleccionado de qualquer um de P, R e Q e dio através de di3 são seleccionados de qualquer aminoácido. A sequência consenso da série mTN8 con6 é WYeie2Ye3G, (SEQ ID NO: 356) em que e3 é P, S ou Y; e2 é C ou Q, e e3 é G ou H.
Além das famílias maturadas por afinidade TN-19, péptidos maturados por afinidade adicionais foram produzidos a partir dos péptidos de primeira série L-2, L-15, L-17, L-20, L-21, e L-24 lineares. Estas famílias são
apresentadas no Quadro V a seguir. QUADROV
Peptobody maturado por afinidade SEQ ID NO: Sequência peptidica L2 104 MEMLDSLFELLKDMVPISKA mL2-Conl 357 RMEMLESLLELLKEIVPMSKAG mL2-Con2 358 RMEMLESLLELLKEIVPMSKAR mL2-l 359 RMEMLESLLELLKDIVPMSKPS mL2-2 360 GMEMLESLFELLQEIVPMSKAP mL2-3 361 RMEMLESLLELLKDIVPISNPP mL2-4 362 RIEMLESLLELLQEIVPISKAE 127(continuação)
Peptobody maturado por afinidade SEQ ID NO: Sequência peptidica mL2-5 363 RMEMLQSLLELLKDIVPMSNAR mL2-6 364 RMEMLESLLELLKEIVPTSNGT mL2 - 7 365 RMEMLESLFELLKEIVPMSKAG mL2-8 366 RMEMLGSLLELLKEIVPMSKAR mL2-9 367 QMELLDSLFELLKEIVPKSQPA mL2-10 368 RMEMLDSLLELLKEIVPMSNAR mL2-11 369 RMEMLESLLELLHEIVPMSQAG mL2-12 370 QMEMLESLLQLLKEIVPMSKAS mL2-13 371 RMEMLDSLLELLKDMVPMTTGA mL2-14 372 RIEMLESLLELLKDMVPMANAS mL2-15 373 RMEMLESLLQLLNEIVPMSRAR mL2-16 374 RMEMLESLFDLLKELVPMSKGV mL2-17 375 RIEMLESLLELLKDIVPIQKAR mL2-18 376 RMELLESLFELLKDMVPMSDSS mL2-19 377 RMEMLESLLEVLQEIVPRAKGA mL2-20 378 RMEMLDSLLQLLNEIVPMSHAR mL2-21 379 RMEMLESLLELLKDIVPMSNAG mL2-22 380 RMEMLQSLFELLKGMVPISKAG mL2-23 381 RMEMLESLLELLKEIVPNSTAA mL2-24 382 RMEMLQSLLELLKEIVPISKAG mL2-25 383 RIEMLDSLLELLNELVPMSKAR L-15 117 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV mL15-conl 384 QVESLQQLLMWLDQKLASGPQG mL15-l 385 RMELLESLFELLKEMVPRSKAV mL15-2 386 QAVSLQHLLMWLDQKLASGPQH mL15-3 387 DEDSLQQLLMWLDQKLASGPQL mL15-4 388 PVASLQQLLIWLDQKLAQGPHA mL15-5 389 EVDELQQLLNWLDHKLASGPLQ my15-6 390 DVESLEQLLMWLDHQLASGPHG mL15-7 391 QVDSLQQVLLWLEHKLALGPQV mL15-8 392 GDESLQHLLMWLEQKLALGPHG 128(continuação)
Peptobody maturado por afinidade SEQ ID NO: Sequência peptidica mL15-9 393 QIEMLESLLDLLRDMVPMSNAF mLl5-10 394 EVDSLQQLLMWLDQKLASGPQA mL15-ll 395 EDESLQQLLIYLDKMLSSGPQV mLl5-12 396 AMDQLHQLLIWLDHKLASGPQA mL15-13 397 RIEMLESLLELLDEIALIPKAW mLl5-14 398 EWSLQHLLMWLEHKLASGPDG mL15-15 399 GGESLQQLLMWLDQQLASGPQR mL15-16 400 GVESLQQLLIFLDHMLVSGPHD mL15-17 401 NVESLEHLMMWLERLLASGPYA mLl5-18 402 QVDSLQQLLIWLDHQLASGPKR mL15-19 403 EVESLQQLLMWLEHKLAQGPQG mLl5-20 404 EVDSLQQLLMWLDQKLASGPHA mL15-21 405 EVDSLQQLLMWLDQQLASGPQK mL15-22 406 GVEQLPQLLMWLEQKLASGPQR mL15-23 407 GEDSLQQLLMWLDQQLAAGPQV mLl5-24 408 ADDSLQQLLMWLDRKLASGPHV mL15-25 409 PVDSLQQLLIWLDQKLASGPQG L-17 119 RATLLKDFWQLVEGYGDN mL17-conl 410 DWRATLLKEFWQLVEGLGDNLV mL17-con2 411 QSRATLLKEFWQLVEGLGDKQA mL17-l 412 DGRATLLTEFWQLVQGLGQKEA mLl7-2 413 LARATLLKEFWQLVEGLGEKVV mL17-3 414 GSRDTLLKEFWQLWGLGDMQT mL17-4 415 DARATLLKEFWQLVDAYGDRMV mL17-5 416 NDRAQLLRDFWQLVDGLGVKSW mL17-6 417 GVRETLLYELWYLLKGLGANQG mL17-7 418 QARATLLKEFCQLVGCQGDKLS mL17-8 419 QERATLLKEFWQLVAGLGQNMR mL17-9 420 SGRATLLKEFWQLVQGLGEYRW mL17-10 421 TMRATLLKEFWLFVDGQREMQW mL17-ll 422 GERATLLNDFWQLVDGQGDNTG 129(continuação)
Peptobody maturado por afinidade SEQ ID NO: Sequência peptidica mL17-12 423 DERETLLKEFWQLVHGWGDNVA mLl7-13 424 GGRATLLKELWQLLEGQGANLV mL17-14 425 TARATLLNELVQLVKGYGDKLV mLl7-15 426 GMRATLLQEFWQLVGGQGDNWM mL17-16 427 STRATLLNDLWQLMKGWAEDRG mLl7-17 428 SERATLLKELWQLVGGWGDNFG mL17-18 429 VGRATLLKEFWQLVEGLVGQSR mL17-19 430 EIRATLLKEFWQLVDEWREQPN mL17-20 431 QLRATLLKEFLQLVHGLGETDS mLl7-21 432 TQRATLLKEFWQLIEGLGGKHV mL17-22 433 HYRATLLKEFWQLVDGLREQGV mLl7-23 434 QSRVTLLREFWQLVESYRPIVN M17-24 435 LSRATLLNEFWQFVDGQRDKRM mL17-25 436 WDRATLLNDFWHLMEELSQKPG mL17-26 437 QERATLLKEFWRMVEGLGKNRG mLl7-27 438 NERATLLREFWQLVGGYGVNQR L-20 122 YREMSMLEGLLDVLERLQHY mL20-l 439 HQRDMSMLWELLDVLDGLRQYS mL20-2 440 TQRDMSMLDGLLEVLDQLRQQR mL20-3 441 TSRDMSLLWELLEELDRLGHQR mL20-4 442 MQHDMSMLYGLVELLESLGHQI mL20-5 443 WNRDMRMLESLFEVLDGLRQQV mL20-6 444 GYRDMSMLEGLLAVLDRLGPQL mL20 conl 445 TQRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR mL20 con2 446 WYRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR L-21 123 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ mL21-l 447 TQNSRQMLLSDFMMLVGSMIQG mL21-2 448 MQTSRHILLSEFMMLVGSIMHG mL21-3 449 HDNSRQMLLSDLLHLVGTMIQG L21-4 450 MENSRQNLLRELIMLVGNMSHQ 130
continuação) Peptobody maturado por SEQ ID NO: Sequência peptidica afinidade mL21-5 451 QDTSRHMLLREFMMLVGEMIQG mL21 conl 452 DQNSRQMLLSDLMILVGSMIQG L-24 126 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN mL24-l 453 NVFFQWVQKHGRWYQWLDINV mL24-2 454 FDFLQWLQNHRSEVEHWLVMDV
Os péptidos maturados por afinidade proporcionados nos Quadros IV e V são então montados em pepticorpos como foi descrito anteriormente e ensaiados utilizando os ensaios in vivo.
Os péptidos L2 maturados por afinidade compreendem uma sequência consenso de f jEMLf 2SLf3f 4LL, (SEQ ID NO: 455), em que fi é M ou I; f2 é qualquer aminoácido; f3 é L ou F; e f4 é E, Q ou D. A família do péptido L15 maturado por afinidade compreende a sequência Lgig2LLg3g4L, (SEQ ID NO: 456), em que g4 é Q, D ou E, g2 é S, Q, D ou E, g3 é qualquer aminoácido, e g4 é L, W, F, ou Y. A família do L17 maturado por afinidade compreende a sequência: hih2h3h4hsh6h7h8h9 (SEQ ID NO: 457) em que h4 é R ou D; h2 é qualquer aminoácido; h3 é A, T, S ou Q; h4 é L ou M; h5 é L ou S; h6 é qualquer aminoácido; h7 é F ou E; h8 é W, F ou C; e h9 é L, F, M ou K. As sequências consenso podem também ser determinadas para a família de péptidos mL20, mL21 e mL24 mostrada anteriormente.
Os pepticorpos foram construídos a partir destes péptidos maturados por afinidade como foi descrito anteriormente, utilizando um linker unido ao domínio Fc de igGl humana, que tem a SEQ ID NO: 296, na terminação N (configuração N), na terminação C (configuração C) da Fc, ou em ambas as terminações N e C (configurações N,C), como foi descrito no Exemplo 2 anterior. Os péptidos nomeados 131 foram unidos às terminações C ou N via uma sequência linker 5 glicina (5G), 8 glicina ou k. Na versão de pepticorpo 2X os péptidos foram ligados com linkers tais como 5 gly, 8 gly ou k. Os péptidos maturados por afinidade e pepticorpos são designados com um pequeno "m" tal como mTN8-19-22, por exemplo. Os pepticorpos da presente invenção contêm ainda dois locais splice onde os péptidos foram escindidos nos vectores pHagemid. A posição destes locais splice são AQ-péptido-LE. Os pepticorpos geralmente incluem estes aminoácidos adicionais (embora não sejam incluídos nas sequências de péptido listadas nos quadros). Em alguns pepticorpos os aminoácidos LE foram removidos das sequências de péptidos. Estes pepticorpos são designados LE .
Os pepticorpos exemplares, e sequências de polinucleótidos exemplares que codificam os mesmos, são proporcionados no Quadro VI a seguir. Este quadro inclui exemplos de sequências de pepticorpo (como em oposição a péptido somente), tal como a 2x mTN8-19-7 (SEQ ID NO: 615) e o pepticorpo com as sequências LE deletadas (SEQ ID NO: 617) . Por meio de explicação, a sequência linkers nas versões 2x refere-se ao linker entre os péptidos em tandem. Estas sequências pepticorpo contêm a Fc, linkers, AQ e LE sequências. A sequência de nucleótidos acompanhante codifica a sequência de péptido além da sequência linkers AQ/LE, se está presente, mas não codifica o linker designado. 132
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL2-Conl RMEMLESLLELL KEIVPMSKAG CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 458) 5 gly N mL2-Con2 RMEMLESLLELL KEIVPMSKAR CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEQ ID NO: 459) · 5 gly N mL2-l RMEMLESLLELL KDIVPMSKPS CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC! TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAAACCATCT (SEQ ID NO: 460) 5 gly N mL2-2 GMEMLESLFELL QEIVPMSKAP GGTAT GGAAATGC T T GAATC T C T T T TTGAACTTCTTCAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCCA (SEQ ID NO: 46 T) 5 gly N mL2-3 RMEMLESLLELL KDIVPISNPP CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATTTCTAATCCACCA (SEQ ID NO: 462) 5 gly N mL2-4 RffiMLESLLELLQ EIVPISKAE CGTATTGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTCAAGAAATTGTTCC AATTTCTAAAGCTGAA (SEQ ID NO: 463) 5 gly N mL2-5 RMEMLQSLLELL KDIVPMSNAR CGTATGGAAATGCTTCAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAATGCTCGT (SEQ ID NO: 464) 5 gly N mL2-6 RMEMLESLLELL KEIVPTSNGT CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC rTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AACTTCTAATGGTACT (SEQ ID NO: 5 gly N 133 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL2-7 RMEMLESLFELL KETVPMSKAG CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTT j TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 46 6 ) 5 gly N mL2-8 RMEMLGSLLELL KEIVPMSKAR CGTATGGAAATGCTIGGTTCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT(SEQ ID NO: 467) 5 gly N mL2-9 QMELLDSLFELL JKEIVPKSQPA CAAATGGAACTTCTTGATTCTCTTT TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AAAATCTCAACCAGCT (SEQ ID NO: 468) 5 gly N my2-10 RMEMLDSLLELL KEIVPMSNAR CGTATGGAAATGCTTGATTCTCTTC rTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAATGCTCGT (SEQ ID NO: 469) 5 gly N mL 2-11 RMEMLESLLELL HEIVPMSQAG CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTCATGAAATTGTTCC AATGTCTCAAGCTGGT (SEQ ID NO: 470) 5 gly N mL2-12 QMEMLESLLQLL KEIVPMSKAS CAAATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTCAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTTCT (SEQ ID NO: 47T) 5 gly N mL2-13 RMEMLDSLLELL !KDMVPMTIGA CGTATGGAAATGCTTGATTCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATGGTTCC AATGACTACTGGTGCT (SEQ ID NO: 472) 5 gly N mL 2-14 RffiMLESLLELLK DMVPMANAS CGTATTGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATGGTTCC AATGGCTAATGCTTCT (SEQ ID NO: 473) 5 gly N 134 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL 2-15 RMEMLESLLQLL NEIVPMSRAR CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTCAACTTCTTAATGAAATTGTTCC AATGTCTCGTGCTCGT (SEQ ID NO: 474) 5 gly N mL2-16 RMEMLESLFDLL KELVPMSKGV CGTATGGAAATGCTIGAATCTCTTT TTGATCTTCTTAAAGAACTTGTTCC AATGTCTAAAGGTGTT (SEQ ID NO: 475) 5 gly N mL 2-17 RIEMLESLLELLK DIVPIQKAR CGTATTGAAATGCTTGAATCTCTTC rTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC kATTCAAAAAGCTCGT (SEQ ID NO: 476 ) 5 gly N mL2-18 RMELLESLFELLK DMVPMSDSS CGTATGGAACTTCTTGAATCTCTTT ITGAACTTCTTAAAGATATGGTTCC AATGTCTGATTCTTCT (SEQ ED NO: 477) 5 gly N mL 2-19 RMEMLESLLEVL QETVPRAKGA CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAAGTTCTTCAAGAAATTGTTCC AeGTGCTAAAGGTGCT (SEQ ID NO: 478) 5 gly N mL2-20 RMEMLDSLLQLL NEIVPMSHAR CGTATGGAAATGCTTGATTCTCTTC TTCAACTTCTTAATGAAATTGTTCC AATGTCTCATGCTCGT (SEQ ID NO: 479) 5 gly N mL2-21 RMEMLESLLELL KDIVPMSNAG CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAATGCTGGT (SEQ ID NO: 480) 5 gly N 135 (continuação
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL 2-2 2 RMEMLQSLFELL KGMVPISKAG CGTATGGAAATGCTTCAATCTCTTT TTGAACTTCTTAAAGGTATGGTTCC AATTTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 481) 5 gly N mL2-23 RMEMLESLLELL KEIVPNSTAA CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AAATTCTACTGCTGCT (SEQ ID NO: 482) . 5 gly N mL 2-2 4 RMEMLQSLLELL KEIVPISKAG CGTATGGAAATGCTTCAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATTTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 4831 5 gly N mL2-25 RffiMLDSLLELLN ELVPMSKAR CGTATTGAAATGCTTGATTCTCTTC TTGAACTTCTTAATGAACTTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEQ ID NO: 484) 5 gly N mLl7-Conl DWRATLLKEFW QLVEGLGDNLV GATTGGCGTGCTACTCTTCTTAAAG AA'ITiTGGCAACTTGTTGAAGGTCT TGGTGATAATCTTGTT (SEQ ID NO: 485) 5 gly N mL17—1 DGRATLLTEFWQ LVQGLGQKEA GATGGTCGTGCTACTCTTCTTACTG AAT T T T GGCAACT TGT T CAAGGTC T TGGTCAAAAAGAAGCT (SEQ ID NO: 486 ) 5 gly N mLl7-2 LARATLLKEFWQ LVEGLGEKW CTTGCTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AAT TXT GGCAACT TGT T GAAGGTC T TGGTGAAAAAGTTGTT (SEQ ID NO: 487) 5 gly N mLl7-3 GSRDTLLKEFWQ LWGLGDMQT GGTTCTCGTGATACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGTTGGTCT TGGTGATATGCAAACT (SEQ ID NO: 488) 5 gly N 136 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL17-4 DARATLLKEFWQ LVDAYGDRMV GATGCTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGATGCTTA TGGTGATCGTATGGTT (SEQ ID NO: 489) 5 gly N mLl7-5 NDRAQLLRDFWQ LVDGLGVKSW AATGATCGTGCTCAACTTCTTCGTG at t t t t ggcaac ttgttgatggtct TGGTGTTAAATCTTGG (SEQ ID NO: 490) 5 gly N mL17-6 GVRETLLYELWY LLKGLGANQG GGTGTTCGTGAAACTCTTCTTTATG AACTTTGGTATCTTCTTAAAGGTCT TGGTGCTAATCAAGGT (SEQ ID NO: 491) 5 gly N mL17-7 QARATLLKEFCQ LVGCQGDKLS CAAGCTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGTCAACTTGTTGGTTGTCA AGGTGATAAACTTTCT (SEQ ID NO: 492) 5 gly N mL17-8 QERATLLKEFWQ LVAGLGQNMR CAAGAACGTGCTACTCTTCTTAAA GAATITT GGCAAC TTGTTGCTGGTC TTGGTCAAAATATGCGT (SEQ ID NO: 493) 5 gly N mLl7-9 SGRATLLKEFWQ. LVQGLGEYRW rCTGGTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AA'rrn'GGCAACTIGTTCAAGGTCT rGGTGAATATCGTTGG (SEQ ID NO:; 494) 5 gly N mL17-10 TMRATLLKEFWL FVDGQREMQW ACTATGCGTGCTACTCTTCTTAAAG AAT TTTGGCTTTTTGTTGATGGTCA ACGTGAAATGCAATGG (SEQ ID NO: 495) 5 gly N 137 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL17-11 GERATLLNDFWQ LVDGQGDNTG GGTGAACGTGCTACTCTTCTTAATG ATTTTTGGCAACTTGTTGATGGTCA AGGTGATAATACTGGT (SEQ ID NO: 496 ) 5 gly N mL17—12 DERETLLKEFWQ LVHGWGDNVA GATGAACGTGAAACICTTCTTAAA GAATITT GGCAACTIGT T CAT GGT T GGGGTGATAATGTTGCT (SEQ ID NO: 497) 5 gly N mL17-13 GGRATLLKELWQ LLEGQGANLV GGTGGTCGTGCTACTCTTCTT AAAG J AACTTT GGCAACT TC TTGAAGGTC A ! AGGTGCTAATCTTGTT (SEQ ID NO : 498) 5 gly N mL17-14 TARATLLNELVQ LVKGYGDKLV ACTGCTCGTGCTACTCTTCTTAATG AACTTGTTCAACTTGTTAAAGGTTA TGGTGATAAACTTGIT (SEQ ID NO: 499) 5 gly N mL17-15 GMRATLLQEFWQ LVGGQGDNWM GGTATGCGTGCTACICTTCTTCAAG AATTTTGGCAACTTGTTGGTGGTCA AGGTGATAATTGGATG (SEQID NO: 500) 5 gly N mL17-16 STRATLLNDLWQ LMKGWAEDRG TCTACTCGTGCTACTCTTCTTAATG AT C T T T GGCAAC T TAT GAAAGGT T G GGCTGAAGATCGTGGT (SEQID NO: 501) 5 gly N mL17-17 SERATLLKELWQ LVGGWGDNFG TCTGAACGTGCTACICTTCTTAAAG AACTTTGGCAACTTGTTGGTGGTTG GGGTGATAATTTTGGT (SEQ ID NO: 502) 5 gly N 138 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ Linker Terminal pepticorpo ID No) GTTGGTCGTGCTACTCTTCTTAAAG VGRATLLKEFWQ AATTTTGGCAACTTGTTGAAGGTCT