CN114073770B - MCM8-cGAS-STING-I型干扰素信号通路作为疾病靶点的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医疗领域，具体而言，涉及MCM8‑cGAS‑STING‑I型干扰素信号通路作为疾病靶点的用途，所述用途包括制备疾病动物模型或制备诊断、预防或治疗疾病的产品中的用途。具体地，包括定量检测MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂在制备诊断疾病的产品中的用途，其中，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病或cGAS‑STING‑I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病；所述MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性相对于参考水平降低，则诊断为所述疾病；所述参考水平代表来自未患有所述疾病的同年龄段受试者的MCM8的基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性水平。

Description

MCM8-cGAS-STING-I型干扰素信号通路作为疾病靶点的用途
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，具体涉及MCM8-cGAS-STING-I型干扰素信号通路作为疾病靶点的用途，更具体而言，涉及MCM8及其相关信号通路或通路靶物质(包括TRIM21、线粒体LC3、cGAS-STING-I型干扰素)，作为包括川崎病在内的血管炎疾病以及相同信号通路异常所导致的其他疾病诊疗靶点中的用途。
背景技术
川崎病，又称小儿皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种以全身血管炎病变为主要病理的急性发热性出疹性小儿疾病。川崎病是多发于婴幼儿，在东亚地区发病率较高并且可能伴随严重并发症，高达25％的川崎病可导致冠状动脉的损伤，严重的可引起血栓性梗塞、心肌梗塞和冠状动脉瘤。在发达国家中川崎病成为诱发后天性心脏病的最主要原因。川崎病的主要诊断标准为持续发热并伴随皮疹、颈淋巴结肿大、结膜充血、口腔症状(如草莓舌、唇皲裂、粘膜充血等)、肢端改变(如手掌肿胀、掌拓红斑、脱皮等)。根据美国心脏协会的指导，持续发热大于5天，或持续发热4天并伴随出现以上并发症状中的至少4种即可诊断为川崎病。目前川崎病的病原学尚不明确，但主流观点认为川崎病由感染因素和遗传因素共同决定 (Onouchi Y,Circulation Journal 2012,76(7):1581-1586)。
川崎病在冬季和春季发病较多，并有区域性爆发的现象，呈现流行病学特征，提示了病原的感染可能是川崎病的主要诱因。然而，导致川崎病的具体病原至今仍不明确。Turnier JL 等及Chang LY等两个实验组的研究表明，半数的川崎病患儿曾感染过至少一种呼吸道病毒(Turnier JL et al,Pediatrics 2015,136(3):E609-E614；Chang LY etal,J Formos Med Assoc 2014, 113(3):148-154)，提示病毒可能是川崎病的重要诱因之一。Rowley AH等人在川崎病尸检样本的超微结构研究也曾检测到呼吸道病毒RNA(RowleyAH et al,Nat Rev Microbiol 2008,6(5):394-401.)。包括科萨奇病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、偏肺病毒、基孔肯雅热病毒、巨细胞病毒等多种病毒都可能是川崎病的诱因。此外，新型冠状病毒感染也可有诱发类似川崎病的系统性病变。除病毒外，细菌也可能是川崎病的潜在诱因。有观点认为几种来自细菌的超级抗原(链球菌致热外毒素SPE-A、中毒休克综合征毒素TSST-1、葡萄球菌肠毒素等) 能够集合T细胞受体的Vb区域，并刺激T细胞产生大量炎症因子。
川崎病在东亚人群发病率高于其他区域10～20倍，且移居欧美国家的东亚人群发病率依然显著高于其他人群，提示了其遗传易感性。早期Burgner D等人通过GWAS发现FCGR2A 与川崎病的易感性相关(Burgner D et al,PLoS Genet.2009Jan；5(1):e1000319)。最近Onouchi Y等人发现ITPKC基因突变能够调控IL-2等促炎因子的释放和T细胞的过度激活从而增加川崎病的易感性(Onouchi Y et al,Nature genetics 2008,40(1):35-42.)。随后Alphonse MP等人再次报道了ITPKC通过参与调控NLRP3炎症小体的激活和炎症因子IL-1b和IL-18的释放，从而影响川崎病的病理发展(Alphonse MP et al,Journal of immunology 2016,197(9):3481-3489.)。然而，更多的易感基因，尤其是东亚人群特异的易感基因仍待发掘。
对于川崎病这种全身性血管炎的治疗方案，存在着重要的未满足的需要。如同其他血管炎类似，川崎病许多的经典治疗是施用糖皮质激素以及抗血小板聚集的药物阿司匹林，其通常要服用很长一段时间。治疗取决于疾病进程的性质和程度，并且可包括非类固醇抗炎剂、抗组胺药、细胞毒性药物(如环磷酰胺)、或免疫抑制剂如甲氨蝶呤。这些药剂中的许多，特别是在经过长时间服用后，产生明显的副作用，如骨髓抑制(白细胞减少、血小板减少)、继发性恶性疾病、不孕、肺间质纤维化、感染和类固醇诱导的糖尿病，其在某些情况下上比原发疾病本身更恶劣。目前治疗川崎病的标准治疗方法是注射免疫球蛋白IVIG联合阿司匹林，球蛋白和阿司匹林的及时治疗可以显著降低冠状动脉并发症的比例。然而，10％～20％的川崎病患儿对传统治疗方法无应答，积极探索新的、耐药性更少的治疗方法或有效的多靶点联合治疗方法成为必须。
此外，由于川崎病作为全身血管炎，在全身多处血管、尤其是心脏血管均存在炎性病变，是血管炎的一种典型的难治愈性疾病，因此一般而言，能够治疗川崎病的药物也可能会对治疗其他血管炎有一定的效果。因此，本发明在关注川崎病的同时，也关注其他血管炎。
血管炎，是一类血管壁及血管周围有炎细胞浸润，并伴有血管损伤，包括纤维素沉积、胶原纤维变性、内皮细胞及肌细胞坏死的疾病，又称脉管炎，其发病原因也并不明确，一般认为血清病、药物变态反应及病毒感染均能引起血管炎。
血管炎被细分为与受影响血管的大小(小血管、中血管和大血管)相关的三类，其中大血管炎包括大动脉炎、巨细胞动脉炎。中等血管炎包括结节性多动脉炎、川崎病。小血管炎包括韦格纳肉芽肿、显微镜下多血管炎、过敏性紫癜、皮肤白细胞破碎性血管炎。大中小动脉静脉均可受累的是白塞病。此外，微血管炎，或动脉和静脉二者的血管炎，也均被包括，例如包括肾小球里面的微血管炎(其是各种肾脏疾病的特征)，或有血栓闭塞性脉管炎和浅静脉炎。
血管炎其他分类方式主要包括：(1)由过敏引起的变应性白细胞破碎性(坏死性)血管炎(主要有变应性皮肤血管炎、变应性系统性血管炎、过敏性紫癜、低补体性(荨麻疹样) 血管炎等)；(2)结节性多动脉炎(主要有系统性结节性多动脉炎、良性皮肤型结节性多动脉炎、婴儿结节性多动脉炎等)；(3)血栓形成性血管炎(主要有血栓闭塞性脉管炎、血栓性静脉炎、恶性萎缩性丘疹病、网状青斑性血管炎、血栓性血小板减少性紫癜等)；(4)肉芽肿性血管炎(主要有韦格纳氏肉芽肿、变应性肉芽肿性血管炎、颞动脉炎、大动脉炎等；(5).淋巴细胞性血管炎(主要有淋巴瘤样丘疹病、急性痘疮样苔藓样糠疹等)；(6)结节性血管炎(主要有结节性血管炎、硬红斑)；(7)血液成分异常性血管炎(主要有冷球蛋白血症、冷高球蛋白血症、巨球蛋白血症等。
血管炎的其他分类还包括，根据血管炎的发生部位不同而命名，包括但不限于皮肤血管炎、内脏血管炎(心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏等)、脑部血管炎等；以及根据致病因素作用进行分类，致病因素直接作用于血管壁导致的为原发性血管，而由邻近组织炎症病变波及血管壁致病的为继发性血管炎。
此外，系统性红斑狼疮，又称狼疮血管炎，其病理基础与川崎病相似，也是一种全身性血管炎，此时血管的通透性增加,出现内脏器官的炎症表现或出现雷诺现象。是皮肤、关节、浆膜、肾脏、心血管、中枢神经等多脏器受累的自身免疫性结缔组织病。
MCM8基因的中文全称为MCM8微染色体维持缺陷8基因(minichromosomemaintenance deficient 8，MCM8)，是DNA解旋酶家族成员之一。MCM8的核活性包括：核苷酸结合、 DNA结合、ATP结合、DNA依赖ATP酶、核苷三磷酸酶。MCM8参与的细胞功能包括： DNA复制、DNA复制启动/转录/调控转录、DNA依赖/细胞周期等。该基因缺陷及其已导致疾病包括胃癌、卵巢发育不全相关的不孕不育等，但该基因如何与疾病相关联的机制不明，以及目前也未见MCM8基因与血管炎(包括川崎病、系统性红斑狼疮等)、白内障、脂肪肝、肺炎或重症肺炎、肾炎等其他疾病的相关报道。阐明该基因在信号通路中所起的作用以及其在疾病发生发展中的关系，有助于提供更多更全更准的靶向诊断、预防和/或治疗相关疾病的方法。
发明内容
本发明旨在解决上述技术问题的至少一部分，通过检测/调控MCM8及其相关通路上的物质的表达来诊断、预防和/或治疗cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活所导致的疾病或线粒体自噬功能异常导致的疾病。
本发明的一个方面提供一种定量检测MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂在制备诊断疾病的产品中的用途，其特征在于，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病和/或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病；其中，所述MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性相对于参考水平降低，则诊断为所述疾病；所述参考水平代表来自未患有所述疾病的同年龄段受试者的MCM8的基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性水平。
优选地，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
优选地，所述蛋白活性优选为MCM8蛋白与TRIM21蛋白的结合活性，或，MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白的结合活性；更优选地，所述结合活性的检测方式是，当检测MCM8蛋白与TRIM21蛋白的结合活性时，检测MCM8蛋白的泛素化水平；当检测MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白的结合活性时，检测MCM8蛋白中氨基酸序列为RSFTAL(SEQ ID NO:4)的LIR motif序列与线粒体LC3蛋白的结合活性。
优选地，所述产品是用于执行以下检测方法中的一种或多种：聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、酶联免疫吸附分析、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析。
优选地，所述产品含有检测MCM8基因和/或对照基因的引物和/或检测探针；和/或还含有样品的处理试剂，包括但不限于样品裂解试剂、样品纯化试剂和/或样品核酸提取试剂；和 /或还含有DNA提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
优选地，所述产品的检测样本或受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的一种或多种；所述检测对象来自成人或儿童，优选儿童。
本发明的第二方面提供一种MCM8基因敲除小鼠在制备疾病动物模型中的用途，其特征在于，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病和/或GAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病。
优选地，基因敲除小鼠的制备方法为采用CRISPR/cas9技术构建的MCM8敲除的小鼠，包括MCM8+/-杂合小鼠或MCM8-/-纯合小鼠，优选MCM8-/-纯合小鼠。
优选地，选择32周的老龄基因敲除小鼠作为疾病的自发动物模型。
本发明的第三方面提供一种提高MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的物质在制备预防和/或治疗疾病的药物中的用途，其特征在于，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病和/或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病。
优选地，所述蛋白活性为MCM8蛋白与TRIM21蛋白的结合活性，或MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白的结合活性。
优选地，所述提高MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的物质选自小分子化药、聚糖类药物、核酸类药物、多肽或蛋白类药物；更优选地，为含有MCM8表达的启动子或增强子的核酸类药物、含有MCM8全长mRNA序列(例如，如SEQ ID NO:1所示的序列及该基因的其他mRNA isoform序列)的核酸类药物(其中包括把mRNA中的U换成T的DNA序列，或它们的互补序列)、至少包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的MCM8 mRNA的任意截短 (例如，SEQID NO:5、SEQ ID NO:6)的核酸类药物(其中包括把mRNA中的U换成T的 DNA序列，或它们的互补序列)、至少包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的MCM8蛋白的任意截短(例如，SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8)或全长序列(例如，如SEQ ID NO:2所示的序列及该蛋白的其他氨基酸isoform序列)的多肽或蛋白药物、能够将MCM8蛋白与线粒体 LC3蛋白结合的分子胶水中的一种或多种。
优选地，药物所制备的剂型为适用于成年人或儿童的剂型，和/或适用于胃肠道给药、经皮给药、眼部给药、鼻部给药、肺部给药的剂型。
所述适用于成人的剂型为采用本发明的药物活性成分与本领域常规辅料通过本领域的常规方法制备成的各种药物剂型，所述药物剂型包括但不限于散剂、片剂、舌下片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂、滴丸剂、滴眼液、眼膏剂、皮肤贴剂等。
