ES2468516T3

ES2468516T3 - Folistatina para usar en la regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria

Info

Publication number: ES2468516T3
Application number: ES04761394.8T
Authority: ES
Inventors: David Morritz De Kretser; David James Phillips; Kristian Lee Jones; Robyn Dep. Of Pathology And Immunology O'hehir; Shane Patella
Original assignee: PARANTA BIOSCIENCES Ltd; Monash University
Current assignee: PARANTA BIOSCIENCES Ltd; Monash University
Priority date: 2003-10-06
Filing date: 2004-10-06
Publication date: 2014-06-16
Anticipated expiration: 2024-10-06
Also published as: CA2541237A1; US20150359846A1; EP1677816B1; US20070248609A1; CA2541237C; DK1677816T3; JP2007507429A; EP1677816A1; US8920806B2; EP1677816A4; WO2005032578A1

Abstract

Folistatina para uso en un método de regulación negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero, en donde la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de trasplante de pulmón, síndrome de dficultad respiratoria aguda grave o asma.

Description

Folistatina para usar en la regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a agentes para usar en la modulación de una respuesta inflamatoria en un mamífero. Más particularmente, la presente invención se refiere a la modulación de una respuesta inflamatoria en un mamífero modulando la actividad funcional de la activita y, de este modo, modulando la cascada de mediadores proinflamatorios. El uso de la presente invención es útil, entre otros, en el tratamiento y/o profilaxis de afecciones caracterizadas por una respuesta inflamatoria aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada, incluyendo, entre otros, sepsis e inflamación de las vías respiratorias. También se describen procedimientos para identificar y/o diseñar agentes capaces de modular la regulaci�n mediada por la activina de la respuesta inflamatoria.

15 Antecedentes de la invención

Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que el autor hace referencia en la presente memoria descriptiva se recogen alfabéticamente al final de la descripción.

La referencia a cualquier técnica anterior en la presente memoria descriptiva no es un reconocimiento o cualquier forma o sugerencia de que la técnica anterior forma parte del conocimiento común general en Australia y no debe interpretarse como tal.

Los mamíferos tienen que defenderse contra muchos pat�genos, incluyendo virus, bacterias, hongos y parásitos, as�

25 como agresiones no patog�nicas tales como tumores y agentes tóxicos o dañinos de algún otro modo. En respuesta, han desarrollado mecanismos efectores que son capaces de montar una defensa contra dichos ant�genos. Estos mecanismos est�n mediados por moléculas solubles y/o por células.

En el contexto de estos, mecanismos efectores, la inflamación es un proceso complejo de múltiples caras en respuesta a una enfermedad o lesión que est� regulado por la liberación de una serie de citocinas (Alexander et al, 2001, J Endotoxin Res 7:167 -202). Estas citocinas se clasifican en términos generales como citocinas pro o antiinflamatorias y el equilibrio crítico entre la liberación y la actividad de las citocinas con acciones opuestas regula la respuesta inflamatoria para impedir que se convierta en franco o se subestime.

35 Si la respuesta inflamatoria continúa sin comprobarse y es franca, el huésped puede sufrir daños tisulares asociados y, en los casos graves, esto puede presentarse como shock séptico y se puede producir insuficiencia multiorg�nica (Ulevitch et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:19 -22). Por el contrario, una respuesta inflamatoria mala o subestimada puede significar infección incontrolada, que tiene como resultado enfermedad crónica y daños en el huésped. La regulaci�n de la respuesta inflamatoria es importante tanto a nivel sist�mico como a nivel local.

El descubrimiento de los procesos de inflamación detallados ha revelado una estrecha relación entre la inflamación y la respuesta inmunitaria. Existen cinco indicadores básicos de inflamación, siendo estos enrojecimiento (rubor), inflamación (tumor), calor (calor), dolor (dolor) y función alterada (functio laesa) Estos indicadores aparecen por extravasaci�n de plasma e infiltración de leucocitos en el sitio de la inflamación. Consistente con estos indicadores,

45 las principales características de la respuesta inflamatoria son, por tanto:

(i): vasodilataci�n, ensanchamiento de los vasos sanguíneos para aumentar el flujo de sangre en el área infectada;

(ii): aumento de la permeabilidad vascular, esto permite que los componentes difundibles entren en el sitio;

(iii) infiltración celular, siendo esto el movimiento dirigido de las células inflamatorias a través de las paredes de los vasos sanguíneos en el sitio de la lesión;

55 (iv) cambios en los perfiles biosint�ticos, metabólicos y catabólicos de muchos órganos; y

(v) activación de las células del sistema inmunitario, as� como sistemas enzim�ticos complejos de plasma sanguíneo.

La extensión a la cual estas características se producen generalmente es proporcional a la gravedad de la lesión y/o a la extensión de la infección.

La respuesta inflamatoria puede clasificarse ampliamente en varias fases. El acontecimiento macroscópico más temprano de una respuesta inflamatoria es la vasoconstricci�n temporal, es decir estrechamiento de loas vasos 65 sanguíneos causada por la contracción del músculo liso en las paredes de los casos, loo que se puede ver como un blanqueamiento de la piel. A esto le sigue varias fases que se producen en minutos, horas y días después, del

siguiente modo:

(i) La respuesta vascular aguda sigue en segundos a una agresión tisular y dura unos minutos. Se caracteriza por vasodilataci�n e incremento de la permeabilidad capilar debido a las alteraciones en el endotelio vascular, lo

5 que conduce a un incremento del flujo sanguíneo (hiperemia) que produce enrojecimiento (eritema) y la entrada de flujo en los tejidos (edema).

(ii) Si se ha producido daño suficiente en los tejidos o si se ha producido infección, la respuesta celular aguda tiene lugar en las siguientes horas. La característica principal de esta fase es la aparición de granulocitos, en particular neutr�filos, en el tejido. Estas células se unen primero a las células endoteliales dentro de los vasos sanguíneos (marginaci�n) y después cruzan al tejido circundante (diapedesis). Si el vaso est� dañado, el fibrin�geno y la fibronectina se depositan en el lugar de la lesión, las plaquetas se agregan y se activan y se forman coágulos.

15 (iii) Si el daño es lo bastante grave, en los siguientes días se puede producir una respuesta celular crónica. Una característica de esta fase de inflamación es la aparición de un infiltrado de células mononucleares compuesto por macr�fagos y linfocitos. Los macr�fagos est�n implicados en la muerte de los microbios, en la limpieza de los residuos celulares y tisulares, y también se piensa que desempeñan un papel significativo en el remodelado tisular.

(iv) En las siguientes semanas se puede producir resolución, en la que se restablece la arquitectura del tejido normal. Los coágulos sanguíneos se eliminan mediante fibrin�lisis. Si no es posible devolver el tejido a su forma original se puede producir cicatrización por llenado con fibroblastos, col�geno y nuevas células endoteliales. En general, para este momento cualquier infección se habr� superado, aunque este no siempre es el caso y puede

25 dar lugar a otras respuestas inmunol�gicas, tales como formación de granulomas.

La inflamación a menudo se considera en términos de inflamación aguda, que incluye todos los acontecimientos de la respuesta vascular aguda y celular aguda (1 y 2 anteriores) e inflamación crónica, que incluye los acontecimientos durante la respuesta celular crónica y resolución o cicatrización (3 y 4).

No obstante, debe entenderse que además de la aparición de respuesta inflamatorias de un modo localizado en el tejido que est� dañado, infectado o sometido a una respuesta autoinmunitaria, las respuestas inflamatorias también se pueden producir sist�micamente, como en el caso de la sepsis.

35 De acuerdo con esto, a la luz del amplio impacto de las respuestas inflamatorias, existe una necesidad constante de aclarar los mecanismos complejos por los cuales funcionan. Identificando estos mecanismos, de este modo se proporciona un alcance para desarrollar medios de modulación adecuada de respuestas inflamatorias.

Inhibina, activina y folistatina son tres familias de polip�ptidos aislados inicialmente y caracterizados de fluido ovárico folicular basándose en su modulación de la liberación de la hormona estimulante del fol�culo de cultivos de células hipofisarias. Además de sus efectos sobre la síntesis y secreción de la hormona estimulante del fol�culo, la inhibina y la activita tienen otras funciones biológicas. Por el contrario, el significado fisiológico de la folistatina era oscuro, hasta que se descubrió que la folistatina es una proteína de unión a la activina.

45 Las activinas, compuestas por dos subunidades β, βA, βB, βC y/o βE son miembros de la superfamilia del factor transformante del crecimiento (TGF)-β [Vale et al., 1990, Handbook of Experimental Physiology, Vol. 95, Eds. Sporn & Roberts, Springer-Verlag, Berlín pág. 211 -248]. Las formas de proteína multim�rica de la activita incluyen las formas homodim�ricas (Activina A -βAβA, Activina B -βBβB, Activina C -βCβC, y Activina E --βEβE) y las formas heterodim�ricas (por ejemplo, Activina AB --βAβB, Activina AC --βAβC, o Activina AE -βAβE). Las activinas son proteínas multifuncionales. Por ejemplo, la activina A, aunque identificada inicialmente como un regulador de la liberación de la hormona estimulante del fol�culo, ahora se sabe que exhibe la gama pleiotr�pico de actividades funcionales que son características de la mayoría de las citocinas. Las activinas, como sus proteínas relacionadas, las inhibinas (que consisten en un d�mero de una subunidad α distinta aunque estructuralmente relacionada y una subunidad β de la activinas) se pueden unir a los receptores de tipo II de la activina. No obstante, solo las activinas

55 son capaces de reclutar los receptores de tipo I para formar un complejo activo, desencadenando vías de se�alizaci�n Smad intracelulares y, de este modo, influyendo sobre la función celular a nivel transcripcional. En la actualidad, se ha mostrado la activina A, AB y B demuestran actividad agonista típica mediada por receptores. Se ha comunicado que la activina B muestra menos actividad biológica que la activina A [Nakamura et al., Journal of Biological Chemistry, 267, 16385 -16389, 1992]. Esto se puede asociar con una variación en la disponibilidad de receptores de tipo I específicos, reclutados de forma diferencial por la activina A y B [Tsuchida et al., 2004 Molecular and Cellular Endocrinology 220, 50 -65].

La folistatina funciona como regulador biológico de la activina. De hecho, inicialmente se identificó por su capacidad para suprimir la secreción de la hormona estimulante del fol�culo, que después se ha mostrado que se debe a su 65 propiedad como proteína de unión a la activina. La folistatina es una proteína monom�rica que se une a la activina con una afinidad elevada y se cree que después conduce a la degradación lisosomal de la activina en complejo. La

folistatina comprende una serie de variantes postraduccionales y de glicosilaci�n. No obstante, las dos isoformas principales son la folistatina 315 de longitud completa, que se cree que es la isoforma circulante predominante, y la isoforma 288, que tiene una fuerte afinidad por los proteoglicanos de heparina sulfato y es, considerablemente, una isoforma asociada a la membrana celular (Phillips y de Kretser, 1998, Frontiers in Neuroendocrinology 19:287 -322).

5 La activina afecta al crecimiento y diferenciación de muchos tipos celulares, estimula la secreción de la hormona estimulante del fol�culo de la hip�fisis e inhibe la hormona de crecimiento, la prolactina, y la liberación de adrenocorticotropina [Billestrup et al., Molecular Endocrinology 1990 4:356 -362; Kitaoka et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1988 157:48 -54; Vale et al., Nature 1986, 321:776 -779]. La activina A se caracterizó por primera vez por su capacidad para estimular la hormona estimulante del fol�culo (FSH) en la hip�fisis, una capacidad compartida por la activina B [Nakamura et al., 1992, supra; Van Dijk et al., 1995, Annals of the New York Academy of Science 762, 319 -330]. No obstante, ahora se sabe que la activina A posee muchas más propiedades además de su función inicial para la que se aisl� por primera vez. Tanto la activina A como la B participan en el desarrollo del feto, presentando sus respectivas desactivaciones en ratones [Vassalli et al., 1994,

15 Genes and Development, 8:414 -427] distintas anomalías fenot�picas. La desactivación de la activina A exhiben defectos fenot�picos letales en neonatos [Vassalli et al., 1994, supra; Matzuk et al., 1995, Nature 374: 354 -356] pero la sustitución del gen βA con βB proporciona rescate parcial de este fenotipo [Brown et al., 2000, Nature Genetics, 25:453 -457], lo que sugiere algún solapamiento en las actividades de la activina A y B. En contraste con estas observaciones, existen pruebas de que la activina B puede tener papeles específicos en procesos tales como la inducción del mesodermo embrionario [Thomsen et al., 1990, Cell 63:485 -493] y el desarrollo de las glándulas mamarias [Robinson et al., 1997, Development 124:2701 -2708]. De particular interés es que se supone que la activina B es la activina de relevancia en la regulaci�n intrahipofisaria de la FSH, como muestran los estudios de neutralización [Corrigan et al., 1991, Endocrinology 128:1682 -1684]. Adicionalmente, son evidentes claras diferencias en los patrones de expresión de la activina A y B durante la reparación tisular [H�bner et al., 1996,

25 Developmental Biology 173:490 -498] y en asociación con modelos de fibrosis hepática [De Bleser et al., 1997, Hepatology, 26:905 -912]. Dichas pruebas sugieren que la activina A y B desempeñan papeles diferentes en una serie de procesos biológicos y patológicos.

La folistatina se une específicamente a varios miembros de la superfamilia del TGF-β pero, como mucho, posee la afinidad más alta de unión a la activina. Como resultado, la folistatina circulante 315 neutraliza la actividad de la activina impidiendo la interacción de la citocina con sus receptores de tipo II [de Winter et al., Molecular and Cellular Endocrinology 1996 116:105 -114] y, además, la folistatina 288 unida a la superficie celular facilita la degradación lisos�mica de la activina [Hashimoto et al., Journal of Biological Chemistry 1997 272:13835 -13842]. Los ARNm de la folistatina y de la activina muestran una amplia distribución tisular [Meunier et al., PNAS 1988 85:247 -251; Michel 35 et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1990 173:401 -407; Schneider et al., European Journal of Endocrinology 2000 142:537 -544]. La folistatina y la activina son detectables en suero [Demura et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1993 76:1080 -1082; Demura et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1992 185:1148 -1154; Gilfillan et al., Clinical Endocrinology 1994 41:453 -461; Khoury et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1995 80:1361 -1368; Knight et al., Journal of Endocrinology 1996148:267 -279; McFarlane et al., European Journal of Endocrinology 1996 134:481 -489; Sakai et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1992 188:921 -926; Sakamoto et al., European Journal of Endocrinology 1996 135:345 -351; Tilbrook et al., Journal of Endocrinology 1996 149:55 -63; Wakatsuki et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1996 81:630 -634], y sus concentraciones en suero aumentan con la edad [Wakatsuki et al. 1996, supra; Loria et al., European Journal of Endocrinology 1998 139:487 -492]. No 45 obstante, en la actualidad, se desconocen las fuentes exactas de folistatina y activina en suero. Los datos actuales sugieren que los equilibrios específicos de tejido de la folistatina y la activina dirigen el crecimiento y diferenciación de los tipos de células respondedoras de un modo autocrino/paracrino [Michel et al., Acta Endocrinologica 1993

129:525 -531; Phillips, Trends in Endocrinology and Metabolism 2001 12:94 -96].

Se ha documentado un papel emergente de la folistatina y la activina en la respuesta inmunitaria innata del cuerpo. Por ejemplo, la folistatina y la activina son secretadas por varios tipos de células en respuesta a los compuestos inflamatorios in vitro [H�bner et al., Experimental Cell Research 1996 228:106 -113; Jones et al., Endocrinology 2000 141:1905 -1908; Keelan et al., Placenta 2000 21:38 -43; Michel et al., Endocrinology 1996 137:4925 -4934; Phillips et al., Journal of Endocrinology 1998 156:77 -82; Yu et al., Immunology 1996 88:368 -374; Er�maa et al., 55 Journal of Experimental Medicine 1992 176:1449 -1452; Shao et al., Cytokine 1998 10:227 -235; Mohan et al., European Journal of Endocrinology 2001 145:505 -511]. Además, en algunos ejemplos de los procesos inflamatorios tales como cicatrización de heridas, enfermedad inflamatoria intestinal y artritis reumatoide, se ha observado un incremento de la expresión de la activina y/o folistatina [H�bner et al., Laboratory Investigation 1997

77:311 -318; H�bner et al., 1996, supra; Yu et al., Clinical and Experimental Immunology 1998 1,12:126 -132]. No obstante, desde estos hallazgos muy trempranos y preliminares, el papel de la activina y la folistatina en el contexto de la inflamación per se no se ha aclarado adicionalmente, ni en el contexto de sus actividades precisas o en el contexto del alcance de las afecciones inflamatorias en las que funcionan. A la luz de la extrema diversidad en términos de la naturaleza y la extensión de las respuestas inflamatorias que se pueden producir y las actividades extremadamente pleiotr�picas de las citocinas, tales como las diversas formas de activina, no es sorprendente que

65 los hallazgos preliminares de mediados a últimos de la década de 1990 no han progresado a teorías más sustanciales. En particular, la activina A, la activina B y la folistatina se expresan en una amplia variedad de tipos celulares y la mayoría de los órganos del cuerpo en respuesta a una amplia gama de estímulos. De acuerdo con lo anterior, su papel en el contexto de la inflamación no se puede predecir y, por tanto, est� lejos de estar claro.

En los trabajos que han llevado a la presente invención, sorprendentemente se ha determinado que la activina A

5 funciona como componente crucial de la cascada de las citocinas que regula la respuesta inflamatoria. Específicamente, la activina A inicia la liberación in vivo de las citocinas proinflamatorias y, de hecho, pueden modular los niveles de citocinas proinflamatorias que se liberan después frente a un estímulo adecuado. De acuerdo con lo anterior, aunque anteriormente se ha observado que los niveles de activina A se modulan durante el inicio y la progresión de una respuesta inflamatoria, hasta el advenimiento de la presente invención no se han realizado progresos para aclarar el papel preciso de esta molécula en el contexto de inflamación.

Sorprendentemente, todavía se ha determinado además que los niveles de activina B se modulan incluso más espectacularmente en el contexto de una respuesta inflamatoria que son niveles de activina A. Esto es particularmente sorprendente a la luz de lo que se sabe hasta la fecha en relación con los distintos papeles de las 15 activinas A y B. Todavía más, mientras que los inmunoensayos dirigidos a la medición de la activina A han estado disponibles para usar durante algún tiempo, el análisis de la activina B se ha inhibido por la ausencia de un inmunoensayo específico para esta especie concreta de activina. Se dispone de un conjunto limitado de datos que sugiere que los niveles de activina B circulantes se alteran durante el embarazo o con la función ovárica [Petraglia et al., 1993, Endocrine Journal 1:323 -327; Woodruff et al., 1997, Journal of Endocrinology 152:167 -174; Vihko et al., 1998, Human Reproduction 13:841 -846; Vihko et al., 2003, Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 80:570 574] Kobayashi et al. (2000) [Biol. Pharm. Bull. 23(6):755 -757] demonstraron que un incremento del ARNm de la activina-βB se asocia con regeneración hepática y el desarrollo de fibosis, aunque los autores no postulan si esto est� unido con cambios en los niveles de activina AB, activina B o inhibina. Un estudio de Rosendahl et al. 2001 [Am J Respir Cell Mol Biol 25:60 -68] analizó un modelo de ratón de exposición de las vías respiratorias inducida por

25 al�rgeno en los pulmones y se centr� en analizar los cambios asociados en la expresión y distribución de la superfamilia del TGF-β y receptores de TGF-β /activina. Este grupo indicó que los al�rgenos de las vías respiratorias inducidas solo produjeron una elevación muy modesta de la expresión del ARNm de la activina βB sobre los niveles control. Los análisis histológicos no proporcionaron información sobre la síntesis de proteínas dim�ricas de activina mdura o la distribución (activinaA o B) ni se proporcion� pruebas de que el modesto incremento de los niveles de ARNm de activina-βB no estaban, de hecho, ligados a cambios en los niveles de inhibina. De acuerdo con lo anterior, la determinación de que los niveles de activina B aumentan, de hecho, de forma espectacular durante la inflamación respecto a los niveles de activina A es extremadamente inesperada a la luz de la información muy limitada que disponible sobre el funcionamiento de las moléculas de activina A y activina B.