mL17-18 i-VEGLVGQSR TGTTGGTCAATCTCGT (SEQ ID NO: 5 gly N 503) M-GAQ- WYPCYEGHFWC TGGTATCCGTGTTATGAGGGTCACT YDL- TCTGGTGCTACGATCTGGGTTCTGG 2x mTN8- GSGSATGGSGST TTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGGT Con6-(N)- ASSGSGSATG- TCCGCTACTGGTTGGTACCCGTGCT 1K N 1K WYPCYEGHFWC ACGAAGGTCAC TTTTGGTGTTAT GA YDL-LE-5G-FC TCTG (SEQ ID NO: 505) (SEQJD N(*504L FC-5G-AQ- WYPCYEGHFWC rGGTATCCGTGTTATGAGGGTCACT YDIA rCTGGTGCTACGATCTGGGTTCTGG 2x mTN8- GSGSATGGSGST ITCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGGT Con6-(C)- ASSGSGSATG- rCCGCTACTGGTTGGTACCCGTGCT 1K C 1K WYPCYEGHFWC ACGAAGGTCAC TTTTGGTGTTAT GA YDL-LE (SEQID TCTG (SEQ ID NO: 507) NO: 506) M-GAQ- [FGCKWWDVQC ATCTTTGGCTGTAAATGGTGGGAC YQF- GTTCAGTGCTACCAGTTCGGTTCTG 2x mTN8- GSGSATGGSGST GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG Con7-(N)- ASSGSGSATG- TTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC 1K N 1K [FGCKWWDVQC AAGTGGTGGGATGTACAGTGTTAT yQF-LE-5G-FC CAGTTT (SEQ ID NO: 509) :SEQ ID NO: 508) 139 (contiuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal FC-5G-AQ- IFGCKWWDVQC ATCTTTGGCTGTAAATGGTGGGAC 2x mTN8-Con7-(C)-1K YQF- GSGSATGGSGST ASSGSGSATG- IFGCKWWDVQC GTTCAGTGCTACCAGTTCGGTTCTG GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG TTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC AAGTGGTGGGATGTACAGTGTTAT 1K C YQF-LE (SEQID CAGTTT (SEQ ID NO: 511) NO: 510) M-GAQ- IFGCKWWDVDC ATCTTTGGCTGTAAGTGGTGGGAC 2x mTN8-Con8-(N)-1K YQF- GSGSATGGSGST ASSGSGSATG- IFGCKWWDVDC GTTGACTGCTACCAGTTCGGTTCTG GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG rTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC AAATGGTGGGACGTTGATTGTTAT 1K N YQF-LE-5G-FC CAGTTT (SEQ ID NO: 513) (SEOIDNO:512) FC-5G-AQ- IFGCKWWDVDC ATCTTTGGCTGTAAGTGGTGGGAC 2x mTN8-Con8-(C)-1K YQF- GSGSATGGSGST ASSGSGSATG- IFGCKWWDVDC GTTGACTGCTACCAGTTCGGTTCTG GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG TTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC AAATGGTGGGACGTTGATTGTTAT 1K C YQF-LE (SEQID CAGTTT (SEQ ID NO: 515) NO: 514) CAGGTTGAATCCCTGCAGCAGCTG ML15-Conl QVESLQQLLMWL DQKLASGPQG CTGATGTGGCTGGACCAGAAACT G GCTTCCGGTCCGCAGGGT (SEQ ID NO: 516) 5 gly C CGTATGGAACTGCTGGAATCCCTG ML15-1 RMELLESLFELLK EMVPRSKAV TTCGAACTGCTGAAAGAAATGGTT CCGCGTTCCAAAGCTGTT (SEQID NO: 517) 5 gly C 140 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL15-2 QAVSLQHLLMW LDQKLASGPQH CAGGCTGTTTCCCTGCAGCACCTGC TGATGTGGC T GGACCAGAAAC T GG CTTCCGGTCCGCAGCAC (SEQID NO:518a 5 gly C mL15-3 DEDSLQQLLMWL DQKLASGPQL GACGAAGACT C CC T GCAGCAGCT G CTGATGTGGCTGGACCAGAAAC T G GCTTCCGGTCCGCAGCTG (SEQID NO: 519) 5 gly C mL15 -4 PVASLQQLLIWL DQKLAQGPHA CCGGTTGCTTCCCTGCAGCAGCTGC TGATCTGGCT GGACCAGAAAC T GG CTCAGGGTCCGCACGCT (SEQID NO: 520) 5 gly c mL15-5 EVDELQQLLNWL DHKLASGPLQ GAAGTT GACGAACT GCAGCAGC T G CIGAACTGGCTGGACCACAAACIG GCTTCCGGTCCGCTGCAG (SEQ ID NO: 521) 5 gly c mL15 -6 DVESLEQLLMWL DHQLASGPHG GACGTTGAATCCCTGGAACAGCTG CTGATGTGGCTGGACCACCAGCTG GCTTCCGGTCCGCACGGT (SEQID NO: 522) 5 gly c mL15 -7 QVDSLQQVLLWL EHKLALGPQV CAGGTTGACTCCCTGCAGCAGGTT CTGCTGTGGCTGGAACACAAACTG GCTCTGGGTCCGCAGGTT (SEQID NO: 523) 5 gly c mL15-8 GDESLQHLLMWL EQKLALGPHG GGTGACGAATCCCTGCAGCACCTG CTGATGTGGCT GGAACAGAAACT G GCTCTGGGTCCGCACGGT (SEQID NO: 524) 5 gly c mL15 -9 QIEMLESLLDLLR DMVPMSNAF CAGAICGAAATGCTGGAATCCCTG ] CTGGACCTGCTGCGIGACATGGTTC] CGATGTCCAACGCTTTC (SEQID NO: 525) 5 gly c 141 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL15 -10 EVDSLQQLLMWL DQKLASGPQA GAAGT T GAC T C CC T GCAGCAGC T G CTGATGTGGCTGGACCAGAAACT G GCTTCCGGTCCGCAGGCT (SEQ ID NO: 526 ) 5 gly C mL15-ll EDESLQQLLIYLD KMLSSGPQV GAAGACGAATC CC T GCAGCAGC T G CTGATCTACCTGGACAAAATGC T G TCCTCCGGTCCGCAGGTT (SEQ ID NO: 527) 5 gly C mL15 -12 AMDQLHQLLIWL DHKLASGPQA GCTATGGACCAGCTGCACCAGCTG CTGATCTGGCTGGACCACAAACT G GCTTCCGGTCCGCAGGCT (SEQ ID NO: 528) 5 gly c mL15-13 RIEMLESLLELLD EIALIPKAW CGTATCGAAATGCTGGAATCCCTG CTGGAACTGCTGGACGAAATCGCT CTGATCCCGAAAGCTTGG (SEQ ID NO: 529) 5 gly c mL15 -14 EWSLQHLLMWL EHKLASGPDG GAAGTTGTTTCCCTGCAGCACCTGC TGATGTGGCT GGAACACAAAC T GG CTTCCGGTCCGGACGGT (SEQID NO: 530) 5 gly c mL15-15 GGESLQQLLMWL DQQLASGPQR GGTGGTGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGCAGCTG GCTTCCGGTCCGCAGCGT (SEQ ID NO: 531) 5 gly c mL15-16 GVESLQQLLIFLD HMLVSGPHD GGTGTTGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATCTTCCTGGACCACATGCTGG TTTCCGGTCCGCACGAC (SEQID NO: 532) 5 gly c mL15 -17 NVESLEHLMMW LERLLASGPYA AACGTTGAATCCCTGGAACACCTG ATGATGTGGCTGGAACGTCTGCTG GCTTCCGGTCCGTACGCT (SEQID NO: 533) 5 gly c 142 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL15 -18 QVDSLQQLLIWL DHQLASGPKR CAGGTT GACT C CC T GCAGCAGCT G CTGATCTGGCTGGACCACCAGCTG GCTTCCGGTCCGAAACGT (SEQID NO: 534) 5 gly C mL15-19 EVESLQQLLMWL EHKLAQGPQG GAAGTTGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGAACACAAACT G GCTCAGGGTCCGCAGGGT (SEQID NO: 535) 5 gly C mL15-20 EVDSLQQLLMWL DQKLASGPHA GAAGT T GAC T C CC T GCAGCAGC T G CTGATGTGGCT GGACCAGAAACT G GCTTCCGGTCCGCACGCT (SEQ ID NO: 536 ) 5 gly c mL15-21 EVDSLQQLLMWL DQQLASGPQK 3AAGTTGACTCCCTGCAGCAGCTG 2TGATGTGGCT GGACCAGCAGC T G OCTTCCGGTCCGCAGAAA (SEQ ED MO: 537) 5 gly c mL15-22 GVEQLPQLLMWL EQKLASGPQR GGTGTTGAACAGCTGCCGCAGCTG CTGATGTGGCT GGAACAGAAACT G GCTTCCGGTCCGCAGCGT (SEQ ID INO: 538) 5 gly c mL15-23 GEDSLQQLLMWL DQQLAAGPQV GGTGAAGACT C CC T GCAGCAGC T G CTGATGTGGCTGGACCAGCAGCTG GCTGCTGGTCCGCAGGTT (SEQ ID NO: 539) 5 gly c mL15-24 ADDSLQQLLMW LDRKLASGPHV GCTGACGACTCCCTGCAGCAGCTG CrTGATGTGGCTGGACCGTAAACTG GCTTCCGGTCCGCACGTT (SEQ ID NO: 540) 5 gly c 143 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL15-25 PVDSLQQLLIWL DQKLASGPQG CCGGTTGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATCTGGCTGGACCAGAAACT G GCTTCCGGTCCGCAGGGT (SEQ ID NO: 541) 5 gly C mLl7-Con2 QSRATLLKEFWQ LVEGLGDKQA CAGTCCCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGGTTGAAGGT CTGGGTGACAAACAGGCT (SEQ ID NO: 542) 5 gly C mL17-19 EIRATLLKEFWQL VDEWREQPN GAAATCCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGGTTGACGAA TGGCGTGAACAGCCGAAC (SEQ ID NO: 543) 5 gly c mLl7-20 QLRATLLKEFLQL VHGLGETDS CAGCTGCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCCTGCAGCTGGTTCACGGTC rGGGTGAAACCGACTCC (SEQ ID NO: 544) 5 gly c mLl7-21 TQRATLLKEFWQ LIEGLGGKHV ACCCAGCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGATCGAAGGT CTGGGTGGTAAACACGTT (SEQ ID NO: 545) 5 gly c mLl7-22 HYRATLLKEFWQ LVDGLREQGV CACTACCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGGTTGACGGT CTGCGTGAACAGGGTGTT (SEQ ID NO: 546 ) 5 gly c mLl7-23 IQSRVTLLREFWQ LVESYRPIVN CAGTCCCGTGTTACCCTGCTGCGTG AATTCTGGCAGCTGGTTGAATCCTA CCGTCCGATCGTTAAC (SEQ ID NO: 547) 5 gly c 144 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL17-24 LSRATLLNEFWQ FVDGQRDKRM CTGTCCCGTGCTACCCTGCTGAACG AATTCTGGCAGTTCGTTGACGGTCA GCGTGACAAACGTATG (SEQ ID NO: 548) 5 gly C mLl7-25 WDRATLLNDFW HLMEELSQKPG rGGGACCGTGCTACCCTGCTGAAC GACTTCTGGCACCTGATGGAAGAA CTGTCCCAGAAACCGGGT (SEQ ID NO: 549) 5 gly C mL17-26 QERATLLKEFWR MVEGLGKNRG CAGGAACGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCGTATGGTTGAAGGT CTGGGTAAAAACCGIGGT (SEQ ED NO: 550) 5 gly c mLl7-2 7 NERATLLREFWQ LVGGYGVNQR AACGAACGTGCTACCCTGCTGCGT GAATTCTGGCAGCTGGTTGGTGGTT ACGGTGTTAACCAGCGT (SEQ ID NO: 551) 5 gly c mTN8Con6-l QREWYPCYGGHL WCYDLHKA CAGCGTGAATGGTACCCGTGCTAC GGTGGTCACCTGTGGTGCTACGAC CIGCACAAAGCI (SEQ ID NO: 552) 5 gly c mTN8Con6-2 ISAWYSCYAGHF WCWDLKQK ATCTCCGCTTGGTACTCCTGCTACG CTGGT CACT T C TGGTGC T GGGACC T GAAACAGAAA (SEQ ID NO: 553) 5 gly c mTN8Con6-3 WTGWYQCYGGH LWCYDLRRK TGGACCGGTTGGTACCAGTGCTAG GGTGGTCACCTGTGGTGCTACGAC CTGCGTCGTAAA (SEQ ID NO: 554) 5 gly c 145 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mTN8Con6-4 KTFWYPCYDGHF WCYNLKSS AAAACCTTCTGGTACCCGTGCTAC GACGGTCACTTCTGGTGCTACAAC CTGAAATCCTCC (SEQ ID NO: 545) 5 gly C mTN8Con6-5 ESRWYPCYEGHL WCFDLTET GAATCCCGTTGGTACCCGTGCTAC GAAGGTCACCTGTGGTGCTTCGAC CTGACCGAAACC (SEQ ID NO: 546) 5 gly C mL24-l NVFFQWVQKHG RWYQWLDINV AACATGGTCGTGTTGTTTATC AATG; GCTTGATATTAATGIT (SEQ ID NO: , 557) 5 gly c mL24-2 FDFLQWLQNHRS EVEHWLVMDV TTTGATTTTCTT CAATGGCTICAAA 1 AT CAICGT TCT GAAGT T GAACAT T G GCTTGTTATGGATGTT (SEQ ID NO: 558) 5 gly c mL 2 0 -1 HQRDMSMLWEL LDVLDGLRQYS CATCAACGTGATATGTCTATGCTTT GGGAACTTCTTGATGTTCTTGATGG TCTTCGTCAATATTCT (SEQ ID NO: 559) 5 gly c mL20-2 TQRDMSMLDGLL EVLDQLRQQR A.CTCAACGTGATAIGTCTATGCTTG ATGGTCTTCTTGAAGTTCTTGATCA ACTTCGTCAACAACGT (SEQ ID NO: 560) 5 gly c mL20-3 TSRDMSLLWELL EELDRLGHQR ACCTCCCGTGACATGTCCCTGCTGT GGGAACIGCIGGAAGAACIGGACC GTCTGGGTCACCAGCGT (SEQ ID NO: 561) 5 gly c 146 (continuação)
mL 2 0 -4 MQHDMSMLYGL VELLESLGHQI AT GCAACAT GATATGTC TATGCT T T ATGGTCTTGTTGAACTTCTTGAATC rCTTGGTCATCAAATT (SEQ ID NO: 5 62) 5 gly C mL20-5 WNRDMRMLESL FEVLDGLRQQV TGGAATCGTGATATGCGTATGCTTG AATCTCTTTTTGAAGTTCTTGATGG rCTTCGTCAACAAGTT (SEQ ID NO: 563) 5 gly C mL 2 0 -6 GYRDMSMLEGLL AVLDRLGPQL GGTTATCGTGATATGTCTATGCTTG AAGGTCTTCTTGCTGTTCTTGATCG TCTTGGTCCACAACTT (SEQ ID NO: 564) 5 gly C mL20 Conl TQRDMSMLEGLL EVLDRLGQQR ACTCAACGTGATATGTCTATGCTTG AAGGTCTTCTTGAAGTTCTTGATCG rCTTGGTCAACAACGT (SEQ ID NO: 565) 5 gly C mL20 Con2 WYRDMSMLEGL LEVLDRLGQQR TGGTACCGTGACATGTCCATGCTG GAAGGT C T GC TGGAAGTT C T GGAC CGTCTGGGTCAGCAGCGT (SEQ ID NO: 5 6 6 ) 5 gly C mL21-l TQNSRQMLLSDF MMLVGSMIQG ACTCAAAATTCTCGTCAAATGCTTC TTTCTGATTTTATGATGCTTGTTGG TTCTATGATTCAAGGT (SEQ ID NO: 567) 5 gly C mL21-2 MQTSRHELLSEFM MLVGSIMHG ATGCAAACTTCTCGTCATATTCTTC TTTCTGAATTTATGATGCTTGTTGG TTCTATTATGCATGGT (SEQ ID NO: 5 6 8) 5 gly C 147 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mL21-3 HDNSRQMLLSDL LHLVGTMIQG CACGACAACTCCCGTCAGATGCTG CTGTCCGACCTGCTGCACCTGGTTG GTACCATGATCCAGGGT (SEQ ID NO: 5 6 9) 5 gly C mL21-4 MENSRQNLLRELI jMLVGNMSHQ ATGGAAAACTCCCGICAGAACCTG CTGCGTGAACTGATCATGCTGGTTG GTAACATGTCCCACCAG (SEQ ID NO: 570) 5 gly C mL21-5 QDTSRHMLLREF MMLVGEMIQG AAGGACACCTCCCGTCACATGCTG 2 T GCG T GAAT T CAT GAT GCTGGTTG 31GAAATGATCCAGGGT (SEQ ID NO: 571) 5 gly c mL21 Conl DQNSRQMLLSDL MILVGSMIQG GACCAGAACTCCCGTCAGATGCTG CTGTCCGACCTGATGATCCTGGTTG GTTCCATGATCCAGGGT (SEQ ID NO: 572) 5 gly c mTN8-19-l VALHGQCTRWP WMCPPQREG GTTGCTCTTCATGGTCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AACGTGAAGGT (SEQ ID NO: 573) 5 gly c mTN8-19-2 YPEQGLCTRWPW MCPPQTLA TATCCAGAACAAGGTCT T TGTACT C GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AAACTCTTGCT (SEQ ID N: 574) 5 gly c mTN8-19-3 GLNQGHCTRWP WMCPPQDSN GGTCT GAACCAGGGTCACTGCACC 3GTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGACTCCAAC (SEQ ID NO: 575) 5 gly c 148 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mTN8-19-4 MTTQGQCTRWPW MCPPQPSG AT GAT TAC T CAAGGT CAAT GTAC T C GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AACCATCTGGT (SEQ ID NO: 576) 5 gly C mTN8-19-5 AGAQEHCTRWP WMCAPNDWI ' GCTGGTGCTCAGGAACACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCGCTCCG AACGACTGGATC (SEQ ID NO: 577) 5 gly C mTN8-19-6 3VNQGQCTRWR WMCPPNGWE GGTGTTAACCAGGGTCAGTGCACC CGTTGGCGTTGGATGTGCCCGCCG AACGGTTGGGAA (SEQ ID NO: 578) 5 gly c mTN8-19-7 LADHGQCIRWPW MCPPEGWE 21GGCIGACCACGGICAGTGCAT C CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG GAAGGIIGGGAA (SEQ ID NO: 579) 5 gly c mTN8-19-8 ILEQAQCTRWPW MCPPQRGG ATCCT GGAACAGGCICAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTGGTGGT (SEQ ID NO: 580) 5 gly c mTN8-19-9 iTQTHAQCTRWP JWMCPPQWEG ACTCAAACTCATGCTCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AATGGGAAGGT (SEQ ID NO: 581) 5 gly c mTN8-19-10 WTQGHCTLWP WMCPPQRWR GTTGTTACTCAAGGTCATTGTACTC ITT GGCCAT GGATGTGT CCACCACA ACGTTGGCGT (SEQ ID NO: 582) 5 gly c mTN8-19-ll IYPHDQCTRWPW MCPPQPYP ATTTATCCACATGATCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AACCATATCCA (SEQ ID NO: 583) 5 gly c 149 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mTN8-19-12 SYWQGQCTRWP WMCPPQWRG TCTTATTGGCAAGGTCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AATGGCGTGGT (SEQ ID NO: 584) 5 gly C mTN8-19-13 MWQQGHCTRWP WMCPPQGWG ATGTGGCAACAAGGTCAT TGTACT CGTTGGCCATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 585) 5 gly C mTN8-19-14 EFTQWHCTRWP WMCPPQRSQ GAAT T CACCCAGTGGCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTTCCCAG (SEQ ID NO: 586) 5 gly C mTN8-19-15 LDDQWQCTRWP WMCPPQGFS CTGGACGACCAGTGGCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTTCTCC (SEQ ID NO: 587) 5 gly c mTN8-19-16 YQTQGLCTRWP WMCPPQSQR rAT CAAACT CAAGGTCTTTGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AATCTCAACGT (SEQ ID NO: 588) 5 gly c mTN8-19-17 ESNQGQCTRWP WMCPPQGGW GAAT CTAATCAAGGT CAAT GTAC T CGTTGGCCATGGATGTGTCCACCA CAAGGTGGTTGG (SEQ ID NO: 589) 5 gly c mTN8-19-18 WTDRGPCTRWP WMCPPQANG TGGACCGACCGTGGTCCGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGCTAACGGT (SEQ ID NO: 590) 5 gly c mTN8-19-19 VGTQGQCTRWP WMCPPYETG GTTGGTACCCAGGGTCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG TACGAAACCGGT (SEQ ID NO: 591)1 5 gly c 150 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mTN8-19-20 fPYEQGKCTRWP WMCPPYEVE CCGTACGAACAGGGTAAATGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG TACGAAGTTGAA (SEQ ID NO: 592) 5 gly C mTN8-19-21 SEYQGLCTRWPW MCPPQGWK TCCGAATACCAGGGTCTGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGAAA (SEQ ID NO: 593) 5 gly C mTN8-19-22 TFSQGHCTRWPW MCPPQGWG ACCTTCTCCCAGGGTCACTGCACCC GTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCGC AGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 594) 5 gly C mTN8-19-23 PGAHDHCTRWP WMCPPQSRY CCGGGTGCTCACGACCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGTCCCGTTAC (SEQ ED NO: 595) 5 gly c mTN8-19-24 VAEEWHCRRWP WMCPPQDWR GT TGC T GAAGAAT GGCACTGCCGT CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGACTGGCGT (SEQ ID NO: 596) 5 gly c mTN8-19-25 VGTQGHCTRWP WMCPPQPAG GTTGGTACCCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCCGGCTGGT (SEQ ID NO: 597) 5 gly c mTN8-19-26 EEDQAHCRSWP WMCPPQGWV GAAGAAGACCAGGCTCACTGCCGT TCCTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGTT (SEQ ID NO: 598) 5 gly c mTN8-19-27 ADTQGHCTRWP WMCPPQHWF GCTGACACCCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCACTGGTTC (SEQ ID NO: 599) 5 gly c 151 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mTN8-19-28 SGPQGHCTRWPW MCAPQGWF TCCGGTCCGCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCGCTCCG CAGGGTTGGTTC (SEQ ID NO: 600) 5 gly C mTN8-19-29 TLVQGHCTRWP WMCPPQRW ACCCT GGT T CAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTTGGGTT (SEQ ID NO: 601) 5 gly C mTN8-19-30 GMAHGKCTRWA WMCPPQSWK GGTATGGCTCACGGTAAATGCACC CGTTGGGCTTGGATGTGCCCGCCG CAGTCCTGGAAA (SEQ ID NO: 602) 5 gly C mTN8-19-31 ELYHGQCTRWP WMCPPQSWA GAACTGTACCACGGICAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGTCCTGGGCT (SEQ ID NO: 603) 5 gly c mTN8-19-32 VADHGHCTRWP WMCPPQGWG GT TGC T GACCACGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 604 5 gly c mTN8-19-33 PESQGHCTRWPW MCPPQGWG CCGGAATCCCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 605) 5 gly c mTN8-19-34 IPAHGHCTRWPW MCPPQRWR ATCCCGGCTCACGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTTGGCGT (SEQ ID NO: 606) 5 gly c mTN8-19-35 FTVHGHCTRWP WMCPPYGWV TTCACCGTTCACGGTCACTGCACCC GTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCGT ACGGTTGGGTT (SEQ ID NO: 607) 5 gly c 152 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal mTN8-19-36 PDFPGHCTRWRW MCPPQGWE CCAGATTTTCCAGGTCATTGTACTC GTTGGCGTTGGATGTGTCCACCAC AAGGTTGGGAA (SEQ ID NO: 608) 5 gly C mTN8-19-37 QLWQGPCTQWP WMCPPKGRY CAGCT GTGGCAGGGTCCGTGCACC CAGTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG AAAGGTCGTTAC (SEQ ID NO: 609) 5 gly C mTN8-19-38 HANDGHCTRWQ WMCPPQWGG CACGC TAACGACGGTCACTGCACC CGTTGGCAGTGGATGTGCCCGCCG CAGTGGGGTGGT (SEQ ID NO: 610) 5 gly C mTN8-19-39 ETDHGLCTRWPW MCPPYGAR GAAACCGACCACGGICTGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG TACGGTGCTCGT (SEQ ID NO: 611) 5 gly c mTN8-19-40 GTWQGLCTRWP WMCPPQGWQ GGTACCTGGCAGGGICTGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGCAG (SEQ ID NO: 612) 5 gly c mTN8-19 Conl VATQGQCTRWP WMCPPQGWG GTTGCTACCCAGGGTCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 613) 5 gly c 153 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ Linker Terminal pepticorpo ID No) GTTGCTACCCAGGGTCAGTGCACC mTN8-19 VATQGQCTRWP CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG 5 gly C Con2 WMCPPQRWG CAGCGTTGGGGT (SEQ ID NO: 614) CTTGCTGATCATGGTCAATGTATTC FC-5G-AQ- GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAG LADHGQCIRWPW AAGGTTGGGAACTCGAGGGTTCCG MCPPEGWELEGS GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC 2X mTN8- GSATGGSGSTASS CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT 1K C 19-7 GSGSATGLADHG GCTACTGGTCTGGCTGACCACGGT QCIRWPWMCPPE CAGTGCATCCGTTGGCCGTGGATG GWE-LE (SEQID TGCCCGCCGGAAGGTTGGGAACTG NO: 615) GAA (SEQ ID NO: 616) CTTGCTGATCATGGTCAATGTATTC FC-5G-AQ- GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAG LADHGQCIRWPW AAGGTTGGGAAGGTTCCGGTTCCG MCPPEGWEGSGS 2X mTN8- ATGGSGGGASSG CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGCG 19-7 ST-GG SGSAT GLADHGQ CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC 1K c del2x LE CIRWPWMCPPEG TGGTC T GGCTGACCACGGTCAGTG CATCCGTTGGCCGTGGATGTGTCCA WE (SEQ ID NO: CCAGAAGGTTGGGAA (SEQ ID NO: 617) 618) 154 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ Linker Terminal pepticorpo ID No) TCTGAATATCAAGGTCTTTGTACTC FC-5G-AQ- GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAG SEYQGLCTRWPW AAGGTTGGAAACTCGAGGGTTCCG MCPPQGWKLEGS GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC 2X mTN8- GSATGGSGSTASS CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT 1K C 19-21 GSGSATGSEYQG GCTACTGGTTCTGAGTATCAAGGC LCTRWPWMCPPQ CTCTGTACTCGCTGGCCATGGATGT GWK-LE (SEQ ID GTCCACCACAAGGCTGGAAGCTGG NO: 619) AA (SEQ ID NO: 620) FC-5G-AQ- rCTGAATATCAAGGTCTTTGTACTC, SEYQGLCTRWPW GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC MCPPQGWKGSGS AAGGTTGGAAAGGTTCCGGTTCCG , 2X ATGGSGGGASSG CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGCG mTN8-19-21 SGSATGSEYQGL CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC 1K C ST-GG CTRWPWMCPPQ TGGTTCTGAGTATCAAGGCCTCTGT del2x LE GWK (SEQ ID ACTCGCTGGCCATGGATGTGTCCA NO: CCACAAGGTTGGAAA (SEQ ID NO: 621) 622) ACTTTTTCTCAAGGTCATTGTACTC FC-5G-AQ- GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC TFSQGHCTRWPW AAGGTTGGGGTCTCGAGGGTTCCG MCPPQGWGLEGS GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC 2X mTN8- GSATGGSGSTASS CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT 1K c 19-22 GSGSATGTFSQG GCTAC TGGTAC T T T T TC T CAAGGCC HCTRWPWMCPP ATTGTACTCGCTGGCCATGGATGTG QGWG-LE (SEQ TCCACCACAAGGCTGGGGCCTGGA ID NO: 623) A (SEQ ID NO: 624) 155 (continuação)
Nome do Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ Linker Terminal pepticorpo ID No) FC-5G-AQ- GTTGCTGATCATGGTCATTGTACTC i VADHGHCTRWP GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC WMCPPQGWGLE AAGGTTGGGGTCTCGAGGGTTCCG GSGSATGGSGST GTTCCGCAACCGGCGGCTCTGGCT 2X mTN8- ASSGSGSATGVA CCACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTC 1K C 19-32 DHGHCTRWPWM TGCTACTGGTGTTGCTGACCACGGT CPPQGWG-LE CACTGCACCCGTTGGCCGTGGATG (SEQ ID NO: TGCCCGCCGCAGGGTTGGGGTCTG 625) GAA (SEQ ID NO: 626) GTTGCTGATCATGGTCATTGTACTC FC-5G-AQ- GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC VADHGHCTRWP AAGGTTGGGGTGGTTCCGGTTCCG 2X WMCPPQGWGGS CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGTG mTN8-19-32 GSATGGSGGGAS CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC 1K C ST-GG SGSGSATGVADH TGGTGTTGCTGACCACGGTCACTGC del2x LE GHCTRWPWVCPP ACCCGTTGGCCGTGGGTGTGTCCA QGWG (SEQ ID CCACAAGGTTGGGGT (SEQ ID NO: NO: 627) 628) CCAGAATCTCAAGGTCATTGTACTC FC-5G-AQ- GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC PESQGHCTRWPW AAGGTTGGGGTCTCGAGGGTTCCG MCPPQGWGLEGS GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC 2X mTN8- GSATGGSGSTASS CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT 1K c 19-33 GSGSATGPESQG GCTACTGGTCCGGAATCCCAGGGT HCTRWPWMCPP CACTGCACCCGTTGGCCGTGGATG QGWGLE (SEQ ID rGCCCGCCGCAGGGTTGGGGTCTG NO: 629) GAA (SEQ ID NO: 630) 156 (continuação)
Nome do pepticorpo Péptido Sequência de nucleótidos (SEQ ID No) Linker Terminal 2X FC-5G-AQ- CCAGAATCTCAAGGT CAT T GTACT C 1K c mTN8-19-33 PESQGHCTRWPW GT T GGCCAT GGAT GT GT CCACCAC ST-GG del2x MCPPQGWGGSGS AAGGTTGGGGTGGTTCCGGTTCCG LE ATGGSGGGASSG SGSATGPESQGH CTRWPWMCP PQGWG (SEQ ID jNO: 631) CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGTG CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC TGGTCCGGAATCCCAGGGTCACTG CACCCGTTGGCCGTGGATGTGTCC ACCACAAGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 632)
Exemplo 7
Rastreio in vitro de pepticorpos maturados por afinidade
Os seguintes pepticorpos exemplares foram rastreados de acordo com os protocolos estabelecidos anteriormente para obter os seguintes valores KD e CI50. 0 Quadro VII mostra o intervalo de valores KD para pepticorpos maturados por afinidade seleccionados em comparação com os pepticorpos parentais, como determinado por ensaios baseados em solução KinExA™ ou ensaios BIAcore®. Estes valores demonstram afinidade aumentada de ligação dos pepticorpos maturados por afinidade para miostatina em comparação com os pepticorpos parentais. 0 Quadro VIII mostra valores CI50 para um número de pepticorpos maturados por afinidade. Um intervalo de valores é dado neste quadro.
Quadro 7
pepticorpos KD TN8-19 (parent) > 1 nM 2xmTN8-19 (parent) > 1 nM lx mTN8-19-7 10 pM 2x mTN8-19-7 12 pM 157 (continuação)
pepticorpos KD lx mTN8-19-21 6 pM 2x mTN8-19-21 6 pM lx mTN8-19-32 9 pM lx mTN8-19-33 21 pM 2x mTN8-19-33 3 pM lx mTN8-19-22 4 pM lx mTN8-19-conl 20 pM
QUADRO VIII
Peptobody maturado por afinidade CI50 (nM) mTN8-19 Conl 1,0 - 4,4 mTN8-19-2 7,508-34,39 mTN8-19-4 16,74 mTN8-19-5 7,743 - 3,495 mTN8-19-6 17,26 mTN8-19-7 1, 778 mTN8-19-9 22,96-18,77 mTN8-19-10 5,252 - 7,4 mTN8-19-ll 28,66 mTN8-19-12 980, 4 mTN8-19-13 20, 04 mTN8-19-14 4,065 - 6,556 mTN8-19-16 4, 654 mTN8-19-21 2,767-3,602 mTN8-19-22 1,927-3,258 mTN8-19-23 6,584 mTN8-19-24 1,673-2,927 mTN8-19-27 4,837-4,925 mTN8-19-28 4,387 mTN8-19-29 6,358 mTN8-19-32 1,842-3,348 mTN8-19-33 2,146-2,745 158 (continuação)
Peptobody maturado por afinidade CI50 (nM) mTN8-19-34 5,028 - 5,069 mTN8Con6-3 86,81 mTN8Con6-5 2385 mTN8-19-7(-LE) 1,75-2,677 mTN8-19-21(-LE) 2,49 mTN8-19-33(-LE) 1,808 2xmTN8-19-7 0,8572 -2,649 2xmTN8-19-9 1,316-1,228 2xmTN8-19-14 1,18-1,322 2xmTN8-19-16 0,9903 -1,451 2xmTN8-19-21 0,828 -1,434 2xmTN8-19-22 0,9937-1,22 2xmTN8-19-27 1,601-3,931 2xmTN8-19-7(-LE) 1,077-1,219 2xmTN8-19-21 (-LE) 0,8827-1,254 2xmTN8-19-33(-LE) 1,12-1,033 mL2-7 90,24 mL2-9 105, 5 mLl5-7 32, 75 mLl5-9 354, 2 mL20-2 122, 6 mL20-3 157, 9 mL20-4 160
Exemplo 8
Actlvldade Anabólicas In vivo de Pepticorpos Exemplares 0 modelo de ratinho CDl nu/nu (Charles River Laboratories, Massachusettes) foi utilizado para determinar a eficácia in vivo dos pepticorpos da presente invenção que incluíam a região Fc humana (huFc). Este modelo respondeu aos inibidores da presente invenção com uma resposta anabólica rápida que foi associada à massa muscular seca 159 aumentada e um aumento em proteínas miofibrilares, mas não foi associada a acumulação no conteúdo de água corporal.
Num exemplo, a eficácia de pepticorpo lx mTN8-19-21 in vivo foi demonstrada pela seguinte experiência. Um grupo de ratinhos CDl nu/nu de 10 8 semanas foi tratado duas vezes na semana ou uma vez na semana com dosagens de 1 mg/kg, 3 mg/kg e 10 mg/kg (injecção subcutânea). O grupo de controlo de ratinhos CDl nu/nu de 10 8 semanas recebeu uma injecção (subcutânea) duas vezes na semana de huFc (veículo) a 10 mg/kg. Os animais foram pesados dia sim, dia não e a massa corporal magra determinada por meio de RMN no dia 0 e dia 13. Os animais são então sacrificados no dia 14 e o tamanho do músculo gastrocnémio determinado. Os resultados são mostrados nas Figuras 2 e 3. A Figura 2 mostra o aumento em peso corporal total dos ratinhos ao longo de 14 dias para as diversas dosagens de pepticorpo em comparação com o controlo. Como pode ser visto a partir da Figura 2 todas as dosagens mostraram um aumentam em peso corporal em comparação com o controlo, com todas as dosagens mostrando aumento estatisticamente significativo sobre o controlo pelo dia 14. A Figura 3 mostra a mudança em massa corporal magra no dia 0 e dia 13 como determinado por meio de RMN, bem como a mudança em peso do músculo gastrocnémio dissecado dos animais no dia 14.
Em outro exemplo, o pepticorpo lx mTN8-19-32 foi administrado a ratinhos CDl nu/nu numa injecção de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, e 30 mg/kg bissemanalmente em comparação com o controlo de huFc (veículo) . Os animais tratados com pepticorpo mostram um aumentam em peso corporal total (não mostrado) bem como massa corporal magra no dia 13 em comparação com dia 0 como determinado por meio da medição por RMN. O aumento em massa corporal magra é mostrado na Figura 4.
Em outro exemplo, um pepticorpo lx maturado por afinidade foi comparado com um pepticorpo 2x maturado por 160 afinidade para a eficácia anabólica in vivo. Os ratinhos machos CDl nu/nu (10 animais por grupo) foram tratados duas vezes na semana com injecções de 1 mg/kg e 3 mg/kg de lx mTN8-19-7 e 2x mTN8-19-7 durante 35 dias, enquanto o grupo de controlo (10 animais) recebeu injecções duas vezes na semana de huFc (3 mg/kg) . Como é mostrado na Figura 5, o tratamento com o pepticorpo 2x resultou num maior ganho de peso corporal e peso de carcaça magra na necropsia em comparação com pepticorpo lx ou controlo.
Exemplo 9
Aumento em resistência muscular
Os ratinhos machos C57B/6 normais de idade comparada de 4 meses foram tratados durante 30 dias com 2 injecções por semana injecções subcutânea 5 mg/kg por semana de 2x mTN8-19-33, 2x mTN8-19-7, e grupo de controlo de veículo huFc (10 animais/grupo). Os animais foram permitidos que se recuperassem sem quaisquer injecções adicionais. A força de preensão foi medida no dia 18 do período de recuperação. A força de preensão foi medida utilizando um medidor Columbia Instruments, modelo 1027 dsm (Columbus, Ohio). O tratamento com pepticorpo resultou em aumento significativo em força de preensão, com animais 2x mTN8-19-33 pré-tratados mostrando um aumento de 14 % em força de preensão em comparação com os ratinhos tratados com controlo, enquanto 2x mTN8-19-7 mostrous um aumento de 15% em força de preensão em comparação com os ratinhos tratados com controlo.
Exemplo 10 Farmacocinética
As experiências farmacocinéticas in vivo foram realizadas utilizando pepticorpos representativos sem as sequências LE. Doses de 10 mg/kg e 5 mg/kg foram administradas a ratinhos CDl nu/nu e os seguintes parâmetros determinados: Cmax (ug/mL), área sob a curva (AUC) (ug-hr/mL), e semivida (hr). Encontrou-se que as 161 versões 2x dos pepticorpos maturados por afinidade têm uma semivida significativamente mais longa que as versões lx. Por exemplo lx mTN8-19-22 maturado por afinidade tem uma semivida nos animais de aproximadamente 50,2 horas, enquanto 2x mTN8-19-22 tem um semivida de aproximadamente 85,2 horas, lx mTN8-7 maturado por afinidade tem uma semivida de aproximadamente 65 horas, enquanto 2x mTN8-19-7 tem uma semivida de aproximadamente 106 horas.
Exemplo 11
Tratamento de ratinhos mdx
Os pepticorpos da presente invenção mostraram aumentar a massa muscular magra num animal e são úteis para o tratamento de uma variedade de distúrbios que envolvem atrofia muscular. A distrofia muscular é um daqueles distúrbios. O modelo de ratinho para distrofia muscular de Duchenne é o ratinho Duchenne mdx (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Os ratinhos mdx envelhecidos (10 meses) foram injectados com o pepticorpo lx mTN8-19-33 (n=8/grupo) ou com o veiculo proteina huFc (N=6/grupo) para um período de tempo de três meses. O programa de dosagem foi dia sim, dia não, 10 mg/kg, por injecção subcutânea. O tratamento com pepticorpo teve um efeito positivo sobre o aumento e manutenção da massa corporal para os ratinhos mdx envelhecidos. Aumentos significativos em peso corporal foram observados no grupo tratado com pepticorpo em comparação com o grupo de controlo tratado com hu-Fc, como é mostrado na Figura 6A. Além disso, a análise por RMN revelou que a razão da massa corporal magra em relação a massa adiposa foi também significativamente aumentada nos ratinhos mdx envelhecidos como um resultado do tratamento com pepticorpo em comparação com o grupo de controlo, e que a percentagem de gordura de peso corporal diminuiu nos ratinhos tratados com pepticorpo em comparação com o grupo de controlo, como é mostrado na Figura 6B. 162
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> AMGEN, INC.
