NO20141479L - Bindingsmidler som inhiberer myostatin - Google Patents

Bindingsmidler som inhiberer myostatin

Info

Publication number
NO20141479L
NO20141479L NO20141479A NO20141479A NO20141479L NO 20141479 L NO20141479 L NO 20141479L NO 20141479 A NO20141479 A NO 20141479A NO 20141479 A NO20141479 A NO 20141479A NO 20141479 L NO20141479 L NO 20141479L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
peptide
amino acid
myostatin
binding
neutral
Prior art date
Application number
NO20141479A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Charles Boone
Hosung Min
Hq Han
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Publication of NO20141479L publication Critical patent/NO20141479L/no
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/06—Anabolic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G01N33/567—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds utilising isolate of tissue or organ as binding agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Description

Oppfinnelsens område
Oppfinnelsen vedrører vekstfaktorer og spesielt vekstfaktoren myostatin og midler som binder myostatin og inhiberer dens aktivitet.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Myostatin, som også er kjent som vekst/differensieringsfaktor-8 (GDF-8) er et transformerende vekstfaktor-p (TGF-p)-familiemedlem som er kjent for å være involvert i regulering av skjelett muskelmasse. De fleste medlemmer av TFG-p-GDF-familien blir uttrykt uspesifikt i mange vevstyper og utøver en mengde pleiotropiske virkninger. Likevel er myostatin for en stor del uttrykt i celler i utviklende og voksent skjelett muskelvev og spiller en essensiell rolle i negativ kontrahering av skjellett muskelvekst (McPherron et al. Nature (London) 387, 83-90 (1997)). Nyere undersøkelser indikerer likevel at lave nivåer
av myostatinuttrykking kan bli målt i hjerte-, fett- og prefettvev.
Myostatin proteinet har blitt svært konservert evolusjonært (McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997)). Den biologisk aktive C-terminale regionen til myostatin har 100 % sekvensidentitet mellom humane-, muse-, rotte-, storfe-, hønse- og kalkunsekvenser. Virkningen til myostatin ser også ut til å være konservert mellom arter. Dette fremgår av fenotypene til dyr som har mutasjon i myostatingenet. To storferaser, belgisk blå (R. Hanset, Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, red., J.W.G. King & F. Menissier (Nijhoff, Haag, Nederland) s. 437-449) og piedemontese (G. Masoero & B. Poujardieu, Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, red. J.W.G. King & F. Menissier (Nijhoff, Haag, Nederland)
s. 450-459) erkarakterisert veden "dobbelt muskel" fenotype og økning i muskelmasse. Disse rasene ble vist å inneha mutasjoner i den kodende regionen for myostatingenet (McPherron et al. (1997) ovenfor). I tillegg viser mus som inneholder en målrettet delesjon i genet som koder for myostatin (Mstn) en dramatisk økning i muskelmasse uten en tilsvarende økning i fett. Individuelle muskler i Mstn -/- mus veier omtrent 100 til 200 prosent mer enn disse musklene i kontrolldyr som et resultat av muskelfiber hypertrofi og hyperplasi (Zimmers et al. Science 296, 1486 (2002)).
Administrering av myostatin til visse stammer av mus har blitt vist å føre til en tilstand som ligner muskelsvinn forstyrrelser som er funnet å være assosiert med kreft,
AIDS og for eksempel muskulær dystrofi. Myostatin administrert som
myostatinproduserende CHO-celler til atymiske nakne mus førte til en svinneffekt med en høy grad av vekttap, en minkning på så mye som 50 % i skjellett muskelmasse i tillegg til fettap og alvorlig hypoglykemi (Zimmers et al., ovenfor).
Tap av myostatin ser ut til å føre til en tilbakegang i muskelmasse og reduksjon i fettakkumulering som følger aldring. Det har blitt vist at aldersrelaterte økninger i fettvevsmasse og minskning i muskelmasse var proporsjonale med myostatinnivåer, som bestemt ved en sammenligning av fett- og muskelmasse i voksne Mstn<+/+->knockout mus når de ble sammenlignet med voksne Mstn"</>--knockout mus (McFerron et al. J. Clin. Invest 109, 595 (2002)). Mstn ^-mus viste minsket fettakkumulering med alder sammenlignet med Mstn<+/+->mus.
I tillegg spiller myostatin en rolle i å opprettholde blodglukosenivåer og kan påvirke utviklingen av diabetes i visse tilfeller. Det er for eksempel kjent at skjellettmuskelresistens ovenfor insulinstimulert glukoseopptak er den tidligste kjente manifestasjonen av ikke-insulinavhengig (type 2) diabetes mellitus (Corregan et al. Endocrinology 128:1682 (1991)). Det har blitt vist at mangelen på myostatin delvis fjerner de tykke fenotypene og diabetes fenotypene i to musemodeller, agouti lethal yellow (A<y>) (Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994)), og overvektige (Lepob/ob).Fettakkumulering og total kroppsvekt forA<y>/a, Mstn dobbelmutant musen ble dramatisk redusert sammenlignet med A<y/a>Mstn<+/+->musen (McFerron et al. (2002) ovenfor). I tillegg var blodglukosenivåer i Ay/a, Mstn ^-musen dramatisk lavere enn i A<y/a>Mstn<+/+->musen etter eksogen glukosetilførsel, noe som tyder på at mangelen på myostatinforbedret glukosemetabolisme. Likeledes viste Lep^^Mstn ^-mus minsket fettakkumulering sammenlignet med Lep<ob/ob>Mstn<+/+->fenotypen.
Derfor foreligger det overbevisende bevis fra fenotypene med overuttrykking og knockoutdyr at myostatin kan spille en rolle i å bidra til et antall metabolske forstyrrelser inkludert forstyrrelser som fører til muskeltap, diabetes, overvekt og hyperglykemi.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot bindingsmidler som binder myostatin og inhiberer dens aktivitet. Bindingsmidlene omfatter minst et peptid som er i stand til å binde myostatin. De myostatinbindende peptidene er fortrinnsvis mellom omtrent 5 og omtrent 50 aminosyrer lange, mer foretrukket mellom omtrent 10 og 30 aminosyrer lange, mer foretrukket mellom omtrent 10 og 25 aminosyrer lange. I en utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet aminosyresekvensen WMCPP (SEKV. ID. NR. 633). I en annen utførelsesform omfatter de myostatinbindende peptidene aminosyresekvensen Caia2Wa3WMCPP (SEKV. ID. NR. 352), der au a2og a3er valgt fra en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre. I en annen utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet sekvensen Cbib2Wb3WMCPP (SEKV. ID. NR. 353), der bi er valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R; b2er valgt fra enhver av R, S, Q; b3er valgt fra enhver av P, R og Q, og der peptidet er mellom 10 og 50 aminosyrer i lenge, og fysiologisk akseptable salter derav. I en annen utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet formelen:
Cicddc^CfiCcTcWco WMCPPdnCii Ci,Ci g (SEKV. ID. NR. 354), der:
Cier fraværende eller enhver aminosyre;
c2er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c3er fraværende en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c4er fraværende eller enhver aminosyre;
c5er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c6er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c7er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c8er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c9er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; og
c10-c13er enhver aminosyre; og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer langt, og fysiologisk akseptable salter derav.
I en beslektet utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet formelen:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WJviCPPd1od11d12d13 (SEKV. ID. NR. 355), der:
di er fraværende eller enhver aminosyre;
d2er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d3er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d4er fraværende eller enhver aminosyre;
d5er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d6er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
d7er valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R;
d8er valgt fra enhver av R, S, Q;
d9er valgt fra enhver av P, R og Q; og
di0-di3er valgt fra enhver aminosyre,
og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav.
Ytterligere utførelsesformer av bindingsmidler omfatter minst ett av de følgende peptidene: (1) et peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen WYeie,Ye,G (SEKV. ID. NR. 356)
der ei er P, S eller Y,
e2er C eller Q, og
e3er G eller H, der peptidet er mellom 7 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav; (2) et peptid som er i stand til å binde myostatin der peptidet omfatter sekvensen fi EMLf, SLf^LL (SEKV. ID. NR. 455),
der fi er M eller I,
f2er enhver aminosyre,
f3er L eller F,
f4er E, Q eller D,
og der peptidet er mellom 7 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav,
(3) et peptid som er i stand til å binde myostatin der peptidet omfatter sekvensen L<g>i<g>2LLg3g4L(SEKV. ID. Nr. 456), der
gi er Q, D eller E,
g2er S, Q, D eller E,
g3er enhver aminosyre,
g4er L, W, F eller Y, og der peptidet er mellom 8 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav;
(4) et peptid som er i stand til å binde myostatin der peptidet omfatter sekvensen hih2h3h4h5h6h7h8h9(SEKV. ID. NR. 457), der
hi er R og D,
h2er enhver aminosyre,
h3er A, T, S eller Q,
h4er L eller M,
h5er L eller S,
h6er enhver aminosyre,
h7er F eller E,
h8 er W, F eller C,
h9er L, F, M eller K, og der peptidet er mellom 9 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav.
I en utførelsesform omfatter bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse ytterligere minst en vehikkel slik som en polymer eller et Fc-domene, og kan ytterligere omfatte minst en linkersekvens. I denne utførelsesformen blir bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse konstruert slik at minst et myostatinbindende peptid er bundet til minst en vehikkel. Peptidet eller peptidene er bundet direkte eller indirekte via en linkersekvens til vehikkelen på N-terminalen, C-terminalen eller en aminosyre sidekjede på peptidet. I denne utførelsesformen har bindingsmiddelet ifølge foreliggende oppfinnelse den følgende generaliserte strukturen: (X<1>)a-F<1->(X<2>)beller multimerer derav;
der Fi er en vehikkel, og X<1>og X<2>hver uavhengig er valgt fra
-(L^c-P<1>; -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2>; -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3>;
og -(LVP^L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
derP<1>,P<2>, P<3>og P<4>er peptider som er i stand til å binde myostatin; ogL<1>,L<2>,L<3>og L4 hver er linkere, og a, b, c, d, e og f hver uavhengig er 0 eller 1,
gitt at minst en av a og b er 1, og fysiologisk akseptable salter derav.
I ulike utførelsesformer av bindingsmidler som har denne generaliserte strukturen kan peptidene P<1>, P<2>, P<3>og P<4>uavhengig bli valgt fra et eller flere av ethvert av peptidene som omfatter sekvensene som er tilveiebrakt ovenfor. P<1>, P<2>, P3 og P<4>er uavhengig valgt fra et eller flere av peptidene som omfatter enhver av de følgende sekvensene: SEKV. ID. NR. 633, SEKV. ID. NR. 352, SEKV. ID. NR. 353, SEKV. ID. NR. 354, SEKV. ID. NR. 355, SEKV. ID. NR. 356, SEKV. ID. NR. 455, SEKV. ID. NR. 456 eller SEKV. ID. NR. 457.
I en ytterligere utførelsesform omfatter bindingsmidlene peptider fusjonert til et Fc-domene, enten direkte eller indirekte, for derved å tilveiebringe peptidlegemet. Peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse oppviser en høy bindingsaffinitet for myostatin og kan inhibere aktiviteten til myostatin som vist både in vitro ved å benytte cellebaserte analyser og i dyr.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nukleinsyremolekyler som omfatter polynukleotider som koder for peptidene, peptidlegemene og peptid- og peptidlegeme varianter og derivater av foreliggende oppfinnelse.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer farmasøytisk akseptable preparater som omfatter et eller flere bindingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse.
Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse inhiberer myostatinaktivitet in vitro og in vivo. Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse øker ren muskelmasse i behandlede dyr og minsker fettmasse som en prosentandel av kroppsvekt i dyret. De myostatinbindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse øker muskelstyrke i behandlede dyremodeller.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for å inhibere myostatinaktivitet i dyr, inkludert mennesker ved å administrere en effektiv dose av et eller flere bindingsmidler til individet. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for å øke ren muskelmasse i dyr, inkludert mennesker ved å administrere en effektiv dose av et eller flere bindingsmidler. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere fremgangsmåter for å behandle myostatin relaterte forstyrrelser ved å administrere en terapeutisk effektiv dose av et eller flere myostatinbindende midler i et farmasøytisk akseptabelt preprat til et individ. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for å behandle muskelsvinnforstyrrelser, inkludert muskulær dystrofi, muskelsvinn som skyldes kreft, AIDS, reumatoid artritt, nyresvikt, uremi, kronisk hjertesvikt, aldersrelatert sarkopeni, forlenget senge-ligge, ryggmargsskade, slag, benbrudd. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for å behandle metabolske forstyrrelser, inkludert overvekt, diabetes, hyperglykemi og benvevstap.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for å øke muskelmasse i kjøttproduksjonsdyr ved å administrere en effektiv dose av et eller flere myostatinbindende midler til dyret.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer analyser som benytter et eller flere myostatinbindende midler for å identifisere og kvantitere myostatin i en prøve. Analysene kan være diagnostiske analyser for å måle eller å overvåke myostatinnivåer i individer med en myostatin relatert forstyrrelse eller sykdom.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser myostatin aktivitet som målt ved uttrykt luciferaseaktivitet (y-akse) mot konsentrasjon (x-akse) for TN8-19-peptidet QGHCTRWPWMCPPY (SEKV. ID. NR. 32) og TN8-19-peptidlegemet (pb) for å bestemme IC50for hvert ved å benytte C2C12-pMARE-luciferaseanalysen beskrevet i eksemplene nedenfor. Peptidlegemet har en lavere IC50-verdi sammenlignet med peptidet. Figur 2 er en graf som viser økningen i total kroppsvekt for CD1 nu/nu-mus behandlet med økende doseringer av lx mTN8-19-21-peptidlegemet over en 14-dagers periode sammenlignet med mus behandlet med en huFc-kontroll, som beskrevet i Eksempel 8. Figur 3A viser økningen i massen til gastrocnemiusmuskel ved en nekropsi av musene behandlet i Figur 2 (Eksempel 8). Figur 3B viser økningen i ren masse som bestemt ved NMR på dag 0 sammenlignet med dag 13 av eksperimentet beskrevet i Eksempel 8. Figur 4 viser økningen i ren kroppsmasse for CD1 nu/nu-mus behandlet med to ganger ukentlig injeksjoner av økende doseringer av lx mTN8-19-32-peptidlegeme som bestemt ved NMR på dag 0 og dag 13 for eksperimentet beskrevet i Eksempel 8. Figur 5A viser økningen i kroppsvekt for CD1 nu/nu-mus behandlet med to ganger ukentlig injeksjoner med 1 x mTN9-19-7 sammenlignet med 2x mTN8-19-7 og kontrolldyrene i 35 dager som beskrevet i Eksempel 8. Figur 5B viser økninger i ren skrottvekt ved nekropsi for lx og 2x versjonene ved 1 mg/kg og 3 mg/kg sammenlignet med dyrene som mottok vehikkelen (huFc) (kontroller). Figur 6A viser økningen i en muskelmasse i forhold til kroppsvekt for aldrende mdx-mus behandlet med enten affinitetsmodne lx mTN8-19-33-peptidlegeme eller huFc-vehikkel ved 10 mg/kg subkutant annenhver dag i tre måneder. Figur 6B viser endringen i fettmasse sammenlignet med kroppsvekt som bestemt ved NMR for de samme musene etter 3 måneders behandling.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer bindingsmidler som er i stand til å binde myostatin og inhibere dens aktivitet. De myostatinbindende midlene kan bli benyttet i analyser for å identifisere, kvantifisere eller overvåke nivåene av myostatin inn i dyr. De myostatinbindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse reduserer myostatinaktivitet. De myostatinbindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse øker ren muskelmasse i dyr, minsker fettmasse som en prosentandel av kroppsvekt og øker muskelstyrke. De myostatinbindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet for å behandle en mengde metabolske forstyrrelser der myostatin spiller en rolle, inkludert muskelsvinn, forstyrrelser slik som muskulære dystrofier, muskelsvinn som skyldes kreft, AIDS, reumatoid artritt, nyresvikt, uremi, kronisk hjertesvikt, forlenget senge-ligge, ryggmargsskade, slag og aldersrelatert sarkopeni i tillegg til andre metabolske forstyrrelser inkludert diabetes, overvekt, hyperglykemi og benvevstap, ved å administrere en terapeutisk dosering av et eller flere bindingsmidler i et farmasøytisk akseptabelt preparat til et individ.
Myostatin
Myostatin, som er en vekstfaktor som også er kjent som GDF-8, er kjent for å være en negativ regulator av skjelettmuskelvev. Myostatin blir syntetisert som et inaktivt prepro-protein som blir aktivert ved hjelp av proteolytisk kløyving (Zimmers et al., ovenfor
(2002)). Forløperproteinet ble kløyvd for å gi et NH2-terminalt, inaktivt predomene og et omtrent 109 aminosyre langt COOH-terminalt protein i formen av en homodimer på omtrent 25 kDa, som er den modne, aktive formen (Zimmers et al, ovenfor (2002)). Det er antatt at den modne dimeren sirkulerer i blodet som et inaktivt, latent kompleks bundet til propeptidet (Zimmers et al., ovenfor (2002).
Som benyttet her refererer uttrykket "fullengde myostatin" til den humane fullengde prepro-proteinsekvensen som beskrevet i McPherron et al. ovenfor (1997), i tillegg til beslektede fullengde polypeptider inkludert allelvarianter og interarthomologer som også er beskrevet i McPherron et al. (1997). Som benyttet her refererer uttrykket "prodomene" eller "propeptid" til det inaktive NH2-terminale proteinet som blir kløyvd av for å frigjøre det aktive COOH-terminale proteinet. Som benyttet her refererer uttrykket "myostatin" eller "modent myostatin" til det modne, biologisk aktive COOH-terminale polypeptidet, i monomer, dimer, multimer form eller annen form. "Myostatin" eller "modent myostatin" referer også til fragmenter av det biologisk aktive modne myostatinet i tillegg til beslektede polypeptider inkludert allele varianter, spleise varianter og fusjonspeptider og polypeptider. Det modne COOH-terminale myostatinproteinet har blitt rapportert å ha 100% sekvensidentitet mellom mange arter inkludert menneske, mus, høns, svin, kalkun og rotte (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)). Myostatin kan, men behøver ikke å inkludere ytterligere terminale residuer slik som målsøkende sekvenser eller metionin- og lysinresiduer og/eller merke- eller fusjonsproteinsekvenser, avhengig av på hvilken måte det blir fremstilt.
Som benyttet her refererer uttrykket "i stand til å binde til myostatin" eller "som har en bindingsaffinitet for myostatin" til et bindingsmiddel eller peptid som binder til myostatin som vist ved hjelp av fag-ELISA-analysen, BIAcore- eller KinExA-analysene beskrevet i eksemplene nedenfor.
Som benyttet her refererer uttrykket "i stand til å modifisere myostatinaktivitet" til virkningen til et middel som enten en agonist eller en antagonist med hensyn til minst en biologisk aktivitet for myostatin. Som benyttet her refererer "agonistaktivitet" eller "hermende aktivitet" til et middel som har biologisk aktivitet som er sammenlignbar med et protein som interagerer med proteinet av interesse, som for eksempel beskrevet i Internasjonal søknad WO 01/83525, innsendt 2. mai 2001, som er inkorporert herved referanse.
Som benyttet her refererer uttrykket "inhiberende myostatinaktivitet" eller "som har antagonistaktivitet" til evnen til et peptid eller bindingsmiddel til å redusere eller blokkere myostatinaktivitet eller signalisering som vist eller in Wtro-analyser slik som for eksempel pMARE C2C12-cellebasert myostatin aktivitetsanalyse eller ved in wVo-dyretesting som beskrevet nedenfor.
Struktur for myostatinbindende midler
I en utførelsesform omfatter bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse minst et myostatinbindende peptid kovalent bundet til minst én vehikkel slik som en polymer eller et Fc-domene. Bindingen av de myostatinbindende peptidene til minst en vehikkel er ment å skulle øke effektiviteten av bindingsmiddelet som et terapeutisk middel ved å øke den biologiske aktiviteten til middelet og/eller minske degraderingen in vivo, øke halveringstiden in vivo, redusere toksisitet eller immunogenisitet in vivo. Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ytterligere omfatte en linkersekvens som binder sammen peptidet og vehikkelen. Peptidet eller peptidene er bundet direkte eller indirekte via en linkersekvens til vehikkelen på N-terminalen, C-terminalen eller en aminosyre sidekjede i peptidet. I denne utførelsesformen har bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse den følgende strukturen:
(X<1>)n-F<1->(X<2>)beller multimerer derav,
der F<1>er en vehikkel, og X<1>og X<2>hver uavhengig er valgt fra
-(LVP<1>; -(LVP1-^2).,-?2; -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3>;
og -(LVPSL2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
derP<1>,P<2>, P<3>og P<4>er peptider som er i stand til å binde myostatin; ogL<1>,L<2>, L3 og L4 hver er linkere, og a, b, c, d, e og f hver uavhengig er 0 eller 1,
gitt at minst en av a og b er 1.
Ethvert peptid som inneholder en cysteinylresidie kan bli kryssbundet med et annet Cys-inneholdende peptid, der begge eller en av disse kan være bundet til en vehikkel. Ethvert peptid som har mer enn en Cys-residie kan danne en intrapeptid-disulfidbinding i tillegg.
I en utførelsesform er vehikkelen et Fc-domene, som definert nedenfor. Denne utførelsesformen blir referert til som et "peptidlegeme". Som benyttet her refererer uttrykket "peptidlegeme" til et molekyl som omfatter et antistoff Fc-domene bundet til minst et peptid. Fremstillingen av peptidlegemer er generelt beskrevet i PCT-publikasjon WO 00/24782, publisert 4. mai 2000, som er inkorporert herved referanse. Eksempler på peptidlegemer er tilveiebrakt som lx- og 2x-konfigurasjoner med en kopi og to kopier av peptidet (koblet i tandem), som beskrevet i eksemplene nedenfor.
Peptider
Som benyttet her refererer uttrykket "peptid" til molekyler på omtrent 5 til omtrent 90 aminosyrer bundet sammen med peptidbindinger. Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis mellom omtrent 5 til omtrent 50 aminosyrer i lengde, mer foretrukket mellom 10 og 30 aminosyrer i lengde, og mest foretrukket mellom omtrent 10 og 25 aminosyrer i lengde, og er i stand til å binde til myostatinproteinet.
Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte en del av en sekvens av naturlig forekommende proteiner, kan være randomiserte sekvenser avledet fra naturlig forekommende proteiner eller kan være kun randomiserte sekvenser. Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er kjent på fagområdet, inkludert kjemisk syntese, fordøying av proteiner eller rekombinant teknologi. Phage-display og RNA-peptidscreening og andre affinitetsscreeningsteknikker er spesielt nyttige for å fremstille peptider som er i stand til å binde myostatin.
Phage-display teknologi er for eksempel beskrevet i Scott et al. Science 249: 386
(1990); Devlin et al., Science 249: 404 (1990); US patentnr. 5 223 409, meddelt 29. juni, 1993; US patentnr. 5 733 731, meddelt 31. mars, 1998; US patentnr. 5 498 530, meddelt 12. mars, 1996; US patentnr. 5 432 018, meddelt 11. juli, 1995; US patentnr. 5 338 665, meddelt, 16. august 1994, US patentnr. 5 922 545, meddelt 13. juli, 1999; WO 96/40987, publisert 19. desember, 1996 og WO 98/15833, publisert 16. april, 1998, der hver av disse er inkorporert herved referanse. Ved å benytte fagbiblioteker blir tilfeldige peptidsekvenser fremvist ved fusjon med kappeproteiner fra filamentøse fag. Typisk blir de fremviste peptidene affinitetseluert enten spesifikt eller ikke-spesifikt mot målmolekylet. De tilbakeholdte fagene kan bli anriket ved hjelp av suksessive runder med affinitetsrensing og repropagering. De beste bindingspeptidene blir valgt for ytterligere analyse, for eksempel ved å benytte fag/ELISA, beskrevet nedenfor, og deretter sekvensert. Eventuelt kan mutagenesebiblioteker bli dannet og screenet for å ytterligere optimalisere sekvensen til de beste binderne (Lowman, Ann Rev Biophys Biomol Struct 26:401-24 (1997)).
Andre fremgangsmåter for å fremstille de myostatinbindende peptidene inkluderer ytterligere affinitetseleksjonsteknikker som er kjent på fagområdet. Et peptidbibliotek kan
bli fusjonert på karboksylterminalen til lac-repressoren og uttrykt i E. coli. En annen E. coli-basert fremgangsmåte tillater fremvisning på cellens ytre membran ved å fusjonere med et peptidoglykanassosiert lipoprotein (PAL). Heretter blir disse og beslektede fremgangsmåter kollektivt referert til som " E. co//'-fremvisning". I en annen fremgangsmåte blir translasjon og tilfeldig RNA stoppet før ribosomfrigjøring, noe som fører til et bibliotek av polypeptider med deres assosiert RNA fremdeles bundet. Heretter blir denne og tilsvarende fremgangsmåter kollektivt referert til som "ribosomfremvisning". Andre fremgangsmåter
benytter kjemisk binding og peptider til RNA. Se for eksempel Roberts og Szostak, Proe Nati. Acad Sei USA, 94: 12297-303 (1997). Heretter blir denne og beslektede fremgangsmåter kollektivt referert til som "RNA-peptidscreening". Tohybrid gjærscreeningsfremgangsmåter kan også bli benyttet for å identifisere peptider ifølge oppfinnelsen som binder til myostatin. I tillegg har kjemisk avledede peptidbiblioteker blitt utviklet der peptider blir immobilisert på stabile, ikke-biologiske materialer slik som polyetylenstaver eller løsningsmiddelpermeable resiner. Et annet kjemisk avledet peptidbibliotek benytter fotolitografi for å skanne peptider som er immobilisert på glass slides. Heretter blir disse og beslektede fremgangsmåter kollektivt referert til som "kjemisk peptidscreening". Kjemisk peptidscreening kan være fordelaktig ved at den tillater anvendelse av D-aminosyrer og andre analoger, i tillegg til ikke-peptid elementer. Både biologiske og kjemiske fremgangsmåter er gjennomgått i Wells og Lowman, Curr Opin Biotechnol 3: 355-62 (1992).
I tillegg kan valgte peptider som er i stand til å binde myostatin bli ytterligere forbedret via anvendelsen av "rasjonell design". I denne tilnærmingen blir trinnvise endringer gjort i en peptidsekvens og effekten av substitusjonen på bindingsaffiniteten eller spesifisiteten til peptidet eller enhver annen egenskap for peptidet blir observert i en hensiktsmessig analyse. Et eksempel på denne teknikken er substitusjon av en enkelt residie på et tidspunkt med alanin, referert til som en "alanin-walk" eller en "alanin-scanning". Når to residier blir erstattet blir det referert til som en "dobbel alanin-walk". Det resulterende peptidet som inneholder aminosyresubstitusjoner blir testet for forbedret aktivitet eller en hvilken som helst annen ytterligere fordelaktig egenskap.
I tillegg kan analyse av strukturen til en protein-protein interaksjon også bli benyttet for å foreslå peptider som hermer interaksjonen til et større protein. I en slik analyse kan krysta I Istruktu ren til et protein peke på identiteten og den relative orienteringen av kritiske residier i proteinet, hvori fra dette kan et peptid bli designet. Se for eksempel Takasaki et al., Nature Biotech 15:1266 (1977). Disse fremgangsmåtene kan også bli benyttet for å undersøke interaksjon mellom et mål-protein og peptider som er valgt ved hjelp av phage-display eller annen affinitetseleksjonsprosess, for derved å peke mot ytterligere modifikasjoner for peptider for å øke bindingsaffinitet og evnen til peptidet til å inhibere aktiviteten til proteinet.
I en utførelsesform blir peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilt som familier av beslektede peptider. Eksempler på peptider er representert ved SEKV. ID. NR. 1 til 132. Disse eksempelpeptidene ble avledet via en seleksjonsprosess der den beste bindere som ble generert via phage-display-teknologi ble ytterligere analysert ved hjelp av fag-ELISA for å oppnå kandidatpeptider ved hjelp av en affinitetseleksjonsteknikk slik som phage-display-teknologi som beskrevet her. Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan likevel bli fremstilt ved hjelp av en rekke andre kjente fremgangsmåter inkludert kjemisk syntese som beskrevet nedenfor.
Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli ytterligere forbedret ved hjelp av prosessen med "affinitetsmåling". Denne prosedyren er rettet mot å øke affiniteten eller aktiviteten til peptidene og peptidlegemene ifølge oppfinnelsen ved å benytte phage-display eller andre seleksjonsteknologier. Basert på en konsensus sekvens kan rettede, sekundære, phage-display-biblioteker for eksempel bli generert av "kjerne" aminosyrer (bestemt fra konsensussekvensen) blir holdt konstante eller blir holdt ensidig i forekomstfrekvens. Alternativt kan en individuell peptidsekvens bli benyttet for å generere et ensidig, rettet phage-display-bibliotek. Panorering av slike biblioteker under mer stringente betingelser kan gi peptider med forbedret binding til myostatin, selektiv binding til myostatin eller med noen annen ytterligere ønskelig egenskap. Likevel kan peptider som har de affinitetsmodnede sekvensene da bli fremstilt ved hjelp av enhver kjent fremgangsmåte, inkludert kjemisk syntese eller rekombinant. Disse peptidene blir benyttet for å fremstille bindingsmidler slik som peptidlegemer av ulike konfigurasjoner som oppviser større inhibitorisk aktivitet i cellebaserte analyser og i in wVo-analyser.
Eksempel 6 nedenfor beskriver affinintetsmodning av "første runde"-peptidene som er beskrevet ovenfor for å fremstille affinitetsmodnende peptider. Eksempler på affinitetsmodnende peptidlegemer er presentert i Tabellene IV og V. De resulterende lx- og 2x-peptidlegemene fremstilt fra disse peptidene ble deretter ytterligerekarakterisertfor bindingsaktivitet, evne til å nøytralisere myostatinaktivitet, spesifisitet ovenfor myostatin i motsetning til andre TNFp-familiemedlemmer og for ytterligere in vitro- og in wVo-aktivitet, som beskrevet nedenfor. Affinitetsmodnede peptider og peptidlegemer er referert til med forstavelsen "m" foran deres familienavn for å skille dem fra første runde peptider av den samme familien.
Eksempler på første runde peptider som er valgt for ytterligere affinitetsmåling i henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderte de følgende peptidene: TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEKV. ID. NR. 33) og de lineære peptidene Lineær-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEKV. ID. NR. 104), Lineær-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEKV. ID. NR. 117), Lineær-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEKV. ID. NR. 119), Lineær-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEKV. ID. NR. 122), Lineær-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEKV. ID. NR. 123), Lineær-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEKV. ID. NR. 126). De affinitetsmålende familiene av hvert av disse er presentert nedenfor i Tabellene IV og V.
Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også varianter og derivater av de valgte peptidene som er i stand til å binde myostatin. Som benyttet her refererer uttrykket "variant" til peptider som har en eller flere aminosyrer innsatt, fjernet eller substituert inn i den originale aminosyresekvensen, og som fremdeles er i stand til å binde til myostatin. Innskudds- og substitusjonsvarianter kan inneholde naturlige aminosyrer i tillegg til ikke-naturlig forekommende aminosyrer. Som benyttet her inkluderer uttrykket "variant" fragmenter av peptidene som fremdeles opprettholder evnen til å binde til myostatin. Som benyttet her refererer uttrykket "derivat" til peptider som har blitt modifisert kjemisk på en eller annen måte som er forskjellig fra innskudds-, delesjons- og substitusjonsvarianter. Varianter og derivater av peptidene og peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet mer inngående nedenfor.
Vehikler