35 Los hallazgos de la presente invención han facilitado ahora el desarrollo de metodología dirigida a la modulación de la respuesta inflamatoria regulando los niveles de activina A y activina B funcionalmente activas y, por tanto, la liberación de citocinas proinflamatorias. De acuerdo con lo anterior, ahora se proporcionan ambos procedimientos para el tratamiento terapéutico y profiláctico de afecciones caracterizadas por una respuesta inflamatria indeseada o inadecuada y medios para la detección selectiva de reguladores de la liberación de citocinas proinflamatorias, tales como miméticos de activina A y activina B, agonistas o antagonistas.

Sumario de la invención

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones siguientes, a menos que el contexto requiera lo

45 contrario, se entiende que la palabra "comprenden" y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” implica la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.

La especificación sujeto contiene información sobre secuencias de nucleótidos preparadas usando el programa PatentIn Version 3,1, presentadas en el presente documento después de la bibliografía. Cada secuencia de nucleótidos se identifica en el listado de secuencias por el indicador numérico <210> seguido del identificador de secuencias (p. ej., <210>1, <210>2, etc). La longitud, el tipo de secuencia (ADN, etcl) y el organismo fuente para cada secuencia de nucleótidos se indica en la información proporcionada en los campos del indicador numérico <211>, <212> y <213>, respectivamente. Las secuencias nucleot�dicas a las que se hace referencia en la

55 especificación se identifican con el indicador SEC ID N� seguido del identificador de la secuencia (p. ej., SEC ID N� 1, SEC ID N� 2, etc.). El identificador de la secuencia al que se hace referencia en la especificación se correlaciona con la información proporcionada en el campo del indicador numérico <400> en el listado de secuencias, seguido del identificador de la secuencia (p. ej., <400>1, <400>2, etc). Es decir, la SEC ID N� como se detalla en la especificación se correlaciona con la secuencia indicada como <400> 1 en el listado de secuencias.

La presente invención proporciona, en un primer aspecto, folistatina para usar en un procedimiento de regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero, en el que la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de un transplante de pulmón, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave o asma.

65 La presente invención proporciona además folistatina para usar en un procedimiento de tratamiento de una afección caracterizada por una respuesta inflamatoria aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada, en un mamífero, en el que la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de un transplante de pulmón, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave o asma.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona folistatina para usar en un procedimiento de regulaci�n

5 negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero mediante la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y/o la activina B en dicho mamífero, en el que la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de una inflamación aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada, de las vías respiratorias.

En la presente invención, cuando la respuesta inflamatoria es una respuesta a una cascada proinflamatoria, la cascada proinflamatoria se caracteriza por la expresión de TNF-α, IL-1 y/o IL-6, y la respuesta inflamatoria se regula por disminución mediante la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y/o la activina B en dicho mamífero hasta un nivel ineficaz para inhibir o retrasar la cascada proinflamatoria.

Tambi�n se describe un método de modulación de la respuesta inflamatoria en un mamífero, comprendiendo dicho

15 método modular la actividad funcional de la activina en la que la regulaci�n por aumento los fragmentos de activina, derivados, mutantes o variantes de la misma hasta un nivel eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de mediadores proinflamatorios y disminuye la activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero en dicho mamífero inhibe o retrasa la la cascada de mediadores proinflamatorios.

Tambi�n se describe un procedimiento de modulación de la respuesta inflamatoria en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la modulación de la actividad funcional de la activina, en la que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de mediadores proinflamatorios y disminuye dicha activina hasta un nivel funcionalmente

25 ineficaz en dicho mamífero en dicho mamífero inhibe o retrasa la la cascada de mediadores proinflamatorios.

Tambi�n se describe un método de modulación de la respuesta inflamatoria local en un mamífero, comprendiendo dicho método la modulación de la actividad funcional de la activinam en la que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de mediadores proinflamatorios y disminuye dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero en dicho mamífero inhibe o retrasa la la cascada de mediadores proinflamatorios locales.

Tambi�n se describe un método de modulación de la respuesta inflamatoria sist�mica en un mamífero,

35 comprendiendo dicho método la modulación de la actividad funcional de la activinam en la que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de mediadores proinflamatorios y disminuye dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero en dicho mamífero inhibe o retrasa la la cascada de mediadores proinflamatorios sist�micos.

Tambi�n se describe un método de modulación de la respuesta inflamatoria en un mamífero, comprendiendo dicho método la modulación de la actividad funcional de la activina, en la que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la que la

45 regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de mediadores proinflamatorios y disminuye dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero en dicho mamífero inhibe o retrasa la cascada de citocinas proinflamatorias. También se describe un método de modulación de la respuesta inflamatoria local en un mamífero, en la que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de mediadores proinflamatorios y disminuye dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero en dicho mamífero inhibe o retrasa la la cascada de citocinas proinflamatorios locales.

55 comprendiendo dicho método la modulación de la actividad funcional de la activina, en la que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad Ps, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de mediadores proinflamatorios y disminuye dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero en dicho mamífero inhibe o retrasa la cascada de citocinas proinflamatorias sist�micas.

Tambi�n se describe un método de regulaci�n negativa de la respuesta inflamatoria en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un agente durante un tiempo y en condiciones suficientes para inducir un nivel funcionalmente ineficaz de la activina, en el que la activina es activina A o una

65 molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en dicho mamífero.

Tambi�n se describe un método de regulaci�n por aumento de la respuesta inflamatoria en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un agente durante un tiempo y en condiciones suficientes para inducir un nivel funcionalmente eficaz de la activina, en el que la activina es activina A o

5 una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en dicho mamífero.

Tambi�n se describe un método de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección o una predisposición al desarrollo de una afección, caracterizada por una respuesta inflamatoria aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada en un mamífero, comprendiendo dicho método modular el nivel de la activina en dicho mamífero, en el que la regulaci�n por aumento de los fragmentos de activina, derivados, mutantes o variantes de la misma hasta un nivel funcionalmente eficaz regula por aumento la cascada de mediadores proinflamatorios y la regulaci�n negativa la activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz inhibe o retrasa la la cascada de mediadores proinflamatorios.

15 También se describe un método de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección o una predisposición al desarrollo de una afección, caracterizada por una respuesta inflamatoria aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada en un mamífero, comprendiendo dicho método modular el nivel de la activina, en el que la activina es activina A una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos de activina, derivados, mutantes o variantes de la misma, en el que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel funcionalmente eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o regula por aumento la cascada de mediadores proinflamatorios y la regulaci�n negativa de dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz inhibe o retrasa la la cascada de citocinas proinflamatorias.

Tambi�n se describe un método de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección o una predisposición al

25 desarrollo de una afección, caracterizada por una respuesta inflamatoria aguda indeseada en un mamífero, comprendiendo dicho método la regulaci�n negativa del nivel de la activina, en el que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos de activina, derivados, mutantes o variantes de la misma, en el que la regulaci�n negativa de dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz inhibe o retrasa la la cascada de citocinas proinflamatorias.

Tambi�n se describe un método de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección o una predisposición al desarrollo de una afección, caracterizada por una respuesta inflamatoria inadecuada en un mamífero, comprendiendo dicho método modular el nivel de la activina, en el que la activina es activina A una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos de activina, derivados, mutantes o variantes de la misma, en

35 el que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel funcionalmente eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o regula por aumento la cascada de mediadores proinflamatorios y la regulaci�n negativa de dicha activina hasta un nivel funcionalmente eficaz regula por aumento la cascada de citocinas proinflamatorias.

Tambi�n se describe el uso de un agente capaz de modular el nivel funcionalmente eficaz de activina, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección o una predisposición al desarrollo de una afección, caracterizado por una respuesta inflamatoria aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada en un mamífero, en el que la regulaci�n por aumento de la activina hasta un nivel funcionalmente eficaz regula por aumento la cascada de mediadores proinflamatorios y la regulaci�n negativa la activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz inhibe o retrasa la cascada de mediadores

45 proinflamatorios.

Tambi�n se describe el uso de un agente capaz de modular el nivel funcionalmente eficaz de activina en el que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes

o variantes de la misma, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección o una predisposición al desarrollo de una afección, caracterizado por una respuesta inflamatoria aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada en un mamífero, en el que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel funcionalmente eficaz en dicho mamífero induce, mantiene o regula por aumento la cascada de mediadores proinflamatorios y la regulaci�n negativa de dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz inhibe o retrasa la cascada de citocinas proinflamatorias.

55 También se describe una composición farmacéutica que comprende el agente modulador como se ha definido anteriormente en el presente docmento junto con uno o ma´s vehículos y / o diluyentes farmac�uticamente aceptables.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1Aes una representación gráfica de la liberación de activina A después de una exposición inflamatoria, en la forma de lipopolisac�rido (LPS), en ratones.

65 La Figura 1B es una representación gráfica de la liberación de folistatina en respuesta a LPS.

La Figura 1C es una representación gráfica de la liberación de TNFα en respuesta a LPS.

La Figura 1D es una representación gráfica de la liberación de IL-6 en respuesta a LPS.

5 La Figura 1E es una representación gráfica de la liberación de IL-1β en respuesta a LPS.

La Figura 2A es una representación gráfica de la liberación de activina A después de una inyección de LPS en ratones que recibieron una inyección de folistatina 288 humana recombinante (rhfolistatina-288) 30 minutos antes del LPS.

La Figura 2B es una representación gráfica de la liberación de folistatina en ratones después de la administración de rhfolistatina-288 30 minutos antes del LPS.

La Figura 2C es una representación gráfica de del nivel de TNFα liberado en ratones después de la 15 administración de rhfolistatina-288 30 minutos antes del LPS.

La Figura 2D es una representación gráfica del nivel de interleucina-6 liberada después de la inyección de rhfolistatina-288 seguido de una inyección de LPS.

La Figura 2E es una representación gráfica del nivel de de IL-1β liberada después de la inyección de folistatina seguido de LPS.

La Figura 3 es una imagen de la expression de activina A en (A) epitelio bronquial y infiltrado inflamatorio, (B) expresión difusa en el músculo liso de la submucosa y las estructuras vasculares (flechas) y (C) expresión en el

25 epitelio bronquial y células inflamatorias discretas (flechas). A y B, el asma; C, la fibrosis qu�stica. Inmunoperoxidasa, aumento original x 400.

La Figura 4 es una representación gráfica de la cinética de de la expresión de activina A y la inflamación pulmonar en el modelo murino de OVA de los inventores. (A) la concentración de la activina en BALF medida mediante ELISA, (B) el número absolute de eosin�filos en el LBA y (C) la frecuencia de células de ganglios linfáticos mediast�nicos productores de IL-4 medida mediante ELISPOT. Varón � SEM, n = 5 ratones por grupo por punto de tiempo.

La figura 5 es una imagen de la expresión de activina A en solución salina de control (A) y ratones OVA

35 sensibilizados tras 4 exposiciones (B), y 10 días después de la 4� exposición (C). Las flechas indican pérdida de expresión de activina A en el epitelio bronquial hipertrofiado (B), y expresión parcheada el día 17 (C).

La figura 6 es una representación gráfica de los niveles de ARNm cuantitativos para las subunidades βA (panel superior) y βB (panel inferior) en hígados de ratones expuestos a una sola inyección intraperitoneal de LPS. Los ratones se trataron con LPS solo (sin pretratamiento con folistatina, círculos sólidos) o 1 μg de folistatina recombinante humana 288 treinta minutos antes del LPS (pretratamiento con folistatina, círculos abiertos). Los datos se representan como la media � SEM en cada punto de tiempo evaluado en relación con LPS, con niveles de expresión expresados en relación con la expresión del gen doméstico, GADPH. Todos los datos a tiempo se normalizaron a un valor de 1 y los datos en los puntos de tiempo posteriores se expresaron en relación a ese

45 punto de tiempo.

La figura 7 es una representación gráfica de los niveles de ARNm cuantitativos para las subunidades βA (panel superior) y βB (panel inferior) en hígados de ratones expuestos a una sola inyección intraperitoneal de CCl4 Los datos se representan como la media � SEM en cada punto de tiempo evaluado en relación con CCl4, con niveles de expresión expresados en relación con la expresión del gen doméstico, GADPH. Todos los datos a tiempo se normalizaron a un valor de 1 y los datos en los puntos de tiempo posteriores se expresaron en relación a ese punto de tiempo.

La Figura 8 es una imagen de la inmunolocalizaci�n de la subunidad βA de la activinas en los hígados de ratones

55 en varios puntos de tiempo después del tratamiento con LPS. Los subunidad βA de la activinas se localize en los hepatocitos de animales no tratados (t = 0 h), pero principalmente alrededor de las venas hepáticas centrales. La inmunolocalizaci�n pareció disminuida a las 5 horas después de la exposición a LPS, pero regres� a los patrones de localización pretratamiento a las 12 horas (X 50).

La Figura 9 es una imagen de la inmunolocalizaci�n de la subunidad βB de la activinas en los hígados de ratones en varios puntos de tiempo después del tratamiento con LPS. Los subunidad βB de la activinas se localize en los hepatocitos de animales no tratados (t = 0 h), en las zonas que rodean los espacios porta, pero no en las venas centrales. La inmunolocalizaci�n pareció disminuida a las 5 horas después de la exposición a LPS, pero regres� a los patrones de localización pretratamiento a las 12 horas. Tenga en cuenta también la pérdida de la

65 localización en los hepatocitos periféricos (asteriscos) (X 50).

La Figura 10 es una imagen de la inmunolocalizaci�n de la subunidad βA de la activina (paneles a y b) y la subunidad βB de la activina (paneles c y d) en los hígados de los ratones a 0 o 36 horas después de la exposición a CCL4. En cuanto al tratamiento con LPS, la subunidad βB de la activina se localizó en las zonas que rodean el tracto portal, pero no en las venas centrales, mientras que la subunidad βA de la activinas se localiza en los

5 hepatocitos que rodean las venas centrales. Obsérvense también que la localización de la subunidad βA de la activina en el punto de tiempo de 36 horas en las zonas de apoptosis/necrosis de hepatocitos, mientras que la localización de la subunidad βB de la activina est� ausente de estas áreas (asteriscos) (X50).

La Figura 11 es una representación gráfica de las concentraciones en suero y líquido cefalorraqu�deo (LCR) de la activina A y la folistatina en pacientes de traumatismo craneal (paneles A -E) tomadas varios días después de la incidencia del traumatismo.

La Figura 12 es una representación gráfica de la liberación de citocinas en ratones a los que se ha administrado 0,5 μg de folistatina antes de LPS.

15 La Figura 13 es una representación gráfica de la liberación de citocinas en ratones a los que se ha administrado 2 μg de folistatina antes de LPS.

La Figura 14 es una representación gráfica de la liberación de IL-6 en ratones a los que se ha administrado 0 -2 μg de folistatina antes de LPS.

La Figura 15 es una representación gráfica de las concentraciones en plasma de folistatina y activina A en cuatro pacientes (paneles A -D) con lesiones de quemaduras moderadas. El día de la obtención de las muestras se refiere al primer día en que se tom� una muestra y no necesariamente en relación con el día de la

25 quemadura.

La Figura 16 es una imagen de la piel que muestra la inmunocitoqu�mica de la inmunocitoqu�mica de activina A (βA) y de folistatina (FS) se muestra en color marrón. H y E representa una sección teñida con hematoxilina y eosina (H y E). SL = estrato lúcido; SGR = estrato granuloso; SSp = estrato espinoso; SGE = estrato germinativo; INF = células inflamatorias.

La Figura 17 es una imagen de una sección que muestra areas epitelializadas y desnudas de quemaduras que muestran fibrosis d�rmica marcada con fibroblastos, los macr�fagos y los vasos sanguíneos marcados con flechas. El producto de color marrón indica positividad a activinas o a folistatina.

35 La Figura 18 es una imagen de una biopsia de la zona que carece de epitelio y que muestra fibrosis marcada, indicando las flechas vasos sanguíneos pequeños que muestran la localización de la activina A y un área de células inflamatorias (INF). Obsérvese que la folistatina muestra una intensidad de la tinción marcadamente menor.

La Figura 19 es una imagen de un mayor aumento que muestra zonas d�rmicas de la fibrosis con zonas de aspecto amorfas de col�geno (C). Fibroblastos (F) que muestran activina A y marcadamente menos intensidad de folistatina. Los vasos sanguíneos también muestran la localización (V).

45 La Figura 20 es una imagen de una sección teñida con H &y E que muestra la colección de células moribundas

(D) e inflamatorias. Otras áreas muestran la localización de la activina A y la folistatina en fibroblastos (F) y células inflamatorias (INF).

Descripci�n detallada de la invención

La presente invención se basa, en parte, en la determinación sorprendente que el papel de las activinas A y B en la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de estas moléculas siendo moduladores de la liberación de citocinas proinflamatorias. Específicamente, se ha encontrado que la activina A inicia el inicio de la cascada de citocinas proinflamatorias. De manera similar, pero aún más sorprendente, ahora también se ha encontrado que las

55 moléculas de activina que comprenden la subunidad βB regulan las etapas muy tempranas de la respuesta inflamatoria, a pesar de que, por lo demás, exhiben un distintivo funcional significativo de la activina A. Más sorprendentemente, sin embargo, esta molécula exhibe niveles significativamente más altos de expresión que la activina A en este momento. De acuerdo con esto, estos hallazgos han facilitado ahora el diseño racional de los medios para la modulación de la respuesta inflamatoria y, en particular, para tratar afecciones terapéuticamente o profil�cticamente que se caracterizan por una respuesta inflamatoria inadecuada. Además, no se facilita la identificación y / o diseño de agentes que interaccionan específicamente con o imitan la activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB para modular su funcionalidad y, de ese modo, la aparición o progresión de una respuesta inflamatoria.

65 De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la presente invención est� dirigido a la folistatina para uso en un procedimiento de regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero, en el que la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de un transplante de pulmón, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave

o asma.

M�s particularmente, la presente invención est� dirigida a la folistatina para uso en un procedimiento de regulaci�n

5 negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero mediante la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y/o la activina B, en el que la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de una inflamación aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada, de las vías respiratorias.

La respuesta inflamatoria es una respuesta compleja que se caracteriza por una serie de eventos fisiológicos y / o inmunol�gicos que se inducen mediante la liberación de una cascada de citocinas en respuesta a uno cualquiera de varios estímulos incluyendo, entre otros, lesión tisu�ar, infección, una respuesta inmunitaria (tal como un pat�geno o un agente inocuo, como ocurre con las alergias) o enfermedad (tales como la formación de tumores o una respuesta autoinmunitaria).

15 Los acontecimientos fisiológicos que caracterizan la inflamación incluyen

(i): vasodilataci�n

(ii): aumento de la permeabilidad vascular

(iii) infiltración celular

(iv): cambios en los perfiles biosint�tivos, metabólicos y catabólicos de los órganos afectados

(v): activación de las células del sistema inmune.

Se debe entender que la referencia a una "respuesta inflamatoria" es una referencia a uno cualquiera o más de los acontecimientos fisiológicos y / o inmunol�gicos o fases inducidas en el contexto de la inflamación y, 25 específicamente, en respuesta a las señales generadas por la cascada de citocinas que dirige la respuesta inflamatoria. Por ejemplo IL-1, TNF-alfa e IL-6 son bien conocidos por sus funciones como mediadores proinflamatorios. También debe entenderse que una respuesta inflamatoria en el contexto de la presente invención incluye esencialmente una referencia a una respuesta parcial, tal como una respuesta que acaba de comenzar o a cualquier fase o acontecimiento específico de una respuesta (tales como las fases y acontecimientos que se detallan en los puntos (i) -(v), anteriormente, o cualquier otro efecto relacionado con la inflamación, incluyendo, entre otros, la producción de proteínas de fase aguda, incluyendo los componentes del complemento, fiebre y una respuesta inmunitaria sist�mica). Además, también debe entenderse que dependiendo de cualquier conjunto dado de circunstancias específicas, el punto final de una respuesta inflamatoria puede variar. Por ejemplo, en algunas situaciones no sólo se puede producir una respuesta vascular aguda. En la medida en que se produce una

35 inflamación "aguda", esto generalmente se entiende que incluye los acontecimientos de una respuesta vascular aguda y una respuesta celular aguda. Algunas respuestas inflamatorias se resuelver�n en la fase aguda, mientras que otras pueden progresar hasta convertirse en respuestas celulares crónicas.