Han, HQ Min Hosung
Boone, Thomas Charles Λ M CO O V AGENTES DE LIGAÇÃO QUE INIBEM A MIOSTATINA <130> A-828 (WO) <140> <141> A SER ASSIGNADO 19-12-2003 <150> <151> US 60/435.923 20-12-2002 <160> 634 A O \—1 V Patentln versão 3.2 <210> <211> <212> <213> 1 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 1
Lys Asp Lys Cys Lys Met Trp His Trp Met Cys Lys Pr o Pro 1 5 TO <210> 2 <211> <212> <213> 14 PRT Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 2
Lys Asp Leu Cys Ala Met Trp His Trp Met Cys Lys Pro Pro 1 5 .10 163
<210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 3
Asp Leu Cys Lys Met Trp Lys Trp Met Cys Lys Pro Pro 15 10
<210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 4
Lys Asp Leu Cys Lys Met Trp His Trp Met Cys Lys Pro Lys 15 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 5
Trp Tyr Pro Cys Tyr Glu Pke His Phe Trp Cys Tyr Asp Leu 15 10
<210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 164 <400> 6
Trp Tyr Pro Cys Tyr Glu Gly His Phe Trp Cys Tyr Asp Leu 15 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 7
Ile Phe Gly Cys Lys Trp Trp Asp Vai Gin Cys Tyr Gin Phe 15 10
<210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 8
Ile Phe Gly Cys Lys Trp Trp Asp Vai Asp Cys Tyr Gin Phe 1 5 10
<210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial.Sequence <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 9
Ala Asp Trp Cys vai Ser iro Asn Trp Phe Cys Met Vai Met 1 5 10 <210> 10 165
<211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 10
His Lys Phe Cys Pro Trp Trp Ala Leu Phe Cys Trp Asp Phe 1 5 10
<210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 11
Lys Asp Leu Cys Lys Met Trp His Trp Met Cys Lys Pro Pro 15 10
<210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 12
Ile Asp Lys Cys Ala Ile Trp Gly Trp Met Cys Pro Pro Leu 1 ' ' 5 10 <210> 13
<211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 166 <40 0> 13
Trp Tyr Pro Cys Gly Glu Phe Gly Met Trp Cys Leu Asn Vai 15 10
<210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 14
Trp Phe Thr Cys Leu Trp Asn Cys Asp Asn Glu 1 5 '10
<210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 15
His Thr Pro Cys Pro Trp Phe Ala Pro Leu Cys Vai Glu Trp 15 10
<210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 16
Lys Glu Trp Cys Trp Arg Trp Lys Trp Met Cys Lys Pro Glu 1 5 10
<210> 17 <211> 14 <212> PRT 167 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 17
Phe Glu Thr Cys Pro Ser Trp Ala Tyr Phe Cys Leu Asp lie 15 10
<210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 18
Ala Tyr Lys Cys Glu Ala Asn Asp Trp Gly Cys Trp Trp Leu 1 5 10
<210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 19
Asn Ser Trp Cys Glu Asp Gin Trp His Arg Cys Trp Trp Leu 1 5 10
<210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 20 168
Trp Ser Ala Cys Tyr Ala Gly His Phe Trp Cys Tyr Asp Leu 15 10
<210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 21
Ala Asn Trp Cys Vai Ser Pro Asn Trp Phe Cys Met Vai Met 15 10
<210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 22
Trp Thr Glu Cys Tyr Gin Gin Glu Phe Trp Cys Trp Asn Leu 15 10
<210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 23
Glu Asn Thr, Cys Glu Arg Trp Lys Trp Met Cys Pro Pro Lys 15 10
<210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 169 <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 24
Trp Leu Pro Cys His Gin Glu Gly Phe Trp Cys Met Asn Phe 1-5 10
<210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 25
Ser Thr Met Cys Ser Gin Trp His Trp Met Cys Asn Pro Phe 15 10
<210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 26
Ile Phe Gly Cys His Trp Trp Asp Vai Asp Cys Tyr Gin Phe 1 5 10
<210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 27
Ile Tyr Gly Cys Lys Trp Trp Asp Ile Gin Cys Tyr Asp Ile 1 5 10 <210> 28 170
<211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 28
Pro Asp Trp Cys Ile Asp Pro Asp Trp Trp Cys Lys Phe Trp 15 10
<210> 29 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 29
Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Tyr 1 5 10
<210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 30
Trp Gin Glu Cys Tyr Arg Glu Gly Phe Trp Cys Leu Gin Thr 15 10
<210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 31 171
Trp Phe Asp Cys Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Cys Trp Ser Pro 1 5 10
<210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 32
Gly Vai Arg Cys Pro Lys Gly His Leu Trp Cys Leu Tyr Pro 15 10
<210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 33
His Trp Ala Cys Gly Tyr Trp Pro Trp Ser Cys Lys Trp Vai 15 10
<210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 34
Gly Pro Ala Cys His Ser Pro Trp Trp Trp Cys Vai Phe Gly 15 10
<210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial 172 <22 0> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 35
Thr Thr Trp Cys Ile Ser Pro Met Trp Phe Cys Ser Gin Gin 15 10
<210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 36
His Lys Phe Cys Pro Pro Trp Ala Ile Phe Cys Trp Asp Phe 15 10
<210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 37
Pro Asp Trp Cys Vai Ser Pro Arg Trp Tyr Cys Asn Met Trp 15 10
<210> 38 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 38
Val Trp Lys Cys His Trp Phe Gly Met Asp Cys Glu Pro Thr 1 5 10 173
<210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 39
Lys Lys His Cys Gin Ile Trp Thr Trp Met Cys Ala Pro Lys 15 10
<210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 40
Trp Phe Gin Cys Gly Ser Thr Leu Phe Trp Cys Tyr Asn Leu 15 10
<210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 41
Trp Ser Pro Cys Tyr Asp His Tyr Phe Tyr CyS Tyr Thr Ile 1 5 10
<210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 174 <400> 42
Ser Trp Met Cys Gly Phe Phe Lys Glu Vai Cys Met Trp Vai 1 5 10
<210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 43
Glu Met Leu Cys Met He His Pro Vai phe Cys Asn Pro His 15. io
<210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 44
Leu Lys Thr Cys Asn Leu Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Leu 1 5 10 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 45
Vai Vai Gly Cys Lys Trp Tyr Glu Ala Trp Cys Tyr Asn Lys 15 10 <210> 46 <211> 14 175
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 46
Pro Ile His Cys Thr Gin Trp Ala Trp Met Cys Pro Pro Thr 1 5 10
<210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 47
Asp Ser Asn Cys Pro Trp Tyr Phe Leu Ser Cys vai Ile Phe 15 10
<210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 48
His ile Trp Cys Asn Leu Ala Met Met Lys Cys vai Glu Met 1 5 10
<210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 49 176
Asn Leu Gin Cys Ile Tyr Phe Leu Gly Lys Cys lie Tyr Phe 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 50 Ala Trp Arg Cys Met Trp Phe Ser Asp Vai 1 5 10 <210> 51 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 51
Trp Phe Arg Cys Phe Leu Asp Ala Asp Trp Cys Thr Ser Vai 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 52
Gl'u Lys Ile Cys Gin Met Trp Ser Trp Met Cys Ala Pro Pro 15 10
<210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial 177 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 53
Trp Phe Tyr Cys His Leu Asn Lys Ser Glu Cys Thr Glu Pro 15 10 <210> 54 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 54
Phe Trp Arg Cys Ala lie Gly Ile Asp Lys Cys Lys Arg Vai 15 10
<210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 55
Asn Leu Gly Cys Lys Trp Tyr Glu Vai Trp Cys Phe Thr Tyr 1 5 10
<210> 56 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 56
Ile Asp Leu Cys Asn Met Trp Asp Gly Met Cys Tyr Pro Pro 15 10 178
<210> 57 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 57
Glu Met Pro Cys Asn Ile Trp Gly Trp Met Cys Pro Pro Vai 1 5 10
<210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 58
Trp Phe Arg Cys Vai teu Thr Gly He Vai Asp Trp Ser Glu Cys Phe 15 10 15
Gly Leu <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 59
Trp Phe Arg Cys Vai Leu Thr Gly He Vai Asp Trp Ser Glu Cys Phe 15 10 15
Gly Leu
<210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial 179 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 60
Leu Pro Trp Cys His Asp Gin Vai Asn Ala Asp Trp Gly Phe Cys Met 1 5 10 15
Leu Trp
<210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 61
Tyr Pro Thr Cys Ser Glu Lys Phe Trp Xle Tyr Gly Gin Thr Cys Vai 15 10 15
Leu Trp
<210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 62
Leu Gly Pro Cys Pro Ile His His Gly Pro Trp Pro Gin Tyr Cys Vai 1 5 10 15
Tyr Trp
<210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial 180 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 63
Pro Phe Pro Cys Glu Thr His Gin Ile Ser Trp Leu- Gly His Cys Leu 15 10 15
Ser Phe
<210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 64
His Trp Gly Cys Glu Asp Leu Met Trp Ser Trp His Pro Leu Cys Arg 15 10 15
Arg Pro
<210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 65
Leu Pro Leu Cys Asp Ala Asp Met Met Pro Thr Ile Gly Phe Cys Vai 1 5 .10 15
Ala Tyr
<210> 66 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial 181 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 66
Ser His Trp Cys Glu Thr Thr Phe Trp Met Asn Tyr Ala Lys Cys Vai 1 5 10 <210> His Ala 67 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 67
Leu Pro Lys Cys Thr His Vai Pro Phe Asp Gin Gly Gly Phe Cys Leu 15 10 15
Trp Tyr
<210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 68
Phe Ser Ser Cys Trp Ser Pro Vai Ser Arg Gin Asp Met Phe Cys Vai 1 5 10 15
Phe Tyr
<210> 69 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial 182 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 69
Ser His Lys Cys Glu Tyr Ser Gly Trp Leu Gin Pro Leu Cys Tyr Arg 1 5 10 15
Pro
<210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 70
Pro Trp Trp Cys Gin Asp Asn Tyr Vai Gin His Met Leu His Cys Asp 15 10 15
Ser Pro <210> 71 <211> 18
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 71
Trp Phe Arg Cys Met Leu Met Asn Ser Phe Asp Ala Phe Gin Cys Vai 15 10 15
Ser Tyr <210> 72 <211> 18
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 183 <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 72
Pro Asp Ala Cys Arg Asp Gin Pro Trp Tyr Met Phe Met Gly Cys Met 15 10 15
Leu Gly
<210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 73
Phe Leu Ala Cys Phe Vai Glu Phe Glu Leu Cys Phe Asp Ser 1 5 10
<210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 74
Ser Ala Tyr Cys Ile Ile Thr Glu Ser Asp Pro Tyr Vai Leu Cys Vai 1 5 10 15
Pro Leu
<210> 75 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 75 184
Pro Ser Ile Cys Glu Ser Tyr Ser Thr Met Trp Leu Pro Met Cys Gin 15 10 15
His Asn
<210> 76 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 76
Trp Leu Asp Cys His Asp Asp Ser Trp Ala Trp Thr Lys Met Cys Arg 1 5 10 '15
Ser His
<210> 77 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 77
Tyr Leu Asn Cys Vai Met Met Asn Thr Ser Pro Phe Vai Glu Cys Vai 15 10 15
Phe Asn
<210> 78 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 78 185
Tyr Pro Trp Cys Asp Gly Phe Met Ile Gin Gin Gly Ile Thr Cys Met 1 5 10 15
Phe Tyr
<210> 79 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 79
Phe Asp Tyr Cys Thr Trp Leu Asn Gly Phe Lys Asp Trp Lys Cys Trp 15 10 15
Ser Arg
<210> 80 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 80
Leu Pro Leu Cys Asn Leu Lys Glu Ile Ser His Vai Gin Ala Cys Vai 15 10 15
Leu Phe
<210> 81 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 81 186
Ser Pro Glu Cys Ala Phe Ala Arg Trp Leu Gly Ile Glu Gin Cys Gin 1 5 10 15
Arg Asp
<210> 82 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 82
Tyr Pro Gin Cys Phe Asn Leu His Leu Leu Glu Trp Thr Glu Cys Asp 15 10 15
Trp Phe
<210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 83
Arg Trp Arg Cys Glu Ile Tyr Asp Ser Glu Phe Leu Pro Lys Cys Trp 15 10 15
Phe Phe
<210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 84 187
Leu Vai Gly Cys Asp Asn Vai Trp His Arg cys Lys Leu Phe 15 10
<210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 85
Ala Gly Trp Cys His Vai Trp Gly Glu Met Phe Gly Met Gly Cys Ser 15 10 15
Ala Leu
<210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 86
His His Glu Cys Glu Trp Met Ala Arg Trp Met Ser Leu Asp Cys Vai 1 5 10 15
Gly Leu
<210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 87 188
Phe Pro Met Cys Gly He Ala Gly Met Lys Asp Phe Asp Phe Cys Vai 1 _ 5 10 15
Trp Tyr
<210> 88 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 88
Arg Asp Asp Cys Thr Phe Trp Pro Glu Trp Leu Trp Lys Leu Cys Glu 1 5 10 15
Arg Pro
<210> 89 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 89
Tyr Asn Phe Cys Ser Tyr Leu Phe Gly Vai Ser Lys Glu Ala Cys Gin 1 5 10 15
Leu Pro
<210> 90 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 90 189
Ala His Trp Cys Glu Gin Gly Pro Trp Arg Tyr Gly Asn lie Cys Met 1 5 10 15 i
Ala Tyr
<210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 91
Asn Leu Vai Cys Gly Lys Ile Ser Ala Trp Gly Asp Glu Ala Cys Ala 15 10 15
Arg Ala
<210> 92 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 92
His Asn Vai Cys Thr Ile Met Gly Pro Ser Met Lys Trp Phe Cys Trp 1 5 10 15
Asn Asp
<210> 93 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 93 190
Asn Asp Leu Cys Ala Met Trp Gly Trp Arg Asn Thr lie Trp Cys Gin 15 10 15
Asn Ser <210> 94 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 94
Pro Pro Phe Cys Gin Asn Asp Asn Asp Met Leu Gin Ser Leu Cys Lys 1.5 10 15
Leu Leu
<210> 95 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 95
Trp Tyr Asp Cys Asn Vai Pro Asn Glu Leu Leu Ser Gly Leu Cys Arg 1 5 10 15
Leu Phe
<210> 96 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 96 191
Tyr Gly Asp Cys Asp Gin Asn His Trp Met Trp Pro Phe Thr Cys Leu 1 . 5 10 15
Ser Leu
<210> 97 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 97
Gly Trp Met Cys His Phe Asp Leu His Asp Trp Gly Ala Thr Cys Gin 15 10 15
Pro Asp
<210> 98 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 98
Tyr Phe His Cys Met Phe Gly Gly His Glu Phe Glu Vai His Cys Glu 15 10 15
Ser Phe
<210> 99 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 99 192
Ala Tyr Trp Cys Trp His Gly Gin Cys Vai Arg Phe 1 5 10 "
<210> 100 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 100
Ser Glu His Trp Thr Phe Thr Asp Trp Asp Gly Asn Glu Trp Trp Vai 15 10 15
Arg Pro Phe
<210> 101 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 101
Met Glu Met Leu Asp Ser Leu Phe Glu Leu Leu Lys Asp Met Vai Pro 15 10 15
Ile Ser Lys Ala 20
<210> 102 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 102 193
Ser Pro Pro Glu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Gly Trp Gin Tyr Gly 15 10 15
Lys Phe Thr <210> 103 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 103
Ser Pro Glu Asn Leu Leu Asn Asp Leu Tyr Ile Leu Met Thr Lys Gin 15 10 15
Glu Trp Tyr Gly 20 <210> 104 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> miostatina
Phe His Vai Vai Thr Pro Tyr Ser <223> Péptido de ligação à <400> 104
Phe Hls Trp Glu Glu Gly Ile Pro 1 5 10 15
Tyr Asp Arg Met 20
<210> 105 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 194 <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 105
Lys Arg Leu Leu Glu Gin Phe Met Asn Asp Leu Ala Glu Leu Vai Ser 1 5 10 15
Gly His Ser
<210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 106
Asp Thr Arg Asp Ala Leu Phe Gin Glu Phe Tyr Glu Phe Vai Arg Ser 15 10 15
Arg Leu Vai Ile 20
<210> 107 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 107
Arg Met Ser Ala Ala Pro Arg Pro Leu Thr Tyr Arg Asp Ile Met Asp 1 5 10 15
Gin Tyr Trp His 20
<210> 108 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial 195 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 108
Asn Asp Lys Ala His Phe Phe Glu Met Phe Met Phe Asp vai Hís Asn 15 10 15
Phe Vai Glu Ser 20 <210> 109 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 109
Gin Thr Gin Ala Gin hys Ile Asp Gly Leu Trp Glu Leu Leu Gin Ser 1 5 10 15
Ile Arg Asn Gin 20
<210> 110 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 110
Met Leu Ser Glu Phe Glu Glu Phe Leu Gly Asn Leu Vai His Arg Gin 15 10 15
Glu Ala <210> 111 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial 196 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 111
Tyr Thr Pro Lys Met Gly Ser Glu Trp Thr Ser Phe Trp His Asn Arg 15 10 15
Ile His Tyr Leu 20
<210> 112 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 112
Leu Asn Asp Thr Leu Leu Arg Glu Leu Lys Met Vai Leu Asn Ser Leu 15 10 15
Ser Asp Met Lys 20 <210> 113 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 113
Phe Asp Vai Glu Arg Asp Leu Met Arg Trp Leu Glu Gly Phe Met Gln 1 5 10 15
Ser Ala Ala Thr 20
<210> 114 <211> 20 <212> PRT 197 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 114
His His Gly Trp Asn Tyr teu Arg Lys Gly Ser Ala Pro Gin Trp Phe 1 5 10 15
Glu Ala Trp Vai 20 <210> 115 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 115
Vai Glu Ser Leu His Gin Leu Gin Met Trp Leu Asp Gin Lys Leu Ala 1 5 10 15
Ser Gly Pro His 20
<210> 116 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 116
Arg Ala Thr Leu Leu Lys Asp Phe Trp Gin Leu Vai Glu Gly Tyr Gly 1 5 10 15
Asp Asn 198
<210> 117 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 117
Glu Glu Leu Leu Arg Glu Phe Tyr Arg Phe Vai Ser Ala Phe Asp Tyr 15 10 15
<210> 118 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 118
Gly Leu Leu Asp Glu Phe Ser His Phe Ile Ala Glu Gin Phe Tyr Gin 15 10 15
Met Pro Gly Gly 20
<210> 119 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 119
Tyr Arg Glu Met Ser Met Leu Glu Gly Leu Leu Asp Vai Leu Glu Arg 1 5 10 15
Leu Gin His Tyr 20 <210> 120 199
<211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 120
His Asn Ser Ser Gin Met Leu Leu Ser Glu Leu ile Met Leu Vai Gly 1 5 10 15
Ser Met Met Gin 20
<210> 121 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 121
Trp Arg Glu His Phe Leu Asn Ser Asp Tyr Ile Arg Asp Lys Leu Ile 1.5. 10 15
Ala Ile Asp Gly 20
<210> 122 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 122
Gin Phe Pro Phe Tyr Vai Phe Asp Asp Leu Pro Ala Gin Leu Glu Tyr 1 5 10 15
Trp Ile Ala 200
<210> 123 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 123
Glu Phe Phe Hís Trp Leu His Asn His Arg Ser Glu Vai Asn His Trp 15 10 15
Leu Asp Met Asn 20
<210> 124 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 124
Glu Ala Leu Phe Gin Asn Phe Phe Arg Asp Vai Leu Thr Leu Ser Glu 15 10 15.