Som benyttet her refererer uttrykket "vehikkel" til et molekyl som kan være bundet til et eller flere peptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis overfører vehiklene minst en ønskelig egenskap på bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse. Peptider alene er utsatt for å bli fjernet in vivo enten via nyrefiltrering, ved hjelp av cellulære oppresningsmekanismer i det retikuloendotele systemet eller ved hjelp av proteolytiske degradering. Kobling til en vehikkel forbedrer den terapeutiske verdien av et bindingsmiddel ved å redusere degradering av bindingsmiddelet og/eller øke halveringstid, reduserer toksisitet, redusere immunogenisitet og/eller øke den biologiske aktiviteten for bindingsmiddelet.
Eksempler på vehikler inkluderer Fc-domener, lineære polymerer slik som polyetylenglykol (PEG), polylysin, dekstran, som en forgrenet kjedepolymer (se for eksempel US patentnr. 4 289 872 tilhørende Denkenwalter et al., meddelt 15. september, 1981, US patentnr. 5 229 490 tilhørende Tam, meddelt 20. juli, 1993; WO 93/21259 fra Frechet et al., publisert 28. oktober 1993), et lipid, en kolesterolgruppe (slik som et steroid), et karbohydrat eller oligosakkarid, eller ethvert naturlig eller syntetisk protein, polypeptid eller peptid som binder til en redningsreseptor.
I en utførelsesform har de myostatinbindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse minst et peptid bundet til minst en vehikkel (F<1>, F<2>) via N-terminalen, C-terminalen eller en sidekjede på en av aminosyreresidiene i peptidet/peptidene. Flere vehikler kan også bli benyttet, slik som et Fc-domene på hver terminal eller et Fc-domene på en terminal og en PEG-gruppe på den andre terminalen eller på en sidekjede.
Et Fc-domene er en foretrukket vehikkel. Som benyttet her omfatter uttrykket "Fc-domene" native Fc- og Fc-variantmolekyler og sekvenser som definert nedenfor. Som benyttet her refererer uttrykket "nativ Fc" til et ikke-antigenbindende fragment av et antistoff eller aminosyresekvensen til det fragmentet som blir fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-tenikker eller ved enzymatisk eller kjemisk kløyving av intakte antistoffer. En foretrukket Fc er en fult human Fc og kan stamme fra enhver av immunoglobulinene, slik som IgGl og IgG2. Likevel er Fc-molekyler som er delvis humane, eller som stammer fra ikke-humane arter også inkludert her. Native Fc-molekyler er sammensatt av monomere polypeptider som kan være bundet sammen til dimere eller multimere former ved hjelp av kovalent (dvs. disulfidbindinger) og ikke-kovalent assosiering. Antallet intermolekylære disulfidbindinger mellom monomere subenheter av native Fc-molekyler strekker seg fra 1 til 4 avhengig av klasse (for eksempel IgG, IgA, IgE) eller subklasser (for eksempel IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Et eksempel på en nativ Fc er en disulfid-bundet dimer som er et resultat av papainfordøying av en IgG (se Ellison et al. (1982), Nucl Acids Res 10: 4071-9). Uttrykket "nativ Fc" som det ble benyttet her er benyttet til å referere til de monomere, dimere og multimere formene.
Som benyttet her refererer uttrykket "Fc-variant" til en modifisert form av en nativ Fc-sekvens gitt at binding til redningsreseptoren blir opprettholdt, som for eksempel beskrevet i WO 97/34631 og WO 96/32478, begge av disse er inkorporert her ved referanse. Fc-varianter kan for eksempel bli konstruert ved å substituere eller fjerne residier, sette inn residier eller trunkere deler som inneholder setet. De innsatte eller substituerte residiene kan også være endrede aminosyrer, slik som peptidhermere eller D-aminosyrer. Fc-varianter kan være foretrukket av flere grunner, da flere av disse er beskrevet nedenfor. Eksempler på Fc-varianter inkluderer molekyler og sekvenser der: 1. Seter som er involvert i disulfidbindingsdannelse blir fjernet. Slik fjerning kan hindre reaksjon med andre cysteininneholdende proteiner som er tilstede i vertscellen som blir benyttet for å fremstille molekylene ifølge oppfinnelsen. For dette formålet kan det cysteininneholdende segmentet på N-terminalen bli trunkert eller cysteinresidier kan bli fjernet eller substituert med andre aminosyrer (for eksempel alanyl, seryl). Selv når cysteinresidier blir fjernet kan enkelkjede-Fc-domenet fremdeles danne et dimert Fc-domene som blir holdt sammen ikke-kovalent. 2. En nativ Fc blir modifisert for å gjøre den mer kompatibel med en valgt vertscelle. For eksempel kan man fjerne PA-sekvensen nær N-terminalen til en typisk nativ Fc som kan bli gjenkjent av et fordøyelsesenzym i E. coli slik som proliniminopeptidase. Man kan også sette på en N-terminal metionylresidie, spesielt når molekylet blir uttrykt rekombinant i en bakteriecelle slik som E. coli. 3. En del av N-terminalen i en nativ Fc blir fjernet for å hindre N-terminal heterogenitet når den blir uttrykt i en valgt vertscelle. For dette formålet kan man fjerne enhver av de første 20 aminosyreresidiene på N-terminalen, spesielt de på posisjoner 1, 2, 3, 4 og 5. 4. Et eller flere glykosyleringsseter blir fjernet. Residier som typisk blir glykosylert (for eksempel asparagin) kan overføre cytolytisk respons. Slike residier kan bli fjernet eller substituert med ikke-glykosylerte residier (for eksempel alanin). 5. Seter involvert i interaksjon med komplement, slik som Clq-bindingssete blir fjernet. For eksempel kan man fjerne eller substituere EKK-sekvensen i human IgGl. Komplementrekruttering er ikke alltid fordelaktig for molekylene ifølge denne oppfinnelsen, og kan slik bli unngått med en slik Fc-variant. 6. Seter som påvirker binding til Fc-reseptorer forskjellig fra en redningsreseptor blir fjernet. En nativ Fc kan inneholde seter for interaksjon med visse hvite blodceller som ikke er nødvendig for fusjonsmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse, og som slik kan bli fjernet. 7. ADCC-setet blir fjernet. ADCC-seter er kjent på fagområdet. Se for eksempel Molec Immunol 29 (5):633-9 (1992) med hensyn til ADCC-seter i IgGl. I tillegg er ikke disse setene nødvendig for fusjonsmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse og kan derfor bli fjernet. 8. Når den native Fc blir avledet fra en ikke-humant antistoff kan den native Fc bli humanisert. For å humanisere en nativ Fc vil man typisk substituere valgte residier i den ikke-humane, native Fc med residier som normalt er funnet i human nativ Fc. Teknikker for antistoff humanisering er velkjente på fagområdet.
Uttrykket "Fc-domene" inkluderer molekyler i monomer eller multimer form, uansett om det er fordøyet fra et helt antistoff eller fremstilt på annen måte. Som benyttet her blir uttrykket "multimer" benyttet på Fc-domener eller molekyler som omfatter Fc-domener refererer til molekyler som har to eller flere polypeptidkjeder assosiert kovalent, ikke-kovalent eller med både kovalente og ikke-kova lente interaksjoner. IgG-molekyler danner typisk dimerer, IgM, pentamerer, IgD, dimerer og IgA, monomerer, dimerer, trimere eller tetramerer. Multimerer kan bli dannet ved å utnytte sekvensen og resulterende aktivitet for den native Ig-kilden til Fc eller ved å derivatisere en slik nativ Fc. Uttrykket "dimer" blir benyttet på Fc-domener eller molekyler som omfatter Fc-domener refererer til molekyler som har to polypeptidkjeder assosiert kovalent eller ikke-kovalent.
I tillegg er en alternativ vehikkel ifølge foreliggende oppfinnelse et ikke-Fc-domeneprotein, polypeptid, peptid, antistoff eller antistoffragment eller lite molekyl (for eksempel en peptidhermende forbindelse) som er i stand til å binde til en redningsreseptor. For eksempel kan man benytte et polypeptid som en vehikkel som beskrevet i US patentnr.
5 739 277, meddelt 14. april, 1998 til Presta et al. Peptider kan også bli valgt ved hjelp av phage-display for binding til FcRn-redningsreseptoren. Slike
redningsreseptorbindingsforbindelser er også inkludert i betydningen av "vehikkel" og ligger innenfor omfanget av denne oppfinnelsen. Slike vehikler bør bli valgt for økt halveringstid (foreksempel ved å unngå sekvenser som blir gjenkjent av proteaser) og minsket immunogenistet (for eksempel ved å favorisere ikke-immunogene sekvenser, som oppdaget i antistoffhumanisering).
I tillegg kan polymervehikkel også bli benyttet for å konstruere bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse. Ulike måter for å koble kjemiske enheter som er nyttige som vehikler er per i dag tilgjengelig, se for eksempel PCT-publikasjon nr. WO 96/11953, med tittelen "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods", som her er inkorporert ved referanse i sin helhet. Denne PCT-publikasjonen tilkjennegir blant andre ting den selektive koblingen av vannløselige polymerer til N-terminalen på proteiner.
En foretrukket polymervehikkel er polyetylenglykol (PEG). PEG-gruppen kan være av enhver hensiktsmessig molekylvekt og kan være lineær eller forgrenet. Den gjennomsnittlige molekylvekten for PEG vil fortrinnsvis ligge i området fra omtrent 2 kDa til omtrent 100 kDa, mer foretrukket fra omtrent 5 kDa til omtrent 50 kDa, mest foretrukket fra omtrent 5 kDa til omtrent 10 kDa. PEG-gruppene vil generelt være bundet til forbindelsen ifølge oppfinnelsen via acylering eller reduktiv alkylering via en reaktiv gruppe på PEG-enheten (for eksempel en aldehyd-, amino-, tiol- eller estergruppe) til en reaktiv gruppe på den oppfinneriske oppfinnelsen (for eksempel en aldehyd-, amino- eller estergruppe). En nyttig strategi for PEGyleringen av syntetiske peptider hvorav kombinering, via dannelse av en konjungatbinding i løsning, av et peptid og en PEG-enhet, der hver bærer en spesiell funksjonalitet som er gjensidig reaktive mot hverandre. Peptidene kan med letthet bli fremstilt ved hjelp av konvensjonell fastfase syntese som kjent på fagområdet. Peptidene blir "preaktivert" med en hensiktsmessig funksjonell gruppe på et spesifikt sete. Forløperne blir renset og fulltkarakterisertfør de blir reagert med PEG-enheten. Ligering av peptidet med PEG foregår vanligvis i vannfase og kan med letthet bli overvåket ved hjelp av reversfase analytisk HPLC. De PEGylerte peptidene kan med letthet bli renset ved hjelp av preparativ HPLC ogkarakterisert vedanalytisk HPLC, aminosyreanalyse og laserdesorpsjonsmassespektrometri.
Polysakkarid polymerer er en annen type av vannløslige polymerer som kan bli benyttet til proteinmodifisering. Dekstraner er polysakkarid polymerer som er sammensatt av individuelle subenheter av glukose i hovedsak bundet sammen ved hjelp av al-6-bindinger. Dekstran i seg selv er tilgjengelig i mange molekylvekts områder og er lett tilgjengelig i molekylvekter fra omtrent 1 kDa til omtrent 70 kDa. Dekstran er en hensiktsmessig, vannløselig polymer til anvendelse i foreliggende oppfinnelse som en vehikkel i seg selv eller i kombinasjon med andre vehikler (for eksempel Fc). Se for eksempel WO 96/11953 og WO 96/05309. Anvendelsen av dekstran konjugert til terapeutiske eller diagnostiske immunoglobuliner har blitt rapportert, se for eksempel europeisk patentpublikasjon nr. 0 315 456, som herved er inkorporert ved referanse. Dekstran på omtrent 1 kDa til omtrent 20 kDa er foretrukket når dekstran blir benyttet som en vehikkel i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse.
Linke re
Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt ytterligere omfatte en "linker"-gruppe. Linkere virker primært som et mellomstykke mellom et peptid og en vehikkel eller mellom to peptider av bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse. I en utførelsesform er linkeren sammensatt av aminosyrer som er bundet sammen ved hjelp av peptidbindinger, fortrinnsvis fra 1 til 20 aminosyrer bundet ved hjelp av peptidbindinger, der aminosyrene er valgt fra de 20 naturlig forekommende aminosyrene. En eller flere av disse aminosyrene kan være glykosylert, slik som det er forstått av fagfolk på området. I en utførelsesform er de 1 til 20 aminosyrene valgt fra glysin, alanin, prolin, asparagin, glutamin og lysin. Fortrinnsvis er en linker sammensatt av en hovedmengde av aminosyrer som er sterisk uhindret, slik som glysin og alanin. Eksempler på linkere er dermed polygylsiner (spesielt (Gly)5, (Gly)8), poly(Gly-Ala) og polyalaniner. Som benyttet her refererer betegnelsen " g" til en glysinhomopeptid liker. Som vist i Tabell II refererer "gn" til en 5x gly-linker på N-terminalen, mens " gc" refererer til 5x gly-linker på C-terminalen. Kombinasjoner av Gly og Ala er også foretrukket. Et eksempel på en linkersekvens som er nyttig for å fremstille bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse er den følgende: gsgsatggsgstassgsgsatg (Sekv. Id. Nr. 305). Denne linkersekvensen blir referert til som "k" eller lk-sekvensen. Betegnelsen "kc", som funnet i Tabell II, refererer til k-linkeren på C-terminalen, mens betegnelsen "kn" refererer til k-linkeren på N-terminalen.
Linkeren ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være ikke-peptid linkere. For eksempel kan alkyl-linkere slik som -NH-(CH2)s-C(0)-, der s = 2-20 bli benyttet. Disse alkyl-linkerne kan ytterligere være substituert med en ikke-sterisk hindrende gruppe slik som lavere alkyl (for eksempel Ci-C6) lavere acyl, halogen (for eksempel Cl, Br), CN, NH2, fenyl osv. Et eksempel på en ikke-peptidlinker er en PEG-linker, og som har en molekylvekt på 100 til 5000 kDa, fortrinnsvis 100 til 500 kDa. Peptidlinkerne kan bli endret til å danne derivater på samme måte som ovenfor.
Eksempler på bindingsmidler
Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter minst et peptid som er i stand til å binde myostatin. I en utførelsesform er det myostatinbindende peptidet mellom omtrent 5 og omtrent 50 aminosyrer i lengde, i en annen, mellom omtrent 10 og 30 aminosyrer i lengde og i en annen, mellom omtrent 10 og 25 aminosyrer i lengde. I en utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet aminosyresekvensen WMCPP (SEKV. ID. NR. 633). I en annen utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet aminosyresekvensen Caia2Wa3WMCPP (SEKV. ID. NR. 352) der ai, a2og a3er valgt fra en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre. I en annen utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet aminosyresekvensen Cbib2Wb3WMCPP (SEKV. ID. NR. 353), der bi er valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R, b2er valgt fra enhver av R, S, Q, b3er valgt fra enhver av P, R og Q, og der peptidet er mellom 10 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav.
I en annen utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet formelen:
CiC2c3c4C5C6Cc7C8Wc9WMCPPcioCiiCi2Ci3(SEKV. ID. NR. 354), der:
Cier fraværende eller enhver aminosyre;
c2er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c3er fraværende en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c4er fraværende eller enhver aminosyre;
c5er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c6er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c7er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c8er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c9er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; og
Cio-Ci3er enhver aminosyre; og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer langt, og fysiologisk akseptable salter derav.
I en beslektet utførelsesform omfatter det myostatinbindende peptidet formelen:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WJ<v>iCPPd1od11d12d13(SEKV. ID. NR. 355), der:
di er fraværende eller enhver aminosyre;
d2er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d3er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d4er fraværende eller enhver aminosyre;
d5er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d6er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
d7er valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R;
d8er valgt fra enhver av R, S, Q;
d9er valgt fra enhver av P, R og Q; og
di0-di3er valgt fra enhver aminosyre,
og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav.
Ytterligere utførelsesformer av bindingsmidler omfatter minst et av de følgende peptidene: (1) et peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen WYeie2Ye3G (SEKV. ID. NR. 356)
der ei er P, S eller Y,
e2er C eller Q, og
e3er G eller H, der peptidet er mellom 7 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav; (2) et peptid som er i stand til å binde myostatin der peptidet omfatter sekvensen fi EMLf, SLf^LL (SEKV. ID. NR. 455),
der fi er M eller I,
f2er enhver aminosyre,
f3er L eller F,
f4er E, Q eller D,
og der peptidet er mellom 7 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav,
(3) et peptid som er i stand til å binde myostatin der peptidet omfatter sekvensen L<g>ig2LLg3g4L (SEKV. ID. Nr. 456), der
gi er Q, D eller E,
g2er S, Q, D eller E,
g3er enhver aminosyre,
g4er L, W, F eller Y, og der peptidet er mellom 8 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav;
(4) et peptid som er i stand til å binde myostatin der peptidet omfatter sekvensen hih2h3h4h5h6h7h8h9(SEKV. ID. NR. 457), der
hi er R og D,
h2er enhver aminosyre,
h3er A, T, S eller Q,
h4er L eller M,
h5er L eller S,
h6er enhver aminosyre,
h7er F eller E,
h8 er W, F eller C,
h9er L, F, M eller K, og der peptidet er mellom 9 og 50 aminosyrer i lengde, og fysiologisk akseptable salter derav.
I en utførelsesform omfatter bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse ytterligere minst en vehikkel slik som en polymer eller et Fc-domene, og kan ytterligere omfatte minst en linkersekvens. I denne utførelsesformen blir bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse konstruert slik at minst et myostatinbindende peptid er kovalent bundet til minst en vehikkel. Peptidet eller peptidene er bundet direkte eller indirekte via en linkersekvens til vesikkelen på N-terminalen, C-terminalen eller en aminosyre sidekjede på peptidet. I denne utførelsesformen har bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse den følgende generaliserte strukturen: (X<1>)a-F<1->(X<2>)beller multimerer derav;
der Fi er en vehikkel, og X<1>og X<2>hver uavhengig er valgt fra
-(LVP<1>; -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2>; -(L<1>)c-P<1->(L<2>)d-P<2->(L<3>)e-P<3>;
og -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
derP<1>,P<2>, P<3>og P<4>er peptider som er i stand til å binde myostatin; ogL<1>,L<2>, L<3>og L4 hver er linkere, og a, b, c, d, e og f hver uavhengig er 0 eller 1,
gitt at minst en av a og b er 1.
I en utførelsesform av bindingsmidlene som har denne generaliserte strukturen kan peptidene P<1>, P<2>, P3 og P<4>bli valgt fra et eller flere av ethvert av peptidene som omfatter sekvensene som er tilveiebrakt ovenfor. Peptidene P<1>, P<2>, P<3>og P<4>kan bli valgt fra et eller flere peptider som omfatter enhver av de følgende sekvensene: SEKV. ID. NR. 633, SEKV. ID. NR. 352, SEKV. ID. NR. 353, SEKV. ID. NR. 354, SEKV. ID. NR. 355, SEKV. ID. NR. 356, SEKV. ID. NR. 455, SEKV. ID. NR. 456 eller SEKV. ID. NR. 457.
I en ytterligere utførelsesform er vehiklene til bindingsmiddelet som har den generelle formelen ovenfor Fc-domener. Peptidene blir derfor fusjonert til et Fc-domene, enten direkte eller indirekte, for derved å tilveiebringe peptidlegemet. Peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse oppviser en høy bindingsaffinitet for myostatin og kan inhibere aktiviteten til myostatin som vist ved in wtro-analyser og in wVo-testing i dyr som er tilveiebrakt her.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nukleinsyremolekyler som omfatter polynukleotider som koder for peptidene, peptidlegemene og peptid- og peptidlegemevarianter og derivater av foreliggende oppfinnelse. Eksempler på nukleotidsekvenser er gitt nedenfor.
Varianter og derivater av peptider og peptidlegemer
Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også varianter og derivater av peptidene og peptidlegemene som er beskrevet her. Siden både peptidene og peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli beskrevet i kraft av deres aminosyresekvens, kan uttrykkene "varianter" og "derivater" bli sagt å gjelde et peptid alene eller et peptid som en komponent av et peptidlegeme. Som benyttet her refererer uttrykket "peptidvarianter" til peptider eller peptidlegemer som har en eller flere aminosyreresidier innsatt, deletert eller substituert inn i den opprinnelige aminosyresekvensen og som opprettholder evnen til å binde til myostatin og modifisere dens aktivitet. Som benyttet her er fragmenter av peptidene eller peptidlegemene inkludert innenfor definisjonen av "varianter".
Det skal forstås slik at ethvert gitt peptid eller peptidlegeme kan inneholde en eller to eller alle tre typer av varianter. Innskuddsvarianter og substitusjonsvarianter kan inneholde naturlige aminosyrer i tillegg til ikke-naturlig forekommende aminosyre eller begge.
Peptidvarianter og peptidlegemevarianter inkluderer også modne peptider og peptidlegemer der leder- eller signalsekvenser er fjernet, og der de resulterende proteinene har ytterligere aminoterminale residier, der disse aminosyrene kan være naturlige eller ikke-naturlige. Peptidlegemer med en ytterligere metionylresidie på aminosyreposisjon -1 (Met^-peptidlegeme) er omfattet, og det er også peptidlegemet med ytterligere metionin-og lysinresidier på posisjonene -2 og -1 (Met"<2->Lys-<1->). Varianter som har ytterligere Met-, Met-Lys-, Lys-residier (eller en eller flere basiske residier generelt) er spesielt nyttige for forbedret rekombinant proteinproduksjon i bakterie vertsceller.
Peptid- eller peptidlegemevarianter ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer også peptider som har ytterligere aminosyreresidier som fremkommer ved anvendelsen av spesifikke uttrykkingssystemer. For eksempel tilveiebringer anvendelse av kommersielt tilgjengelige vektorer som uttrykker et ønsket polypeptid som en del av glutation-S-transferase (GST)-fusjonsprodukt det ønskede polypeptidet som har en ytterligere glysinresidie på aminosyreposisjon -1 etter kløving av GST-komponenten fra det ønskede polypeptidet. Varianter som fremkommer fra uttrykking i andre vektorsystemer er også omfattet, inkludert de der histidinmerker blir inkorporert i aminosyresekvensen, generelt på karboksyterminalen og/eller aminoterminalen på sekvensen.
I et eksempel blir innskuddsvarianter tilveiebrakt der en eller flere aminosyreresidier, enten naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende aminosyrer, blir påsatt på en peptidaminosyresekvens. Innskudd kan være lokalisert på enhver av eller begge endene til proteinet, eller kan være posisjonert i interne regioner av peptidlegemet aminosyresekvensen. Innskuddsvarianter med ytterligere reisidier på enhver av eller begge ender kan inkludere for eksempel fusjonsproteiner og proteiner inkludert aminosyremerker. Innskuddsvarianter inkluderer peptider der en eller flere aminosyreresidier blir påsatt på peptidaminosyresekvensen eller et fragment derav.
Innskuddsvarianter inkluderer også fusjonsproteiner der amino- og/eller karboksyterminaler på peptidet eller peptidlegemet blir fusjonert med et annet polypeptid, et fragment derav eller aminosyrer som ikke generelt er ansett for å være en del av noen spesifikk proteinsekvens. Eksempler på slike fusjonsproteiner er immunogene polypeptider, proteiner med lang sirkulerende halveringstid, slik som immunoglobulin konstantregioner, markørproteiner, proteiner eller polypeptider som fremmer rensingen av det ønskede peptidet eller peptidlegemet, og peptidsekvenser som fremmer dannelsen av multimere proteiner (slik som leucin-zipper motiver som er nyttige i dimerdannelse/stabilitet).
Denne typen av innskuddsvariant har generelt hele eller en vesentlig del av det native molekylet bundet på N- eller C-terminalen til hele eller en del av et annet polypeptid. For eksempel benytter fusjonsproteiner typisk ledersekvenser fra andre arter for å tillate den rekombinante uttrykkingen av et protein i en heterolog vert. Et annet nyttig fusjonsprotein inkluderer påsettingen av et immunologisk aktivt domene, slik som en antistoff epitop, for å fremme rensingen av fusjonsproteinet. Inkludering av et kløyvingssete på eller nær fusjonsovergangen vil fremme fjerning av det fremmede polypeptidet etter rensing. Andre nyttige fusjoner inkluderer kobling av funksjonelle domener, slik som aktive seter fra enzymer, glykosyleringsdomener, cellulære målsignaler eller transmembranregioner.
Det finnes ulike kommersielt tilgjengelige fusjonsproteinuttrykkingssystemer som kan bli benyttet i foreliggende oppfinnelse. Spesielt nyttige systemer inkluderer, men er ikke begrenset til, glutaion-S-transferase (GST)-systemet (Pharmacia), maltose bindingsproteinsystemet (NEB, Beverley, MA), FLAG-systemet (IBI, New Haven, CT) og 6xHis-systemet (Qiagen, Chatsworth, CA). Disse systemene er i stand til å produsere rekombinante peptider og/eller peptidlegemer som kun inneholder et lite antall ytterligere aminosyrer, som det er usannsynlig vil vesentlig vil påvirke aktiviteten til peptidet eller peptidlegemet. For eksempel setter både FLAG-systemet og 6xHis-systemet kun på korte sekvenser, der begge av disse er kjent for å være dårlig antigene og som ikke skadelig påvirker foldig av et polypeptid til sin native konformasjon. En annen N-terminal fusjon som er ansett for å være nyttig er fusjon av et Met-Lys-dipeptid på den N-terminale regionen på proteinet eller peptidene. En slik fusjon kan gi fordelaktige økninger i proteinuttrykking eller aktivitet.
Andre fusjonssystemer gir polypeptid hybrider der det er ønskelig å fjerne fusjonspartneren fra det ønskede peptidet eller peptidlegemet. I en utførelsesform blir fusjonspartneren bundet til det rekombinante peptidlegemet ved hjelp av en peptidsekvens som inneholder en spesifikk gjenkjenningssekvens for en protease. Eksempler på passende sekvenser er de som blir gjenkjent av Tobacco-Etch-Virus-proteasen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) eller Faktor Xa (New England Biolabs, Beverly, MA).
Oppfinnelsen tilveiebringer også fusjonspolypeptider som omfatter hele eller en del av et peptid eller peptidlegemet ifølge foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med trunkert vevsfaktor (tTF). tTF er et vaskulært målmiddel som består av en trunkert form av et humant koaguleringsinduserende protein som virker som et tumorblodkar koaguleringsmiddel som beskrevet i US patentnr. 5 877 289, 6 004 555, 6 132 729, 6 132 730, 6 156 321 og europeisk patentnr. EP 0988056. Fusjonen av tTF til anti-myostatin peptidlegemet eller -peptidet, eller fragmenter derav fremmer leveringen av anti-myostatin antagonister til målceller, for eksempel skjellettmuskelceller, hjertemuskelceller, fibroblaster, pre-adipocytter og muligens adipocytter.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen delesjonsvarianter der en eller flere aminosyreresidier i et peptid eller peptidlegeme blir fjernet. Delesjoner kan bli utført på en eller begge endene av peptidlegemet, eller ved fjerning av en eller flere residier inn i peptidlegemet aminosyresekvensen. Delesjonsvarianter inkluderer nødvendigvis alle fragmenter av et peptid eller peptidlegeme.
I nok et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen substitusjonsvarianter av peptider og peptidlegemer ifølge oppfinnelsen. Substitusjonsvarianter inkluderer de peptidene og peptidlegemene der en eller flere aminosyreresidier blir fjernet og erstattet med en eller flere alternative aminosyrer, der aminosyrene kan være naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende. Substitusjonsvarianter gir peptider eller peptidlegemer som er "lignende" med det opprinnelige peptidet eller peptidlegemet, ved at de to molekylene har en viss prosentandel av aminosyrer som er identiske. Substitusjonsvarianter inkluderer substitusjoner av 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 og 20 aminosyrer inne i et peptid eller peptidlegeme, der antallet substitusjoner kan være opptil 10% av aminosyrene til peptidet eller peptidlegemet. I et aspekt er substitusjonene konservative av natur, men oppfinnelsen omfatter likevel substitusjoner som er ikke-konservative og inkluderer også ukonvensjonelle aminosyrer.
Identitet og similaritet for beslektede peptider og peptidlegemer kan med letthet bli beregnet ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Slike fremgangsmåter inkluderer, men er
ikke begrenset til, de som er beskrevet i Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., red., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., red., Academic Press, New York (1993); Computer ANalysis of Sequence Data, Del 1, Griffin, A.M. og Griffin, H.G., red., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis
Primer, Gribskov, M. og Devereux, J., red., M. Stockton Press, New York (1991); og Carillo et al., SIAM J. Applied Matn., 48:10073 (1988).
Foretrukne fremgangsmåter for å bestemme slektskapet eller prosentvis identitet for to peptider eller polypeptider, eller et polypeptid og et peptid, er designet for å gi den største likheten mellom sekvensene som ble testet. Fremgangsmåte for å bestemme identitet er beskrevet i allment tilgjengelige dataprogrammer. Foretrukne dataprogram fremgangsmåter for å bestemme identitet mellom to sekvenser inkluderer, men er ikke begrenset til, GCG-programvarepakken, inkludert GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN og FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). BLASTX-programmet er allment tilgjengelig fra National Center of Biotechnology Information (NCBI) og fra andre kilder (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., ovenfor (1990)). Den velkjente Smith-Waterman algoritmen kan også bli benyttet for å bestemme identitet.
Visse sammenligningsskjemaer for å sammenligne to aminosyresekvenser kan føre til matchingen av kun en kort region av de to sekvensene, og denne lille sammenlignede region kan ha svært høy sekvensidentitet selv om det ikke er noe signifikant slektskap mellom de to fullengdesekvensene. I visse utførelsesformer vil den valgte sammenligningsfremgangsmåten tilsvarende resultere i en sammenligning som spenner over minst 10% av den fullstendige lengden til mål-polypeptidet som blir sammenlignet, dvs. minst 40 påfølgende aminosyrer der sekvenser på minst 400 aminosyrer blir sammenlignet, 30 påfølgende aminosyrer der sekvenser på minst 300 til omtrent 400 aminosyrer blir sammenlignet, minst 20 påfølgende aminosyrer der sekvenser på 200 til omtrent 300 aminosyrer blir sammenlignet og minst 10 påfølgende aminosyrer der sekvenser på omtrent 100 til 200 aminosyrer blir sammenlignet. For eksempel å benytte dataalgoritmen GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) blir to polypeptider for hvilke den prosentvise sekvensidentiteten skal bli bestemt, sammenlignet for optimal matching av deres respektive aminosyrer (det "matchede strekket", som bestemt ved algoritmen). I visse utførelsesformer blir en bruddåpningsstraff (som typisk blir beregnet som 3X den gjennomsnittlige diagonalen, den "gjennomsnittlige diagonal" er gjennomsnittet av diagonalen av sammenligningsmatriksen som blir benyttet, "diagonalen" er verdien eller nummeret som er tilordnet hver perfekte aminosyrematch av den spesielle sammenligningsmatriksen) og en bruddforlengningsstraff (som vanligvis er 1/10 av bruddåpningsstraffen), i tillegg til en sammenligningsmatriks slik som PAM 250 eller BLOSUM 62 benyttet sammen med algoritmen. I visse utførelsesformer blir en standard sammenligningsmatriks (se Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)
(1978) for PAM 250 sammenligningsmatriksen; Henikoff et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA, 89:10915-10919 (1992) for BLOSUM 62-sammenligningsmatriksen) også benyttet av algoritmen.
I visse utførelsesformer kan for eksempel parameterne for en polypeptidsekvenssammenligning bli gjort med det følgende: Algoritme: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); Sammenligningsmatriks: BLOSUM 62 fra Henikoff et al., ovenfor (1992); Bruddstraff: 12; Bruddlengdestraff: 4; Grense for similaritet: 0, sammen med ingen straff for endeåpninger.
I visse utførelsesformer kan parameterne for polynukleotid molekylsekvens (i motsetning til en aminosyresekvens)-sammenligninger bli gjort med de følgende: Algoritme: Needleman et al., ovenfor (1970); Sammenligningsmatriks: match = +10, ikke-match = 0; Bruddstraff: 50: Bruddlengdestraff: 3.