更优选地，药物所制备的剂型为适用于儿童的剂型，适用于儿童的剂型包括颗粒剂、糖浆剂、咀嚼片、分散片、混悬剂、泡腾片、滴剂、肠溶剂、灌肠剂、口崩片、溶液剂、冲剂、栓剂。
所述药物还可根据药物成分的需要，制备成脂质体或纳米脂质体、细粉或冻干粉、微乳剂、眼药水或眼膏剂、溶液剂(例如口服溶液剂、注射剂)、脂质体、透皮吸收制剂(软膏剂或贴剂或凝胶剂)、滴鼻剂、肺部的吸入制剂(如粉雾剂)、缓控释制剂(微球注射剂、埋植剂)。
本发明的第四方面提供一种预防和/或治疗疾病的药物组合物，其特征在于，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病，所述药物组合物含有以下a)、b)、c)所述成分中的a)和c)的组合；或，a)和b)和c)的组合：
a)提高MCM8的基因表达的药物、提高MCM8的蛋白表达的药物、增加MCM8蛋白与TRIM21蛋白结合的药物、增加细胞核内MCM8泛素化或磷酸化修饰的药物、增加MCM8 蛋白与线粒体LC3蛋白结合的药物中的一种或一种以上的组合；
其中，a)选自小分子化药、聚糖类药物、核酸类药物、多肽或蛋白类药物；更优选地，选自含有MCM8表达的启动子或增强子的核酸类药物、含有MCM8全长mRNA序列(例如，如SEQ ID NO:1所示的序列及该基因的其他mRNA isoform序列,其中包括把mRNA中的U 换成T的DNA序列，或它们的互补序列)的核酸类药物、至少包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的MCM8 mRNA的任意截短(例如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6,其中包括把mRNA 中的U换成T的DNA序列，或它们的互补序列)的核酸类药物、至少包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的MCM8蛋白的任意截短(例如，SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8)或全长序列 (例如，如SEQ ID NO:2所示的序列及该蛋白的其他氨基酸isoform序列)的多肽或蛋白药物、能够将MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白结合的分子胶水；
b)减少胞浆内线粒体DNA聚集的药物、抑制cGAS-STING信号通路的药物、抑制I型干扰素表达或与其受体结合的药物、其他能够预防或治疗所述疾病的活性药物中的一种或一种以上的组合；
其中，b)选自抑制I型干扰素表达或与其受体结合的药物时，为包括干扰素α和/或干扰素β的I型干扰素的中和抗体、I型干扰素受体的阻断抗体或者刺激受试者产生抗I型干扰素的抗体的药物，更优选地，所述抗体选自Anifrolumab、Faralimomab、MEDI-545、Rontalizumab、 Sifalimumab、AGS-009、IFNαKinoid、NI-0101、I-401中的一种或多种；
c)核酸、多肽或蛋白的递送载体，和/或药学上可接受的载体。
本发明的第五方面提供一种疾病的诊断标志物，其特征在于，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病；所述诊断标志物为突变的MCM8基因或MCM8蛋白；所述突变使得MCM8基因的表达水平相对于参考水平降低，或MCM8蛋白的表达水平相对于参考水平降低，或相对于参考水平MCM8蛋白与TRIM21蛋白结合的活性降低，或相对于参考水平MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白结合的活性降低；所述参考水平代表来自未患有所述疾病的同年龄段受试者的MCM8的基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性水平。
优选地，所述线粒体自噬功能异常导致的疾病和/或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病选自自身免疫性疾病、炎症性疾病、神经病症、衰老相关疾病或癌症。
所述线粒体自噬功能异常导致的疾病优选心血管疾病、神经疾病或神经退行性疾病，或癌症；所述cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病包括自身免疫性、炎症性疾病和癌症等，如Aicardi-Goutieres综合症、系统性红斑狼疮等，优选血管炎、重症肺炎、肾炎、系统性红斑狼疮、脂肪肝(包括酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝)、白内障。
本发明的第六方面提供一种血管炎的诊断标志物，其中所述诊断标志物为带有826G＞C 和/或1094G＞A和/或839C>A和/或2291C>G突变的MCM8基因，或为带有A276P突变和/ 或S365N和/或S280C突变和/或S764A突变的MCM8蛋白，或为在SEQ ID NO:2的MCM8 蛋白序列第272-277位存在的除A276P突变以外的其他MCM8蛋白单个突变或连锁突变，或其相应位点上的基因突变或连锁突变(在SEQ ID NO:1的MCM8基因序列第816-831位存在的除826G＞C突变以外的其他MCM8基因单个突变或连锁突变)。
优选地，所述血管炎为川崎病或系统性红斑狼疮。
本发明的第七方面是提供血管炎的诊断标志物在制备检测血管炎的产品中的用途，其中，所述突变为带有826G＞C和/或1094G＞A和/或839C>A和/或2291C>G突变的MCM8基因，或为带有A276P突变和/或S365N和/或S280C突变和/或S764A突变的MCM8蛋白；或为在SEQ ID NO:2的MCM8蛋白序列第272-277位存在的除A276P突变以外的其他MCM8蛋白单个突变或连锁突变，或其相应位点上的基因突变或连锁突变(在SEQ ID NO:1的MCM8基因序列第816-831位存在的除826G＞C突变以外的其他MCM8基因单个突变或连锁突变)。
优选地，所述血管炎为川崎病或系统性红斑狼疮。
优选地，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
优选地，所述产品是用于执行以下检测方法中的一种或多种：聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、酶联免疫分析法(ELISA)、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析。
优选地，所述产品含有检测MCM8基因和/或对照基因的引物；和/或检测MCM8基因突变或对照基因的探针；和/或还含有样品的处理试剂，包括但不限于样品裂解试剂、样品纯化试剂和/或样品核酸提取试剂；和/或还含有DNA提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
优选地，所述产品的检测样本或受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的一种或多种；所述检测对象来自成人或儿童，优选儿童。
本发明的第八方面是提供血管炎的诊断或检测方法，所述方法包括检测受试者的MCM8 基因或它们的编码蛋白中是否存在突变位点，如果存在突变位点，不管是纯合突变位点还是杂合突变位点，只要所述突变位点影响到基因或蛋白的功能，例如使得MCM8蛋白表达水平或者蛋白活性相对于不患有血管炎的同龄人群的水平下降，则所述受试者被鉴定为患有血管炎，或者诊断所述受试者为患有血管炎的风险评级为高风险，又或者诊断所述受试者的后代也容易携带血管炎的易感基因；优选地，所述血管炎为川崎病或系统性红斑狼疮；并且其中，所述受试者可以是儿童、成年人、老人等任何人群；所述突变位点可为所述基因或蛋白上的任何满足前述条件的突变，例如，在MCM8基因序列的AGGUCAUUUACUGCUCUC(SEQ ID NO:3,其中包括把mRNA中的U换成T的DNA序列，或它们的互补序列)的LIR motif序列中存在突变或在MCM8蛋白序列的RSFTAL(SEQ ID NO:4)的LIR motif序列中存在突变；又例如，可选为本发明前文已记载过的发明人已发现的突变，所述突变为带有826G＞C和/或1094G＞A和/或839C>A和/或2291C>G突变的MCM8基因(即SEQ ID NO:1中第826位的 G鸟嘌呤突变为C胞嘧啶；和/或第1094位的G鸟嘌呤突变为A腺嘌呤；和/或第839位的C 胞嘧啶突变为A腺嘌呤；和/或第2291位的C胞嘧啶突变为G鸟嘌呤)，或所述突变为带有 A276P突变和/或S365N和/或S280C突变和/或S764A突变的MCM8蛋白(即SEQ ID NO:2 中第276位的A丙氨酸突变为P脯氨酸；和/或第365位的S丝氨酸突变为N天冬酰胺；和/ 或第365位的S丝氨酸突变为N天冬酰胺；和/或第280位的S丝氨酸突变为C半胱氨酸；和/或第764位的S丝氨酸突变为A丙氨酸)。
优选地，本发明的诊断或检测血管炎的方法包括采用引物和/或探针进行检测的步骤，所述引物和/或探针所扩增的片段包含整个基因，或至少涵盖能够检测到是否存在目的突变位点的片段。并且，本发明的检测血管炎的方法中检测突变位点通过选自如下的方法或技术进行：聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、酶联免疫分析法、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析技术、单链构象异构多态分析技术、探针扩增阻滞突变系统。
本发明的第九个方面是提供MCM8基因敲除小鼠在制备血管炎动物模型中的用途。
优选地，所述血管炎选自川崎病或系统性红斑狼疮。
优选地，当所述血管炎为川崎病时，其步骤包括将采用本领域常规方法构建的MCM8敲除小鼠，通过腹腔注射LCWE(Lactobacillus casei cell wall extract,干酪乳杆菌细胞壁成分) 构建川崎病小鼠模型；当所述血管炎为系统性红斑狼疮时，其步骤包括采用本领域常规方法构建MCM8敲除的小鼠，并进一步通过腹腔注射姥鲛烷(Pristane)构建小鼠狼疮肾炎模型。
本发明的第十个方面是提供MCM8基因和/或蛋白作为制备血管炎预防和/或治疗药物的药物靶点的应用，所述应用包括但不限于任何可以提高MCM8的正常基因表达或蛋白表达或蛋白活性的物质作为活性成分，以及能够递送所述活性成分的核酸、多肽或蛋白的递送载体，和/或药学上可接受的载体，制备成本领域常规的剂型应用。
优选地，所述血管炎选自川崎病或系统性红斑狼疮。
优选地，所述蛋白活性为MCM8蛋白与TRIM21蛋白的结合活性，或MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白的结合活性。
优选地，所述提高MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的物质选自小分子化药、聚糖类药物、核酸类药物、多肽或蛋白类药物；更优选地，为含有MCM8表达的启动子或增强子的核酸类药物、含有MCM8全长mRNA序列(例如，如SEQ ID NO:1所示的序列及该基因的其他mRNA isoform序列,其中包括把mRNA中的U换成T的DNA序列，或它们的互补序列)的核酸类药物、至少包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的MCM8 mRNA的任意截短(例如，SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6,其中包括把mRNA中的U换成T的DNA序列，或它们的互补序列)的核酸类药物、氨基酸序列至少包含RSFTAL(SEQ ID NO:4)的MCM8 蛋白的任意截短(例如SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8)或全长序列(其中，MCM8蛋白的全长序列如SEQ ID NO:2所示的序列及该蛋白的其他氨基酸isoform序列)的多肽或蛋白、能够将MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白结合的分子胶水中的一种或多种。
优选地，所述药物还可进一步还有如下活性成分，包括：减少胞浆内线粒体DNA聚集的药物、抑制cGAS-STING信号通路激活的药物、抑制I型干扰素表达或抑制I型干扰素与其受体结合的药物、其他能够预防或治疗所述疾病的活性药物中的一种或一种以上的组合。
优选地，所述I型干扰素为干扰素α和/或干扰素β，所述抑制I型干扰素表达的药物为I 型干扰素的中和抗体、I型干扰素受体的阻断抗体或者刺激受试者产生抗I型干扰素的抗体的药物。
优选地，所述抗体为人源化抗体或人抗体，亚型可选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。
更优选地，所述抗体选自Anifrolumab、Faralimomab、MEDI-545、Rontalizumab、Sifalimumab、AGS-009、IFNαKinoid、NI-0101、I-401中的一种或多种。
优选地，药物所制备的剂型为适用于成年人或儿童的剂型，其中优选适用于儿童的剂型，适用于儿童的剂型包括颗粒剂、糖浆剂、咀嚼片、分散片、混悬剂、泡腾片、滴剂、肠溶剂、灌肠剂、口崩片、溶液剂、冲剂、栓剂；和/或适用于胃肠道给药、经皮给药、眼部给药、鼻部给药、肺部给药的剂型。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了MCM8基因或蛋白是川崎病或系统性红斑狼疮或心血管炎或肺血管炎或血液成分异常血管炎等血管炎疾病、肺炎或重症肺炎、肾炎、脂肪肝、白内障等多疾病的疾病诊断、预防和/或治疗相关的靶点和动物模型制备的靶点。
本发明还发现了，MCM8基因或蛋白参与到上述疾病的发生、发展中起关键作用的相关通路或靶物质，完整地阐明了相关疾病的发病机理和防治方法，包括：
发现了低表达或敲低或敲除的MCM8能够抑制线粒体自噬功能(包括抑制线粒体自噬体的形成)、抑制损伤线粒体的修复或及时清除，从而造成更多损伤线粒体DNA在胞浆聚集、进而激活cGAS-STING-I型干扰素信号通路，产生大量I型干扰素，促进多个疾病的发生发展；
而在MCM8及其cGAS-STING-I型干扰素信号通路功能正常时，当受到不利因素例如氧化应激状态下，信号分子(例如NO)发出信号，随后激发TRIM21与MCM8结合，使得细胞内的MCM8泛素化后出细胞核，出核行使功能的MCM8上的LIR-motif序列(RSFTAL， SEQ ID NO:4)与线粒体LC3结合，启动线粒体自噬体形成，则可清除或修复受损失的DNA，抑制损伤线粒体DNA在胞浆聚集，进而也抑制cGAS-STING-I型干扰素通路激活，抑制疾病的发生发展；