Arg Glu Tyr
<210> 125 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 125 201
Gin Tyr Trp Glu Gin Gin Trp Met Thr Tyr Phe Arg Glu Asn Gly Leu 15 10 15
His Vai Gin Tyr 20
<210> 126 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 126
Asn Gin Arg Met Met Leu Glu Asp teu Trp Arg Ile Met Thr Pro Met 1 5 10 15
Phe Gly Arg Ser 20
<210> 127 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 127
Phe Leu Asp Glu Leu Lys Ala Glu Leu Ser Arg His Tyr Ala Leu Asp 1 5 10 15
Asp Leu Asp Glu 20
<210> 128 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 202 <40 0> 128
Gly Lys Leu Ile Glu Gly Leu Leu Asn Glu Leu Met Gin Leu Glu Thr 1 5 10 .15
Phe Met Pro Asp 20 <210> 129 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 129 Ile Leu Leu Leu Asp Glu Tyr Lys Lys Asp Trp Lys 1 5 10 <210> 130 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 130 15
Gin Gly His Cys Thr.Arg Trp 1 5
Pro. Trp Met Cys Pro Pro Tyr Gly Ser 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser 20
Gly Ser Thr Ala.Ser Ser Gly Ser Gly 25 30
Ser Ala Thr Gly Gin Gly His 35
Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro 40 ' 45
Pro Tyr 50<210> 131 <211> 43 <212> PRT 203 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 131
Trp Tyr Pro Cys Tyr Glu Gly His Phe Trp Cys Tyr Asp Leu Gly Ser 15 10 15
Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Trp Tyr Pro 20 25 Cys Tyr Glu Gly His Phe Trp Cys Tyr Asp Leu 35 40 <210> 132 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 132
His Thr Pro Cys Pro Trp Phe Ala Pro Leu Cys Vai Glu Trp Gly Ser 15 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Ala Thr Gly His Thr Pro Cys Pro Trp Phe Ala Pro Leu Cys Vai 35 40 45
Glu Trp 50 <210> 133
<211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 204 <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 133
Pro Asp Trp Cys IIe Asp Pro Asp Trp Trp Cys Lys Phe Trp Gly Ser 1 5 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Ala Thr Gly Pro Asp Trp Cys Ile Asp Pro Asp Trp Trp Cys Lys 35 40 45
Phe Trp 50
<210> 134 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 134
Ala Asn Trp Cys Vai Ser Pro Asn Trp Phe Cys Met Vai Met Gly Ser 15 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Ala Thr Gly Ala Asn Trp Cys Vai Ser Pro Asn Trp Phe Cys Met 35 40 45
Vai Met 50
<210> 135 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 205 <400> 135
Pro Asp Trp Cys Ile Asp Pro Asp Trp Trp Cys Lys Phe Trp Gly Ser 15 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 '30
Ser Ala Thr Gly Pro Asp Trp Cys Ile Asp Pro Asp Trp Trp Cys Lys 35 40 45
Phe Trp 50 <210> 136 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 136
His Trp Ala Cys Gly Tyr Trp Pro Trp Ser Cys Lys Trp Vai Gly Ser 15 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Ala Thr Gly His Trp Ala Cys Gly Tyr Trp Pro Trp Ser Cys Lys 35 40 45
Trp Vai 50
<210> 137 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 137 206
Lys Lys His Cys Gin Ile Trp Thr Trp Met Cys Ala Pro Lys Gly Ser 1 5 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Ala Thr Gly Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro 35 40 45
Pro Tyr 50
<210> 138 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 138
Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Tyr Gly Ser 15 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Ala Thr Gly Lys Lys His Cys Gin Xle Trp Thr Trp Met Cys Ala 35 40 45
Pro Lys 50 '
<210> 139 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 207 <400> 139
Lys Lys His Cys Gin Ile Trp Thr Trp Met Cys Ala Pro Lys Gly Ser 15 10 15
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Ala Thr Gly Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro 35 40 45
Pro Tyr 50 <210> 140 <211> 36 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 140
Lys Lys His Cys Gin Ile Trp Thr Trp Met Cys Ala Pro Lys Gly Gly 15 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met 20 25 30
Cys Pro Pro Tyr 35
<210> 141 <211> 34 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 141 208
Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Tyr Gly Gly 1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly tys Lys His Cys Gin Ile Trp Thr Trp Met Cys Ala 20 25 30
Pro Lys <210> 142 <211> 14
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) . . (3) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(6) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 142
Lys Asp Xaa Cys Xaa Xaa Trp His Trp Met Cys Lys Pro Xaa 15 10
<210> 143 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220>
<221> MISC FEATURE 209 <222> (2)..(3) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(7) <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 143
Trp Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Gly ?he Trp Cys Leu Asn Vai 15 10
<210> 144 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(10) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(14) <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 144
Ile Xaa Gly Cys Xaa Trp Trp Asp Xaa Xaa Cys Tyr Xaa Xaa 15 10 <210> 145 210
<211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC-FFATURE <222> (12) . . (14) <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 145
Xaa Xaa Trp Cys Vai Ser Pro Xaa Trp Phe Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 . 10
<210> 146 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) . . (3) <223> Xaa = qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(10) <223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 146 211
Xaa Xaa Xaa Cys Pro Trp Phe Ala Xaa Xaa Cys Vai Asp Trp 1 5 10
<210> 147 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 147 aaagacaaat gcaaaatgtg gcactggatg tgcaaaccgc cg 42
<210> 148 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 148 aaagacctgt gcgctatgtg gcactggatg tgcaaaccgc cg 42
<210> 149 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 149 aaagacctgt gcaaaatgtg gaaatggatg tgcaaaccgc cg 42
<210> 150 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 212 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 150 aaagacctgt gcaaaatgtg gcactggatg tgcaaaccga aa 42
<210> 151 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 151 tggtacccgt gctacgaatt ccacttctgg tgctacgacc tg 42
<210> 152 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 152 tggtacccgt gctacgaatt ccacttctgg_tgctacgacc tg 42
<210> 153 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 153 213 tggtacccgt gctacgaagg tcacttctgg tgctacgacc tg 42
<210> 154 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 154 tggtacccgt gctacgaagg tcacttctgg tgctacgacc tg 42
<210> 155 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 155 atcttcggtt gcaaatggtg ggacgttcag tgctaccagt tc 42
<210> 156 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 156 atcttcggtt gcaaatggtg ggacgttgac tgctaccagt tc 42
<210> 157 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 214 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 157 atcttcggtt gcaaatggtg ggacgttgac tgctaccagt tc 42
<210> 158 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 158
gctgactggt gcgtttcccc gaactggttc tgcatggtta tg 42 <210> 159 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 159 cacaaattct gcccgtggtg ggctctgttc tgctgggact tc 42
<210> 160 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 160 42 aaagacctgt gcaaaatgtg gcactggatg tgcaaaccgc cg 215
<210> 161 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 161 atcgacaaat gcgctatctg gggttggatg tgcccgccgc tg 42
<210> 162 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 162 tggtacccgt gcggtgaatt cggtatgtgg tgcctgaacg tt 42
<210> 163 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 163 tggttcacct gcctgtggaa ctgcgacaac gaa 33
<210> 164 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 216 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 164 cacaccccgt gcccgtggtt cgctccgctg tgcgttgaat gg 42
<210> 165 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 165 aaagaatggt gctggcgttg gaaatggatg tgcaaaccgg aa 42
<210> 166 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 166 ttcgaaacct gcccgtcctg ggcttacttc tgcctggaca tc 42
<210> 167 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 167 ttcgaaacct gcccgtcctg ggcttacttc tgcctggaca tc 42 <210> 168 217
<211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 168 gcttacaaat gcgaagctaa cgactggggt tgctggtggc tg 42
<210> 169 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 169 aactcctggt gcgaagacca gtggcaccgt tgctggtggc tg 42
<210> 170 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 170 tggtccgctt gctacgctgg tcacttctgg tgctacgacc tg 42
<210> 171 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 218 <40 0> 171 gctaactggt gcgtttcccc gaactggttc tgcatggtta tg 42
<210> 172 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 172 tggaccgaat gctaccagca ggaattctgg tgctggaacc tg 42
<210> 173 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 173 gaaaacacct gcgaacgttg gaaatggatg tgcccgccga aa 42
<210> 174 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 174 tggctgccgt gccaccagga aggtttctgg tgcatgaact tc 42 <210> 175 <211> 42 219
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 175 tccaccatgt gctcccagtg gcactggatg tgcaacccgt tc 42
<210> 176 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 176 atcttcggtt gccactggtg ggacgttgac tgctaccagt tc 42
<210> 177 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 177 atctacggtt gcaaatggtg ggacatccag tgctacgaca tc 42
<210> 178 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 220 <40 0> 178 ccggactggt gcatcgatcc ggactggtgg tgcaaattct gg 42
<210> 179 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 179 cagggtcact gcacccgttg gccgtggatg tgcccgccgt ac 42
<210> 180 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 180 tggcaggaat gctaccgtga aggtttctgg tgcctgcaga cc 42
<210> 181 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 181 tggttcgact gctacggtcc gggtttcaaa tgctggtccc cg 42
<210> 182 <211> 42 <212> ADN 221 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 182
ggtgttcgtt gcccgaaagg tcacctgtgg tgcctgtacc cg 42 <210> 183 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 183 cactgggctt gcggttactg gccgtggtcc tgcaaatggg tt 42
<210> 184 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 184 ggtccggctt gccactcccc gtggtggtgg tgcgttttcg gt 42
<210> 185 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 185 222 accacctggt gcatctcccc gatgtggttc tgctcccagc ag 42
<210> 186 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 186 cacaaattct gcccgccgtg ggctatcttc tgctgggact tc 42
<210> 187 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 187 ccggactggt gcgtttcccc gcgttggtac tgcaacatgt gg 42
<210> 188 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 188 gtttggaaat gccactggtt cggtatggac tgcgaaccga cc 42
<210> 189 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 223 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 189 aaaaaacact gccagatctg gacctggatg tgcgctccga aa 42
<210> 190 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 190 tggttccagt gcggttccac cctgttctgg tgctacaacc tg 42
<210> 191 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 191 tggtccccgt gctacgacca ctacttctac tgctacacca tc 42
<210> 192 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 192 224 tcctggatgt gcggtttctt caaagaagtt tgcatgtggg tt 42
<210> 193 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 193 gaaatgctgt gcatgatcca cccggttttc tgcaacccgc ac 42
<210> 194 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 194 ctgaaaacct gcaacctgtg gccgtggatg tgcccgccgc tg 42
<210> 195 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 195 gttgttggtt gcaaatggta cgaagcttgg tgctacaaca aa 42
<210> 196 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 225 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 196 ccgatccact gcacccagtg ggcttggatg tgcccgccga cc 42
<210> 197 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 197 gactccaact gcccgtggta cttoctgtcc tgcgttatct tc 42
<210> 198 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 198 gactccaact gcccgtggta cttcctgtcc tgcgttatct tc 42
<210> 199 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 199 42 aacctgcagt gcatctactt cctgggtaaa tgcatctact tc 226
<210> 200 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 200 gcttggcgtt gcatgtggtt ctccgacgtt tgcaccccgg gt 42
<210> 201 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 201 tggtttcgtt gttttcttga tgctgattgg tgtacttctg tt 42
<210> 202 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 202 gaaaaaattt gtcaaatgtg gtcttggatg tgtgctccac ca 42
<210> 203 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 227 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 203 tggttttatt gtcatcttaa taaatctgaa tgtactgaac ca 42
<210> 204 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 204 ttttggcgtt gtgctattgg tattgataaa tgtaaacgtg tt 42
<210> 205 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 205 ttttggcgtt gtgctattgg tattgataaa tgtaaacgtg tt 42
<210> 206 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 206 42 attgatcttt gtaatatgtg ggatggtatg tgttatccac ca 228
<210> 207 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 207 gaaatgccat gtaatatttg gggttggatg tgtccaccag tt 42
<210> 208 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 208 tggttccgtt gcgttctgac cggtatcgtt gactggtccg aatgcttcgg tctg 54
<210> 209 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 209 ggtttctcct gcaccttcgg tctggacgaa ttctacgttg actgctcccc gttc 54
<210> 210 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 229 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 210 ctgccgtggt gccacgacca ggttaacgct gactggggtt tctgcatgct gtgg 54
<210> 211 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 211 tacccgacct gctccgaaaa attctggatc tacggtcaga cctgcgttct gtgg 54
<210> 212 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 212 ctgggtccgt gcccgatcca ccacggtccg tggccgcagt actgcgttta ctgg 54
<210> 213 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 213 54 ccgttcccgt gcgaaaccca ccagatctcc tggctgggtc actgcctgtc cttc 230
<210> 214 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 214 cactggggtt gcgaagacct gatgtggtcc tggcacccgc tgtgccgtcg tccg 54
<210> 215 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 215 ctgccgctgt gcgacgctga catgatgccg accatcggtt tctgcgttgc ttac 54
<210> 216 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 216 tcccactggt gcgaaaccac cttctggatg aactacgcta aatgcgttca cgct 54
<210> 217 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 231 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 217 ctgccgaaat gcacccacgt tccgttcgac cagggtggtt tctgcctgtg gtac 54
<210> 218 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 218 ttctcctcct gctggtcccc ggtttcccgt caggacatgt tctgcgtttt ctac 54
<210> 219 <211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 219 tcccacaaat gcgaatactc cggttggctg cagccgctgt gctaccgtcc g 51
<210> 220 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 220 54 ccgtggtggt gccaggacaa ctacgttcag cacatgctgc actgcgactc cccg 232
<210> 221 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 221 tggttccgtt gcatgctgat gaactocttc gacgctttcc agtgcgtttc ctac 54
<210> 222 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 222 ccggacgctt gccgtgacca gccgtggtac atgttcatgg gttgcatgct gggt 54
<210> 223 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 223 ttcctggctt gcttcgttga attcgaactg tgcttcgact cc 42
<210> 224 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 233 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 224 tccgcttact gcatcatcac cgaatccgac ccgtacgttc tgtgcgttcc gctg 54
<210> 225 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 225 ccgtccatct gcgaatccta ctccaccatg tggctgccga tgtgccagca caac 54
<210> 226 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 226 tggctggact gccacgacga ctcctgggct tggaccaaaa tgtgccgttc ccac 54
<210> 227 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 227 tacctgaact gcgttatgat gaacacctcc ccgttcgttg aatgcgtttt caac 54 234
<210> 228 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 228 tacccgtggt gcgacggttt catgatccag cagggtatca cctgcatgtt ctac 54
<210> 229 <211> .54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 229 ttcgactact gcacctggct gaacggtttc aaagactgga aatgctggtc ccgt 54
<210> 230 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 230 ctgccgctgt gcaacctgaa agaaatctcc cacgttcagg cttgcgttct gttc 54
<210> 231 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 235 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 231 tccccggaat gcgctttcgc tcgttggctg ggtatcgaac agtgccagcg tgac 54
<210> 232 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 232 tacccgcagt gcttcaacct gcacctgctg gaatggaccg aatgcgactg gttc 54
<210> 233 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 233 cgttggcgtt gcgaaatcta cgactccgaa ttcctgccga aatgctggtt cttc 54
<210> 234 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 234 42 ctggttggtt gcgacaacgt ttggcaccgt tgcaaactgt tc 236
<210> 235 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 235 gctggttggt gccacgtttg gggtgaaatg ttcggtatgg gttgctccgc tctg 54
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<210> 237 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 237 ttcccgatgt gcggtatcgc tggtatgaaa gacttcgact tctgcgtttg gtac 54
<210> 238 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 237 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 238
cgtgatgatt gtactttttg gccagaatgg ctttggaaac tttgtgaacg tcca 54 <210> 239 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 239 tataattttt gttcttatct ttttggtgtt tctaaagaag cttgtcaact tcca 54
<210> 240 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 240 gctcattggt gtgaacaagg tccatggcgt tatggtaata tttgtatggc ttat 54
<210> 241 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 241 54 aatcttgttt gtggtaaaat ttctgcttgg ggtgatgaag cttgtgctcg tgct 238
<210> 242 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 242 cataatgttt gtactattat gggtccatct atgaaatggt tttgttggaa tgat 54
<210> 243 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 243 aatgatcttt gtgctatgtg gggttggcgt aatactattt ggtgtcaaaa ttct 54
<210> 244 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 244 ccaccatttt gtcaaaatga taatgatatg cttcaatctc tttgtaaact tctt 54
<210> 245 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 239 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 245 tggtatgatt gtaatgttcc aaatgaactt ctttctggtc tttgtcgtct tttt 54
<210> 246 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 246 tatggtgatt gtgatcaaaa tcattggatg tggccattta cttgtctttc tctt 54
<210> 247 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 247 ggttggatgt gtcattttga tcttcatgat tggggtgcta cttgtcaacc agat 54
<210> 248 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 248 54 tattttcatt gtatgtttgg tggtcatgaa tttgaagttc attgtgaatc tttt 240
<210> 249 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 249 gcttattggt gttggcatgg tcaatgtgtt cgtttt 36
<210> 250 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 250 tccgaacact ggaccttcac cgactgggac ggtaacgaat ggtgggttcg tccgttc 57
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<210> 252 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 241 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 252 tccccgccgg aagaagctct gatggaatgg ctgggttggc agtacggtaa attcacc 57
<210> 253 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 253
tccccggaaa acctgctgaa cgacctgtac atcctgatga ccaaacagga atggtacggt 60 <210> 254 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 254 ttccactggg aagaaggtat occgttccac gttgttaccc cgtactccta cgacogtatg 60
<210> 255 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 255 aaacgtctgc tggaacagtt catgaacgac ctggctgaac tggtttccgg tcactcc 57 242
<210> 256 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 256 gacacccgtg acgctctgtt ccaggaattc tacgaattcg ttcgttcccg tctggttatc 60
<210> 257 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 257 cgtatgtccg ctgctccgcg tccgctgacc taccgtgaca tcatggacca gtactggcac 60
<210> 258 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 258 aacgacaaag ctcacttctt cgaaatgttc atgttcgacg ttcacaactt cgttgaatcc 60
<210> 259 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 243 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 259 cagacccagg ctcagaaaat cgacggtctg tgggaactgc tgcagtccat ccgtaaccag 60
<210> 260 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 260 atgctgtccg aattcgaaga attcctgggt aacctggttc accgtcagga agct 54
<210> 261 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 261 tacaccccga aaatgggttc cgaatggacc tccttctggc acaaccgtat ccactacctg 60
<210> 262 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 262 60 ctgaacgaca ccctgctgcg tgaactgaaa atggttctga actccctgtc cgacatgaaa 244
<210> 263 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 263 ttcgacgttg aacgtgacct gatgcgttgg ctggaaggtt tcatgcagtc cgctgctacc 60
<210> 264 <211> .60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 264 caccacggtt ggaactacct gcgtaaaggt tccgctccgc agtggttcga agcttgggtt 60
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<210> 266 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 245 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 266 cgtgctaccc tgctgaaaga cttctggcag ctggttgaag gttacggtga caac 54
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<210> 268 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 268 ggtctgctgg acgaattctc ccacttcatc gctgaacagt tctaccagat gccgggtggt 60
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<210> 270 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 270 cacaactcct cccagatgct gctgtccgaa ctgatcatgc tggttggttc catgatgcag 60
<210> 271 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 271 tggcgtgaac acttcctgaa ctccgactac atccgtgaca aactgatcgc tatcgacggt 60
<210> 272 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 272 cagttcccgt tctacgtttt cgacgacctg ccggctcagc tggaatactg gatcgct 57
<210> 273 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 247 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 273 gaattcttcc actggctgca caaccaccgt tccgaagtta accactggct ggacatgaac 60
<210> 274 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 274 gaagctcttt ttcaaaattt ttttcgtgat gttcttactc tttctgaacg tgaatat 57 <210> 275
<211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 275 caatattggg aacaacaatg gatgacttat tttcgtgaaa atggtcttca tgttcaatat 60
<210> 276 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 276 60 aatcaacgta tgatgcttga agatctttgg cgtattatga ctccaatgtt tggtcgttct 248
<210> 277 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 277 tttcttgatg aacttaaagc tgaactttct cgtcattatg ctcttgatga tcttgatgaa 60
<210> 278 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 278 ggtaaactta ttgaaggtct tcttaatgaa cttatgcaac ttgaaacttt tatgccagat 60
<210> 279 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 279 attcttcttc ttgatgaata taaaaaagat tggaaatctt ggttt 45
<210> 280 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 249 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 280 cagggccact gtactcgctg gccgtggatg tgcccgccgt acggttctgg ttccgctacc 60 ggtggttctg gttccactgc ttcttctggt tccggttctg ctactggtca gggtcactgc 120 actcgttggc catggatgtg tccaccgtat 150
<210> 281 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 281 tggtatccgfc gttatgaggg tcacttctgg tgctacgatc tgggttctgg ttccactgct 60 tcttctggtt ccggttccgc tactggttgg tacccgtgct acgaaggtca cttttggtgt 120 tatgatctg 129
<210> 282 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 282 cacactccgt gtccgtggtt tgctccgctg tgcgttgaat ggggttctgg ttccgctact ' 60 ggtggttccg gttccactgc ttcttctggt tccggttctg caactggtca caccccgtgc 120 ccgtggtttg caccgctgtg tgtagagtgg 150 <210> 283 250
<211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 283 ccggattggt gtatcgaccc ggactggtgg tgcaaattct ggggttctgg ttccgctacc 60 ggtggttccg gttccactgc ttcttctggt tccggttctg caactggtcc ggactggtgc 120 atcgacccgg attggtggtg taaattttgg 150
<210> 284 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 284 ccggattggt gtatcgaccc ggactggtgg tgcaaattct ggggttctgg ttccgctacc 60 ggtggttccg gttccactgc ttcttctggt tccggttctg caactggtcc ggactggtgc 120 atcgacccgg attggtggtg taaattttgg 150
<210> 285 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 285 60 251 60 251 120 129 accacttggt gcatctctcc gatgtggttc tgctctcagc agggttctgg ttccactgct tcttctggtt ccggttctgc aactggtact acttggtgta tctctccaat gtggttttgt tctcagcaa
<210> 286 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 286 60 120 150 cactgggcat gtggctattg gccgtggtcc tgcaaatggg ttggttctgg ttccgctacc ggtggttccg gttccactgc ttcttctggt tccggttctg caactggtca ctgggcttgc ggttactggc cgtggtcttg taaatgggtt <210> 287 <211> 150
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 287 60 120 150 aaaaaacact gtcagatctg gacttggatg tgcgctccga aaggttctgg ttccgctacc ggtggttctg gttccactgc ttcttctggt tccggttccg ctactggtca gggtcactgc actcgttggc catggatgtg tccgccgtat
<210> 288 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 60 252 <400> 288 120 150 cagggtcact gcacccgttg gccgtggatg tgcccgccgt acggttctgg ttccgctacc ggtggttctg gttccactgc ttcttctggt tccggttctg ctactggtaa aaaacactgc cagatctgga cttggatgtg cgctccgaaa
<210> 289 <211> 150 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <40Q> 289 60 120 150 aaaaaacact gtcagatctg gacttggatg tgcgctccga aaggttctgg ttccgctacc ggtggttctg gttccactgc ttcttctggt tccggttccg ctactggtca gggtcactgc açtcgttggc catggafcgtg tccgccgtat
<210> 290 <211> 108 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 290 60 aaaaaacact gccagatctg gacttggatg tgcgctccga aaggtggtgg tggtggtggc ggtggccagg gtcactgcac ccgttggccg tggatgtgtc cgccgtat
<210> 291 <211> 102 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 108 60 253 <400> 291 102 cagggtcact gcacccgttg gccgtggatg tgcccgccgt acggtggtgg tggtggtggc aaaaaacact gccagatctg gacttggatg tgcgctccga aa
<210> 292 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 292 gagagagagc atatgaatga gaacagtgag caaaaag 37
<210> 293 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 293 agagagggat ccattatgag cacccacagc ggtc 34
<210> 294 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 294 cggcgcaact atcggtatca agctg 25 <210> 295 254
<211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 295 catgtaccgt aacactgagt ttcgtc 26
<210> 296 <211> 227 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 296 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 1 5
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 10 15
Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro 20
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 25 ' 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr
Cys Vai Vai Vai Asp.Vai Ser His 256 35 40 45
Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80
Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai 115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser 130 135 140
Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu 145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175
Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met 195 200 ' 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys 225 <210> 297 <211> 67 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 257 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 297 acaaacaaac atatgggtgc acagaaagcg gccgcaaaaa aactcgaggg tggaggcggt 60 67 ggggaca
<210> 298 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina
<400> 298 ggtcattact ggaccggatc 20 <210> 299 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 299 cgtacaggtt tacgcaagaa aatgg 25
<210> 300 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 258 <400> 300 tttgttggat ccattactcg agtttttttg cggccgcttt ctgtgcacca ccacctccac 60 ctttac 66