En ciertas circunstancias, el proceso agudo, caracterizado por la infiltración de neutr�filos y edema, da paso a un predominio de los fagocitos mononucleares y linfocitos. Se cree que esto se produce en algún grado con el proceso de cciatrizaci�n normal, pero se convierte en exagerada y crónica cuando hay eliminación ineficaz de materiales extraños como en ciertas infecciones (por ejemplo, tuberculosis) o después de la introducción de cuerpos extraños (por ejemplo, amianto) o deposición de cristales (por ejemplo, cristales de urato). La inflamación crónica se asocia a menudo con la fusión de las células mononucleares para formar células gigantes multinucleadas, que eventualmente

45 se convierten en un granuloma. La inflamación crónica también se observa en condiciones de hipersensibilidad retardada. La respuesta inflamatoria sujeto puede ser sist�mica o localizada. Ejemplos de respuestas inflamatorias sist�micas incluyen aquellas que entran en el ámbito de síndrome de respuesta inflamatoria sist�mica, como el shock séptico, shock tóxico o septicemia.

Ejemplos de respuestas inflamatorias localizadas incluyen las que se producen en el contexto de la inflamación de las vías respiratorias (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis qu�stica, el trasplante de pulmón, bronquiolitis obliterante, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva, asbestosis, apnea del sueño obstructiva, hipoxia o hipertensión pulmonar), artritis reumatoide, esclerosis múltiple, encefalitis, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave, enfermedad inflamatoria intestinal, pancreatitis, aterosclerosis, meningitis, apendicitis,

55 angiog�nesis, psoriasis, protección neuronal, necrosis tubular renal, lesión cerebral traumática, respuestas alérgicas y cicatrización de heridas (por ejemplo, tras cirugía, quemaduras u otras lesiones de tejidos). Sin embargo, se debe entender que algunas respuestas inflamatorias localizadas pueden llegar a ser sist�micas, por ejemplo, como puede ocurrir cuando el inicio del choque séptico se produce como complicación de quemaduras graves o heridas abdominales. En otro ejemplo, la septicemia puede ser resultado de la transición de una infección bacteriana más localizada a una infección circulatoria.

De acuerdo con ello, en una realización preferida, la presente invención comprende regulaci�n negativa de dicha activina a un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero para inhibir o retardar la cascada de mediadores proinflamatorios locales.

65 Más preferentemente, dicha respuesta inflamatoria local es aguda.

En otra realización preferida, la presente invención comprende regulaci�n negativa de dicha activina a un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero para inhibir o retardar la cascada de mediadores proinflamatorios sist�micos.

5 Más preferentemente, dicha respuesta inflamatoria sist�mica es aguda.

De acuerdo con estos aspectos preferidos de la presente invención, dicha respuesta inflamatoria aguda est�, preferentemente, regulada por disminución y se produce en el contexto de, o est� asociado de otro modo con, shock séptico, septicemia, inflamación de las vías respiratorias, apendicitis, meningitis, respuesta hepática a toxinas o virus, angiog�nesis, psoriasis, protección de los nervios, aterosclerosis, necrosis tubular renal, encefalitis, cicatrización de heridas o lesiones traumáticas, como ocurre con lesiones, cirugía y quemaduras (por ejemplo, lesiones cerebrales traumáticas).

Preferentemente, dicha inflamación de las vías respiratorias se produce en el contexto de asma, enfermedad

15 pulmonar intersticial, fibrosis qu�stica, trasplante de pulmón, SDRA, bronquiolitis obliterante, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva, asbestosis, apnea obstructiva del sueño, hipoxia o hipertensión pulmonar.

Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria sist�mica aguda se produce en el contexto de un síndrome de respuesta inflamatoria sist�mica y aún más particularmente sepsis, septicemia, shock tóxico, shock séptico, traumatismo tisular, meningitis o apendicitis.

En otra realización preferida, dicha enfermedad inflamatoria es crónica.

A�n más preferentemente, dicha respuesta inflamatoria crónica se produce en el contexto de, o est� asociado de

25 otro modo con, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, asma, psoriasis o cicatrización de heridas.

Se debe entender que algunas afecciones y enfermedades, tales como enfermedad inflamatoria intestinal o cicatrización de heridas, pueden estar asociados con las fases tanto aguda como crónica y, por lo tanto, se detallan en el presente documento en ambos contextos.

La referencia a "la activina A" debe entenderse como una referencia a todas las formas de activina A. La activina A es una proteína dim�rica que comprende dos subunidades βA de la activina. También debe entenderse que incluye la referencia a un d�mero que comprende cualquier isoforma que pueda derivarse de corte y empalme del ARNm de

35 βA de la activina o mutante o formas polim�rficas de βA de la activina. La referencia a "la activina A" debe entenderse que incluye la referencia a todas las formas de estas moléculas, incluyendo todos los precursores, proprote�nas o formas intermedias de los mismos. La referencia a la activina A también debe entenderse que se extiende a cualquier proteína de activina A, existente como un d�mero, mult�mero o como proteína de fusión.

La referencia a "una molécula de activina que comprende una subunidad βB" debe entenderse como una referencia a una molécula monom�rica o multim�rica, preferentemente un d�mero, que comprende al menos una subunidad βB de la activina. La referencia a "activinaβB" debe entenderse como una referencia a todas las formas de activina βB. “Subunidad βB de activina"t ambi�n se denomina indistintamente "activina βB". Debe entenderse que incluye la referencia a cualquier isoforma que pueda derivarse de corte y empalme del ARNm de la activina βB o mutante o

45 formas polim�rficas de la activina βB. Con la referencia a "activina βB" no se pretende que sea limitante y debe leerse como que incluye una referencia a todas las formas de β activina βB incluyendo cualquier proteína codificada por el gen de la subunidad βB de la activina, cualquier polip�ptido de la subunidad, tales como formas precursoras que pueden generarse, y cualquier proteína βB, existente mon�mero, mult�mero o proteína de fusión. Las formas de proteína multim�rica de la activina βB incluye, por ejemplo, las proteínas activina B homodim�rica (βB-ΒB) o la activina AB heterodim�rica (βLa-ΒB), activina BC (βB-ΒC), activina BD (βB-ΒD) o activina BE (βB-ΒE). Preferentemente, dicha molécula de activina es activina B.

La referencia a "modulación" debe entenderse como una referencia a la regulaci�n por aumento o a la regulaci�n por dismnico�n de la respuesta inflamatoria sujeto. La referencia a "regulaci�n negativa" de una respuesta inflamatoria 55 se debe entender, por tanto, como una referencia a la prevención, reducción (por ejemplo, ralentizaci�n) o, de otra manera, inhibición de uno o más aspectos de una respuesta inflamatoria, mientras que la referencia a "regulaci�n por aumento" debe entenderse que tiene el sentido inverso. En el contexto de la presente invención, la modulación de la respuesta inflamatoria se logra a través de la regulaci�n por aumento o la regulaci�n negativa de la cascada de citocinas proinflamatorias. Aunque el método preferido es el de regular negativa la respuesta inflamatoria en el contexto de afecciones caracterizadas por una respuesta inflamatoria no deseada, tales como inflamación de las vías respiratorias, sepsis, septicemia, meningitis, artritis reumatoide o traumatismo de los tejidos, la presente invención, sin embargo, se extiende a la regulaci�n por aumento de la respuesta inflamatoria en circunstancias en las que se desea que se produzca una respuesta inflamatoria. Esto puede ocurrir, por ejemplo, en situaciones en las que se requiere una respuesta inflamatoria para proporcionar una actividad de tipo adyuvante. Esto puede ser

65 particularmente útil en el contexto de la terapia anti-tumoral. En otra forma de realización, la regulaci�n por aumento de los mecanismos de defensa del huésped puede ser deseable.

La inflamación es un proceso biológico complejo que implica la interacción, en forma de cascada, de numerosos mediadores solubles. Brevemente, la cascada de citocinas y otros mediadores inflamatorios que actúan para inducir una respuesta inflamatoria se puede representar esquemáticamente del siguiente modo:

I. II.: Citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-1, IL-6) Citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-1, IL-6)

↓

I. II.: Activación de monocitos y Linfocitos T Interacción adhesiva monocitos-células endoteliales

↓

I. II. III.: Inducción y Liberación de Moléculas de Adhesión (sICAM-1, sVCAM-1) inducción de síntesis de quimiocinas (MCP-1, MIP-1α, RANTES) Sobreexpresi�n de citocinas hematopoy�ticas (M-CSF, GM-CSF)

↓

I. II. III. IV.: Producción de otras citocinas. Generación de radicales libres III. NO Sobreproducción Apoptosis

↓

I. II. III.: Destrucción de tejidos Remodelación del tejido Pérdida de funciones

De acuerdo con lo anterior, la referencia a "cascada de mediadores proinflamatorios" o "cascada de citocinas proinflamatorias" debe entenderse como una referencia a la interacción secuencial de moléculas solubles que caracterizan la aparición y progresión de una respuesta inflamatoria. En particular, el inicio de una cascada de 10 mediadores inflamatorios se caracteriza por la regulaci�n por aumento secuencia de la expresión de TNF-α, IL-1 e IL-6. .Sin embargo, todo el proceso inflamatorio se caracteriza, no obstante, por cambios secuenciales en los niveles de varias citocinas (el término "citocinas" debe entenderse ampliamente que incluye referencia a las interleucinas, quimiocinas, monocinas, factores estimulantes de colonias y otras hormonas proteicas de este tipo). A pesar de las observaciones anteriores de que los niveles de activina est�n modulados en mamíferos que experimentan una 15 respuesta inflamatoria, no se entiende el papel preciso de la activina en este contexto. Para este fin, todavía se entiende en general que las citocinas proinflamatorias est�n constituidas por TNF-α, IL-1 e IL-6. Aún más, y sin limitar la presente invención de ninguna manera, el TNF-α se secreta en respuesta a diversos estímulos proinflamatorios y ejerce una amplia variedad de efectos. A bajas concentraciones, actúa como una molécula paracrina y autocrina, regulanado por incremento las moléculas de adhesión vascular, activando los neutr�filos y 20 estimulando los monocitos para que secreten interleucina 1, 6 y más TNF-α. A concentraciones más altas, el TNF-α entra en el suero y se convierte en una hormona endocrina. Aquí, actúa como un pir�geno, estimula aún más la liberación de citocinas a partir de células mononucleares, activa el sistema de coagulación y suprime la maduración de las células madre de la médula ósea. A concentraciones aún más altas, el TNF-α tiene muchos efectos nocivos, incluyendo la hipotensi�n (probablemente a través de la inducción de la síntesis de óxido nítrico [NO]) y la inducción

25 de coagulación intravascular diseminada (CID).

La IL-1 también se produce en las células mononucleares activadas en respuesta a estímulos proinflamatorios. La IL-1 tiene dos formas: IL-1α e IL-1β. La IL-1α es activa como su molécula de 33 kDa; la IL-1β necesita ser escindido adicionalmente en un p�ptido biol�gicamente activo de 17 kDa. Los efectos endocrinos de dosis altas de IL-1β son

30 similares al TNF-α, y causan fiebre, CID y desgaste metabólico. Los monocitos activados también producen IL-6 en respuesta a la estimulaci�n de IL-1 y TNF-α. La IL-6 actúa después sobre los hepatocitos y las células B para propagar el proceso inflamatorio. Con estimulaci�n de IL-6, los hepatocitos secretan mayores niveles de reactantes de fase aguda, tales como el fibrin�geno. La IL-6 también actúa como factor de crecimiento de células B, de modo que estimula la formación y la liberación de anticuerpos.

35 En términos de la modulación de la respuesta inflamatoria (particularmente regulaci�n negativa de la respuesta), la modulación de la cascada de citocinas ha sido un foco principal. Se han hecho intentos de alterar la cascada de citocinas proinflamatorias para bloquear una molécula inflamatoria en particular, alterando de este modo, teóricamente, la cascada y beneficiando potencialmente al paciente. El TNF-α y la IL-1 son dos de tales moléculas

40 dirigidas a la modulación.

Las terapias con anticuerpo anti-TNF-α y antagonista del receptor de la IL-1 se han probado. Sin embargo, hasta la fecha, usar como objetivo una citocina o mediador inflamatorio específico para inmunoterapia ngeneralmente no se ha demostrado que sea una propuesta útil para el tratamiento. En este sentido, generalmente se ha considerado 45 que, puesto que cualquier citocina o mediador es sólo un componente de la cascada, la neutralización de un agente es poco probable que regule por disminución toda la cascada. Es por estas razones por lo que los presentes hallazgos son tan sorprendentes. En primer lugar, se ha determinado que la cascada de mediador proinflamatorio,

desde sus fases más tempranas, implica la modulación del nivel de expresión de activina A. Específicamente, los niveles de activina A se incrementan poco después del estímulo inflamatorio y antes de la expresión de TNF-α, IL-1 e IL-6. De acuerdo con lo anterior, la activina A parece estar implicada en la iniciación de la cascada de citocinas proinflamatorias. Aún más, se ha determinado que la regulaci�n negativa de la funcionalidad de la de activina A, de

5 hecho, puede lograr el resultado favorable de regular por disminución la respuesta inflamatoria. Un papel para la activina B durante las primeras etapas de la cascada de citocinas proinflamatorias también se ha aclarado sorprendentemente. Aún más sorprendentemente, sin embargo, ha sido la determinación de que los niveles de activina B que se observan durante esta fase de una respuesta inflamatoria son significativamente mayores que los correspondientes niveles de activina A.

En el presente documento se describe un procedimiento de modulación de la respuesta inflamatoria en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la modulación de la actividad funcional de la activina, en la que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende la subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en la que la regulaci�n por aumento de dicha activina hasta un nivel funcionalmente eficaz en dicho

15 mamífero induce, mantiene o aumenta la cascada de citocinas proinflamatorios y la disminución de dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz en dicho mamífero inhibe o retrasa la la cascada de citocinas proinflamatorias.

Preferentemente, dicha activina es activina A y / o activina B.

En una realización, la presente invención est� dirigida a la folistatina para uso en un método de regulaci�n negativa, una respuesta inflamatoria local en un mamífero, comprendiendo dicho método la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y/o la activina B, para inhibir o retrasar la cascada de citocinas proinflamatorias locales.

25 Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria local es aguda.

En otra realización preferida, la presente invención est� dirigida a la folistatina para uso en un método de regulaci�n negativa, una respuesta inflamatoria sist�mica en un mamífero, comprendiendo dicho método la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y/o la activina B, para inhibir o retrasar la cascada de citocinas proinflamatorias sist�micas.

Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria sist�mica es aguda.

De acuerdo con estos aspectos preferidos de la presente invención, dicha respuesta inflamatoria aguda est�,

35 preferentemente, regulada por disminución y se produce en el contexto de, o est� asociado de otro modo con, shock séptico, septicemia, inflamación de las vías respiratorias, apendicitis, meningitis, respuesta hepática a toxinas o virus, angiog�nesis, psoriasis, protección de los nervios, aterosclerosis, necrosis tubular renal, encefalitis o cicatrización de heridas o lesiones traumáticas, como ocurre con lesiones, cirugía y quemaduras (por ejemplo, lesiones cerebrales traumáticas).

Preferentemente, dicha inflamación de las vías respiratorias se produce en el contexto de asma, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis qu�stica, trasplante de pulmón, SDRA, bronquiolitis obliterante, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva, asbestosis, apnea obstructiva del sueño, hipoxia o hipertensión pulmonar.

45 Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria sist�mica aguda se produce en el contexto de un síndrome de respuesta inflamatoria sist�mica y aún más particularmente sepsis, septicemia, shock tóxico, shock séptico, traumatismo tisular, meningitis o apendicitis.

En otra realización preferida, dicha enfermedad inflamatoria es crónica.

A�n más preferentemente, dicha respuesta inflamatoria crónica se produce en el contexto de, o est� asociado de otro modo con, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, asma, psoriasis o cicatrización de heridas.

55 De acuerdo con estas realizaciones preferidas, dicha cascada de citocinas proinflamatorias corresponde a la expresión de TNF-α, IL-1 y / o IL-6.

Debe entenderse que, en términos de modulación de la cascada de citocinas proinflamatorias, esto puede lograrse ya sea mediante la modulación de los niveles reales de estas citocinas o por la modulación de su funcionalidad. Por ejemplo, y sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, se ha demostrado que la administración de folistatina (esta molécula funciona como un antagonista de la activina) antes de la exposición a LPS de un mamífero, no obstante, resulta en la expresión de un pico de activina A a una concentración que es la misma que se observa normalmente durante la inflamación. Sin embargo, debido a la unión de la folistatina a la activina A, bloqueando de este modo la funcionalidad de activina A, la concentración de TNF-α que se expresa 65 desciende en un 50 %. Es interesante el hecho de que se observa que la concentración de IL-6 aumenta 6 veces en un punto de tiempo significativamente más temprano. En total, estos cambios en el perfil de citocinas

proinflamatorias, sin embargo, dan lugar a una disminución en la respuesta inflamatoria observada. Estos hallazgps se basan en la medición de proteínas y, por tanto, indican la secreción y / o liberación de activina madura proteína dim�rica. Por consiguiente, el tratamiento previo con folistatina no parece afectar este proceso. Sin embargo, cuando se mide el ARNm de la activina �A y / o βB, el pretratamiento con folistatina mejora, de hecho, los mecanismos de

5 síntesis de los genes de las subunidades de activina. Con respecto a la subunidad �A de la activina, la inhibición del ARNm no se refleja en la liberación de proteínas. El mismo mecanismo se postula para aplicar en el contexto de la activina βB. De acuerdo con lo anterior, todavía sin limitar la presente invención de ninguna manera, se produce una rápida liberación de la proteína esencialmente prealmacenada y después una vía de síntesis regulada por folistatina que est� separada de este mecanismo de liberación. No obstante, de más importancia es la determinación inesperada de que se observa un pequeño aumento delATNm de la activina después de la estimulaci�n inflamatoria, pero un aumento masivo del ARNm de la activina βB mediante la misma estimulaci�n.

En el presente documento, la referencia a la consecución de un "nivel funcionalmente eficaz" o "nivel funcionalmente ineficaz" de activina debe entenderse como una referencia a la consecución de ese nivel de activina en el que la

15 modulación de la respuesta inflamatoria se puede lograr, ya sea regulaci�n por aumento o la regulaci�n negativa. A este respecto, est� dentro de la habilidad del experto en la técnica para determinar, utilizando procedimientos de rutina, el nivel de umbral de expresión de activina encima del cual o por debajo del cual la inflamación se modula.

Se debe entender que la referencia a un "nivel eficaz" significa el nivel necesario para lograr al menos en parte, la respuesta deseada. La cantidad puede variar dependiendo de la salud y el estado f�sicao de la población celular y / o el individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico de la población celular y / o individuo que se est� tratando, el grado de regulaci�n por aumento o por disminución que se desee, la formulación de la composición que se utiliza, la evaluación de la situación m�dica y otros factores relevantes. De acuerdo con lo anterior, cabe esperar que este nivel puede variar entre las situaciones individuales, de modo que entran en un amplio intervalo, que puede

25 determinarse mediante ensayos de rutina.

La modulación de los niveles de activina se puede conseguir mediante cualquier medio adecuado incluyendo, entre otros:

(i): La modulación de los niveles absolutos de activina de tal manera que haya más o menos activina presente en el entorno celular.

(ii): El agonismo o antagonismo de la actividad funcional de la proteína activina de un modo tal que la eficacia funcional de la activina se aumenta o se reduce. Por ejemplo, el aumento de la semivida de la activina puede

35 lograr un aumento en el nivel funcionalmente eficaz de activina sin llegar a necesitar realmente un aumento en la concentración absoluta de la activina. Del mismo modo, el antagonismo parcial de la activina puede actuar para reducir, aunque no necesariamente eliminar, la eficacia funcional de dicho activina. De acuerdo con lo anterior, esto puede proporcionar un medio de regulaci�n negativa de la activina sin necesariamente regular por disminución las concentraciones absolutas de activina.

En términos de lograr la regulaci�n por aumento o por disminución de la activina, medios para alcanzar este objetivo serían bien conocidos por la persona experta en la técnica e incluyen, entre otros:

(i) Introducir en una célula una molécula de ácido nucleico que codifica la activina o con el fin de regular por 45 incremento la capacidad de dicha célula para expresar la activina.

(ii) Introducir en una célula una molécula proteica o no proteica que modula la regulaci�n de la transcripción y / o traducción de un gen, en el que este gen puede ser el gen de la activina o una parte funcional del mismo o algún otro gen o región del gen (por ejemplo, región promotora) que directa o indirectamente modula la expresión del gen de la activina.