Andre eksempler på algoritmer, bruddåpningsstraffer, bruddforlengningsstraffer, sammenligningsmatriser, grenser for similaritet osv., kan bli benyttet inkludert de som er frembrakt i Program manualen, Wisconsin Package, versjon 9, september 1997. Valget som må bli gjort vil være åpenbart for fagfolk på området og vil være avhengig av den spesifikke sammenligningen som skal bli gjort, slik som DNA til DNA, protein til protein, protein til DNA, og ytterligere, hvorvidt sammenligning er mellom gitte par av sekvenser (i hvilke tilfelle GAP eller BestFit generelt er foretrukket) eller mellom en sekvens og en stor database av sekvenser (i hvilket tilfelle FASTA eller BLASTA er foretrukket).
Stereoisomerer (for eksempel D-aminosyre) av de 20 konvensjonelle (naturlig forekommende) aminosyrene, ikke-naturlig forekommende aminosyrer slik som a-, a-disubstituerte aminosyrer, N-alkylaminosyrer, melkesyre og andre ukonvensjonelle aminosyrer kan også være hensiktsmessige komponenter for peptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ikke-naturlig forekommende aminosyrer inkluderer for eksempel: aminadipinsyre, p-alanin, p-aminpropionsyre, aminsmørsyre, piperidinsyre, aminokapronsyre, aminoheptansyre, aminoisosmørsyre, aminopimelinsyre, diaminosmørsyre, desmosin, diaminopimelinsyre, diaminopropionsyre, N-etylglycin, N-etylasparagin, hydroksylysin, allO-hydroksylysin, hydroksyprolin, isodesmosin, allo-isoleucin, N-metylglysin, sarkosin, N-metylisoleucin, N-metylvalin, norvalin, norleucin, oritin, 4-hydroksyprolin, y-karboksyglutamat, e-N,N,N-trimetyllysin, e-N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, N-formylmetionin, 3-metylhistidin, 5-hydroksylysin, a-N-metylarginin og andre tilsvarende aminosyrer og aminosyrer (for eksempel 4-hydroksyprolin).
Naturlig forekommende residier kan bli oppdelt i (overlappende) klasser basert på gjensidige sidekjede egenskaper: 1) nøytral hydrofob: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Met, Phe; 2) nøytral polar: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin, Tyr, Gly; 3) sur: Asp, Glu; 4) basisk: His, Lys, Arg;
5) residier som påvirker kjedeorientering: Gly, Pro; og
6) aromatisk: Trp, Tyr, Phe.
Substitusjoner av aminosyrer kan være konservative, noe som fører til peptider som har funksjonelle og kjemiske karakteristika som er tilsvarende til de for det opprinnelige peptidet. Konservative aminosyresubstitusjoner involverer å bytte ut et medlem av en av de ovenfor nevnte klassene med et annet medlem av den samme klassen. Konservative endringer kan omfatte en konvensjonell aminosyreresidie, som typisk ble inkorporert ved hjelp av kjemisk peptidsyntese heller enn ved syntese i biologiske systemer. Disse inkluderer peptidhermere og andre reverserte eller inverterte former av aminosyreenheter.
Ikke-konservative substitusjoner kan involvere utbyttingen av et medlem av en av disse klassene med et medlem fra en annen klasse. Disse endringene kan føre ti len vesentlig modifisering i de funksjonelle og/eller kjemiske karakteristika for peptidene. I utførelsen av slike endringer, ifølge visse utførelsesformer, kan den hydropatiske indeksen til aminosyrer bli overveid. Hver aminosyre har blitt tilordnet en hydropatisk indeks på basis av sin hydrofobisitet og ladningskarakteristika. Disse er: isoleucin (+4,5); valin (+4,2), leucin (+3,8), fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glysin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrosin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lysin (-3,9) og arginin (-4,5).
Viktigheten av den hydropatiske aminosyreindeksen i overføringen av interaktiv biologisk funksjon på et protein er forstått på fagområdet. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Det er kjent at visse aminosyrer kan bli substituert for andre aminosyrer som har en lignende hydropatisk indeks eller verdi og fremdeles opprettholde en lignende biologisk aktivitet. I utførelsen av endringen basert på den hydropatiske indeksen, i visse utførelsesformat, er substitusjon av aminosyrer hvis hydropatiske indekser ligger innenfor + 2 inkludert. I visse utførelsesformer er de som ligger innenfor + 1 inkludert, og i visse utførelsesformer er de innenfor +_ 0,5 inkludert.
Det er også anerkjent på fagområdet at substitusjonen av like aminosyrer kan bli gjort effektiv på basis av hydrofilisitet, spesielt der det biologisk funksjonelle peptidlegemet eller peptidet som derved blir dannet er ment for anvendelse i immunologiske utførelsesformer, som i foreliggende tilfelle. I visse utførelsesformer korrelerer den største lokale gjennomsnittlige hydrofilisitet for en protein, som bestemt av hydrofilisiteten til sine tilhørende aminosyrer, med dets immunogenisitet og antigenisitet, dvs. med en biologisk egenskap for proteinet.
De følgende hydrofilisitetsverdiene har blitt tilordnet til disse aminosyreresidiene: arginin (+3,0); lysin (+3,0); aspartat (+3,0 + 1); glutamat (+3,0 +_ 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glysin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 +_ 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); isoleucin (-1,8); tyrosin (-2,3); fenylalanin (-2,5) og tryptofan (-3,4). Ved utførelsen av endringer basert på lignende hydrofilisitetsverdier, i visse utførelsesformer, er substitusjon av aminosyrer hvis hydrofilisitetsverdier ligger innenfor + 2 inkludert, i visse utførelsesformer, er de som ligger innenfor + 1 inkludert, og i visse utførelsesformer er de innenfor +_ 0,5 inkludert. Man kan også identifisere epitoper fra primære aminosyresekvenser på basis av hydrofilisitet. Disse regionene blir også referert til som "epitop kjerneregioner".
Eksempler på aminosyresubstitusjoner er fremlagt i Tabell 1 nedenfor.
En fagperson på området vil også være i stand til å fremstille varianter av peptidene og peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse ved for eksempel hjelp av tilfeldig substitusjon, og teste det resulterende peptidet eller peptidlegeme for bindingsaktivitet ved å benytte analysene som er beskrevet her.
I tillegg kan en fagperson på området gjennomgå strukturfunksjonsundersøkelser eller tredimensjonale strukturanalyser for å identifisere residier i lignende polypeptider som er viktige for aktivitet eller struktur. I lys av en slik sammenligning kan man forutse viktigheten av aminosyreresidier i et protein som tilsvarerer til aminosyreresidier som er viktige for aktivitet eller struktur i lignende proteiner. En fagperson på området kan velge kjemisk lignende aminosyresubstitusjoner for slike forutsette, viktige aminosyreresidier. Variantene kan deretter bli screenet ved å benytte aktivitetsanalyser som beskrevet her.
Et antall vitenskapspublikasjoner har blitt viet til prediksjonen av sekundær struktur. Se Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Ad. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148 (1978). I tillegg er dataprogrammer per i dag tilgjengelige for å assistere ved prediksjon av sekundær struktur. En fremgangsmåte for å forutse sekundær struktur er basert på homologimodellering. For eksempel har to polypeptider eller proteiner som har en sekvensidentitet som er større enn 30%, eller similariteten er større enn 40% ofte like strukturelle topologier. Den senere veksten av proteinstruktur databasen (PDB) har tilveiebrakt en forbedret evne til å forutsi sekundær struktur, inkludert det potensielle antall av foldinger i en proteinstruktur. Se Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(l):244-247 (1999). Det har blitt foreslått (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol. 7(3):369-376 (1997)) at det eksisterer et begrenset antall med foldinger i et gitt protein og at med en gang et kritisk antall strukturer har blitt løst, så vil strukturell forutsiing bli dramatisk mer nøyaktig.
Ytterligere fremgangsmåter for å forutsi sekundær struktur inkluderer "tredning"
(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19
(1996)), "profilanalyse" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proe. Nat. Acad. Sei., 84(13):4355-4358
(1987) og "evolusjonær kobling" (se Holm, ovenfor (1999) og Brenner, ovenfor (1997)).
I visse utførelsesformer inkluderer peptid- eller peptidlegeme varianter glykosyleringsvarianter der et eller flere glykosyleringsseter slik som et N-bundet glykosyleringssete har blitt tilsatt på peptidlegemet. Et N-bundet glykosyleringssete erkarakterisert vedsekvensen: Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr, der aminosyreresidien som er betegnet X kan være enhver aminosyreresidie bortsett fra prolin. Substitusjon eller addisjon av aminosyreresidier for å danne denne sekvensen tilveiebringer et potensielt nytt sete for påsetningen av en N-bundet karbohydratkjede. Alternativt vil substitusjoner som eliminerer denne sekvensen fjerne en eksisterende N-bundet karbohydratkjede. Også tilveiebrakt er en rearrangering av N-bundne karbohydratkjeder der ett eller flere N-bundne glykosyleringsseter (typisk de som er naturlig forekommende) blir eliminert og et eller flere nye N-bundne seter blir dannet.
Oppfinnelsen tilveiebringer også "derivater" av peptidene eller peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse. Som benyttet her refererer uttrykket "derivat" til modifikasjoner som er forskjellig fra, eller i tillegg til, innskudd, delesjoner eller substitusjoner av aminosyreresidier som opprettholder evnen til å binde til myostatin.
Foretrukket er modifikasjonene som ble gjort på peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse for å fremskaffe derivater av kovalent natur, og inkluderer for eksempel kjemisk binding med polymerer, lipider, andre organiske og uorganiske enheter. Derivater ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt for å øke sirkulerende halveringstid for et peptidlegeme, eller kan bli fremstilt for å forbedre målsøkende kapasitet for peptidlegemet mot ønskede celler, vev eller organer.
Oppfinnelsen omfatter videre derivatbindende midler som er kovalent modifisert for å inkludere en eller flere vannløslige polymerkoblinger, slik som polyetylenglykol, polyoksyetylenglykol eller polypropylenglykol, som beskrevet i US patentnr. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144, 4 670 417, 4 791 192 og 4 179 337. Flere andre nyttige polymerer som er kjent på fagområdet inkluderer monometoksypolyetylenglykol, dekstran, cellulose eller andre karbohydratbaserte polymerer, poly-(N-vinylpyrrolidon)-polyetylenglykol, propylenglykolhomopolymerer, en polypropylenoksid/etylenoksid kopolymer, polyoksyetylerte polyoler (for eksempel glyserol) og polyvinylalkohol, i tillegg til blandinger av disse polymerene. Spesielt foretrukket er peptidlegemer som er kovalent modifiserte med polyetylenglykol (PEG)-subenheter. Vannløslige polymerer kan være bundet på spesifikke posisjoner, for eksempel på aminoterminalen til peptidlegemene, eller tilfeldig bundet til en eller flere peptidkjeder på polypeptidet. Anvendelsen av PEG for å forbedre den terapeutiske kapasiteten for bindingsmidler, for eksempel peptidlegemer, og for humaniserte antistoffer spesielt, er beskrevet i US patentnr. 6 133 426 til Gonzales et al., meddelt 17. oktober, 2000.
Oppfinnelsen omfatter også derivatisering av peptidet og/eller vehikkeldelen av de myostatinbindende midlene. Slike derivater kan forbedre løselighet, absorpsjon, biologisk halveringstid og lignende for forbindelsene. Enhetene kan alternativt eliminere eller avslutte enhver uønsket bivirkning av forbindelsene og lignende. Eksempler på derivater inkluderer forbindelser der: 1. Derivatet eller en del derav er syklisk. For eksempel kan peptiddelen være modifisert slik at den inneholder to eller flere Cys-residier (for eksempel i linkeren), som kan bli syklisk ved hjelp av disulfidbindingsdannelse. 2. Derivatet er kryssbundet eller gjort i stand til å kryssbinde mellom molekyler. For eksempel kan peptiddelen bli modifisert slik at den inneholder en Cys-residie og derved være i stand til å danne en intermolekylær disulfidbinding med et likt molekyl. Derivatet kan også bli kryssbundet via dets C-terminale ende. 3. En eller flere peptidyl [-C(0)NR-]-bindinger blir erstattet med en ikke-peptidylbinding. Eksempler på ikke-peptidylbindinger er -CH2-karbamat [-CH2-OC(0)NR-], fosfonat, -CH2-sulfonamid [-CH2-S(0)2NR-], urea [-NHC(0)NH-], -CH2-sekundært amin og alkylert peptid [-C(0)NR6- der R6er lavere alkyl]. 4. N-terminalen er derivatisert. Typisk kan N-terminalen bli acylert eller modifisert til et substituert amin. Eksempler på N-terminale derivatgrupper inkluderer -NRRi(forskjellig fra -NH2), -NRC(0)Ri, -NRC(0)ORi, -NRS(0)2Ri, -NHC(0)NHRi, suksinimid eller benzyloksykarbonyl-NH- (CBZ-NH-), der R og R±hver uavhengig er hydrogen eller lavere alkyl og der fenylringen kan være substituert med 1 til 3 substituenter som er valgt fra gruppen bestående av Ci-C4-alkyl, Ci-C4-alkoksy, klor og brom. 5. Den frie C-terminalen er derivatisert. Typisk er C-terminalen forestret eller amidert. For eksempel kan man benytte fremgangsmåter som er beskrevet på fagområdet for å tilsette (NH-CH2-CH2-NH2)2til forbindelser ifølge oppfinnelsen på C-terminalen. Tilsvarende kan man benytte fremgangsmåter som er beskrevet på fagområdet for å tilsette -NH2, (eller "capping" med en -NH2-gruppe) til forbindelser ifølge oppfinnelsen på C-terminalen. Eksempler på C-terminale derivatgrupper inkluderer for eksempel -C(0)R2der R2er lavere alkoksy eller -NRaRjder R3og R*uavhengig er hydrogen eller Ci-C8alkyl (fortrinnsvis Ci-C4alkyl). 6. En disulfidbinding blir erstattet med annen, fortrinnsvis mer stabil, kryssbindende enhet (for eksempel et alkylen). Se for eksempel Bhatnagar et al., J Med Chem 39:3814-9 (1996), Alberts et al., Thirteenth Am Pep Symp, 357-9 (1993). 7. En eller flere individuelle aminosyreresidier er modifisert. Ulike derivatiserende midler er kjent for å reagere spesifikt med valgte sidekjeder eller terminale residier, som beskrevet i detalj nedenfor.
Lysinylresidier og aminoterminale residier kan bli reagert med ravsyre eller andre karboksylsyreanhydrider som reverserer ladningen til lysinylresidiene. Andre passende reagenser for derivatisering av a-aminoinneholdende residier inkluderer iminoestere slik som metylpikolinimidat, pyridoksalfosfat, pyridoksal, klorborhydrid, trinitrobenzensulfonsyre, O-metylisourea, 2,4-pentandion og transaminasekatalysert reaksjon med glyoksylat.
Arginylresidier kan bli modifisert med reaksjon med enhver av eller en kombinasjon av flere konvensjonelle reagenser, inkludert fenylglyoksal, 2,3-butandion, 1,2-sykloheksandion og ninhydrin. Derivatisering av arginylresidier krever at reaksjonen blir utført i alkaliske betingelser på grunn av den høye pKa-verdien til guanidin reaksjonsgruppen. Videre kan disse reagensene reagere med grupper av lysin tildelt til arginin-e-aminogruppe.
Spesifikke modifikasjoner av tyrosylresidier har blitt studert inngående med spesielt interesse rettet mot introdusering av spektralmerker på tyrosylresidier med reaksjon med aromatiske diazoniumforbindelser eller tetranitrometan. Vanligvis blir N-acetylimidizol og tetranitrometan benyttet for å danne O-acetyltyrosylenheter og henholdsvis 3-nitroderivater.
Karboksyl sidekjedegrupper (aspartyl eller glutamyl) kan bli valgt selektivt ved reaksjon med karbodiimider (R'-N=C=N-R') slik som l-sykloheksyl-3-(2-morfolinyl-(4- etyl)karbodiimid eller l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl)karbodiimid. Videre kan aspartyl- og glutamylresidier bli konvertert til asparaginyl og glutaminylresidier ved reaksjon med ammoniumioner.
Glutaminyl- og asparaginylresidier kan bli deamidert til de tilsvarende glutamyl- og aspartylresidiene. Alternativt blir disse residiene amidert under mildt sure betingelser. Alle formene av disse residiene faller innenfor omfanget av denne oppfinnelsen.
Cysteinylresidier kan bli erstattet med aminosyreresidier eller andre enheter enten for å eliminere disulfidbinding eller i motsatt fall for å stabilisere kryssbinding. Se for eksempel Bhatnagar et al., { ovenfor).
Derivatisering av bifunksjonelle midler er nyttig for å kryssbinde peptidene eller deres funksjonelle derivater til en vannuløselig støttematriks eller til andre makromolekylære vehikler. Vanlig benyttede kryssbindingsmidler inkluderer for eksempel l,l-bis(diazoacetyl)-2-fenyletan, glutaraldehyd, N-hydroksysuksinimidestere, foreksempel estere med 4-azidosalisylsyre, homobifunksjonelle imidoestere, inkludert disyksinimidylestere slik som 3,3'-ditiobis(suksinimidylpropionat) og bifunksjonelle maleimider slik som bis-N-maleimido-l,8-oktan. Derivatiserende midler slik som metyl-3-[(p-azidofenyl)ditio]propioimidat gir fotoaktiverbare intermediater som er i stand til å danne kryssbindinger i nærvær av lys. Alternativt blir reaktive vannuløselige matriser slik som cyanogenbromid-aktiverte karbohydrater og de reaktive substratene beskrevet i US patentnr. 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537 og 4 330 440 benyttet til proteinimmobilisering.
Karbohydrat (oligosakkarid)-grupper kan hensiktsmessig bli bundet til seter som er kjent for å være glykosyleringsseter i proteiner. Generelt blir O-bundne oligosakkarider bundet til serin (Ser)- eller treonin (Thr)-residier, mens N-bundne oligosakkarider blir bundet til asparagin (Asn)-residier når de er en del av sekvensen Asn-X-Ser/Thr, der X kan være enhver aminosyre bortsett fra prolin. X er fortrinnsvis en av de 19 naturlig forekommende aminosyrene forskjellig fra prolin. Strukturene til N-bundne og O-bundne oligosakkarider og sukkerresidiene som er funnet i hver type er forskjellig. En type sukker som er vanlig funnet på begge er N-acetylneuraminsyre (referert til som sialinsyre). Sialinsyre er vanligvis den terminale residien til både N-bundne og O-bundne oligosakkarider og kan i kraft av sin negative ladning overføre sure egenskaper til den glykosylerte forbindelsen. Slike seter kan bli inkorporert i linkeren til forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen og bli fortrinnsvis glykosylert av en celle i løpet av rekombinant produksjon av polypeptidforbindelsene (foreksempel pattedyrceller slik som CHO, BHK, COS). Likevel kan slike seter ytterligere bli glykosylert ved hjelp av syntetiske eller halvsyntetiske prosedyrer som er kjent på fagområdet.
Andre mulige modifikasjoner inkluderer hydroksylering av protein og lysin, fosforylering av hydroksylgrupper av seryl- eller treonylresidier, oksidasjon av svovelatomet i Cys, metylering av a-aminogruppene på lysin-, arginin- og histidin sidekjeder (se for eksempel Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W.H. Freeman & Co., San Francisco), s. 79-86 (1983)].
Forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli endret på DNA-nivået i tillegg. DNA-sekvensen til enhver del av forbindelsen kan bli endret til kodoner som er mer kompatible med den valgte vertscellen. For E. coli, som er den foretrukne vertscellen, er optimaliserte kodoner kjent på fagområdet. Kodoner kan bli substituert for å eliminere restriksjonsseter eller for å inkludere hvilende restriksjonsseter, som kan hjelpe til i prosessering av DNA i den valgte vertscellen. Vehikkel-, linker- og peptid-DNA-sekvensene kan bli modifisert for å inkludere enhver av de foregående sekvensendringene.
Ytterligere derivater inkluderer ikke-peptid analoger som tilveiebringer en stabilisert struktur eller minsket biodegradering, og disse er også omfattet. Peptidhermer analoger kan bli fremstilt basert på et valgt inhibitorisk peptid ved erstatning av en eller flere residier med ikke-peptid enheter. Fortrinnsvis tillater ikke-peptid enhetene peptidet i å opprettholde sin naturlige konfirmasjon eller stabilisere en foretrukket, for eksempel bioaktiv, konfirmasjon som opprettholder evnen til å gjenkjenne og binde myostatin. I et aspekt oppviser den resulterende analogen/hermeren økt bindingsaffinitet for myostatin. Et eksempel på fremgangsmåter for fremstilling av ikke-peptidhermeranaloger fra peptider er beskrevet i Nachman et al., Regul Pept 57:359-370 (1995). Hvis det er ønskelig kan peptidene ifølge oppfinnelsen bli modifisert, foreksempel ved glykosylering, amidering, karboksylering eller fosforylering, eller ved hjelp av dannelsen av syreaddisjonssalter, aminer, estere, spesielt C-terminale estere og N-acylderivater av peptidene ifølge oppfinnelsen. Peptidlegemene kan også bli modifisert for å danne peptidderivater ved å danne kovalente eller ikke-kova lente komplekser med andre enheter. Kovalent bundne komplekser kan bli fremstilt ved å binde de kjemiske enhetene til funksjonelle grupper på sidekjedene til aminosyrer som omfatter peptidlegemene, eller på N- eller C-terminalene.
Spesielt er det forventet at peptidene kan bli konjugert til en reportergruppe, inkludert, men ikke begrenset til, et radiomerke, et fluorescerende merke, et enzym (for eksempel som katalyserer en kolorimetrisk eller fluorimetrisk reaksjon), et substrat, en fast matriks eller en bærer (for eksempel biotin eller avidin). Oppfinnelsen tilveiebringer dermed et molekyl som omfatter et peptidlegeme molekyl der molekylet fortrinnsvis ytterligere omfatter en reportergruppe som er valgt fra gruppen som består av et radiomerke, et fluorescerende merke, et enzym, et substrat, en fast matriks og en bærer. Slike merker er velkjente for fagfolk på området, for eksempel er biotinmerker spesielt påtenkt. Anvendelsen av slike merker er velkjent for fagfolk på området og er beskrevet i for eksempel US patentnr. 3 817 837, 3 850 752, 3 996 345 og 4 277 437. Andre merker som vil være nyttig inkluderer, men er ikke begrenset til radioaktive merker, fluorescerende merker og kjemiluminiscerende merker. US pantentskrifter som vedrører anvendelsen av slike merker inkluderer for eksempel US patentnr. 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350 og 3 996 345. Ethvert av peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte et, to eller flere av ethvert av disse merkene.
Fremgangsmåter for å fremstille peptider og peptidlegemer
Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli inndelt ved å benytte et bredt utvalg av teknikker som er kjent på fagområdet. For eksempel kan slike peptider bli syntetisert i løsning eller på en fast støtte i overensstemmelse med konvensjonelle teknikker. Ulike automatiske syntetiseringsinnretninger er kommersielt tilgjengelige og kan bli benyttet i overensstemmelse med kjente protokoller. Se for eksempel Stewart og Young { ovenfor) ; Tam et al., J. Am. Chem Soc, 105:6442 (1983); Merrifield, Science 232:341-347
(1986); Barany og Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, red., Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987) og US patentnr.
5 434 398, der hver av disse er inkorporert her ved referanse.
Fastfase peptidsyntese fremgangsmåter benytter et kopoly(styrendivinylbenzen) inneholdende 0,1-1,0 mM aminer/g polymer. Disse fremgangsmåtene for peptidsyntese benytter butyloksykarbonyl(t-BOC) eller 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (FMOC)-beskyttelse av <x-aminogrupper. Begge fremgangsmåter involverer trinnvise synteser hvorved en enkelt aminosyre blir påsatt i hvert trinn ved å starte fra C-terminalen til peptidet (se Coligan et al., Curr Prot Immunol, Wiley Interscience, 1991, enhet 9). Ved ferdigstillelse av kjemisk syntese kan det syntetiske peptidet bli deprotektert for å fjerne t-BOC- eller FMOC-aminosyre blokkeringsgruppene og kløyvd fra polymeren ved behandling med syre ved redusert temperatur (for eksempel flytende HF-10% anisol i omtrent 0,25 til omtrent 1 time ved 0°C). Etter avdamping av reagensene blir peptidene ekstrahert fra polymeren med 1% eddiksyre løsning som deretter blir lyofilisert for å gi det urensede materialet. Dette kan normalt bli renset ved hjelp av slike teknikker som gelfiltrering på Sephadex G-15 ved å benytte 5% eddiksyre som et løsningsmiddel. Lyofilisering av hensiktsmessige fraksjoner fra kolonnen vil gi de homogene peptidene eller peptidderivatene, som deretter kan blikarakterisert vedslike standardteknikker som aminosyreanalyse, tynnsjiktskromatografi, HPLC, ultrafiolett absorpsjonsspektroskopi, molar rotasjon, løselighet og kvantitert ved hjelp av fastfase-Edman-degradering.
Phage-display teknikker kan være spesielt effektive i å identifisere peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som beskrevet ovenfor. Kort fortalt blir et fag-bibliotek fremstilt (ved for eksempel å benytte ml 13, fd, eller A,-fag), som oppviser innskudd fra 4 til omtrent 80 aminosyreresidier. Innskuddene kan foreksempel representere en fullstendig degenerert eller gjensidig samling. Fagbærende innskudd som binder til det ønskede antigenet blir valgt og denne prosessen blir gjentatt i flere sykler med reseleksjon av fag som binder til det ønskede antigenet. DNA-sekvensering blir utført for å identifisere sekvensene til de uttrykte peptidene. Den minimale lineære delen av sekvensen som binder til det ønskede antigenet kan bli bestemt på denne måten. Prosedyren kan bli gjentatt ved å benytte et gjensidig bibliotek som inneholder innskudd som inneholder deler av eller hele den minimale, lineære delen pluss et eller flere ytterligere degenererte residier oppstrøms eller nedstrøms derav. Disse teknikkene kan identifisere peptider ifølge oppfinnelsen med enda større bindingsaffinitet for myostatin enn midler som allerede er identifisert her.
Uavhengig av måten peptidene blir fremstilt på kan et nukleinsyremolekyl som koder for hvert slikt peptid bli generert ved å benytte standard rekombinante DNA-prosedyrer. Nukleotidsekvensen til slike molekyler kan bli manipulert som hensiktsmessig uten å endre aminosyresekvensen de koder for, for å ivareta degenereringen av nukleinsyrekoden i tillegg til for å ivareta kodonpreferanse i spesielle vertsceller.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nukleinsyremolekyler som omfatter polynukleotidsekvenser som koder for peptidene og peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse nukleinsyremolekylene inkluderer vektorer og konstruksjoner som inneholder polynukleotider som koder for peptidene og peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse, i tillegg til peptid- og peptidlegemevarianter og derivater. Eksempler på nukleinsyremolekyler er tilveiebrakt i eksemplene nedenfor.
Rekombinante DNA-teknikker tilveiebringer også en hensiktsmessig fremgangsmåte for å fremstille fullengde peptidlegemer og andre store polypeptidbindende midler ifølge foreliggende oppfinnelse, eller fragmenter derav. Et polynukleotid som koder for peptidlegemer eller fragmenter kan bli innsatt i en ekspresjonsvektor som i sin tur kan bli innsatt i en vertscelle for produksjon av bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fremstilling av eksempler på peptidlegemer ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i Eksempel 2 nedenfor.
En mengde ulike ekspresjonsvektor/vertssystemer kan bli benyttet for å uttrykke peptidene og peptidlegemene ifølge oppfinnelsen. Disse systemer inkluderer, men er ikke begrenset til mikroorganismer slik som bakterier som er transformert med rekombinante bakteriofag-, plasmid- eller kosmid-DNA-ekspresjonsvektorer, gjær transformert med gjærekspresjonsvektorer, innsektcelle systemer som er infisert med virusekspresjonsvektorer (for eksempel baculovirus), plantecelle systemer som er transfektert med virusekspresjonsvektorer (foreksempel blomkål mosaikkvirus, CaMV, tobakk mosaikkvirus, TMV) eller transformert med bakterielle ekspresjonsvektorer (for eksempel Ti eller pBR322-pasmid) eller dyrecelle systemer. I en foretrukket vertscellelinje er E. co//'-stamme 2596 (ATCC# 202174), som er benyttet til uttrykking av peptidlegemer som beskrevet nedenfor i Eksempel 2. Pattedyrceller som er nyttige i rekombinant proteinproduksjon inkluderer, men er ikke begrenset til, VERO-celler, HeLa-celler, kinesiske hamster ovarie (CHO)-cellelinjer, COS-celler (slik som COS-7), W138-, BHK-, HepG2-, 3T3-, RIN-, MDCK-, A549-, PC12-, K562- og 293-celler.
Uttrykket "ekspresjonsvektor" refererer til et plasmid, fag, virus eller vektor, for å uttrykke et polypeptid fra en polynukleotidsekvens. En ekspresjonsvektor kan omfatte en transkripsjonen enhet som omfatter en samling av (1) et genetisk element eller elementer som har en regulatorisk rolle i genuttrykking, for eksempel promoterer eller enhancere, (2) en strukturell sekvens eller sekvens som koder for bindingsmiddelet som blir transkribert til mRNA og translatert til protein, og (3) hensiktsmessige transkripsjonsinitieringssekvenser og terminseringssekvenser. Strukturelle enheter som er ment til anvendelse i gjæruttrykkingssystemer eller eukaryotiske uttrykkingssystemer inkluderer fortrinnsvis en ledersekvens som gjør ekstracellulære sekresjon av translatert protein ved en vertscelle mulig. Der rekombinant protein blir uttrykt uten en leder- eller transportsekvens, kan den alternativt inkludere en aminoterminal metionylresidie. Denne residien kan bli, men behøver ikke å bli, kløyvd fra det uttrykte rekombinante proteinet for å tilveiebringe et endelig peptidprodukt.
For eksempel kan peptidene eller peptidlegemene bli rekombinant uttrykt i gjær ved å benytte et kommersielt tilgjengelig uttrykkingssystem, for eksempel Pichia-uttrykkingssystemet (Invitrogen, San Diego, CA), ved å følge produsentens instruksjoner. Dette systemet er også avhengig av pre-pro-a-sekvens for å rette sekresjon, men transkripsjon av innskuddet er drevet av alkoholoksidase (AOXl)-promoteren, ved induksjon med metanol. Det utskilte peptidet ble renset fra gjærvekstmediet ved å benytte fremgangsmåtene som ble benyttet til å rense peptidet fra bakterielle og pattedyrcellesupernatanter.
Alternativt kan cDNA som koder for peptidet og peptidlegemene bli klonet inn i baculovirus ekspresjonsvektoren pVL393 (PharMingen, San Diego, CA). Denne vektoren kan bli benyttet i overensstemmelse med produsentens retningslinjer (PharMingen) for å infisere Spodoptera frugiperda- ceWer i sF9-proteinfritt medium og for å fremstille rekombinant protein. Det rekombinante proteinet kan bli renset og konsentrert fra media ved å benytte en heparin-Sepharose-kolonne (Pharmacia).
Alternativt kan peptidet eller peptidlegemet bli uttrykt i et innsektssystem. Innsektssystemet for proteinuttrykking er velkjente for fagfolk på området. I et slikt system kan Autographa califomica nukleært polyhedrosevirus (AcNPV) bli benyttet som en vektor for å uttrykke fremmede gener i Spodoptera frugiperda- ceWer eller i Trichoplusia larvae. Den peptidkodende sekvensen kan bli klonet inn i en ikke-essensiell region på viruset slik som polyhedringenet og plassert under kontroll av polyhedrinpromoteren. Vellykket innsetning av peptidet vil gjøre polyhedringenet inaktivt og produsere rekombinante virus som mangler kappe av kappeprotein. De rekombinante virusene kan bli benyttet til å infisere S. frugiperda- ceWer eller Trichoplusia larvae i hvilke peptidet blir uttrykt (Smith et al., J Virol 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proe Nat Acad Sei (USA) 91: 3223-7 (1994)).
I et annet eksempel kan DNA-sekvensen som koder for peptidet blir amplifisert ved hjelp av PCR og klonet inn i en hensiktsmessig vektor, for eksempel pGEX-3X (Pharmacia). pGEX-vektoren er designet for å produsere et fusjonsprotein som omfatter glutation-S-transferase (GST), kodet for av vektoren og et protein som er kodet for av et DNA-fragment som er satt inn i vektorens kloningssete. Primerne for PCR kan bli fremstilt slik at det for eksempel inkluderer et hensiktsmessig kløyvingssete. Der fusjonsenheten er benyttet kun for å fremme uttrykking eller på annen måte ikke er ønskelig som en påkobling på peptidet av interesse, kan det rekombinante fusjonsproteinet bli kløyvd fra GST-delen av fusjonsproteinet. Den pGEX-3X/spesifikke bindingsmiddel peptidkonstruksjonen blir transformert inn i E. coli XL-l-Blue-celler (Stratagene, La Jolla, CA) og individuelle transformanter isolert og dyrket. Plasmid-DNA fra individuelle transformanter kan bli renset og delvis sekvensert ved å benytte en automatisert sekvensmaskin for å bekrefte tilstedeværelsen av det ønskede spesifikke bindingsmiddelkodende nukleinsyre innskuddet i riktig orientering.