<210> 301 <211> 681 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 301 gacaaaactc acacatgtcc accttgccca gcacctgaac fccctgggggg accgtcagtt 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 302 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 259 <400> 302 ggtggaggtg gtggt 15
<210> 303 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <400> 303
Met Phe Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Asp Lys Cys Lys Met Trp His 1 5 .10 .15
Trp Met Cys Lys Pro Pro 20
<210> 304 <211> 740 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 304 260 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctcçggg taaaggtgga ggtggtggta agacaaatgc aaaatgtggc 720 actggatgtg caaaccgccg 740
<210> 305 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 305
Val Ala Leu His Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Prò Pro
Gin Arg Glu Gly 20
<210> 306 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 261 < 4 Ο Ο > 306
Tyr Pro Glu Gin Gly Leu Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 .15
Gin Thr Leu Ala 20
<210> 307 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 307
Gly Leu Asn Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1-5 10 15
Gin Asp Ser Asn 20 <210> 308 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 308
Met Ile Thr Gin Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 lo 15
Gin Pro Ser Gly 20
<210> 309 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 262 <400> 309
Ala Gly Ala Gin Glu His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Ala Pro 15 10 15
Asn Asp Trp Ile 20 <210> 310 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 310
Gly Vai Asn Gin Gly Gin Cys Thr Arg Trp Arg Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Asn Gly Trp Glu 20
<210> 311 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 311
Leu Ala Asp His Gly Gin Cys Ile Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5-10 15
Glu Gly Trp Glu 20
<210> 312 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial 263 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 312
Ile Leu Glu Gin Ala Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Arg Gly Gly 20
<210> 313 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 313
Thr Gin Thr His Ala Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Trp Glu Gly 20
<210> 314 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 314
Vai Vai Thr Gin Gly His Cys Thr Leu Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Arg Trp Arg 20
<210> 315 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial 264 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 315
Ile Tyr Pro His Asp Gin Cys Thr Ar9 ^ Pro TrP Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Pro Tyr Pro 20
<210> 316 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificiâl <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 316
Ser Tyr Trp Gin Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Trp Arg Gly 20 <210> 317 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de liqação à miostatina <400> 317
Met Trp Gin Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Gin Gly Trp Gly 20
<210> 318 <211> 20 <212> PRT 265 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 318
Glu Phe Thr Gin Trp His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 1° 15
Gin Arg Ser Gin 20
<210> 319 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 319
Leu Asp Asp Gin Trp Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Gly Phe Ser 20
<210> 320 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 320
Tyr Gin Thr Gin Gly Leu Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 '15
Gin Ser Gin Arg 20 266
<210> 321 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 321
Glu Ser Asn Gin Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Gin Gly Gly Trp 20
<210> 322 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 322
Trp Thr Asp Arg Gly Pro Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Ala Asn Gly 20
<210> 323 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 323 267
Vai Gly Thr Gin Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Tyr Glu Thr Gly 20
<210> 324 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 324
Pro Tyr Glu Gin Gly Lys Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Tyr Glu Vai Glu 20
<210> 325 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 325
Ser Glu Tyr Gin Gly Leu Cys Thr Arg Trp Pro Tm Met Cys Pro Pro 1 5 10 ‘ 15
Gin Gly Trp Lys 20
<210> 326 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 268 <400> 326
Thr Phe Ser Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Gly Trp Gly 20
<210> 327 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 327
Pro Gly Ala His Asp His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys. Pro Pro 1 5 10 15
Gin Ser Arg Tyr 20
<210> 328 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 328
Val Ala Glu Glu Trp His Cys Arg Arg Trp Pro Trp Met Cys.Pro Pro 15 10 15
Gin Asp Trp Arg 20
<210> 329 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial 269 <22 0> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 329
Val Gly Thr Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Pro Ala Gly 20 <210> 330 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 330
Glu Glu Asp Gin Ala His Cys Arg Ser Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Gly Trp Val 20
<210> 331 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 331
Ala Asp Thr Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Gin His Trp Phe 20 <210> 332 <211> 20 270
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 332
Ser Gly Pro Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Ala Pro 15 10 15
Gin Gly Trp Phe 20
<210> 333 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 333
Thr Leu Vai Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Arg Trp Vai 20 <210> 334 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 334
Gly Met Ala His Gly Lys Cys Thr Arg Trp Ala Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Ser Trp Lys 20 271 271 <210> 335 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 335 Glu Leu Tyr His Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro pro 1 5 10 15
Gin Ser' Trp Ala 20
<210> 336 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 336
Vai Ala Asp His Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Gly Trp Gly 20
<210> 337 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 337 272
Pro Glu Ser Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Gin Gly Trp Gly 20 <210> 338 <211> 20
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 338
Ile Pro Ala His Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Gin Arg Trp Arg 20
<210> 339 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 339
Phe Thr Vai His Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 -5 10 15
Tyr Gly Trp Vai 20
<210> 340 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 273 A O O V 340 Pro Asp Phe Pro Gly His Cys Thr . Arg Trp Arg Trp Met Cys Pro Pro 1 , 5 -10 15 Gin Gly Trp Glu 20 <210> 341 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 341
Gin Leu Trp Gin Gly Pro Cys Thr Gin Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Lys Gly Arg Tyr 20 <210> 342 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 342
His Ala Asn Asp Gly His Cys Thr Arg Trp Gin Trp Met cys Pro Pro 15 10 15
Gin Trp Gly Gly 20
<210> 343 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência ArtifiCj_aq <220> 274 <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 343
Glu Thr Asp His Gly Leu Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro l 5 10 15
Tyr Gly Ala Arg 20
<210> 344 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 344
Gly Thr Trp Gin Gly Leu Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Gly Trp Gin 20
<210> 345 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 345
Val Ala Thr Gin Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10 15
Gin Gly Trp Gly 20
<210> 346 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial 275 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 346
Vai Ala Thr Gin Gly Gin Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro 15 10 15
Gin Arg Trp Gly 20
<210> 347 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 347
Gin Arg Glu Trp Tvr Pro Cys Tyr Gly Gly His teu Trp Cys Tyr Asp 15 10 15
Leu His Lys Ala 20
<210> 348 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 348
Xle Ser Ala Trp Tyr Ser Cys Tyr Ala Gly His Phe Trp Cys Trp Asp 15 10 15
Leu Lys Gin Lys 20
<210> 349 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial 276 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 349
Trp Thr Gly Trp Tyr Gin Cys Tyr Gly Gly His Leu Trp Cys Tyr Asp 1 5 10 15
Leu Arg Arg Lys 20
<210> 350 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 350
Lys Thr Phe Trp Tyr Pro Cys Tyr Asp Gly His Phe Trp Cys Tyr Asn 1 5 10 15
Leu Lys Ser Ser 20 <210> 351 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 351
Glu Ser Arg Trp Tyr Pro Cys Tyr Glu Gly His Leu Trp Cys Phe Asp 15 10 15
Leu Thr Glu Thr 20 <210> 352 <211> 10 277
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa é seleccionado de um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa é seleccionado de um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico <400> 352
Cys, Xaa Xaa Trp Xaa Trp Met Cys Pro Pro 1 5 10
<210> 353 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa é seleccionado de qualquer um dos aminoácidos T, I ou R. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa é seleccionado de qualquer um de R, S, Q. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa é seleccionado de qualquer um de P, R e Q. 278 <400> 353
Cys Xaa Xaa Trp Xaa Trp Met Cys Pro Pro 15 10
<210> 354 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa está ausente ou é qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa está ausente ou é um aminoácido neutro, hidrofóbico, neutro polar ou ácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa está ausente ou é qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa está ausente ou é um aminoácido neutro, hidrofóbico, neutro polar ou ácido <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa está ausente ou é um aminoácido neutro, hidrofóbico, neutro polar ou básico <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(9) <223> Xaa è um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico 279 <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa è um aminoácido neutro hidrofóbico, neutro polar ou básico <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 354
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Trp Xaa Trp Met Cys Pro pro 15 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa 20
<210> 355 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220> <221> MISC_FEATLTRE <222> (1)..(1) <223> Xaa está ausente ou é qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) . . (3) <223> Xaa está ausente ou é um aminoácido neutro, hidrofóbico, neutro polar ou ácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa está ausente ou é qualquer aminoácido <220>
<221> MISC FEATURE 280 <222> (5)..(5) <223> Xaa está ausente ou é um aminoácido neutro, hidrofóbico, neutro polar ou ácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) . . (6) <223> Xaa está ausente ou é um aminoácido neutro, hidrofóbico, neutro polar ou básico <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa é seleccionado de qualquer um dos
aminoácidos T, I o R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa é seleccionado de qualquer um de R, S, Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11) . . (11) <223> Xaa é seleccionado de qualquer um de P, R e Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17) . . (20) <223> Xaa é qualquer aminoácido <400> 355
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Trp Xaa Trp Met Cys Pro Pro 1 5-10 15
Xaa Xaa xaa xaa 20
<210> 356 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 281 281 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) . . (3) <223> Xaa é P, S ou Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa é C ou Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa é G ou H <400> 356 Trp Tyr Xaa Xaa Tyr Xaa Gly 1 5 <210> 357 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 357 Axg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 15 10 15
Pro Met Ser Lys Ala Gly 20
<210> 358 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 358 282
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10 .15
Pro Met Ser Lys Ala Arg 20 <210> 359 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 359
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ile Vai 1 5 10 15
Pro Met Ser Lys Pro Ser 20
<210> 360 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 360
Gly Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Phe Glu Leu Leu Gin Glu Ile Vai 15 10 15
Pro Met Ser Lys Ala Pro 20
<210> 361 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 283 <400> 361
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Asp lie Vai 1 5 10 15
Pro Ile Ser Asn Pro Pro 20
<210> 362 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 362
Arg Ile Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Gin Glu Ile Vai 1 5 10 Pro Ile Ser Lys Ala GlU 20 <210> 363 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 363 Arg Met Glu Met Leu Gin Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ile Vai 1 5 10 15
Pro Met Ser Asn Ala Arg 20
<210> 364 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 284 <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 364
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10 15
Pro Thr Ser Asn Gly Thr 20
<210> 365 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 365
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Phe Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10· 15 Pro Met Ser Lys Ala Gly 20 <210> 366 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 366 Arg Met Glu Met Leu Gly Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10 15
Pro Met Ser Lys Ala Arg 20
<210> 367 <211> 22 <212> PRT 285 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 367
Gin Het Glu Leu Leu Asp Ser Leu Phe Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10 15
Pro Lys Ser Gin Pro Ala 20
<210> 368 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 368
Arg Met Glu Met Leu Asp Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10 15
Pro Met Ser Asn Ala Arg 20
<210> 369 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 369
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu His Glu Ile Vai 15 10 15
Pro Met Ser Gin Ala Gly 20 <210> 370 <211> 22 286
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 370
Gin Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Gin Leu Leu Lys Glu Ile Vai 15 10 15
Pro Met Ser Lys Ala Ser 20
<210> 371 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 371
Arg Met Glu Met Leu Asp Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Asp Met Vai 15 10 15
Pro Met Thr Thr Gly Ala 20
<210> 372 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 372
Arg Ile Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Asp Met Vai 1 5 10 15 .
Pro Met Ala Asn Ala Ser 20 287
<210> 373 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 373
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Gin Leu Leu Asn Glu Ile Vai 1 ' 5 10 15
Pro Met Ser Arg Ala Arg 20
<210> 374 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 374
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Phe Asp Leu Leu Lys Glu Leu Vai 15 10 15
Pro Met Ser Lys Gly Vai 20
<210> 375 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 375 288
Arg Ile Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ile Vai 1 5 10 15
Pro Ile Gin Lys Ala Arg 20
<210> 376 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 376
Arg Met Glu Leu Leu Glu Ser Leu Phe Glu Leu Leu Lys Asp Met Vai 1 5 10 15
Pro Met Ser Asp Ser Ser 20
<210> 377 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 377
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Vai Leu Gin Glu Ile Vai 1 5 10 15
Pro Arg Ala Lys Gly Ala 20 .
<210> 378 <211> 22 <212> PRT <213>. Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 289 <400> 378
Arg Met Glu Met Leu Asp Ser Leu Leu Gin Leu Leu Asn Glu Ile Vai 15 10 15
Pro Met Ser His Ala Arg 20
<210> 379 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 379
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ile Vai 15 10 15
Pro Met Ser Asn Ala Gly 20
<210> 380 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 380
Arg Met Glu Met Leu Gin Ser Leu Phe Glu Leu Leu Lys Gly Met vai 15 10 15
Pro Ile Ser Lys.Ala Gly 20
<210> 381 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 290 <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 381
Arg Met Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10 „15
Pro Asn Ser Thr Ala Ala 20
<210> 382 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 382
Arg Met Glu Met Leu Gin Ser Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Ile Vai 1 5 10 15
Pro Ile Ser Lys Ala Gly 20
<210> 383 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 383
Arg Ile Glu Met Leu Asp Ser Leu Leu Glu Leu Leu Asn Glu Leu Vai 1.5 10 15
Pro Met Ser Lys Ala Arg 20 <210> 384 291 <211> 22
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 384
Gin Vai Glu Ser Leu Gin Gin teu Leu Met Trp Leu Asp Gin Lys Leu 1 5 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin Gly 20 <210> 385 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 385
Arg Met Glu Leu Leu Glu Ser Leu Phe Glu Leu Leu Lys Glu Met Vai 15 10 15
Pro Arg Ser Lys Ala Vai 20
<210> 386 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 386
Gin Ala Vai Ser Leu Gin His Leu Leu Met Trp Leu Asp Gin Lys Leu 1 5 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin His 20 292
<210> 387 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 387
Asp Glu Asp Ser teu Gin Gin Leu Leu Met Trp Leu Asp Gin Lys Leu 1 5 10 Ala Ser Gly Pro Gin Leu 20 * <210> 388 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência . Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 388
Pro Vai Ala Ser Leu Gin Gin Leu Leu Ile Trp Leu Asp Gin Lys Leu 15 10 15
Ala Gin Gly Pro His Ala 20
<210> 389 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 389 293
Glu Vai Asp Glu Leu Gin Gin Leu Leu Asn Trp Leu Asp His Lys Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro Leu Gin 20
<210> 390 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 390
Asp Vai Glu Ser Leu Glu Gin Leu Leu Met Trp Leu Asp His Gin Leu 1 5 .10 15
Ala Ser Gly Pro His Gly 20
<210> 391 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 391
Gin Vai Asp Ser Leu Gin Gin Vai Leu Leu Trp Leu Glu His Lys Leu 1 5 10 15
Ala Leu Gly Pro Gin Vai 20
<210> 392 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 294 <400> 392
Gly Asp Glu Ser Leu Gin His Leu Leu Met Trp Leu Glu Gin Lys Leu 15 10 15
Ala Leu Gly Pro His Gly 20
<210> 393 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 393
Gin Ile Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Asp Leu Leu.Arg Asp Met Vai 1 5 10 15
Pro Met Ser Asn Ala Phe 20
<210> 394 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 394
Glu Vai Asp Ser Leu Gin Gin Leu Leu Met Trp Leu Asp Gin Lys Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin Ala 20
<210> 395 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial 295 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 395
Glu Asp Glu Ser Leu Gin Gin Leu Leu Ile Tyr Leu Asp Lys Mét Leu 15 10 15
Ser Ser Gly Pro Gin Vai 20
<210> 396 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 396
Ala Met Asp Gin Leu His Gin Leu Leu Ile Trp Leu Asp His Lys Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin Ala 20
<210> 397 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 397
Arg Ile Glu Met Leu Glu Ser Leu Leu Glu Leu Leu Asp Glu Ile Ala 1 5 10 15
Leu Ile Pro Lys Ala Trp . 20
<210> 398 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial 296 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 398
Glu Vai Val Ser Leu Gin His Leu Leu Met Trp Leu Glu His Lys Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro Asp Gly 20
<210> 399 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 399
Gly Gly Glu Ser Leu Gin Gin Leu Leu Met Trp Leu Asp Gin Gin Leu 1 5 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin Arg 20
<210> 400 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 400
Gly Val Glu Ser Leu Gin Gin Leu Leu Ile Phe Leu Asp His Met Leu 15 10 15
Val Ser Gly Pro His Asp 20
<210> 401 <211> 22 <212> PRT 297 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 401
Asn Vai Glu Ser Leu Glu His Leu Met Met Trp Leu Glu Arg Leu Leu 1 5. 10 15
Ala Ser Gly Pro Tyr Ala 20
<210> 402 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 402
Gin Vai Asp Ser Leu Gin Gin Leu Leu Ile Trp Leu Asp His Gin Leu 1 5 10 15
Ala Ser Gly Pro Lys Arg 20 <210> 403 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 403
Glu Vai Glu Ser Leu Gin Gin Leu Leu Met Trp Leu Glu His Lys Leu 15 10 15
Ala Gin Gly Pro Gin Gly 20 <210> 404 <211> 22 298
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 404
Glu Vai Asp Ser Leu Gin Gin Leu Leu Met Trp Leu Asp Gin Lys Leu 1 5 10 15
Ala Ser Gly Pro Hís Ala • 20
<210> 405 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 405
Glu Vai Asp Ser Leu Gin Gin Leu Leu Met Trp Leu Asp Gin Gin Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin Lys 20
<210> 406 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 406
Gly Vai Glu Gin Leu Pro Gin Leu Leu Met Trp Leu Glu Gin Lys Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin Arg 20 <210> 407 299
<211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 407
Gly Glu Asp Ser Leu Gin Gin. Leu Leu Met Trp Leu Asp Gin Gin Leu 15 10 15
Ala Ala Gly Pro Gin Vai 20
<210> 408 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 408
Ala Asp Asp Ser Leu Gin Gin Leu Leu Met Trp Leu Asp Arg Lys Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro His Vai 20
<210> 409 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 409 300
Pro Vai Asp Ser Leu Gin Gin Leu Leu Ile Trp Leu Asp Gin Lys Leu 15 10 15
Ala Ser Gly Pro Gin Gly 20 <210> 410 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 410
Asp Trp Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Glu Gly 15 10 15
Leu Gly Asp Asn Leu Vai 20
<210> 411 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 411
Gin Ser Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Glu Gly 15 10 15
Leu Gly Asp Lys Gin Ala 20
<210> 412 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 301 < 4 0 0 > 412
Asp Gly Arg Ala Thr Leu Leu Thr Glu Phe Trp Gin Leu Vai Gin Gly 1 5 10 15
Leu Gly Gin Lys Glu Ala 20 .
<210> 413 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 413
Leu Ala Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Glu Gly 15 10 15
Leu Gly Glu Lys Vai Vai 20
<210> 414 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 414
Gly Ser Arg Asp Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Vai Gly 1 5 10 15
Leu Gly Asp Met Gin Thr 20
<210> 415 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 302 <400> 415
Asp Ala Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Asp Ala 15 10 15
Tyr Gly Asp Arg Met Vai 20
<210> 416 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 416
Asn Asp Arg Ala Gin Leu Leu Arg Asp Phe Trp Gin Leu Vai Asp Gly 15 10 15
Leu Gly Vai Lys Ser Trp 20
<210> 417 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 417
Gly Vai Arg Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Leu Trp Tyr Leu Leu Lys Gly 15 10 15
Leu Gly Ala Asn Gin Gly 20
<210> 418 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial 303 <22 0> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 418
Gin Ala Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Cys Gin Leu Vai Gly çys 1 5 10 15
Gin Gly Asp Lys Leu Sex' 20
<210> 419 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 419
Gin Ala Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Cys Gin Leu Vai Gly Cys 1 5 10 .15
Gin Gly Asp Lys Leu Ser 20
<210> 420 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 420
Ser Gly Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Gin Gly 15 10 15
Leu Gly Glu Tyr Arg Trp 20
<210> 421 <211> 22 <212> PRT 304 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 421
Thr Met Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Leu phe Vai Asp Gly 15 10 15
Gin Arg Glu Met Gin Trp 20
<210> 422 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 422
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Leu Asn Asp Phe Trp Gin Leu Vai Asp Gly 15 10 15
Gin Gly Asp Asn Thr Gly 20
<210> 423 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 423
Asp Glu Arg Glu Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Hís Gly 15 10 15
Trp Gly Asp Asn Vai Ala 20 <210> 424 <211> 22 305
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 424
Gly Gly Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Leu Trp Gin Leu Leu Glu Gly 15 10 15
Gin Gly Ala Asn Leu.Vai 20 <210> 425 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 425
Thr Ala Arg Ala Thr Leu Leu Asn Glu Leu Vai Gin Leu Vai Lys Gly 1 5 10 .15
Tyr Gly Asp Lys Leu Vai 20
<210> 426 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 426
Gly Met Arg Ala Thr Leu Leu Gin Glu Phe Trp Gin Leu Vai Gly Gly 1 5 10 15
Gin Gly Asp Asn Trp Met 20 306 <210> 427 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 427
Ser Thr Arg Ala Thr Leu Leu Asn Asp Leu Trp Gin Leu Met Lys Gly 1 5 10 15
Trp Ala Glu Asp Arg Gly 20
<210> 428 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 428
Ser Glu Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Leu Trp Gin Leu Vai Gly Gly 15 10 15
Trp Gly Asp Asn Phe Gly 20
<210> 429 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 429 307 307 Vai Gly Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Glu Gly 1.5 10 15
Leu Vai Gly Gin Ser Arg 20 <210> 430 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 430 Glu Ile Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Asp Glu 1 5 10 15
Trp Arg Glu Gin Pro Asn 20 <210> 431 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 431 Gin Leu Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Leu Gin Leu vai His Gly 1 5 10 15
Leu Gly Glu Thr Asp Ser 20
<210> 432 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 432 308
Thr Gin Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Ile Glu Gly 1 ' 5 10 15
Leu Gly Gly Lys His Vai 20
<210> 433 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 433
His Tyr Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Gin Leu Vai Asp Gly 1 5 10 15
Leu Arg Glu Gin Gly Vai 20
<210> 434 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 434
Gin Ser Arg Vai Thr Leu Leu Arg Glu Phe Trp Gin Leu Vai Glu Ser 1 5 10 15
Tyr Arg Pro Ile Vai Asn 20
<210> 435 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 309 <400> 435
Leu Ser Arg Ala Thr Leu Leu Asn Glu Phe Trp Gin Phe Vai Asp Gly 15 10 15
Gin Arg Asp Lys Arg Met 20 <210> 436
<211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 436
Trp Asp Arg Ala Thr Leu Leu Asn Asp Phe Trp Hís Leu Met Glu Glu 1 5 10 15
Leu Ser Gin Lys Pro Gly 20
<210> 437 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 437
Gin Glu Arg Ala Thr Leu Leu Lys Glu Phe Trp Arg Met Vai Glu Gly 1 5 10 15
Leu Gly Lys Asn Arg Gly 20
<210> 438 <211> 22 <212> PRT 310 <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 438
Asn Glu Arg Ala Thr Leu Leu Arg. Glu Phe Trp Gin Leu Vai Gly Gly 1 5 io 15
Tyr Gly Vai Asn Gin Arg 20
<210> 439 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 439
His Gin Arg Asp Met Ser Met Leu Trp Glu Leu Leu Asp Vai Leu Asp 15 10 15
Gly Leu Arg Gin Tyr Ser 20
<210> 440 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 440
Thr Gin Arg Asp Met Ser Met Leu Asp Gly Leu Leu Glu Vai Leu Asp 1 .5 10 15 .