(iii) Introducir en una célula el producto de expresión de activina (esto debe entenderse que incluye el uso de homólogos de la activina).

55 (iv) Introducción de una molécula proteica o no proteica que funciona como antagonista del producto de expresión de la activina.

(v) Introducción de una molécula proteica o no proteica que funciona como agonista del producto de expresión de la activina.

Las moléculas proteicas descritas anteriormente se pueden derivar de cualquier fuente adecuada, tal como fuentes naturales, recombinantes o sintéticos e incluye proteínas de fusión o moléculas que se han identificado después de, por ejemplo, detección selectiva de productos naturales. La referencia a moléculas no proteicas puede ser, por ejemplo, una referencia a una molécula de ácido nucleico o puede ser una molécula derivada de fuentes naturales, 65 tales como por ejemplo, detección selectiva de productos naturales o puede ser una molécula sintetizada químicamente. La presente invención contempla análogos del producto de expresión de la activina o pequeñas

mol�culas capaces de actuar como agonistas o antagonistas. Agonistas químicos pueden no necesariamente derivar del producto de expresión de la activina, pero pueden compartir ciertas similitudes conformacionales. Alternativamente, los agonistas químicos pueden diseñarse específicamente para satisfacer ciertas propiedades f�sicoqu�micas. Los antagonistas pueden ser cualquier compuesto capaz de bloquear, inhibir o, de otro modo,

5 prevenir que la activina de lleve a cabo su función biológica normal. Los antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales y ácidos nucleicos antisentido que impiden la transcripción o traducción de los genes o el ARNm de la activina en células de mamífero. La mdulaci�n de la expresión también puede conseguirse utilizando ant�genos, ARN, ribosomas, ADNzimas, apt�meros, anticuerpos o moléculas adecuadas para su uso en cosupresi�n. Las secuencias de oligonucle�tidos antisentido adecuadoas (fragmentos de ADN de cadena sencilla) de la activina pueden crearse o identificarse por su capacidad para suprimir la expresión de la activina. La producción de oligonucle�tidos antisentido para una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein and Cohen, 1988 (Cancer Res 48:2659 -68) and van der Krol et al., 1988 (Biotechniques 6:958 -976).

En el contexto de los anticuerpos, en el presente documento se describe el uso de cualquier forma adecuada de

15 anticuerpos, incluyendo anticuerpos catalíticos o derivados, homólogos, análogos o miméticos de dichos anticuerpos. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser de origen natural seleccionado de activina o de sus subunidades o pueden producirse específicamente para el d�mero activina o sus mon�meros (en el presente documento se hace referencia como el "ant�geno"). En el caso de este último, el ant�geno puede primero necesitar asociarse con una molécula portadora. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos se pueden usar, tales como fragmentos Fab o Fab '2. Además, la presente invención se extiende a anticuerpos recombinantes y sintéticos y a híbridos de anticuerpos. Un "anticuerpo sintético" se considera en el presente documento que incluye fragmentos e híbridos de anticuerpos. El ant�geno también se puede utilizar para la detección de anticuerpos de origen natural.

25 Ambos anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden obtener por inmunizaci�n con el ant�geno o derivado, homólogo, análogo, mutante, o mimético del mismo y cualquier tipo es utilizable terapéuticamente.Los métodos para obtener ambos tipos de sueros son bien conocidos en la técnica.Los sueros policlonales son menos preferidos pero se preparan de manera relativamente fácil por inyección de un animal de laboratorio adecuado con una cantidad eficaz de ant�geno, o partes antig�nicas de los mismos, recogida de suero del animal, y aislando sueros específicos por cualquiera de las técnicas inmunoadsorbentes conocidas.Aunque los anticuerpos producidos por este método son utilizables, por lo general son menos favorecidos debido a la heterogeneidad potencial del producto.

El uso de anticuerpos monoclonales se prefiere particularmente debido a la capacidad para producirlos en grandes cantidades y la homogeneidad del producto.La preparación de líneas celulares de hibridoma para la producción de

35 anticuerpo monoclonal derivado por fusión de una línea celular inmortal y linfocitos sensibilizados contra la preparación inmunog�nica se puede hacer mediante técnicas que son bien conocidas por aquellos que son expertos en la técnica.(Véase, por ejemplo Douillard y Hoffman, ABC de hibridomas, en Compendio de Inmunolog�a Vol. II, ed. por Schwartz, 1981; Kohler y Milstein, Nature 256: 495-499, 1975; European Journal of Immunology 6: 511-519, 1976).

Preferentemente, el anticuerpo se une específicamente al ant�geno.Por "se une específicamente" se quiere decir alta avidez y / o alta afinidad de unión de un anticuerpo a un ant�geno específico.La unión a su ep�topo en este ant�geno de anticuerpos específicos es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro ep�topo, particularmente aquellos que pueden estar presentes en moléculas en asociación con, o en la misma muestra, como el ant�geno

45 específico de interés.Los anticuerpos que se unen específicamente a un polip�ptido de interés pueden ser capaces de unirse a otros polip�ptidos a un débil, todavía detectable, nivel (por ejemplo, 10 % o menos de la unión mostrada al polip�ptido de interés).Tal débil fondo vinculante o vinculante, es fácilmente discernible desde el anticuerpo específico de unión al polip�ptido de interés, por ejemplo, mediante el uso de controles apropiados.

Las moléculas proteicas y no proteicas a las que se hace referencia en los puntos (i) -(v) anteriores, en lo sucesivo en el presente documento se denominan "agentes moduladores". En la medida en que se busca disminuir la actividad de activina, dicho agente modulador puede ser:

(ii) cualquier agente que regula por aumento la expresión o función de la subunidad α de la inhibina.La subunidad

55 α puede dimerizar con las subunidades β de la activina para formar inhibina, de este modo regula por disminución eficazmente los niveles de activina.

(iii) inhibina. Esta molécula puede unirse a la β-glucano e inhibir las acciones de la activina través de su receptor. Véase por ejemplo el mecanismo descrito por Xuet y col. (1995) o el uso del antagonista Smad7 (Bernard et al.2004).

(iv): cualquier agente que regula por aumento los niveles de βC , ya que esto resulta en la formación de la forma inactiva de CA de la activina.

(v): anticuerpo neutralizante de activina.Por ejemplo, como se describe en Poulakiet al. (2004)

(vii) mutants de activina que inhiben la activina nativa de la unión a su receptor. Por ejemplo, como se describe en Harrison et al. 2004.

65 (vii) transfecci�n o el tratamiento con un receptor de activina mutante que impide la se�alizaci�n normal de la activina. Véase, por ejemplo, el sistema descrito por Maeshima et al. (2004)

La folistatina se puede administrar ya sea como una proteína o su sobreexpresi�n puede ser inducida in vivotal como a través del sistema mediada por adenovirus descrito por Takabe et al.2003.

5 A este respecto, la referencia a "folistatina" se debe leer como incluyendo la referencia a todas las formas de folistatina incluyendo, a modo de ejemplo, los tres núcleos de proteínas y seis formas de peso molecular que se han identificado como derivado del ARNm empalmados alternativamente FS288 FS315 y .En consecuencia, también debe entenderse que incluye la referencia a cualquier isoformas que puedan derivarse de corte y empalme alternativo de ARNm folistatina o formas mutantes o polim�rficos de folistatina.Debe entenderse aún más para extender a cualquier proteína codificada por el gen de la folistatina, cualquier polip�ptido de la subunidad, tales como formas precursoras que pueden ser generadas, y cualquier proteína folistatina, existente como un mon�mero, mult�mero o proteína de fusión.Una definición análoga se aplica a "inhibina".

La detección de los agentes moduladores se han definido anteriormente se puede lograr por cualquiera de varios

15 métodos adecuados, incluyendo, pero de ninguna manera limitada a, en contacto una célula que comprende el gen de la activina o equivalente funcional o derivado del mismo con un agente y la detección de la modulación de la proteína activina producción o la actividad funcional, la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica la activina molécula o la modulación de la actividad o expresión de una diana celular activina corriente abajo.La detección de esta modulación se puede lograr utilizando técnicas tales como transferencia Western, ensayos de cambio de movilidad electrofor�tica y / o de la lectura de los reporteros de la actividad activina como luciferasas, CAT y similares.

Se debe entender que el gen de la activina o equivalente funcional o derivado de la misma pueden ser de origen natural en la célula que es el sujeto de prueba o puede haber sido transfectado en una célula huésped para fines de 25 ensayo.Además, el gen de origen natural o transfectada puede ser expresado constitutivamente -proporcionando de esta manera un modelo útil para, entre otras cosas, la detección de agentes que regulan a la baja la actividad de activina, en ya sea el ácido nucleico o la expresión de los niveles de productos, o el gen puede requerir la activación -por lo tanto proporcionar un modelo útil para, entre otras cosas, la detección de agentes que hasta de regular la expresión de la activina.Además, en la medida en que una molécula de ácido nucleico activina se transfecta en una célula, esa molécula puede comprender todo el gen activina o puede comprender simplemente una porción del gen tal como la parte que regula la expresión del producto activina.Por ejemplo, la región promotora activina puede transfectarse en la célula, que es el objeto de ensayos.En este respecto, cuando se utiliza sólo el promotor, la detección de la modulación de la actividad del promotor se puede lograr, por ejemplo, ligando el promotor a un gen reportero.Por ejemplo, el promotor puede ser ligado a la luciferasa o un informador CAT, la modulación de la

35 expresión de gen que se puede detectar a través de la modulación de la intensidad de la fluorescencia o actividad de reportero CAT, respectivamente.En otro ejemplo, el tema de la detección podría ser un objetivo de regulaci�n activina corriente abajo, en lugar de activina en s�.Sin embargo, otro ejemplo incluye los sitios de unión de activina ligó a un reportero mínima.Modulación de la actividad activina puede ser detectado por la detección de la modulación de la liberación de citocinas proinflamatorias.Este es un ejemplo de un sistema indirecto en donde la modulación de la expresión de la activina, per se, no es el tema de la detección.Más bien, la modulación de la actividad corriente abajo que regula la activina se controla.

Estos métodos proporcionan un mecanismo para la realización de cribado de alto rendimiento de agentes moduladores putativos, tales como los agentes proteicos o no proteicos que comprenden sintética, combinatoria,

45 química y bibliotecas naturales.Estos métodos también facilitar la detección de agentes que se unen ya sea la molécula de activina de ácido nucleico o producto de expresión en s� o que modulan la expresión de una molécula de corriente arriba, que posteriormente molécula de corriente arriba modula la expresión o actividad de activina producto de expresión.De acuerdo con ello, estos métodos proporcionan un mecanismo de agentes que ya sea directamente o indirectamente modulan la expresión y / o actividad de activina detectar.

Los agentes que se utilizan de acuerdo con el método de la presente invención pueden tomar cualquier forma adecuada.Por ejemplo, los agentes proteicos pueden ser glicosilada o no glicosilada, fosforilada o defosforilado en diversos grados y / o pueden contener otras varias moléculas usadas, ligados, ligados o asociados de otro modo con las proteínas, tales como amino�cidos, lípidos, carbohidratos u otros p�ptidos, polip�ptidos o proteínas.Del mismo

55 modo, los sujetos moléculas no prote�nicas también pueden tomar cualquier forma adecuada.Tanto los agentes proteicos y no proteicos descritos en este documento pueden estar unidos, con destino asociado de otro modo con otras moléculas protein�ceas o no protein�ceas.Por ejemplo, en una realización de la presente invención, dicho agente se asocia con una molécula que permite su orientación a una región localizada.

La molécula proteica o no prote�nico sujeto puede actuar directa o indirectamente para modular la expresión de la activina o la actividad del producto de expresión activina.Dicha molécula actúa directamente si se asocia con la molécula de ácido nucleico o la expresión del producto de activina para modular la expresión o actividad, respectivamente.Dicha molécula actúa indirectamente si se asocia con una molécula distinta de la molécula de ácido nucleico activina o producto de expresión que modula otra molécula, ya sea directamente o indirectamente la 65 expresión o actividad de la molécula de ácido nucleico activina o producto de expresión, respectivamente.Por consiguiente, el método de la presente invención abarca la regulaci�n de la activina expresión molécula de ácido

nucleico o la actividad del producto de expresión a través de la inducción de una cascada de pasos de regulaci�n.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción de una molécula de ácido nucleico.La referencia a "producto de expresión" es una referencia al producto producido a partir de la transcripción y traducción de una 5 molécula de ácido nucleico.La referencia a la "modulación" debe ser entendida como una referencia a la regulaci�n o baja regulaci�n.

"Derivados" de las moléculas descritas en este documento (por ejemplo, activina A, activina B, folistatina o otros agentes proteicos o no proteicos) incluyen fragmentos, partes, porciones o variantes de fuentes naturales o no naturales.Las fuentes no naturales incluyen, por ejemplo, recombinantes o de fuentes sintéticas.Por "fuentes recombinantes" se entiende que la fuente celular de la que se cosecha la molécula sujeto ha sido alterado genéticamente.Esto puede ocurrir, por ejemplo, con el fin de aumentar o de otra manera mejorar la velocidad y el volumen de producción por esa fuente celular particular.Las partes o fragmentos incluyen, por ejemplo, las regiones activas de la molécula.Los derivados se pueden derivar de la inserción, deleci�n o sustitución de amino�cidos.Los

15 derivados por inserción de amino�cidos incluyen amino y / o fusiones terminales carbox�licos as� como inserciones intrasecuencia de amino�cidos individuales o múltiples.Variantes de la secuencia de amino�cidos de inserción son aquellas en las que uno o más residuos de amino�cidos se introducen en un sitio predeterminado en la proteína aunque la inserción aleatoria también es posible con el cribado adecuado del producto resultante.Las variantes de deleci�n se caracterizan por la eliminación de uno o más amino�cidos de la secuencia.Variantes de amino�cidos por sustitución son aquellas en las que al menos un residuo en una secuencia ha sido eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar.Adiciones a secuencias de amino�cidos incluyen fusiones con otros p�ptidos, polip�ptidos o proteínas, como se detalla más arriba.

Los derivados también incluyen fragmentos que tienen ep�topos particulares o partes de toda la proteína fusionada a

25 p�ptidos, polip�ptidos u otras moléculas protein�ceas o no protein�ceas.Por ejemplo, folistatina, o derivado del mismo se pueden fusionar a una molécula para facilitar su localización a un sitio en particular.Los análogos de las moléculas contempladas en este documento incluyen, pero no se limitan a, modificación a cadenas laterales, incorporación de amino�cidos no naturales y / o sus derivados durante el p�ptido, polip�ptido o la síntesis de proteínas y el uso de reticulantes y otros métodos que imponen restricciones conformacionales sobre la moléculas protein�ceas o sus análogos.

Los derivados de secuencias de ácidos nucleicos contempladas en este documento pueden de manera similar pueden derivar de sustituciones simples o múltiples nucleótidos, deleciones y / o adiciones incluida la fusión con otras moléculas de ácido nucleico.Los derivados de las moléculas de ácido nucleico utilizadas incluyen

35 oligonucle�tidos, cebadores de PCR, moléculas antisentido, moléculas adecuadas para su uso en cosupresi�n y la fusión de moléculas de ácido nucleico.Los derivados de las secuencias de ácidos nucleicos también incluyen variantes degeneradas.

Una "variante" o "mutante" de activina o folistatina deben entenderse en el sentido de las moléculas que muestran al menos parte de la actividad funcional de la forma de activina o folistatina de la que es una variante o mutante.Una variación o mutación puede adoptar cualquier forma y puede ser natural o no natural.

Un "homólogo" se quiere decir que la molécula se deriva de una especie distinta de la que est� siendo tratado.Esto puede ocurrir, por ejemplo, donde se determina que una especie distinta de la que est� siendo tratada produce una

45 forma de activina o folistatina, por ejemplo, que presenta características funcionales similares y adecuados a la de la activina o folistatina que se produce naturalmente por el tratamiento sujeto sometido a estudio.

Qu�mica y equivalentes funcionales deben entenderse como moléculas que exhiben una o más de las actividades funcionales de la molécula sujeto, que los equivalentes funcionales pueden ser derivados de cualquier fuente tales como ser sintetizado o identificado a través de procesos de selección, tales como el cribado de productos naturales químicamente.Por ejemplo equivalentes químicos o funcionales pueden ser diseñados y / o identificarse utilizando métodos bien conocidos tales como la química combinatoria o cribado de alto rendimiento de bibliotecas recombinantes o posterior a la selección de productos naturales.Agentes antagonistas también pueden ser examinados para la utilización de tales métodos.

55 Por ejemplo, bibliotecas que contienen moléculas orgánicas pequeñas pueden ser examinados, en el que se utilizan moléculas orgánicas que tienen un gran número de sustituciones de grupos de padres específicos.Un esquema sintético general puede seguir los métodos publicados (por ejemplo, Bunin BA, et al. (1994) Proc.Natl.Acad.Ciencia.EE.UU., 91:4708-4712; DeWitt SH, et al. (1993) Proc.Natl.Acad.Ciencia.EE.UU., 90:69096913).En pocas palabras, en cada etapa de síntesis sucesiva, uno de una pluralidad de diferentes sustituyentes seleccionado se añade a cada uno de un subconjunto seleccionado de tubos en una matriz, con la selección de subconjuntos de tubo son tales como para generar todas las permutaciones posibles de los diferentes sustituyentes empleados en la producción de la biblioteca.Una estrategia de permutación adecuada se describe en US. Patent No. 5,763,263.

65 En la actualidad existe un gran interés en el uso de bibliotecas combinatorias de moléculas orgánicas al azar para buscar compuestos biol�gicamente activos (véase, por ejemplo U.S. Patent No. 5,763,263).Los ligandos descubiertos por la selección de bibliotecas de este tipo pueden ser útiles en la imitación o el bloqueo de los ligandos naturales o interferir con los ligandos de origen natural de una diana biológica.En el presente contexto, por ejemplo, se pueden utilizar como punto de partida para el desarrollo de análogos de activina que presentan

5 propiedades tales como efectos farmacol�gicos más potentes.La activina o una parte del mismo pueden funcional de acuerdo con la presente invención se usa en las bibliotecas de combinación formada por diversos métodos de síntesis en fase sólida o en fase de solución (véase, por ejemplo U.S. Patent No. 5,763,263y las referencias citadas en el mismo).Mediante el uso de técnicas, tales como el descrito en U.S. Patent No. 5,753,187, Millones de nuevos compuestos químicos y biológicos y / o pueden ser examinados de manera rutinaria en menos de un par de semanas.Del gran número de compuestos identificados, se analizó adicionalmente aquéllos que tengan actividad biológica apropiada.

Con respecto a los métodos de cribado de bibliotecas de alto rendimiento, oligom�rico o compuestos de la biblioteca de moléculas pequeñas capaces de interactuar específicamente con un agente biológico seleccionado, tal como una

15 biomol�cula, un complejo de macromolécula, o célula, se tamizan utilizando un dispositivo de biblioteca combinatoria que es fácilmente elegido por la persona experta en la técnica a partir de la variedad de métodos bien conocidos, tales como los descritos anteriormente.En un procedimiento de este tipo, cada miembro de la biblioteca se proyect� por su capacidad para interaccionar específicamente con el agente seleccionado.En la práctica del método, un agente biológico se introduce en tubos que contienen compuestos y se deja interactuar con el compuesto de biblioteca individual en cada tubo.La interacción est� diseñado para producir una señal detectable que se puede utilizar para controlar la presencia de la interacción deseada.Preferentemente, el agente biológico est� presente en una solución acuosa y otras condiciones est�n adaptados en función de la interacción deseada.La detección puede llevarse a cabo por ejemplo mediante cualquier método basado funcional o no funcional bien conocido para la detección de sustancias.

25 Además de la detección de moléculas que imitan la actividad de activina uno puede identificar y utilizar moléculas que funcionan de forma agonista o antag�nicamente a la activina con el fin regular por aumento o por disminución la actividad funcional de la activina en relación a modular el crecimiento celular. El uso de tales moléculas se describe con más detalle a continuación. En la medida en que la molécula sujeto es protein�ceo, que se puede derivar, por ejemplo, a partir de fuentes naturales o recombinantes, incluyendo proteínas de fusión o siguientes, por ejemplo, los métodos de selección descritos anteriormente. La molécula no prote�nico puede ser, por ejemplo, un producto químico o molécula sintética que también ha sido identificado o generada de acuerdo con la metodología anteriormente identificado. Por consiguiente, se contempla aquí es el uso de análogos químicos de la activina capaces de actuar como agonistas o antagonistas. Agonistas químicos pueden no necesariamente ser derivados de

35 la activina, pero pueden compartir ciertas similitudes conformacionales. Alternativamente, los agonistas químicos se pueden diseñar específicamente para imitar ciertas propiedades fisicoqu�micas de la activina. Los antagonistas pueden ser cualquier compuesto capaz de bloquear, inhibir o de otro modo la prevención de activina de llevar a cabo sus funciones biológicas normales. Los antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales específicos para la activina

o partes de la activina.