Fusjonsproteinet som kan bli fremstilt som et uløselig inklusjonslegeme i bakterien kan bli renset på følgende måte. Vertsceller blir samlet ved hjelp av sentrifugering, vasket i 0,15 M NaCI, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA og behandlet med 0,1 mg/ml lysozym (Sigma, St. Louis, MO) i 15 minutter ved romtemperatur. Lysatet kan bli klaret ved hjelp av sonikering og celleavfall kan bli spunnet ned til en pel lett i 10 minutter ved 12 000 X g. Den fusjonsproteininneholdende pelleten kan bli resuspendert i 50 mM Tris, pH 8 og 10 mM EDTA, lagt over 50 % glyserol og sentrifugert i 30 minutter ved 6 000 X g. Pelleten kan bli resuspendert i standard fosfatbufret saltløsning (PBS), fri for Mg++ og Ca++. Fusjonsproteinet kan bli ytterligere renset ved å fraksjonere den resuspenderte pelleten i en denaturerende SDS-PAGE (Sambrook et al, ovenfor). Gelen kan bli dynket i 0,4 M KCI for å visualisere proteinet, som kan bli skåret ut og elektroeluert i gelkjøringsbuffer som mangler SDS. Hvis GST/fusjonsproteinet er fremstilt i bakterier som et løselig protein, kan det bli renset ved å benytte GST-rensemodulen (Pharmacia).
Fusjonsproteinet kan bli utsatt for fordøying for å kløyve GST fra peptidet ifølge oppfinnelsen. Fordøyingsreaksjonen (20-40 mg fusjonsprotein, 20-30 enheter human trombin (4 000 U/mg, Sigma) i 0,5 ml PBS kan bli innkubert 16-48 timer ved romtemperatur og satt på en denaturerende SDS-PAGE-gel for å fraksjonere reaksjonsproduktene. Gelen kan bli dynket i 0,4 M KCI for å visualisere proteinbåndene. Identiteten av proteinbåndet som tilsvarer den forventede molekylvekten for peptidet kan bli bekreftet ved hjelp av aminosyre sekvensanalysen ved å benytte en automatisert sekvensmaskin (Applied Biosystems Modell 473A, Foster City, CA). Alternativt kan identiteten blir bekreftet ved å utføre HPLC og/eller massespektrometri av peptidene.
Alternativt kan en DNA-sekvens som koder for peptidet bli klonet inn i et plasmid som inneholder ønsket promoter og eventuelt en ledersekvens (Better et al., Science 240: 1041-43 (1988)). Sekvensen i denne konstruksjonen kan bli bekreftet ved hjelp av automatisert sekvensering. Plasmidet kan deretter bli transformert inn i E. co//'-stamme MC1061 ved å benytte standardprosedyrer som bruk av CaCI2-innkubering og varmesjokkbehandling av bakterien (Sambrook et al., ovenfor). De transformerte bakteriene kan bli dyrket i LB-medium tilsatt karbenicillin og produksjon av det uttrykte protein kan bli indusert med vekst i et passende medium. Hvis den er til stede kan ledersekvensen effektivere utskilling av peptidet og bli kløyvd i løpet av utskilling.
Pattedyr vertssystemet for uttrykkingen av rekombinante peptider og peptidlegemer er velkjente for fagfolk på området. Vertscelle stammer kan bli valgt for en spesiell evne til å prosessere det uttrykte protein eller produsere visse post-translasjonelle modifikasjoner som vil være nyttige for å tilveiebringe proteinaktivitet. Slike modifikasjoner av proteiner inkluderer, men er ikke begrenset til, acetylering, karboksylering, glykosylering, fosforylering, lipidering og acylering. Ulike vertsceller slik som CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 og lignende har spesifikt cellulært maskineri og karakteristiske mekanismer for slike post-translasjonelle aktiviteter og kan bli valgt for å sikre den korrekte modifisering og prosessering av det introduserte, fremmede proteinet.
Det er foretrukket at transformerte celler blir benyttet til langtids, høyt utbytte proteinproduksjon. Med en gang celler er transformert med vektorer som inneholder selekterbare markører i tillegg til den ønskede uttrykkingskassett, kan cellene bli tillatt å vokse i 1-2 dager i et anriket medium før de blir byttet over til selektivt medium. Den selekterbare markører er designet for å tillate vekst og gjenvinning av celler som vellykket uttrykker de introduserte sekvensene. Resistente klumper av stabilt transformerte celler kan bli proliferert ved å benytte vevskultur teknikker som er hensiktsmessige for cellelinjen som er benyttet.
Et antall seleksjonssystemer kan bli benyttet for å gjenvinne cellene som har blitt transformert for rekombinant proteinproduksjon. Slike seleksjonssystemer inkluderer, men er ikke begrenset til, HSV-tymidinkinase, hypoksantinguaninfosforibosyltransferase- og adeninfosforibosyltransferasegener i henholdsvis tk-, hgprt- eller aprt-celler. Anti-metabolitt resistens kan også bli benyttet som basis for seleksjon for dhfr som overfører resistens for metotreksat, gpt som overfører resistens for mykofenolsyre, neo som overfører resistens for aminoglykosid G418 og overfører resistens for klorsulfuron og hygro som overfører resistens for hygromycin. Ytterligere selekterbare gener som kan være nyttige inkluderer trpB, som tillater celler å benytte indol i stedet for tryptofan eller hisD som tillater cellene å benytte histinol i stedet for histidin. Markører som gir en visuell indikasjon for identifikasjon av transformanter inkluderer antocyaniner, p-glukuronidase og dets substrat, GUS og luciferase og dets substrat, luciferin.
Rensing og refolding av bindingsmidler
I noen tilfeller kan bindingsmidlene slik som peptidene og/eller peptidlegemene ifølge denne oppfinnelsen trenge å bli "refoldet" og oksidert til en hensiktsmessig tertiær struktur og disulfidbindinger generert for å kunne være biologisk aktive. Refolding kan bli oppnådd ved å benytte et antall prosedyrer som er velkjente på fagområdet. Slike fremgangsmåter inkluderer for eksempel å utsette det løseliggjorte polypeptidmiddelet til en pH som vanligvis er over 7 i nærvær av et kaotropisk middel. Valget av kaotrop er tilsvarende til valgene som er benyttet for inklusjonslegeme løseliggjøring, selv om en kaotrop typisk blir benyttet ved en lavere konsentrasjon. Eksempler på kaotropiske midler er guanidin og urea. I de fleste tilfeller vil refoldings-/oksidasjonsløsningen også inneholde et reduserende middel pluss dets oksiderte form i et spesifikt forhold for å generere et spesielt redokspotensiale som tillater at disulfidforskyvning foregår for dannelsen av cysteinbroer. Noen vanlig benyttede redokspar inkluderer cystein/cystamin, glutation/ditiobisGSH, kobberklorid, ditiotreitol DTT/ditian DTT og 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. I mange tilfeller kan et tilleggs løsningsmiddel bli benyttet for å øke effektiviteten av refoldingen. Vanlig benyttede tilleggsløsningsmidler inkluderer glyserol, polyetylenglykol av ulike molekylvekter og arginin.
Det kan være ønskelig å rense peptidene og peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse. Proteinrenseteknikker er velkjente for fagfolk på området. Disse teknikkene involverer på et nivå den grove fraksjoneringen av de proteininneholdende og ikke-proteininneholdende fraksjonene. Etter å ha separert peptidet og/eller peptidlegemet fra andre proteiner kan peptidet eller polypeptidet av interesse enklere bli renset ved å benytte kromatografiske og elektroforetiske teknikker for å oppnå delvis eller fullstendig rensing (eller rensing til homogenisitet). Analytiske fremgangsmåter som er spesielt passende for klargjøringen av peptidlegemer og peptider ifølge foreliggende oppfinnelse er ionebytterkromatografi, eksklusjonskromatografi, polyakrylamidgelelektroforese, isoelektrisk fokusering. En spesiell effektiv fremgangsmåte for å rense peptider er rask flytende proteinkromatografi eller til og med HPLC.
Visse aspekter av oppfinnelsen vedrører rensingen, og i spesielle utførelsesformer, den vesentlige rensingen av et peptidlegeme eller peptid ifølge oppfinnelsen. Uttrykket "renset peptidlegeme eller peptid", slik som det blir benyttet her, er ment å skulle referere til et preparat, som er isolerbart fra andre komponenter, der peptidlegemet eller peptidet blir renset til enhver grad relativt i forhold til dets naturlige tilstand. Et renset peptid eller peptidlegeme refererer derfor også til et peptidlegeme eller peptid som er fri fra miljøet der det vanligvis kan forekomme.
Generelt vil "renset" referere til et peptid- eller peptidlegemepreparat som har blitt utsatt for fraksjonering for å fjerne ulike andre komponenter, og der preparatet vesentlig opprettholder sin uttrykte biologiske aktivitet. Der uttrykket "vesentlig renset" blir benyttet, vil denne betegnelsen referere til et peptid- eller peptidlegeme preparat der peptidlegemet eller peptidet utgjør hoveddelen av preparatet, slik som å utgjøre omtrent 50%, omtrent 60%, omtrent 70%, omtrent 80%, omtrent 90%, omtrent 95% eller mer av proteinet i preparatet.
Ulike fremgangsmåter for å kvantifisere graden av rensing av peptidet eller peptidlegemet vil være kjent for fagfolk på området i lys av foreliggende beskrivelse. Disse inkluderer for eksempel å bestemme den spesifikke bindingsaktiviteten i en aktiv fraksjon, eller undersøke mengden av peptid eller peptidlegeme i en fraksjon ved hjelp av SDS/PAGE- analyse. En foretrukket fremgangsmåte for å undersøke renheten av et peptid- eller peptidlegemefraksjon er å beregne bindingsaktiviteten i fraksjonen for å sammenligne den med bindingsaktiviteten i det opprinnelige ekstraktet, og for derved å beregne graden av rensning, som her blir gitt en "-ganger renseverdi". De faktiske enhetene som blir benyttet for å representere mengden av bindingsaktivitet vil selvfølgelig være avhengig av den spesielle analyseteknikken som er valgt for å følge rensingen og hvorvidt eller ikke peptidlegemet eller peptidet oppviser en påvisbar bindingsaktivitet.
Ulike teknikker som er passende til anvendelse ved rensing vil være velkjent for fagfolk på området. Disse inkluderer for eksempel presipitering med ammoniumsulfat, PEG, antistoffer (immunpresipitering) og lignende eller ved hjelp av varmedenaturering, etterfulgt av sentrifugering, kromatografitrinn slik som affinitetskromatografi (for eksempel protein-A-Sepharose), ionebytting, gelfiltrering, reversfase, hydroksylapatitt og affinitetskromatografi, isoelektrisk fokusering, gelelektroforse og kombinasjoner av slike og andre teknikker. Slik som det er generelt kjent på fagområdet er det antatt at rekkefølgen av utførelsen av de ulike rensetrinnene kan bli endret eller at visse trinn kan bli omgått og fremdeles resultere i en hensiktsmessig fremgangsmåte for fremstillingen av et vesentlig renset bindingsmiddel.
Det er ikke noe generelt krav at bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse alltid må bli tilveiebrakt i deres mest rensede tilstand. Faktisk er det ansett at mindre vesentlige rensede bindingsmiddelprodukter vil ha anvendelighet i visse utførelsesformer. Delvis rensing kan bli utført ved å benytte færre rensetrinn i kombinasjon eller ved å benytte ulike former av det samme generelle renseskjemaet. For eksempel er det satt pris på at kationbytter kolonnekromatografi som er utført ved å benytte et HPLC-apparat generelt vil føre til større rensegrad enn den samme teknikken ved å benytte et lavtrykkskromatografisystem. Fremgangsmåter som oppviser lavere grad av relativ rensing kan ha fortrinn i total gjenvinning av peptidet eller peptidlegemet eller i å opprettholde bindingsaktivitet for peptidet eller peptidlegemet.
Det er kjent at vandringen av et peptid eller polypeptid kan variere, og noen ganger signifikant, med ulike betingelser med SDS/PAGE (Capaldi et al., Biochem Biophys Res Comm., 76: 425 (1977)). Det vil derfor bli satt pris på at under ulike elektroforesebetingelser så kan de synlige molekylvektene for rensede eller delvis rensede bindingsmiddel uttrykkingsprodukter variere.
Aktivitet for myostatinbindende midler
Etter konstruksjon av bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse blir de testet for deres evne til å binde myostatin og inhibere eller blokkere myostatinaktivitet. Ethvert antall analyser eller dyretester kan bli benyttet for å bestemme evnen til middelet til å inhibere eller blokkere myostatinaktivitet. Flere analyser som blir benyttet for å karakterisere peptidene eller peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i eksemplene nedenfor. I en analyse ar C2C12 pMARE-luc-analysen som gjør bruk av en myostatinresponsiv cellelinje (C2C12 myoblaster) som er transfektert med en luciferase reportervektor inneholdende myostatin/aktivin responselementer (MARE). Eksempel på peptidlegemer blir analysert ved å preinnkubere en serie av peptidlegemefortynninger med myostatin og deretter utsette cellene for innkuberingsblandingen. Den resulterende luciferaseaktiviteten blir bestemt og en titreringskurve blir generert fra serien av peptidlegemefortynninger. IC50(konsentrasjonen av peptidlegemet for å oppnå 50% inhibering av myostatinaktivitet som målt ved luciferaseaktivitet) ble deretter bestemt. En annen analyse som er beskrevet nedenfor er en BIAcore-analyse for å bestemme de kinetiske parameterne Ka (asossieringshastighetskonstant), kd
(dissosieringshastighetskonstant) og KD(dissosieringslikevektskonstant) forde myostatinbindende midlene. Lavere dissosierings likevekts kon stan te r (KDiuttrykt i nM)
indikerte en større affinitet fra peptidlegemet for myostatin. Ytterligere analyser inkluderer blokkeringsanalyser for å bestemme hvorvidt et bindingsmiddel slik som et peptidlegeme er nøytraliserende (forhindre binding til myostatin til dens reseptor) eller ikke-nøytraliserende (forhindrer ikke binding av myostatin til dets reseptor), selektivitetsanalyser som bestemmer om bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse binder selektivt til myostatin og til andre TGFp-familiemedlemmer, og KinEx-A-analyser eller løsningsbaserte likevektsanalyser som også bestemmer KDog er ansett for å være mer sensitive i visse tilfeller. Disse analysene er beskrevet i Eksempel 3.
Figur 1 viser IC50-verdien for et peptid sammenlignet med IC50-verdien for peptidlegemeformen av peptidet. Dette viser at peptidlegemet er vesentlig mer effektivt i å inhibere myostatinaktivitet enn peptidet alene. I tillegg oppviser affinitetsmodne peptidlegemer generelt forbedrede IC50- og KD-verdier sammenlignet med morpeptidene og peptidlegemene. IC50-verdiene for et antall affinitetsmodnede eksempelpeptidlegemer er vist i Tabell VII, Eksempel 7 nedenfor. I visse tilfeller kan fremstilling av en 2x versjon av peptidlegemet der to peptider er bundet i tandem øke aktiviteten til peptidlegemet både in vitro og in vivo.
In wVo-aktiviteter er vist i eksemplene nedenfor. Aktivitetene til bindingsmidlene inkluderer anabol aktivitet som øker ren muskelmasse i dyremodeller eller til å minske fettmasse med hensyn til total kroppsvekt i behandlede dyremodeller og øker muskelstyrke i dyremodeller.
Anvendelse av de myostatinbindende midlene
De myostatinbindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse binder til myostatin og blokkerer eller inhiberer myostatinsignalisering inne i målrettede celler. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og reagenser for å redusere mengden eller aktiviteten av myostatin i et dyr ved å administrere en effektiv dosering av et eller flere myostatinbindende midler til dyret. I et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter og reagenser for å behandle myostatin relaterte forstyrrelser i et dyr som omfatter å administrere en effektiv dosering av et eller flere bindingsmidler til dyret. Disse myostatinrelaterte forstyrrelsene inkluderer, men er ikke begrenset til ulike former for muskelsvinn i tillegg til metabolske forstyrrelser slik som diabetes og beslektede forstyrrelser, og bendegenerative sykdommer slik som osteoporose.
Som vist i Eksempel 8 nedenfor øker eksempelpeptidlegemer ifølge foreliggende oppfinnelse dramatisk ren muskelmasse i CDl-nu/nu musemodellen. Denne in vivo-aktiviteten korrelerer med in wtro-bindingen og inhibitorisk aktivitet beskrevet nedenfor for de samme peptidlegemene.
Muskelsvinn forstyrrelser inkluderer dystrofier slik som Duchenne's muskulære dystrofi, progressiv, muskulær dystrofi, Becker's type muskulær dystrofi, Dejerine-Landouzy muskulær dystrofi, Erb's muskulære dystrofi og infantil neuroaksonal muskulær dystrofi. For eksempel forbedret blokkering av myostatin i anvendelsen av antistoffer in vivo den dystrofiske fenotypen til mdx-musemodellen for Duchenne's muskulære dystrofi (Bogdanovich et al., Nature 420, 28 (2002)). Peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse øker ren muskelmasse som en prosentandel av kroppsvekt og minsker fettmasse som en prosentandel av kroppsvekt når det blir administrert til en aldret mdx-musemodell.
Ytterligere muskelsvinnforstyrrelser fremstår fra kroniske sykdommer slik som amyotrofisk lateral sklerose, kongestiv, obstruktiv pulmonær sykdom, kreft, AIDS, nyresvikt og reumatoid artritt. For eksempel ble kakeksi eller muskelsvinn og tap av kroppsvekt indusert i atymiske nakenmus ved hjelp av et systemisk administrert myostatin (Zimmers et al., ovenfor). I et annet eksempel ble serum- og intramuskulære konsentrasjoner av myostatinim mun reaktivt protein funnet å være økt i menn som oppviser AIDS-relatert muskelsvinn og ble relatert inverst til fettfri masse (Gonzales-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)). Ytterligere tilstander som fører til muskelsvinn kan komme fra inaktivitet som skyldes invaliditet slik som for folk som er dømt til å sitte i en rullestol, forlenget sengeligger som skyldes slag, sykdom, ryggmargskade, benfraktur eller trauma, og muskulær atrofi i et mikrogravitetsmiljø (romfart). For eksempel ble plasmamyostatin immunreaktivt protein i plasma funnet å øke etter forlenget sengeligge (Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2): 11(1999). Det ble også funnet at musklene hos rotter som var utsatt for et mikrotyngdekrafts miljø i løpet av en romfartstur uttrykte en økt mengde av myostatin sammenlignet med musklene hos rotter som ikke ble utsatt (Lalani et al., J. Endocrin 167 (3): 417-28 (2000)).
I tillegg ser det ut til at aldersrelaterte økninger i forholdene fett til muskel og aldersrelatert muskulær atrofi er relatert til myostatin. For eksempel økte det gjennomsnittlige myostatin immunreaktive proteinet i serum med alder i grupper av unge (19-35 år), middelaldrende (36-75 år) og eldre (76-92 år) menn og kvinner mens den gjennomsnittlige muskelmassen og fettfrie masse sank med alder i disse gruppene
(Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). Det har også blitt vist at myostatingen-knockout i mus økte myogenese og minsket adipogenese (Lin et al., Biochem Biophys Res Commun 291 (3):701-6 (2002), noe som førte til voksende mennesker med økt muskelmasse og minsket fettakkumulering og leptinutskilling. Eksempelpeptidlegemer forbedrer forholdet mellom den rene muskelmassen og fett i aldrede mdx- mus som vist nedenfor.
I tillegg har myostatin nå blitt funnet å være uttrykt ved lave nivåer i hjertemuskel og uttrykking er oppregulert etter kardiomyocytter etter infarkt (Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (l):l-9 (1999)). Derfor kan redusering av myostatin nivåer i hjertemuskelen forbedre tilfriskning av hjertemuskel etter infarkt.
Myostatin ser også ut til å påvirke metabolske forstyrrelser inkludert type-2-diabetes, ikke-insulingavhengig diabetes mellitus, hyperglykemi og overvekt. Foreksempel har mangel på myostatin blitt vist å forbedre de overvektige og diabetiske fenotypene i to musemodeller (Yen et al., ovenfor). Det har blitt vist i eksemplene nedenfor at å minske myostatinaktivitet ved å administrere inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse vil minske forholdet mellom fett til muskel i et dyr, inkludert aldrede dyremodeller. Derfor vil en minskning av fettsammensetning ved å administrere inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse forbedre diabetes, overvekt og hyperglykemiske tilstander i dyr.
Økning av muskelmasse ved å redusere myostatinnivåer kan i tillegg forbedre benstyrke og redusere osteoporose og andre degenerative bensykdommer. Det har for eksempel blitt funnet at myostatinmanglende mus viste økt mineralinnhold og tetthet i overarmsbenet hos mus og økt mineralinnhold i både trabekulært og kortikalt ben i regionene der musklene er festet, i tillegg til økt muskelmasse (Hamrick et al., Calcif Tissue Int 71(l):63-8 (2002)).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter og reagenser for å øke muskelmasse i kjøttrasedyr ved å administrere en effektiv dosering av det myostatinbindende middelet til dyret. Siden det modne C-terminale myostatin polypeptidet er identisk i alle arter som er testet, vil myostatinbindende midler være forventet å være effektive for å øke muskelmasse og redusere fett i enhver landbruksmessig viktig art, inkludert kveg, høns, kalkuner og griser.
Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli benyttet alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske midler for å forbedre deres terapeutiske effekter eller minste potensielle bivirkninger. Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse innehar en eller flere ønskelige, men uventede kombinasjoner av egenskaper for å forbedre den terapeutiske verdien til midlene. Disse egenskapene inkluderer økt aktivitet, økt løselighet, redusert degradering, økt halveringstid, redusert toksisitet og redusert immunogenisitet. Dermed er bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige for utvidede behandlingsregimer. I tillegg er egenskapene med hydrofilisitet og hydrofobisitet for forbindelsene ifølge oppfinnelsen vel balanserte for derved å forbedre deres anvendelse for både in vitro- og spesielt in wVo-anvendelser. Spesifikt har forbindelser ifølge oppfinnelsen hensiktsmessig grad av løselighet i vandig medium som tillater absorpsjon og biotilgjengelighet i kroppen, mens de også har en grad av løselighet i lipider som tillater forbindelsen å krysse cellemembranen til et antatt virkningssete, slik som en spesiell muskelmasse.
Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige for å behandle et "individ" eller ethvert dyr inkludert mennesker, når de blir administrert i effektive doseringer i hensiktsmessige preparater.
I tillegg er de myostatinbindende midlene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige for å påvise og kvantifisere myostatin i et antall analyser. Disse analysene er beskrevet i mer detalj nedenfor.
Generelt er bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse nyttige som innfangingsmidler for å binde og immobilisere myostatin i en mengde ulike analyser som er lignende til de som for eksempel er beskrevet i Asai, red. Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993). Bindingsmidlene kan bli market på en eller annen måte eller kan reagere med et tredje molekyl slik som et anti-bindende middelantistoff som er merket for å muliggjøre at myostatin kan bli påvis og kvantitert. For eksempel kan et bindingsmiddel eller et tredje molekyl bli modifisert med en påvisbar enhet, slik som biotin, som dermed kan bli bundet av et fjerde molekyl, slik som enzymmerket streptavidin, eller andre proteiner. (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997)).
Gjennom enhver spesiell analyse kan innkuberings- og/eller vasketrinn være nødvendig etter hver kombinasjon av reagenset. Inkubasjonstrinn kan variere fra omtrent 5 sekunder til flere timer, fortrinnsvis fra omtrent 5 minutter til omtrent 24 timer. Likevel vil innkuberingstiden være avhengig av analyseformatet, volum av løsning, konsentrasjoner og lignende. Vanligvis vil analysene bli utført ved omkringliggende temperatur selv om de kan bli utført i et bredere område med temperaturer.
Ikke- kompetitive bindinasanalvser:
Bindingsanalyser kan være den ikke-kompetitive typen der mengden av innfanget myostatin blir direkte mål. I en foretrukket "sandwich"-analyse kan for eksempel bindingsmiddelet bli bundet direkte til et fast substrat der det blir immobilisert. Disse immobiliserte midlene binder deretter til myostatin som er til stede i testprøven. De immobiliserte myostatin blir deretter bundet med et merkemiddel, slik som et merket antistoff mot myostatin, som kan bli påvist. I en annen foretrukket "sandwich"-analyse kan et andre middel som er spesifikt for bindingsmiddelet bli tilsatt som inneholder en påvisbar enhet, slik som bitoin, og hvilket et tredje merket molekyl kan spesifikt binde, slik som streptavidin (Se Harlow og Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, kap. 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), som er inkorporert herved referanse).
Kompetitive bindinqsanalvser:
Bindingsanalyser kan være av den kompetitive typen. Mengden av myostatin som er til stede i prøven blir målt indirekte ved å måle mengden av myostatin som blir fortrengt eller konkurrert vekk fra et bindingsmiddel ved myostatin som er til stede i prøven. I en foretrukket kompetitiv bindingsanalyse blir en kjent mengde av myostatin, vanligvis merket, tilsatt til prøven og prøven blir deretter brakt i kontakt med bindingsmiddelet. Mengden av merket myostatin som er bundet til bindingsmiddelet er invers proporsjonalt til konsentrasjon av myostatin som er til stede i prøven. (Ved å følge protokollene som for eksempel er funnet i Harlow og Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, kap. 14, s. 579-583, ovenfor).
I en annen foretrukket kompetitiv bindingsanalyse blir bindingsmidlene immobilisert på et fast substrat. Mengden av myostatin som er bundet til bindingsmiddelet kan bli bestemt enten ved å måle mengden av myostatin som er til stede i et myostatin/bindingsmiddel kompleks, eller alternativt ved å måle mengden av gjenværende myostatin som ikke er i kompleks.
Andre bindinqsanalvser
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også Western-blot-fremgangsmåter for å påvise eller kvantifisere tilstedeværelsen av myostatin i en prøve. Teknikken består generelt i å separere prøveproteiner ved hjelp av gelelektroforese på bakgrunn av molekylvekt og overføre proteinene til en hensiktsmessig fast bærer, slik som nitrocellulosefilter, et nylonfilter eller derivatisert nylonfilter. Prøven blir innkubert med bindingsmidlene eller fragmenter derav som binder myostatin og det resulterende komplekset blir påvist. Disse bindingsmidlene kan bli direkte merket eller alternativt bli påvist etterpå ved å benytte merkede antistoffer som spesifikt binder til bindingsmiddelet.
Diagnostiske analyser
Bindingsmidlene eller fragmentene derav ifølge foreliggende oppfinnelse kan være nyttige for diagnose av tilstander eller sykdommer som erkarakterisert vedøkte mengder av myostatin. Diagnostiske analyser for høye nivåer av myostatin inkluderer fremgangsmåter som benytter et bindingsmiddel og et merke for å påvise myostatin i menneskelige kroppsvæsker, ekstrakter av celler eller spesifikke vevsekstrakter. For eksempel kan serumnivåer av myostatin bli målt i et individ over tid for å bestemme starten på muskelsvinn som assosiert med aldring eller inaktivitet, som beskrevet i for eksempel Yaransheski et al., ovenfor. Økte myostatinnivåer ble vist å korrelere med gjennomsnittlig minsket muskelmasse og fettfri masse i grupper av menn og kvinner med økende alder (Yarasheski et al., ovenfor). Bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være nyttig for å overvåke økninger eller minskninger i nivåene av myostatin hos et gitt individ over tid. Bindingsmidlene kan bli benyttet i slike analyser uten eller med modifikasjoner. I en foretrukket diagnostisk analyse vil bindingsmidlene være merket ved å for eksempel koble på et merke eller et reportermolekyl. Et stort utvalg av merker og reportermolekyler er kjent, der noen av disse allerede har blitt beskrevet her. Spesielt er foreliggende oppfinnelse nyttig for diagnose av humane sykdommer.
En mengde ulike protokoller for å måle myostatinproteiner ved å benytte bindingsmidler for myostatin er kjent på området. Eksempler inkluderer enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA), radioimmunoanalyse (RIA) og fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
For diagnostiske applikasjoner i visse utførelsesformer vil bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse typisk være merket med en påvisbar enhet. Den påvisbare enheten kan være enhver som er i stand til å produsere, enten direkte eller indirekte, et påvisbart signal. For eksempel kan den påvisbare enheten være en radioisotop slik som<3>H,<1>4C,32P,3<5>S eller<125>I, en fluorescerende eller kjemiluminescerende forbindelse, slik som fluoresceinisotiocyanat, rodamin eller luciferein, eller et enzym slik som alakalisk fosfatase, p-galaktosidase eller pepperrotperoksidase (Bayer et al., Meth Enz, 184: 138 (1990)).
Farmasøytiske preparater
Farmasøytiske preparater med myostatinbindende midler slik som peptidlegemer som er beskrevet her ligger innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Slike preparater omfatter en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et myostatinbindende middel, fragment, variant eller derivat derav som beskrevet her, en blanding med et farmasøytisk akseptabelt middel. I en foretrukket utførelsesform omfatter farmasøytiske preparater antagonistbindingsmidler som inhiberer myostatin delvis eller fullstendig i blanding med et farmasøytisk akseptabelt middel. Typisk vil de myostatinbindende midlene være tilstrekkelig renset for administrering til et dyr.
Det farmasøytiske preparatet kan inneholde formuleringsmaterialer for å modifisere, opprettholde eller preservere, for eksempel pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farge, isotonisitet, lukt, sterilitet, stabilitet, hastighet for oppløsning eller frigivning, adsorpsjon eller gjennomtrengning for preparatet. Hensiktsmessige formuleringsmaterialer inkluderer, men er ikke begrenset til aminosyrer (slik som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin), antimikrobe midler, antioksidanter (slik som askorbinsyre, natriumsulfitt eller natriumhydrogensulfitt), buffere (slik som borat, bikarbonat, Tris-HCI, citrater, fosfater eller andre organiske syrer), fyllmidler (slik som mannitol eller glysin), chelaterende midler (slik som etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)), kompleksdannende midler (slik som kaffein, polyvinylpyrrolidon, p-syklodekstrin eller hydroksypropyl-p-syklodekstrin), fyllstoffer, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater (slik som glukose, mannose eller dekstriner), proteiner (slik som serumalbumin, gelatin eller immunoglobuliner), fargemidler, smaksmidler og fortynnende midler, emulgatorer, hydrofile polymerer (slik som polyvinylpyrrolidon), lavmolekylærvektspolypeptider, saltdannende motioner (slik som natrium), preserveringsmidler (slik som benzalkoniumklorid, benzosyre, salisylsyre, timerosal, fenetylalkohol, metylparaben, propylparaben, klorheksidin, sorbinsyre eller hydrogenperoksid), løsningsmidler (slik som glyserin, propylenglykol eller polyetylenglykol), sukkeralkoholer (slik som mannitol eller sorbitol), suspensjonsmidler, overflateaktive midler eller fuktgjørende midler (slik som pluroner, PEG, sorbitanestere, polysorbater slik som polysorbat-20, polysorbat-80, triton, trometamin, lecitin, kolesterol, tyloksapal), stabilitetsfremmende midler (sukkrose eller sorbitol), tonisitetsfremmende midler (slik som alkalimetallhalider (fortrinnsvis natrium- eller kaliumklorid, mannitolsorbitol), leveringsvehikler, fortynningsmidler, eksipienser og/eller farmasøytiske adjuvanser.
(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, A.R. Gennaro, red., Mack Publishing Company, 1990).
Det optimale farmasøytiske preparatet vil bli bestemt av en fagperson på området avhengig av for eksempel den påtenkte administreringsmåten, leveringsformatet og ønsket dosering. Se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences ovenfor. Slike preparater kan påvirke den fysiske tilstanden, stabiliteten, hastigheten av in wVo-frigjøring og hastigheten av/7? wVo-fjerning av bindingsmiddelet.
Den primære vehikkelen eller bærere i et farmasøytisk preparat kan være enten vandig eller ikke-vandig i natur. For eksempel kan en passende vehikkel eller bærer være vann for injeksjon, fysiologisk saltløsning eller kunstig cerebrospinal væske, muligens tilsatt med andre materialer som er vanlig i preparater for parenteral administrering. Nøytralt bufret saltoppløsning eller saltoppløsning blandet med serumalbumin er ytterligere eksempler på vehikler. Andre eksempler på farmasøytiske preparater omfatter Tris-buffer på omtrent pH 7,0-8,5 eller acetatbuffer på omtrent pH 4,0-5,5, som ytterligere kan inkludere sorbitol eller et passende substitutt derav. I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan bindingsmiddelpreparatene bli fremstilt for lagring ved å blande det valgte preparatet som har den ønskede grad av renhet med eventuelle formuleringsmidler (Remington's Pharmaceutical Sciences, ovenfor) i formen av en lyofilisert klump eller en vandig løsning. Videre kan bindingsmiddel produktet bli formulert som et lyofilisat ved å benytte hensiktsmessige eksipienser slik som sukkrose.