进而可通过干预上述信号通路中的任意一个或一个以上的组合的靶物质对本发明所述的疾病(包括川崎病、心脏血管炎、肺血管炎、系统性红斑狼疮、血液成分异常性血管炎等血管炎疾病、I型干扰素升高相关的炎症、线粒体自噬功能障碍相关的疾病、cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活相关的疾病等)进行预防和/或治疗，从而提供了与现有技术已知的药物或疗法不同的新的疾病的治疗方案，为疾病的防治提供了新的以及减少耐药性的技术方案。例如，当选择anti-IFNAR对该川崎病、心脏血管炎等疾病进行治疗时，观察到了明显的治疗效果。
更具体地，本发明还发现了川崎病的与前述机理或信号通路密切相关的诊断标志物，所述诊断标志物为带有826G＞C和/或1094G＞A和/或839C>A和/或2291C>G突变的MCM8基因，或所述突变为带有A276P突变和/或S365N和/或S280C突变和/或S764A突变的MCM8 蛋白，以及根据本发明的研究，选择其他在SEQ ID NO:2的MCM8蛋白序列第272-277位存在的除A276P突变以外的其他MCM8蛋白单个突变或连锁突变，或其相应位点上的基因突变或连锁突变(在SEQ ID NO:1的MCM8基因序列第816-831位存在的除826G＞C突变以外的其他MCM8基因单个突变或连锁突变)，或其他同样影响LIR功能的MCM8基因或蛋白的突变。通过上述标志物，能够给川崎病等血管炎疾病提供一种低成本的快速诊断方法，尤其是发生在东亚人群的川崎病的诊断。
附图说明
图1为本发明实施例中的川崎病患者炎症因子及全外显子测序的分析结果。其中，
A图：川崎病患者血浆中不同细胞因子和炎症因子的水平；
B图：列举了川崎病患者携带的各个SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)在不同人种中的突变频率概览；
C图：列举了川崎病患者携带的各个SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)在东亚人群中的具体突变频率；
D图：显示本发明实施例中的MCM8的突变位点，及其在不同物种间的保守性；
E图：显示MCM8该突变在不同人种的具体发生频率。
图2为本发明实施例中的MCM8敲低能够促进cGAS-STING通路介导的I型干扰素的产生的结果。其中，
A图：在THP-1细胞中用siRNA敲低MCM8后，用ELISA检测的IFN-β释放的结果；
B图：在THP-1细胞中敲低MCM8后，用SeV病毒、poly(dA:dT)及LPS细菌毒素刺激细胞的Q-PCR检测的IFN-β的表达结果；
C图：在cGAS、STING、RIG-I、IFI16被敲除的THP-1细胞中分别敲低MCM8，通过ELISA检测IFN-β的释放。
图3示出了本发明实施例中，MCM8敲低促进了线粒体DNA的释放。其中，
A图：在THP-1细胞中敲低MCM8，分别用SeV、poly(dA:dT)刺激或不刺激细胞，然后通过核质分离提取细胞浆中的DNA，Q-PCR检测DNA的来源；
B图：通过MCM8的基因型对川崎病患者的外周血单核细胞(PBMC)进行分组(正常组ref和突变组mut)，分别用LPS、SeV或poly(dA:dT)刺激或不刺激细胞，通过核质分离提取胞浆DNA，Q-PCR检测DNA的来源；
C图：在THP-1细胞中敲低MCM8，用SeV刺激细胞，同时分别用线粒体通透性转换孔(MTP)的抑制剂环孢素A(CsA)或溶剂DMSO处理细胞，通过ELISA检测IFN-α的释放；
D图：用EtBr处理THP-1细胞构建无线粒体的ρ0细胞，在正常THP-1或ρ0THP-1中敲低MCM8，随后用SeV刺激细胞，通过Q-PCR检测IFNA和IFNB的表达；
E图：用EtBr处理THP-1细胞构建无线粒体的ρ0细胞，在正常THP-1或ρ0THP-1中敲低MCM8，随后用SeV刺激细胞，通过免疫印迹检测pIRF3的水平。
图4示出了本发明实施例中的MCM8敲低抑制线粒体自噬体形成的结果。其中，
A图：THP-1细胞中敲低MCM8，分别用LPS、SeV刺激细胞或不刺激细胞，免疫印迹检测线粒体LC3及其他线粒体(TOM20,MFN2,PINK1,COXIV)蛋白的表达；
B图：Hela细胞中过表达F-MCM8，分别用LPS、SeV刺激细胞或不刺激细胞，免疫印迹检测线粒体LC3及其他线粒体蛋白(TOM20,MFN2,PINK1,COXIV)的表达；
C图：Hela细胞中敲低MCM8，在LPS的刺激下，检测LC3和线粒体的共定位；
D图：THP-1细胞中敲低MCM8，免疫电镜检测线粒体自噬的数目；
E图：根据图D免疫电镜的结果进行的统计分析结果；
F图：是THP-1细胞中，敲低MCM8，并分别用SeV和LPS刺激细胞或不刺激细胞，在线粒体自噬抑制剂Mdivi处理或不处理的情况下，提取胞浆DNA，并通过Q-PCR检测胞浆中线粒体DNA的含量；
G图：是THP-1细胞中，敲低MCM8，并分别用SeV和LPS刺激细胞或不刺激细胞，在线粒体自噬抑制剂Mdivi处理或不处理的情况下，通过Q-PCR检测IFNA和IFNB的表达。
图5示出了本发明实施例中MCM8作为线粒体自噬受体的结果。其中，
A图：构建含有或不含有LIR motif序列的多种MCM8截短形式，检测与LC3的结合结果；
B图：显示MCM家族不同成员是否具有LIR motif；
C图：模拟LC3与MCM8 LIR motif的三级结构的相互作用的图；
D图：模拟LC3与MCM8 LIR motif的二级结构的相互作用的图；
E图：MCM8及其A276P点突变与LC3的相互作用结果；
F图：检测正常A276位点和突变P276位点人的PBMC分别受LPS、SeV、poly(dA:dT)刺激或不刺激时胞浆线粒体DNA的含量。
图6为本发明实施例中的MCM8敲除促进川崎病发展的小鼠模型及抗IFNAR治疗的有效性结果图。其中，
A图：正常和MCM8敲除的LCWE川崎病小鼠模型第5天(急性期)和14天(亚急性期)血清中细胞因子的释放情况；
B图：建模14天的小鼠心脏血管炎症HE染色示意图；
C图：对建模14天的小鼠进行抗IFNAR治疗并取心脏组织进行HE染色观察；
D图：根据HE染色结果进行临床评分统计；
E图：将心脏切片进行IHC染色，检测心脏标本中IFN-α的表达情况；
F图：根据IHC染色结果进行IFN-α定量分析图。
图7为示出MCM8缺失导致肺血管炎的图。其中，
A图为MCM8-/-小鼠的肺部HE病理全景和病理部位放大；
B图为WT小鼠的肺部HE病理全景和局部放大。
图8为示出MCM8缺失加重肺部炎症的图。其中，
A图：小鼠新冠感染模型的造模方法图示；
B图：新冠模型WT，Mcm8+/-和Mcm8-/-小鼠的肺脏照片；
C图：新冠模型WT,Mcm8+/-和Mcm8-/-小鼠的肺脏HE病理切片全景和放大图。
D图：新冠模型WT,Mcm8+/-和Mcm8-/-小鼠的肺脏HE病理部位放大图；
E图：MCM8敲除小鼠肺脏的水肿和坏死细胞碎片的情况；
F图：MCM8基因敲除鼠的心脏的HE染色结果全景；
G图：MCM8基因敲除鼠的心脏的HE染色结果病变位置放大。
图9为示出MCM8缺失而加重小鼠肾炎及SLE表型的图。其中，
a图：狼疮肾炎模型小鼠的存活曲线；
b图：狼疮肾炎模型小鼠血清中抗dsDNA抗体的浓度；
c图：注射姥鲛烷4个月后，小鼠肺脏的HE病理切片及病变部位放大；
d图：注射姥鲛烷4个月后，小鼠肾脏的HE病理切片及病变部位放大。
图10为示出MCM8缺失促进脂肪性肝炎的HE病理切片病变位置放大图。
图11为示出MCM8敲除造成小鼠眼角膜病变的图。其中，
A图：MCM8敲除小鼠眼表角膜变白的图示；
B图：MCM8敲除小鼠眼表角膜变白的放大图；
C图：MCM8敲除小鼠的左眼变白的图示；
D图：MCM8敲除小鼠的右眼无眼的图示。
图12为NO促进TRIM21介导MCM8泛素化出核的图示。其中，
a图：MCM8在SeV和LPS刺激时的出核被莱普霉素B抑制；
b图：核质分离后，MCM8在细胞质的泛素化显著高于细胞核内的泛素化水平；
c图：加入泛素连接酶抑制剂TAK-243后MCM8的出核受到抑制；
d图：在HeLa细胞中证明MCM8能够结合TRIM21且在LPS和poly(dA:dT)刺激时结合增加；
e图：TRIM21介导的MCM8泛素化可被NO清除剂1400W抑制；
f图：加入NO清除剂1400W使得MCM8的出核受到抑制；
g图：MCM8通路的示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种定量检测MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂在制备诊断疾病的产品中的用途，其中所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病；其中，所述MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性相对于参考水平降低，则诊断为所述疾病；所述参考水平代表来自未患有所述疾病的同年龄段受试者的MCM8的基因表达水平或蛋白表达水平或蛋白活性水平。
对于本发明提及的“基因序列”，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条，及其可反推成相应的蛋白序列。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，同时也公开了相应的蛋白序列。例如提及MCM8基因的mRNA序列，实际上包括该序列以及其互补序列，以及相应的翻译成蛋白的序列。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补的核苷酸序列，也包括其对应的翻译后的氨基酸序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然；本申请中的基因序列包括mRNA形式或cDNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及MCM8基因的mRNA序列，实际也包括相应的cDNA序列，也等同公开和可利用将mRNA序列中的U替换为T的序列，以及还等同公开或利用它们的互补序列；此外，为了检测前述基因突变，可以设计能够扩增整个基因的检测引物和/或探针，也可以在突变所在位置前后设计检测引物和/或探针。
术语“线粒体自噬”(mitophagy)，是指选择性地隔离和降解受损伤或不完整线粒体的自噬方式，其参与维持线粒体网络功能的完整性和细胞的稳态。换言之，当线粒体自噬功能正常、线粒体自噬体能够正常启动和/或形成，则能够清除或修复受损伤的DNA，否则，损伤的DNA 不能被修复，则会出现如本发明实施例所述的胞浆DNA聚集、cGAS-STING-I型干扰素信号通路被激活，I型干扰素产生，诱发多种炎症、癌症等病症的发生、发展，目前已知的线粒体自噬相关的疾病多与神经疾病、心血管疾病、癌症相关，因此，针对线粒体自噬的干预对线粒体功能障碍相关的人类疾病具有治疗潜力，目前已知尿素A等小分子合成或天然化合物，被证明有助于吞噬有丝分裂。
其中，术语“cGAS-STING-I型干扰素信号通路”，意指通过DNA受体cGAS识别DNA后，通过信号转导到STING，进而激活I型干扰素的过程。所述I型干扰素为干扰素α和/或干扰素β。
cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活的疾病包括自身免疫性、炎症性疾病、衰老相关疾病和癌症等。
另外，下文中有时提到的“MCM8-cGAS-STING-I型干扰素信号通路”意指，通过控制MCM8的上游或下游的表达，例如通过控制TRIM21与MCM8结合、使其泛素化(和/或伴随磷酸化)，以及通过促进MCM8与线粒体LC3结合，调控cGAS-STING-I型干扰素信号通路。
术语“泛素化”、“磷酸化”，在真核细胞中，泛素化和磷酸化是8种常见的蛋白质修饰方式。泛素在蛋白酶体降解途径中发挥重要的靶向作用，细胞外信号严格调控着目的蛋白的泛素化。在很多情况下，这种调控又伴随依赖于蛋白质的磷酸化。
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，其可抑制病毒复制，同时还可增强自然杀伤细胞(NK 细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。目前通用的分类方法将干扰素分为三型，其中I型有IFN-α和IFN-β。I型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用；IFN-ω属于IFN-α家族，其结构和大小与其它IFN-α稍有差异，但抗原性有较大的不同。
进一步的，所述IFN-α亚型选自IFN-ω、IFN-αA、IFN-αB2、IFN-αC、IFN-αF、IFN-αG、IFN-αH2、IFN-αI、IFN-αJ1、IFN-αK、IFN-αWA和IFN-α4a中的至少一种人干扰素α(IFN-α) 亚型。
在一些实施方式中，所述试剂用于抑制I型干扰素的表达或抑制I型干扰素与其受体的结合。
在一个实施方式中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片，其中，所述试剂盒也可以包括所述诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
在一个实施方式中，所述蛋白活性为MCM8蛋白与TRIM21蛋白的结合活性，或，MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白的结合活性。
所述“TRIM21”是一种人抗E3泛素蛋白连接酶，TRIM21蛋白在各种类型细胞,特别是某些免疫细胞如T细胞,巨噬细胞和树突状细胞中广泛表达。TRIM21最先作为自身抗原被发现，又称为Ro52/SS-A,常引起干燥综合征,系统性红斑狼疮和系统性硬化症等自身免疫病，在固有免疫和适应性免疫的调控中发挥重要作用。TRIM21蛋白是目前在哺乳动物体内发现的唯一一个细胞浆内IgG受体。此外，TRIM21蛋白还在固有免疫中调控多种细胞因子的分泌。
所述结合活性的示例性的检测方式包括，当检测MCM8蛋白与TRIM21蛋白的结合活性时，检测MCM8蛋白的泛素化水平；当检测MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白的结合活性时，检测MCM8蛋白中氨基酸序列为RSFTAL的LIR motif序列与线粒体LC3蛋白的结合活性。
在一个实施方式中，所述用于定量检测MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的试剂在制备诊断疾病的产品是用于执行以下检测方法中的一种或多种：各种PCR相关方法，包括聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；核苷酸或氨基酸序列测序法；变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析。
在一个实施方式中，所述产品含有检测MCM8基因或对照基因的引物和/或检测探针；和/或还含有样品的处理试剂，包括但不限于样品裂解试剂、样品纯化试剂和/或样品核酸提取试剂；和/或还含有DNA提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
其中，“对照基因”是指是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。