An�logos de activina o de agonista activina o agentes antagónicos contemplados en este documento incluyen, pero no se limitan a, modificaciones de cadenas laterales, la incorporación de ácidos y / o derivados de amino�cidos no naturales durante el p�ptido, polip�ptido o la síntesis de proteínas y el uso de reticulantes y otros métodos que imponen restricciones conformacionales sobre los análogos. La forma específica que dichas modificaciones pueden

45 tomar depender� de si la molécula objeto es proteico o no proteico. La naturaleza y / o de la idoneidad de una modificación particular se pueden determinar rutinariamente por la persona experta en la técnica.

Por ejemplo, ejemplos de modificaciones de cadena lateral contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como por alquilaci�n reductora por reacción con un aldeh�do seguido por reducción con NaBH4; amidinaci�n con metilacetimidato; acilaci�n con anh�drido acético; carbamoilaci�n de grupos amino con cianato; trinitrobencilaci�n de grupos amino con 2, 4, 6-ácido sulf�nico trinitrobenceno (TNBS); acilaci�n de grupos amino con anh�drido succ�nico y anh�drido tetrahidroft�lico; y piridoxilaci�n de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido por reducción con NaBH4.

55 El grupo guanidina de residuos de arginina puede ser modificado por la formación de productos de condensación heteroc�clicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo puede modificarse por activación de carbodiimida a través de la formación de O-acilisourea seguido de derivatizaci�n posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente.

Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse por métodos tales como carboximetilaci�n con ácido yodoac�tico o yodoacetamida; oxidación de ácido perf�rmico a ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol; reacción con maleimida, anh�drido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercuriales utilizando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulf�nico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4

65 nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilaci�n con cianato a pH alcalino.

Residuos de tript�fano pueden modificarse mediante, por ejemplo, oxidación con N-bromosuccinimida o alquilaci�n del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo.Los residuos de tirosina por otro lado, pueden ser alterados por nitraci�n con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.

5 La modificación del anillo de imidazol de un residuo de histidina puede realizarse por alquilaci�n con derivados de ácido yodoac�tico o N-carboetoxilaci�n con dietilpirocarbonato.

Los ejemplos de incorporación de amino�cidos no naturales y derivados durante la síntesis de proteínas incluyen, pero no se limitan a, uso de norleucina, ácido but�rico 4-amino,-3-hidroxi-5-fenilpentanoico 4-amino ácido, ácido 6

10 aminohexanoico, t-butilglicina , norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina,-3-hidroxi-6-metilheptanoico 4-amino ácido, 2-tienil alanina y / o isómeros D de amino�cidos.Una lista de amino�cidos no naturales contemplados aquí se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1

Amino�cidos no convencionales Código Amino�cidos no convencionales C�digo�cido α-aminobut�rico Abu L-N-metilalanina Nmala α-amino-α-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg Aminociclopropano-carboxilato Cpro L-N-metilasparagina Nmasn

�cido L-N-methylaspartic Nmasp ácido aminoisobut�rico Aib L-N-metilciste�na Nmcys Aminonorbomil-carboxilato Norb L-N-metilglutamina Nmgln

�cido L-N-metilglut�mico Nmglu Ciclohexilalanina Chexa L-N-metilhistidina Nmhis Ciclopentilalanine CPES L-N-metilisolleucine Nmile D-alanina Dal L-N-metilleucina Nmleu D-arginina Darg L-N-metillisina Nmlys ácido D-asp�rtico DASP L-N-metilmetionina Nmmet D-ciste�na Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle D-glutamina Dgln L-N-methylnorvalina Nmnva ácido D-glut�mico Dglu L-N-metilornitina Nmom D-histidina DHIS L-N-metilfenilalanina Nmphe D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro D-leucina DLeu L-N-metilserina Nmser D-lisina DLys L-N-metiltreonina Nmthr D-metionina DMET L-N-metiltript�fano Nmtrp D-ornitina Dorn L-N-metiltirosina Nmtyr D-fenilalanina DPhe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina DSER L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina DTHR L-norleucina Nle D-tript�fano DTrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtyr α-metil-aminoisobutirato Maib D-valina Dval α-metil--aminobutirato Mgabu D-α-metilalanina Dmala α-metilciclohexilalanina Mchexa D-α-metilarginina Dmarg α-metilcilcopentilalanina Mcpen D-α-metilasparagina Dmasn α-metil-α-naftilalanina Manap D-α-metiaspartato Dmasp α-metilpenicilamina MPes D-α-metilciste�na Dmcys N-(4-aminobutol)glicina Nglu D-α-metilglutaminea Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg D-α-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Nom D-α-metilisoleucina Dmile N-amino-α-metilbutirato Nmaabu D-α-metileucina Dmleu α-naftilalanina Anap D-α-metilisina Dmlys N-bencilglicina Nphe D-α-metilmetionina Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln D-α-metilornitina Dmom N-(carbamilmetil)glicina Nasn D-α-metilfenilalanina Dmfe N-(2-carboxietil)glicina Nglu D-α-metilprolina Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp D-α-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-α-metiltreonina Dmtr N-cicloheptilglicina Nchep D-α-metiltriptofan Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex D-α-metiltirosina Dmti N-ciclodecilglicina Ncdec D-α-metilvalina Dmval N-cilcododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metilaspartato Dnmasp N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm D-N-metilcisteina Dnmcis N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe D-N-metilglutamina Dnmgln N-(3-guanidinopropil)glicina Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Nthr D-N-metilhistidina Dnmhis N-(hidroxietil))glicina Nser D-N-metilisoleucina Dnmile N-(imidazoliletil))glicina Nhis D-N-metilleucina Dnmleu N-(3-indolilietil)glicina Nhtrp D-N-metillisina Dnmlis N-metil-γ-aminobutirato Nmgabu N-metilciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmom N-metilciclopentilalanina Nmcpen N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe N-metilaminoisobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro N-(1-metilpropil)glicina Nile D-N-metilserina Dnmser N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltript�fano Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nval D-N-metiltirosina Dnmtir N-metila-naptilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicillamina Nmpen ácido γ-aminobut�rico Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr L-t-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys L-etilglicina Etg penicillamina Pen L-homofenilalanina Hfe L-α-metilalanina Mala L-α-metilarginina Marg L-α-metilasparagina Masn L-α-metilaspartato Masp L-α-metil-t-butilglicina Mtbug L-α-metilcisteina Mcis L-metiletilglicina Metg L-α-metilglutamina Mgln L-α-metilglutamato Mglu L-α-metilhistidina Mhis L-α-metilhomofenilalanina Mhphe L-α-metilisoleucina Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet L-α-metilleucina Mleu L-α-metillisina Mlys L-α-metilmetionina Mmet L-α-metilnorleucina Mnle L-α-metilnorvalina Mnva L-α-metilomitina Mom L-α-metilfenilalanina Mphe L-α-metilprolina Mpro L-α-metilserina Mser L-α-metilthreonina Mthr L-α-metiltrit�fanp Mtrp L-α-metiltirosina Mtyr L-α-metilvalina Mval L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe N-(N-(2,2-difeniletil) carbamilmetil)glicina 1-carboxi-1-(2,2-Nnbhm N-(N-(3,3-difenilpropil) Nnbhe difenil-Nmbc etilamino)ciclopropanpo carbamilmetil)glicina

Los reticuladores se pueden usar para, por ejemplo, estabilizar las conformaciones 3D usando reticuladores homobifuncionales tales como los ésteres imido bifuncionales que tienen grupos espaciadores (CH2)n con n=1 a n=6, glutaraldeh�do, ésteres N-hidroxisuccinimida y reactivos heterobifuncionales que normalmente contiene un resto

5 aminoreactivo tal como N-hidroxisuccinimida y otro resto reactivo específico de grupo.

La modulación de dichos niveles funcionales de activina se puede conseguir mediante la administración de dicha activina, una molécula de ácido nucleico que codicia dicha activina o un agente que efectúa la modulación de dicha actividad de activina o dicha expresión del gen de activina (en lo sucesivo denominado de forma colectiva “agentes

10 moduladores”). Preferentemente, el método sujeto se usa para regular por disminución la respuesta inflamatoria en un mamífero.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención est� dirigida a folistatina para uso en un método de regulaci�n negativa de la respuesta inflamatoria en un mamífero, comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero

15 una cantidad eficaz de folistatina durante un tiempo y en condiciones suficientes para inducir un nivel funcionalmente ineficaz de la activina, en el que la activina es activina A y/o activina B.

Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria se modula a través de la modulación de la cascada de citocinas proinflamatorias. Todav� más preferentemente, dicha cascada de citocinas proinflamatorias se caracteriza por la

20 expresión de TNF-α, IL-1 y / o IL-6.

M�s preferentemente, dicha respuesta inflamatoria es una respuesta inflamatoria local aguda o una respuesta inflamatoria sist�mica aguda.

25 De acuerdo con estas realizaciones preferidas de la presente invención, dicha respuesta inflamatoria aguda se produce en el contexto de, o est� asociado de otro modo con, shock séptico, septicemia, inflamación de las vías respiratorias, apendicitis, meningitis, respuesta hepática a toxinas o virus, angiog�nesis, psoriasis, protección de los nervios, aterosclerosis, necrosis tubular renal, encefalitis o cicatrización de heridas o lesiones traumáticas, como ocurre con lesiones, cirugía y quemaduras (por ejemplo, lesiones cerebrales traumáticas).

30 Preferentemente, dicha inflamación de las vías respiratorias se produce en el contexto de asma, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis qu�stica, trasplante de pulmón, SDRA, bronquiolitis obliterante, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva, asbestosis, apnea obstructiva del sueño, hipoxia o hipertensión pulmonar.

Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria sist�mica aguda se produce en el contexto de un síndrome de 5 respuesta inflamatoria sist�mica y aún más particularmente sepsis, septicemia, shock tóxico, shock séptico, traumatismo tisular, meningitis o apendicitis.

En otra realización preferida, dicha enfermedad inflamatoria es crónica.

Tambi�n se describe un método de regulaci�n por aumento de la respuesta inflamatoria en un mamífero,

15 comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un agente durante un tiempo y en condiciones suficientes para inducir un nivel funcionalmente eficaz de la activina, en el que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en dicho mamífero.

Preferentemente, dicha activina es activina A y / o activina B.

Preferentemente, dicho agente es el producto de expresión activina A o activina B.

El término “mamífero”, como se usa en el presente documento, incluye seres humanos, primates, animales granja

25 (por ejemplo, caballos, ganado vacuno, ovejas, cerdos, burros), animales de ensayo en laboratorio (p. ej., ratones, ratas, cobayas), animales de compa��a (p. ej., perros, gatos) y animales salvajes cautivos (p. ej., canguros, ciervos, zorros). Preferentemente, el mamífero es un ser humano o un animal de ensayo en laboratorio. Incluso más preferentemente, el mamífero es un ser humano.

La referencia a “inducir” deber� entenderse como referencia a alcanzar el nivel deseado de activina, sea un nivel funcionalmente eficaz o un nivel funcionalmente ineficaz. Más probablemente, dicha inducción se consiga mediante la regulaci�n por aumento o la regulaci�n negativa de la expresión de activina, como se ha descrito anteriormente, aunque cualquier otro medio de alcanzar inducción est�, no obstante, abarcado por el procedimiento de la presente invención.

35 Como se ha detallado anteriormente en el presente documento, un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de la invención en relación con el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades o de otras afecciones indeseadas.

Por tanto, la presente invención contempla la folistatina para usar en un procedimiento de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección, o una predisposición al desarrollo de una afección, caracterizada por una respuesta inflamatoria aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada, en un mamífero, en el que la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de un transplante de pulmón, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave o asma.

45 Más particularmente, por tanto, la presente invención contempla la folistatina para usar en un procedimiento de regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero mediante la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y/o la activina B en dicho mamífero, en el que la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de una inflamación aberrante, indeseada o, de otro modo, inadecuada, de las vías respiratorias.

Preferentemente, dicha activina es activina A y / o activina B.

Preferentemente, la respuesta inflamatoria es una respuesta a una cascada proinflamatoria, en la que dicha cascada de citocinas proinflamatorias se caracteriza por la expresión de TNF-α, IL-1 y / o IL-6.

55 La referencia a una respuesta inflamatoria aberrante, no deseada o de otra manera inapropiada” deber� entenderse como una referencia a una respuesta excesiva, una respuesta inadecuada o a una respuesta fisiológicamente normal, que es inadecuada en cuanto a que es indeseada o, de otro modo, inadecuada. Ejemplos de respuestas inflamatorias aberrantes o de otro modo indeseadas incluyen las que se producen en el contexto del shock séptico, septicemia, inflamación de las vías respiratorias, apendicitis, meningitis, respuesta hepática a toxinas o virus, angiog�nesis, psoriasis, protección de los nervios, aterosclerosis, necrosis tubular renal o cicatrización de heridas o lesiones traumáticas, como ocurre con la cirugía y las quemaduras. No obstante, a este respecto, algunas formas de inflamación de las vías respiratorias reflejan, de hecho, respuestas fisiológicas normales que son indeseadas, tales como las que se producen en el contexto de alergia o asma. Ejemplos de respuestas inadecuadas incluyen el fallo de cualquier respuesta inflamatoria inadecuada para producirse como parte de un régimen de inmunizaci�n.

65 De acuerdo con lo anterior, la respuesta inflamatoria sujeto es, preferentemente, una respuesta inflamatoria aguda

indeseada de tipo local o sist�mica.

Por tanto, se proporciona, preferentemente, un método de tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una afección o una predisposición al desarrollo de una afección, caracterizada por una respuesta inflamatoria aguda indeseada en 5 un mamífero, comprendiendo dicho método la regulaci�n negativa del nivel de la activina, en el que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una subunidad βB, fragmentos de activina, derivados, mutantes

o variantes de la misma, en el que la regulaci�n negativa de dicha activina hasta un nivel funcionalmente ineficaz inhibe o retrasa la cascada de citocinas proinflamatorias.

Preferentemente, dicha activina es activina A y / o activina B.

De acuerdo con esta descripción, dicha afección es shock séptico, septicemia, inflamación de las vías respiratorias, apendicitis, meningitis, encefalitis, respuesta hepática a toxinas o virus, angiog�nesis, psoriasis, protección de los nervios, aterosclerosis, necrosis tubular renal, o cicatrización de heridas o lesiones traumáticas, como ocurre con la

15 lesión, la cirugía y quemaduras (por ejemplo, de lesiones cerebrales traumáticas).

En la invención, dicha inflamación de las vías respiratorias se produce en el contexto de asma, enfermedad pulmonar intersticial, la fibrosis qu�stica, el trasplante pulmonar, bronquiolitis obliterante, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva, el SARS, la asbestosis, la apnea obstructiva del sueño, la hipoxia o la hipertensión pulmonar.

M�s preferentemente, dicha condición es el síndrome de respuesta inflamatoria sist�mica y aún más particularmente la sepsis, la septicemia, choque tóxico, choque séptico, traumatismo de los tejidos, la meningitis o apendicitis.

En otra realización preferida, dicha enfermedad inflamatoria es crónica.

25 Aún más preferentemente, dicha respuesta inflamatoria crónica se produce en el contexto de, o est� asociado de otro modo con la esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, asma, psoriasis o la cicatrización de heridas.

Tambi�n se describe un método para tratar terapéuticamente y / o profil�cticamente una condición, o una predisposición al desarrollo de una condición, que se caracteriza por una respuesta inflamatoria inadecuada en un mamífero, comprendiendo dicho método modular el nivel de activina, que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una βB de subunidades, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de la misma, en dicho mamífero, en el que hasta la regulaci�n de la activina dijo a un nivel funcionalmente eficaz hasta regula la cascada

35 de citocinas proinflamatorias.

Preferentemente, dicho activina es activina A y / o activina B.

Estos aspectos terapéuticos y profilácticos de la presente invención se consiguen preferentemente mediante la administración de una cantidad eficaz del agente modulador, como se define anteriormente, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular adecuadamente la cascada de citocinas proinflamatorias.

Una "cantidad eficaz" significa una cantidad necesaria al menos en parte para lograr la respuesta deseada, o para retrasar la aparición o inhibir la progresión o detener del todo, la aparición o progresión de la condición particular que

45 se trata. La cantidad varía dependiendo de la condición de salud y física del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar, el grado de protección deseado, la formulación de la composición, la evaluación de la situación m�dica, y otros factores relevantes .Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos de rutina.

Las referencias a "tratamiento" y "profilaxis" se han de considerar en su contexto más amplio. El término "tratamiento" no implica necesariamente que un sujeto se trate hasta la recuperación total. Del mismo modo, "profilaxis" no significa necesariamente que el tema no ser� finalmente contraer una enfermedad. En consecuencia, el tratamiento y profilaxis incluyen la mejoría de los síntomas de una condición particular o prevención o reducción de otro modo el riesgo de desarrollar una condición particular. El término "profilaxis" se puede considerar como la

55 reducción de la gravedad o la aparición de una condición particular."Tratamiento" también puede reducir la gravedad de una condición existente.

La presente invención contempla además una combinación de terapias, tales como la administración del agente modulador junto con otras moléculas protein�ceas o no protein�ceas que pueden facilitar el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Por ejemplo, se puede combinar el método de la presente invención con radioterapia o quimioterapia. Administración de folistatina de la presente invención se ha descrito anteriormente, en la forma de una composición farmacéutica, puede realizarse por cualquier medio conveniente. La folistatina de la composición farmacéutica se contempla para mostrar una actividad terapéutica cuando se administra en una cantidad que depende del caso

65 particular. La variación depende, por ejemplo, en el ser humano o animal. Un amplio rango de dosis puede ser aplicable. Considerando un paciente, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 mg de folistatina se pueden administrar por kilogramo de peso corporal por día. Regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, varias dosis divididas se pueden administrar diariamente, intervalos de tiempo adecuados semanales, mensuales o otros o la dosis se puede reducir proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación.

5 La folistatina se puede administrar de una manera conveniente tal como por vía oral, intravenosa (en donde soluble en agua), respiratoria, transd�rmica, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrad�rmica o supositorio o implante (por ejemplo, utilizando moléculas de liberación lenta).La folistatina se puede administrar en la forma de sales farmac�uticamente aceptables no tóxicas, tales como sales de adición de ácido o complejos met�licos, por ejemplo

10 con zinc, hierro o similares (que se consideran como sales para propósitos de esta solicitud).Ejemplos ilustrativos de tales sales de adición de ácido son clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartrato y similares. Si el ingrediente activo es para ser administrado en forma de comprimido, el comprimido puede contener un aglutinante tal como goma de tragacanto, almidón de maíz o gelatina; un agente disgregante, tal como ácido alg�nico; y un lubricante, tal como estearato de magnesio.

15 Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, respiratoria, por vía transd�rmica, por vía intratraqueal, nasofaríngea y, por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intracraneal, intrad�rmica, intramuscular, intraocular, intratecal, intracerebral, intranasal, infusión, vía oral, rectal, a través de goteo i.v., parche y el implante. Preferentemente, dichos medios de administración es la inhalaci�n con respecto al tratamiento de la inflamación de

20 la vía aérea y por vía intravenosa, intramuscular o transd�rmica para otras condiciones.

De acuerdo con estos métodos, el agente definido de acuerdo con la presente invención se pueden coadministrar con uno o más de otros compuestos o moléculas. Por "coadministrado" se entiende la administración simultánea en la misma formulación o en dos formulaciones diferentes a través de las mismas o diferentes rutas o administración

25 secuencial por las mismas o diferentes rutas. Por ejemplo, el agente sujeto se puede administrar junto con un agente agon�stico con el fin de mejorar sus efectos. Por la administración "secuencial" se entiende una diferencia de tiempo de segundos, minutos, horas o días entre la administración de los dos tipos de moléculas. Estas moléculas se pueden administrar en cualquier orden.