Gin Leu Arg Gin Gin Arg 20 <210> 441 311
<211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 441
Thr Ser Arg Asp Met Ser Leu Leu Trp Glu Leu Leu Glu Glu Leu Asp 15 10 15
Arg Leu Gly His Gin Arg 20
<210> 442 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 442
Met Gin His Asp Met Ser Met Leu Tyr Gly Leu Vai Glu Leu Leu Glu 1 5 10 15
Ser Leu Gly His Gin Ile 20
<210> 443 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 443 312
Trp Asn Arg Asp Met Arg Met Leu Glu Ser Leu Phe Glu Vai Leu Asp 1 5 10 15
Gly Leu Arg Gin Gin Vai 20 <210> 444 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 444
Gly Tyr Arg Asp Met Ser Met Leu Glu Gly Leu Leu Ala Vai Leu Asp 15 10 15
Arg Leu Gly Pro Gin Leu 20
<210> 445 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 445
Thr Gin Arg Asp Met Ser Met Leu Glu Gly Leu Leu Glu Vai Leu Asp 1 5 10 15
Arg Leu Gly Gin Gin Arg ' 20
<210> 446 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de liqação à miostatina <400> 446 313
Trp Tyr Arg Asp Met Ser Met Leu Slu Gly keu keu <*lu Vai Leu Asp 1 5 10 15
Arg Leu Gly Gin Gin Arg 20 <210> 447
<211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 447
Thr Gin Asn Ser Arg Gin Met Leu Leu Ser Asp Phe Met Met Leu Vai 1 5 10 15
Gly Ser Met Ile Gin Gly 20
<210> 448 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 448
Met Gin Thr Ser Arg His Ile Leu Leu Ser Glu Phe Met Met Leu Vai 15 10 15
Gly Ser Ile Met His Gly 20
<210> 449 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina 314 <400> 449
His Asp Asn Ser Arg Gin Met Leu Leu Ser Asp Leu Leu His Leu Vai 15 10 15
Gly Thr Met Ile Gin Gly 20
<210> 450 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 450
Met Glu Asn Ser Arg Gin Asn Leu Leu Arg Glu Leu Ile Met Leu Vai 15 10 15
Gly Asn Met Ser His Gin 20
<210> 451 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 451
Gin Asp Thr Ser Arg His Met Leu Leu Arg Glu Phe Met Met Leu Vai 1 5 10 15
Gly Glu Met Ile Gin Gly 20
<210> 452 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial 315 <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 452
Asp Gin Asn Ser Arg Gin Met Leu Leu Ser Asp Leu Met lie Leu Vai 15 10 15
Gly Ser Met Ile Gin Gly 20
<210> 453 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 453
Asn Vai Phe Phe Gin Trp Vai Gin Lys His Gly Arg Vai Vai Tyr Gin 15 10 15
Trp Leu Asp Ile Asn Vai 20
<210> 454 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 454
Phe Asp Phe Leu Gin Trp Leu Gin Asn His Arg Ser Glu Vai Glu His 1 5 10 15
Trp Leu Vai Met Asp Vai 20 <210> 455 <211> 11 316
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1)
<223> Xaa é M ou I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8)
<223> Xaa é L ou F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9) . . (9)
<223> Xaa é E, Q ou D <400> 455
Xaa Glu Met Leu Xaa Ser Leu Xaa Xaa Leu Leu 15 10
<210> 456 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2) . . (2) <223> Xaa é Q, D ou E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) . . (3)
<223> Xaa é S, Q, D ou E 317 <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7)
<223> Xaa é L, W, F ou Y <400> 456
Leu Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Leu 1 5
<210> 457 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1)
<223> Xaa é R ou D <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) . . (3)
<223> Xaa é A, T, S ou Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4)
<223> Xaa é L ou M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5) 318 <223> Xaa é L ou S <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa é qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7)
<223> Xaa é F ou E <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa é W, F ou C. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9)
<223> Xaa é L, F, M ou K <400> 457
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 458 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 458
cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag aaattgttcc aatgtctaaa 60 gctggt 66 <210> 459 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial 319 <22 0> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 459 cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag aaattgttcc aatgtctaaa 60 gctcgt 66
<210> 460 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 460 cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag atattgttcc aatgtctaaa 60 ccatct 66
<210> 461 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 461 ggtatggaaa tgcttgaatc tctttttgaa cttcttcaag aaattgttcc aatgtctaaa 60 gctcca 66
<210> 462 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 320 <400> 462 cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag atattgttcc aatttctaat 60 ccacca 66
<210> 463 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 463 cgtattgaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttcaag aaattgttcc aatttctaaa 60 gctgaa 66
<210> 464 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 464 cgtatggaaa tgcttcaatc tcttcttgaa cttcttaaag atattgttcc aatgtctaat 60 gctcgt 66
<210> 465 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 465 321
cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag aaattgttcc aacctctaat 60 ggtact 66 <210> 466 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 466 cgtatggaaa tgcttgaatc tctttttgaa cttcttaaag aaattgttcc aatgtctaaa 60 gctggt 66
<210> 467 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 467 cgtatggaaa tgcttggttc tcttcttgaa cttcttaaag aaattgttcc aatgtctaaa 60 gctcgt 66
<210> 468 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 468 caaatggaac ttcttgattc tctttttgaa cttcttaaag aaattgttcc aaaatctcaa 60 66 ccagct 322
<210> 469 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 469 cgtatggaaa tgcttgattc tcttcttgaa cttcttaaag aaattgttcc aatgtctaat 60 gctcgt 66
<210> 470 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 470
cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttcatg aaattgttcc aatgtctcaa 60 gctggt 66 <210> 471 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 471
caaatggaaa tgcttgaatc tcttcttcaa cttcttaaag aaattgttcc aatgtctaaa 60 gcttct <210> 472 <211> 66 <212> ADN 66 323 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 472 cgtatggaaa tgcttgattc tcttcttgaa cttcttaaag atatggttcc aatgactact 60 ggtgct 66
<210> 473 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 473 cgtattgaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag atatggttcc aatggctaat 60 gcttct 65
<210> 474 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 474 cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttcaa cttcttaatg aaattgttcc aatgtctcgt 60 gctcgt 66
<210> 475 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 324 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 475 cgtatggaaa tgcttgaatc tctttttgat cttcttaaag aacttgttcc âatgtctaaa 60 ggtgtt 66
<210> 476 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 476 cgtattgaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag atattgttcc aattcaaaaa 60 gctcgt 66
<210> 477 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 477 cgtatggaac ttcttgaatc tctttttgaa cttcttaaag atatggttcc aatgtctgat 60 tcttct 66
<210> 478 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 325 <400> 478 cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa gttcttcaag aaattgttcc acgtgctaàa 60 ggtgct 66
<210> 479 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 479 cgtatggaaa tgcttgattc tcttcttcaa cttcttaatg aaattgttcc aatgtctcat 60 gctcgt 66
<210> 480 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 480 cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag atattgttcc aatgtçtaat 60
gctggt <210> 481 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 66 326 <400> 481 cgtatggaaa tgcttcaatc tctttttgaa cttcttaaag gtatggttcc aatttctaaa 60 gctggt 66
<210> 482 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 482 cgtatggaaa tgcttgaatc tcttcttgaa cttcttaaag aaattgttcc aaattctact 60 gctgct ' 66
<210> 483 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 483 cgtatggaaa tgcttcaatc tcttcttgaa cttcttaaag aaattgttcc aatttctaaa 60 gctggt 66
<210> 484 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 484 327 cgtattgraaa tgcttgattc tcttcttgaa cttcttaatg aacttgttcc aatgtctaaa 60 gctcgt 66
<210> 485 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 485 gattggcgtg ctactcttct taaagaattt tggcaacttg ttgaaggtct tggtgataat 60 cttgtt 66
<210> 486 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 486 gatggtcgtg ctactcttct tactgaattt tggcaacttg ttcaaggtct tggtçaaaaa 60 gaagct 66
<210> 487 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 487 cttgctcgtg ctactcttct taaagaattt tggcaacttg ttgaaggtct tggtgaaaaa 60 66 gttgtt 328
<210> 488 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 488 ggttctcgtg atactcttct taaagaattt tggcaacttg ttgttggtct tggtgatatg 60 caaact 66
<210> 489 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 489
gatgctcgtg ctactcttct taaagaattt tggcaacttg ttgatgctta tggtgatcgt 60 atggtt 66 <210> 490 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 490
aatgatcgtg ctcaacttct ccgtgatttt tggcaacttg ttgatggtct tggtgttaaa 60 tcttgg , 66 <210> 491 <211> 66 <212> ADN 329 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 491 ggtgttcgtg aaactcttct ttatgaactt tggtatcttc ttaaaggtct tggtgctaat 60 caaggt 66
<210> 492 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 492 caagctcgtg ctactcttct taaagaattt tgtcaacttg ctggttgtca aggtgataaa 60 ctttct 66
<210> 493 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 493 caagaacgtg ctactcttct taaagaattt tggcaacttg ttgctggtct tggtcaaaat 60 atgcgt
<210> 494 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial 66 330 < 2 2 0 > <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 494
tctggtcgtg ctactcttct taaagaattt tggcaacttg ttcaaggtct tggtgaatat 60 cgttgg 66 <210> 495 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 495 actatgcgtg ctactcttct taaagaattt tggctttttg ttgatggtca acgtgaaatg 60 caatgg 66
<210> 496 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 496
ggtgaacgtg ctactcttct taatgatttt tggcaacttg ttgatggtca aggtgataat 60 actggt 66 <210> 497 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 331 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 497
gatgaacgtg aaactcttct taaagaattt tggcaacttg ttcatggttg gggtgataat 60 gttgct 66 <210> 498 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 498 ggtggtcgtg ctactcttct taaagaactt tggcaacttc ttgaaggtca aggtgctaat 60 cttgtt 66
<210> 499 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 499 actgctcgtg ctactcttct taatgaactt gttcaacttg ttaaaggtta tggtgataaa 60 cttgtt 66
<210> 500 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 500 332 ggtatgcgtg ctactcttct tcaagaattt tggcaacttg ttggtggtca aggtgataat 60 tggatg 66
<210> 501 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 501 tctactcgtg ctactcttct taatgatctt tggcaactta tgaaaggttg ggctgaagat 60 cgtggt 66
<210> 502 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 502 tctgaacgtg ctactcttct taaagaactt tggcaacttg ttggtggttg gggtgataat 60 tttggt 66
<210> 503 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 503 gttggtcgtg ctactcttct taaagaattt tggcaacttg ttgaaggtct tgttggtcaa 60 66 tctcgt 333 333 <210> 504 <211> 62 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62). . (62) <223> Xaa = Fc <400> 504
Trp Cys Tyr 15
Met Gly Ala Gin Trp Tyr Pro Cys Tyr Glu Gly His Phe 15 10
Thr Ala Ser 30 .
Asp Leu Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser 20 25
Glu Gly His
Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Trp Tyr Pro Cys Tyr 35 40 45
Xaa
Phe Trp Cys Tyr Asp Leu Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly 50 55 60
<210> 505 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 505 tggtatccgt gttatgaggg tcacttctgg tgctacgatc tgggttctgg ttccactgct 60 tcttctggtt ccggttccgc tactggttçg tacccgtgct acgaaggtca cttttggtgt 120 tatgatctg 129 <210> 506 <211> 60 334
<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Fc <400> 506
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Tyr Pro Cys Tyr Glu Gly His 1 5 10 15
Phe Trp Cys Tyr Asp Leu Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Trp Tyr Pro Cys 35 40 45
Tyr Glu Gly His Phe Trp Cys Tyr Asp Leu Leu Glu 50 ' 55 60
<210> 507 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 507 tggtatecgt gttatgaggg tcacttctgg tgetacgatc tgggttctgg ttccactgct 60 tcttctggtt ccggttccgc taceggttgg tacccgtgct acgaaggtca cttttggtgt 120 tatgatctg 129
<210> 508 <211> 62 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 335 <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62).. (62) <223> Xaa = Fc <400> 508
Met Gly Ala Gin Ile Phe Gly Cys Lys Trp Trp Asp Vai Gin Cys Tyr 15 10 15
Gin Phe Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ile Phe Gly Cys Lys Trp Trp Asp 35 40 45
Vai Gin Cys Tyr Gin Phe Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 50 55 60
<210> 509 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 509 atctttggct gtaaatggtg ggacgttcag tgctaccagt tcggttctgg ttccactgct 60 tcttctggtt ccggttccgc tactggtatc ttcggttgca agtggtggga tgtacagtgt 120 tatcagttt 129
<210> 510 <211> 60 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> 336
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Fc <400> 510
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ile Phe Gly Cys Lys Trp Trp Asp 15 10 15
Vai Gin Cys Tyr Gin Phe Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ile Phe Gly Cys 35 40 45
Lys Trp Trp Asp Vai Gin Cys Tyr Gin Phe Leu Glu 50 55 60
<210> 511 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 511 atctttggct gtaaatggtg ggacgttcag tgctaccagt tcggttctgg ttccactgct 60 tcttctggtt ccggttccgc tactggtatc ttcggttgca agtggtggga tgtacagtgt 120 tatcagfctt 129 <210> 512 <211> 62 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62) . . (62) <223> Xaa = Fc <400> 512 337
Met GXy Ala Gin Ile ?he Gly Cys Lys Trp Trp Asp Vai Asp Cys Tyr 15 10 15
Gin Phe Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser 20 25 30
Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ile Phe Gly Cys Lys Trp Trp Asp 35 40 45
Vai Asp Cys Tyr Gin Phe Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 50 55 60
<210> 513 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 513 atctttggct gtaagtggtg ggacgttgac tgctaccagt tcggttctgg ttccactgcfc 5o tcttctggtt ccggttccgc tactggtatc ttcggttgca aatggtggga cgttgattgt 120 tatcagttt 229
<210> 514 <211> 60 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) . . (1) <223> Xaa = Fc <400> 514 338
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ile Phe Gly Cys Lys Trp Trp Asp 15 10 15
Vai Asp Cys Tyr Gin Phe Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly 20 25 30
Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ile Phe Gly Cys 35 40 45 i
Lys Trp Trp Asp Vai Asp Cys Tyr Gin Phe Leu Glu 50 55 60
<210> 515 <211> 129 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 515 atctttggct gtaagtggtg ggacgttgac tgctaccagt tcggttctgg ttccactgct 60 fccttctggtt ccggttccgc tactggtatc ttcggttgca aatggfcggga cgttgattgt 120 tatcagttt 129
<210> 516 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial. <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 516 caggttgaat ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc agaaactggc ttccggtccg 60 cagggt 66
<210> 517 <211> 66 <212> ADN 339 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 517 cgtatggaac tgctggaatc cctgttcgaa ctgctgaaag aaatggttcc gcgttccaaa 60 gctgtt 66
<210> 518 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 518 caggctgttt ccctgcagca cctgctgatg tggctggacc agaaactggc ttccggtccg 60 cagcac · 66
<210> 519 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 519 gacgaagact ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc agaaactggc ttccggtccg 60 cagctg 66
<210> 520 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 340 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 520 ccggttgctt ccctgcagca gctgctgatc tggctggacc agaaactggc tcagggtccg 60 cacgct 66
<210> 521 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 521 gaagttgacg aactgcagca gctgctgaac tggctggacc acaaactggc ttccggtccg 60 ctgcag 66
<210> 522 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 522
gacgttga&t ccctggaaca gctgctgatg tggctggacc accagctggc ttccggtccg 60 cacggt 66 <210> 523 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 341 <400> 523 caggttgact ccctgcagca ggttctgctg tggctggaac acaaactggc tctgggtccg 60 caggtt 66
<210> 524 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 524 ggtgacgaat ccctgcagca cctgctgatg tggctggaac agaaactggc tctgggtccg 60 cacggt 66
<210> 525 <211> 66 <212> ADN <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 525 cagatcgaaa tgctggaatc cctgctggac ctgctgcgtg acatggttcc gatgtccaac 60 gctttc 66
<210> 526 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 526 gaagttgact ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc agaaactggc ttccggtccg 60 66 caggct 342
<210> 527 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 527
gaagacgaat ccctgcagca gctgctgatc tacctggaca aaatgctgtc ctccggtccg 60 caggtt 66 <210> 528 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 528 gctatggacc agctgcacca gctgctgatc tggctggacc acaaactggc ttccggtccg 60 caggct 66
<210> 529 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 529 cgtatcgaaa tgctggaatc cctgctggaa ctgctggacg aaatcgctct gatcccgaaa .60 gcttgg 66 <210> 530 343
<211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 530 gaagttgttt ccctgcagca cctgctgatg tggctggaac acaaactggc ttccggtccg 60 gacggt 66
<210> 531 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 531 ggtggtgaat ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc agcagctggc ttccggtccg 60 cagcgt 66
<210> 532 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 532 ggtgttgaat ccctgcagca gctgctgatc ttcctggacc acatgctggt ttccggtccg 60 cacgac 66
<210> 533 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial 344 <22 0> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 533 aacgttgaafc ccctggaaca cctgatgatg tggctggaac gtctgcfcggc ttccggtccg 60 tacgct 66 <210> 534 <211> 66
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 534 caggttgact ccctgcagca gctgctgatc tggctggacc accagctggc ttccggtccg 60 aaacgt 66
<210> 535 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 535
gaagttgaat ccctgcagca gctgctgatg tggctggaac acaaactggc tcagggtccg 60 cagggt 66 <210> 536 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 345 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 536
gaagttgact ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc agaaactggc ttccggtccg 60 cacgct 6 6 <210> 537 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 537 gaagttgact ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc agcagctggc ttccggtccg 60 cagaaa 66
<210> 538 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 538
ggtgttgaac agctgccgca gctgctgatg tggctggaac agaaactggc ttccggtccg 60 cagcgt 66 <210> 539 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 346 <400> 539
ggtgaagact ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc agcagctggc tgctggtccg 60 caggtt 66 <210> 540 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 540 gctgacgact ccctgcagca gctgctgatg tggctggacc gtaaactggc ttccggtccg 60 cacgtt 66
<210> 541 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 541
ccggttgact ccctgcagca gctgctgatc tggctggacc agaaactggc ttccggtccg 60 cagggt 66 <210> 542 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 542 347 cagtcccgtg ctaccctgct gaaagaattc tggcagctgg ttgaaggtct gggtgacaaa 60 caggct 66
<210> 543 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 543 gaaatccgtg ctaccctgct gaaagaattc tggcagctgg ttgacgaatg gcgtgaacag 60 ccgaac 66
<210> 544 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 544 <400> 544 cagctgcgtg ctaccctgct gaaagaattc cfcgcagctgg ttcacggtct gggtgaaacc 60 gactcc 66
<210> 545 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 545 acccagcgtg ctaccctgct gaaagaattc tggcagctga tcgaaggtct gggtggtaaa 60 cacgtt 66 348
<210> 546 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de liqação à miostatina <400> 546 cactaccgtg ctaccctgct gaaagaattc tggcagctgg ttgacggtct gcgtgaacag 60 ggtgtt 66
<210> 547 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 547
cagtcccgtg ttaccctgct gcgtgaattc tggcagctgg ttgaatccta ccgtccgatc 60 gttaac 66 <210> 548 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 548
ctgtcccgtg ctaccctgct gaacgaattc tggcagttcg ttgacggtca gcgtgacaaa 60 cgtatg <210> 549 <211> 66 <212> ADN 66 349 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 549
tgggaccgtg ctaccetgct gaacgacttc tggcacctga tggaagaacc gtcecagaaa 60 ccgggt 66 <210> 550 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 550 caggaacgtg ctaccetgct gaaagaattc tggcgtatgg ttgaaggtct gggtaaaaac 60 cgtggt 66
<210> 551 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 551 aacgaacgtg ctaccetgct gcgtgaattc tggcagctgg ttggtggtta cggtgttaac 60 cagcgt 66 <210> 552 <211> 60 <213> Sequência Artificial <220> 350 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 552 cagcgtgaat ggtacccgtg ctacggtggt cacctgtggt gctacgacct gcacaaagct 60
<210> 553 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 553 atctccgctt ggtactcctg ctacgctggt cacttctggt gctgggacct gaaacagaaa 60
<210> 554 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 554 tggaccggtt ggtaccagtg ctacggtggt cacctgtggt gctacgacct gcgtcgtaaa 60
<210> 555 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 555 aaaaccttct ggtacccgtg ctacgacggt cacttctggt gctacaacct gaaatcctcc 60
<210> 556 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 351 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 556 gaatcccgtt ggtaccogtg ctacgaaggt cacctgtggt gcttcgaoct gaccgaaacc 60
<210> 557 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 557 aatgttfcttt ttcaatgggt tcaaaaacat ggtcgtgttg tttatcaatg gcttgatatt 60 aatgtt 66
<210> 558 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 558 tttgattttc ttcaatggct tcaaaatcat cgttctgaag ttgaacattg gcttgttatg 60 gatgtt 66
<210> 559 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 559 352 catcaacgtg atatgtctat gctttgggaa cttcttgatg ttctcgatgg tcttcgtcaa 60 tattct 66
<210> 560 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 560 actcaacgtg atatgtctat gcttgatggt cttcttgaag ttcttgatca acttcgtcaa 60 caacgfc 66
<210> 561 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 561 acctcccgtg acatgtccct gctgtgggaa ctgctggaag aactggaccg tctgggtcac 60 cagcgt 66
<210> 562 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 562 atgcaacatg atatgtctat gctttatggt cttgttgaac ttcttgaatc tcttggtcat 60 66 caaatt 353
<210> 563 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 563 tggaatcgtg atatgcgtat gcttgaatct ctttttgaag ttcttgatgg tcttcgtcaa 60 caagtt 66
<210> 564 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 564 ggttatcgtg atatgtctat gcttgaaggt cttcttgctg ttcttgatcg tcttggtcca 60 caactt 66 <210> 565 <211> 66 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 565 actcaacgtg atatgtctat gcttgaaggt cttcttgaag ttcttgatcg tcttggtcaa 60 caacgt 66
<210> 566 <211> 66 <212> ADN 354 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 566 tggtaccgtg acatgtccat gctggaaggt ctgctggaag ttctggaccg tctgggtcag 60 cagcgt 66
<210> 567 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 567 actcaaaatt ctcgtcaaat gcttctttct gattttatga tgcttgttgg ttctatgatt 60 caaggt 66
<210> 568 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 568 atgcaaactt ctcgtcatat tcttctttct gaatttatga tgcttgttgg ttctattatg 60 catggt
<210> 569 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial 66 <220> 355 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 569
cacgacaact cccgtcagat gctgctgtcc gacctgctgc acctggttgg taccatgatc 60 cãgggt 66 <210> 570 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 570 atggaaaact cccgtcagaa cctgctgcgt gaactgatca tgctggttgg taacatgtcc 60 caccag ' 66