在一个实施方式中，所述产品的检测样本或受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的一种或多种；所述检测对象来自成人或儿童，优选儿童。
在本发明中，术语“敲低”是指利用miRNA、siRNA、反义核苷酸等使靶基因MCM8的表达降低。
另外，根据如上所述内容，所述试剂可以于DNA水平、mRNA水平或者蛋白水平发挥作用。当所述试剂为抑制试剂(例如抑制cGAS-STING、特别是抑制I型干扰素的试剂)时，蛋白水平的抑制剂可以为靶物质的中和抗体，或者其受体或上游分子的阻断抗体，或者可以对其活性起到阻断作用的物质，例如化合物。
RNA水平的抑制剂例如miRNA、siRNA、反义核苷酸等。
DNA水平的抑制剂例如各种可以敲除靶基因全长或其部分片段的试剂(优选CRISPR系统)。
在一些实施方式中，所述试剂用于减少胞浆内线粒体DNA的聚集。另外，本发明还涉及一种MCM8基因敲除小鼠在制备疾病动物模型中的用途，其中，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病或GAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病。
本发明还进一步涉及一种提高MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的物质在制备预防和/或治疗疾病的药物中的用途，其中，所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病或 cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病。
在一个实施方式中，所述蛋白活性为MCM8蛋白与TRIM21蛋白的结合活性，或MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白的结合活性。
作为所述提高MCM8的基因表达或蛋白表达或蛋白活性的物质，可以选自小分子化药、聚糖类药物、核酸类药物、多肽或蛋白类药物；更优选地，为含有MCM8表达的启动子或增强子的核酸类药物、至少包含5’-AGGUCAUUUACUGCUCUC-3‘(SEQ ID NO:3所示)的核苷酸序列的MCM8 mRNA的任意截短(例如，SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)或全长序列(如 SEQ ID NO:1)的核酸类药物(其中包括把mRNA中的U换成T的DNA序列，或它们的互补序列)、氨基酸序列至少包含RSFTAL(SEQ ID NO:4)的MCM8蛋白的任意截短(例如，SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8)或全长序列(如SEQ ID NO:2)的多肽或蛋白、能够将MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白结合的分子胶水中的一种或多种，其中，“含有MCM8全长mRNA序列的核酸类药物、氨基酸序列至少包含RSFTAL的MCM8蛋白的任意截短或全长序列的多肽或蛋白”等为外源表达的MCM8的mRNA、蛋白或它们的功能片段，或能够负载或表达上述物质的成分，可选例如表达载体(如质粒载体)、脂质体、慢病毒、腺病毒等。
另外，本发明还涉及一种预防和/或治疗疾病的药物组合物，其中所述疾病为线粒体自噬功能异常导致的疾病或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病，所述药物组合物含有以下a)、b)、c)所述成分中的a)和c)的组合；或，a)和b)和c)的组合：
a)提高MCM8的基因表达的药物、提高MCM8的蛋白表达的药物(例如外源表达的MCM8的mRNA、蛋白或它们的功能片段，或能够负载或表达上述物质的成分，可选例如表达载体、脂质体、慢病毒等)、增加MCM8蛋白与TRIM21蛋白结合的药物、增加细胞核内 MCM8泛素化或磷酸化修饰的药物、增加MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白结合的药物中的一种或一种以上的组合；
其中，a)选自小分子化药、聚糖类药物、核酸类药物、多肽或蛋白类药物；更优选地，选自含有MCM8表达的启动子或增强子的核酸类药物、至少包含5’-AGGUCAUUUACUGCUCUC-3‘(SEQ ID NO:3所示)的核苷酸序列的MCM8 mRNA的任意截短(如SEQID NO:5、SEQ ID NO:6)或全长序列(如SEQ ID NO:1)的核酸类药物(其中包括把mRNA中的U换成T的DNA序列，或它们的互补序列)、氨基酸序列至少包含RSFTAL(SEQ ID NO:4)的MCM8蛋白的任意截短(如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8)或全长序列 (如SEQ ID NO:2)的多肽或蛋白、能够将MCM8蛋白与线粒体LC3蛋白结合的分子胶水；
b)提高线粒体自噬体形成的药物(例如尿素A)、减少胞浆内线粒体DNA聚集的药物、抑制cGAS-STING信号通路激活的药物、抑制I型干扰素表达的药物、其他能够预防或治疗所述疾病的活性药物中的一种或一种以上的组合；
其中，优选为抑制I型干扰素表达的药物，所述I型干扰素为干扰素α和/或干扰素β，所述抑制I型干扰素表达的药物为I型干扰素的中和抗体、I型干扰素受体的阻断抗体或者刺激受试者产生抗I型干扰素的抗体的药物，更优选地，所述抗体选自Anifrolumab、Faralimomab、 MEDI-545、Rontalizumab、Sifalimumab、AGS-009、IFNαKinoid、NI-0101、I-401中的一种或多种；
c)核酸、多肽或蛋白的递送载体(例如表达载体、脂质体、慢病毒)，和/或药学上可接受的载体或辅料成分。
在一些实施方式中，所述抗体是特异性的，优选对其靶物质具有108l/mol、或更优选109 l/mol的亲和力。
根据本发明，正常机理情况下，细胞受到氧化应激时，产生NO信号分子，NO促进TRIM21 转位入核，入核后的TRIM21结合MCM8并泛素化MCM8，泛素化的MCM8出核定位到线粒体并通过其LIR-motif募集LC3，启动线粒体自噬，清除损伤线粒体。当MCM8的低表达或突变时，能够抑制线粒体自噬，抑制损伤线粒体的及时清除，从而造成更多损伤线粒体DNA 在胞浆聚集、进而激活cGAS-STING-I型干扰素信号通路，产生更多的I型干扰素，促进多个疾病的发生发展；通过干预上述信号通路中的任意一个靶物质对本发明所述的疾病(包括川崎病、血管炎、I型干扰素升高相关的炎症、线粒体自噬功能障碍相关的疾病、cGAS-STING- I型干扰素信号通路异常激活相关的疾病等)进行预防和/或治疗。
本文使用的术语“靶物质”可以包括但不仅限于靶基因、靶mRNA和靶蛋白等，所述试剂可以通过额外给予靶物质或者抑制靶物质来发挥作用。如本领域技术人员显而易见的，靶 mRNA不应当解释为限于上述基因直接转录得到的特定mRNA序列，例如，当所述试剂为siRNA时，其可以通过与靶mRNA等部分序列结合以阻断整个靶mRNA等作用。同样的，在本发明中用作靶物质的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的蛋白等片段，特别是功能性片段。另外，或在替代方案中，靶蛋白可以携带翻译后修饰。翻译后修饰的非限制性实例是泛素化、糖基化、酰化和/或磷酸化。
“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，“抗体片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。在一些优选的实施方式中，所述试剂为人源化抗体或人抗体。
“人源化抗体”是指其中抗原结合位点来源于非人物种且可变区框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架区中可包含置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白序列或种系基因序列的精确拷贝。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点区均来源于人起源的序列。如果所述抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人起源的序列。
在一些实施方式中，所述人源化抗体或人抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。
在一些实施方式中，所述试剂选自Anifrolumab、Faralimomab、MEDI-545、Rontalizumab、 Sifalimumab、AGS-009、IFNαKinoid、NI-0101、I-401中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述线粒体自噬功能异常导致的疾病和/或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病，选自自身免疫性疾病、炎症性疾病、神经病症、衰老相关疾病或癌症。
在一个实施方式中，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、系统性肺纤维化(SSc)、肌炎、肖格伦综合征、爱卡地综合征、辛梅二氏综合征、皮肤血管炎、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、STING相关的血管炎。
在一个实施方式中，所述炎症性疾病，选自病毒、细菌或真菌感染导致感染性疾病、银癣病、牛皮癣、炎症性肠病(IBD)、囊肿性纤维化(CF)、疱疹、哮喘和过敏、脓毒症和败血性休克、登革出血热、I型糖尿病、子宫内膜异位、前列腺炎、葡萄膜炎、子宫成熟，优选为I型干扰素介导的炎症性疾病。
在一个实施方式中，所述神经病症选自额颞叶变性、阿尔茨海默病、帕金森氏病、路易体痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、关岛型帕金森痴呆ALS复合症、亨廷顿氏舞蹈病、包涵体肌病伴早发性佩吉特病和额颞叶痴呆、包涵体肌炎、肌原纤维肌病、拳击手痴呆、慢性创伤性脑病、亚历山大症、遗传性包涵体肌病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、先天性肌无力综合征、先天性肌病、痉挛性束颤综合征、杜兴氏肌肉营养不良症、II型糖原贮积病、遗传性痉挛性截瘫、艾萨克斯综合征、卡恩斯塞尔综合征、朗伯伊顿肌无力综合征、线粒体肌病、肌肉萎缩症、重症肌无力、肌强直性营养不良、外周神经病变、脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓性肌肉萎缩症、僵人综合征、泰勒综合征和格林巴利综合征、渐冻症。
在一个实施方式中，所述衰老导致的疾病选自心血管疾病、骨质疏松症、年龄相关的肺疾病、年龄相关的眼疾病、年龄相关的肝疾病、年龄相关的肾疾病、年龄相关的听力损失、年龄相关的肌肉疲劳或少肌症、年龄相关的皮肤状况、胰纤维化、口腔粘膜下纤维化。
在一个实施方式中，所述癌症选自肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、宫颈癌、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌。
在一个实施方式中，所述STING相关的血管炎选自川崎病、心脏血管炎、皮肤血管炎。
所述病毒、细菌或真菌感染导致感染性疾病选自细菌性肺炎、病毒性肺炎，包括流感、新冠肺炎、细菌性脑膜炎呼吸病症、呼吸合胞病毒(RSV)引起的肺炎、细菌性肠炎。
所述炎症性肠病选自未定性的结肠炎、溃疡性结肠炎或克罗恩病。
所述心血管疾病选自动脉粥样硬化、心绞痛、心律失常、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、心内膜炎、冠状动脉血栓形成、心肌梗死、高血压、主动脉瘤、心脏舒张功能障碍、高胆固醇血症、高脂血症、二尖瓣脱垂、周围血管疾病、心脏应激抗性(cardiac stress resistance)、心肌纤维化、脑动脉瘤、高血压和中风。
所述年龄相关的肾疾病选自肾衰竭、肾虚弱、肾纤维化。
所述年龄相关的肺疾病选自肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张。
所述年龄相关的皮肤状况选自湿疹、银屑病、色素沉着过度、痣、皮疹、特应性皮炎、荨麻疹、与光过敏或光老化相关的疾病和病症、皱纹、瘙痒、感觉迟钝、湿疹爆发、嗜酸性皮肤病、反应性嗜中性皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫大疱性皮肤病、皮肤纤维组织细胞增殖、皮肤淋巴瘤。
所述年龄相关的眼病选自黄斑变性、青光眼、白内障、老视和视力损失的眼疾病或病症。
在一个优选的实施方式中，所述线粒体自噬功能异常导致的疾病或cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活导致的疾病选自血管炎、肺炎、肾炎、系统性红斑狼疮、脂肪性肝炎、白内障，更优选地，所述血管炎优选为川崎病、系统性红斑狼疮、心脏血管炎、肺血管炎、血液成分异常性血管炎。
在本发明中，所述药学上可接受的载体或辅料成分的实例包括结合剂(糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄芪胶(tragacanth)、聚乙烯吡咯烷酮等)、填充剂(乳糖、蔗糖、淀粉、磷酸钙、山梨糖醇、甘氨酸等)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等)、崩解剂(淀粉、微晶纤维素(microcrystalline cellulose)等)、湿润剂(十二烷基硫酸钠(sodium laurylsulphate) 等)、悬浮剂(山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆(glucose syrup)、明胶、氢化食用脂肪等)、乳化剂(卵磷脂、山梨醇单油酸酯、阿拉伯树胶等)、非水性载体(杏仁油、分馏椰子油或甘油、丙二醇、乙醇等疏水酯等)、防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸等)、芳香剂(合成香料、天然香料等)、甜味剂(蔗糖、甜叶菊、木糖醇等)、pH调节剂(碳酸氢钠、碳酸钾等)、粉剂(色素、染料、树脂等)、增稠剂(阿拉伯树胶、甲基纤维素等)、抗氧化剂(维生素C、维生素E等)等等。