30 De acuerdo con la presente invención, aunque el método preferido es tratar terapéuticamente las respuestas inflamatorias agudas no deseadas, en determinadas circunstancias, uno puede también buscar para tratar las enfermedades inflamatorias crónicas. Se aprecia que es poco probable que revertir cualquier remodelación tisular (formación de cicatrices), que ya se ha producido el logro de la baja regulaci�n de la respuesta inflamatoria crónica. Sin embargo, tal método podría prevenir la aparición de cualquier daño tisular adicional. Con respecto a las

35 aplicaciones profilácticas de la presente invención, hay muchas circunstancias en las que se puede desear establecer un régimen de tratamiento preventivo. Por ejemplo, se puede establecer un régimen de este tipo en pacientes con predisposición a desarrollar una enfermedad autoinmune, los pacientes que han sufrido un traumatismo de los tejidos, tales como quemaduras graves, los pacientes sometidos a un trasplante de órganos, los pacientes con fibrosis qu�stica, que sufren asma / alergia o aquellos propensos a trastornos como la apnea del

40 sueño la respiración.

Tambi�n se describe el uso de un agente capaz de modular el nivel funcionalmente eficaz de activina fragmentos, derivados, mutantes o variantes de los mismos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y / o profiláctico de una condición, o una predisposición para el desarrollo de una condición, que se caracteriza por

45 una respuesta inflamatoria aberrante, no deseada o de otra manera inapropiada en un mamífero en el que hasta la regulaci�n de la activina a un nivel funcionalmente eficaz hasta regula la cascada de mediador pro-inflamatorio y activina abajo de la regulaci�n a un nivel inhibe funcionalmente ineficaces o retarda la cascada de mediadores proinflamatorios.

50 También se describe el uso de un agente capaz de modular el nivel funcionalmente eficaz de activina, que la activina es activina A o una molécula de activina que comprende una βB de subunidades, fragmentos, derivados, mutantes o variantes de los mismos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y / o profiláctico de una condición, o una predisposición al desarrollo de una condición, caracterizada por una respuesta inflamatoria aberrante, no deseado o de otra manera inadecuada en un mamífero, en el que hasta la regulaci�n de dicho activina

55 a un nivel funcionalmente eficaz hasta regula la cascada de citocinas proinflamatorias y abajo-regulaci�n dijo activina a un nivel funcionalmente ineficaz inhibe o retarda la cascada de citocinas proinflamatorias.

Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria es una respuesta inflamatoria aguda de cualquiera del tipo agudo o sist�mica.

60 De acuerdo con estos aspectos preferidos, dijo se regula hacia abajo-respuesta inflamatoria aguda y preferentemente dicha condición es el shock séptico, la septicemia, la inflamación de las vías respiratorias, la apendicitis, la meningitis, la respuesta hepática a toxinas o virus, la angiog�nesis, la psoriasis, la protección de los nervios, aterosclerosis, tubular renal necrosis, la curación de heridas o lesiones traumáticas, como ocurre con la

5 lesión, la cirugía y quemaduras, y dijeron que se regula por disminución de respuesta inflamatoria.

Preferentemente, dicha inflamación de las vías respiratorias se produce en el contexto de asma, enfermedad pulmonar intersticial, la fibrosis qu�stica, el trasplante pulmonar, bronquiolitis obliterante, enfisema, enfermedad pulmonar obstructiva, el SARS, la asbestosis, la apnea obstructiva del sueño, la hipoxia o la hipertensión pulmonar.

Preferentemente, dicha respuesta inflamatoria sist�mica aguda se produce en el contexto de un síndrome de respuesta inflamatoria sist�mica y aún más particularmente la sepsis, la septicemia, choque tóxico, choque séptico, traumatismo de los tejidos, la meningitis o apendicitis.

15 En otra realización preferida, dicha enfermedad inflamatoria es crónica.

A�n más preferentemente, dicha respuesta inflamatoria crónica se produce en el contexto de, o est� asociado de otro modo con la esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, asma, psoriasis o la cicatrización de heridas.

Tambi�n se describe una composición farmacéutica que comprende el agente modulador como se ha definido anteriormente junto con vehículos y / o diluyentes uno o más vehículos farmac�uticamente aceptables. Los agentes dijeron que se les conoce como los ingredientes activos

25 Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles o puede ser en forma de una crema u otra forma adecuada para la aplicación típica. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersi�n que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersi�n y por el uso de tensioactivos. Las prevenciones de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antif�ngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido s�rbico,

35 timerosal y similares. En muchos casos, ser� preferible incluir agentes isot�nicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersi�n básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y la técnica de liofilización que

45 produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Cuando los ingredientes activos est�n protegidos convenientemente pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o puede encerrarse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o se pueden incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 1 % en peso de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede estar 55 convenientemente entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80 % del peso de la unidad. Se elabora la cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles de tal manera que en una dosificación adecuada. Composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de modo que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0,1 mg y 2000 mg de compuesto activo.

El agente también se puede preparar para la administración a través de la vía aérea, ya sea en una forma soluble o en partículas. Por ejemplo, el agente puede administrarse a través de un inhalador oral o un nebulizador.

Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener los componentes como se enumeran a continuación: un aglutinante tal como goma, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes 65 tales como fosfato dic�lcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido alg�nico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina pueden añadirse o un agente aromatizante tal como menta, aceite de gaulteria, o aroma de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con 5 goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propil parabenos como conservantes, un colorante y un aromatizante tal como aroma de cereza

o de naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmac�uticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo (s) se puede incorporar en preparaciones de liberación sostenida y formulaciones.

10 La composición farmacéutica puede comprender también moléculas genéticas tales como un vector capaz de transfectar células diana, donde el vector lleva una molécula de ácido nucleico que codifica la activina A o un agente modulador como se ha definido anteriormente. El vector puede, por ejemplo, ser un vector viral.

15 La presente invención se define por los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1

Materiales y Métodos

Animales y detalles experimentales generales

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código Australiano NHMRC de Prácticas para el Cuidado de animales con fines científicos (1997) y fueron aprobados por el Comité de ética Animal de la Universidad 25 de Monash.

Ciento veintiséis hombres C57BI / 6 ratones (4-8 semanas), se asignaron al azar en dos grupos; Grupo 1 consistió en nueve subgrupos de ocho animales (N total = 72) mientras que el grupo 2 consistía en nueve subgrupos de seis animales (n = 54).Todos los animales fueron mantenidos en estabulaci�n animal estándar con acceso a comida y 30 agua durante todo el experimento. El lipopolisac�rido (LPS) (E. coli serotipo 0127: B8, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se purificó usando un método de extracción de fenol-agua como se ha descrito anteriormente (Manthey et al. 1994, J Immunol 153:2653-63), Y se administra como una inyección en bolo por vía intraperitoneal de 100 mg en 100 l de solución salina isot�nica, no pirog�nica por ratón. La folistatina-288 recombinante humana (rhfolistatina-288; Biotech, Australia) se administr� como una inyección intraperitoneal de 1 g en 100 l de solución salina isot�nica, no 35 pirog�nico, 30 minutos antes de la LPS. El grupo 1 recibió inyecciones de LPS y rfolistatina-288 mientras que el Grupo 2 recibió una inyección de LPS solo.Los ratones se anestesiaron a continuación con una forma de inhalante de isoflurano (Abbott Australasia LTD, Kurnell, Australia), y se sacrificaron para la recogida de sangre a los 30 minutos, 1, 2, 3, 5, 8, 12 y 24 horas y un grupo fue sacrificado sin inyección para actuar como controles para los niveles basales.La sangre se recogió en un tubo de 1,5 ml de centrífuga que contiene 50μl de etileno ácido

40 diaminotetraac�tico (EDTA, material de laboratorio BDH, Poole, Reino Unido) y se centrifug� a 250 g a temperatura ambiente con el plasma retirados y almacenados a -20 � C hasta que se ensayaron para la activina A, folistatina , TNFa, IL-6 e IL-1β.

Ensayos

45 La activina A se midió por ELISA como se describió previamente usando activina A humana recombinante como un estándar (Knight et al., J Endocrinol 148:267-79).Mide ELISA tanto gratuitos como de activina folistatina fijo y no se cruza de forma significativa con otras isoformas de activina (Knight y col., supra).La sensibilidad media fue de 0,01 ng / ml, y la media de los coeficientes de inter-ensayo intra-e de las variaciones (CV) fueron 3,9 % y 5,1 %

50 respectivamente.

Concentraciones folistatina en suero se midieron con un radioinmunoensayo como se describió anteriormente (O'Connor et al., Hum Reprod.14:827-832).La norma y el trazador empleado fue rfolistatina-288.Al igual que con la activina A ELISA, este RIA medidas ambas formas encuadernadas de follistatins libres y.La sensibilidad del ensayo

55 media fue de 2,7 ng / ml.ED50fue de 13,3 ng / ml, y los CV inter-ensayo intra-e fueron 6,4 % y 10,2 %, respectivamente.

Rat�n citocinas TNFa, IL-1β y IL-6 se midieron por ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.).Estos ensayos utilizan proteínas recombinantes de ratón como estándares y anticuerpos monoclonales para la detección.La

60 sensibilidad del ensayo de TNF fue 0,5 ng / ml, y los CV inter-ensayo de intra-y fueron < 10 %.La sensibilidad del ensayo de IL-6 fue de 0,2 ng / ml y los CV inter-ensayo de intra-y fueron < 10 % y 12 % respectivamente.La sensibilidad de la IL-1β era ng / ml y los CV inter-ensayo de intra-y fueron < 10 % y < 11 %, respectivamente.

An�lisis de Datos

Todos los datos se analizaron mediante un ANOVA de una vía con una prueba t pareada se utiliza para comparar las diferencias entre los puntos de tiempo en los diferentes grupos de tratamiento. 5

Resultados

El papel de la activina A en ratones después de una exposición a LPS intraperitoneal

10 Se observ� una versión robusta de activina A en los ratones después de la inyección de LPS volvió a extraer. Los niveles de activina A aument� dentro de 30 minutos después de la administración de LPS y alcanzó su punto máximo en 1 hora de regresar a los niveles basales entre 3 a 8 horas, seguido de un aumento posterior a las 12 horas antes de volver de nuevo a los niveles basales a las 24 horas (Fig.1A).Después de la administración de LPS, folistatina se libera en la circulación, pero se retras� en comparación con activina A, aumentando a 3 horas y

15 permaneciendo elevada hasta 24 horas (Fig.1B).Se observ� la liberación de TNF en la circulación de seguir el pico monofásico clásico, aumentando en 0.5 horas (p < 0,01) después de la administración de LPS, alcanzando un máximo de 1 hora y regresar a los niveles basales a las 5 a 8 horas (Fig.1C).Concentraciones s�ricas de IL-6 fue elevada posterior a elevaciones en TNFa, el aumento de entre 1 y 2 horas, alcanzando un máximo a las 2 horas (p <0,01) y permaneciendo elevada hasta entre 5 (p < 0,01) y 8 horas (Fig.1D).Los niveles de IL-1β en la circulación

20 fueron significativamente menores que TNFa o IL-6 (30-50 veces) con IL-1β creciente después de la inyección de 1 hora y alcanzando un máximo de 5 horas (p < 0,01), antes de regresar a los niveles basales a las 8 horas (Fig.1E).

El pico de liberación de activina A no se vio afectada por la administración de rfolistatina-288.Después de la administración de LPS activina A liberación en la circulación fue todavía un pico rápido y robusto en 1 hora y 25 regresar a los niveles basales dentro de 5 horas (Fig.2A).Curiosamente, la concentración de ratón circulatorio folistatina-288 fue suprimida significativamente a lo largo de todo el período de pico, 5-8 horas (p < 0,03) después de la administración de LPS en ratones inyectados con rfolistatina-288 (fig.2B).Además, la liberación de TNFa se suprimió significativamente (50 % de supresión) mediante la administración de rfolistatina-288 antes de la inyección de LPS (p < 0,01), aunque el perfil de liberación no se alter� significativamente (Fig.2C).Por el contrario, la IL-6 30 liberación fue alterado en ambos cantidades absolutas y temporalmente.Curiosamente, la IL-6 concentraciones máximas se incrementaron significativamente (p < 0,01) en ratones administrados rfolistatina-288 antes de LPS en aproximadamente 2 veces (Fig.2D).Además, el aumento de IL-6 se produjeron anteriormente en la presencia de rfolistatina-288, alcanzando un máximo de 1 hora, en comparación con 2 horas en ratones que recibieron LPS solo.Liberación de IL-1β no era tan evidente en la presencia de rfolistatina-288 en comparación con los ratones que

35 recibieron LPS solo (Fig.2E).Además, el perfil también se movió de tal manera que las elevaciones en las concentraciones s�ricas se produjeron anteriormente en la presencia de rfolistatina-288, alcanzando un máximo de 2 horas en comparación con 5 horas en ratones que recibieron LPS solo (p < 0,01).Sin embargo, hay que señalar que no había una diferencia significativa en las concentraciones de IL-1β en cualquier punto de tiempo.

40 EJEMPLO 2

ACTIVINA Y FOLISTATINA EN UN MODELO MURINO DE ASMA ALÉRGICA EXPERIMENTAL

Datos piloto de nuestra ovoalb�mina (OVA) la sensibilizaci�n y el modelo de desafío de asma alérgica destaca los 45 principales cambios en la expresión de activina durante la evolución de la respuesta inflamatoria pulmonar.

La compartimentaci�n de la activina y folistatina se observa en un modelo murino de asma alérgica, y la expresión de la activina en varios sitios celulares en el tejido pulmonar de los pacientes con fibrosis qu�stica y asma (Figura 3).La cinética de la secreción de activina se han mapeado encontrar que la concentración pico en BALF (Fig. 4A)

50 coincide con la inflamación pico y eosinofilia (Fig. 4B), y la producción de IL-4 (Fig. 4C).

El análisis inmunohistoqu�mico de la expresión de la activina en el pulmón muestra que la activina se expresa en el epitelio de las vías respiratorias de los ratones de control (solución salina) (Fig. 5A).Sin embargo, después de 4 retos OVA (día 8) de la vía aérea se someten a cambios profundos, con hipertrofia de las células epiteliales y marcada 55 pérdida de la expresión de activina (Fig. 5B).Estas alteraciones persisten hasta el día 17 (10 días después de la exposición final), aunque la expresión activina pasa a ser variable entre la vía aérea adyacente e incluso dentro de la misma de las vías respiratorias (Fig. 5C).Colectivamente, estos hallazgos indican que la activina pre-almacenada se libera en el tejido circundante durante la respuesta inflamatoria.Una tendencia general hacia la morfología de las vías respiratorias normal y expresión activina en los puntos de tiempo posteriores sugiere que este proceso de

60 remodelación es reversible.Finalmente, el análisis inmunohistoqu�mico preliminar revela la pérdida de expresión folistatina en el epitelio bronquial después de OVA desafío muy similar al patrón visto para la activina.

EJEMPLO 3

CARACTERIZACI�N DE LA EXPRESIÓN PULMONAR DE ACTIVINA Y FOLISTATINA

5 Expresión de ARNm de Activina y folistatina y compartimentaci�n del receptor de la activina en el ratón

El uso de un protocolo de sensibilizaci�n y desafío con OVA como alergeno que hemos encontrado una correlación entre la magnitud de la respuesta inflamatoria y la regulaci�n diferencial de la activina y expresión folistatina en el epitelio bronquial frente BALF se ha encontrado.El hallazgo de que la proteína activina se reduce drásticamente en células epiteliales bronquiales mandatos que activina y expresión folistatina se fije en múltiples puntos de tiempo durante y siguiendo el protocolo de inmunizaci�n.Los ratones se sensibilizó con OVA (50 mg en hidróxido de aluminio) en los días 0 y 12, y desafi� a través de la intubaci�n intratraqueal con OVA (25 g) en los días 24, 26, 28 y 30 (Hardy et al., 2003, Am J Respir Crit Care Med 167:1393-1399).Los ratones de control reciben solución salina en lugar de OVA. Los ratones se mataron (n = 6 por grupo) después de cada uno de 4 retos de al�rgenos, y en los días 15 2, 4, 7, 10 y 20 después de la exposición a la ovalb�mina final.La inmunohistoqu�mica se realiza en pulmón fijado con formalina.Activina y folistatina se detectan con anticuerpos específicos (E4, generado contra la EPB subunidad de activina humano; 2E6, producido contra folistatina recombinante humano), que reaccionan de forma cruzada con el ratón; isotipo anticuerpos emparejados sirven como controles.Los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos anti-peroxidasa de rábano picante-ratón apropiadas.Medición de la activina A en BALF y el suero es de acuerdo a una enzima establecido protocolo de ELISA conectado (Knight et al., 1996, supra) Utilizando recombinante humano activina A estándar.Concentración folistatina en BALF y el suero se midió usando un radioinmunoensayo discontinua (O'Connor et al., 1999, supra).Un protocolo en tiempo real de RT-PCR establecido se utiliza para cuantificar la activina y folistatina ARNm en el tejido pulmonar.La inmunohistoqu�mica (Santa Cruz Biotechnology) también se utiliza para evaluar la expresión de tipo I y receptores de activina II para determinar que

25 las células pueden ser sensibles a la activina.En un número menor de puntos de tiempo no radiactivo in situla hibridación se realiza para determinar la localización de los ARNm de los receptores de activina para medir cualquier cambio en la compartimentaci�n de los ARNm concomitante con el cambio en la localización de la proteína.Activina y folistatina intensidad de la tinción en el epitelio y la submucosa bronquial se obtuvo mediante análisis doble ciego en una escala de 0 = ausente, 1 = débil, 2 = moderado, 3 = Alta intensidad.Diez bronquiolos de diámetro interno 150-200 micras de cada ratón se analizan para llegar a las puntuaciones para los ratones individuales.

Expresi�n de activina y folistatina en la enfermedad de las vías respiratorias humanas

Se realizó un análisis inmunoqu�mico detallada de la activina y de expresión folistatina en el tejido normal, asmático

35 y qu�stica pulmonar fibrosis y BAL (ver métodos anteriores).Las muestras de tejido se obtuvieron a partir de muestras de tejido pulmonar resecado almacenados y potenciales en el momento del trasplante (fibrosis qu�stica severa n = 20), con la cooperación del Servicio de pulmón Trasplante Cardiaco del Hospital Alfred, de Melbourne.Tejido asmática est�n disponibles a partir de almacenado tejido pulmonar resecado y prospectivo tejido de la biopsia endobronquial de pacientes asmáticos sometidos a broncoscopia por razones de diagnóstico intercurrentes (n = 10).De las vías respiratorias de control emparejados por edad de los no fumadores sin antecedentes conocidos de enfermedad de las vías respiratorias se recogen de nuevo post mortemmuestras proporcionadas por el Departamento de Anatomía Patológica (n = 20).El tejido se obtiene de la vía aérea proximal (bronquio del lóbulo inferior derecho) en el momento de la resecci�n pulmonar.Las muestras se fijan en cada uno de:

(1) de acetona enfriada con inhibidores de la proteasa a -20 � C para su posterior incorporación en glicol metacrilato 45 (GMA), y (2) etanol y formalina para su posterior inclusión en parafina.

EJEMPLO 4

DEFINICI�N DE LA RELACIÓN ENTRE LA EXPRESIÓN DE ACTIVINA Y FOLISTATINA Y LA INFLAMACIÓN PULMONAR

Los aspectos clave de la respuesta inflamatoria alérgica se miden con el fin de caracterizar la relación entre activinas y folistatina y la magnitud de la respuesta inflamatoria.Los ratones (n = 6 por grupo) est�n sensibilizados y desafiados con OVA (como se indica en Objetivo 1), y asesinado después de cada uno de los 4 retos de al�rgenos, 55 y en los días 2, 4, 7, 10 y 20 después de la OVA desafío final.Se recoge suero de la sangre entera, y la prueba de presencia de OVA-IgE específica e IgG1por ELISA de tipo s�ndwich. El tejido pulmonar se fija en formol antes de la inclusión en parafina; secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina y ácido periódico de Schiff para la evaluación microscópica de la inflamación y para la determinación de la producción de moco-frecuencia de células.BAL y mediast�nicos ganglios linfáticos sola célula suspensiones se cuentan.Cytospots celular del LBA se Giemsa manchadas y recuentos diferenciales realizaron en 200 células por ratón ≥; las células se identifican por criterios morfológicos.Frecuencia de IFN-γ células productoras en los ganglios linfáticos del mediastino estimuladas con OVA IL-4, IL-5, IL-13 y est�n determinados por ELISPOT (BD Biosciences y R & D Systems).Placas de ELISPOT se leyeron en un lector de ELISPOT AID.BALF se recoge después de haber realizado los recuentos de células, y se almacenaron a -70 � C para su posterior análisis de las citocinas anteriores por ELISA de tipo s�ndwich. Además, 65 tejido fijado con formalina de pulmón de control, asmático y pacientes con fibrosis qu�stica se tiñeron inmunohistoqu�micamente para detectar mastocitos (AA1, Dako), eosin�filos (proteína básica principal de

eosin�filos, peroxidasa de eosin�filos, BD Biosciences), los linfocitos T (CD3, Dako) y macr�fagos (CD68, PGM1, Dako).Las células se contaron usando un sistema de amplificación de 3 capas con estreptavidina-biotina-peroxidasa y AEC (Sigma-Aldrich) como el sustrato.Los recuentos se realizaron utilizando un analizador de imágenes (Image-Pro Plus, MediaCybernetics) a una profundidad de 150 micras por debajo de la membrana basal y se expresaron

5 como células por mm2.La expresión de citocinas Th2 clave se mide en BALF de los pacientes y los controles (BD Biosciences).