De farmasøytiske prepartene kan bli valgt for parenteral levering. Alternativt kan prepartene bli valgt for inhalering eller for enteral levering slik som oralt, auralt, oftalmikalt, rektalt eller vaginalt. Fremstillingen av slike farmasøytisk akseptable preparater ligger innenfor kunnskapen på fagområdet.
Formuleringskomponentene foreligger i konsentrasjoner som er akseptable for setet for administrering. For eksempel blir buffere benyttet for å opprettholde preparatet ved fysiologisk pH eller ved lavere pH, typisk innenfor et pH-område på fra omtrent 5 til omtrent 8.
Der parenteral administrering er påtenkt kan de terapeutiske preparatene til anvendelse i oppfinnelsen foreligge i form av en pyrogenfri, parenteralt akseptabel vandig løsning som omfatter det ønskede bindingsmiddelet i en farmasøytisk akseptabel vehikkel. En spesielt passende vehikkel for parenteral injeksjon er sterilt destillert vann der et bindingsmiddel blir formulert som en steril, isoton løsning, som er hensiktsmessig preservert. Nok et annet preparat kan involvere formuleringen av det ønskede molekylet med et middel, slik som injiserbare mikrokuler, bionedbrytbare partikler, polymerforbindelser (polyeddiksyre, polyglykolsyre), kuler eller liposomer, som tilveiebringer den kontrollerte eller opprettholdte frigivelsen av produktet som dermed kan bli levert via en depot-injeksjon. Hyaluronsyre kan også bli benyttet, og dette kan ha effekten av å fremme vedvarende varighet i sirkulasjon. Andre hensiktsmessige måter for å introdusere det ønskede molekylet inkluderer implanterbare legemiddel leveringsinnretninger.
I et annet aspekt kan farmasøytiske formuleringer som er passende til parenteral administrering bli formulert i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologisk kompatible buffere slik som Hank's løsning, Ringer's løsning eller fysiologisk bufret saltløsning. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde stoffer som øker viskositeten til suspensjonen, slik som natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelsene bli fremstilt som hensiktsmessige oljeaktige injeksjonssuspensjoner. Passende lipofile løsningsmidler eller vehikler inkluderer fettoljer, slik som sesamolje eller syntetiske fettsyreestere slik som etyloleat, triglyserider eller liposomer. Ikke-lipid polykationiske aminopolymerer kan også bli benyttet til levering. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde hensiktsmessige stabilisatorer eller midler som øker løseligheten til forbindelsene og tillater fremstilling av svært konsentrerte løsninger. I en annen utførelsesform kan et farmasøytisk preparat bli formulert for inhalering. For eksempel kan et bindingsmiddel bli formulert som et tørt pulver for inhalering. Polypeptid-eller nukleinsyremolekyl inhaleringsløsninger kan også bli formulert med en drivgass for aerosollevering. I nok en annen utførelsesform kan løsninger bli nebuliserte. Pulmonær administrering er ytterligere beskrevet i PCT-søknad nr. PCT/US94/001875, som beskriver pulmonær levering av kjemisk modifiserte proteiner.
Det er også påtenkt at visse formuleringer kan bli administrert oralt. I en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan bindingsmiddelmolekyler som blir administrert på denne måten bli formulert med eller uten de bærerne som er vanlig benyttet i sammensetningen av faste doseringsformer slik som tabletter og kapsler. For eksempel kan en kapsel bli designet for å frigi den aktive delen av formuleringen på det stedet i fordøyelsessystemet der biotilgjengelighet er maksimalisert og presystemisk degradering er minimalisert. Ytterligere midler kan bli inkludert for å fremme absorpsjon av bindingsmiddel molekylet. Fortynningsmidler, smakstilsetninger, vokstyper med lavt smeltepunkt, planteoljer, smøremidler, suspensjonsmidler, tablettoppløsende midler og bindingsmidler kan også bli benyttet.
Farmasøytiske preparater for oral administrering kan også bli formulert ved å benytte farmasøytisk akseptable bærere som er velkjent på fagområdet i doseringer som er passende til oral administrering. Slike bærere gjør de farmasøytiske preparatene i stand til å bli formulert som tabletter, piller, drageer, kapsler, flytende stoffer, geler, siruper, vellinger, suspensjoner og lignende for inntak av pasienten.
Farmasøytiske preparater for oral anvendelse kan bli fremskaffet ved å kombinere aktive forbindelser med faste eksipienser og prosessere den resulterende blandingen av granuler (eventuelt etter oppmaling) for å oppnå tabletter eller dragékjerner. Hensiktsmessige hjelpestoffer kan bli tilsatt hvis ønskelig. Passende eksipienser inkluderer karbohydrat- eller proteinfyllstoffer, slik som sukkere, inkludert laktose, sukkrose, mannitol og sorbitol, stivelse fra mais, hvete, ris, potet eller andre planter, cellulose slik som metylcelluose, hydroksypropylmetylcellulose eller natriumkarboksymetylcellulose, gummier inkludert arabisk gummi og tragant gummi og proteiner slik som gelatin og collagen. Hvis det er ønskelig kan oppløsende eller løseliggjørende midler bli tilsatt, slik som kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar og alginatsyre eller et salt derav, slik som natriumalginat.
Dragékjerner kan bli benyttet sammen med hensiktsmessige belegninger, slik som konsentrerte sukkerløsninger som også kan inneholde arabisk gummi, talkum, polyvinylpyrrolidon, karbopol gel, polyetylenglykol og/eller titandioksid, lakkløsninger og passende organiske løsningsmidler eller løsningsmiddel blandinger. Fargestoffer eller pigmenter kan bli tilsatt til tablettene eller dragébeleggene for produktidentifisering eller for å karakterisere kvantiteten av aktiv forbindelse, dvs. dosering.
Farmasøytiske preparater som kan bli benyttet oralt inkluderer også trykktilpasningskapsler som er laget av gelatin i tillegg til myke, forseglede kapsler lagd av gelatin og et belegningsmiddel, slik som glyserol eller sorbitol. Trykktilpasningskapsler kan inneholde aktive ingredienser blandet med fyllstoffer eller bindingsstoffer slik som laktose eller stivelser, smøremidler slik som talkum eller magnesiumstearat og eventuelt stabilisatorer. I myke kapsler kan de aktive forbindelsene bli løst eller suspendert i passende væsker, slik som fettoljer, flytende eller flytende polyetylenglykol med eller uten stabilisatorer.
Et annet farmasøytisk preparat kan involvere en effektiv mengde av bindingsmiddel i en blanding med ikke-toksiske eksipienser som er hensiktsmessige for fremstillingen av
tabletter. Ved å oppløse tablettene i sterilt vann, eller annen hensiktsmessig vehikkel, kan løsningen bli fremstilt i enhetsdoseform. Passende eksipienser inkluderer, men er ikke begrenset til inerte fortynningsmidler slik som kalsiumkarbonat, natriumkarbonat eller dikarbonat, laktose eller kalsiumfosfat, eller bindingsmidler slik som stivelse, gelatin eller akasie eller smøremidler slik som magnesiumstearat, stearinsyre eller talkum.
Ytterligere farmasøytiske preparater vil være åpenbare for fagfolk på området, inkludert formuleringer som involverer bindingsmiddel molekyler i vedvarende eller kontrollerte leveringsformuleringer. Teknikker for å formulere en mengde andre vedvarende eller kontrollerte leveringsmåter, slik som liposombærere, bionedbrytbare mikropartikler eller porøse kuler og depotinjeksjoner, er også kjent for fagfolk på området. Se for eksempel PCT/US93/00829 som beskriver kontrollert frigjøring av porøse polymermikropartikler for leveringen av farmasøytiske preparater. Ytterligere eksempler på vedvarende frigjørende preparater inkluderer halvgjennomtrengelige polymermatrikser i form av formgitte artikler, for eksempel filmer eller mikrokapsler. Vedvarende frigjøringsmatrikser kan inkludere polyestere, hydrogeler, polylaktider (US 3 773 919, EP 58 481), kopolymerer av L-g I uta min syre og y-etyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983), poly (2-hydroksyetylmetakrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etylenvinylacetat (Langer et al., ovenfor) eller poly-D(-)-3-hydroksysmørsyre (EP 133 988). Vedvarende frigjørende preparater inkluderer også liposomer som kan bli fremstilt ved enhver av flere fremgangsmåter som er kjente på fagområdet. Se for eksempel Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985), EP 36 676, EP 88 046, EP 143 949.
Det farmasøytiske preparatet som skal bli benyttet til in wVo-administrering må typisk være steril. Dette kan bli oppnådd ved filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner. Der preparatet blir lyofilisert, kan sterilisering ved å benytte denne fremgangsmåten bli utført enten før eller etter lyofilisering og rekonstituering. Preparatet til parenteral administrering kan bli lagret i lyofilisert form eller i løsning. I tillegg er parenterale preparater generelt plassert i en beholder som har en steril inngangsåpning, for eksempel en intravenøs løsningspose eller rør som har et gjennomsnittbart segl med en hypoderm injeksjonsnål.
Med en gang det farmasøytiske preparatet har blitt formulert kan de bli lagret i sterile rør som en løsning, suspensjon, gel, emulsjon, faststoff eller et dehydrert eller lyofilisert pulver. Slike formuleringer kan bli lagret enten i en klar-til-bruk form eller i en form (for eksempel lyofilisert) som krever rekonstitusjon før administrering.
I en spesifikk utførelsesform er foreliggende oppfinnelse rettet mot sett for fremstilling av en enkeltdose administreringsenhet. Settene kan hvert inneholde både en første beholder som har et tørket protein og en andre beholder som har en vandig formulering. Også inkludert i omfanget av denne oppfinnelsen er sett som inneholder enkelt kammer og multikammer forhåndsfylte sprøyter (for eksempel væskesprøyter og lyosprøyter).
En effektiv mengde av et farmasøytisk preparat som skal bli benyttet terapeutisk vil for eksempel være avhengig av den terapeutiske konteksten og de terapeutiske målene. En fagperson på området vil sette pris på at de hensiktsmessige doseringsnivåene for behandling dermed vil variere delvis på molekylet som blir levert, indikasjon bindingsmiddelmolekylet blir benyttet for, administreringsmåten og størrelsen (kroppsvekt, kroppsoverflate eller organstørrelse) og tilstanden (alderen og generell helsetilstand) for pasienten. I overensstemmelse med dette kan legen filtrere doseringen og modifisere administreringsmåten for å oppnå den optimale terapeutiske effekten. En typisk dosering kan ligge i området fra omtrent 0,1 mg/kg til opp til omtrent 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor. I andre utførelsesformer kan doseringen strekke seg fra 0,1 mg/kg opp til omtrent 100 mg/kg, eller 1 mg/kg opp til omtrent 100 mg/kg eller 5 mg/kg opp til omtrent 100 mg/kg.
For enhver forbindelse kan den terapeutisk effektive dosen bli beregnet i utgangspunktet enten i cellekultur analyser eller i dyremodeller slik som mus, rotter, kaniner, hunder, griser eller aper. En dyremodell kan også bli benyttet for å bestemme det hensiktsmessige konsentrasjonsområdet og administreringsmåten. Slik informasjon kan derfor bli benyttet for å bestemme nyttige doser og administreringsmåter hos mennesker.
Den eksakte doseringen vil bli bestemt i lys av faktorer som er relatert til individet som krever behandling. Dosering og administrering blir juster for å gi tilstrekkelige nivåer av den aktive forbindelsen eller for å opprettholde den ønskede effekten. Faktorer som kan bli tatt hensyn til inkluderer alvorligheten av sykdomstilstanden, den generelle helsetilstanden til individet, alderen, vekten og kjønnet til individet, tidspunkt og frekvens for administrering, legemiddelkombinasjoner, reaksjons-sensitiviteter og respons ovenfor terapi. Lengevirkende farmasøytiske preparater kan bli administrert hver tredje til fjerde dag, hver uke eller annenhver uke avhengig av halveringstiden og fjerningshastigheten fra kroppen til den spesielle formuleringen.
Hyppigheten av dosering vil være avhengig av de farmakokinetiske parameterne til bindingsmiddel molekylet i formuleringen som blir benyttet. Typisk blir et preparat administrert inntil en dosering er nådd som oppnår den ønskede effekten. Preparatet kan derfor bli administrert som en enkelt dose eller som multiple doser (med den samme eller ved ulike konsentrasjoner/doseringer) overtid, eller som en kontinuerlig infusjon. Ytterligere finjustering av den hensiktsmessige doseringen blir rutinemessig gjort. Hensiktsmessige doseringer kan bli bekreftet via anvendelsen av hensiktsmessige doseresponsdata.
Administreringsmåten for det farmasøytiske preparatet foregår i overensstemmelse med kjente fremgangsmåter, for eksempel oralt, intravenøs injeksjon, intraperitonealt, intracerebralt (intraparenchymalt), intracerebroventrikulært, intramuskulært, intraokkulart, intraarterielt, intraportalt, intralesionalt, intramedulært, intratekalt, intraventrikulært, transdermalt, subkutant, intraperitonealt, intranasalt, enteralt, topisk, sublingvalt, ureteralt, vaginalt eller rektalt, ved vedvarende frigjørende systemer eller med implanteringsinnretninger. Der det er ønskelig kan preparatene bli administrert ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig ved infusjon eller ved implantatinnretninger.
Alternativt eller i tillegg kan preparatet bli administrert lokalt via implantering av en membran, svamp eller annet hensiktsmessig materiale på hvilket det ønskede molekylet har blitt absorbert eller innkapslet. Der en implanteringsinnretning har blitt benyttet kan innretningen bli implantert i ethvert passende vev eller organ, og levering av det ønskede molekylet kan være via diffusjon, tidsfrigjørende bolus eller kontinuerlig administrering.
I noen tilfeller kan det være ønskelig å benytte farmasøytiske preparater på en ex wVo-måte. I slike tilfeller blir celler, vev eller organer som har blitt fjernet fra pasienten utsatt for de farmasøytiske preparatene og etter dette blir cellene, vevene og/eller organene implantert tilbake i pasienten.
I andre tilfeller kan et bindingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse slik som et peptidlegeme bli levert ved å implantere visse celler som har blitt genetisk endret ved å benytte fremgangsmåter slik som de som er beskrevet her for å utrykke og utfylle polypeptidet. Slike celler kan være dyreceller eller humane celler og kan være autologe, heterologe eller xenogene. Eventuelt kan cellene være blitt gjort udødelige. For å minske muligheten for en immunologisk respons kan cellene bli innkapsler for å unngå infiltrering av omkringliggende vev. Innkapslingsmaterialene er typisk biokompatible, halvgjennomtrengelige polymere innkapslinger eller membraner som tillater frigjøringen av proteinproduktene, men som forhindrer ødeleggelsen av cellene ved pasientens immunsystem eller ved andre skadelige faktorer fra de omkringliggende vev.
Farmasøytiske preparater som inneholder bindingsmidlene ifølge foreliggende oppfinnelse blir administrert til et individ for å behandle enhver myostatinrelatert forstyrrelse. Disse inkluderer muskelsvinn forstyrrelser, inkludert, men ikke begrenset til muskulær dystrofi, muskelsvinn ved kreft, AIDS, muskelatrofi, reumatoid artritt, nyresvikt/uremi, kronisk hjertesvikt, forlenget sengeligge, ryggmargsskade, slag og aldringsrelatert sarkopeni. I tillegg blir disse preparatene administrert for å behandle overvekt, diabetes, hyperglykemi og for å øke bentetthet.
Oppfinnelsen har blitt beskrevet og de følgende eksemplene er fremlagt for illustrasjon og ikke for å begrense.
Eksempel 1
Identifisering av myostatinbindende peptider
Tre filamentøse fag-biblioteker, TN8-IX (5X10<9>uavhengige transformanter), TN12-I (1,4X10<9>uavhengige transformanter) og lineær (2,3X10<9>uavhengige transformanter)
(Dyax Corp.) ble benyttet for å selektere for myostatinbindende fag. Hvert bibliotek ble innkubert på myostatin belagte overflater og utsatt for ulike panoreringsbetingelser: ikke-spesifikk eluering og spesifikk eluering ved å benytte rekombinant, human aktivinreseptor IIB/Fc-kimere (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) eller myostatin propeptid eluering som beskrevet nedenfor. For alle tre biblioteker ble fagene eluert på en ikke-spesifikk måte i den første runden av seleksjon, mens reseptoren og promyostatin ble
benyttet i den andre og tredje runden med seleksjon. Seleksjonsprosedyrene ble utført som beskrevet nedenfor.
Fremstilling av myostatin
Myostatin protein ble fremstilt rekombinant i E. co//'-K-12-stamme 2596 (ATCC 202174) på følgende måte. Polynukleotider som koder for det humane promyostatinmolekylet ble klonet inn i pAMG21-ekspresjonsvektoren (ATCC nr. 98113) som var avledet fra ekspresjonsvektoren pCFM1656 (ATCC nr. 69576) og ekspresjonsvektorsystemet som er beskrevet i US patentnr. 4 710 473, ved å følge prosedyren som er beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 00/24782. Polynukleotidet som koder for promyostatin ble fremskaffet fra en pattedyr ekspresjonsvektor. Den kodende regionen ble amplifisert og benyttet i en standard PCR-fremgangsmåte og følgende PCR-primerne til å introdusere restriksjonssetet for Ndel og BamHI. 5' primeren: 5 '-G AG AG AG AGC ATATG AATG AG A AC AGTG AGC A AAAAG - 3' (Sekv. Id. Nr. 292).
3'primer: 5'-AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC-3' (Sekv. Id. Nr. 293).
PCR-produktet og vektoren ble fordøyd med begge enzymer, blandet og ligert. Produktet av ligeringen ble transformert inn i E. co//'-stammen 2596. Enkle kolonier ble sjekket under mikroskop for rekombinant proteinutvikling i form av inklusjonslegemer. Plasmidet ble isolert og sekvensert gjennom den kodende regionen av det rekombinante genet for å bekrefte genetisk kvalitet.
Bakterievelling ble generert fra en 10 I fermentering ved å benytte en ladningsfremgangsmåte ved 37°C. Kulturen ble indusert med HSL ved en celletetthet på 9,6 OD60oog høstet 6 timer senere ved en tetthet på 104 OD6oo- Vellingen ble lagret ved -80°C. E. co//'-velling som uttrykker promyostatin ble lysert i en mikrofluidiserer ved 16 000 psi, sentrifugert for å isolere den uløselige inklusjonslegemefraksjonen. Inklusjonslegemer ble resuspendert i guanidinhydroklorid inneholdende ditiotreitol og løseliggjort ved romtemperatur. Dette ble deretter fortynnet 30 ganger i en vandig buffer. Det refoldede promyostatin ble deretter konsentrert og byttet buffer på til 20 mM Tris pH 8,0 og påsatt på en anion bytterkolonne. Anion bytterkolonnen ble eluert med en økende natriumklorid gradient. Fraksjonene som inneholdt promyostatin ble slått sammen. Promyostatin fremstilt i E. coli mangler de første 23 aminosyrene og begynner med et metionin før residiet 24 som er asparagin. For å fremstille modent myostatin ble sammenslått promyostatin enzymatisk kløyvd mellom propeptidet og den modne myostatin C-terminal. Den resulterende blandingen ble deretter påsatt på en C4-rpHPLC-kolonne ved å benytte en økende gradient av acetonitril inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre. Fraksjoner inneholdende modent myostatin ble slått sammen og tørket i en SpeedVac.
Det rekombinante, modne myostatinet som ble fremstilt fra E. coli ble testet i den myoblast-C2C12-baserte analysen beskrevet nedenfor og funnet å være fullt aktiv sammenlignet med rekombinant, murint, myostatin som kommersielt er fremstilt i et pattedyr cellesystem (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota). Det E. co//'-produserte, modne myostatinet ble benyttet i fagdisplay- og screeningsanalyser beskrevet nedenfor.
Fremstilling av mvostatinbelaqte rør
Myostatin ble immobilisert på 5 ml Immuno-Tubes (NUNC) ved en konsentrasjon på 8 ug myostatin protein i 1 ml 0,1 M natriumkarbonatbuffer (pH 9,6). Det myostatin belagte immunorøret ble innkubert med risting i en 1 time ved romtemperatur. Myostatinbelagte immunorør ble deretter blokkert ved å tilsette 5 ml med 2 % melk-PBS og innkubert ved romtemperatur 1 time ved rotering. Det resulterende myostatinbelagte immunorøret ble deretter vasket 3 ganger med PBS før det ble utsatt for seleksjonsprosedyrene. Ytterligere immunorør ble også fremstilt for negative seleksjoner (uten myostatin). For hver panoreringsbetingelse ble 5-10 immunorør utsatt for prosedyren ovenfor, bortsett fra at immunorørene ble belagte med 1 ml 2% BSA-PSB istedenfor myostatin protein.
Negativ seleksjon
I hver panoreringsbetingelse ble omtrent 100 tilfeldige bibliotekekvivalenter for TN8-IX og TN12-I-biblioteker (5X10<11>pfu forTN8-IX og 1,4X10" pfu forTN12-I) og omtrent 10 tilfeldige bibliotekekvivalenter for det lineære biblioteket (2,3X10<10>pfu) tatt ut fra bibliotek forrådsløsningen og fortynnet til 1 ml med PBST (PBS med 0,05% Tween-20). Den 1 ml med fortynnet bibliotek forrådsløsning ble tilsatt til et immunorør som var klargjort for den negative seleksjon og innkubert i 10 minutter ved romtemperatur med risting. Fag supernatanten ble fjernet og tilsatt til det andre immunorøret for et annet negativt seleksjonstrinn. På denne måten ble 5-10 negative seleksjonstrinn utført.
Seleksjon for mvostatinbindino
Etter det siste negative seleksjonstrinnet ovenfor ble fag supernatanten tilsatt til de klargjorte myostatinbelagte immunorørene. Immunorøret ble innkubert med risting i 1 time ved romtemperatur for å tillate spesifikke fag å binde til myostatin. Etter at supernatanten var fjernet ble immunorøret vasket omtrent 15 ganger med 2% melk-PBS, 10 ganger med PBST og to ganger med PBS for de tre rundene med seleksjon med alle tre biblioteker (TN8-IX, TN 12-1 og lineære biblioteker) bortsett fra at i den andre runden med seleksjoner med TN8-IX- og TN12-I-biblioteker ble immunorøret vasket omtrent 14 ganger med 2% melk-PBS, to ganger med 2% BSA-PBS, 10 ganger med PBST og en gang med PBS.
Uspesifikk eluering
Etter det siste vasketrinnet ble de bundne fagene eluert fra immunorøret ved å tilsette 1 ml 100 mM trietylamin løsning (Sigma, St. Louis, Missouri) med 10-minutters innkubering med risting. pH i den fag-inneholdende løsningen ble deretter nøytralisert med 0,5 ml IM Tris-HCI (pH 7,5).
Reseptor ( Human aktivinreseptoiO- eluerinq av bundne fag
I runde 2 og 3 etter det siste vasketrinnet ble de bundne fagene eluert fra immunorøret ved å tilsette 1 ml med 1 nM reseptorprotein (rekombinant human aktivinreseptor IIB/Fc-kimere, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) med en 1-times innkubering for hver betingelse.
Propeptid eluering av bundne fag
I runde 2 og 3 etter det siste vasketrinnet ble de bundne fagene eluert fra immunorøret ved å tilsette 1 ml med 1 nM propeptidprotein (fremstilt som beskrevet ovenfor) med en 1-times innkubering for hver betingelse.
Fag- amplifisering
Frisk E. coli (XL-1 Blue MRF)-kultur ble dyrket til OD600= 0,5 i LB-medium inneholdende 12,5 ug/ml tetrasyklin. For hver panneringsbetingelse ble 20 ml av denne kulturen avkjølt på is og sentrifugert. Bakteriepelleten ble resuspendert i 1 ml med min-A-saltløsningene.
Hver blanding fra ulike elueringsfremgangsmåter ble tilsatt til en konsentrert bakterieprøve og innkubert ved 37°C i 15 minutter. 2 ml NZCYM-medium (2x NZCYM, 50 ug/ml ampicillin) ble tilsatt til hver blanding og innkubert ved 37°C i 15 minutter. Den resulterende 4 ml løsningen ble platet på en stor NZCYM-agarplate inneholdende 50 ug/ml ampicillin og innkubert over natt ved 37°C.
Hver av bakterie/fag-blandingene som ble dyrket over natt på en stor NZCYM-agarplate ble skrapet av i 35 ml LB-medium og agarplaten ble ytterligere skylt med ytterligere 35 ml LB-medium. Den resulterende bakterie/fag-blandingen i LB-medium ble sentrifugert for å kunne fjerne bakterien som en pellet. 50 \ i\ av fag-supernatanten ble påført til et rent rør og 12,5 ml PEG-løsning (20% PEG8000, 3,5M ammoniumacetat) ble tilsatt og innkubert på is i 2 timer for å presipitere fag. Det presipiterte fagene ble sentrifugert ned og resuspendert i 6 ml av fag-resuspensjonsbufferen (250 mM NaCI, 100 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Denne fag-løsningen ble ytterligere renset ved å sentrifugere vekk de gjenværende bakterier og presipitere fagene på nytt ved å tilsette 1,5 ml med PEG-løsningen. Etter et sentrifugeringstrinn ble fag-pelleten resuspendert i 400 ul PBS. Denne løsningen ble utsatt til en siste sentrifugering for å kvitte seg med gjenværende bakterieavfall. Det resulterende fag-preparatet ble titrert med en standard plakkdannelses analyse (Molecular Cloning, Maniatis et al., 3. utgave).
Ytterli<g>ere runder med seleksjon oo am<p>lifiserin<g>
I den andre runden ble de amplifiserte fagene (10<11>pfu) fra den første runden benyttet som utgangsfag for å utføre seleksjon- og amplifiseringstrinnet. De amplifiserte fagene (IO<11>pfu) fra den andre runden ble i sin tur benyttet som utgangsfag for å utføre en tredje runde med seleksjon og amplifisering. Etter elueringstrinnene i den tredje runden ble en liten fraksjon av de eluerte fagene platet ut som i plakkdannelsesanalysen ovenfor. Individuelle plakk ble plukket og plassert i 96-brønners mikrotiterplater inneholdende 100 ul TE-buffer i hver brønn. Disse utgangsplatene ble innkubert ved 4°C over natt for å tillate fag å el uere inn i TE-bufferen.
Klonanalyse
Faa- ELISA
Fag-klonene ble utsatt for fag-ELISA og deretter sekvensert. Sekvensene ble rangert som diskutert nedenfor.
Fag-ELISA ble utført på følgende måte. En E. coli XL-l-Blue MRF' kultur ble dyrket inntil OD60onådde 0,5. 30 ul av denne kulturen ble fordelt i hver brønn på en 96-brønners mikrotiterplate. 10 ul av eluert fag ble tilsatt til hver brønn og tillatt å infisere bakterier i 15 minutter ved romtemperatur. Omtrent 120 ml med LB-medium inneholdende 12,5 ug/ml tetrasyklin og 50 ug/ml ampicillin ble tilsatt til hver brønn. Mikrotiterplaten ble deretter innkubert med risting over natt ved 37°C. Myostatin protein (2 ug/ml i 0,1 M natriumkarbonat buffer, pH 9,6) ble tillatt å belegges på en 96-brønners Maxisorp-plate (NUNC) over natt ved 4°C. Som en kontroll ble en separat Maxisorp-plate belagt med 2% BSA tillaget i PBS.
På den følgende dagen ble væske i de proteinbelagte Maxisorp-platene fjernet, vasket tre ganger med PBS og hver brønn ble blokkert med 300 \ i\ 2% melkeløsning ved romtemperatur i 1 time. Melkeløsningen ble fjernet og brønnene ble vasket tre ganger med PBS-løsningen. Etter det siste vasketrinnet ble omtrent 50 ul PBST-4% melk tilsatt til hver brønn på de proteinbelagte Maxisorp-platene. Omtrent 50 ul av overnatt kulturer fra hver brønn i 96-brønners mikrotiterplater ble overført til de tilsvarende brønnene på de myostatinbelagte platene i tillegg til kontrollplatene belagt med 2% BSA. 100 \ i\ blandingen i de to utgavene av plater ble innkubert i 1 time ved romtemperatur. Væsken ble fjernet fra Maxisorp-platene og brønnene ble vasket omtrent tre ganger med PBST etterfulgt av to ganger med PBS. Det HRP-konjugerte anti-M13-antistoffet (Amersham Pharmacia Biotech) ble fortynnet til omtrent 1:7 500 og 100 ul av den fortynnede løsningen ble tilsatt til hver brønn på Maxisorp-platene i 1 time ved romtemperatur. Væsken ble igjen fjernet og celle ble vasket omtrent tre ganger med PBST etterfulgt av to ganger med PBS. 100 ul med LumiGlo kjemiluminiscerende substrat (KPL) ble tilsatt til hver brønn til Maxisorp-platene var innkubert i omtrent 5 minutter for å få reaksjonen til å skje. Kjemiluminiscensenheten på Maxisorp-platene ble avlest på en plateavleser (Lab System).
Sekvenserin<g>av faa- kloner
For hver fag-klon ble sekvenseringstemplatet klargjort ved hjelp av en PCR-fremgangsmåte. Det følgende oligonukleotidpar ble benyttet for å amplifisere et 500 nukleotid fragment:
Den følgende blandingen ble klargjort for hver klon.
En termosykler (GeneAmp PCR Systems 9700, Applied Biosystem) ble benyttet for å kjøre det følgende program: [94°C i 5 min, 94°C i 30 sek., 55°C i 30 sek, 72°C i 45 sek.] x 30 sykluser; 72°C i 7 min, avkjølt til 4°C. PCR-produktet fra hver reaksjon ble renset opp ved å benytte QIAquick Multiwell PCR rensesettet (Qiagen) ved å følge produsentens protokoll. De rensede PCR-produktene ble sjekket ved å kjøre 10 ul av hver PCR-reaksjonsblanding med 1 ul fargestoff (10X BBXS agarosegel påsetningsfargestoff) på en 1% agarosegel. Det gjenværende produktet ble deretter sekvensert ved å benytte ABI 377 sekvensmaskinen (Perkin Eimer) ved å følge produsentens anbefalte protokoll.
Sekvensranaerina oa analyse
Peptidsekvensene som ble translatert fra nukleotidsekvensene ble korrelert med ELISA-data. Klonene som viste høye kjemiluminiscensenheter i de myostatinbelagte brønnene og lave kjemiluminiscensenheter i de 2 % BSA-belagte brønnene ble identifisert. Sekvensene som forekom flere ganger ble identifisert. Kandidatsekvenser som er valgt basert på disse kriteriene ble utsatt for ytterligere analyse som peptidlegemer. Omtrent 1 200 individuelle kloner ble analysert. Av disse ble omtrent 132 peptider valgt for å fremstille peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse er vist i Tabell I nedenfor. Peptidene som har SEKV. ID. NR. 1 til 129 ble benyttet for å fremstille peptidlegemer av samme navn. Peptidene som har SEKV. ID. Nr. 130-141 vist i Tabell I omfatter to eller flere peptider fra SEKV. ID. NR. 1 til 132 bundet med en linkersekvens. SEKV. ID. NR. 130-141 ble også benyttet for å fremstille peptidlegemer av samme navn.
Konsensussekvenser ble bestemt for den TN-8-avledede gruppen av peptider. Disse er som følger:
For alle konsensussekvensene ovenfor er de understrekede "kjernesekvensene" fra hver konsensussekvens aminosyren som alltid forekommer i denne posisjonen. " X" refererer til enhver naturlig forekommende eller modifisert aminosyre. De to cysteinene som ligger inne i kjernesekvensene var faste aminosyrer i TN8-IX-biblioteket.
Eksempel 2
Fremstilling av peptidlegemer
Konstruerinq av DNA som koder for peptid- Fc- fusionsproteiner
Peptider som er i stand til å binde myostatin ble benyttet alene eller i kombinasjon med hverandre for å konstruere fusjonsproteinet der et peptid ble fusjonert til Fc-domenet i humant IgGl. Aminosyresekvensen til Fc-delen i hvert peptidlegeme er som følger (fra aminoterminal til karboksyterminal):
Peptidet ble fusjonert i N-konfigurasjonen (peptid ble bundet til N-terminalen på Fc-regionen), C-konfigurasjonen (peptid ble bundet til C-terminalen på Fc-regionen) eller en
N,C-konfigurasjonen (peptid ble bundet både på N- og C-terminalen på Fc-regionen). Separate vektorer ble benyttet for å uttrykke N-terminale fusjoner og C-terminale fusjoner. Hvert peptidlegeme ble konstruert ved å anneale par av oligonukleotider ("oligoer") til den valgte fagnukleinsyren for å fremstille en dobbelttrådet nukleotidsekvens som koder for peptidet. Disse polynukleotidmolekylene ble konstruert som ApaL- til X/joJ-fragmenter. Fragmentene ble ligert inn i enten den pAMG21-Fc-N-terminale vektoren for den N-terminale orienteringen eller den pAMG21-Fc-C-terminale vektoren forden C-terminale orienteringen som tidligere hadde blitt fordøyd med ApaLI og Xhol. De resulterende ligeringsblandingene ble transformert ved elektroporering inn i E. co//'-stammen 2596 eller 4167-celler (en hsdR- variant av stamme 2596-celler) ved å benytte standard prosedyrer. Klonene ble screenet for evnen til å produsere det rekombinante protein produktet og for å inneha genfusjon som har en korrekt nukleotidsekvens. En enkelt slik klon ble valgt for vert av de modifiserte peptidene.
Mange av konstruksjonene ble dannet ved å benytte en alternativ vektor betegnet pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc. Denne vektoren er tilsvarende til den ovenfor beskrevne vektoren bortsett fra at vektorfordøyingen ble utført med BsmBI. Noen konstruksjoner fusjonerte peptidsekvenser på begge ender av Fc. I disse tilfellene var vektoren en blanding av pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc og pAMG21-2xBs-C-Fc.
Konstruksjon av pAMG21
Ekspresjonsplasmid PAMG21 (ATCC nr. 98113) er avledet fra ekspresjonsvektoren pCFM1656 (ATCC nr. 69576) og ekspresjonsvektorsystemet beskrevet i US patentnr. 4 710 473 ved å følge prosedyren som er beskrevet i internasjonal patentsøknad WO 00/24782, der alle disse er inkorporert her ved referanse.
Fc- N- terminal vektor
Den Fc-N-terminale vektoren ble konstruert ved å benytte pAMG21-Fc-Gly5-Tpo-vektoren som templat. En 5' PCR-primer (nedenfor) ble designet for å fjerne Tpo-peptidsekvensen i pAMG-Tpo-Gly 5 og erstatte den med en polylinker inneholdende ApaLI-og Xhol- seter. Ved å benytte denne vektoren som et templat ble PCR utført med "Expand Long Polymerase" ved å benytte den følgende 5' primeren og en universell 3' primer:
Det resulterende PCR-produktet ble gelrenset og fordøyd med restriksjonsenzymene Ndel og BsrGI. Både plasmidet og polynukleotidet som koder for peptidet av interesse sammen med sin linker ble gelrenset ved å benytte Qiagen (Chatsworth, CA) gelrense spin-kolonner. Plasmidet og innskuddet ble deretter ligert ved å benytte standardligeringsprosedyrer og den resulterende ligeringsblandingen ble transformert inn i E. co//'-celler (stamme 2596). Enkeltkolonier ble valgt og DNA-sekvensering ble utført. En korrekt klon ble identifisert og denne ble benyttet som en vektorkilde for de modifiserte peptidene som er beskrevet her.
Konstruerinq av Fc- C- terminalvektor
Den Fc-C-terminale vektoren ble konstruert ved å benytte pAMG21-Fc_Gly5_Tpo-vektor som et templat. En 3' PCR-primer ble designet for å fjerne Tpo-peptidsekvensen og erstatte den med en polylinker inneholdende ApaLI- og Xhol- seter. PCR ble utført med "Expand Long Polymerase" ved å benytte en universell 5' primer og 3' primeren.
Det resulterende PCR-produktet ble gelrenset og fordøyd med restriksjonsenzymene BsrGI og BamHl. Både plasmidet og polynukleotidet som koder for hvert av peptidene av interesse med sine linkere ble gelrenset med Qiagen-gelrensespinnkolonner. Plasmidet og innskuddet ble deretter ligert ved å benytte standard ligeringsprosedyrer og den resulterende ligeringsblandingen ble transformert inn i E. coli (stamme 2596) celler. Stamme 2596 (ATCC 202174) er en stamme av E. coli K-12 som er modifisert slik at den inneholder lux-promoteren og to A.-temperatursensitive repressorer, cI857s7- og lac IQ<->repressoren. Enkeltkolonier ble valgt og DNA-sekvensering ble utført. En korrekt klon ble identifisert og benyttet som en kilde for hvert peptidlegeme beskrevet her.
Uttrvkkinq i E . coli
Kulturer av hver av pAMG21-Fc-fusjonskonstruksjoner i E. co//'-stamme 2596 ble dyrket ved 37°C i Terrific Broth medium (Se Tartof og Hobbs, "Improved media for growing plasmid and cosmid clones", Bethesda Research Labs Focus, volum 9, s. 12, 1987, sitert i tidligere nevnte Sambrook et al.). Induksjon av genproduktuttrykking fra lux PR-promoteren ble oppnådd etter tilsetningen av den syntetiske autoindusereren, N-(3-oksoheksanoyl)-DL-homoserinlakton, til kulturmediet til en sluttkonsentrasjon på 20 nanogram per milliliter (ng/ml). Kulturer ble innkubert ved 37°C i ytterligere 6 timer. Bakteriekulturene ble deretter undersøkt med mikroskop for tilstedeværelse av inklusjonslegemer og samlet ved sentrifugering. Refraktile inklusjonslegemer ble observert i induserte kulturer, noe som tyder på at Fc-fusjonene mest sannsynlig ble produsert i den uløselige fraksjonen i E. coli. Cellepelleter ble lysert direkte ved resuspensjon i Laemmli-prøvebuffer inneholdende 10% p-merkaptoetanol og deretter analysert ved hjelp av SDS-PAGE. I de fleste tilfeller ble et intenst, coomassiefarget bånd av passende molekylvekt observert på en SDS-PAGE-gel.
Folding oa rensing av peptidlegemer
Celler ble knust i vann (1/10 volum per volum) ved hjelp av høytrykks homogenisering (3 kjøringer ved 15 000 PSI) og inklusjonslegemer ble høstet ved hjelp av sentrifugering (4000 RPM i J-6B i 30 minutter). Inklusjonslegemer ble løseliggjort i 6M guanidin, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,0 i 1 time ved et forhold på 1/10 ved omkringliggende temperatur. Den løseliggjorte blandingen ble fortynnet 25 ganger i 4 M urea, 20% glyserol, 50 mM Tris, 160 mM arginin, 3 mM cystein, 1 mM cystamin, pH 8,5. Blandingen ble innkubert over natt i kalde omgivelser. Blandingen ble deretter dialysert mot 10 mM Tris pH 8,5, 50 mM NaCI, 1,5 M urea. Etter en dialyse over natt ble pH i dialysatet justert til pH 5 med eddiksyre. Presipitatet ble fjernet ved hjelp av sentrifugering og supernatanten ble satt på en SP-Sepharose-Fast-Flow-kolonne balansert i 10 mM NaAc, 50 mM NaCI, pH 5, 4°C. Etter påsetting ble kolonnen vasket til baselinje med 10 mM NaAc, 50 mM NaCI, pH 5,2. Kolonnen ble utviklet med en 20-kolonners volumgradient fra 50 mM til -500 mM NaCI i acetatbufferen. Alternativt, etter vasken til baselinjen, ble kolonnen vasket med 5 kolonnevolumer med 10 mM natriumfosfat pH 7,0 og kolonnen utviklet med en 15-kolonners volumgradient fra 0-400 mM NaCI i fosfatbuffer. Kolonnefraksjoner ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Fraksjoner som inneholdt dimert peptidlegeme ble slått sammen. Fraksjoner ble også analysert ved hjelp av gelfiltrering for å bestemme om noen aggregater var tilstede.
Et antall peptidlegemer ble fremstilt fra peptidene i Tabell 1. Peptidene ble bundet til det humane IgGl Fc-molekylet for å danne peptidlegemene i Tabell II. Når det gjelder peptidlegemene i Tabell II indikerer C-konfigurasjonen at peptidet som ble navngitt var bundet på C-terminalen til Fc. N-konfigurasjonen indikerer at peptidet som ble navngitt var bundet på N-terminalene til Fc. N,C-konfigurasjonen indikerer at et peptid var bundet på N-terminalene og et på C-terminalen til hvert Fc-molekyl. 2x-betegnelsen indikerer at de to peptidene som ble navngitt var bundet i tandem til hverandre og også bundet på N- eller C-terminalene, eller begge N,C på Fc, atskilt med linkeren som er indikert. To peptider bundet i tandem atskilt med en linker er indikert for eksempel som Myostatin-TN8-29-19-8g, som indikerer at TN8-29-peptid er bundet via en (gly)8-linker til TN8-19-peptid. Peptidet/peptidene ble bundet til Fc via en (gly)5-linkersekvens hvis ikke annet er spesifisert. I noen tilfeller ble peptidet/peptidene bundet via en k-linker. Linkeren som var betegnet k eller lk refererer til gsgsatggsgstassgsgsatg (Sekv. Id. Nr. 301)-linksersekvensen, der kc refererer til linkeren som er bundet til C-terminalen på Fc og kn refererer til linkeren som er bundet til N-terminalen på Fc. I Tabell II nedenfor refererer kolonne 4 til linkersekvensen som binder Fc sammen med det første peptidet og den femte kolonne refererer til konfigurasjonen N eller C eller begge.
Siden Fc-molekylet dimeriseres i løsning vil et peptidlegeme som er konstruert slik at man får et peptid faktisk være en dimer med to kopier av peptidet og to Fc-molekyler, og 2X versjonen som har to peptider i tandem vil faktisk være en dimer med fire kopier av peptidet og to Fc-molekyler.
Siden peptidlegemene som er gitt i Tabell II er uttrykt i E. coli, er den første
aminosyreresidien Met (M). Derfor er peptidlegemet i N-konfigurasjonen Met-peptid-linker-Fc eller for eksempel Met-peptid-linker-peptid-linker-Fc. Peptidlegemer i C-konfigurasjonen er arrangert som Met-Fc-linker-peptid eller for eksempel Met-Fc-linker-peptid-linker-peptid. Peptidlegemer i C,N-konfigurasjonen er en kombinasjon av begge, for eksempel Met-peptid-linker-Fc-linker-peptid.
Nukleotidsekvenser som koder for eksempel peptidlegemer er tilveiebrakt nedenfor i Tabell II. Polynukleotidsekvensene som koder for et eksempel peptidlegeme ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer en nukleotidsekvens som koder for Fc-polypeptidsekvensen slik som den følgende:
I tillegg er polynukleotidene som koder for ggggg-linkeren slik som den følgende inkludert:
Polynukleotidet som koder for peptidlegemet inkluderer også kodonet som koder for metioninet ATG og et stoppkodon slik som TAA.
Derfor er strukturen til det første peptidlegemet i Tabell II TN8-Conl med en C-konfigurasjon og (gly)5-linker som følger: M-Fc-GGGGG-KDDCKMWHWMCKPP (Sekv. Id. Nr. 303). Eksempel-polynukleotider som koder for dette peptidlegemet vil være:
Eksempel 3
In wtro-analyse
C2C12- cellebasert myostatin aktivitetsanalvse
Denne analysen viser den myostatinnøytraliserende enden til inhibitoren som blir testet ved å måle i hvilket omfang binding av myostatin til dens reseptor blir inhibert.
En myostatinresponsiv reportercellelinje ble generert ved transfeksjon av C2C12-myoblastceller (ATCC nr. CRL-1772) med en pMARE-luc-konstruksjon. pMARE-luc-konstruksjonen ble fremstilt ved å klone 12 repetisjoner av CAGA-sekvensen som representerer myostatin/aktivin-responselementene (Dennler et al. EMBO 17:3091-3100
(1998)) inn i en pLuc-MCS-reportervektor (Stratagene kat.nr. 219087) oppstrøms for TATA-boksen. Myoblast-C2C12-cellene uttrykker naturlig myostatin/aktivin reseptorer på sin celleoverflate. Når myostatin binder til cellereseptorene blir Smad-veien aktivert og fosforylert Smad binder til responselementet (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), noe som fører til utviklingen av luciferasegenet. Luciferaseaktivitet blir deretter målt ved å benytte et kommersielt luciferase-reporteranalysesett (kat.nr. E4550, Promega, Madison, WI) i overensstemmelse med produsentens protokoll. En stabil linje med C2C12-celler som hadde blitt transfektert med pMARE-luc (C2C12/pMARE klon 44) ble benyttet for å måle myostatinaktivitet i henhold til den følgende prosedyren.
Et likt antall av reportercellene (C2C12/pMARE klon 44) ble platet på 96-brønners kulturer. En første runde screening ved å benytte to fortynninger av peptidlegemet ble utført med myostatinkonsentrasjonen satt til 4 nM. Rekombinant, modent myostatin ble preinnkubert i 2 timer ved romtemperatur med peptidlegemer med henholdsvis 40 nM og 400 nM. Reportercellekulturen ble behandlet med myostatinet med eller uten peptidlegemer i 6 timer. Myostatinaktivitet ble målt ved å bestemme luciferaseaktiviteten i de behandlede kulturene. Denne analysen ble benyttet for i utgangspunktet å identifisere peptidlegemetreff som inhiberte myostatinsignaliseringsaktiviteten i re po rte ra na lysen. Etter hvert ble en 9-punkts titreringskurve generert med myostatinkonsentrasjonen fastsatt til 4 nM. Myostatinet ble preinnkubert med hver av de følgende ni konsentrasjonene av peptidlegemer: 0,04 mM, 0,4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM, 2 nM og 4 nM i 2 timer før blandingen ble tilsatt til reportercellekulturen. IC50-verdiene for et antall eksempelpeptidlegemer er tilveiebrakt i Tabell III og for affinitetsmodnede peptidlegemer i Tabell VIII.
BIAcore- analvse
En affinitetsanalyse av hvert kandidat myostatin peptidlegeme utført på et BIAcore-3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ)-apparat ved å benytte sensorbrikke CM5 og 0,005 % P20-overflateaktivt middel (Biacore, Inc.) som kjørebuffer. Rekombinant, modent myostatin protein ble immobilisert til en forskningsgrad-CM5-sensorbrikke (Biacore, Inc.) via primære amingrupper ved å benytte aminkoblingssettet (Biacore, Inc.) i henhold til produsentens foreslåtte protokoll.
Direkte bindingsanalyse ble benyttet for å screene og rangere peptidlegemene etter deres evne til å binde til immobilisert myostatin. Bindingsanalyse ble utført ved injeksjon av to konsentrasjoner (40 og 400 nM) av hvert kandidat myostatinbindende peptidlegeme til den immobiliserte myostatinoverflaten med en strømningshastighet på 50 ul/min i 3 minutter. Etter en dissosieringstid på 3 minutter ble overflaten regenerert. Bindingskurver ble sammenlignet kvalitativt for bindingssignalintensitet i tillegg til for dissosieringshastigheter. Bindingskinetiske parametere for peptidlegemet inkludert ka (assosierings hastighetskonstant), kd(dissosierings hastighetskonstant) og KD(dissosierings likevekts kon stant) ble bestemt ved å benytte BIA-evaluerings-programvaren 3.1 (Biacore, Inc.). Jo lavere dissosierings likevektskonstantene er (uttrykt i nM), jo høyere er affiniteten til peptidlegemet for myostatin. Eksempler på KD-verdier for peptidlegemet er vist i Tabell III og Tabell VI for affinitetsmodnede peptidlegemer nedenfor.
Blokkerinasanalvse på ActRIIB/ Fc- overflate
Blokkeringsanalyse ble utført ved å benytte immobilisert ActRIIB/Fc (R6D Systems, Minneapolis, MN) og myostatin i nærvær og fravær av peptidlegemer med BIAcore analysesystemet. Analysene ble benyttet for å klassifisere peptidlegemer som ikke-nøytraliserende (de som ikke forhindrer myostatin å binde til ActRIIB/Fc) eller nøytraliserende (de som forhindrer myostatin å binde til ActRIIB/Fc). Baselinje myostatin-ActRIIB/Fc-binding ble først bestemt i fravær av peptidlegemet.
For tidlige screeningsundersøkelser ble peptidlegemer fortynnet til 4 nM, 40 nM og 400 nM i prøvebuffer og innkubert med 4 nM myostatin (også fortynnet i prøvebuffer). Peptidlegemet: ligandblandingene ble tillatt å nå likevekt ved romtemperatur (minst 5 timer) og deretter injisert over den immobiliserte ActRIIB/Fc-overflaten i 20-30 minutter ved en strømningshastighet på 10 ul/min. En økt bindingsrespons (over kontrollbinding uten peptidlegeme) indikerte at peptidlegemebinding til myostatin var ikke-nøytraliserende. En minsket bindingsrespons (sammenlignet med kontrollen) indikerte at peptidlegemebinding til myostatin blokkerte bindingen av myostatin til ActRIIB/Fc. Utvalgte peptidlegemer ble ytterligerekarakterisert vedå benytte blokkeringsanalysen i en full konsentrasjonsserie for å utlede IC50-verdier (for nøytraliserende peptidlegemer) eller EC50(for ikke-nøytraliserende peptidlegemer). Peptidlegemeprøvene ble seriefortynnet fra 200 nM til 0,05 mM i prøvebuffer og innkubert med 4 mM myostatin ved romtemperatur for å nå likevekt (minimum 5 timer) før de ble injisert over den immobiliserte ActRIIB/Fc-overflaten i 20-30 minutter med en strømningshastighet på 10 ul/min. Etter prøveinjeksjonen ble bundet ligand tillatt å dissosiere fra reseptoren i 3 minutter. Ved å plotte bindingssignal mot peptidlegemekonsentrasjon ble IC50-verdier for hvert peptidlegeme i nærvær av 4 nM myostatin beregnet. Det ble for eksempel funnet at peptidlegemene TN8-19, L2 og L17 inhiberer myostatinaktivitet i cellebaserte analyse, men binding av TN-8-19 blokkerer ikke myostatin/ActRIIB/Fc-interaksjoner, noe som tyder på at Tn-8-19 binder til en annen epitop enn den som blir observert for de to andre peptidlegemene.
Epitopkateqoriserinq for peptidlegemer
Et renset peptidlegeme ble immobilisert på en BIAcore brikke for å fange myostatin før injeksjon av et andre peptidlegeme, og mengden av sekundært peptidlegeme bundet til det fangede myostatin ble bestemt. Kun peptidlegeme med distinkte epitoper vil binde til det fangede myostatin, for derved å muliggjøre kategoriseringen av peptidlegemer med tilsvarende eller distinkt epitop bindingsegenskaper. For eksempel ble det vist at peptidlegemer TN8-19 og L23 binder til ulike epitoper på myostatin.
Selektivitetsanalvse
Disse analysene ble utført ved anvendelse av BIAcore-teknologi for å bestemme selektiviteten av binding for peptidlegemene til andre TGFp-familiemedlemmer. ActRIIB/Fc, TGFpRII/Fc og BMPR-IA/Fc (alle fremskaffet fra R&.D Systems, Minneapolis, MN) ble kovalent koblet til forskningsgrad sensorbrikker i henhold til produsentens anbefalte protokoll. Fordi BIAcore analyser påviser endringer i den refraktive indeksen representerer forskjellen mellom responsen som er påvist med injeksjon over den immobiliserte reseptoroverflaten sammenlignet med responsens som er påvist med injeksjon over kontrolloverflaten i fravær av peptidlegemet den faktiske bindingen av Aktivin A, TGFpi, TGFp3 og BMP4 til reseptorene. Med preinnkubering av peptidlegemer og TGFp-molekyler indikerer en endring (økning eller minskning) i bindingsrespons peptidlegemebinding til TGBp-familien av molekyler. Peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse binder alle til myostatin, men ikke til Aktivin-A, TGFpi, TBFp3 eller BMP4.
KinEx- A- likevektsanalvser
Løsningsbaserte likevekts bindingsanalyser ved å benytte KinEx-A-teknologi (Sapidyne Instruments, Inc.) ble benyttet for å bestemme dissosieringslikevekten (KD) for myostatinbinding til peptidlegeme molekyler. Denne løsningsbaserte analysen er ansett å være mer sensitiv enn BIAcore-analysen i noen tilfeller. Reacti-Gel-6X ble forhåndsbelagt med omtrent 50 ug/ml myostatin over natt og deretter blokkert med BSA. 30 pM og 100 pM med peptidlegemeprøver ble innkubert med ulike konsentrasjoner (0,5 pM til 5 nM) av myostatin i prøvebuffer ved romtemperatur i 8 timer før det ble kjørt gjennom de myostatinbelagte kulene. Mengden av kulebundet peptidlegeme ble kvantifisert ved hjelp av fluorescens (Cy5)-merket geit-anti-human-Fc-antistoff ved 1 mg/ml i superblokkering. Bindingssignalet er proporsjonalt med konsentrasjonen av et peptidlegeme med likevekt med en gitt myostatinkonsentrasjon. KDble fremskaffet fra den ikke-lineære regresjonen av konkurreringskurvene ved å benytte en en-seters homogen bindingsmodell med todelt kurve tilveiebrakt i KinEx-A-programvaren (Sapidyne Instrument, Inc.).
Eksempel 4
Sammenligning av myostatininhibitorer
Evnen til tre første runde eksempelpeptidlegemer til å binde til (KD) og inhibere (IC50) ble sammenlignet med KD- og IC50-verdiene som er fremskaffet for det løselige reseptorfusjonsproteinet ActRIIB/Fc (R&.D Systems, Inc., Minneapolis, Minn.). IC50-verdiene ble bestemt ved å benytte pMARE-luc-cellebaserte analysen beskrevet i Eksempel 3 og KD-verdiene ble bestemt ved å benytte Biacore-analysen beskrevet i Eksempel 3.
Peptidlegeme har en IC50som er forbedret i forhold til reseptor/Fc-inhibitoren og bindingsaffiniteter som er sammenlignbare for to peptidlegemer med reseptor/Fc.
Eksempel 5
Sammenligning av evnen for peptid og peptidlegeme til å inhibere myostatin
Den følgende peptidsekvensen: QGHCTRWPWMCPPY (TN8-19) (SEKV. ID. NR. 33) ble benyttet for å konstruere det tilsvarende peptidlegeme TN8-19 (pb) i henhold til prosedyren som er beskrevet i Eksempel 2 ovenfor. Både peptidet alene og peptidlegemet ble screenet for myostatininhiberende aktivitet ved å benytte den C2C12-baserte analysen beskrevet i Eksempel 3 ovenfor. Det kan bli sett i Figur 1 at IC50(effektiv konsentrasjon for 50% inhibering av myostatin) for peptidlegemet er vesentlig mindre enn den for peptidet, og dermed er evnen til peptidet i å inhibere myostatinaktivitet blitt vesentlig forbedret ved å plassere det i peptidlegeme konfigurasjonen.
Eksempel 6
Fremstilling av affinitetsmodnede peptider og peptidlegemer
Flere av førsterundepeptidene som ble benyttet til peptidlegemefremstilling ble valgt til affinitetsmodning. De valgte peptidene inkluderte de følgende: den cysteinbegrensede TN8-19, QGHCTRWPWMCPPY (SEKV. ID. NR. 33) og de lineære peptidene Lineær-2 (MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEKV. ID. NR. 104), Lineær-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEKV. ID. NR. 117), Lineær-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEKV. ID. NR. 119), Lineær-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEKV. ID. NR. 122), Lineær-21 HNSSQMLSELIMLVGSMMQ (SEKV. ID. NR. 123), Lineær-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEKV. ID. NR. 126). Basert på en konsensussekvens ble rettede, sekundære fagdisplay enheter generert der "kjerne aminosyrer" (bestemt fra konsensussekvensen) enten ble holdt konstant eller påvirket i frekvens og forekomst. Alternativt kunne en individuell peptidsekvens blitt benyttet for å fremstille et påvirket direkte fagdisplay bibliotek. Panorering av slike biblioteker under mer stringente betingelser kan gi peptider med forbedret binding til myostatin, selektiv binding til myostatin eller med en eller annen ytterligere ønskelig egenskap.
Fremstilling av dopede oliaoer for biblioteker
Oligonukleotider ble syntetisert i en DNA-syntetiseringsmaskin der disse oligonukleotidene var 91 % "dopede" i kjernesekvensen, dvs. at hver løsning bestod av 91 % av den representerte basen (A, G, C eller T) og 3 % av hver av de andre tre nukleotidene. For eksempel for TN8-19-familien var en 91% dopet oligo som ble benyttet til konstruering av et sekundært fagbibliotek følgende:
der "N" indikerer at hver av de fire nukleotidene A, T, C og G var tilstede like ofte, K indikerer at G og T forekom like ofte og de små bokstavene representerer en blanding av 91% av den indikerte basen og 3% av hver av de andre basene. Familien av oligonukleotider som ble fremstilt på denne måten ble PCR-amplifisert som beskrevet ovenfor, ligert inn i fagmidvektorer, for eksempel et modifisert pCESl-plasmid (Dyax), eller enhver tilgjengelig fagmidvektor i henhold til protokollen som er beskrevet ovenfor. De sekundære fagbibliotekene som ble generert var alle 91% dopet og hadde mellom 1 og 6,5 x IO<9>uavhengige transformanter. Bibliotekene ble panorert som beskrevet ovenfor, men med de følgende betingelsene:
Runde- l- panorerinq:
Runde- 2- panorerinq:
Runde- 3- panorerina:
Panorering av de sekundære bibliotekene ga peptider med forbedret binding til myostatin. Individuelle valgte kloner ble satt for fag-ELISA som beskrevet ovenfor og sekvensert.
De følgende affinitetsmodnede TN8-19-familiene av peptider er vist i Tabell IV nedenfor.
Konsensussekvensen som er avledet fra affinitetsmodnet TN-8-19-1 til Con2 (bortsett fra mTN8 con6-sekvensene) vist ovenfor er: Caia7Wa<g>WMCPP (SEKV. ID. NR. 352). Alle disse peptidene omfatter sekvensen WMCPP (SEKV. ID. NR. 633). De understrekede aminosyrene representerer kjerneaminosyrene som foreligger i alle utførelsesformer og a1#a2og a3er valgt fra en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre. I en utførelsesform av denne konsensussekvensen, Cbib7Wb^ WMCPP (SEKV. ID. NR. 353), er bi valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R, b2er valgt fra enhver av R, S, Q og b3 er valgt fra enhver av P, R og Q. Alle peptidene omfatter sekvensen WMCPP (SEKV. ID. NR. 633). En mer detaljert analyse av de affinitetsmodnede TN8-sekvensene som omfatter SEKV. ID. NR. 352 tilveiebringer den følgende formelen:
Cic,c^ac.;CfiCc7CRWc0 WMCPPCinCi 1 Ci,Ci„ (SEKV. ID. NR. 354), der:
Cier fraværende eller enhver aminosyre;
c2er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c3er fraværende en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c4 er fraværende eller enhver aminosyre;
c5er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
c6er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c7er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c8er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
c9er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; og Ci0-Ci3er enhver aminosyre.
I en utførelsesform av formuleringen ovenfor er b7 valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R, b8er valgt fra enhver av R, S, Q og b9er valgt fra enhver av P, R og Q. Dette gir den følgende sekvensen:
did2d3d4d5d6Cd7d8Wd9Wi1CPPdiodiidi2di3(SEKV. ID. NR. 355).
di er fraværende eller enhver aminosyre;
d2 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d3 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d4 er fraværende eller enhver aminosyre;
d5er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre;
d6 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre;
d7 er valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R;
d8er valgt fra enhver av R, S, Q;
d9er valgt fra enhver av P, R og Q; og
di0-di3 er valgt fra enhver aminosyre.
Konsensussekvensen til mTN8 con6-serien er WYeie2Ye3G (SEKV. ID. NR. 356) der ei er P, S eller Y, e2er C eller Q og e3 er G eller H.
I tillegg til den affinitetsmodnede TN-19-familien ble ytterligere affinitetsmodne peptider fremstilt fra de lineære første runde peptidene L-2, L-15, L-17, L-20, L-21 og L-24. Disse familiene er vist i Tabell V nedenfor.
De affinitetsmodnede peptidene som er vist i Tabellene IV og V blir deretter satt sammen til peptidlegemer som beskrevet ovenfor og analysert ved å benytte in vivo-analysene.
De affinitetsmodnede L2-peptidene omfatter en konsensussekvens med fi EMLf7SLNfdLL (SEKV. ID. NR. 455), der fi er M eller I, f2er enhver aminosyre, f3er L eller F og f4er E, Q eller D.
Den affinitetsmodnede L15-peptidfamilien omfatter sekvensen LaiCbLL<q>^aiL (SEKV.
ID. NR. 456), der gi er Q, D eller E, g2er S, Q, D eller E, g3er enhver aminosyre og g4er L, W, F eller Y. Den affinitetsmodnede L17-familien omfatter sekvensen: h1h2h3h4h5h6h7h8h9(SEKV. ID. NR. 457), der hi er R eller D, h2er enhver aminosyre, h3er A, T, S eller Q, h4er L eller M, h5er L eller S, h6er enhver aminosyre, h7er F eller E, h8er W, F eller C og h9er
L, F, M eller K. Konsensussekvenser kan også bli bestemt for ml_20-, ml_21- og ml_24-familiene av peptider som er vist ovenfor.
Peptidlegemet ble konstruert fra disse affinitetsmodnede peptidene som beskrevet ovenfor ved å benytte en linker bundet til Fc-domenet på human IgGl, som har SEKV. ID. NR. 296 på N-terminalen (N-konfigurasjon), på C-terminalen (C-konfigurasjon) til Fc, eller på både N- og C-terminalen (N,C-konfigurasjon), som beskrevet i Eksempel 2 ovenfor. Peptidene som er navngitt ble bundet på C- eller N-terminalen via en 5-glysin- (5G), 8-glysin- eller k-linkersekvens. I 2X-peptidlegemeversjonen ble peptidene bundet med linkere slik som 5-gly, 8-gly eller k. Affinitetsmodnede peptider og peptidlegemer er designet med en liten "m" slik som for eksempel mTN8-19-22. Peptidlegemer ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder ytterligere to spleiseseter der peptidene ble spleiset inn i fagemidvektorene. Posisjonen til disse spleisesetene er AQ-peptid-LE. Peptidlegemene inkluderer generelt disse ytterligere aminosyrene (selv om de ikke er inkludert i peptidsekvensene som er gitt i tabellene). I noen peptidlegemer ble LE-aminosyrene fjernet fra peptidsekvensene. Disse peptidlegemene er betegnet -LE.
Eksempel-peptidlegemer og eksempel-polynukleotidsekvenser som koder for dem er gitt i Tabell VI nedenfor. Denne tabellen inkluderer eksempler på peptidlegemesekvenser (i motsetning til kun peptid), slik som 2x-mTN8-19-7 (SEKV. ID. NR. 615) og peptidlegemet med LE-sekvensene fjernet (SEKV. ID. NR. 617). For forklaringens del refererer linkersekvensen i 2x-versjonene til linker mellom tandempeptidene. Disse peptidlegemesekvensene inneholder Fc-, linker-, AQ- og LE-sekvensene. Den tilhørende nukleotidsekvensen koder for peptidsekvensen i tillegg til AQ/LE-linkersekvensene, hvis de er tilstede, men koder ikke for den gitte linkeren.
Eksempel 7
In Wtro-screening av affinintetsmodnede peptidlegemer
De følgende eksempelpeptidlegemene ble screenet i henhold til protokollene som er fremlagt ovenfor for å oppnå de følgende KD- og IC50-verdiene. Tabell VII viser området for KD-verdier for valgte affinitetsmodne peptidlegemer sammenlignet med mor-peptidlegemene, som bestemt ved KinExA-løsningsbaserte analyser eller BIAcore-analyser. Disse verdiene viste økt bindingsaffinitet for de affinitetsmodnede peptidlegemene for
myostatin sammenlignet med mor-peptidlegemene. Tabell VIII viser IC50-verdier for et antall affinitetsmodnede peptidlegemer. Et område med verdier er gitt i denne tabellen.
Eksempel 8
In wVo-anabol aktivitet for eksempel-peptidlegemer
CD1 nu/nu-musemodellen (Charles River Laboratories, Massachusettes) ble benyttet for å bestemme in wVo-effektiviteten for peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse som inkluderte den humane Fc-regionen (huFc). Denne modellen reagerte på inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse med en rask anabol respons som var assosiert med økt tørr muskelmasse og en økning i myofibrillære proteiner, men var ikke assosiert med akkumulering av vanninnhold i kroppen.
I et eksempel ble effektiviteten til lx peptidlegeme mTN8-19-21 vist ved hjelp av det følgende eksperimentet. En gruppe med 10 8-uker gamle CD1 nu/nu-mus ble behandlet to ganger ukentlig eller en gang ukentlig med doseringer på 1 mg/kg, 3 mg/kg og 10 mg/kg (subkutan injeksjon). Kontrollgruppen på 10 8-uker gamle CD1 nu/nu-mus mottok en to ganger ukentlig (subkutan) injeksjon med huFc (vehikkel) ved 10 mg/kg. Dyrene ble veid hver andre dag og ren kroppsmasse ble bestemt ved hjelp av NMR på dag 0 og dag 13. Dyrene ble deretter avlivet på dag 14 og størrelsen på gastroknemius muskelen ble bestemt. Resultatene er vist i Figur 2 og 3. Figur 2 viser økningen i total kroppsvekt for musene over 14 dager for de ulike doseringene av peptidlegemene sammenlignet med kontrollen. Slik som det kan bli sett i Figur 2, har alle doseringene vist en økning i kroppsvekt sammenlignet med kontrollen, der alle doseringene viser statistisk signifikante økninger i forhold til kontrollen ved dag 14. Figur 3 viser endringen i ren kroppsmasse på dag 0 og dag 13 som bestemt ved hjelp av NMR, i tillegg til endringen i vekt for gastroknemius muskelen som er dissekert fra dyrene på dag 14.
I et annet eksempel ble lx mTN8-19-32-peptidlegemet administrert til CD1 nu/nu-mus ved en to ganger ukentlig injeksjon med 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg og 30 mg/kg sammenlignet med huFc-kontrollen (vehikkel). De peptidlegeme-behandlede dyrene viser en økning i total kroppsvekt (ikke vist) i tillegg til ren kroppsmasse på dag 13 sammenlignet med dag 0 som bestemt ved hjelp av NMR-måling. Økningen i ren kroppsmasse er vist i
Figur 4.
I et annet eksempel ble et lx affinitetsmodnet peptidlegeme sammenlignet med et 2x affinintetsmodnet peptidlegeme for in wVo-anabol effektivitet. CD1 nu/nu-hannmus (10 dyr per gruppe) ble behandlet med to ganger ukentlig injeksjoner med 10 mg/kg og 3 mg/kg med lx mTN8-19-7 og 2x mTN8-19-7 i 35 dager, mens kontrollgruppen (10 dyr) mottok to ganger ukentlig injeksjoner med huFc (3 mg/kg). Som vist i Figur 5 resulterte behandling med 2x peptidlegeme i større økning av kroppsvekt og ren kadavervekt ved død sammenlignet med lx peptidlegeme eller kontroll.
Eksempel 9
Økning i muskelstyrke
Normale aldersmatchede 4 måneder gamle C57B/6-hannmus ble behandlet i 30 dager med 2 injeksjoner per uke med subkutane injeksjoner 5 mg/kg per uke med 2x mTN8-19-33, 2x mTN8-19-7 og huFc-vehikkel kontrollgruppe (10 dyr/gruppe). Dyrene ble tillatt å hente seg inn igjen uten ytterligere injeksjoner. Gripestyrke ble målt på dag 18 av gjeninnhentingsperioden. Gripestryken ble målt til å benytte et måleinstrument fra Columbia Instruments, modell 1027 dsm (Columbus, Ohio). Peptidlegeme-behandling førte til signifikant økning i gripestyrke, der 2 x mTN8-19-33-forhåndsbehandlede dyr viste en 14% økning i gripestyrke sammenlignet med kontrollbehandlede mus, mens 2x mTN8-19-7 viste en 15% økning i gripestyrke sammenlignet med kontrollbehandlede mus.
Eksempel 10
Farmakokinetikk
In wVo-farmakokinetiske eksperimenter ble utført ved å benytte representative peptidlegemer uten LE-sekvensene. 10 mg/kg og 5 mg/kg doseringer ble administrert til CD1 nu/nu-mus og de følgende parameterne ble bestemt: Cmax (ug/ml), areale under kurven (AUC) (^g-t/ml) og halveringstid (t). Det ble funnet at 2x-versjonene av de affinitetsmodnede peptidlegemene haren vesentlig lenger halveringstid enn lx-versjonene. For eksempel har lx-affinitetsmodnet mTN8-19-22 en halveringstid i dyrene på omtrent 50,2 timer, mens 2x mTN8-19-22 har en halveringstid på omtrent 85,2 timer. Affinitetsmodne lx mTN8-7 har en halveringstid på omtrent 65 timer, mens 2 x mTN8-19-7 haren halveringstid på omtrent 106 timer.
Eksempel 11
Behandling av mdx-mus
Peptidlegemene ifølge foreliggende oppfinnelse har blitt vist å øke ren muskelmasse i et dyr og er nyttige til behandlingen av en mengde forstyrrelse som involverer muskelsvinn. Muskulær dystrofi er en av disse forstyrrelsene. Musemodellen for Duchenne's muskulære dystrofi er Duchenne-mdx-musen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Eldre (10 måneder gamle) mdx-mus ble injisert med enten peptidlegeme lx mTN8-19-33 (n=8/gruppe) eller med vehikkelen huFc-protein (N=6/gruppe) i en 3 måneders tidsperiode. Doseringsskjemaet var hver andre dag, 10 mg/kg, ved subkutan injeksjon. Peptidlegeme-behandlingen hadde en positiv effekt på økning og opprettholdelse av kroppsmasse for de aldrede mdx-musene. Vesentlige økninger i kroppsvekt ble observert i den peptidlegeme-behandlede gruppen sammenlignet med den hu-Fc-behandlede kontrollgruppen, som vist i Figur 6a. I tillegg avslørte NMR-analyse at forholdet mellom den rene kroppsmassen og fettmasse også var vesentlig økt i de aldrede mdx-musene som et resultat av peptidlegeme-behandling sammenlignet med kontrollgruppen, og at fettprosenten av kroppsvekt minsket i peptidlegeme-behandlede mus sammenlignet med kontrollgruppen, som vist i Figur 6B.
Foreliggende oppfinnelse skal ikke bli begrenset i omfang av de spesifikke utførelsesformene som er beskrevet her, som er ment som enkeltillustrasjoner på individuelle aspekter av oppfinnelsen, og funksjonelle, ekvivalente fremgangsmåter og komponenter er oppfinnelse. Faktisk vil ulike modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til de som er vist og beskrevet her være åpenbare for fagfolk på området ut ifra den foregående beskrivelsen og medfølgende tegninger. Slike modifikasjoner er ment å skulle falle innenfor omfanget av de tilhørende kravene.