本发明的上述药物或者药物组合物可以制备的剂型为适用于成年人或儿童的剂型，优选适用于儿童的剂型。其中，成人的剂型只要所述试剂可以被给药，可以制成片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、液体和溶液、悬浮液、乳液、注射剂和滴剂等；适用于儿童的剂型可选包括颗粒剂、糖浆剂、咀嚼片、分散片、混悬剂、泡腾片、滴剂、肠溶剂、灌肠剂、口崩片、溶液剂、冲剂、栓剂等。本发明对药物的给药方法没有任何限制，具体给药方法可以从口服、注射(皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内)、皮肤给药、经皮给药等中进行适当地选择，并且优选制备成适用于胃肠道给药、皮肤给药、眼睛给药、肺部给药的剂型。
在一些实施方式中，所述药物或者药物组合物中还可以包含其他的川崎病的治疗剂。
在一些实施方式中，所述治疗剂包括一剂或多剂的IVIG、阿司匹林、抗TNF-α剂、皮质类固醇、环孢菌素(cyclosporin)、IL-1抑制剂(阿那白滞素(anakinra)及卡纳单抗(canakinumab))、环磷酰胺(cyclophosphamide)、利妥昔单抗(Rituximab)、托珠单抗(Tocilizumab)、己酮可可碱(Pentoxifylline)、血浆分离术(plasmapheresis)或其组合。
根据本发明的再一方面还涉及一种治疗、预防、减轻和/或缓解上述疾病的方法，包括对受试者给予有效量的如上所述试剂或药物的步骤。
本发明中所述的术语“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明中所述疾病或病症的剂量。
本发明中所述的术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明所述试剂或药物以治疗、预防、减轻和/或缓解本申请所述疾病、病症、症状的动物，受试者包括温血动物，诸如哺乳类，像是灵长类，且较佳地是人类。非人类的灵长类也是个体。用语个体包括驯养动物，诸如猫、狗等，家畜(举例来说，牛、马、猪、绵羊、山羊等)以及实验动物(举例来说，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。
本发明进一步涉及一种血管炎的诊断标志物，其中所述生物标志物为带有826G＞C和/ 或1094G＞A和/或839C>A和/或2291C>G突变的MCM8基因，或所述突变为带有A276P突变和/或S365N和/或S280C突变和/或S764A突变的MCM8蛋白；或为在SEQ ID NO:2的 MCM8蛋白序列第272-277位存在的除A276P突变以外的其他MCM8蛋白单个突变或连锁突变，或其相应位点上的基因突变或连锁突变(在SEQ ID NO:1的MCM8基因序列第816- 831位存在的除826G＞C突变以外的其他MCM8基因单个突变或连锁突变)。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M. Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑 (1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
实施例
通过川崎病示例性地说明MCM8-cGAS-STING-I型干扰素信号通路对疾病的调节机制(实施例1-9)。
实施例1川崎病患者的I型干扰素水平异常升高
川崎病是一种儿童全身性血管炎，发病机制不明，目前普遍认为由感染因素诱导，因此，为了研究川崎病患者中是否存在感染等因素导致的细胞因子水平异常，发明人收集了42例川崎病人，30例非川崎发烧病人和25例健康对照的血液，通过Bio-Plex Pro公司37因子试剂盒，并按照说明书步骤检测血浆中的炎症因子指标。结果显示，除传统炎症因子外，I型干扰素IFN-α和IFN-α水平异常升高，且在疾病的不同时期(急性期、亚急性期、康复期)居高不下(图1的A图)。结果提示了I型干扰素在川崎病发展过程中起着至关重要的作用，可能成为潜在的疾病诊断、预防和/或治疗靶点。
实施例2川崎病患者的全外显子测序分析发现MCM8突变
川崎病在东亚人群高发，具有基因易感性，为了发掘其易感基因，探索易感机制，首先对130例川崎病患者的血样(来自广州市妇女儿童医疗中心，且上述采集过程已通过广州市妇女儿童医疗中心的临床研究伦理审查)进行全外显子测序，并进行GWAS分析(Genomewide association study，全基因组关联分析)，通过重点关注突变频率具有显著人群差异的基因及染色体稳定性相关的调控基因，结果发现染色质维稳基因、尤其是染色质维稳基因中的 MCM8基因的突变，是东亚人群特异的易感因素(图1的B图和图1的C图)。发明人检测到的两个MCM8的突变A276P、S365N(对应的基因突变位点信息为c.826G＞C和c.1094G ＞A，见图1的B图和C图)，分别位于rs61752028和rs28403619(见图1的D图)。上述突变位点为连锁突变，在不同物种间具有保守性，其两个突变频率在所收集的川崎病患者中富集高达28％以上，所述两个突变在东亚人群高达23％以上，而其在非东亚人群的突变频率仅为0.1％～3％(图1的D图和E图)。
此外，除了前述发现的A276P突变、S365N突变，发明人还发现了其他的川崎病相关的点突变，即S280C突变和S764A突变，进一步进行了克隆和细胞实验，步骤包括：采用293T细胞分别过表达200ng MCM8、以及各突变即MCM8(A276P)、MCM8(S280C)、MCM8 (S365N)，以及MCM8(S764A)，并在转染24小时后，用poly(dA:dT)刺激细胞0、12、 24h，收集RNA，Q-PCR检测IFN-β的mRNA水平。结果，以过表达MCM8的IFN-β水平 0h、12h、24h分别为0、100、250，而MCM8的A276P突变、S365N突变以及S764A突变，均导致IFN-β水平升高(在24h时高于300)，尤其S365N突变的升高最显著(在24h时为 1000，相对于MCM8过表达p＜0.001)，而S280C突变并未导致IFN-β水平升高(在24h时低于250)。由此可进一步认为，此前发现的MCM8的A276P突变、S365N突变均是影响MCM8调节I型干扰素功能、导致川崎病的突变因素，而S280C突变和S764A突变也是新发现的川崎病这样的全身性血管炎中的突变，可利用该两个突变在川崎病以及类似于川崎病的全身性血管炎疾病(例如系统性红斑狼疮)中来诊断或辅助诊断疾病。
实施例3MCM8敲低的受感染细胞产生了更多的I型干扰素
为了进一步明确MCM8的表达对I型干扰素产生的影响，进行本实施例实验。
通过在THP-1细胞系(一种人白血病细胞系，代表白细胞，白细胞是血细胞的一大类，是作为血管炎相关疾病，尤其是血液成分异常性血管炎研究的理想细胞模型)中用siRNA敲低MCM8，模拟机体中MCM8表达不足的现象。具体敲低方法如下：取50pmol的siRNA，加入25ul OPTI-MEM培养基；同时取2ul lipofectamine RNAi Max,加入25ul OPTI-MEM培养基；将二者充分混合后，室温静置10分钟，将转染复合物加入铺有1X106/ml THP-1细胞的24孔板中。在THP-1细胞中敲低MCM8后，发明人通过ELISA检测THP-1细胞上清中 IFN-β的释放。
由于川崎病病原不明，病毒和细菌均有可能是川崎病的诱因，发明人分别用SeV(MOI 1)、 poly(dA:dT)(1ug/ml)和LPS(200ng/ml)(下同)模拟病毒和细菌的刺激，收集上清，通过赛默飞公司IFN-β特异的ELISA(并按照相应的说明书操作)检测或用TRIZOL提取细胞 RNA，用诺唯赞反转录试剂盒和QPCR试剂盒按照说明书检测。RNA提取和QPCR检测的具体实验方法如下：RNA提取：适量的细胞加入1ml TRIZOL；剧烈震荡15s后，室温孵育5 分钟，以使细胞得到充分裂解；加入200ul氯仿，强力Votex 15s，室温孵育2-15分钟；12000Xg 离心细胞裂解液15分钟，转移水相；水相与500ul异丙醇混合均匀后，室温孵育5-10分钟；12000Xg离心混合液10分钟，弃上清；1ml乙醇浸没沉淀RNA，震荡洗涤；7500Xg离心洗涤液5分钟，弃掉多余的乙醇；自然风干后加入20ul DEPC水溶解RNA。
结果如图2，其中，A图表示在THP-1细胞中MCM8-siRNA敲低MCM8后，与对照组相比(对应结果图中的Ctrl siRNA)，IFN-β的释放极显著增加(P＜0.001)；B图表示在THP- 1细胞中敲低MCM8，随后分别用病毒SeV、poly(dA:dT)及细菌毒素LPS刺激细胞的结果，与对照组相比(对应结果图中的NC SiRNA)，IFN-β的表达显著增加(P＜0.01)；以上结果显示，MCM8敲低组与对照组相比，产生了更多的I型干扰素以应对这些刺激，具有显著 (P＜0.01)～极显著(P＜0.001)的统计意义(图2中，P＜0.01时，用“**”表示；p＜0.001 时，用“***”表示，下文同)，说明MCM8敲低能直接导致I型干扰素的自发释放。
实施例4MCM8引起I型干扰素表达变化的相关信号通路是cGAS-STING
为了探索自发释放的/增多的I型干扰素经过何种途径产生，发明人在THP-1细胞中通过sgRNA分别敲除了可能影响I型干扰素释放的不同的受体，包括cGAS、STING、RIG-I、IFI16。同样通过收集实施例3中所述的上清，并用IFN-β特异的ELISA试剂盒检测IFN-β的释放。结果如图2的C图所示(每个柱状图从左到右表示：ctrl siRNA空白对照组、MCM8 siRNA对照组、敲除相应受体的ctrl siRNA组、敲除相应受体的MCM8 siRNA组。其中，ctrl siRNA空白对照组、MCM8 siRNA对照组数据有所不同，是由于实验时经历的细胞培养时间、批次不同所致)，当cGAS或STING被敲除后，I型干扰素的自发释放被抑制，而其他受体 RIG-I、IFI16则未被抑制(以及反而与敲低MCM8所起的作用相反)，说明MCM8、cGAS、 STING是与产生I型干扰素相关的同一通路上的靶物质，而MCM8是影响该通路的上游且 cGAS、STING是影响该通路的下游。同样的，进一步采用SeV、poly(dA:dT)和LPS刺激上述细胞发现，应对刺激时，敲除cGAS或STING的情形下，由于MCM8敲低引起的I型干扰素的增加也被阻断。
实施例5MCM8表达降低导致胞浆中的线粒体DNA显著增加
由于cGAS-STING是胞浆中重要的DNA识别受体，因此实施例4的发现还提示MCM8敲低可能与胞浆DNA的产生有关。由此，为了探索胞浆中是否产生了DNA及其来源，发明人进一步通过转染MCM8特异性的siRNA，在THP-1细胞中敲低MCM8，并对细胞进行SeV 或poly(dA:dT)的刺激，发明人对刺激后的细胞进行核质分离(此处的细胞核质分离采用碧云天细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取试盒，并按照说明书操作，下文同)，提取胞浆DNA，并通qPCR检测胞浆DNA的来源。结果发现，胞浆DNA主要由线粒体DNA和少量核DNA组成，当MCM8敲低后，胞浆中的线粒体DNA显著增加(图3的A图，其中，D-loop表示线粒体DNA)。
为了进一步验证这一发现，发明人通过测序，将病人的PBMC(外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell)分为携带正常MCM8基因(A276，结果用MCM8 ref表示)和携带突变MCM8基因(P276，结果用MCM8 mut表示，如前所述，该突变使得MCM8的表达量降低)两组，两组PBMC均经过LPS、SeV或poly(dA：dT)刺激后，分别提取其胞浆DNA，并通过Q-PCR检测其DNA来源。结果发现，突变组川崎病人的胞浆中，线粒体DNA数量显著增加(图3的B图)。该结果再次证明了，MCM8敲低或者MCM8突变导致的MCM8表达水平降低，均会使得胞浆中的线粒体DNA(mtDNA)累积，从而激活cGAS-STING介导的I型干扰素通路。
实施例6MCM8功能缺陷通过增加胞浆mtDNA数量来激活cGAS-STING-I型干扰素信号通路
为了进一步验证MCM8-cGAS-STING通路的作用机制，发明人在THP-1细胞中敲低MCM8并对细胞进行SeV刺激，再用MTP复合孔抑制剂环胞素A(CsA)(2.5mM-5mM) 处理细胞抑制线粒体DNA的释放。结果发现，在敲低MCM8的情形下应用SeV刺激、不给与CsA时，IFN-β显著增加，而同样敲低MCM8的情形下应用SeV刺激同时给与CsA时，则IFN-β并未增加(图3的C图)，说明后者的MCM8对I型干扰素的功能调控作用受到显著抑制，也即，MCM8调控I型干扰素的功能受线粒体DNA数量的影响，当胞浆中线粒体 DNA的数量并未增加或未聚集时，I型干扰素的产生受抑制。类似的，当用EtBr处理去除细胞线粒体后，完全清除细胞内的线粒体DNA，方法为用EtBr处理THP-1细胞构建无线粒体的ρ0细胞，在正常THP-1或ρ0THP-1中敲低MCM8，随后用SeV刺激细胞，通过Q-PCR 检测IFNA和IFNB的表达，以及通过免疫印迹检测pIRF3(磷酸化活化的IRF3蛋白)的水平。结果显示，在无线粒体的细胞(deplete-mito)中，MCM8调控I型干扰素的功能也被阻断(图3的D图和E图)，其中，D图中，以4个条形柱为一组，从左到右表示ctrl siRNA空白对照组、MCM8 siRNA对照组、无线粒体的细胞的ctrl siRNA组、无线粒体的细胞的MCM8 siRNA组，E图中表明cGAS-STING信号通路的下游产物pIRF3蛋白的表达也被明显抑制，说明胞浆线粒体DNA的产生或聚集是cGAS-STING信号通路的上游靶物质。综上，MCM8 敲低通过促进胞浆mtDNA的聚集来起到增加I型干扰素表达的作用，反之，抑制或清除 mtDNA的药物则会阻断MCM8调控I型干扰素的功能，并且，敲低MCM8通过增加胞浆 mtDNA数量从而激活cGAS-STING-I型干扰素信号通路。
实施例7MCM8通过调节LC3的活化参与线粒体自噬
基于实施例6的发现，MCM8与胞浆mtDNA数量、cGAS-STING-I型干扰素信号通路的关系，而mtDNA数量与线粒体自噬相关，因此，进一步进行如下实验。MCM8敲低抑制线粒体自噬相关蛋白的实验：在敲低MCM8的THP-1细胞中，研究了与线粒体自噬相关的检测指标，其中，分别用LPS、SeV刺激细胞或不刺激细胞，免疫印迹检测线粒体LC3及其他线粒体蛋白TOM20、MFN2、PINK1、COXIV的表达。结果发现，相比对照组(Ctrl siRNA)， MCM8的敲低能够抑制线粒体LC3的活化,并增加线粒体蛋白(TOM20、MFN2、PINK1、 COXIV)的量(图4的A图)；而相对应的，在Hela细胞中过表达MCM8(Flag-MCM8)，分别用LPS、SeV刺激细胞或不刺激细胞，免疫印迹检测线粒体LC3及其他线粒体蛋白 (TOM20,MFN2,PINK1,COXIV)的表达，结果发现，相比对照组(EV)，过表达MCM8更明显地促进了LC3的活化，并因此抑制了并增加线粒体蛋白(TOM20、MFN2、PINK1、COXIV) 的量(图4的B图)。