<210> 571 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 571
caggacacct cccgtcacat gctgctgcgt gaattcatga tgctggttgg tgaaatgatc 60 cagggt 66 <210> 572 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 356 <400> 572 gaccagaact cccgtcagat gctgctgtcc gacctgatga tcctggttgg ttccatgatc 60 cagggt 66
<210> 573 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 573 gttgctcttc atggtcaatg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca acgtgaaggt 60
<210> 574 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 574 tatccagaac aaggtctttg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aactcttgct 60
<210> 575 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 575 ggtctgaacc agggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca ggactccaac 60
<210> 576 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 357 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 576 atgattactc aaggtcaatg tactogttgg ccatggatgt gtccaccaca accatctggt 60
<210> 577 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <210> 577
gctggtgctc aggaacactg cacccgttgg ccgtggatgt gcgctccgaa cgactggatc 60 <210> 578 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 578 ggtgttaacc agggtcagtg cacccgttgg cgttggatgt gcccgccgaa cggttgggaa 60
<210> 579 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 579
ctggctgacc acggtcagtg catccgttgg ccgtggatgt gcccgccgga aggttgggaa 60 <210> 580 <211> 60 <212> ADN 358 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 580 atcctggaac aggctcagtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gcgtggtggt 60
<210> 581 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 581 actcaaactc atgctcaatg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca atgggaaggt 60
<210> 582 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 582 gttgttactc aaggtcattg tactctttgg ccatggatgt gtccaccaca acgttggcgt 60
<210> 583 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 583 atttatccac atgatcaatg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca accatatcca 60 <210> 584 359
<211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 584 tcttattggc aaggtcaatg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca atggcgtggt 60
<210> 585 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 585 atgtggcaac aaggtcattg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggttggggt 60
<210> 586 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 586 gaattcaccc agtggcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gcgttcccag 60
<210> 587 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 587 ctggacgacc agtggcagtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gggtttctcc 60 360
<210> 588 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 588 tatcaaactc aaggtctttg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca atctcaacgt 60
<210> 589 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 589 gaatctaatc aaggtcaatg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggtggttgg 60
<210> 590 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 590 tggaccgacc gtggtccgtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca ggctaacggt 60
<210> 591 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 361 <400> 591 gttggtaccc agggtcagtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgta cgaaaccggt 60
<210> 592 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 592 ccgtacgaac agggtaaatg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgta cgaagttgaa 60
<210> 593 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 593 tccgaatacc agggtctgtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gggttggaaa 60
<210> 594 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 594 accttctccc agggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gggttggggt 60
<210> 595 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 362 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 595 ccgggtgctc acgaccactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gtcccgttac 60
<210> 596 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 596 gttgctgaag aatggcactg ccgtcgttgg ccgtggatgt gcccgccgca ggactggcgt 60
<210> 597 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 597 gttggtaccc agggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gccggctggt 60
<210> 598 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 598 gaagaagacc aggctcactg ccgttcctgg ccgtggatgt gcccgccgca gggttgggtt 60
<210> 599 <211> 60 <212> ADN 363 <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 599 gctgacaccc agggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gcactggttc 60
<210> 600 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 600 tccggtccgc agggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcgctccgca gggttggttc 60
<210> 601 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 601 accctggttc agggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gcgttgggtt 60
<210> 602 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 602 ggtatggctc acggtaaatg cacccgttgg gcttggatgt gcccgccgca gtcctggaaa 60 <210> 603 364
<211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 603 gaactgtacc acggtcagtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gtcctgggct 60
<210> 604 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 604 gttgctgacc acggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gggttggggt 60
<210> 605 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 605 ccggaatccc agggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gggttggggt 60
<210> 606 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 606 atcccggctc acggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gcgttggcgt 60 365
<210> 607 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 607 ttcaccgttc acggtcactg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgta cggttgggtt 60
<210> 608 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 608 ccagattttc caggtcattg tactcgttgg cgttggatgt gtccaccaca aggttgggaa 60
<210> 609 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 609 cagctgtggc agggtccgtg cacccagtgg ccgtggatgt gcccgccgaa aggtcgttac 60
<210> 610 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 366 <400> 610 cacgctaacg acggtcactg cacccgttgg cagtggatgt gcccgccgca gtggggtggt 60
<210> 611 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 611 gaaaccgacc acggtctgtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgta cggtgctcgt 60
<210> 612 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 612 ggtacctggc agggtctgtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gggttggcag 60
<210> 613 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 613 gttgctaccc agggtcagtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gggttggggt 60
<210> 614 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina 367 <400> 614 gttgctaccc agggtcagtg cacccgttgg ccgtggatgt gcccgccgca gcgttggggt 60 <210> 615 <211> 74 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> Λ OO C\] CN V Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Fc <400> 615
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Ala Asp His Gly Gin Cys Ile 1 5 10 15
Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Glu Gly Trp Glu Leu Glu Gly Ser 20 25 30
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 35 40 45
Ser Ala Thr Gly Leu AlaiAsp His Gly Gin Cys lie Arg Trp Pro Trp 50 55 60
Met cys Pro Pro Glu Gly Trp Glu Leu Glu 65 70
<210> 616 <211> 198 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 616 368 cttgetgatc atggtcaatg tattcgttgg ccatggatgt gtccaccaga aggttgggaa 60 ctcgagggtt ccggttccgc taccggcggc tcfcggctcca ctgcttcttc cggttccggt 120 tctgctactg gtctggctga ccacggtcag tgcatccgtt ggccgtggat gtgcccgccg 180 gaaggttggg aactggaa 198 <210> 617 <211> 70 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Fc <400> 617 xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Ala Asp His Gly Gin Cys Ile 1 5 10 15
Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Glu Gly Trp Glu Gly Ser Gly Ser 20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala 35 40 45
Thr Gly Leu Ala Asp His Gly Gin Cys Ile Arg Trp Pro Trp Met Cys 50 55 60
Pro Pro Glu Gly Trp Glu S5 70
<210> 618 <211> 186 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação a miostatina 369 <400> 618 cttgetgatc atggtcaatg tattcgttgg ccatggatgt gtccaccaga aggttgggaa 60 ggttccggtt ccgctaccgg cggctctggc ggtggcgctt cttccggttc cggttctgct 120 actggtctgg ctgaccacgg tcagtgcatc cgttggccgt ggatgtgtcc accagaaggt 180 tgggaa 186
<210> 619 <211> 74 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Fc <400> 619
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser Glu Tyr Gin Gly Leu Cys Thr 1 5 10 15 Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Lys Leu Glu Gly Ser 20 25 30 Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Ser GlU Tyr Gin Gly Leu Cys Thr Arg Trp Pro Trp 50 55 60 Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Lys Leu Glu 65 70
<210> 620 <211> 198 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 370 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 620 tctgaatatc aaggtctttg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggttggaaa 60 ctcgagggtt ccggttccgc taccggcggc tctggctcca ctgcttcttc cggttccggt 120 tctgctactg gttctgagta tcaaggcctc tgtactcgct ggccatggat gtgtccacca 180 caaggctgga agctggaa 198 <210> 621 <211> 70 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> Λ t^> t^> LO V Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (D.. (D <223> Xaa = Fc <400> 621
Xaa Gly Gly (Sly Gly Gly Ala Gin Ser Glu Tyr Gin Gly Leu Cys Thr 1 5 10 15
Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Lys Gly Ser Gly Ser 20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala 35 40 45
Thr Gly Ser Glu Tyr Gin Gly Leu Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys 50 55 60
Pro Pro Gin Gly Trp lys 65 70
<210> 622 <211> 186 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 371 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 622 tctgaatatc aaggtctttg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggttggaaa ggttccggtt ccgctaccgg cggctctggc ggtggcgctt cttccggttc cggttctgct actggttctg agtatcaagg cctctgtact cgctggccat ggatgtgtcc accacaaggt tggaaa 60 120 180 186
<210> 623 <211> 74 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Fc <400> 623
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Phe Ser Gin Gly His Cys Thr 15 10 15
Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Leu Glu Gly Ser 20 25 30
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 35 40 45
Ser Ala Thr Gly Thr Phe Ser Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp 50 55 60
Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Leu Glu 65 70
<210> 624 <211> 198 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 372 <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 624 actttttctc aaggtcattg ctcgagggtt ccggttccgc tctgctactg gtactttttc caaggctggg gcctggaa tactcgttgg ccatggatgt taccggcggc tctggcitcca tcaaggccat tgtactcgct gtccaccaca aggttggggt ctgcttcttc cggttccggt ggccatggat gtgtccacca 60 120 180 198 <210> 625 <211> 74 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)·.(1) <223> Xaa = Fc <400> 625 xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Vai Ala Asp His Gly His Cys Thr 1 5 10 15
Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Leu Glu Gly Ser 20 25 30
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 35 40 45
Ser Ala Thr Gly Vai Ala Asp His Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp 50 55 60
Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Leu Glu 65 70 <210> 626 373
<211> 198 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 626 gttgctgatc atggtcattg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggttggggt 60 ctcgagggtt ccggttccgc aaccggcggc tctggctcca ctgctfccttc cggttccggt 120 tetgctactg gtgfctgctga ccacggtcac tgcacccgtt ggccgtggat gtgcccgccg 180 cagggttggg gtctggaa · 198 <210> 627 <211> 70 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (D <223> Xaa = Fc <400> 627
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Vai Ala Asp His Gly His Cys Thr 15 10 15
Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser 20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala 35 40 45
Thr Gly Vai Ala Asp His Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Vai Cys 50 55 60
Pro Pro Gin Gly Trp Gly 65 70 374
<210> 628 <211> 186 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 628 60 120 180 186 gttgctgatc atggtcattg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggttggggt ggttccggtt ccgctaccgg cggctctggc ggtggtgctt cttccggttc cggttctgct actggtgttg ctgaccacgg tcactgcacc cgttggccgt gggtgtgtcc accacaaggt tggggt <210> 629 <211> 74 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> Λ 00 CN CN V Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) · · (1) <223> Xaa = Fc <400> 629 375
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro.Glu Ser Gin Gly His Cys'Thr 15 10 15
Arg Trp Pro Trp Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Leu Glu Gly Ser 20 25 30
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly 35 40 45
Ser Ala Thr Gly Pro Glu Ser Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp 50 55 60
Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Leu Glu 65 70
<210> 630 <211> 198 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 630 60 120 180 198 ccagaatctc aaggtcattg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggttggggt ctcgagggtt ccggttccgc taccggcggc tctggctcca ctgcttcttc cggttccggt tctgctactg gtccggaatc ccagggtcac tgcacccgtt ggccgtggat gtgcccgccg cagggttggg gtctggaa <210> 631 <211> 70 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Pepticorpo <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) ·. (1) <223> Xaa= Fc <400> 631 376
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Àla Gin Pro Glu Ser Gin Gly His Cys Thr 1 5 10 15
Arg Trp Pro. Trp Met Cys Pro Pro Gin Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser 20 25 30
Ala Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala 35 40 45
Thr Gly Pro Glu Ser Gin Gly His Cys Thr Arg Trp Pro Trp Met Cys 50 55 60
Pro Pro Gin Gly Trp Gly 65 70
<210> 632 <211> 186 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos que codifica o péptido de ligação à miostatina <400> 632 ccagaatctc aaggtcattg tactcgttgg ccatggatgt gtccaccaca aggttggggt 60 ggttçcggct ccgctaccgg cggctctggc ggtggtgctt cttccggttc cggttctgct 120 actggtccgg aatcccaggg tcactgcacc cgttggccgt ggatgtgtcc accacaaggt 180 tggggt 186
<210> 633 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido de ligação à miostatina <400> 633
Trp Met Cys Pro Pro 1 5 377
<210> 634 <211> 90 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de nucleótidos gerada de forma aleatória <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> N = A, T, C ou G são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (18).. (18) <223> K = G e T são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> N = A, T, C ou G são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (21) . . (21) <223> K = G e T são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (22) . . (23) <223> N = A, T, C ou G são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> K = G e T são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (30) . . (30) <223> K = G e T são igualmente representados <220> <221> misc feature 378 <222> (33) . . (33) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (36) . . (36) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (39) . . (39) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (42) .. (42) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (45) .. (45) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (48) .. (48) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (51) . . (51) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (54) .. (54) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (57) .. (57) <223> Κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (60) . . (60) 379 <223> κ = G e Τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (63).. (63) <223> κ = g e τ são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (66) . . (66) <223> K = G e T são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (67)..(68) <223> N = A, T, C ou G são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (69) . . (69) <223> K = G e T são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (70) . . (71) <223> N = A, T, C ou G são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (72) .. (72) <223> K = G e T são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (73) . . (74) <223> N = A, T, C ou G são igualmente representados <220> <221> misc_feature <222> (75) .. (75) <223> K = G e T são igualmente representados <400> 634 cacagtgcac agggtnnknn knnkcakggk caktgkackc gktgkccktg katktgkcck 60 90 ccktaknnkn nknnkcattc tctcgagatc 380
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição wo 0209641 A [0008] wo 0183525 A [0025] wo 0024782 A [0029] [0172] [0195] us 5223409 A [0032] us 5733731 A [0032] us 5498530 A [0032] us 5432018 A [0032] us 5338665 A [0032] us 5922545 A [0032] wo 9640987 A [0032] wo 9815833 A [0032] us 4289872 A, Denkenwalter [0041] us 5229490 A, Tam [0041] wo 9321259 A, Frechet [0041] wo 9734631 A [0044] wo 9632478 A [0044] us 5739277 A, Presta [0046] wo 9611953 A [0047] [0049] wo 9605309 A [0049] EP 0315456 A [0049] us 5877289 A [0067] us 6004555 A [0067] us 6132729 A [0067] us 6132730 A [0067] us 6156321 A [0067] EP 0988056 A [0067] 2 2 us 4640835 A [0079] us 4496689 A [0079] us 4301144 A [0079] us 4670417 A [0079] us 4791192 A [0079] us 4179337 A [0079] us 6133426 A, Gonzales [0079] us 3969287 A [0087] us 3691016 A [0087] us 4195128 A [0087] us 4247642 A [0087] us 4229537 A [0087] us 4330440 A [0087] us 3817837 A [0092] us 3850752 A [0092] us 3996345 A [0092] us 4277437 A [0092] us 3939350 A [0092] us 5424398 A [0093] us 94001875 W [0150] us 9300829 W [0157] us 3773919 A [0157] EP 58481 A [0157] EP 133988 A [0157] EP 36676 A [0157] EP 88046 A [0157] EP 143949 A [0157] US 4710473 A [0172] [0195] us 60435923 B [0242] na
Literatura não relacionada com patentes referida descrição
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Claims (24)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um agente de ligação que compreende pelo menos um péptido capaz de se ligar a miostatina, em que o péptido compreende a sequência Cbib2Wb3WMCPP (SEQ ID NO: 353), em que bi é seleccionado a partir de qualquer um dos aminoácidos T, I, ou R; b2 é seleccionado a partir de qualquer um de R, S, Q; b3 é seleccionado a partir de qualquer um de P, Re Q, em que o péptido tem entre 10 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
2. O agente de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que o péptido é seleccionado a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 305-308, 310-313, 315-331, 333, e 335-346. 2 e em que a, b, c, d, e, e f são cada um independentemente 0 ou 1, com a condição de que pelo menos um de a e b seja 1, e em que os péptidos P1, P2, P3, e P4 têm cada um entre 10 e 50 aminoácidos de comprimento, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
4. O agente de ligação de acordo com a reivindicação 3, em que os péptidos são independentemente seleccionados a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 305-308, 310-313, 315-331, 333, e 335-346.
5. O agente de ligação de acordo com a reivindicação 3, em que aéOebél, ou em que a é 1 e b é 0.
6. O agente de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-5, em que o veiculo é um domínio Fc.
7. Uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de polinucleótidos que codifica os agentes de ligação de acordo com a reivindicação 6.
8. A molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7, em que o polinucleótido é seleccionado a partir de qualquer uma das SEQ ID NO: 573 a 614, e 616, 618,620, 622, 624, 626, 628, 630, 632.
9. Um vector de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7.
10. Uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão de acordo com a reivindicação 9.
11. A célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, em que a célula é uma célula procariótica. 3
12. A célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, em que a célula é uma célula eucariótica.
13. Um método de preparação de um agente de ligação a miostatina que compreende cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10 sob condições que promovam a expressão da proteína recombinante, e recuperar a proteína.
14. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do agente de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável do mesmo.
15. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para utilização num método de inibição da actividade de miostatina num indivíduo em necessidade da mesma.
16. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para utilização num método de aumento de massa muscular magra e força num indivíduo em necessidade da mesma.
17. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para utilização num método de aumento da razão de massa muscular magra em relação à gordura num indivíduo em necessidade da mesma.
18. A composição de acordo com a reivindicação 17, em que o indivíduo é um animal para alimentação.
19. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para utilização num método de tratamento de uma doença ou distúrbio de atrofia muscular num indivíduo em necessidade da mesma. 4
20. A composição de acordo com a reivindicação 19, em que a doença ou distúrbio de atrofia muscular é seleccionado a partir dos seguintes: distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica, doença pulmonar obstrutiva congestiva, insuficiência cardíaca crónica, caquexia do cancro, SIDA, insuficiência renal, uremia, sarcopenia relacionada com a idade, artrite reumatóide, e atrofia muscular devido a repouso prolongado na cama, acidente vascular cerebral, lesão da medula espinhal, doença, fractura óssea, traumatismo, envelhecimento, e exposição a microgravidade.
21. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para utilização num método de tratamento de um distúrbio metabólico num indivíduo.
22. A composição de acordo com a reivindicação 21, em que o distúrbio metabólico é seleccionado dos seguintes distúrbios: diabetes do tipo 2, diabetes mellitus não dependente de insulina, hiperglicemia, perda óssea e obesidade.
23. O agente de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para utilização num método de detecção ou diagnóstico de um distúrbio relacionado com a miostatina num indivíduo.
24. Um método de medição da miostatina numa amostra ex vivo ou in vitro que compreende colocar em contacto a amostra com o agente de ligação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e medir o complexo ligado.
25. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14 para utilização em terapêutica. 1/6 Activídade de sinalizaçao da miostatina (4 nM de miostatina)
TN8-19 (péptído) TN8-i9(pepíicorpo) 7 . 8 concentração: nM (log) FIGURA 1 2/6 2/6
m+m—HuFc (2/semanalmente) ......1mpk í2/semanaimente) •o.»..,., 3ifjpk (2/semanaÍ mente) 10rnpk(2/semanalmente) c -o - 10mpk(1 /semanaimente) FIGURA 2 3/6 Φ Xj JB o31 φ ^φ 3 C EU o (β H Φ Φ » « iS 3Ϊ oaotji— 0,175 0,15D 0,125-0,100 - 0,075 opgo- ofm- * JTESi λ .ív ) U- í ···' 0,000 X' HuFc 1mpk 3mpk 10mpk10mpk (2/S) (2/S) (2/s) (2/s) (1/S) FIGURA 3A
D0 D13 □Vmpk FIGURA 3B 03mpk 010mpk(2/semanalmente) i10mpk{1/semanalmente) 4/6
□HuFc
1 mk 3 mk 10 mk 30 mk FIGURA 4 5/6
Dia de injecção FIGURA 5A 1 mg/kg 3 mg/kg
Hu-Fc 1 x 2 x 1 x 2x 2xPc:3mpk 2xPc: 1 mpk 1 xPc: 3 mpk 1 x pc: I mpk Hu-Fc FIGURA 5B β/β
Hu-Fc lxraTNS- (n-6) 19*33 FIGURA 6A
Hu-Fc lxmTN8- (n=6) 19-33 FIGURA 6B
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