Claims (35)

1. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter aminosyresekvensen WMCPP (SEKV. ID. NR. 633).
2. Bindingsmiddel ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidet er mellom 5 og 50 aminosyrer i lengde.
3. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter aminosyresekvensen Caia7Wa^ WMCPP (SEKV. ID. NR.
352), der alr a2 og a3 er valgt fra en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre og der peptidet er mellom 10 og 50 aminosyrer i lengde.
4. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen Cic7CgCdC;CfiCc7CRWcq WMCPPcinCi 1 Ci 7Cn (SEKV. ID. NR. 354), der: Ci er fraværende eller enhver aminosyre; c2 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; c3 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; c4 er fraværende eller enhver aminosyre; c5 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; c6 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; c7 er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; c8 er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; c9 er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; og c10 -c13 er enhver aminosyre; og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer i lengde.
5. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen did7d^dad.;dfiCd7d«Wdo WMCPPdindiidi7dn (SEKV. ID. NR. 355), der: di er fraværende eller enhver aminosyre; d2 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; d3 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; d4 er fraværende eller enhver aminosyre; d5 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; d6 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; d7 er valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R; d8 er valgt fra enhver av R, S, Q; d9 er valgt fra enhver av P, R og Q; og d10 -d13 er valgt fra enhver aminosyre, og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer i lengde.
6. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen WYei e2 Ye3 G (SEKV. ID. NR. 356) der ei er P, S eller Y, e2 er C eller Q og e3 er G eller H, og der peptidet er mellom 7 og 50 aminosyrer i lengde.
7. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen fi EMLf2 SLf3 f4 LL (SEKV. ID. NR. 455), der fi er M eller I, f2 er enhver aminosyre, f3 er L eller F, f4 er E, Q eller D, og der peptidet er mellom 7 og 50 aminosyrer i lengde.
8. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen Lgi g2 LLg3 g4 L (SEKV. ID. NR. 456), der gi er Q, D eller E, g2 er S, Q, D eller E, g3 er enhver aminosyre, g4 er L, W, F eller Y, og der peptidet er mellom 8 og 50 aminosyrer i lengde.
9. Bindingsmiddel, karakterisert ved at det omfatter minst ett peptid som er i stand til å binde myostatin, der peptidet omfatter sekvensen hi h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 hg (SEKV. ID. NR. 457), der hi er R eller D, h2 er enhver aminosyre, h3 er A, T, S eller Q, h4 er L eller M, h5 er L eller S, h6 er enhver aminosyre, h7 er F eller E, h8 er W, F eller C, h9 er L, F, M eller K, og der peptidet er mellom 9 og 50 aminosyrer i lengde.
10. Bindingsmiddel, karakterisert ved at nevnte middel har strukturen: (X <1> )a -F <1-> (X <2> )b eller multimerer derav; der Fi er en vehikkel, og X <1> og X <2> hver uavhengig er valgt fra -(L^c-P1; -(L^c-P^L^-P 2; -(L <1> )c -P <1-> (L <2> )d -P <2-> (L <3> )e -P <3> ; og -(LVPSL2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; derP<1> ,P<2> ,P<3> og P <4> er peptider som er i stand til å binde myostatin, der L <1> , L <2> , L3 og L <4> hver er linkere, og a, b, c, d, e og f hver uavhengig er 0 eller 1, gitt at minst én av a og b er 1.
11. Bindingsmiddel ifølge krav 10, hvor ett eller flere av de myostatinbindende peptidene omfatter aminosyresekvensen WMCPP (SEKV. ID. NR. 633) og der peptidet er mellom 10 og 50 aminosyrer i lengde.
12. Bindingsmiddel ifølge krav 10, hvor ett eller flere av de myostatinbindende peptidene omfatter aminosyresekvensen Cai a2 Wa3 WMCPP (SEKV. ID. NR. 352), der ai, a2 og a3 er valgt fra en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre, og der peptidet er mellom 10 og 50 aminosyrer i lengde.
13. Bindingsmiddel ifølge krav 10, hvor ett eller flere av de myostatinbindende peptidene hvert uavhengig omfatter sekvensen c1 c2 c3 c4 C5 C6 Cc7 C8 WcgWMCPPc10 c11 c12 c13 (SEKV. ID. NR. 354), der: Ci er fraværende eller enhver aminosyre; c2 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; c3 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; c4 er fraværende eller enhver aminosyre; c5 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; c6 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; c7 er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; c8 er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; c9 er en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; og C10 -C13 er enhver aminosyre; og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer i lengde.
14. Bindingsmiddel ifølge krav 10, hvor ett eller flere av de myostatinbindende peptidene hvert uavhengig omfatter sekvensen did7d^d4dsdKCd7dRWdq WMCPPdindiidi7dn (SEKV. ID. NR. 355), der: di er fraværende eller enhver aminosyre; d2 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; d3 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; d4 er fraværende eller enhver aminosyre; d5 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller sur aminosyre; d6 er fraværende eller en nøytral hydrofob, nøytral polar eller basisk aminosyre; d7 er valgt fra enhver av aminosyrene T, I eller R; d8 er valgt fra enhver av R, S, Q; d9 er valgt fra enhver av P, R og Q; og di0 -di3 er valgt fra enhver aminosyre, og der peptidet er mellom 20 og 50 aminosyrer i lengde.
15. Bindingsmiddel, karakterisert ved at nevnte middel har strukturen: (X1)a-F1-(X2)b eller multimerer derav; der Fi er en vehikkel, og X <1> og X <2> hver uavhengig er valgt fra -(L^c-P1; -(LVpMlVP2; -(L <1> )c -P <1-> (L <2> )d -P <2-> (L <3> )e -P <3> ; og -(LVPSL2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; derP<1> ,P<2> , P <3> og P <4> er peptider som er i stand til å binde myostatin, og der én eller flere avP<1> ,P<2> ,P3 og P <4> hver uavhengig er valgt fra gruppen som består av: (a) et peptid som omfatter aminosyresekvensen WYeie?Ye^ G (SEKV. ID. NR. 356) der ei er P, S eller Y, e2 er C eller Q, og e3 er G eller H; (b) et peptid som omfatter aminosyresekvensen fi EMLfzSLf^LL (SEKV. ID. NR.
455) , der fi er M eller I, f2 er enhver aminosyre, f3 er L eller F, f4 er E, Q eller D; (c) et peptid som omfatter aminosyresekvensen Lgi g2 LLg3 g4 L (SEKV. ID. Nr.
456) , der gi er Q, D eller E, g2 er S, Q, D eller E, g3 er enhver aminosyre, g4 er L, W, F eller Y; og (d) et peptid som omfatter aminosyresekvensen hi h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h9 (SEKV. ID. NR. 457), der hi er R og D, h2 er enhver aminosyre, h3 er A, T, S eller Q, h4 er L eller M, h5 er L eller S, h6 er enhver aminosyre, h7 er F eller E, h8 er W, F eller C og h9 er L, F, M eller K; der peptidet er mellom 9 og 50 aminosyrer i lengde, derL<1> ,L 2,L<3> ogL<4> hver er linkere, og a, b, c, d, e og f hver uavhengig er 0 eller 1, gitt at minst én av a og b er 1.
16. Bindingsmiddel, karakterisert ved at nevnte middel har strukturen: (X <1> )a -F <1-> (X <2> )b eller multimerer derav; der Fi er en vehikkel, og X <1> og X <2> hver uavhengig er valgt fra -(L^c-P1; -(L <1> )c -P <1-> (L <2> )d -P <2-> (L <3> )e -P <3> ; og -(LVPSL2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4; derP<1> ,P<2> , P <3> og P <4> er peptider som er i stand til å binde myostatin, og er uavhengig valgt fra SEKV. ID. NR. 305 til 351 og SEKV. ID. NR. 357 til 454, derL<1> ,L 2,L<3> ogL<4> hver er linkere, og a, b, c, d, e og f hver uavhengig er 0 eller 1, gitt at minst én av a og b er 1.
17. Bindingsmiddel ifølge ethvert av kravene 10 til 16, hvor vehikkelen er et Fc-domene.
18. Polynukleotidsekvens, karakterisert ved at den koder for bindingsmiddelet ifølge krav 17.
19. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter polynukleotidet ifølge krav 18.
20. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 19.
21. Vertscelle ifølge krav 20, hvor cellen er en prokaryot celle.
22. Vertscelle ifølge krav 21, hvor cellen er en eukaryot celle.
23. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en effektiv mengde av bindingsmiddelet ifølge ethvert av kravene 1 eller 10, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer derav.
24. Farmasøytisk preparat ifølge krav 23, hvor vehikkelen er et Fc-domene.
25. Anvendelse av et bindingsmiddel ifølge ethvert av kravene 1, 3 eller 10 for fremstilling av et preparat som inhibere myostatinaktivitet i et individ.
26. Anvendelse av et bindingsmiddel ifølge ethvert av kravene 1 eller 10 for fremstilling av et preparat som øker ren muskelmasse hos et individ.
27. Anvendelse ifølge krav 26, der individet er et matdyr.
28. Anvendelse av et bindingsmiddel ifølge ethvert av kravene 1 eller 10 for fremstilling av et preparat for å øke forholdet mellom ren muskelmasse i forhold til fett i et individ.
29. Anvendelse av et bindingsmiddel ifølge ethvert av kravene 1 eller 10 for fremstilling av et preparat til behandling en muskelsvinnsykdom hos et individ.
30. Anvendelse ifølge krav 29, der sykdommen er valgt fra muskulær dystrofi, amyotrofisk lateral sklerose, kongestiv obstruktiv pulmonær sykdom, kronisk hjertesvikt, kreft, AIDS, nyresvikt, uremi, reumatoid artritt, aldersrelatert sarkopeni og muskelsvinn som skyldes forlenget sengeligge, ryggmargskade, slag, benbrudd og aldring.
31. Anvendelse av et bindingsmiddel ifølge ethvert av kravene 1 eller 10 for fremstilling av et preparat til behandling av en myostatin relatert metabolsk forstyrrelse hos et individ.
32. Anvendelse ifølge krav 31, der den metabolske forstyrrelsen er valgt fra diabetes, overvekt, hyperglykemi og bentap.
33. Fremgangsmåte for å påvise myostatin i en prøve, karakterisert ved at den omfatter å bringe prøven i kontakt med et bindingsmiddel ifølge krav 1 eller 10, og påvise det bundne komplekset.
34. Fremgangsmåte for å måle myostatin i en prøve, karakterisert ved at den omfatter å kontakte prøven med et bindingsmiddel ifølge krav 1 eller 10, og måle det bundne kompleks.
35. Fremgangsmåte for å diagnostisere en myostatin relatert forstyrrelse hos et individ, karakterisert ved at den omfatter å bringe en prøve som er tatt fra individet i kontakt med et bindingsmiddel ifølge krav 1 eller 10 og påvise det bundne komplekset.
NO20141479A 2002-12-20 2014-12-05 Bindingsmidler som inhiberer myostatin NO20141479L (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43592302P 2002-12-20 2002-12-20
PCT/US2003/040781 WO2004058988A2 (en) 2002-12-20 2003-12-19 Binding agents which inhibit myostatin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO20141479L true NO20141479L (no) 2005-09-08