为了更一步研究MCM8对线粒体自噬的影响，发明人在Hela细胞中，用siRNA敲低MCM8，并通过免疫荧光染色共染LC3和mitotracker(线粒体标记)，最后通过共聚焦免疫荧光显微镜观察LC3和mitotracker的共定位。其中，免疫荧光的具体方法如下：免疫荧光所用的荧光二抗gout anti-Mouse 488，gout anti-Mouse 594,gout anti-Mouse 633,goutanti-Rabbit 488, Gout anti-Rabbit 594,Gout anti-Rat 488,Gout anti-Rat 594，DAPI均购买于life technology公司。 Buffer配置：Blocking buffer为含0.3％TritonX100和5％山羊血清的PBS，抗体稀释液为0.3％Triton X100和1％BSA的PBS；待检测细胞准备好后，弃细胞上清，用PBS洗涤；弃上清， 4％PFA固定15分钟；弃上清，用PBS洗涤3次，每次5分钟；弃上清，Blocking Buffer封闭1小时；弃上清，将待检测蛋白的抗体用相应Buffer1:500稀释，4度孵育过夜；弃上清，用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入稀释好的荧光二抗(1:1000稀释)，室温孵育2小时； PBS洗涤三次，每次5分钟；弃上清，用含抗淬灭剂和DAPI的封片液封片，备用。结果见图4的C图，图中显示了，在对照组中，LC3与线粒体存在显著的共定位信号，而当MCM8 被敲低时(图示中为MCM8 siRNA)，LC3与线粒体的共定位信号显著减少，因此，说明了 MCM8敲低能够显著抑制LC3与mitotracker的共定位。
此外，在THP-1细胞中敲低MCM8后，通过免疫电镜检测线粒体自噬的数目，结果发现，MCM8敲低的细胞当中，线粒体自噬体形成的结构明显减少(见图4的D图),同时，根据D图免疫电镜的结果进行进一步定量的统计分析结果也表明，敲低MCM8后，THP-1细胞内的线粒体自噬数目显著减少(图4的E图)，说明，免疫电镜更直观地显示了，敲低MCM8 后，THP-1细胞内的线粒体自噬体形成的数目显著减少(图4D和4E)。
进一步地，在THP-1细胞中，敲低MCM8，并分别用SeV和LPS刺激细胞或不刺激细胞，在线粒体自噬体形成的抑制剂Mdivi处理或不处理的情况下，提取胞浆DNA，并通过Q- PCR检测胞浆中线粒体DNA的含量以及IFNα和IFNβ的表达。结果显示，MCM8敲低的细胞表现出的mtDNA的聚集，与线粒体自噬体形成的抑制剂Mdivi处理组中的对照组表现相类似(图4F)，MCM8敲低的细胞表现出IFNα和IFNβ的表达水平升高，与线粒体自噬体形成的抑制剂Mdivi处理组的对照组表现相类似(图4G)。说明MCM8敲低抑制了线粒体自噬体的形成，从而影响其调控I型干扰素的功能。
上述结果提示，MCM8的低表达会导致线粒体自噬体的形成受到抑制，继而导致抑制损伤线粒体的及时清除，从而造成更多损伤线粒体DNA在胞浆聚集。结合前述实施例，可以证明，MCM8的低表达存在与LC3线粒体结合减少、线粒体自噬体形成减少导致线粒体DNA的聚集，以上激活了cGAS-STING通路、促使I型干扰素表达增加，从而促进诸如川崎病等多种疾病的发生发展。
实施例8存在LIR motif的MCM8能够直接与LC3结合
直接结合LC3的蛋白一般都具备LIR motif，发明人在网站预测MCM8是否具备LIRmotif时，发现MCM8272-277位点之间的序列为LIR motif。根据MCM8的功能结构域，发明人构建了MCM8不同截短形式的截短突变，检测及其与LC3的结合结果，结果发现：含有LIRmotif序列的各种MCM8(包括全长的MCM8、截短的MCM8)均能够和LC3结合，而去除LIR motif的MCM8则丧失了与LC3的结合功能(图5的A图，其中，FL代表全长 MCM8蛋白；dMCM代表去除MCM但保留LIR motif序列的MCM8蛋白；dLIR代表去除 LIR motif序列的MCM8蛋白；dN代表去除MCM的N端序列但保留LIR motif序列的MCM8 蛋白；LIR motif序列指RSFTAL)。进一步的质谱实验也证实了，MCM8能够与LC3直接结合。
另外，进一步比较了不同MCM家族的成员，发现只有MCM8和MCM9具备类似LIRmotif，而只有MCM8拥有更经典的LIR motif(图5的B图)。通过3D结构预测，也模拟出了MCM8LIR motif与LC3的结合(如图5的C图和D图所示)。更有趣的是，发明人在川崎病人中发现的MCM8点突变P276即位于LIR motif上，突变后(A276P)，MCM8与LC3 的结合能力大大降低(图5的E图，IP Flag组中的α-LC3条带消失)。
进一步地，提取携带正常A276位点和突变P276位点的人的PBMC，并分别LPS、SeV、poly(dA:dT)刺激细胞或不刺激细胞，提取胞浆DNA，并通过Q-PCR的方式，检测胞浆线粒体DNA含量。结果发现，当对川崎病患者的PBMC进行LPS、SeV或poly(dA：dT)的刺激时，MCM8点突变P276存在更多胞浆线粒体DNA的聚集(图5的F图)。
综上结果均表明，LIR motif(尤其是272-277位的氨基酸序列为RSFTAL的片段)对于线粒体自噬体的形成、降低胞浆线粒体DNA的聚集至关重要。因此，以LIR motif或其点突变为靶点的技术手段，为线粒体自噬相关的疾病(例如心血管疾病、神经系统病变等)以及前述已证明的线粒体自噬形成障碍的下游通路cGAS-STING-I型干扰素异常激活导致的疾病 (包括炎症性疾病、自身免疫性疾病、癌症、衰老相关疾病)提供了诊断、预防和/或治疗方面的可选依据。
实施例9MCM8敲除的动物模型中I型干扰素水平、心脏血管损伤及抗IFNAR抗体效果验证
为了进一步在生理层面确认MCM8和I型干扰素在川崎病发生发展过程中的影响。发明人通过南京模式生物，采用CRISPR/cas9的技术构建MCM8敲除小鼠，并通过腹腔注射LCWE (Lactobacillus casei cell wall extract,干酪乳杆菌细胞壁成分)构建小鼠川崎模型。在建模5 天(急性期)和14天(亚急性期)时，采用Biolegend公司的小鼠13因子炎症CBA试剂盒，并按照说明书操作，检测小鼠血清中的炎症因子。结果发现，急性期时，与对照组相比，干扰素β(代表I型干扰素)、γ及炎症因子TNFα、MCP-1在MCM8敲除组中的表达水平均显著升高；亚急性期时，干扰素β(代表I型干扰素)、γ及炎症因子TNFα、MCP-1在MCM8 敲除组中的表达水平也均升高，但只有干扰素β、MCP-1的升高与对照组相比具有显著差异(图6的A图)。因此表明，MCM8敲除小鼠在川崎病模型中的急性期和亚急性期均呈现出 I型干扰素的表达水平显著升高，再次证明MCM8表达降低或缺失等缺陷，是导致I型干扰素产生、疾病发生或发展的关键因素。
同时，在建模14天时，发明人对小鼠用PBS和4％的PFA进行心脏灌注(冲掉血细胞)，并对小鼠心脏进行蜡块包埋和切片，以及苏木精和伊红(H&E)染色(或简称HE染色)。HE染色的具体方法如下：取动物组织固定于4％多聚甲醛(PFA)固定24h，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15min脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。苏木素室温染色6min，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3s，置于自来水中，流水返蓝5min。伊红染色3min，依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片并镜检。结果：HE染色显示MCM8敲除的小鼠心脏存在更严重的免疫细胞浸润(图6的B图)，提示了更严重的血管炎症和血管损伤。此外，重新取LCWE 诱导的小鼠川崎病模型，对模型小鼠用抗IFNAR抗体(Leinco technologies公司，货号I-401，一种干扰素α受体抗体)治疗，取建模14天的小鼠心脏，再次重复“PBS和4％PFA灌洗后包埋石蜡切片，通过HE染色观察小鼠的血管炎症”的步骤，结果发现，HE染色显示经过IFNAR 抗体治疗，WT和MCM8敲除的小鼠血管炎显著减轻，免疫细胞浸润情况减轻，接近未造模组(图6的C图)，而将图6的B图和C图进行临床评分统计定量检测，结果也显示，经过 anti-IFNAR处理的MCM8敲除小鼠的心脏血管炎显著好转(图6的D图)。因此，说明通过影响MCM8相关通路上的靶物质，例如给予anti-IFNAR抗体，来调控cGAS-STING-I型干扰素通路，是可行的血管炎等疾病防治方案。
进一步地，通过IHC染色检测心脏组织中IFN-α的表达情况，IHC染色的具体方法如下： 58度烤片一小时，依次经过二甲苯I，二甲苯II，100％、90％、80％、70％的乙醇，蒸馏水，蒸馏水脱蜡。随后，将切片放入抗原修复液中，微波炉3min高火煮沸，随后15分钟中小火维持进行抗原修复；玻片放入3％双氧水浸泡20分钟；PBS洗3次；加入非免疫山羊血清，室温孵育半小时；将玻片放入湿盒，加入一抗，4度过夜；第二天将玻片取出复温，随后用 PBS洗3遍。加二抗室温孵育1小时，PBS洗三次；加DAB显色剂，显微镜下观察显色，适时终止；加苏木素染色2分钟，蒸馏水冲洗，反蓝液反蓝5分钟，自来水冲洗5-10分钟；依次浸入70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，中性树脂封片。结果显示，MCM8 敲除后，从免疫组化染色图(图6的E图)以及定量分析图(图6的F图)，均可见小鼠的 IFN-α显著上调，与前述其他实施例的结果相吻合。
实施例10MCM8缺失导致肺血管炎
采用CRISPR/cas9技术构建MCM8敲除的小鼠(包括MCM8+/-杂合小鼠和MCM8-/-纯合小鼠)，同时取WT野生型小鼠，小鼠在SPF(无菌)饲养环境下，正常饲料喂养至32周， WT和MCM8敲除的小鼠各随机取4只处死小鼠，取其肺脏，进行石蜡包埋和HE染色。结果：图7的A图为MCM8-/-小鼠的肺部HE病理全景和病理部位放大，可明显观察到，血管周围有着色较深的免疫细胞的浸润。图7的B图为WT小鼠的肺部HE病理全景和局部放大，可观察到WT小鼠结构清晰完整，较为健康，没有炎症浸润。因此表明，MCM8敲除小鼠，尤其是MCM8-/-小鼠，在年老时会产生自发的肺部血管炎，除了说明MCM8是肺血管炎的靶点，还提示可用此方式制备肺血管炎模型。
总之，以上实施例1-9以川崎病为例，阐明了MCM8基因缺陷导致的MCM8表达水平降低，影响了MCM8与线粒体LC3的结合进而影响了线粒体自噬体形成，导致胞浆中的线粒体DNA聚集，从而激活了cGAS-STING-I型干扰素信号通路激活，使得I型干扰素表达异常增加，促进了包括川崎病、心脏血管炎、血液血管炎等在内的血管炎疾病的发生、发展，实施例10还进一步证明了MCM8基因缺陷导致了肺部血管炎的发生、发展，因此可认为 MCM8的缺陷与全身的多部位血管炎相关，MCM8可作为血管炎的诊疗靶点开发应用。
以下实施例11-14通过更多的疾病模型，进一步阐明MCM8基因表达降低或缺失，还会引发的其他线粒体自噬功能障碍相关疾病、cGAS-STING-I型干扰素信号通路异常激活相关疾病。
实施例11MCM8缺失加重肺部炎症
采用CRISPR/cas9技术构建MCM8敲除的小鼠(包括MCM8+/-杂合小鼠和MCM8-/-纯合小鼠)。接下来，用8周龄小鼠构建新冠病毒感染模型，步骤包括：首先，通过滴鼻的方式，对小鼠进行过表达人的ACE2的腺病毒感染。滴鼻5天后，对小鼠进行新冠病毒(COVID- 19，病毒由广州医科大学提供)侵染，侵染4天后，处死小鼠，取鼠小鼠肺脏进行拍照固定和HE染色(图8的A图为小鼠新冠感染模型的造模方法图示)。
结果如下：从小鼠的肺脏图，图8的B图，可见，新冠模型WT和MCM8敲除小鼠的肺脏均存在较严重的损伤，证明造模成功。单从肺脏照片，不足以判断损伤的严重程度，因此更进一步对小鼠肺脏和心脏进行包埋和HE染色。
从小鼠的肺脏HE病理切片全景，图8的C图，可见相较于WT和MCM8+/-小鼠，MCM8-/-小鼠的肺HE病理切片表现为更严重的肺损伤和结构破坏。图8的D图，是对损伤部位进行放大，观察到，相较于WT和MCM8+/-小鼠，MCM8-/-小鼠存在更严重的水肿和更多的细胞坏死碎片。图8的E图是根据HE病理切片对WT，MCM8+/-小鼠和MCM8-/-小鼠的水肿和细胞坏死情况进行的评分统计。从小鼠的心脏HE病理切片全景和放大图，图8的F和G 图，可见相较于WT和MCM8+/-小鼠，MCM8-/-小鼠的心脏HE病理切片表现出明显的炎症浸润，说明MCM8-/-小鼠的肺炎为重症肺炎，已明显累及心脏。
因此，说明MCM8基因缺陷会加重肺炎，尤其是重症肺炎，从而MCM8也可作为肺炎或重症肺炎疾病的诊疗靶点和动物模型构建的靶点。
实施例12MCM8缺失显著增加肾损伤和SLE的严重程度
采用CRISPR/cas9技术构建MCM8敲除的小鼠，并进一步通过腹腔注射0.5mg姥鲛烷(Pristane)构建小鼠狼疮肾炎模型，检测小鼠的生存时间、自身抗体浓度、HE病理切片。结果发现，与野生型小鼠相比，MCM8缺失小鼠明显更容易在建模过程因严重的肾损伤死亡(图9的a图)，同时，腹腔注射姥鲛烷2个月后检测小鼠血清中抗dsDNA抗体的浓度，也发现，MCM8缺失小鼠血清中抗自身ds-DNA的抗体增加(图9的b图)；此外，注射姥鲛烷4个月后，通过HE病理切片显示，除了肾脏会看到严重损伤以外，肺脏也同样观察到损伤，说明 SLE疾病模型中已严重累及到肺脏，其中，图9的c图为小鼠肺脏的HE病理切片及病变部位放大，图中可见相比WT小鼠，MCM8敲除的小鼠产生了更严重的类似间质性肺炎的症状，肺部结构严重破坏；图9的d图则可见，MCM8敲除的小鼠出现了凝固型坏死或组织自溶构象，部分肾小管细胞核有减少或消失，局部病灶出现出血、蛋白管型。以上结果说明了，除了实施例11的肺炎以外，MCM8敲除还会导致肾炎和红斑狼疮(SLE)的表现更明显和严重，从而MCM8也可作为肾炎和系统性红斑狼疮疾病的诊疗靶点和动物模型构建的靶点，其中，如本文背景技术中所提及，系统性红斑狼疮的病理基础也属于一种全身性的血管炎，因此，此处再次证明MCM8基因或蛋白缺陷是多种血管炎疾病的标志。
实施例13MCM8缺失促进脂肪性肝炎
采用CRISPR/cas9技术构建MCM8敲除的小鼠，取32周的老龄WT和MCM8-/-敲除小鼠的肝脏进行固定，石蜡包埋切片并通过HE染色检测病理情况。结果发现，与对照组相比，MCM8-/-肝脏存在明显的空泡状脂肪化，并存在炎症细胞浸润(图10)。从而表明，老龄的MCM8敲除小鼠能够自发产生脂肪肝表型，MCM8也可作为脂肪肝的诊疗靶点和动物模型构建的靶点。
实施例14MCM8敲除造成小鼠眼角膜变白
采用CRISPR/cas9技术构建MCM8敲除的小鼠，观察32周的老龄小鼠眼睛。结果发现， MCM8-/-敲除小鼠的眼睛角膜变白(图11的A图、B图和C图)、部分小眼症和无眼，其中无眼见图11的D图)。从而MCM8也可作为白内障的诊疗靶点和动物模型构建的靶点。
实施例15NO诱导TRIM21与MCM8结合、使之泛素化后出核行使功能
MCM8作为染色质维稳基因，主要定位于细胞核，而前述研究的机理均为在细胞外的信号通路，因此为了在上述基础上更加深入研究MCM8如何发挥功能的机理，包括是否需要出核发挥功能、如何调控前述的信号通路及其靶物质(包括与线粒体LC3、启动线粒体自噬体形成、清除胞浆受损线粒体DNA、cGas-STING-I型信号通路)等，进行如下实验。