EJEMPLO 5

CORRELACI�N DE LA EXPRESIÓN DE ACTIVINA Y FOLISTATINA CON LA REMODELACIÓN DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS

Se analizan los acontecimientos de remodelación en las muestras almacenadas y potenciales de la normal (n = 20), asma (n = 10) y la fibrosis qu�stica (n = 20) de pulmón humano.Análisis de imágenes morfom�trico e 15 inmunohistoqu�mica se utilizan para medir los índices clave de la respuesta de remodelación, incluyendo: (i) el engrosamiento de la membrana basal subepitelial, (ii) proliferaci�n de fibroblastos, (iii) la hiperplasia de miofibroblastos, (iv) de las vías respiratorias hipertrofia del músculo liso / hiperplasia , y (v) la angiog�nesis.Grosor de la membrana basal subepitelial y la angiog�nesis se miden utilizando protocolos bien establecidos (Li et al., 1997, Am JRespir Crit Care Med 156:229-233; Wilson et al., 1997, Clin Exp Allergy 27:363-371; Orsida et al., 1999, Thorax 54:289-295).Hipertrofia del músculo liso de la vía aérea y la hiperplasia se evalúan en hematoxilina y eosina secciones teñidas (Image-Pro Plus) mediante la medición de diámetro de células de músculo liso en micras (diámetro a través del núcleo) y el porcentaje de músculo liso en la submucosa bronquial (Benayoun et al., 2003, Am J Respir Crit Care Med 167:1360-1368).Además, hipertrofia del músculo liso de las vías respiratorias se evalu� por inmunohistoqu�mica al anotar intensidad de actina de músculo liso α-y miosina quinasa expresión de la cadena ligera

25 (Sigma-Aldrich) en una escala de 0-3 (ver Objetivo 1) (Benayoun et al.,2003, supra).La proliferaci�n de fibroblastos se evalu� por inmunohistoqu�mica en secciones fijadas en formalina utilizando anticuerpos específicos para la proliferaci�n de células ant�geno nuclear (PCNA, Dako).Los fibroblastos se identifican mediante criterios morfológicos y tinción de prolil-4-hidroxilasa (Dako).El número de fibroblastos PCNA-positivas por debajo de la membrana basal se cuentan, normalizado a la longitud de la membrana basal y se expresa por mm2�rea de la biopsia del cuantificable (Image-Pro Plus).Todos los parámetros se miden en al menos 2 secciones seriadas de cada paciente.

EJEMPLO 6

35 INVESTIGACIÓN DE SI EL TRATAMIENTO CON FOLISTATINA PREVIENE LA INFLAMACIÓN PULMONAR Y POTENCIA LA RESOLUCIÓN EN UN MODELO MURINO

Modulaci�n por folistatina de expresión y liberación de activina-modelo murino de asma aguda

La función de la activina est� regulada por un número de proteínas de unión, el mejor estudiado siendo su interacción con la alta afinidad de la proteína de unión folistatina.La unión a folistatina recombinante humano efectivamente bloquea la interacción con el receptor de activina, neutralizando de ese modo las acciones biológicas de la activina A (Phillips, 2000, 22:689-696 Bioensayos).El uso de modelos de ratón de asma, la capacidad de la folistatina para modular la expresión de activina y la liberación en el pulmón, BAL y el suero se evalúa, la 45 comparación de diferentes dosis de folistatinas y vías de administración.La inyección intraperitoneal de 1 mg folistatina por adulto de ratón 0,5 horas antes de la inyección de LPS bloquea la subida en folistatina visto 4 horas más tarde, y suprime la liberación de citocinas proinflamatorias (TNF-α e IL-1β), mientras que activin liberación es irreprochable.Bloques As� folistatinas tratamiento de efectos inducidos activina, pero no de su lanzamiento.Inicialmente, los ratones (n = 6 por grupo) reciben IP 1 mg por ratón folistatina, 0,5 horas antes de cada uno de los cuatro retos OVA.Esta vía de administración folistatina se compara con intranasal y ensayo administración intratraqueal diferentes dosis y tiempos de administración.Los ratones de control reciben solución salina.Activina A y la expresión folistatina se controla mediante ELISA en BALF, y por RT-PCR e inmunohistoqu�mica en el pulmón (ver Objetivo 1) después de cada una de las cuatro desafíos OVA, y en los días 2, 4, 7, 10 y 20 después de la última OVA desafío.El último punto de tiempo revela si activina A expresión devuelve los

55 niveles de pre-exposición en los ratones no tratados OVA, y da una indicación sobre la duración del bloqueo inducido folistatina de activina.

En segundo lugar, una determinación de si se hace de si la neutralización de la activina A por folistatina disminuye la gravedad y la duración de la inflamación pulmonar alérgica.La capacidad de la folistatina para atenuar la inflamación pulmonar mediante la medición de parámetros de clave 'alérgicas' incluyendo específica de IgE e IgG1, Eosinofilia, la hipersecreci�n de moco, y la producción de citocinas se investiga.Los ratones se mataron después de cada uno de los cuatro retos OVA, y en los días 2, 4, 7, 10 y 20 después de la exposición a la ovalb�mina final.De sangre, BAL, los pulmones y ganglios linfáticos mediast�nicos se recogen para la enumeración de células inflamatorias, específica de OVA IgE e IgG1, Eosinofilia, la producción de moco y el análisis ELISPOT de IL-4, IL-5, IL-13, e IFN-γ. (métodos 65 como por Objetivo 1).Puesto que el TGF-� también est� involucrado en la inmunorregulaci�n y la remodelación de tejidos, la concentración de TGF-� en BALF se mide (R & D Systems) y la expresión de TGF-� en secciones de

tejido se mide mediante técnicas de inmunohistoqu�mica (Santa Cruz Biotechnology) para determinar si su producción est� modulada por activina / folistatina (Lee et al., 2001, J. Exp. Med. 194:809-821).Estos datos proporcionan información sobre la capacidad de neutralización de activina para mejorar la inflamación pulmonar alérgica.

Modulaci�n por folistatina de la expresión y liberación de activina-modelo murino de asma crónica

Repita el ant�geno de dosificación a intervalos de tiempo no tolerog�nicos para hasta seis semanas se lleva a cabo en un modelo murino de asma crónica (2 retos / semana el lunes y jueves) para inducir la inflamación de la vía aérea sostenida y remodelación crónica (Coyle et al., 1996, J Immunol 156:2680-2685).Los ratones se tratan con folistatina de acuerdo con la dosis y la vía optimizado anteriormente.Los efectos del tratamiento folistatina sobre la remodelación en este modelo de ratón se evalúan mediante la medición de: (i) la membrana basal engrosamiento sub-epitelial, (ii) la angiog�nesis, (iii) la hipertrofia del músculo liso, y (iv) la inducción de células de moco (Lee et al.,2001, supra; Kumar et al., 2002, Clin Exp Allergy 32:1104-1111).Espesor Sub-epitelial de la membrana basal, la

15 angiog�nesis y la hipertrofia del músculo liso son evaluados.La metaplasia y / o hiperplasia de células caliciformes secretoras de moco se evalúa.Estos datos proporcionan información sobre la capacidad de la folistatina para inhibir la respuesta de remodelación de las vías respiratorias.

An�lisis estadístico

La distribución de cada conjunto de datos es la prueba de la normalidad antes del análisis.Datos normalmente distribuidos se analizó usando ANOVA de una vía con la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.Comparaciones individuales entre los grupos se hace utilizando la prueba t de Student de dos colas.Las relaciones entre la expresión de la activina / folistatina y, o bien la inflamación o índices de remodelación se analiza

25 mediante la correlación de Pearson.

Los datos que no se distribuyen normalmente se analizan utilizando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de Dunn Comparaciones múltiples de la prueba post-hoc.Comparaciones individuales entre los grupos se realizan mediante una prueba U de Mann-Whitney de dos colas para datos no paramétricos.Las relaciones entre la expresión de la activina / folistatina y, o bien la inflamación o índices de remodelación se exploran mediante correlación de Spearman.La Pvalor de ≤ 0,05 se consider� significativo.

EJEMPLO 7

35 CAMBIOS PROFUNDOS EN LA ACTIVINA B DURANTE LA INFLAMACIÓN LOCALIZADA Y SIST�MICA

Materiales y Métodos

Dise�o experimental

Para el modelo sist�mica de LPS, los ratones machos C57/BL se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) con 100 mg de LPS de fenol purificado (Sigma: E.ColiLos ratones de control, inyectados con PBS, se sacrificaron en el tiempo 0 y animales restantes (6/time punto) en 0,5, 1, 3, 5, 8, 12 y 24 horas y después de la inyección de LPS.En un experimento independiente, los efectos de las activinas se neutralizaron por el pretratamiento de los ratones con la

45 proteína de unión a activina, folistatina, que es capaz de unirse y la ablaci�n de los efectos de las formas de activina [Nakamura et al., 1990, Science 247:836-838].En este experimento, los ratones fueron pretratados ip con folistatina recombinante humano 288 (1 g) 30 minutos antes de una inyección de LPS. Los ratones se sacrificaron 30 minutos después de la inyección folistatina (tiempo 0) y en los mismos tiempos, relativa a LPS, como se indica anteriormente.En el momento del sacrificio, los tejidos a ser examinados para niveles de expresión se colocaron en hielo frío de Trizol (Invitrogen Life Technologies) y se almacenaron a -80 C para la extracción de ARN más tarde.Los tejidos también se colocaron en formalina antes de la transferencia a etanol al 70 % para la fijación más tarde y estudios inmunohistoqu�micos.

Para el modelo de inflamación hepática aguda, los ratones macho C57/BL6 fueron inyectados ip con 750 l / kg BW

55 CCl4Los ratones de control, inyectados con PBS, se sacrificaron en el tiempo 0 y animales restantes se sacrificaron a las 1, 2, 4,8, 12, 24, 36, 48 y 72 horas siguientes CCl4inyecci�n.Los tejidos se recogieron como se describe anteriormente para la extracción de RNA y los estudios inmunohistoqu�micos.

Extracciones de ARN se realizaron en 3-5 muestras de tejido de cada punto de tiempo se ha descrito anteriormente.Se extrajo el ARN utilizando Trizol de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.Para cada muestra, aproximadamente 10 g de ARN se trat� con DNasa I (Ambion Inc) de acuerdo con el protocolo del fabricante.Las concentraciones de ARN para cada muestra se determinaron y 1 g se transcriben de forma inversa para dar ADNc utilizando el kit de transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen Life Technologies) y usando el protocolo suministrado por el fabricante.Análisis en tiempo real de los niveles de expresión se hicieron para los 65 siguientes genes: GAPDH, β activinaLaβ subunidades y activinaBsubunidad.La inhibina α-subunidad de la expresión de ARNm también se examin� utilizando métodos termociclador convencional, pero los niveles de expresión fueron

consistentemente demasiado bajo para permitir el análisis cuantitativo (datos no mostrados).

Los cebadores específicos utilizados para la cuantificación en tiempo real de los genes fueron (5'-a 3 '):

GAPDH F tactggcatcttcaccacca (producto de 394 pb) (SEC ID N� 1) Activina βa Fggctaacagaaccaggacca (producto de 325bp ) (SEC ID N� 2) Activina βB F gacacgcatagccagactca (producto de 399bp) (SEC ID N� 3) Subunidad ∀ de inhibina F cttatgtattccggccatcc (producto de 326bp) (SEC ID N� 4) GAPDH R gtgagcttcccattcagctc (productote 394 pb) (SEC ID N� 5) Activina β a R cttcttcccatctccatcca (producto de 325bp) (SEC ID N� 6) Activina β B R acttgccctctccaagaaca (producto de 399bp) (SEC ID N� 7) Subunidad ∀ de inhibina R cctagtgtgggctaccagga (producto de 326bp) (SEC ID N� 8)

5 Los cebadores fueron diseñados específicamente para su uso con el termociclador luz en tiempo real sistema de PCR de Roche.Los productos de PCR se aislaron y secuenciaron y análisis de BLAST utilizan para confirmar que representaban los productos de los genes deseados.Análisis en tiempo real se realizaron utilizando SYBR Roche mastermix verde (termociclador Light Fast Start principal DNA SYBR verde, Roche Diagnostics GmbH) con

10 condiciones optimizadas para la sensibilidad máxima.Temperaturas de recocido para todos los cebadores fueron 60

C. Normas y QC utilizados en los análisis se prepararon a partir de ADNc combinada derivada de las muestras experimentales en los que los niveles de expresión de los genes de interés eran altas.Diluciones seriadas del cDNA estándar era para cubrir un rango de expresión de 300 veces.CDNA muestras experimentales se diluyeron en el rango de la curva estándar y todos los ADNc se dividió en alícuotas y se almacenaron a -20.Cada muestra se

15 analizó para los tres productos de genes de interés, al menos dos veces en carreras de análisis independientes.Entre reproducibilidad QC ensayo para todos los productos de los genes dio CV de < 22 %.

Inmunohistoqu�mica

20 Secciones de parafina se dewaxed y ant�genos obtenidos por deslizamientos inmersión en 0,01 M de tampón citrato, pH 6,0, el calentamiento en un horno de microondas (alta durante 2,5 minutos o 5 minutos para �A o βB respectivamente, entonces bajo durante 5 minutos para ambos), la refrigeración a 4 � C durante ~ 20 minutos, y el lavado en agua durante 5 minutos.Peroxidasa end�gena fue bloqueada en 3 % de H2O2durante 10 minutos, y se desliza bloqueados durante 1 hora (10 % de suero normal de conejo + bloque de CAS, Zymed Laboratories Inc., CA,

25 # 00-8120) para activina �A o 20 % de Tween normal de cabra serum/0.1 % 20 en tamponada con Tris solución salina (TBS) durante 1 hora para activina βB. La solución de bloqueo fue extraida y las secciones se incubaron con anticuerpos específicos para la activina �A-subunidad (E4, 10 g / ml en 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) / TBS, Universidad de Oxford Brookes) o βB activina subunidad (2 g / ml diluido en solución de bloqueo, Jones et al.2000) durante la noche a 4 � C. Después del lavado, las diapositivas �A activina se incubaron en conejo anti-IgG

30 de rat�n2b-HRP (Zymed, # 61 a 0320) diluido 1:500 durante 2 horas y se lav� dos veces en NaCl tamponada con Tris (TBS) 0,05 % de Tween-20, pH 7,5, a continuación, MilliQ H2Producto de reacción O. fue desarrollado con 3,3 'diaminobencidina (DAB) kit de sustrato (Zymed # 00-2014), y las secciones counterstained en hematoxilina durante 15 segundos.Todos los pasos de lavado estaban en TBS/0.05 % de Tween-20.Para las diapositivas βB activina, las secciones se lavaron y después se incubaron con Dako Envision con HRP (de conejo, # K4003) durante 1 hora a

35 temperatura ambiente.Las secciones se lavaron de nuevo en TBS / Tween y el producto de reacción se desarroll� con DAB, seguido de tinción de contraste como para activina �A. Control negativo secciones fueron incubadas con la proteína IgG2B de mieloma de ratón purificada (Zymed # 02-6300) en lugar del anticuerpo-�A específica activina

o IgG de conejo no inmunizado (Dako # X0903) en lugar del anticuerpo-βB específica activina.

40 Análisis de los datos

Para cada muestra, los niveles de expresión de activina �A y βB de ARNm se expresan en relación con el nivel de expresión de GAPDH para esa muestra.A partir de entonces, todos los tiempos 0 datos se normalizaron a 1 y datos en puntos de tiempo posteriores se expres� en relación a ese punto del tiempo.Todos los datos se representan

45 como la media � SEM valores.Los valores se derivan normalmente de las 3 muestras de tejido evaluadas por punto de tiempo, pero más muestras se evaluaron en los controles y en algunos momentos de la hora temprana.

Resultados

50 En un modelo de ratón de la inflamación después de la exposición sist�mica aguda con LPS, los niveles de mRNA de hígado para la activina se examinaron �A y βB subunidades.Activina �A subunidad mRNA mostr� un aumento menor (< niveles de control 2 veces) en el nivel de expresión de 1 hora después de LPS, pero los niveles de entre 1 y 3 horas de expresión disminuyó notablemente y de 3 a 8 horas de supresión clara (a < 25 % de control Niveles) fue evidente (Figura 6, panel superior).Por 12 horas, la expresión se acercaba a los niveles de control y a las 24 horas

55 se había vuelto a los niveles previos al tratamiento.El tratamiento con la proteína de unión activina y antagonista, folistatina, dio lugar a una supresión inmediata de activina �A niveles de mRNA de la subunidad.

En contraste, los niveles de mRNA de la subunidad βB hígado muestran un perfil completamente diferente a la subunidad �A activina, el aumento inmediatamente después de LPS para alcanzar un nivel de expresión máximo a 5 horas, en cuyo momento, la expresión de media sobre los niveles de control 35 veces (Figura 6, menor panel).Entre 5 y 12 horas de esta expresión se redujo progresivamente, pero a las 12 horas, la expresión era todavía elevado (en

5 promedio, los niveles de control de 7 veces).A las 24 horas después de tratamiento con LPS, los niveles de activina βB de mRNA fueron todavía de ~ 5 -veces por encima de los niveles de control.En cuanto a la activina �A expresión de la subunidad, activina βB patrones de expresión de las subunidades fueron alterados por el tratamiento previo folistatina, con clara supresión de los efectos asociados con LPS en βB expresión de la subunidad.

En el modelo de la inflamación después de la estimulaci�n hepática aguda con CCl4, Activina �A expresión de la subunidad cayó ligeramente tras la CCL4tratamiento (Figura 7, panel superior), de tal manera que en 1 y 2 horas, los niveles de expresión promedio fueron de sólo 40-50 % de los niveles de control.Por el contrario, a las 4 horas después de la inyección, el ARNm promedio �A fue moderadamente (80 %) elev� y luego disminuyó a los niveles previos al tratamiento en torno a las 36 horas.En contraste con la subunidad �A activina, activina βB mostr� los

15 mayores cambios en la expresión a las 24 y 36 horas después de la CCL4inyecci�n, con un aumento de 13,5 veces por encima de los niveles de control (Figura 7, panel inferior).

En ambos modelos inflamatorios, se examin� la expresión de la inhibina α-subunidad, pero los niveles de expresión fueron consistentemente demasiado bajo para permitir el análisis cuantitativo.Por lo tanto es poco probable que los cambios profundos en la activina βB subunidad ARNm dieron como resultado la formación de d�meros de inhibina elevadas (un d�mero de α-βB o inhibina B), pero dimerizados para formar activina B (un d�mero de βB-βB).Teniendo en cuenta los únicos cambios marginales en la activina �A ARNm, es relativamente poco probable que el aumento de la expresión de ARNm βB result� en la formación significativa del heterod�mero, activina AB (�A-βB).