Family

ID=32682298

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20053545A NO335982B1 (no) 2002-12-20 2005-07-19 Bindingsmidler som inhiberer myostatin, fremgangsmåte for deres fremstilling, farmasøytisk preparat derav og anvendelse derav for fremstilling av et preparat, fremgangsmåte for å påvise eller diagnostisere en myostatinrelatert forstyrrelse samt fremgangsmåte for å måle myostatin i en prøve.
NO20141479A NO20141479L (no) 2002-12-20 2014-12-05 Bindingsmidler som inhiberer myostatin

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20053545A NO335982B1 (no) 2002-12-20 2005-07-19 Bindingsmidler som inhiberer myostatin, fremgangsmåte for deres fremstilling, farmasøytisk preparat derav og anvendelse derav for fremstilling av et preparat, fremgangsmåte for å påvise eller diagnostisere en myostatinrelatert forstyrrelse samt fremgangsmåte for å måle myostatin i en prøve.

Country Status (28)

Country Link
US (7) US7511012B2 (no)
EP (2) EP2272864A3 (no)
JP (3) JP4959137B2 (no)
KR (9) KR20120060250A (no)
CN (2) CN102382172A (no)
AR (2) AR042545A1 (no)
AT (1) ATE496938T1 (no)
AU (2) AU2003301195B2 (no)
BR (1) BR0317538A (no)
CA (2) CA2510893C (no)
CY (1) CY1111388T1 (no)
DE (1) DE60335915D1 (no)
DK (1) DK1581649T3 (no)
EA (1) EA009056B1 (no)
ES (1) ES2359562T3 (no)
HK (1) HK1084419A1 (no)
IL (3) IL169168A0 (no)
ME (1) MEP57508A (no)
MX (1) MXPA05006521A (no)
NO (2) NO335982B1 (no)
NZ (1) NZ541253A (no)
PL (1) PL383616A1 (no)
PT (1) PT1581649E (no)
RS (1) RS52815B (no)
SI (1) SI1581649T1 (no)
TW (1) TWI328456B (no)
WO (1) WO2004058988A2 (no)
ZA (1) ZA200505481B (no)

Families Citing this family (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2319928T1 (sl) 1998-10-23 2013-08-30 Kirin-Amgen, Inc. Dimerni trombopoietinski peptidni mimetiki, ki se veĺ˝ejo na receptor mp1 in imajo trombopoietinsko aktivnost
TWI329129B (en) 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US7572763B2 (en) * 2002-02-21 2009-08-11 Wyeth Follistatin domain containing proteins
BR0307907A2 (pt) 2002-02-21 2011-07-05 Wyeth Corp gasp1: proteìna contendo domìnio de folistatina
US7193069B2 (en) * 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
US20040138118A1 (en) * 2002-09-16 2004-07-15 Neil Wolfman Metalloprotease activation of myostatin, and methods of modulating myostatin activity
AR047392A1 (es) * 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20040223966A1 (en) * 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
NZ541253A (en) * 2002-12-20 2010-03-26 Amgen Inc Peptide binding agents which inhibit myostatin
AU2004245025A1 (en) * 2003-06-02 2004-12-16 Wyeth Use of myostatin (GDF8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
ATE522548T1 (de) * 2003-11-13 2011-09-15 Hanmi Holdings Co Ltd Verfahren zur massenproduktion der konstanten region von immunglobulin
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
JP2007535912A (ja) 2003-12-31 2007-12-13 シェーリング−プラウ・リミテッド 中和エピトープベースの増殖増強性ワクチン
US9045553B2 (en) 2004-05-27 2015-06-02 Acceleron Pharma, Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
US7316998B2 (en) * 2004-05-27 2008-01-08 Acceleron Pharma Inc. Cerberus/Coco derivatives and uses thereof
JP2008505928A (ja) * 2004-07-08 2008-02-28 アムジェン　インコーポレーテッド 治療用ペプチド
EP1797127B1 (en) * 2004-09-24 2017-06-14 Amgen Inc. Modified fc molecules
AU2005323087A1 (en) 2004-12-30 2006-07-13 Schering-Plough Pty. Limited Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
NZ538097A (en) * 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
EP1864138A2 (en) * 2005-03-23 2007-12-12 Wyeth Detection of gdf-8 modulating agents
MX2007011405A (es) * 2005-03-23 2007-10-11 Wyeth Corp Deteccion de una respuesta inmune para agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8).
EA012801B1 (ru) 2005-06-14 2009-12-30 Эмджен Инк. Самобуферирующиеся композиции белков
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
WO2007044411A2 (en) 2005-10-06 2007-04-19 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
UA92504C2 (en) * 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US20090163579A1 (en) * 2005-10-14 2009-06-25 Daniel Raederstorff Novel use of nutraceutical compositions
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
MX2008007324A (es) * 2005-12-06 2009-03-04 Amgen Inc Usos de antagonistas de miostatina.
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
JP5058261B2 (ja) 2006-09-05 2012-10-24 イーライ リリー アンド カンパニー 抗ミオスタチン抗体
US20090252703A1 (en) * 2006-10-19 2009-10-08 Gegg Jr Colin V Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields
JP2010512326A (ja) * 2006-12-08 2010-04-22 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、Ｃｏｃｏおよびこれらの誘導体の使用
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
US7947646B2 (en) 2007-03-06 2011-05-24 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides
CA2687141C (en) 2007-05-22 2014-04-01 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
WO2009015345A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
EP2170396B1 (en) 2007-08-03 2016-12-21 Summit Corporation Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
EP2197421A1 (en) * 2007-08-31 2010-06-23 Amgen, Inc Solid-state protein formulation
ES2750254T3 (es) 2007-09-27 2020-03-25 Amgen Inc Formulaciones farmacéuticas
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
RU2519645C2 (ru) 2008-05-14 2014-06-20 Эгрикалчер Виктория Сервисиз Пти Лтд Применение ангиогенина или агонистов ангиогенина для лечения заболеваний и нарушений
CA2997971A1 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Amgen Inc. Variants of activin iib receptor polypeptides and uses thereof
MX2011013898A (es) * 2009-06-22 2012-05-22 Amgen Inc Proteínas replegadas que usan un estado de oxido-reduccion quimicamente controlado.
EP2445924B2 (en) 2009-06-25 2023-12-13 Amgen Inc. Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system
US8945511B2 (en) * 2009-06-25 2015-02-03 Paul Weinberger Sensitive methods for detecting the presence of cancer associated with the over-expression of galectin-3 using biomarkers derived from galectin-3
MX344382B (es) 2009-10-23 2016-12-14 Amgen Inc * Adaptador de vial y sistema.
JO3340B1 (ar) * 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
ES2545411T5 (es) 2010-06-07 2024-04-05 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármaco
JP2013537425A (ja) 2010-08-16 2013-10-03 アムジエン・インコーポレーテツド ミオスタチンに結合するポリペプチド、組成物および方法
US9480624B2 (en) 2011-03-31 2016-11-01 Amgen Inc. Vial adapter and system
LT2699293T (lt) 2011-04-20 2019-04-25 Amgen Inc. Automatinio purškimo prietaisas
WO2012153337A2 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Anti-microbial peptides and uses of same
KR102084171B1 (ko) 2011-10-14 2020-04-14 암젠 인크 주사기 및 어셈블리 방법
EA034347B1 (ru) 2011-10-26 2020-01-30 Амген Инк. Способ инактивации вирусов при получении антител
FR2982860B1 (fr) * 2011-11-18 2015-07-10 Ass Fr Contre Les Myopathies Utilisation de la fibromoduline et du lumican pour augmenter la masse musculaire
AU2012364736A1 (en) 2011-12-19 2014-07-24 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides, alone or in combination with chemotherapy, and uses thereof
RU2014143029A (ru) 2012-03-26 2016-05-20 Проньютриа, Инк. Заряженные питательные белки и способы их применения
US9605040B2 (en) 2012-03-26 2017-03-28 Axcella Health Inc. Nutritive proteins and methods
US9700071B2 (en) 2012-03-26 2017-07-11 Axcella Health Inc. Nutritive fragments, proteins and methods
CN104364259A (zh) 2012-03-26 2015-02-18 普罗努塔利亚公司 营养性片段、蛋白质和方法
AU2013204740C1 (en) 2012-05-10 2015-10-01 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Methods of treating cancer using angiogenin or an angiogenin agonist
RS60318B1 (sr) 2012-08-01 2020-07-31 Ikaika Therapeutics Llc Ublažavanje tkivnog oštećenja i fibroze pomoću anti-ltbp4 antitela
SI3081249T1 (sl) 2012-11-21 2021-03-31 Amgen Inc. Naprava za dajanje zdravila
WO2014119753A1 (ja) * 2013-01-31 2014-08-07 学校法人 東京薬科大学 マイオスタチン阻害ペプチド
JP2016508504A (ja) 2013-02-01 2016-03-22 サンタ マリア バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 対象に対する抗アクチビン−ａ化合物の投与
TWI639449B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
CA2904725C (en) 2013-03-15 2022-04-12 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
WO2014149357A1 (en) 2013-03-22 2014-09-25 Amgen Inc. Injector and method of assembly
KR101523065B1 (ko) * 2013-06-19 2015-05-27 한국기초과학지원연구원 입자크기가 제어된 금 나노입자의 제조방법 및 제조된 금 나노입자를 이용한 비색식 강산 검출방법
TW201601741A (zh) * 2013-09-09 2016-01-16 品特生物療法有限公司 用於治療ｅｓｒｄ病患之ｐｅｗ的肌肉生長抑制素拮抗劑
SG11201601999UA (en) 2013-09-25 2016-04-28 Pronutria Inc Compositions and formulations for prevention and treatment of diabetes and obesity, and methods of production and use thereof in glucose and caloric control
AU2014340174B2 (en) 2013-10-24 2019-09-12 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
US11097055B2 (en) 2013-10-24 2021-08-24 Amgen Inc. Injector and method of assembly
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
CN106413779B (zh) 2014-05-07 2020-06-05 安姆根有限公司 具有减震元件的自助注射器
JP6822843B2 (ja) 2014-06-03 2021-01-27 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達装置によって収集されたデータを遠隔で処理するためのシステム及び方法
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3943135A3 (en) 2014-10-14 2022-06-29 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
CA3005158A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
ES2785311T3 (es) 2014-12-19 2020-10-06 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos con botón móvil o campo de interfaz de usuario
EP3258988B1 (en) 2015-02-17 2019-08-28 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
US11268107B2 (en) 2015-04-23 2022-03-08 Washington State University SMAD7 gene delivery into muscle cells
CN106191215B (zh) 2015-04-29 2020-03-24 中国科学院上海生命科学研究院 肌肉萎缩相关的蛋白质分子标记Dkk-3的筛选及其应用
SI3334747T1 (sl) 2015-08-13 2024-02-29 Amgen Inc. Globinsko nabito filtriranje proteinov, ki vežejo antigen
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
EP3386573B1 (en) 2015-12-09 2019-10-02 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
MX2018008369A (es) 2016-01-08 2019-05-15 Scholar Rock Inc Anticuerpos de anti-miostatina pro/latente y metodo de uso de los mismos.
EP4035711A1 (en) 2016-03-15 2022-08-03 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
RU2613420C1 (ru) * 2016-04-13 2017-03-16 Сергей Михайлович Юдин Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
CN109414481B (zh) * 2016-04-25 2022-11-01 葛兰素史克知识产权开发有限公司 用于治疗病理性肌肉损失和虚弱的nope
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
US10988284B2 (en) 2016-05-13 2021-04-27 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
US11238150B2 (en) 2016-05-16 2022-02-01 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
WO2017209899A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
WO2018004842A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US10150115B2 (en) * 2016-07-21 2018-12-11 Spacepharma SA System and method for rehydrating powder and delivering the rehydrated powder to a reactor
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
EP3528787A4 (en) 2016-10-21 2020-05-06 Amgen Inc. PHARMACEUTICAL FORMULATIONS AND PROCESSES FOR THEIR PREPARATION
EP3532127A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Amgen Inc. On-body injector
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
DK3565592T3 (da) * 2017-01-06 2023-05-01 Scholar Rock Inc Behandling af stofskiftesygdomme ved inhibering af myostatinaktivering
EP3570917A1 (en) 2017-01-17 2019-11-27 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
CA3048520A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
WO2018152073A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
CA3050927A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Brian Stonecipher Drug delivery device with activation prevention feature
KR102627069B1 (ko) 2017-03-07 2024-01-18 암겐 인코포레이티드 과압에 의한 바늘 삽입
IL268386B2 (en) 2017-03-09 2023-11-01 Amgen Inc Insertion mechanism for a drug delivery device
EP4241807A3 (en) 2017-03-28 2023-10-11 Amgen Inc. Plunger rod and syringe assembly system and method
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
MX2019015472A (es) 2017-06-22 2020-02-19 Amgen Inc Reduccion del impacto/choque de la activacion del mecanismo.
AU2018290302B2 (en) 2017-06-23 2024-02-29 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
WO2019014014A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Amgen Inc. NEEDLE INSERTION-RETRACTING SYSTEM HAVING DOUBLE TORSION SPRING SYSTEM
WO2019018169A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Amgen Inc. PERMEABLE GAS SEALING ELEMENT FOR MEDICINE CONTAINER AND METHODS OF ASSEMBLY
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
EP3691717B1 (en) 2017-10-04 2023-02-08 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
IL273323B1 (en) 2017-10-09 2024-06-01 Amgen Inc Drug delivery device with drive assembly and related assembly method
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
EP3706830A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN111225696B (zh) 2017-11-10 2023-07-18 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
AU2018368338A1 (en) 2017-11-16 2020-04-09 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
AU2018368340B2 (en) 2017-11-16 2024-03-07 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
EP3569614A1 (en) 2018-05-18 2019-11-20 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Compounds and methods for the immobilization of myostatin-inhibitors on the extracellular matrix by transglutaminase
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
KR102259645B1 (ko) 2018-07-16 2021-06-02 강릉원주대학교산학협력단 구멍쇠미역 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물
KR102042352B1 (ko) 2018-07-16 2019-11-07 강릉원주대학교산학협력단 땅콩 껍질 추출물을 포함하는 근력강화 또는 근감소증의 예방 및 치료용 조성물
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US20210128844A1 (en) 2018-07-24 2021-05-06 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
EP3826701A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
WO2020068623A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
EP3856283A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
AU2019352616A1 (en) 2018-10-02 2021-03-18 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
TW202408605A (zh) 2018-10-05 2024-03-01 美商安進公司 具有劑量指示器之藥物遞送裝置
CN117138169A (zh) 2018-10-15 2023-12-01 安进公司 药物递送装置
US20210346596A1 (en) 2018-10-15 2021-11-11 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
WO2020086635A1 (en) 2018-10-23 2020-04-30 Amgen Inc. Automatic calibration and automatic maintenance of raman spectroscopic models for real-time predictions
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
MA54057A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament à rétraction partielle d'élément d'administration de médicament
WO2020132647A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
US20220062299A1 (en) 2018-12-26 2022-03-03 Northwestern University Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder
US20220160972A1 (en) 2019-04-24 2022-05-26 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
WO2021041067A2 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021158469A1 (en) 2020-02-03 2021-08-12 Amgen Inc. Multivariate bracketing approach for sterile filter validation
KR20240011135A (ko) 2021-05-21 2024-01-25 암젠 인크 약물 용기를 위한 충전 레시피를 최적화하는 방법
CA3236194A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Amgen Inc. Deep learning-based prediction for monitoring of pharmaceuticals using spectroscopy
WO2023096233A1 (ko) * 2021-11-25 2023-06-01 (주)네오크레마 신규 펩티드 및 이의 용도
WO2023096232A1 (ko) * 2021-11-25 2023-06-01 (주)네오크레마 신규 펩티드 및 이의 용도

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5750375A (en) 1988-01-22 1998-05-12 Zymogenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs and biologically active dimerized polypeptide fusions
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
WO1993006843A1 (en) 1991-10-08 1993-04-15 Duke University Peptides corresponding to antigenic determinants of htlv
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
EP1333035A3 (en) 1993-03-19 2004-07-07 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) * 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6607884B1 (en) 1993-03-19 2003-08-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-8
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
DE69841139D1 (de) 1997-07-14 2009-10-22 Univ Liege Mutationen im myostatingen steigern muskelmasse in säugetieren
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
GB2333706A (en) 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals
US6369201B1 (en) * 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers
JP4544742B2 (ja) * 1998-05-06 2010-09-15 メタモーフイクス・インコーポレーテツド Ｇｄｆ−８の阻害による糖尿病の処置法
EP1027608B1 (en) * 1998-07-30 2010-01-20 Odyssey Thera, Inc. Protein fragment complementation assays
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
AU772694B2 (en) * 1999-01-21 2004-05-06 Metamorphix International, Inc. Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
US6284882B1 (en) * 1999-06-10 2001-09-04 Abbott Laboratories Myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof
EA005248B1 (ru) * 1999-07-20 2004-12-30 Фармекса А/С Способ отрицательной регуляции активности gdf-8
EP1593689A3 (en) 2000-01-18 2006-04-05 Ovita Limited Myostatin and mimetics thereof
JP2004512010A (ja) * 2000-03-29 2004-04-22 ディージーアイ・バイオテクノロジーズ・エル・エル・シー インスリン及びｉｇｆ−１受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト
JP3991086B2 (ja) * 2000-12-23 2007-10-17 ダイアックス、コープ 造影剤として有用なフィブリン結合部分
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
NZ541253A (en) 2002-12-20 2010-03-26 Amgen Inc Peptide binding agents which inhibit myostatin
AU2004245025A1 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Wyeth Use of myostatin (GDF8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
ES2468516T3 (es) 2003-10-06 2014-06-16 Paranta Biosciences Limited Folistatina para usar en la regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria
ATE522548T1 (de) 2003-11-13 2011-09-15 Hanmi Holdings Co Ltd Verfahren zur massenproduktion der konstanten region von immunglobulin
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
JP2007526337A (ja) 2004-03-02 2007-09-13 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド Ａｌｋ７およびミオスタチン阻害剤ならびにその使用
AU2005227896B2 (en) 2004-03-23 2008-11-13 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
EP1797127B1 (en) * 2004-09-24 2017-06-14 Amgen Inc. Modified fc molecules
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
WO2007024535A2 (en) 2005-08-19 2007-03-01 Wyeth Antagonist antibodies against gdf-8 and uses in treatment of als and other gdf-8-associated disorders
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1

Also Published As

Publication number Publication date
NO20053545L (no) 2005-09-08
US20040181033A1 (en) 2004-09-16
US8920798B2 (en) 2014-12-30
EP1581649A2 (en) 2005-10-05
KR20150013350A (ko) 2015-02-04
KR101304718B1 (ko) 2013-09-05
KR20150107899A (ko) 2015-09-23
JP2013048622A (ja) 2013-03-14
MXPA05006521A (es) 2005-08-26
US20090227517A1 (en) 2009-09-10
SI1581649T1 (sl) 2011-09-30
AU2003301195B2 (en) 2010-01-07
TW200505474A (en) 2005-02-16
EP1581649A4 (en) 2008-10-08
DK1581649T3 (da) 2011-05-02
AR042545A1 (es) 2005-06-22
WO2004058988A3 (en) 2007-11-15
US7511012B2 (en) 2009-03-31
JP2006524034A (ja) 2006-10-26
NZ541253A (en) 2010-03-26
CA2510893C (en) 2012-07-10
AU2003301195A1 (en) 2004-07-22
CY1111388T1 (el) 2015-08-05
KR20120037517A (ko) 2012-04-19
AU2010201389A1 (en) 2010-04-29
CA2774928A1 (en) 2004-07-15
BR0317538A (pt) 2005-11-29
KR20110086881A (ko) 2011-08-01
EA200501000A3 (ru) 2007-04-27
CN101287484B (zh) 2012-10-10
KR20130036378A (ko) 2013-04-11
ZA200505481B (en) 2008-01-30
RS52815B (sr) 2013-10-31
IL205265A (en) 2017-01-31
US20130230515A1 (en) 2013-09-05
JP4959137B2 (ja) 2012-06-20
JP2010193888A (ja) 2010-09-09
EP2272864A2 (en) 2011-01-12
IL205265A0 (en) 2011-07-31
IL205266A0 (en) 2011-07-31
ATE496938T1 (de) 2011-02-15
KR20160045936A (ko) 2016-04-27
US20090220491A1 (en) 2009-09-03
KR20050091015A (ko) 2005-09-14
HK1084419A1 (en) 2006-07-28
EP2272864A3 (en) 2011-02-16
AR097588A2 (es) 2016-03-23
ES2359562T3 (es) 2011-05-24
KR20140004805A (ko) 2014-01-13
DE60335915D1 (de) 2011-03-10
CN101287484A (zh) 2008-10-15
CN102382172A (zh) 2012-03-21
CA2510893A1 (en) 2004-07-15
US7803923B2 (en) 2010-09-28
US20120083442A1 (en) 2012-04-05
TWI328456B (en) 2010-08-11
NO20053545D0 (no) 2005-07-19
IL169168A0 (en) 2007-07-04
US8071538B2 (en) 2011-12-06
EA009056B1 (ru) 2007-10-26
KR20120060250A (ko) 2012-06-11
PT1581649E (pt) 2011-04-13
NO335982B1 (no) 2015-04-13
EP1581649B1 (en) 2011-01-26
EA200501000A2 (ru) 2006-06-30
US7928075B2 (en) 2011-04-19
PL383616A1 (pl) 2008-04-14
US20150175687A1 (en) 2015-06-25
WO2004058988A2 (en) 2004-07-15
US20100330072A1 (en) 2010-12-30
RS20050530A (en) 2007-09-21
MEP57508A (en) 2011-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO20141479L (no) Bindingsmidler som inhiberer myostatin
AU2010214691B2 (en) Uses of myostatin antagonists
AU2014228423A1 (en) Myostatin antagonism in human subjects
AU2013216655B2 (en) Binding agents which inhibit myostatin
AU2016202981A1 (en) Binding agents which inhibit myostatin
AU2013213714A1 (en) Uses of myostatin antagonists