通过出核抑制剂莱普霉素B(leptomycin B)处理细胞，抑制蛋白出核穿梭，并通过核质分离，分别检测细胞浆(cyto)和细胞核(nuc)中的MCM8的表达。结果显示，与对照组相比 (Vehicle),MCM8在SeV和LPS刺激时，部分出核(检测到MCM8在细胞浆中表达增加)，而加入莱普霉素B后，MCM8出核明显受到抑制(MCM8在胞浆中表达没有增加)，见图12 的a图。同时，通过免疫共沉淀法检测胞浆和细胞核中MCM8的泛素化修饰(HA-Ubiqutin)，结果发现，与细胞核内信号相比，在LPS和poly(dA:dT)刺激时，细胞浆中存在明显更多的泛素化修饰(图12的b图)。而当加入泛素连接酶抑制剂TAK-243抑制泛素化时，MCM8的出核受到明显抑制，体现在：尚未进行TAK处理时，核质分离后，在LPS和poly(dA:dT)刺激时，细胞质中的MCM8增加；而TAK处理后，细胞质中的MCM8不能在刺激时增加，见图 12的c图。可见，泛素化对于MCM8的出核至关重要。
结合进一步的在HeLa细胞中转染Flag-TRIM21和HA-MCM8，并进行免疫共沉淀分析，结果显示，MCM8能够结合E3泛素连接酶TRIM21，并且在有LPS或poly(dA:dT)刺激时，结合增加(图12的d图)。
此外，当使用NO清除剂1400W处理细胞后，发现TRIM21介导的MCM8的泛素化被显著抑制(图12的e图)。同时，在LPS和poly(dA:dT)刺激时，MCM8的出核也被1400W 所抑制(图12的f图)。
综上，在压力情况下，细胞产生NO，NO促进TRIM21转位入核，入核后的TRIM21介导MCM8的泛素化，并使之出核。MCM8出核后，结合到损伤线粒体，并募集LC3，通过线粒体自噬清除损伤线粒体。一旦MCM8不足或突变，线粒体自噬受损，不能清除损伤线粒体，线粒体DNA通过BAX/BAK或VDAC1孔释放到细胞浆，细胞浆中的mtDNA被cGAS识别，通过cGAS-STING信号通路激活I型干扰素信号通路，释放I型干扰素，造成血管损伤和血管炎(图12的g图)。
因此，实施例1-15的结果综合提示了，当线粒体损伤产生氧化压力产生NO信号时，NO 信号能够促进TRIM21泛素化MCM8，从而使MCM8出核发挥前文已验证的其他信号通路功能、抑制前述诸如川崎病或系统性红斑狼疮或心血管炎或肺血管炎或血液成分异常血管炎等血管炎疾病、肺炎或重症肺炎、肾炎、脂肪肝、眼睛损伤等多疾病的产生。
最后，由于MCM8的表达降低(被敲低或沉默)使得线粒体自噬体形成障碍而胞浆线粒体DNA增多、cGAS-STING信号通路激活I型干扰素信号通路异常激活，因此，通过制备MCM8的mRNA、蛋白或它们的功能片段产品，包括全长或截短的与本发明发现的信号通路上的靶物质能够相互作用、从而外源性地MCM8基因缺陷的mRNA、蛋白或它们的功能片段，是能够防治本发明疾病的有效手段。因此，提供实施例16-17，以示例性地展示有效的 MCM8靶向的疾病防治产品。
实施例16MCM8的mRNA产品的制备
1.合成全长的MCM8的mRNA(SEQ ID NO:1)，或MCM8的LIR motif功能片段(SEQ IDNO:3)或包含LIR motif功能片段的其他MCM8基因的截短序列(例如SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6，或，其他包含LIR motif功能片段的MCM8基因的任意5’端或3’端截短序列)；
所述mRNA可选是通过使用本领域常规市售试剂盒体外转录合成或利用本领域常用的质粒、慢病毒、腺病毒、大肠杆菌类载体表达，其中还可进一步包括纯化步骤，所纯化方法包括氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化或高效液相色谱纯化中的一种或其组合，以获得纯化后的mRNA；
2.将目的mRNA与附加剂(可选包括稳定剂、pH调节剂、缓冲液、脂类聚合物、溶剂等，溶剂选自DMSO、乙醇、聚乙二醇、水等)一起结合本领域的常规操作制备得到外源递送该mRNA序列的产品，可选例如脂质体或纳米脂质体等。
实施例17MCM8的多肽或蛋白产品的制备
1.将常规方式合成或纯化获得MCM8的全长蛋白(SEQ ID NO:2)或LIR motif功能片段 (SEQ ID NO:4)或包含LIR motif功能片段的其他MCM8蛋白的截短序列(例如SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8，或，其他包含LIR motif功能片段的MCM8蛋白的任意N端或C端截短序列)；
2.采用本领域常规的方法制备外源递送上述多肽或蛋白的产品，例如添加药学上可接受的辅料制备成细粉或冻干粉、微乳剂、眼药水或眼膏剂、溶液剂(例如口服溶液剂、注射剂)、脂质体、透皮吸收制剂(软膏剂或贴剂或凝胶剂)、滴鼻剂、肺部的吸入制剂(如粉雾剂)、缓控释制剂(微球注射剂、埋植剂)等。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> MCM8-cGAS-STING-I型干扰素信号通路作为疾病靶点的用途
<130>
<150> CN202010847559.3
<151> 2020-08-21
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2523
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
augaauggag aguauagagg cagaggauuu ggacgaggaa gauuucaaag cuggaaaagg 60
ggaagaggug gugggaacuu cucaggaaaa uggagagaaa gagaacacag accugaucug 120
aguaaaacca caggaaaacg uacuucugaa caaaccccac aguuuuugcu uucaacaaag 180
accccacagu caaugcaguc aacauuggau cgauucauac cauauaaagg cuggaagcuu 240
uauuucucug aaguuuacag cgauagcucu ccuuugauug agaagauuca agcauuugaa 300
aaauuuuuca caaggcauau ugauuuguau gacaaggaug aaauagaaag aaagggaagu 360
auuuugguag auuuuaaaga acugacagaa gguggugaag uaacuaacuu gauaccagau 420
auagcaacug aacuaagaga ugcaccugag aaaaccuugg cuugcauggg uuuggcaaua 480
caucaggugu uaacuaagga ccuugaaagg caugcagcug aguuacaagc ccaggaagga 540
uugucuaaug auggagaaac aaugguaaau gugccacaua uucaugcaag gguguacaac 600
uaugagccuu ugacacagcu caagaauguc agagcaaauu acuauggaaa auacauugcu 660
cuaagaggga cagugguucg ugucaguaau auaaagccuc uuugcaccaa gauggcuuuu 720
cuuugugcug cauguggaga aauucagagc uuuccucuuc cagauggaaa auacagucuu 780
cccacaaagu guccugugcc ugugugucga ggcaggucau uuacugcucu ccgcagcucu 840
ccucucacag uuacgaugga cuggcaguca aucaaaaucc aggaauugau gucugaugau 900
cagagagaag caggucggau uccacgaaca auagaaugug agcuuguuca ugaucuugug 960
gauagcugug ucccgggaga cacagugacu auuacuggaa uugucaaagu cucaaaugcg 1020
gaagaagguu cucgaaauaa gaaugacaag uguauguucc uuuuguauau ugaagcaaau 1080
ucuauuagua auagcaaagg acagaaaaca aagaguucug aggaugggug uaagcaugga 1140
auguugaugg aguucucacu uaaagaccuu uaugccaucc aagagauuca agcugaagaa 1200
aaccuguuua aacucauugu caacucgcuu ugcccuguca uuuuugguca ugaacuuguu 1260
aaagcagguu uggcauuagc acucuuugga ggaagccaga aauacgcaga ugacaaaaac 1320
agaauuccaa uucggggaga cccccacauc cuuguuguug gagauccagg ccuaggaaaa 1380
agucaaaugc uacaggcagc gugcaauguu gccccacgug gcguguaugu uugugguaac 1440
accacgacca ccucuggucu gacgguaacu cuuucaaaag auaguuccuc uggagauuuu 1500
gcuuuggaag cuggugcccu gguacuuggu gaucaaggua uuuguggaau cgaugaauuu 1560
gauaagaugg ggaaucaaca ucaagccuug uuggaagcca uggagcagca aaguauuagu 1620
cuugcuaagg cugguguggu uuguagccuu ccugcaagaa cuuccauuau ugcugcugca 1680
aauccaguug gaggacauua caauaaagcc aaaacaguuu cugagaauuu aaaaaugggg 1740
agugcacuac uauccagauu ugauuugguc uuuauccugu uagauacucc aaaugagcau 1800
caugaucacu uacucucuga acaugugauu gcaauaagag cuggaaagca gagaaccauu 1860
agcagugcca caguagcucg uaugaauagu caagauucaa auacuuccgu acuugaagua 1920
guuucugaga agccauuauc agaaagacua aaggugguuc cuggagaaac aauagauccc 1980
auuccccacc agcuauugag aaaguacauu ggcuaugcuc ggcaguaugu guacccaagg 2040
cuauccacag aagcugcucg aguucuucaa gauuuuuacc uugagcuccg gaaacagagc 2100
cagagguuaa auagcucacc aaucacuacc aggcagcugg aaucuuugau ucgucugaca 2160
gaggcacgag caagguugga auugagagag gaagcaacca aagaagacgc ugaggauaua 2220
guggaaauua ugaaauauag caugcuagga acuuacucug augaauuugg gaaccuagau 2280
uuugagcgau cccagcaugg uucuggaaug agcaacaggu caacagcgaa aagauuuauu 2340
ucugcucuca acaacguugc ugaaagaacu uauaauaaua uauuucaauu ucaucaacuu 2400
cggcagauug ccaaagaacu aaacauucag guugcugauu uugaaaauuu uauuggauca 2460
cuaaaugacc aggguuaccu cuugaaaaaa ggcccaaaag uuuaccagcu ucaaacuaug 2520
uaa 2523
<210> 2
<211> 840
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asn Gly Glu Tyr Arg Gly Arg Gly Phe Gly Arg Gly Arg Phe Gln
1 5 10 15
Ser Trp Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Asn Phe Ser Gly Lys Trp Arg
20 25 30
Glu Arg Glu His Arg Pro Asp Leu Ser Lys Thr Thr Gly Lys Arg Thr
35 40 45
Ser Glu Gln Thr Pro Gln Phe Leu Leu Ser Thr Lys Thr Pro Gln Ser
50 55 60
Met Gln Ser Thr Leu Asp Arg Phe Ile Pro Tyr Lys Gly Trp Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Phe Ser Glu Val Tyr Ser Asp Ser Ser Pro Leu Ile Glu Lys Ile
85 90 95
Gln Ala Phe Glu Lys Phe Phe Thr Arg His Ile Asp Leu Tyr Asp Lys
100 105 110
Asp Glu Ile Glu Arg Lys Gly Ser Ile Leu Val Asp Phe Lys Glu Leu
115 120 125
Thr Glu Gly Gly Glu Val Thr Asn Leu Ile Pro Asp Ile Ala Thr Glu
130 135 140
Leu Arg Asp Ala Pro Glu Lys Thr Leu Ala Cys Met Gly Leu Ala Ile
145 150 155 160
His Gln Val Leu Thr Lys Asp Leu Glu Arg His Ala Ala Glu Leu Gln
165 170 175
Ala Gln Glu Gly Leu Ser Asn Asp Gly Glu Thr Met Val Asn Val Pro
180 185 190
His Ile His Ala Arg Val Tyr Asn Tyr Glu Pro Leu Thr Gln Leu Lys
195 200 205
Asn Val Arg Ala Asn Tyr Tyr Gly Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Gly Thr
210 215 220