25 El uso de anticuerpos específicos para el �A activina y subunidades βB, la inmunolocalizaci�n de hígado se investigó tanto en el modelo sist�mica aguda de la exposición a LPS y el modelo inflamatoria hepática aguda usando CCl4.La localización de la subunidad �A activina en el hígado normal fue en los hepatocitos y, más específicamente los predominantemente alrededor de las venas centrales (Figura 8).Después de la exposición LPS, la localización apareció a disminuir alrededor de 5 horas después de LPS y regres� a una distribución de pre-tratamiento por 12 horas.Para la subunidad βB activina, sin embargo, la localización fue más evidente en los hepatocitos que rodean las áreas del tracto portal del hígado y por lo menos alrededor de las venas centrales (Figura 9).Sin embargo, la localización parecía disminuir a las 5 horas siguientes LPS y regres� patrones previos al tratamiento por 12 horas.También parece ser una pérdida de la localización de hepatocitos en las zonas periféricas del hígado (Figura 9).En la Comisión de Climatolog�a4modelo de inflamación hepática aguda, sub-unidades localizadas en los

35 hepatocitos que rodean la vena central y espacios porta para las subunidades �A y βB respectivamente (Figura 10a y 10b).Sin embargo, 36 horas después de la CCL4tratamiento, no parecía ser la localización de la subunidad �A activina (Figura 10c) en los hepatocitos, que est�n destinadas a convertirse en apoptosis / necrosis, mientras que hubo poca o ninguna localización para la subunidad βB activina en estas áreas (Figura 10d).

EJEMPLO 8

ACTIVINA Y FOLISTATINA EST�N ELEVADAS EN PACIENTES CON LESIÓN CEREBRAL TRAUMÁTICA GRAVE

45 Antecedentes

Lesi�n cerebral traumática (TBI) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los adultos jóvenes (Van Baalen et al., 2003, de la Discapacidad y Rehabilitación 25 9-18).La activación de diversas vías inmunol�gicas se produce después de la lesión cerebral traumática, incluyendo la liberación de varias citocinas, la activación de las células gliales del cerebro y las diversas respuestas de lesiones celulares y tisulares.Un número de citocinas inflamatorias de respuesta se han detectado en el suero y el líquido cefalorraqu�deo (LCR) de pacientes con TCE, derivados de la respuesta inflamatoria post-traumático.La medición de la activina A y su proteína de unión, folistatina, no se ha determinado en esta configuración y fue el propósito de este estudio.Estos resultados muestran que ambas proteínas y, en particular, activina, son sensibles y elevada en el LCR de pacientes con lesión cerebral

55 traumática. Como consecuencia, estos hallazgos proporcionan nuevas posibilidades de nuevas oportunidades de diagnóstico y terapéuticos basados en torno a este componente de la respuesta inflamatoria iniciada por TBI.

Materiales y Métodos

Los pacientes fueron ingresados en el Alfred Hospital, Melbourne, después de TBI, debido en gran parte a los accidentes de tráfico.Los seis pacientes evaluados en este subgrupo de un estudio más amplio eran todos hombres, y tenían edades comprendidas entre 16 a 50 años.Ellos tenían una puntuación de coma de Glasgow (GCS) de 3-7 a su ingreso al Servicio de Urgencias Alfred.En la mayoría de los casos, se obtuvieron muestras pareadas de suero y LCR de estos pacientes tras el consentimiento �tico est� firmado por un pariente más cercano.Las muestras se

65 recogieron en relación diaria con el TBI. Las muestras se centrifugaron a 170 g durante 10 minutos, dividen en partes alícuotas y se congelaron hasta su análisis.

Activina concentraciones en suero se determinaron como se ha descrito anteriormente utilizando una enzima-ensayo inmunoenzim�tico (ELISA) (Knight et al.1996, supra)."Total" activina A El ensayo mide, que es a la vez componentes unidos gratuito y.El estándar de ensayo fue recombinante humana activina A (Programa pituitaria (PPNH) National hormonal y, Torrance, CA, EE.UU.).La sensibilidad del ensayo media fue de 0,01 ng / ml, y la media-ensayo

5 coeficientes intra-e inter de variación (CV) fueron ambos < 9 %.

Concentraciones folistatina en suero se midieron con un radioinmunoan�lisis validado para folistatina humana como se describe previamente (O'Connor et al.1999, supra), que también mide tanto las formas unidas y libres.El estándar utilizado fue folistatina recombinante humana 288, la sensibilidad del ensayo fue 2,0 ng / ml y los coeficientes intraensayo e interensayo de variación fueron ambos < 4,9 %.

Para las muestras de LCR, los ensayos de activina y folistatinas fueron como se describe anteriormente.Sin embargo, el diluyente estándar utilizado fue de 0,05 % de BSA en PBS para que coincida con la concentración de proteína en las muestras.Una solución de 20 % de BSA en PBS (25 l) se a�adi� a los pocillos en la activina A de

15 ELISA antes de la adición de las muestras de LCR, ya que esto se encontr� para mejorar la reproducibilidad de los ensayos.

Resultados

El análisis de este conjunto de pacientes con TCE mostr� que las concentraciones de activina se elevaron después de TBI (Figura 11).Este fue especialmente el caso de la activina A en el líquido cefalorraqu�deo. El patrón temporal y los niveles de la activina en el LCR vari� ligeramente para cada paciente, pero en general los niveles fueron más altos en un paciente individual 1-2 días después del incidente de TBI.Para folistatina, había en algunos de los pacientes un aumento de menor importancia en los niveles de suero o LCR, pero no hasta el punto de visto activina

25 CSF.Como las concentraciones de activina CSF mostraron una elevación después de TBI, esto probablemente refleja la activación de las vías inflamatorias en el sistema nervioso central (SNC) y particularmente el cerebro, y sugiere el trauma y la inflamación se limita en gran medida a este órgano y no parte de un inflamatoria sist�mica respuesta.

EJEMPLO 9

PAPEL DE LA ACTIVINA Y LA FOLISTATINA EN LA LIBERACIÓN DE CITOCINAS INDUCIDA POR LIPOPOLISAC�RIDOS

35 Antecedentes

La activina A se libera en respuesta a la administración de lipopolisac�rido (LPS) en ratones.Este lanzamiento se produce temprano en la cascada de citocinas que sigue y parece preceder a la liberación del tumor citocinas proinflamatorias factor de necrosis α clave (TNF) y la interleucina-6 (IL-6).Cuando el antagonista de la activina, folistatina, se administr� antes de la inyección de LPS, se alter� la liberación de estas citocinas-.Esto indicó que la activina tiene un papel en la modulación de la liberación de estas citocinas como parte de la respuesta inflamatoria y que folistatina podría ser utilizado como un adyuvante terapéutico para modificar la liberación de citocinas durante la enfermedad inflamatoria.

45 Métodos

Los métodos empleados para los siguientes experimentos son los mismos que los descritos en el Ejemplo 1 con la excepción de que se utilizaron dos dosis diferentes de folistatina para identificar efectos de dosis depende de la actividad de activina en la modulación de la liberación de citocinas en una respuesta inflamatoria inducida por LPS.Las dos dosis utilizadas tras la exampled 1 experimento, que utilizó 1 g de folistatina, fueron de 2 mg y 0,5 mg.

Resultados

Activina y perfil de liberación folistatina no cambian significativamente entre las dosis de 0,5 mg, 1μg o 2μg de

55 folistatina antes de la estimulaci�n con LPS.El nivel de supresión de la liberación de TNF como los mismos siguientes tres dosis separadas de folistatina (0,5, 1 y 2 microgramos) antes de la administración de LPS. La liberación de IL-6 aumenta aproximadamente 250 % en los ratones administr� 1 g de folistatina antes de LPS en comparación con el aumento observado en los ratones LPS administrado solo.Sin embargo, la IL-6 liberación sólo se incrementa en 50 % en los ratones administrados 0,5 g de folistatina previo a LPS. La liberación de IL-6 en ratones administr� 2 g de folistatina previo a LPS es el mismo que el observado en los ratones inyectados con LPS solo.

Conclusiones

La liberación de TNF fue similar tras la administración de la dosis de 0,5, 1 y 2 g de folistatina.(Figuras 12, 13 y 2A y 65 2B).

IL-6 liberación en ratones administr� 1 g de folistatina antes de LPS aumentado (≈ 50.000 pg / ml) en comparación con la liberación de IL-6 en los ratones que se les administr� LPS solo (≈ 20.000 pg / ml).Cuando la dosis de folistatina se duplicó a 2 g, la liberación de IL-6 no aument�.Más bien, en realidad se redujo de nuevo a los niveles observados en los ratones LPS administrado solo (≈ 20.000 pg / ml).Sin embargo, en los ratones administrados 0,5 g

5 de folistatina antes de la administración de LPS, IL-6 aument� de liberación (≈ 30.000 pg / ml) a niveles por encima de la observada en ratones LPS administrados, pero no aument� en la misma medida como se observa en los ratones administrados 1 g de la folistatina previo a LPS. Esto demuestra un efecto de la folistatina sobre la modulación de la liberación de citocinas por activina en una manera dependiente de la dosis hasta una dosis de 1 g / ratón con la dosis más alta de 2 microgramos que conducen a una supresión de los niveles encontrados en los ratones que recibieron LPS solo.La dosis de folistatina utilizado para modular la respuesta de citocinas es un componente crítico de cualquier aplicación terapéutica.

Parece que la dosis de folistatina requerida para bloquear la capacidad de activina para modular la liberación de TNF no es tan alta como la que se requiere para modular la liberación de IL-6.Esto puede estar relacionado con los

15 diferentes patrones de liberación temporales de TNF e IL-6, con TNFa ser de liberación antes que la IL-6 y por lo tanto potencialmente más sensible a la presencia de un factor estimulador temprano en la respuesta inflamatoria tales como la activina.

EJEMPLO 10

ACTIVINA Y FOLISTATINA SE EXPRESAN DURANTE EL PROCESO DE CURACIÓN DE LAS QUEMADURAS

Antecedentes

25 Quemaduras representan una lesión grave con su dependiente de la gravedad en el área de la superficie del cuerpo afectada por la quemadura, as� como la profundidad de la quemadura, a saber, parcial o de grosor completo.Las quemaduras menores producen una lesión local con una respuesta inflamatoria local seguido por un proceso de curación.Este último puede restaurar la piel a su estado pre-quemadura o puede resultar en una cicatriz debido a un proceso fibr�tico que implica la deposición de col�geno.

En las quemaduras más graves, se produce una profunda respuesta inflamatoria que implica la trasudaci�n de fluido, as� la muerte de tejido de la lesión térmica.No puede haber cambios profundos en el equilibrio de líquidos que conduce a shock y muerte.Durante el proceso de curación, con grandes quemaduras, hay insuficiente de la piel para los propósitos dejando las superficies abiertas susceptibles a la infección y la inflamación de injerto.A menudo la

35 inflamación conduce a procesos fibr�ticos que dan como resultado la deposición de col�geno y la cicatrización severa.

Los niveles actuales ejemplo de análisis de activina A y folistatina en la circulación de pacientes con quemaduras.También estudi� son la expresión local de la activina A y folistatina en biopsias tomadas de pacientes con quemaduras en diferentes etapas de curación.

Material y Métodos

Los niveles de activina A y folistatina se midieron en muestras de suero de 4 pacientes con quemaduras en las

45 diferentes etapas después de la lesión térmica.Además, las muestras de tejido tomadas de la zona de la lesión en los pacientes (n = 3) con quemaduras como parte de su tratamiento habitual en la Unidad de Quemados del Hospital Alfred fueron examinadas por microscop�a de luz utilizando secciones teñidas por haematoxoylin y eosina, as� como por inmunocitoqu�mica para determinar la expresión de la activina A y folistatina.

Activina concentraciones en suero se determinaron como se ha descrito anteriormente utilizando una enzima-ensayo inmunoenzim�tico (ELISA) (Knight et al.1996, supra)."Total" activina A El ensayo mide, que es a la vez componentes unidos gratuito y.El estándar de ensayo fue de activina A humana recombinante a partir de Biotech Australia (Robertson et al.1992).La sensibilidad del ensayo media fue de 0,01 ng / ml, y la media-ensayo coeficientes intra-e inter de variación (CV) fueron ambos < 4,9 %.

55 Concentraciones folistatina en suero se midieron con un radioinmunoan�lisis validado para folistatina humana como se describe previamente (O'Connor et al.1999, supra),que también mide tanto las formas libres y ligados.El estándar empleado y que se utiliza como trazador era folistatina recombinante humano 288 (Programa de pituitaria (PPNH) Nacional de Hormonas y, Torrance, CA, EE.UU.), la sensibilidad del ensayo fue 2,0 ng / ml y los coeficientes intraensayo e interensayo de variación fueron ambos < 4,9 %.

Para la inmunolocalizaci�n de secciones de tejido para la activina y folistatina, las secciones de parafina se dewaxed y ant�genos recuperados por diapositivas inmersión en tampón de citrato 0,01 M, pH 6,0, el calentamiento en un microondas (alta durante 2,5 minutos, bajo durante 5 minutos), enfriamiento a 4 � C durante -20 minutos, y lavado en 65 agua durante 5 minutos.Peroxidasa end�gena fue bloqueada en 3 % de H2O2, Y las diapositivas bloqueadas durante 1 hora (bloque CAS, Zymed Laboratories Inc., CA, # 00 a 8120).Las secciones fueron incubadas en β activinaLa-(E4,

IgG2b) O-específica folistatina (2E6) de anticuerpos (IgM) en 10 mg / ml durante la noche a 4 � C. Después del lavado, los portaobjetos se incubaron en IgG anti-rat�n2b-HRP (Zymed, # 61 a 0320) o IgM-HRP (Zymed # 61-6820) diluido 1:500, durante 2 horas, y se lavaron dos veces en NaCl tamponada con Tris (TBS) 0,05 % de Tween-20, pH 7,5, a continuación, MilliQ H2Producto de reacción O. fue desarrollado con el kit de sustrato de tetrahidrocloruro de

5 3,3 '-diaminobencidina (Zymed # 00-2014), y secciones contratinci�n en hematoxilina durante 15 segundos.Todos los pasos de lavado estaban en TBS/0.05 % de Tween-20.Los anticuerpos se diluyeron en 1 % de BSA / TBS.

Resultados

10 En los cuatro pacientes (Figura 15, paneles A-D), los niveles de activinas A y folistatina variaron y mostraron picos como en la figura B y se observaron niveles muy altos en uno de los pacientes (panel D). En el último paciente, los niveles est�n muy significativamente elevados por encima de los observados y alcanzan niveles vistos en pacientes con septicemia (Michel et al., 2003, European Journal of Endocrinology 148: 559-564). A partir de estos estudios preliminares, se concluye que os niveles de activina A y de folistatina en suero pueden variar significativamente

15 durante el curso de una lesión por quemaduras y, en algunos pacientes, los niveles alcanzar los hallados en pacientes con septicemia. Estos estudios son consistentes con el concepto de que la respuesta inflamatoria asociada con quemaduras incia niveles incrementados de activina A, lo que a su vez estimula la folustatina similar a los ejempllos indicados de los cambios en estos niveles en ratones a los que se administra una exposición a LPS.

20 Los sitios de expresión de activina A y folistatina en muestras de tejido tomadas de las zonas quemadas a diferentes puntos de tiempo después de la lesión demuestran que diversos tipos de células pueden producir estas proteínas.

La expresión de activina A se detecta mediante la localización de la subunidada βA y en la epidermis de la piel, la activina A se localizó de un modo parcheado en el estrato basal germinativo (SGE), hasta un grado limitado en el 25 estrato espinoso (SSp) y más intensamente en el estrato granuloso (SGR), justo por debajo del estrato lúcido (SL) cuando est� presente (Figuras 16 y 17). La folistatiina se expresa ligeramente en el estrato germinativo, en mayor medida en el estrato espinoso pero hasta un grado marcadamente disminuido en el estrato granuloso. Cunado hay estrato lúcido en la piel queratinizada engrosada, la folistatina se localizó en las células de esta región (Figuras 16 y 17). Obsérvese que las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) para ayudar a la identificación

30 celular.

En la dermis, la activina A se encuentra en el endotelio de los capilares y vasos pequeños (V) en macr�fagos y monocitos y en leucocitos polimorfonucleares cuando est� presente (Figuras 18-20). Los fibroblastos (F) contienen activina A. Hay folistatina en las células endoteliales y en una cantidad baja en los macr�fagos (M) y los fibroblastos 35 (Figuras 18-20). En las biopsias de pacientes con mala cicatrización, inflamación y fibrosis caracterizadas por agregaciones de col�geno (C), se produjo una regulaci�n por aumento de la activina A en los fibroblastos, macr�fagos y monocitos y los leucocitos (INF) (Figuras 18-20). En algunas áreas existen acumulaciones de macr�fagos, monocitos, leucocitos y células en degeneración (D) y cada una muestra una localización sgnificativa de activina A, mientras que la de la folistatina es parcheada o de menor intensidad (Fig 18-20). El incremento de la

40 vascularidad en estas regiones muestra una localización clara e incrementada de la activina A en células endoteliales (V) (véanse las flechas, Fig. 18) (Figuras 18-20).

El incremento de la localización de la A activa en fibroblastos es probable que sea responsable de la fibrosis d�rmica que se produce tras quemaduras en la piel, ya que algunos investigadores han hallado una correlación entre la 45 regulaci�n por aumento de la activina A en tejido pulmonar después del tratamiento con bleomicina y la fibrosis pulmonar resultante (Matsuse et al., 1995, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 13 17-24). También se hallaron correlaciones similares entre la regulaci�n por aumento de la activina A y la fibrosis pulmonar en seres humanos (Matsuse et al., 1996, American Journal of Pathology 148 707-713) y Ohga et al. (Ohga et al., 1996, Biochemical and Biophysical Research Communications 228 391-396) mostraron que la activina A estimula la

50 proliferaci�n de fibroblastos pulmonares y su diferenciación en miofibroblastos que producen col�geno.

Dado que la folistatina neutraliza las acciones de la activina A y puede atenuar el desarrollo de fibrosis hepática, se puede usar para prevenir el desarrollo de fibrosis inducida por la reacción inflamatoria causada por quemaduras. Los niveles elevados de activina A y de folistatina observados en algunos pacientes después de quemaduras indica la 55 participación de la activina A en este proceso inflamatorio análogo a los cambios inducidos por el LPS en ratones. El ejemplo anterior, que muestra que la folistatina administrada antes de la exposición a LPS en ratones puede alterar el patrón de citocinas, proporcona pruebas de que el bloqueo de las acciones biológicas de la activina puede alterar la cascada de citocinas. Estos datos indican además que el bloqueo de las acciones biológicas de la activina A induc�da por la lesión térmica por la folistatina bloquearía las acciones de la activina A que son consecuencia de una

60 lesión tisular.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MONASH UNIVERSITY

5 <120> Método terapéutico

<130> 12508890/TDO

<150> 2003905461

<151>

<150> 2004902056

<151>

15 <150> 2004904834

<151>

<160> 8

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> ADN 25 <213> cebador

<400> 1 tactggcatc ttcaccacca 20

<210> 2

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

35 <400> 2 ggctaacaga accaggacca 20

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 4 cttatgtatt ccggccatcc 20

55 <210> 5

<211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 5 gtgagcttcc cattcagctc 20

<210> 6

<211> 20 65 <212> ADN

<213> cebador <400> 6 cttcttccca tctccatcca 20

<210> 7 5 <211> 20

<212> ADN

<213> cebador

<400> 7 10 acttgccctc tccaagaaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> ADN 15 <213> cebador

<400> 8 cctagtgtgg gctaccagga 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Folistatina para uso en un método de regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero, en

donde la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de trasplante de pulmón, síndrome de dficultad 5 respiratoria aguda grave o asma.
2. Folistatina para uso en un método de tratamiento de una afección caracterizado por una respuesta inflamatoria aberrante, no deseada o, de otro modo, inapropiada en un mamífero, en donde la respuesta inflamatoria se produce en el contexto de trasplante de pulmón, síndrome de dificultad respiratoria aguda grave o asma.
3. Folistatina para uso en un método de regulaci�n negativa de una respuesta inflamatoria en un mamífero mediante la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y / o de la activina B en dicho mamífero, en donde la respuesta inflamatoria se produce en el contexto inflamación aberrante, no deseada o, de otra manera, inadecuada, aguda de las vías respiratorias.
4. Folistatina para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la respuesta inflamatoria es una respuesta a una cascada proinflamatoria, en donde dicha cascada de citocinas proinflamatorias se caracteriza por la expresiσn de TNF-α, IL-1 y / o IL-6 y en donde la respuesta inflamatoria se regula por disminución a través de la regulaci�n negativa de la actividad funcional de la activina A y / o de la activina B en dicho

20 mamífero hasta un nivel funcionalmente ineficaz para inhibir o retardar la cascada proinflamatoria.
5. La folistatina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la folistatina es la isoforma 288 de folistatina o la isoforma 315 de folistatina.

25 6. La folistatina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el la respuesta inflamatoria es aguda.
7. La folistatina para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el mamífero es

un ser humano. 30