Val Val Arg Val Ser Asn Ile Lys Pro Leu Cys Thr Lys Met Ala Phe
225 230 235 240
Leu Cys Ala Ala Cys Gly Glu Ile Gln Ser Phe Pro Leu Pro Asp Gly
245 250 255
Lys Tyr Ser Leu Pro Thr Lys Cys Pro Val Pro Val Cys Arg Gly Arg
260 265 270
Ser Phe Thr Ala Leu Arg Ser Ser Pro Leu Thr Val Thr Met Asp Trp
275 280 285
Gln Ser Ile Lys Ile Gln Glu Leu Met Ser Asp Asp Gln Arg Glu Ala
290 295 300
Gly Arg Ile Pro Arg Thr Ile Glu Cys Glu Leu Val His Asp Leu Val
305 310 315 320
Asp Ser Cys Val Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Gly Ile Val Lys
325 330 335
Val Ser Asn Ala Glu Glu Gly Ser Arg Asn Lys Asn Asp Lys Cys Met
340 345 350
Phe Leu Leu Tyr Ile Glu Ala Asn Ser Ile Ser Asn Ser Lys Gly Gln
355 360 365
Lys Thr Lys Ser Ser Glu Asp Gly Cys Lys His Gly Met Leu Met Glu
370 375 380
Phe Ser Leu Lys Asp Leu Tyr Ala Ile Gln Glu Ile Gln Ala Glu Glu
385 390 395 400
Asn Leu Phe Lys Leu Ile Val Asn Ser Leu Cys Pro Val Ile Phe Gly
405 410 415
His Glu Leu Val Lys Ala Gly Leu Ala Leu Ala Leu Phe Gly Gly Ser
420 425 430
Gln Lys Tyr Ala Asp Asp Lys Asn Arg Ile Pro Ile Arg Gly Asp Pro
435 440 445
His Ile Leu Val Val Gly Asp Pro Gly Leu Gly Lys Ser Gln Met Leu
450 455 460
Gln Ala Ala Cys Asn Val Ala Pro Arg Gly Val Tyr Val Cys Gly Asn
465 470 475 480
Thr Thr Thr Thr Ser Gly Leu Thr Val Thr Leu Ser Lys Asp Ser Ser
485 490 495
Ser Gly Asp Phe Ala Leu Glu Ala Gly Ala Leu Val Leu Gly Asp Gln
500 505 510
Gly Ile Cys Gly Ile Asp Glu Phe Asp Lys Met Gly Asn Gln His Gln
515 520 525
Ala Leu Leu Glu Ala Met Glu Gln Gln Ser Ile Ser Leu Ala Lys Ala
530 535 540
Gly Val Val Cys Ser Leu Pro Ala Arg Thr Ser Ile Ile Ala Ala Ala
545 550 555 560
Asn Pro Val Gly Gly His Tyr Asn Lys Ala Lys Thr Val Ser Glu Asn
565 570 575
Leu Lys Met Gly Ser Ala Leu Leu Ser Arg Phe Asp Leu Val Phe Ile
580 585 590
Leu Leu Asp Thr Pro Asn Glu His His Asp His Leu Leu Ser Glu His
595 600 605
Val Ile Ala Ile Arg Ala Gly Lys Gln Arg Thr Ile Ser Ser Ala Thr
610 615 620
Val Ala Arg Met Asn Ser Gln Asp Ser Asn Thr Ser Val Leu Glu Val
625 630 635 640
Val Ser Glu Lys Pro Leu Ser Glu Arg Leu Lys Val Val Pro Gly Glu
645 650 655
Thr Ile Asp Pro Ile Pro His Gln Leu Leu Arg Lys Tyr Ile Gly Tyr
660 665 670
Ala Arg Gln Tyr Val Tyr Pro Arg Leu Ser Thr Glu Ala Ala Arg Val
675 680 685
Leu Gln Asp Phe Tyr Leu Glu Leu Arg Lys Gln Ser Gln Arg Leu Asn
690 695 700
Ser Ser Pro Ile Thr Thr Arg Gln Leu Glu Ser Leu Ile Arg Leu Thr
705 710 715 720
Glu Ala Arg Ala Arg Leu Glu Leu Arg Glu Glu Ala Thr Lys Glu Asp
725 730 735
Ala Glu Asp Ile Val Glu Ile Met Lys Tyr Ser Met Leu Gly Thr Tyr
740 745 750
Ser Asp Glu Phe Gly Asn Leu Asp Phe Glu Arg Ser Gln His Gly Ser
755 760 765
Gly Met Ser Asn Arg Ser Thr Ala Lys Arg Phe Ile Ser Ala Leu Asn
770 775 780
Asn Val Ala Glu Arg Thr Tyr Asn Asn Ile Phe Gln Phe His Gln Leu
785 790 795 800
Arg Gln Ile Ala Lys Glu Leu Asn Ile Gln Val Ala Asp Phe Glu Asn
805 810 815
Phe Ile Gly Ser Leu Asn Asp Gln Gly Tyr Leu Leu Lys Lys Gly Pro
820 825 830
Lys Val Tyr Gln Leu Gln Thr Met
835 840
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggucauuua cugcucuc 18
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Arg Ser Phe Thr Ala Leu
1 5
<210> 5
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgaggcaggu cauuuacugc ucuccgcagc ucuccucuca caguuacgau ggacuggcag 60
ucaaucaaaa uccaggaauu gaugucugau gaucagagag aagcaggucg gauuccacga 120
acaauagaau gugagcuugu ucaugaucuu guggauagcu gugucccggg agacacagug 180
acuauuacug gaauugucaa agucucaaau gcggaagaag guucucgaaa uaagaaugac 240
aaguguaugu uccuuuugua uauugaagca aauucuauua guaauagcaa a 291
<210> 6
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
uaugagccuu ugacacagcu caagaauguc agagcaaauu acuauggaaa auacauugcu 60
cuaagaggga cagugguucg ugucaguaau auaaagccuc uuugcaccaa gauggcuuuu 120
cuuugugcug cauguggaga aauucagagc uuuccucuuc cagauggaaa auacagucuu 180
cccacaaagu guccugugcc ugugugucga ggcaggucau uuacugcucu ccgcagcucu 240
ccucucacag uuacgaugga cuggcaguca aucaaaaucc aggaauugau gucugaugau 300
cagagagaag caggucggau uccacgaaca auagaaugug agcuuguuca ugaucuugug 360
gauagcugug ucccgggaga cacagugacu auuacuggaa uugucaaagu cucaaaugcg 420
gaagaagguu cucgaaauaa gaaugacaag uguauguucc uuuuguauau ugaagcaaau 480
ucuauuagua auagcaaagg acagaaaaca aagaguucug aggaugggug uaagcaugga 540
auguugaugg aguucuca 558
<210> 7
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Arg Gly Arg Ser Phe Thr Ala Leu Arg Ser Ser Pro Leu Thr Val Thr
1 5 10 15
Met Asp Trp Gln Ser Ile Lys Ile Gln Glu Leu Met Ser Asp Asp Gln
20 25 30
Arg Glu Ala Gly Arg Ile Pro Arg Thr Ile Glu Cys Glu Leu Val His
35 40 45
Asp Leu Val Asp Ser Cys Val Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Gly
50 55 60
Ile Val Lys Val Ser Asn Ala Glu Glu Gly Ser Arg Asn Lys Asn Asp
65 70 75 80
Lys Cys Met Phe Leu Leu Tyr Ile Glu Ala Asn Ser Ile Ser Asn Ser
85 90 95
Lys
<210> 8
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Tyr Glu Pro Leu Thr Gln Leu Lys Asn Val Arg Ala Asn Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Gly Thr Val Val Arg Val Ser Asn Ile Lys
20 25 30
Pro Leu Cys Thr Lys Met Ala Phe Leu Cys Ala Ala Cys Gly Glu Ile
35 40 45
Gln Ser Phe Pro Leu Pro Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Pro Thr Lys Cys
50 55 60
Pro Val Pro Val Cys Arg Gly Arg Ser Phe Thr Ala Leu Arg Ser Ser
65 70 75 80
Pro Leu Thr Val Thr Met Asp Trp Gln Ser Ile Lys Ile Gln Glu Leu
85 90 95
Met Ser Asp Asp Gln Arg Glu Ala Gly Arg Ile Pro Arg Thr Ile Glu
100 105 110
Cys Glu Leu Val His Asp Leu Val Asp Ser Cys Val Pro Gly Asp Thr
115 120 125
Val Thr Ile Thr Gly Ile Val Lys Val Ser Asn Ala Glu Glu Gly Ser
130 135 140
Arg Asn Lys Asn Asp Lys Cys Met Phe Leu Leu Tyr Ile Glu Ala Asn
145 150 155 160
Ser Ile Ser Asn Ser Lys Gly Gln Lys Thr Lys Ser Ser Glu Asp Gly
165 170 175
Cys Lys His Gly Met Leu Met Glu Phe Ser
180 185

Claims (8)

1.检测MCM8的基因表达的试剂在制备诊断疾病的产品中的用途，其特征在于：
所述疾病为血管炎；
所述血管炎选自川崎病、系统性红斑狼疮、心脏血管炎、肺血管炎；
所述MCM8的基因表达相对于参考水平降低，则诊断为所述疾病；所述参考水平代表来自未患有所述疾病的同年龄段受试者的MCM8的基因表达水平。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂或基因芯片。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
所述产品是用于执行以下检测方法中的一种或多种：聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、核苷酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：
所述产品含有检测MCM8基因和/或对照基因的引物和/或检测探针；和/或还含有样品的处理试剂，包括样品裂解试剂、样品纯化试剂和/或样品核酸提取试剂；和/或还含有DNA提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
5.根据权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于：
所述产品的检测样本或受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：
所述待测对象来自成人或儿童。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：
所述待测对象来自儿童。
8.MCM8基因敲除小鼠在制备疾病动物模型中的用途，其特征在于：所述疾病为血管炎；
所述血管炎选自川崎病、系统性红斑狼疮、心脏血管炎、肺血管炎。
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